DE19937102A1 - Gewebeersatz und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Gewebeersatz, der geeignet ist zur Transplantation und aus einem partikelförmigen, bioresorbierbaren Trägermaterial besteht, das mit wenigstens einem Wachstumsfaktor beladen und mit Zellen besiedelt ist. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines derartigen Gewebeersatzes.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Gewebeersatz, der zur Transplantation geeignet ist, sowie Verfahren zu seiner Herstellung.

Nicht heilende chronische und großflächige Wunden der Haut stellen ein großes therapeutisches und sozioökonomisches Problem dar. Eine erfolgversprechende und zum Teil noch in der Entwicklung befindliche Therapiemöglichkeit dieser Probleme besteht in der Transplantation von kultivierten Keratinozyten. Diese werden zur Deckung großflächiger Wunden als autologe oder allogene Transplantate eingesetzt. Konventionelle Verfahren verwenden mehrschichtige Zellagen als sogenannte "sheets" (Cultured Epithelial Autografts = CEA).

Probleme bei Anwendung der CEA betreffen die spontane Blasenbildung und mangelnde Anheftung der Keratinozyten, ausgedehnte Wundkontraktionen und Mißerfolge bei der Regeneration einer Dermis-äquivalenten Schicht sowie mechanische Instabilität. Das Anwachsen der Transplantate, die sogenannte "take"-Rate, erfüllt nicht die Erwartungen.

In den letzten Jahren hat sich die Grundlagenforschung auf dem Gebiet des "Tissue Engineering" bei Hautersatzverfahren mehr in Richtung der Züchtung von Einzelzellen anstelle von ausdifferenzierten Zellplatten ("sheet grafts") gewandelt. Neuere Entwicklungen bestehen in der Verwendung kultivierter Keratinozytensuspensionen in Fibrinkleber. Die Verwendung von Keratinozyten-Einzelzellsuspensionen in Fibrinklebermatrix kann nachweislich experimentell und klinisch eine Epidermis mindestens der gleichen Qualität rekonstituieren wie "sheet grafts".

Die Zellen werden in Kulturflaschen vermehrt und müssen vor der Transplantation enzymatisch von der Kulturflasche abgelöst werden. Dabei werden proteolytisch Haftmoleküle zerstört, die für eine spätere Haftung auf dem Wundgrund wichtig sind. Das führte dazu, daß transplantierbare und zumindest teilweise resorbierbare Trägermaterialien verwendet werden. Beispiele sind Platten aus Hyaluronsäure, Kollagen oder mit Kollagen beschichtetem Nylon. Dabei kann aber nur eine begrenzte Anzahl von Zellen auf die Wunde aufgebracht werden. Außerdem ist das Verhältnis Material/Zelle auf der Seite des Materials, was Probleme bei der Bildung der neuen Epidermis bereiten kann.

Bislang sind jedoch keine bioresorbierbaren Mikrosphären als Träger für die Zellen eingesetzt worden. Nicht-resorbierbare Mikrosphären, beispielsweise aus Dextran, werden nicht abgebaut, was zu starken Entzündungsreaktionen führt, die die Wundheilung behindern. Daher werden erfindungsgemäß nur Materialien verwendet, die vollständig bioresorbierbar sind.

Den Zellen können physiologische Wachstumsfaktoren zur optimalen Proliferation und zur zeitgerechten Ausdifferenzierung zur Verfügung gestellt werden. Hierzu können verschiedene Methoden angewendet werden, die Plasmide mit Wachstumsfaktorgenen in die transplantierten Zellen einschleusen. Versuche haben gezeigt, daß die Wundheilung durch die Expression von Wachstumsfaktoren beschleunigt ist. Die Methode ist jedoch relativ kompliziert, außerdem bestehen Bedenken, was die Transfektionseffizienz und -stabilität, die Überlebensrate der Zellen und toxikologische Gefahren angeht. Grundsätzlich besteht sogar die Möglichkeit der Tumorinduktion. Erfindungsgemäß werden daher die Wachstumsfaktoren bevorzugt als Substanz zugegeben.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, einen vorteilhaften Gewebeersatz bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Gewebeersatz, der geeignet ist zur Transplantation und aus einem polymeren Trägermaterial besteht, das mit Zellen besiedelt ist. Dabei weist das polymere Trägermaterial Partikelform auf, so daß die Zellen nach Besiedelung des Trägermaterials als Suspensionskultur kultiviert werden können. Das Trägermaterial ist bioresorbierbar und mit wenigstens einem Wachstumsfaktor beladen.

Der erfindungsgemäße Gewebeersatz besitzt die Vorteile, daß er transplantierbar ist, gut verträglich ist, genügend Zellen bereitstellt, auf enzymatische Methoden zur Ablösung von Zellen verzichtet und in dosierter Weise Wachstumsfaktor liefert, so daß eine verbesserte Wundheilung erreicht werden kann.

Der Begriff "Gewebe" umfaßt im allgemeinen Sprachgebrauch Epithelgewebe, Binde- und Stützgewebe, Muskelgewebe und Nervengewebe. Der Begriff "Gewebe" im Sinne der Anmeldung ist jedoch weiter zu fassen. Ein Gewebeersatz soll somit nicht nur beispielsweise Epithel- oder Bindegewebe ersetzen, sondern allgemein räumlich benachbarte Zellen und ihre Interzellularsubstanzen. Beispielsweise soll ein Hautersatz sowohl Epithel- als auch Bindegewebe ersetzen.

Das Trägermaterial weist Partikelform auf, dabei können verschiedenste geometrische Formen vorkommen. Die Partikel des Trägermaterials können annähernd Kugelform aufweisen, aber auch langgestreckt, scheibenförmig oder ohne definierte geometrische Form sein. Der Durchmesser der Partikel ist in der Regel kleiner als 1 mm. Bevorzugt haben die Partikel einen Durchmesser von 50 bis 1000 µm, am bevorzugtesten 100 bis 250 µm. Als Durchmesser ist hier die größte, längenmäßige Ausdehnung des Partikels zu verstehen. Bevorzugt weisen die Partikel eine Oberfläche auf, die gut von Zellen besiedelt werden kann.

Erfindungsgemäß ist das Trägermaterial mit Zellen besiedelt. Vorzugsweise handelt es sich bei den Zellen um Hautzellen, so daß der Gewebeersatz als Hautersatz eingesetzt werden kann. Am bevorzugtesten sind die Zellen menschliche Keratinozyten. Die Partikelform des Trägermaterials gewährleistet, daß nach Besiedelung des Trägermaterials mit Zellen die Zellen in Suspensionskultur weiterkultiviert werden können. Die erfindungsgemäße Form ermöglicht somit eine effiziente Zellvermehrung und damit ein günstiges Verhältnis von Zellzahl zu Trägermaterial. Das partikelförmige Trägermaterial wird im folgenden auch als Mikrosphären bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Trägermaterial wird nach Transplantation vom tierischen oder menschlichen Körper resorbiert. Bevorzugt findet die Resorption innerhalb 50 Tagen statt und noch bevorzugter innerhalb von 25 Tagen. Durch die Bioverträglichkeit des Trägermaterials und die Möglichkeit der Resorption werden Fremdkörperreaktionen und Entzündungen minimiert. Bevorzugte Trägermaterialien sind Hyaluronsäure, Hyaluronsäurederivate, Fibrin, Rinderkollagen, Kollagen-GAG (Glycosaminglycan) Substrate.

Ein besonders bevorzugtes polymeres Trägermaterial besteht aus Polylactid. Polylactid ist ein lineares Polyester-Polymer auf Basis von Milchsäure. Es kann durch Polymerisation aus Lactid hergestellt werden. Lactid ist ein zyklischer Ester aus zwei Molekülen Milchsäure, der durch Hochtemperatur-Destillation von Milchsäure erhältlich ist. Polylactid ist - wie andere aliphatische Polyester, die auf natürlich vorkommenden Substanzen beruhen - vom tierischen und menschlichen Körper abbaubar und damit bioresorbierbar.

Die Mikrosphären sind mit wenigstens einem Wachstumsfaktor beladen. Deshalb wird wenigstens ein Wachstumsfaktor freigesetzt, während die Mikrosphären resorbiert werden. Wachstumsfaktoren sind Substanzen, die die Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen stimulieren können. In der Regel handelt es sich um Proteine, es gibt jedoch auch niedermolekulare Wachstumsfaktoren, die keine Proteine sind. Die Anwesenheit von Wachstumsfaktor in der Wundflüssigkeit stimuliert die Zellen zur Proliferation und gegebenenfalls zur Ausdifferenzierung, was die Wundheilung beschleunigt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann während der Freisetzung des Wachstumsfaktors eine Wachstumsfaktorkonzentration in der Wundflüssigkeit von 100 bis 1000 pg/ml erreicht werden, vorzugsweise eine Konzentration von 200 bis 400 pg/ml. Die angegebenen Konzentrationswerte wurden als vorteilhaft im Fall von EGF gefunden. Auch Konzentrationen außerhalb dieser Bereiche können aber stimulierende Wirkung ausüben und gehören zum Bereich der Erfindung. Dem Fachmann ist auch klar, daß verschiedene Wachstumsfaktoren in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen wirksam sein können. Ein wichtiges Kriterium dafür kann beispielsweise die Affinität des Wachstumsfaktors zu seinem Rezeptor sein. Somit sind die angegebenen Konzentrationsbereiche nicht als limitierend anzusehen.

Als Wachstumsfaktoren können alle Wachstumsfaktoren, die für die Wundheilung von Bedeutung sind, eingesetzt werden, insbesondere TGF (Transforming Growth Factor)-beta 1 und 2, bFGF (basic Fibroblast Growth Factor), KGF (Keratinocyte Growth Factor), PDGF (Platelet derived Growth Factor)-AB, VGF (Vascular Growth Factor), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Bevorzugt ist epidermaler Wachstumsfaktor (EGF).

Die Freisetzung des Wachstumsfaktors erfolgt bevorzugt nicht aufgrund der Expression eines Wachstumsfaktorgens, das in die Zellen eingebracht worden ist, vielmehr sind die Mikrosphären mit Wachstumsfaktor-Protein beladen. Vorzugsweise ist der Wachstumsfaktor in den Mikrosphären homogen verteilt, so daß es während der Resorptionsphase zu einer kontinuierlichen, gleichmäßigen Wachstumsfaktorfreisetzung kommt.

Der erfindungsgemäße Gewebeersatz ermöglicht es, daß schnell Zellen aus einer Biopsie vermehrt und kultiviert werden können und in großer Anzahl zur Verfügung gestellt werden können. Das bioresorbierbare und bioverträgliche polymere Trägermaterial führt zu besonders niedrigen Fremdkörper- bzw. Entzündungsreaktionen, was die Wundheilung fördert. Schließlich führt die Freisetzung von Wachstumsfaktor(en) während der Resorption zu einer Stimulation der Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen in räumlicher Nähe, was die Wundheilung ebenfalls positiv beeinflußt. Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal einen Gewebeersatz, vor allem einen Hautersatz zur Verfügung, der die genannten vorteilhaften Eigenschaften aufweist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebeersatzes. Erfindungsgemäß werden dabei zunächst Zellen bereitgestellt, mit denen partikelförmiges, bioresorbierbares, polymeres Trägermaterial besiedelt wird. Das Trägermaterial wurde bevorzugt zuvor mit wenigstens einem Wachstumsfaktor beladen.

Die Bereitstellung der Zellen erfolgt vorzugsweise aus einer Biopsie. Bei den Zellen handelt es sich vorzugsweise um Hautzellen, am bevorzugtesten um menschliche Keratinozyten. Die Keratinozyten können beispielsweise aus einer Biopsie der Leistengegend gewonnen werden. Alternativ hierzu können die Zellen auch von geeigneten Zellkulturen, die von Zellinien abstammen, geliefert werden. Die eingesetzten Zellen sind daher bevorzugt autolog, aber auch geeignete allogene Zellen können verwendet werden.

Als weitere Zelltypen, vor allem um zusammengesetzte Hautäquivalente zu konstruieren, sind zur Anzüchtung auf den Carriern und zur Transplantation Fibroblasten und Endothelzellen geeignet. Aber auch außerhalb der Therapie von chronischen Wunden können Neurozyten zur Regeneration von Nerven und Adipozyten zur Auffüllung von Fettgewebsdefekten eingesetzt werden.

Vor der Besiedelung des Trägermaterials können die isolierten Zellen in Kultur vermehrt werden.

Die Herstellung des polymeren Trägermaterials erfolgt bevorzugt durch in vitro-Polymerisation von monomeren Bestandteilen. Mögliche Trägermaterialien sind Hyaluronsäure, Hyaluronsäurederivate, Fibrin, Rinderkollagen, Kollagen-GAG (Glycosaminglycan) Substrate oder Mischungen dieser Materialien. Am bevorzugtesten wird Polylactid eingesetzt.

Die Sphären können beispielsweise durch das sogenannte Aerosol solvent extraction system (ASES) hergestellt werden. Hierbei macht man sich eine Extraktionsmethode zunutze, bei der das Polymer in einer organischen Phase gelöst ist. Diese Suspension wird in eine superkritische Gasphase gesprayt. Dann muß das organische Lösungsmittel extrahiert werden, wonach Mikrosphären des Polymers übrigbleiben.

Vorzugsweise wird das Trägermaterial mit Wachstumsfaktor beladen, indem der Wachstumsfaktor während des Polymerisationsvorganges dem Trägermaterial zugegeben wird. Dadurch wird eine gleichmäßige Verteilung des Wachstumsfaktor- Proteins in dem Trägermaterial erreicht. Die Verfahrensbedingungen müssen so eingestellt werden, daß der Wachstumsfaktor nicht inaktiviert wird.

Alternativ können bereits gefertigte Mikrosphären mit dem Wachstumsfaktor beschichtet werden. Hierzu kann eine geeignete Konzentration des Wachstumsfaktors in eine geeignete Beschichtungslösung, beispielsweise eine Kollagenlösung eingebracht werden und bei der Beschichtung mit auf die Sphärenoberfläche gebracht werden.

Um die Anheftung der Zellen zu verbessern, kann das polymere Trägermaterial mit Substanzen beschichtet werden, die die Adhäsion von Zellen an Substraten begünstigen, beispielsweise Kollagen oder Fibronektin.

Das polymere Trägermaterial kann schließlich durch Zellen besiedelt werden, das besiedelte Trägermaterial kann daraufhin weiterkultiviert werden, so daß die Zellen auf der Oberfläche proliferieren können. Die Kultivierung der besiedelten Trägermaterialien erfolgt in Suspensionskultur in sogenannten "Spinnerkulturen". Dabei handelt es sich meist um Gefäße, die um eine Achse kontinuierlich rotieren, oder um Gefäße, die einen "Klöppel" aufweisen, der von einem Magnetrührgerät angetrieben wird, so daß die Suspension kontinuierlich durchmischt wird.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

Beispiel 1 Herstellung, Beladung und Beschichtung der Mikrosphären

Die Herstellung der PLA-Mikrosphären erfolgt mittels einer modifizierten Doppel-Emulsion-Lösungs Technik: 4 g D,L-Lactid (RG 202 H, Fa. Boehringer Ingelheim, BRD) werden in 4 ml Dichlormethan (Fa. Merck, Darmstadt, BRD) in einem handelsüblichen Reagenzglas vollständig aufgelöst. Das zur Beladung verwendete humane rekombinante EGF (epidermal growth factor) (Fa. Sigma U.S.A.) wird in 100 µl PBS aufgelöst und dem PLA-Dichlormethan-Gemisch beigemengt. Durch anschließendes Homogenisieren auf einem Vortex-Gerät erreicht man eine gleichmäßige Verteilung.

Die Herstellung der Placebo Mikrosphären erfolgt durch Zugabe von PBS ohne rekombinantes EGF.

Dieser Lösung wird 10 ml einer 0,5%igen wäßrigen Polyvinylalkohollösung (PVA 25/40, Molekulargewicht 80000, Fa. Serva) zugesetzt und für 30 Sekunden auf einem Vortex-Gerät homogenisiert. Durch diese Homogenisationsdauer erhält man ein Maximum an Trägern mit der zur Zellkultivierung optimalen Größe von 100 bis 250 µm.

Die Emulsion wird in 500 ml einer 2%igen Isopropanollösung überführt und für 5 Stunden auf einer Magnetrührplatte mit einem 5 cm langen Rührstab gerührt. Durch das Auswaschen des Dichlormethans in die äußere alkoholische Phase präzipitiert das aufgelöste Polymer und die noch weichen Mikrosphären verfestigen sich.

Um Träger zu entfernen, die größer oder kleiner als die gewünschte Größe sind, spült man die entstandenen Mikrosphären mit 5 l destilliertem Wasser durch zwei hintereinandergeschaltete Analysesiebe (Fa. Retsch, BRD) mit der Maschenweite 250 µm und 106 µm.

Anschließend werden die Mikrosphären in ein Kolbenglas (Duran) gegeben, in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und für 36 bis 48 Stunden in einem Lyophilisator (Alpha 1-4, Fa. Christ, BRD) gefriergetrocknet. Dies hat zum einen den Zweck, daß die Mikrosphären einfacher zu handhaben sind, zum anderen verdampfen die letzten Reste des zelltoxischen Dichlormethans.

Die Beschichtung der Mikrosphären erfolgt kurz vor Aufbringen der Zellen. Ein Gramm der hergestellten Mikrosphären werden mit 20 ml einer 5% Gelatine Lösung (Bacto Gelatin, Fa. Difco) in einem sterilen 50 ml Röhrchen (Fa. Greiner) für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Um eine mögliche Verklumpung oder Verklebung der Sphären zu vermeiden und eine gleichmäßige Beschichtung zu erhalten, müssen die Träger durch einen Schütteltisch (KS 501 digital, Fa. Ika Labortechnik) bei 150 Umdrehungen/Minute ständig in Suspension gehalten werden. Danach pipettiert man den Gelatineüberstand nach dem Absedimentieren der Träger vorsichtig ab.

Beispiel 2 Nachweis der Bioverträglichkeit und Resorbierbarkeit der Trägermaterialien (Tierversuch)

Als Versuchstiere werden athymische Nacktmäuse verwendet.

Auf dem Rücken der Versuchstiere wird eine sternförmige Hautinzision angebracht. Die Haut wird vorsichtig mobilisiert und eine nach unten offene Siliconglocke von 1 cm Durchmesser implantiert (Wundkammer nach Fusenig). Die definierte Wunde, die von der Kammer bedeckt wird, ist 1 cm im Durchmesser. Der Rand der Kammer wird mit vier Einzelknopffäden fixiert und somit abgedichtet. In die Kammer kann Kulturmedium über eine Injektion eingebracht und Flüssigkeit zur laborchemischen Untersuchung abgesaugt werden.

Die Polylactidpolymer Sphären sollen zunächst auf ihre Bioverträglichkeit und auf ihre Abbaubarkeit hin untersucht werden. Hierzu können sterile Proben des Materials sowohl in Nacktmäuse als auch als immunkompetente Kontrolle in Ratten subcutan über eine Hautinzision eingebracht werden. Es werden je vier Versuchstiere eingesetzt und nach 14, 21, 35 und 56 Tagen die Stelle der Implantation nekropsiert und histologisch untersucht.

Die Mikrosphären wurden in zwei Monaten resorbiert, es konnten nur sehr geringe Entzündungsreaktionen nachgewiesen werden. Das Material weist sehr gute Verträglichkeit auf.

Beispiel 3 Kultivierung von Keratinozyten auf Mikrosphären

Humane Haut aus dem plastisch-chirurgischen Operationssaal wird in ein steriles Röhrchen (Fa. Greiner) mit Transportmedium (Hank's Buffered Salt Solution, HBSS, Fa. Seromed) und Gentamycin (Fa. Gibco) in bakerizider Konzentration von 20 µg/ml gegeben.

Dann wird eine serumfreie Keratinozytenkultur nach Boyce (Boyce 1983) hergestellt: Nach ausgiebiger Reinigung der Gewebeproben aus dem OP durch Spülung mit Pufferlösung und kurzem Abspülen mit 70%igem Alkohol wird das von Fettgewebe gereinigte Hautstück bei 4°C über Nacht in 10%iger Dispaselösung inkubiert. Nach Ablösung der Epidermis und Herstellen einer Einzelzellsuspension mit 0,05% Trypsin, wird eine Primärkultur mit Keratinozytenmedium der Fa. Gibco angesetzt und in 75 cm² Gewebekulturflaschen ausgesäht. Bei 80% Konfluenz wird die erste Trypsinpassage hergestellt.

Die Zellen werden dann in Zellkulturflaschen unter den üblichen Bedingungen inkubiert. Beispielsweise werden die Zellen in Keratinozytenmedium der Fa. Gibco bei 37°C und einer Standardatmosphäre mit 5% CO₂ bebrütet. Zur Kultur der Zellen auf den Mikrosphären werden die Zellen nach erneuter Subkonfluenz trypsinisiert und zu den in einem speziellen Spinnersystem enthaltenen, wie oben angefertigten, Mikrosphären gegeben. Vorversuche mit anderem Sphärenmaterial haben einen bestimmten Rührmodus ergeben, der auch hier eingehalten wird (Voigt, 1996).

Das optimale Zell/Carrier Verhältnis ist nach eingehenden Vorversuchen etwa 15 zu 1. Damit werden in eine 500 ml Spinnerflasche (Fa. Integra Biosiences) 2 × Zellen in 75 ml Keratinozytenmedium gegeben und in einer, in Vorversuchen optimierten Rührintervallen (Cellspinn Rühreinheit der Fa. Integra Biosiences), mit der entsprechenden Carrierzahl in Suspension gehalten. Der Rührmodus entspricht einer Geschwindigkeit mit 30 RPM. Die Drehrichtung wurde während der ersten Rührphase (6 Stunden) verändert, um den Zellen die Möglichkeit zu geben auf den Carriers zu haften, und zwar von rechts nach links nach einem Rotationswinkel von insgesamt 1260°. Nach 4 Stunden sind alle vitalen Zellen in der Kultur an den Carriern adhärent und beginnen sich auf der Kügelchenoberfläche zu teilen. Nach 7 Tagen waren alle Sphären voll bewachsen, die Schicht auf der gebogenen Oberfläche ist konfluent.

Beispiel 4 Eignung von beschichteten Trägermaterialien als Kulturoberfläche

Kollagen-beschichtete Polylactid-Mikrosphären wurden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Mikrosphären wurden mit Keratinozyten beladen wie in Beispiel 2 beschrieben. Als Kontrolle wurden Mikrosphären eingesetzt, die nicht mit Kollagen beschichtet waren. Im Ergebnis zeigen die beschichteten Mikrosphären eine bessere Anhaftung von Keratinozyten als unbeschichtete.

Tabelle 1

Zellanhaftung bei Polyactidcarriern mit und ohne Beschichtung mit Rinderkollagen Typ 1. Es wurden drei unterschiedlichen Versuchsansätze ausgewertet und die Mittelwerte angegeben.

Beispiel 5 Mit Keratinozyten besiedelte Mikrosphären als Hautersatz (Tierversuch)

Mit Keratinozyten besiedelte Mikrosphären wurden als subkonfluente Kultur auf eine Vollhautwunde am Nacktmausrücken aufgebracht und mit einer Wundkammer nach Fusenig (siehe Beispiel 2) bedeckt.

Die Versuchstiere werden in speziellen Käfigen gehalten und mit speziellem antibiotikahaltigem Futter (üblich als Prophylaxe bei athymischen Nacktmäusen) ernährt. Die Biopsietage waren in dieser Gruppe 7, 14, 21, 28, 35 und 56. Die Histologie zeigte einen Transfer der Keratinozyten auf die Mauswunde an Tag 7, einen Verschluß des Epithels an Tag 14 mit unterhalb des Epithels reizlos liegenden Carriern. Teilweise sind die Carrier mit einer Epithelzellschicht dicht an der Epidermis und haben Kontakt zur Oberfläche.

Hiermit konnte gezeigt werden, daß die Transplantation von Keratinozyten und die Rekonstitution einer Epidermis entsprechend den alternativen, etablierten Transplantationsverfahren in diesem System gelingt.

Beispiel 6 Protokoll zum Nachweis der EGF-Freisetzung in vitro

Der Polylactidrohsubstanz werden verschiedene Konzentrationen rekombinanten Wachstumsfaktors (epidermal growth factor EGF) (Fa. Sigma) zugesetzt. Die Mikrosphären werden dann wie in Beispiel 1 hergestellt. Zur Überprüfung der Freisetzung werden dann 2 ml in PBS resuspendierte Sphären in eine 6 Lochplatte verteilt. Der Überstand wird über 6 Tage alle 24 h komplett gewonnen und durch 2 ml PBS erneuert. Der Überstand wird dann mittels Gel Elektrophorese auf die EGF-Konzentration untersucht.

Beispiel 7 Protokoll zum Nachweis der Bioaktivität des freigesetzten EGF ("Doppelkammerversuch")

Um die Bioaktivität des gemessenen EGF zu eruieren kann ein Doppelkammerversuch eingesetzt werden: Hierbei wird eine Zellkulturschale mit 50 000 Keratinozyten inoculiert. Die Kulturschale ist so gefertigt, daß sie einen Einsatz aufnehmen kann, dessen Boden im Medium der Zellkultur ca. 0,5 cm über den Zellen hängt. In diesen Einsatz wird eine geeignete Zahl (entsprechend Versuch in Beispiel 6) wachstumsfaktortragender Mikrosphären gelegt. Die Proliferation der Zellen auf dem Kulturschalengrund wird gemessen und mit Kontrollgruppen mit unterschiedlichen Wachstumshormonkonzentrationen und Leerkontrollen verglichen. Zur Messung der Proliferation stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Möglich ist die Auszählung der Zellen zu festgelegten Zeitpunkten der Zellkultur. Eleganter ist eine Methode, bei der ein Substrat mitochondrial in einen Farbstoff umgesetzt wird und dann photometrisch (z. B. bei 490 nm) ausgewertet werden kann (z. B. MTS Test: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium wird in Formazan umgewandelt).

Claims (17)

1. Gewebeersatz, der geeignet ist zur Transplantation, umfassend ein polymeres Trägermaterial, das mit Zellen besiedelt ist, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) das polymere Trägermaterial Partikelform aufweist, so daß die Zellen nach Besiedelung des Trägermaterials als Suspensionskultur kultiviert werden können,
• b) das Trägermaterial bioresorbierbar ist,
• c) das polymere Trägermaterial mit wenigstens einem Wachstumsfaktor beladen ist.

2. Gewebeersatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial hauptsächlich aus Polylactid besteht.

3. Gewebeersatz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel des polymeren Trägermaterials einen Durchmesser von etwa 100 bis etwa 250 µm aufweisen.

4. Gewebeersatz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Hautzellen sind.

5. Gewebeersatz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautzellen hauptsächlich Keratinozyten sind.

6. Gewebeersatz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen menschliche Zellen sind.

7. Gewebeersatz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) beladen ist.

8. Gewebeersatz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Freisetzung eines oder mehrerer Wachstumsfaktoren während der Bioresorption des Trägermaterials eine Wachstumsfaktorkonzentration von 200 bis 400 pg/ml in der Wundflüssigkeit erreicht werden kann.

9. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeersatzes, das folgende Schritte umfaßt:

• a) Bereitstellung von Zellen,
• b) Bereitstellung eines partikelförmigen, bioresorbierbaren, polymeren Trägermaterials, das mit wenigstens einem Wachstumsfaktor beladen ist,
• c) Besiedelung des polymeren Trägermaterials mit den Zellen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen aus einer Biopsie gewonnen werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor der Besiedelung des polymeren Trägermaterials in Zellkultur vermehrt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Hautzellen sind.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen menschliche Hautzellen sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen menschliche Keratinozyten sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial hauptsächlich aus Polylactid besteht.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Beladung des polymeren Trägermaterials mit Wachstumsfaktor dadurch erfolgt, daß der oder die Wachstumsfaktoren bei der Polymerisierung des Trägermaterials anwesend sind.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial vor der Besiedelung durch Zellen mit Kollagen beschichtet wird.