JP7142841B2 - 細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体外で細胞チップおよび細胞組織チップを製造する方法に関する。

生体外で細胞の三次元組織を構築する技術は、創薬研究および再生医療研究において重要であり、特にヒト生体組織に近い細胞組織の構築が求められている。

生体外で細胞を取り扱う場合、プラスチックディッシュやガラスシャーレ等の培養容器を用いて二次元的に細胞培養を行うのが一般的である。しかしながら、実際の生体内では細胞が三次元的に増殖して組織や臓器を形成しているため、生体内に近い培養環境を実現するためには三次元の細胞組織チップを構築し、その細胞組織チップに対して評価実験を行うことが創薬研究および再生医療研究の進展には重要である。

細胞同士が集合、凝集化した細胞組織チップ（細胞集合体）を、例えばウェルプレートにおける整列した複数のウェル（凹部）のそれぞれに配置して、それぞれの細胞集合体を評価するアッセイ法は、細胞機能の評価や、新規医薬品として有効な化合物を選択するスクリーニングにおいて広く用いられている。このような細胞集合体に対してアッセイ法を行うことにより、少量の試料で多項目を短時間で評価することが可能であり、迅速性、簡便性、安全性、再現性および高い信頼性を確保する点において有利である。

細胞を基板上に精密パターニング配置する技術には、フォトリソグラフィ技術で基板を加工して細胞接着を制御する方法と、細胞を直接プリントして配置および固定化する方法がある。近年では、細胞を三次元（３Ｄ）に配置および積層するための３Ｄプリンタ技術の進展に伴い、３Ｄプリンタを用いた細胞集合体の構築が検討されており、細胞集合体から得られた組織モデルによる創薬研究および再生医療への応用が盛んに展開されている。

特開2008-126459号公報 特開2008-017798号公報 特開2010-022251号公報 特開2015-229148号公報 特開2016-087822号公報 特開2017-163931号公報 特開2017-169560号公報 特開2017-131144号公報 特開2015-112576号公報

細胞集合体の構築のための３Ｄプリンタとしては、インクジェットプリンタ（inkjet printer：インクジェット方式サーマルタイプ、ピエゾタイプ）、マイクロ押出プリンタ（microextrusion printer：ディスペンサ方式）、レーザアシストプリンタ（laser-assisted printer：パルスレーザ方式）が存在する。しかしながら、これらのプリンタにおいては、吐出できる材料が制限されており、またプリント速度（作製速度）および解像度（吐出量）においても大きく制約を受けるものであった。さらに、従来の３Ｄプリンタにおいては、吐出する材料が細胞を含む細胞含有溶液の場合、吐出後の状態における製造すべき細胞集合体の細胞生存率および細胞密度等に関して問題を有するものであった。特に、高い粘性を有する細胞含有溶液から細胞集合体を製造する場合には、プリンタのノズルにおいて高粘性の溶液が目詰まりするおそれがあるため、高い解像度、即ち微細な細胞集合体を大量に製造することができず問題を有するものであった。

また、細胞集合体における細胞の乾燥によるダメージを防止するためには、細胞をゲル化剤にて包埋する必要がある。細胞をゲル化剤にて包埋する場合、２液が混合されるとゲル化する２液性ゲル化剤が用いられている。なお、紫外線硬化型のゲル化剤や、熱硬化型のゲル化剤を用いた場合には、硬化時における紫外線および熱が細胞に対して悪影響を与えるため、このような硬化剤の使用は好ましいものではない。

２液性ゲル化剤を用いて細胞集合体を製造する場合には、２台のプリンタを使用し、一方のプリンタのノズルから細胞を含む一方のゲル化剤を所定位置に吐出して、他方のゲル化剤を他方のプリンタのノズルから一方のゲル化剤に対して高精度に吐出して、互いのゲル化剤を確実に反応させる必要がある。このように、異なるプリンタを使用して２液のゲル化剤を同じ位置に高精度に吐出してゲル化させ、細胞集合体を製造することは容易なことではない。また、２台のプリンタを用いるために、装置全体が大型化するという問題を有している。特に、インクジェット方式や、ディスペンサ方式のプリンタを用いて細胞集合体を製造する場合には、ゲル化剤として粘性の高い材料を用いた場合にはノズルの先端で目詰まりするおそれがあり、高い信頼性と高い精度を維持して所望量のゲル化剤を確実にノズルから吐出することは困難であった。

本発明は、高粘性の細胞含有材料であったとしても、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび細胞組織チップを短時間（高速度）で大量に確実に製造することができる細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法の提供を目的とするものである。

前記目的を達成するために、本発明に係る一態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、
細胞を含む第１塗布液を貯留する第１塗布液容器と、
前記第１塗布液容器に貯留された前記第１塗布液に浸漬可能な第１塗布針と、
第２塗布液を貯留する第２塗布液容器と、
前記第２塗布液容器に貯留された前記第２塗布液に浸漬可能な第２塗布針と、を備えた微細塗布装置を用いた細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法であって、
前記第１塗布液容器に貯留された前記第１塗布液に前記第１塗布針における少なくとも先端を浸漬して、前記第１塗布針の先端に前記第１塗布液を保持させる工程、
前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液を塗布対象物に接触させて、塗布対象物に前記第１塗布液を塗布する工程、
前記第２塗布液容器に貯留された前記第２塗布液に前記第２塗布針における少なくとも先端を浸漬して、前記第２塗布針の先端に前記第２塗布液を保持させる工程、および
前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液を塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触させる工程、を含む。

本発明によれば、粘性の高い細胞含有溶液が材料であっても、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび細胞組織チップを短時間で大量に確実に製造することができる。

本発明に係る実施形態１において用いる卓上型の微細塗布装置を示す正面図である。 （ａ）は実施形態１の微細塗布装置における塗布ユニットに装着される塗布針（第１塗布針および第２塗布針）を示す図であり、（ｂ）は塗布針における針部の先端部分を示す拡大図である。 実施形態１の微細塗布装置における塗布ユニットの塗布動作を示す図 （ａ）は第１塗布針による第１塗布動作に示した図であり、（ｂ）は第２塗布針による第２塗布動作を示した図である。 （ａ）は第１塗布針による第１塗布動作における先端の動きを示す動作図であり、（ｂ）は第２塗布針による第２塗布動作における先端の動きを示す動作図である。 実施形態１の微細塗布装置において、第１塗布機構による第１塗布動作および第２塗布機構による第２塗布動作の連続塗布動作を示す動作図である。 塗布回数と液滴スポットの形状（塗布径および塗布高さ）との関係の一例を示すグラフである。 第１塗布針の第３塗布動作を示す動作図である。 第１塗布針の第３塗布動作と第２塗布針の第２塗布動作との連続塗布動作を示す動作図である。 第１塗布液の液滴スポットに対して第２塗布液が塗布された直後の組織体の状態を示す画像である。 図１０に示した組織体を３日間培養したときの状態を示す画像である。 塗布針の先端直径と、液滴スポットに含まれる塗布細胞数との実験結果を示すグラフである。 先端直径が３３０μｍの第１塗布針を用いて第３塗布動作を行った場合の塗布細胞数を計測した実験結果を示すグラフである。

先ず始めに、本発明に係る細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法における各種態様について記載する。なお、本発明における細胞チップとは、例えば培養容器において実質的に個々の細胞が分散して接着している状態の実質的に１つの細胞で形成されたチップである。また、細胞組織チップとは、基板上で細胞が集合、凝集、積層化して組織化し、機能している状態の細胞集合体のことをいい、細胞シートなどの二次元細胞集合体、細胞シートを重ね合わせた三次元細胞集合体を含む。

本発明に係る第１の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、
細胞を含む第１塗布液を貯留する第１塗布液容器と、
前記第１塗布液容器に貯留された前記第１塗布液に浸漬可能な第１塗布針と、
第２塗布液を貯留する第２塗布液容器と、
前記第２塗布液容器に貯留された前記第２塗布液に浸漬可能な第２塗布針と、を備えた微細塗布装置を用いた細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法であって、
前記第１塗布液容器に貯留された前記第１塗布液に前記第１塗布針における少なくとも先端を浸漬して、前記第１塗布針の先端に前記第１塗布液を保持させる工程、
前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液を塗布対象物に接触させて、塗布対象物に前記第１塗布液を塗布する工程、
前記第２塗布液容器に貯留された前記第２塗布液に前記第２塗布針における少なくとも先端を浸漬して、前記第２塗布針の先端に前記第２塗布液を保持させる工程、および
前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液を塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触させる工程、
を含む。

本発明に係る第２の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法においては、前記の第１の態様の前記第１塗布液と前記第２塗布液とが接触して反応し、ゲル化する工程、を含むものとしてもよい。

本発明に係る第３の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法においては、前記の第１の態様または第２の態様の前記第２塗布針の先端直径を、前記第１塗布針の先端直径より大きく構成してもよい。

本発明に係る第４の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第３の態様において、前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液が接触塗布される塗布速度が、前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液が塗布対象物に接触塗布される塗布速度より遅くなるよう設定されてもよい。

本発明に係る第５の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第４の態様のいずれかの態様において、前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液が、塗布対象物に接触する直前で前記第１塗布針の塗布速度を遅くして接触させ、
前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液が、塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触する直前で前記第２塗布針の塗布速度を遅くして接触させてもよい。

本発明に係る第６の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第５の態様のいずれかの態様において、前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液が塗布対象物に接触する直前で、前記第１塗布針を一旦所定時間停止後に停止前の塗布速度より遅くして接触させてもよい。

本発明に係る第７の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第６の態様のいずれかの態様において、前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液が塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触する直前で、前記第２塗布針を一旦所定時間停止後に停止前の塗布速度より遅くして接触させてもよい。

本発明に係る第８の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第７の態様のいずれかの態様において、前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液を塗布対象物に接触させて、塗布対象物に前記第１塗布液を接触させてから所定時間経過後に、前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液を塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触塗布させてもよい。

本発明に係る第９の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第８の態様のいずれかの態様において、前記第１塗布針の先端に前記第１塗布液を保持させて、前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液を塗布対象物に塗布する工程を複数回繰り返した後、前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液を、塗布対象物の前記第１塗布液に接触させてもよい。

本発明に係る第１０の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第９の態様のいずれかの態様において、前記第１塗布液と前記第２塗布液が２液混合のゲル化剤であってもよい。

本発明に係る第１１の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第１０の態様のいずれかの態様において、前記第２塗布針の塗布時の塗布対象物からの高さが、前記第１塗布針の塗布時の塗布対象物からの高さより高く設定されてもよい。

本発明に係る第１２の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第９の態様において、前記第１塗布針により前記第１塗布液を塗布対象物に塗布する工程を複数回繰り返すとき、前記第１塗布針の塗布時の塗布対象物からの高さを徐々に上昇させるよう設定してもよい。

本発明に係る第１３の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第１２の態様のいずれかの態様において、前記第１塗布針および前記第２塗布針の先端が、塗布時の移動方向に直交する平面を含むよう構成してもよい。

本発明に係る第１４の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第１３の態様のいずれかの態様において、前記第１塗布針が前記第１塗布液容器を貫通して前記第１塗布液を塗布対象物に塗布し、前記第２塗布針が前記第２塗布液容器を貫通して前記第２塗布液を塗布対象物に塗布するよう構成してもよい。

本発明に係る第１５の態様の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第１４の態様のいずれかの態様において、前記第１塗布液における細胞としては、未修飾の細胞または修飾された細胞が用いられてもよい。

本発明に係る細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、後述する実施形態において具体的な例示を用いて説明するように、塗布針の先端に付着させた数ｐＬ（ピコリットル）の微少な液滴を一回当たり極短時間で、例えば０．１秒で対象物の所定位置に高精度に塗布できる微細塗布装置を用いて、安全性および再現性が高く、自動化が可能であり、短時間で大量の信頼性の高い細胞チップおよび細胞組織チップ（細胞集合体）の製造を提案するものである。

本発明においては、複数の塗布針を備えた、例えば２本の塗布針を備えた２針形式の微細塗布装置を用いることにより、従来の塗布装置（プリンタ）では対応することが困難であったゲル化された細胞チップおよび細胞組織チップ（細胞集合体）を高速度で安定して製造することが可能となる。この結果、様々な細胞組織チップを自動化して無菌状態で多量に製造することが可能となる。従って、本発明に係る細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、安全性および再現性が高く、高い信頼性を有する細胞チップおよび細胞組織チップを自動化により大量に製造することが可能となる。なお、以下の実施形態においては塗布液として細胞を含む２液性ゲル化剤を用いた場合について説明する。

次に、添付の図面を参照して本発明に係る細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法について具体的な構成例を示す実施形態を用いて説明する。なお、本発明に係る細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、以下に説明する実施形態の微細塗布装置を用いる構成に限定されるものではなく、微細塗布装置において実行される細胞塗布動作（細胞塗布方法）と同等の技術的思想による細胞塗布動作（細胞塗布方法）を含むものである。

（実施形態１）
以下、具体的な実施形態１について添付の図面を参照して説明する。図１は、実施形態１において用いる卓上型の微細塗布装置１を示す正面図である。図１に示す微細塗布装置１は、当該微細塗布装置１における設定、制御、および表示を行うための表示・制御部（図示省略）を備える。実施形態１の微細塗布装置１における表示・制御部としては、所謂パーソナルコンピュータ（ＰＣ）で構成される。

微細塗布装置１は、卓上に水平に配置された本体ベース２において、水平方向に移動可能なＸＹテーブル３と、ＸＹテーブル３に対して上下方向（鉛直方向）に移動するように微調整可能な塗布ユニット４と、ＸＹテーブル３上の塗布物（細胞等）を目視観察等を行うための観察光学系ユニット（例えば、ＣＣＤカメラ等）５Ａと、作製された塗布物の計測等を行う計測機器を含む評価系装置（例えば、レーザー変位計、白色干渉計等）５Ｂと、を備えている。ＸＹテーブル３上には、塗布対象物として、例えば、細胞培養用容器である培養容器６として多数の凹み（ウェル）を有するウェルプレート等の器具が所定位置に載置され固定される。例えば、ウェルプレートの各ウェルには細胞含有溶液である塗布液が塗布されて、複数の細胞チップまたは細胞組織チップが作製される。なお、本発明の微細塗布装置としては、観察光学系ユニットおよび評価系装置５Ｂを備えない構成、若しくはいずれか一方を備える構成を含むものである。

なお、実施形態１においては、図１に示すように、卓上型の微細塗布装置１の構成で説明するが、本発明はこのような卓上型の構成に限定されるものではなく、実質的に同じ構成で大型化して培養室等に設置される大型の微細塗布装置１を含むものである。

上記のように構成された微細塗布装置１における塗布ユニット４は、ＸＹテーブル３上の培養容器６の各ウェル内に細胞チップまたは細胞組織チップを作製するための細胞塗布動作を行うよう構成されている。以下、塗布ユニット４の構成および塗布ユニット４による細胞塗布動作について説明する。

［塗布ユニットの構成］
微細塗布装置１における塗布ユニット４は、２つの塗布機構（第１塗布機構４Ａおよび第２塗布機構４Ｂ）を備えており、それぞれの塗布機構４Ａ、４Ｂが独立して塗布動作を行うように構成されている。微細塗布装置１においては、細胞チップまたは細胞組織チップを作製するために、塗布液として２液性ゲル化剤を用いる構成であり、第１塗布機構４Ａおよび第２塗布機構４Ｂが備えられている。

図２の（ａ）は、塗布ユニット４における第１塗布機構４Ａおよび第２塗布機構４Ｂに装着される塗布針７を示す図である。塗布針７は、針保持部８、およびその針保持部８に突設された針部９を有する。図２の（ｂ）は、塗布針７における針部９の先端部分を示す拡大図である。実施形態１の塗布針９の先端部分は、円錐形状に形成されており、その先端９ａが、ＸＹテーブル４の水平面に対向するように平面（フラット）に形成されている。即ち、先端９ａの平面は鉛直方向に直交する水平面である。

微細塗布装置１においては、第１塗布機構４Ａに装着される塗布針７（第１塗布針７Ａ）と、第２塗布機構４Ｂに装着される塗布針７（第２塗布針７Ｂ）とは、塗布針９の先端９ａの直径が異なっているが、その他の構成は実質的に同じである。塗布針９の先端９ａの直径ｄは、作製される細胞チップまたは細胞組織チップの形状に大きく関係している。実施形態１の微細塗布装置１において、塗布針９の先端９ａの直径ｄは、第１塗布機構４Ａに装着される第１塗布針７Ａが、例えば３３０μｍであり、第２塗布機構４Ｂに装着される第２塗布針７Ｂが、例えば１０００μｍであり、このように先端直径が異なる第１塗布針７Ａおよび第２塗布針７Ｂを用いて微細な細胞チップまたは細胞組織チップを作製した。なお、実施形態１において、第１塗布針７Ａおよび第２塗布針７Ｂにおける針保持部８、針部９、および先端９ａは同じ参照符号を用いて説明する。

図２の（ｂ）に示すように、塗布針７の先端部分が円錐形状を有し、その先端９ａが水平面であるため、先端９ａを水平面に研磨することにより、先端９ａの直径ｄは所望の直径に形成することが容易である。

図３は、塗布ユニット４における塗布動作を模式的に示す図である。塗布ユニット４の塗布動作においては、第１塗布機構４Ａによる第１塗布動作を行った後、第２塗布機構４Ｂによる第２塗布動作を行う。第１塗布機構４Ａによる第１塗布動作により塗布される第１塗布液１１Ａは細胞を懸濁した第１ゲル化剤であり、第２塗布機構４Ｂにより塗布される第２塗布液１１Ｂは第１塗布液１１Ａをゲル化するための第２ゲル化剤である。

図３においては、第１塗布機構４Ａにおける第１塗布動作を模式的に示している。図３に示すように、第１塗布機構４Ａには、細胞含有溶液である第１塗布液１１Ａを所定量貯留する塗布液溜り１０ａが形成された第１塗布液容器１０Ａが設けられている。また、第１塗布機構４Ａには、塗布液溜り１０ａを貫通して上下方向（鉛直方向）に高速移動（往復動作）する第１塗布針７Ａが装着されている。

第１塗布針７Ａの往復動作は、駆動源（例えば、モータ）の回転動作をリンク機構を介して往復動作に変換する駆動機構により達成される。第１塗布針７Ａの上下方向（鉛直方向）の高速の往復動作は、第１塗布液容器１０Ａの上端に形成された貫通孔（上部孔１０ｂ）により、第１塗布針７Ａの針部９が摺動可能に保持されており、第１塗布針７Ａの高速往復動作の信頼性が確保されている。第１塗布針７Ａは、第１塗布機構４Ａにおいて第１塗布針７Ａを高速往復動作させる駆動機構の所定位置に脱着可能に設けられており、例えば、駆動機構に対してマグネットの磁力により、またはネジ止め等により脱着可能な構成としている。

上記のように、第１塗布機構４Ａにおける駆動機構に固定された第１塗布針７Ａは、上下方向（鉛直方向）における所定間隔の間を高速度で往復移動する。このような駆動機構の駆動制御、ＹＸテーブル３および第１塗布機構４Ａを備える塗布ユニット４の全体を上下方向（鉛直方向）に移動する上下移動機構の駆動制御の設定等は、表示・制御部において行われる。なお、第１塗布針７Ａの上下方向の往復動作は超高速度であり、例えば１往復が、０．５秒以下、さらに０．１秒以下に設定することが可能である。

上記のように、塗布ユニット４における第１塗布機構４Ａは、第１塗布針７Ａを保持して上下方向に高速で往復動作するように構成されており、第１塗布針７Ａは、細胞含有溶液である第１塗布液１１Ａを貯留する塗布液溜り１０ａに対して、上下方向（鉛直方向）に移動し貫通するように構成されている。塗布液溜り１０ａを有する第１塗布液容器１０Ａの上部および下部には第１塗布針７Ａにより貫通される孔（上部孔１０ｂ、下部孔１０ｃ）が形成されている。

塗布ユニット４における第１塗布機構４Ａは、上記のように構成されて第１塗布針７Ａを駆動するが、塗布ユニット４における第２塗布機構４Ｂにおいても同様に構成されており、第２塗布針７Ｂが第２塗布液容器１０Ｂ（図３の塗布液容器１０Ａ参照）の塗布液溜り（１０ａ）を貫通して上下方向（鉛直方向）に高速移動（１往復動作）する。即ち、第２塗布針７Ａの第２塗布動作は、駆動源（例えば、モータ）の回転動作をリンク機構を介して往復動作に変換する駆動機構により達成されている。なお、第１塗布針７Ａの第１塗布動作および第２塗布針７Ａの第２塗布動作においては、１つの駆動源の回転動作を第１リンク機構および第２リンク機構のそれぞれ介して伝達するように切り替える構成である。第１リンク機構および第２リンク機構においては、往復動作時の速度制御を行うことができるよう構成されている。

第１塗布機構４Ａと第２塗布機構４Ｂとにおいては、前述のように、第１塗布針７Ａと第２塗布針７Ｂの塗布針先端の直径が異なっている。また、第１塗布機構４Ａと第２塗布機構４Ｂとにおける塗布動作の違いは、第１塗布動作の塗布回数が複数回であるのに対して、第２塗布動作の塗布回数が１回であることと、塗布動作の往復動作時における塗布針先端の最下点位置である。

上記のように、第１塗布機構４Ａによる第１塗布動作と、第２塗布機構４Ｂによる第２塗布動作は、塗布回数と塗布時における先端最下点の位置以外は実質的に同様の動作である。このため、第２塗布機構４Ｂによる第２塗布動作については、図３の模式図を参照して第１塗布機構４Ａの第１塗布動作を主として説明する。

［塗布動作］
図３に示した第１塗布機構４Ａによる第１塗布動作は、第１塗布容器１０Ａの塗布液溜り１０ａに貯留された細胞を含む第１塗布液１１Ａ（第１ゲル化剤）が塗布対象物である培養容器６のウェルの底面上に塗布される細胞塗布動作である。

細胞塗布動作においては、第１塗布針７Ａが第１塗布容器１０Ａの塗布液溜り１０ａを通り抜けて、培養容器６のウェルの底面上に細胞を含む第１塗布液１１Ａが接触塗布される。この接触塗布とは、第１塗布針７Ａの先端９ａに保持されている極微量の第１塗布液１１Ａがウェルの底面に接触して塗布されるものであり、第１塗布針７Ａの先端９ａとウェルの底面との当接による塗布とは異なるものである。

図３の(ａ)は、細胞塗布動作における第１塗布針７Ａの塗布液浸漬状態を示している。この塗布液浸漬状態においては、第１塗布針７Ａが上部孔１０ｂから塗布液溜り１０ａに挿入されており、第１塗布針７Ａの先端９ａが塗布液溜り１０ａの第１塗布液１１Ａに浸漬している。この塗布液浸漬状態においては、第１塗布針７Ａの先端９ａが第１塗布液１１Ａに浸漬しているため、先端９ａに付着する第１塗布液１１Ａが乾燥しない構成である。このとき、第１塗布容器１０Ａの下部孔１０ｃの直径は微細（例えば、１ｍｍ以下）であるため、第１塗布液１１Ａが塗布液溜り１０ａから漏洩することはない。

図３の（ｂ）は、第１塗布針７Ａの先端９ａが第１塗布容器１０Ａの下部孔１０ｃから突出して、先端９ａが保持する第１塗布液１１Ａが培養容器６のウェルの底面に接触している塗布状態を示している。即ち、第１塗布針７Ａの先端９ａが塗布液溜り１０ａを貫通して突出した下降状態においては、第１塗布針７Ａの先端部分には一定量の第１塗布液１１Ａが保持されている。このため、第１塗布針７Ａの先端９ａに保持された第１塗布液１１Ａがウェルの底面に接触することにより、第１塗布液１１Ａが第１塗布針７Ａの先端９ａからウェルの底面に移動し接触塗布される。培養容器６のウェルの底面に移動した微細な液滴スポットＳは、その表面張力によりウェルの底面上に略半球状に盛り上がった状態となる。

上記の第１塗布針７Ａによる細胞塗布動作が、所定回数繰り返されて、第１塗布液１１Ａがウェルの底面上に接触塗布される。第１塗布針７Ａによる所定回数の細胞塗布動作において、２回目以降の接触塗布では第１塗布針７Ａの先端９ａに保持されている第１塗布液１１Ａとウェルの底面上に塗布された第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳとの接触により塗布される。このように、細胞塗布動作が所定回数（例えば、１０回）繰り返されて、第１塗布液１１Ａが接触塗布され、ウェルの底面上には微細な液滴スポットＳが形成される。例えば、１０回の細胞塗布動作を行うことにより、第１塗布針７Ａの先端９ａの直径が３３０μｍの場合には、略２５０～３００μｍの直径の液滴スポットＳが形成される。

上記のように、図３の（ａ）、（ｂ）に示す第１塗布針７Ａによる細胞塗布動作が所定回数（例えば、１０回）繰り返されて、培養容器６のウェルの底面上には微細な液滴スポットＳが形成される。第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳが形成された後、第２塗布機構４Ｂの第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作が実行される。第２塗布動作においては、第２塗布液１１Ｂが、形成された第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳに対して１回だけ接触塗布される。第１塗布液１１Ａは細胞を懸濁した第１ゲル化剤であり、第２塗布液１１Ｂは第１ゲル化剤との混合により反応してゲル化する第２ゲル化剤である。第２ゲル化剤である第２塗布液１１Ｂが第１塗布液１１Ａに対して覆い被さるように接触塗布されることにより、互いに十分に反応して液滴スポットＳが確実にゲル化する。

図４の（ａ）に示す（ａ－１）～（ａ－４）の図は、第１塗布針７Ａによる１回の第１塗布動作（細胞塗布動作）の動きを模式的に示した図である。図４の（ｂ）に示す（ｂ－１）～（ｂ－３）の図は、は第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作を模式的に示した図である。図４の（ａ）においては、第１塗布針７Ａの先端９ａに極微量の第１塗布液１１Ａが保持された状態（ａ－１）と、塗布対象物である培養容器６のウェルの底面上に第１塗布針７Ａの先端９ａの第１塗布液１１Ａが接触した状態（ａ－２）と、第１塗布針７Ａの先端９ａが第１塗布液１１Ａが接触して上昇直後の状態（ａ－３）と、第１塗布針７Ａの先端９ａがウェルの底面から上昇してウェルの底面上に微細な液滴スポットＳ（高さＺ１）が形成された状態（ａ－４）と、を模式的に示している。

実施形態１の微細塗布装置１においては、図４の（ａ）に示す第１塗布動作が所定回数、例えば、１０回繰り返されて、細胞が懸濁された第１ゲル化剤である第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳ（高さＺ２）が形成される。第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳ（高さＺ２）に対して、図４の（ｂ）に示すように、第２塗布針７Ｂの先端９ｂに保持された第２ゲル化剤である第２塗布液１１Ｂが接触塗布される。

実施形態１の微細塗布装置１においては、第１塗布動作に用いられる第１塗布針７Ａの先端９ａの直径が、例えば３３０μｍであり、第２塗布動作に用いられる第２塗布針７Ｂの先端９ｂの直径が、例えば１０００μｍである。このため、第２塗布針７Ｂによる塗布量は、第１塗布針７Ａによる塗布量に比べて多く、第１塗布針７Ａによる第１塗布動作において形成された第１塗布液１１Ａの微細な液滴スポットＳに対して、第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作により、第２塗布液１１Ｂが確実に覆う状態となる。

上記のように、第１塗布針７Ａによる所定回数の第１塗布動作（図４の（ａ））を行い、その後、第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作（図４の（ｂ））を行うことにより、第２塗布液１１Ｂが第１塗布液１１Ａを覆うように塗布されて、第１塗布液１１Ａと第２塗布液１１Ｂが反応して、ゲル化した細胞チップまたは細胞組織チップが作製される。

なお、第１塗布針７Ａによる塗布量と、第２塗布針７Ｂによる塗布量が大きく異なっており、第２塗布液１１Ｂの消費量が第１塗布液１１Ａの消費量に比べて多いため、第２塗布液容器１０Ｂの容量を第１塗布液容器１０Ａに比べて大きくしてもよい。即ち、第２塗布液容器１０Ｂに貯留される第２塗布液１１Ｂの貯容量を、第１塗布液容器１０Ａに貯留される第２塗布液１１Ａの貯容量より大きく構成してもよい。

図５の（ａ）は第１塗布針７Ａによる第１塗布動作における先端９ａの動きを示す動作図であり、図５の（ｂ）は第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作における先端９ａの動きを示す動作図である。図５の（ａ）および（ｂ）の動作図において、縦軸が塗布針先端位置を示し、横軸が時間を示している。

図５の（ａ）に示すように、第１塗布針７Ａの第１塗布動作（往復動作）においては、その先端９ａが上限位置Ｐ１ａから第１塗布速度Ｖ１ａで下降し、予め設定された塗布直前の速度変更位置Ｐ２ａに達したとき、第１塗布速度Ｖ１ａより遅い第２塗布速度Ｖ２ａで低速下降する。第１塗布針７Ａの先端９ａが第２塗布速度Ｖ２ａで下降して、接触塗布位置Ｐ３ａで先端９ａに保持された第１塗布液１１Ａが接触塗布される。接触塗布位置Ｐ３ａに関しては、塗布対象物である培養容器６のウェル底面の位置および高さを評価系装置５Ｂに設けられている位置計測機器等による検出データに基づいて算出して、予め設定してもよい。また、接触塗布位置Ｐ３ａに関しては、第１塗布動作における塗布最初の原点位置を予め検出して設定し、その原点位置に基づいて塗布動作における２回目以降の接触塗布位置Ｐ３ａを設定してもよい。即ち、第１塗布針７Ａによる複数回の塗布動作においては、塗布動作を１回行う度に接触塗布が可能な範囲で接触塗布位置Ｐ３ａを徐々に上げる設定としてもよい。

第１塗布動作において、接触塗布位置Ｐ３ａで接触塗布した後は、初期位置である上限位置Ｐ１ａに復帰速度Ｖ３で戻り、次の塗布動作を繰り返す。図５の（ａ）に示すように、１回の塗布動作において、上限位置Ｐ１ａ（時間Ｔ１ａ）から速度変更位置Ｐ２ａ（時間Ｔ２ａ）までを第１塗布速度Ｖ１ａで下降し、速度変更位置Ｐ２ａ（時間Ｔ２ａ）から接触塗布位置Ｐ３ａ（時間Ｔ３ａ）までを第２塗布速度Ｖ２ａ（＜Ｖ１ａ）で下降して接触塗布する。接触塗布後は、上限位置Ｐ１ａ（時間Ｔ４ａ）まで所定の復帰速度Ｖ３で上昇する。

実施形態１の微細塗布装置１においては、接触塗布位置Ｐ３ａに到達するときの第１塗布針７Ａの第２塗布速度Ｖ２ａは第１塗布速度Ｖ１ａに比して低速度であるため、第１塗布針７Ａの先端９ａは設定された接触塗布位置Ｐ３ａに対して精度高く配置することができ、微細な塗布動作を行うことができる。なお、第１塗布針７Ａの先端９ａが塗布対象物である基板表面に接触したとしても、接触衝撃は小さいものとなり、細胞に対する影響を小さいものとすることができる。

一方、第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作においては、図５の（ｂ）に示すように、第１塗布針７Ａの第１塗布動作（図５の（ａ））に比べて低速度に設定されている。第２塗布針７Ｂの第２塗布動作においては、第２塗布針７Ｂの先端９ａが上限位置Ｐ１ｂから第１塗布速度Ｖ１ｂ（Ｖ１ｂ＜Ｖ１ａ）で下降し、予め設定された塗布直前の速度変更位置Ｐ２ｂ（Ｐ２ｂ＝Ｐ２ａ）に達したとき、第１塗布速度Ｖ１ｂより遅い第２塗布速度Ｖ２ｂで低速下降する。第２塗布針７Ｂの先端９ａが第２塗布速度Ｖ２ｂで下降して、接触塗布位置Ｐ３ｂで先端９ａに保持された第２塗布液１１Ｂが第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳに対して接触塗布される。接触塗布位置Ｐ３ｂは、評価系装置５Ｂに設けられている位置計測機器により、第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳの位置、および高さを示す検出データに基づいて算出し、設定してもよい。

第２塗布動作において、接触塗布位置Ｐ３ｂで接触塗布した後は、初期位置である上限位置Ｐ１ｂに復帰速度Ｖ３で戻る。図５の（ｂ）に示すように、第２塗布動作において、上限位置Ｐ１ｂ（時間Ｔ１ｂ）から速度変更位置Ｐ２ｂ（時間Ｔ２ｂ）までを第１塗布速度Ｖ１ｂ（＜Ｖ１ａ）で下降し、速度変更位置Ｐ２ｂ（時間Ｔ２ｂ）から接触塗布位置Ｐ３ｂ（時間Ｔ３ｂ）までを第２塗布速度Ｖ２ｂ（＜Ｖ１ｂ）で下降して接触塗布する。接触塗布後は、上限位置Ｐ１ｂ（時間Ｔ４ｂ）まで所定の復帰速度Ｖ３で上昇する。

図６は、実施形態１の微細塗布装置１において、第１塗布機構４Ａによる第１塗布動作と、第２塗布機構４Ｂによる第２塗布動作との連続塗布動作を示す動作図である。図６に示す第１塗布機構４Ａによる第１塗布動作においては、第１塗布針７Ａにより第１塗布液１１Ａが塗布対象物である培養容器６に対して１０回の接触塗布が実行されている。

図６に示すように、第１塗布動作における１０回の接触塗布においては、第１塗布針７Ａの最下点位置である接触塗布位置Ｐ３ａが、１回の接触塗布が終了する度に徐々に上方へ移動するように設定されている。実施形態１の微細塗布装置１における第１塗布動作では、例えば、接触塗布位置Ｐ３ａを各接触塗布毎に数μｍだけ上方に移動させている。

発明者は、第１塗布機構４Ａによる第１塗布動作により形成される液滴スポットＳの形状（塗布径および塗布高さ）について計測実験を行った。図７は、塗布回数と液滴スポットＳの形状（塗布径および塗布高さ）との関係の一例を示すグラフである。

図７に示すように、液滴スポットＳの塗布径においては塗布回数が５回目までは徐々に大きくなり、６回目以降は塗布径が大きく変わることがなかった。また、液滴スポットＳの塗布高さに関しては、１回目の塗布で最終的な塗布高さの約半分の高さの液滴スポットＳが形成されており、その後においては５回目までに最終的な塗布高さと略同等の液滴スポットＳが形成されている。図７に示す例の場合には、５回の塗布回数を行うことにより液滴スポットＳの形状が略決定されていた。但し、塗布回数と液滴スポットＳの形状との関係は、塗布液の粘性などの特性により大きく変化するため、少なくとも１０回の塗布回数を行うことにより、液滴スポットＳの形状が安定すると考えられる。

実施形態１の微細塗布装置１においては、塗布針先端に保持されている塗布液が塗布対象物（培養容器のウェル底面または液滴スポット等）に接触することにより、塗布液を塗布する接触塗布という特殊な塗布動作を行っている。このため、塗布対象物に形成された液滴スポットＳに対して接触塗布されても、塗布針先端に保持されている塗布液の全てが基板上の液滴スポットＳに移行する塗布動作ではない。接触塗布においては、塗布される液滴スポットＳの塗布量および形状は、塗布針先端に保持されている塗布液の保持量および塗布液の特性、そして塗布対象物の表面性状（表面粗さ）等で決定されると考えられる。

上記のように第１塗布動作が終了した後においては、所定時間の間にＸＹテーブル３上の塗布対象物を第１塗布針７Ａの直下から、第２塗布針７Ｂの直下に移動して、第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作が開始される。第２塗布動作においては、第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳを覆うように第２塗布液１１Ｂが第２塗布針７Ｂにより接触塗布される。

なお、細胞を懸濁した第１塗布液１１Ａ（第１ゲル化剤）を第１塗布針７Ａで塗布した後、第２塗布針７Ｂで第２塗布液１１Ｂ（第２ゲル化剤）を塗布するまでに、僅かな時間（図６における切替時間Ｔｃ）を有しているため、第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳにおいて適度に緩衝して細胞が安定し、第１塗布液１１Ａに懸濁した細胞の流出を防止することができる。

実施形態１の微細塗布装置１においては、図５の動作図に示したように、第１塗布機構４Ａによる第１塗布針７Ａの第１塗布動作における塗布対象物に最も近づくときの近接速度（Ｖ２ａ）を遅くする（Ｖ２ａ＜Ｖ１ａ）設定である。塗布液における粘性等の特性によっては、近接速度を遅くするだけでは第１塗布針７Ａの先端９ａに保持する塗布量が一定とならない場合が生じる。このように先端９ａの近接速度を遅くするだけでは、一定の塗布量を安定して塗布できないときには、塗布対象物の直前の位置である速度変更位置Ｐ２ａにおいて第１塗布針７Ａを一旦所定時間停止させることにより、第１塗布針７Ａの先端９ａに保持する第１塗布液１１Ａの量を均一化することが可能となる。

図８は、第１塗布針７Ａを塗布対象物の直前の速度変更位置Ｐ２ａで一旦所定時間停止させる第３塗布動作を示す第１塗布針７Ａの先端９ａの動作図である。図８に示すように、第１塗布針７Ａの先端９ａは、第１塗布速度Ｖ１ａで下降して速度変更位置Ｐ２ａに達した時（Ｔ２）、微少な所定時間（Ｔ２→Ｔ２’）だけ停止しており、この所定時間経過後に再び第２塗布速度Ｖ２ａで塗布対象物に向かって下降して接触塗布している。このように第１塗布針７Ａの先端９ａを塗布対象物の直前位置で微少な所定時間だけ停止させることにより、第１塗布液１１Ａの先端９ａによる保持量を均一化することができる。このため、第１塗布機構４Ａにおいて第１塗布針７Ａの第３塗布動作を行うことにより、塗布対象物に対して、塗布液の特性に応じて一定の塗布量を安定して信頼性高く塗布することが可能となる。

上記のように、第３塗布動作においては、速度変更位置Ｐ２ａで一旦停止し、所定時間（Ｘ）経過後に停止前の第１塗布速度Ｖ１ａより遅い第２塗布速度Ｖ２ａで接触塗布位置Ｐ３ａに下降する。接触塗布位置Ｐ３ａで接触塗布した後は、初期位置である上限位置Ｐ１ａに復帰速度Ｖ３で戻り、次の塗布動作を繰り返す。図８に示すように、１回の塗布動作において、上限位置Ｐ１ａ（時間Ｔ１）から速度変更位置Ｐ２ａ（時間Ｔ２）までを第１塗布速度Ｖ１ａで下降し、所定時間（Ｘ）経過後に速度変更位置Ｐ２ａ（時間Ｔ２’）から接触塗布位置Ｐ３ａ（時間Ｔ３ｃ）までを第２塗布速度Ｖ２ａ（＜Ｖ１ａ）で下降して接触塗布する。接触塗布後は、上限位置Ｐ１ａ（時間Ｔ４ｃ）まで所定の復帰速度Ｖ３で上昇する。

なお、図８は、第１塗布針７Ａの第３塗布動作を示したが、この第３塗布動作は第２塗布針７Ｂにおいても同様の塗布動作を行うことが可能である。即ち、第２塗布針７Ｂの先端に保持された第２塗布液１１Ｂが塗布対象物に接触する直前で、第２塗布針７Ｂを一旦所定時間停止後に停止前の塗布速度より遅くして接触させてもよい。このように第２塗布針７Ｂの先端９ａを塗布対象物の直前位置で微少な所定時間だけ停止させることにより、第２塗布液１１Ｂの先端９ａによる保持量を均一化することができる。

図９は、図８に示した第１塗布針７Ａの第３塗布動作と、図５の（ｂ）に示した第２塗布針７Ｂの第２塗布動作との連続塗布動作を示す動作図である。図９に示す第１塗布針７Ａによる第３塗布動作においては、第１塗布針７Ａにより第１塗布液１１Ａが塗布対象物である培養容器６に対して１０回の接触塗布が行われている。

図９に示す第３塗布動作においては、図６に示した第１塗布動作と同様に、第１塗布針７Ａの最下点位置である接触塗布位置Ｐ３ａが、１回の塗布が終了する度に徐々に上方へ移動するように設定されている。また、第３塗布動作が終了後の所定時間の切替時間（Ｔｃ）経過後において第２塗布針７Ｂにより第２塗布液１１Ｂが第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳに対して接触塗布される。

実施形態１における微細塗布装置１の塗布動作においては、塗布針７（７Ａ，７Ｂ）の先端９ａに極微量な塗布液１１（１１Ａ，１１Ｂ）を付着させて塗布対象物に接触させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量の液滴スポットＳを高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布し形成することができる。また、塗布液１１の粘度としては、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下の材料を塗布することが可能であり、高粘度の細胞分散液の塗布が可能となる。実施形態１における微細塗布装置１の塗布動作おいては、インクジェットプリンタ等のノズルを用いたプリンタでは目詰まり等の問題を有するため使用できなかった粘度１０ｍＰａ・ｓ以上、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下の材料を塗布材料として使用することが可能となる。また、塗布針７の先端９ａに保持した極微量な塗布液１１を塗布対象物に接触させて塗布するため、塗布針７の鉛直方向位置のバラツキに影響されることなく、塗布液１１を安定して繰り返し塗布することができる。このように、実施形態１の塗布ユニット４および微細塗布装置１の塗布動作によれば、高粘度の細胞分散液を塗布対象物に対して所定の位置に精密塗布することができるため、任意のパターニングを有する細胞チップ、細胞を立体的に造形した細胞組織チップを製造することができる。このため、本発明に係る実施形態１の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、製造された細胞チップおよび細胞組織チップが、薬剤の薬効、安全性の評価のスクリーニング等の創薬研究および再生医療の分野において利用されて、各分野における進展に効果を奏するものである。

（実験例）
以下、実施形態１において説明した微細塗布装置１を用いて発明者らが実施した具体的な実験について説明する。但し、以下の説明において記載した物質名や具体的な塗布条件は、一例として示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の実験においては、実施形態１の微細塗布装置１を用いて２液性ゲル化剤による塗布実験を行った。

この塗布実験においては、第１塗布機構４Ａの第１塗布針７Ａとして先端直径が３３０μｍを用い、第２塗布機構４Ｂの第２塗布針７Ｂとして先端直径が１０００μｍを用いた。２液性ゲル化剤における第１塗布液１１Ａ（第１ゲル化剤）としては、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を４×１０^７cells/mLの濃度で２０mg/mLのフィブリノゲン溶液に分散させた溶液（懸濁液）を用いた。一方、第２塗布液１１Ｂ（第２ゲル化剤）としては、８００unit/mLのトロンビン溶液を用いた。

塗布実験においては、図９に示したように第１塗布針７Ａによる第３塗布動作（図８参照）と、第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作（図５の（ｂ）参照）を行った。

先ず、第１塗布針７Ａによる第３塗布動作において、第１塗布針７Ａが第１塗布速度Ｖ１ａで下降し、第１塗布針７Ａによる塗布量を安定させるために、速度変更位置Ｐ２で第１塗布針７Ａを一旦所定時間（図８における期間（Ｔ２→Ｔ２’）：Ｘ）静止させる。第１塗布針７Ａが所定時間Ｘだけ静止することにより、先端９ａに保持される第１塗布液１１Ａが安定する。第１塗布針７Ａが所定時間Ｘだけ静止した後、第１塗布針７Ａが第１塗布速度Ｖ１ａより遅い第２塗布速度Ｖ２ａで最下端である接触塗布位置Ｐ３ａまで下降して、接触塗布する。最下端である接触塗布位置Ｐ３ａは、１回塗布する毎に数μｍ上方へ移動させている。この塗布する毎の接触塗布位置Ｐ３ａの移動距離は、経験則に基づいて予め設定されているが、微細塗布装置１の評価系装置５Ｂに設けられている位置計測機器等による計測された塗布スポットの高さに応じて設定してもよい。塗布実験においては、第１塗布針７Ａの１回の塗布により形成される液滴スポットＳの高さＺ１より低い高さを第１塗布針７Ａが１回塗布する毎に上方へ移動する移動距離としている。

塗布実験における第１塗布針７Ａによる第３塗布動作では、上記のように針先先端位置を上昇させて、塗布対象物であるプラスチック製カバースリップであるセルデスクＬＦ（登録商標）（住友ベークライト株式会社製）の培養容器６のウェル底面上に１０回連続して接触塗布して液滴スポットＳを形成した。

第１塗布針７Ａによる第３塗布動作が終了した後、ウェル底面上の第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳを数秒間（図９における切替時間Ｔｃ）放置して、液滴スポットＳが安定した後、第２塗布針７Ｂによる第２塗布動作を開始した。第２塗布動作においては、第２塗布針７Ｂの先端９ａに保持された第２塗布液１１Ｂがウェル底面上の第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳに確実に接触して塗布できるように、第２塗布針７Ｂの先端位置が設定される。例えば、第２塗布針７Ｂの先端位置は、ウェル底面上の第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳの高さＺ２（１０回塗布後の高さ）に設定されてもよく、第２塗布針７Ｂの先端９ａから垂れ下がる第２塗布液１１Ｂの最下点位置を考慮して設定してもよい。このように第２塗布針７Ｂの先端位置を設定することにより、第２塗布液１１Ｂが第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳの上面に確実に接触塗布される。この結果、第２塗布液１１Ｂの第２ゲル化剤であるトロンビンが、第１塗布液１１Ａであるヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を含むフィブリノゲン溶液の懸濁液を覆うように塗布され（図４の（ｂ）参照）、液滴スポットＳをゲル化による組織固定して、細胞組織チップを作製した。作製した細胞組織チップの観察結果を図１０および図１１に示す。

図１０は、第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳに対して第２塗布液１１Ｂが塗布された直後（０日間培養）の組織体の状態を示す画像である。図１１は、図１０に示した組織体を３日間培養したときの状態を示す画像である。図１１に示すように、３日間培養の培養により細胞組織体（細胞集合体）の構造が確認され、細胞組織チップが確実に構築されていることが確認できた。

また、発明者は、塗布針７の先端直径を変更して塗布実験を行い、塗布針７の先端直径と、基板上に塗布された液滴スポットＳに含まれる塗布細胞数とを計測した。この実験においては、第１塗布液１１ＡとしてｉＰＳ－ＣＭを４×１０^７cells／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液に分散させた懸濁液を用いた。実験の結果、１回の塗布で、塗布針７の先端直径が５０μｍのとき液滴スポットＳには平均１．１個の塗布細胞が存在し、先端直径が１００μｍのときの液滴スポットＳには平均４．０個の塗布細胞が存在し、先端直径が１５０μｍのときの液滴スポットＳには平均４．５個の塗布細胞が存在し、先端直径が２００μｍのときの液滴スポットＳには平均１９．１個の塗布細胞が存在していた。そして先端直径が３３０μｍの塗布針７で１回塗布したとき液滴スポットＳには平均８５．３個の塗布細胞が存在していた。図１２は、塗布針７の先端直径と、液滴スポットＳに含まれる塗布細胞数との関係を考察するための実験結果を示すグラフである。図１２において、縦軸が塗布細胞数［cells／spot］を示し、横軸が塗布針７の先端直径［μｍ］を示す。

図１２のグラフに示すように、塗布針７の先端直径が大きいほど液滴スポットＳにおける塗布細胞は多く存在していた。従って、実施形態１の微細塗布装置１においては、第１塗布針７Ａの先端直径を選択することにより、塗布対象物の基板等に対して所望の塗布細胞数を有する液滴スポットＳを形成することが可能となることが理解できる。即ち、塗布針７の先端直径、溶液細胞濃度、溶液粘度等を選択することにより、所望の細胞チップおよび細胞組織チップの製造を行うことが可能となる。

図１３は、先端直径が３３０μｍの第１塗布針７Ａを用いて第３塗布動作（１０回の接触塗布）を行った場合の塗布細胞数を計測した実験結果を示すグラフである。図１３において、縦軸が塗布細胞数［cells／spot］を示し、横軸が第１塗布針７Ａによる塗布回数を示している。この塗布実験においては、第１塗布液１１ＡとしてｉＰＳ－ＣＭを４×１０^７cells／ｍＬの濃度で２０mg/mLのフィブリノゲン溶液に分散させた溶液を用いた。図１３に示すように、第１塗布針７Ａがウェル底面上に第１塗布液１１Ａを１０回塗布した場合には、平均１６２．４個の塗布細胞が存在していた（４回の実験）。なお、図１２および図１３のグラフにおいては、塗布細胞数の標準偏差（正方向）をエラーバーで示している。

上記のように、実施形態１の微細塗布装置１においては、第１塗布針７Ａを有する第１塗布機構４Ａにより所望の細胞数を含む液滴スポットＳを形成することができると共に、形成された第１塗布液１１Ａの液滴スポットＳに対して、第２塗布針７Ｂを有する第２塗布機構４Ｂにより第２塗布液１１Ｂを確実に塗布して反応させ、ゲル化した細胞チップまたは細胞組織チップを確実に製造することができる。

なお、実施形態１の微細塗布装置１においては、塗布針７が塗布液容器１０の塗布液溜り１０ａを貫通して塗布対象物に接触塗布する構成であるが、本発明はこのような構成に限定されるものではない。例えば、塗布液溜り１０ａの塗布液に浸漬した塗布針７を持ち上げ、塗布対象物の塗布位置に移動させて接触塗布する構成としてもよい。このように構成された微細塗布装置においても前述の実施形態１の微細塗布装置１による効果と同様に高粘性の細胞含有ゲル化剤が材料であったとしても、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび細胞組織チップを短時間（高速度）で確実に製造することが可能となる。

本発明で使用できる細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、線維芽細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、消化管細胞、神経細胞、肝細胞、腎細胞、膵細胞等の各種初代細胞、ｉＰＳ細胞由来の分化細胞、並びに各種がん細胞等が使用できる。細胞としては、未修飾の細胞、またはタンパク質、糖鎖、核酸等で修飾された細胞、例えばフィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン等の既に知られているコーティング剤、コーティング方法でコーティングされた細胞を用いることができる。

なお、細胞含有溶液には、内包した細胞が安定して接着・増殖できる環境を与えるために、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、マトリゲル等の細胞外マトリックス成分、線維芽細胞増殖因子や血小板由来成長因子等の細胞増殖因子、その他、血管内皮細胞やリンパ管内皮細胞、各種幹細胞等の添加剤を含ませてもよい。また、ゲル化剤としてフィブリノゲンやアルギン酸、感熱応答性高分子等をふくませてもよい。

前述の実施形態および実験例を用いて説明したように、本発明は、新たなバイオプリンタを用いて細胞チップおよび細胞組織チップを製造する新たな製造方法を提供するものである。従来のノズルを用いたプリンタを用いて製造する場合と比較して、塗布針を用いてその先端表面に付着した溶液を塗布する構成であるため、溶液が目詰まりすることがなく、細胞集合体の解像度および形成速度が向上し、より少ないサンプル量（試料）で信頼性の高い細胞チップおよび細胞組織チップを確実に製造することができる。また、従来のプリンタを用いた場合に比較して、高粘度の細胞分散液を対象物に対して塗布して、細胞チップおよび細胞組織チップを製造しているため、塗布後の細胞分散液における蒸発を抑えることができ、高い細胞生存率を維持することができる。

本発明における微細塗布装置においては、先端に極微量な塗布液を付着させた針（塗布針）を塗布対象物（培養容器等）に接触させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量となる液滴を高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布することができる。また、塗布液の粘度としては、１×１０^５ｍＰａ・ｓまでの材料を塗布することが可能であり、高粘度の細胞分散液の塗布が可能となる。

本発明によれば、例えば２液性ゲル化剤により細胞集合体を製造することが容易なものとなり、大量の細胞集合体を高精度に製造することができる。更に、本発明によれば、粘性の高い細胞含有ゲル化剤が材料であったとしても、所望の細胞チップおよび細胞組織チップを短時間（高速度）で大量に製造することができ、製造された細胞チップおよび細胞組織チップにおいて所望の細胞密度を有して高い細胞生存率を維持することができる。

この結果、本発明によれば、高粘度の細胞分散液を塗布対象物（培養容器等）に対して所定の位置に精密塗布することが可能となり、任意のパターニングを有する細胞チップ、細胞を立体的に造形した細胞組織チップを製造することができる。この結果、製造された細胞チップおよび細胞組織チップは、薬剤の薬効、安全性の評価のスクリーニング等の創薬研究および再生医療の分野において利用できる。

本発明をある程度の詳細さをもって実施形態において説明したが、この構成は例示であり、この実施形態の開示内容は構成の細部において変化してしかるべきものである。本発明においては、実施形態における要素を他の要素との置換、組合せ、および順序の変更は請求された本発明の範囲及び思想を逸脱することなく実現し得るものである。

本発明に係る細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法は、信頼性の高い様々な細胞チップおよび細胞組織チップを大量に製造することができるため、創薬研究および再生医療を研究する上でも重要な技術であり、産業上の利用可能性が高い発明である。

１ 微細塗布装置
２ 本体ベース
３ ＸＹテーブル
４ 塗布ユニット
４Ａ 第１塗布機構
４Ｂ 第２塗布機構
５Ａ 観察光学系装置
５Ｂ 評価系装置
６ 培養容器
７ 塗布針
７Ａ 第１塗布針
７Ｂ 第２塗布針
８ 針保持部
９ 針部
９ａ 先端
１０ 塗布液容器
１０Ａ 第１塗布液容器
１０Ｂ 第２塗布液容器
１０ａ 塗布液溜り
１０ｂ 上部孔
１０ｃ 下部孔
１１ 塗布液
１１Ａ 第１塗布液（細胞含有溶液：第１ゲル化剤）
１１Ｂ 第２塗布液（第２ゲル化剤）

Claims (15)

1. 細胞を含む第１塗布液を貯留する第１塗布液容器と、
   前記第１塗布液容器に貯留された前記第１塗布液に浸漬可能な第１塗布針と、
   第２塗布液を貯留する第２塗布液容器と、
   前記第２塗布液容器に貯留された前記第２塗布液に浸漬可能な第２塗布針と、を備えた微細塗布装置を用いた細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法であって、
   前記第１塗布液容器に貯留された前記第１塗布液に前記第１塗布針における少なくとも先端を浸漬して、前記第１塗布針の先端に前記第１塗布液を保持させる工程、
   前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液を塗布対象物に接触させて、塗布対象物に前記第１塗布液を塗布する工程、
   前記第２塗布液容器に貯留された前記第２塗布液に前記第２塗布針における少なくとも先端を浸漬して、前記第２塗布針の先端に前記第２塗布液を保持させる工程、および
   前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液を塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触させる工程、
   を含む、細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
2. 前記第１塗布液と前記第２塗布液とが接触して反応し、ゲル化する工程、を含む、請求項１に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
3. 前記第２塗布針の先端直径が、前記第１塗布針の先端直径より大きく構成された、請求項１または２に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
4. 前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液が接触塗布される塗布速度が、前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液が塗布対象物に接触塗布される塗布速度より遅くなるよう設定された、請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
5. 前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液が、塗布対象物に接触する直前で前記第１塗布針の塗布速度を遅くして接触させる工程と、
   前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液が、塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触する直前で前記第２塗布針の塗布速度を遅くして接触させる工程と、を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
6. 前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液が塗布対象物に接触する直前で、前記第１塗布針を一旦所定時間停止後に停止前の塗布速度より遅くして接触させる工程、を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
7. 前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液が塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触する直前で、前記第２塗布針を一旦所定時間停止後に停止前の塗布速度より遅くして接触させる工程、を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
8. 前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液を塗布対象物に接触させて、塗布対象物に前記第１塗布液を接触させてから所定時間経過後に、前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液を塗布対象物に塗布された前記第１塗布液に接触塗布させる工程、を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
9. 前記第１塗布針の先端に前記第１塗布液を保持させる工程と、前記第１塗布針の先端に保持された前記第１塗布液を塗布対象物に塗布する工程と、を複数回繰り返した後、前記第２塗布針の先端に保持された前記第２塗布液を、塗布対象物の前記第１塗布液に接触させる工程、を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
10. 前記第１塗布液と前記第２塗布液が２液混合のゲル化剤である、請求項１から９のいずれか１項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
11. 前記第２塗布針の塗布時の塗布対象物からの高さが、前記第１塗布針の塗布時の塗布対象物からの高さより高く設定された、請求項１から１０のいずれか１項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
12. 前記第１塗布針により前記第１塗布液を塗布対象物に塗布する工程を複数回繰り返すとき、前記第１塗布針の塗布時の塗布対象物からの高さを徐々に上昇させるよう設定された、請求項９に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
13. 前記第１塗布針および前記第２塗布針の先端は、塗布時の移動方向に直交する平面を含むよう構成された、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
14. 前記第１塗布針が前記第１塗布液容器を貫通して前記第１塗布液を塗布対象物に塗布し、前記第２塗布針が前記第２塗布液容器を貫通して前記第２塗布液を塗布対象物に塗布するよう構成された、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。
15. 前記第１塗布液における細胞としては、未修飾の細胞または修飾された細胞が用いられる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の細胞チップおよび細胞組織チップの製造方法。

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