DE10127933A1 - Transplantat zur Abdeckung von Defekten in der Mundhöhle - Google Patents

Transplantat zur Abdeckung von Defekten in der Mundhöhle

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Transplantats zur Abdeckung von Defekten der Mundhöhle, bei dem man eine Membran, die eine mit einer Schicht aus Nylongewebe fest verbundene Silikonfolie umfaßt, in vitro mit Zellen besiedelt, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen. Die Erfindung betrifft auch ein Transplantat, das durch das Verfahren erhältlich ist und die Verwendung der Membran zur in vitro-Herstellung eines Transplantats.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Mundchirurgie, insbesondere die Herstellung von Transplantaten zur Defektdeckung im Bereich der Mundhöhle.
Zahnlosigkeit sowie die unphysiologische Belastung des Alveolarkammes durch Plattenprothesen führen zur Kieferatrophie und damit zum Verlust von Hart- und Weichgewebe. Einen extremen Gewebeverlust verursachen Resektionen von Kiefer und benachbartem Weichgewebe bei chirurgischer Tumortherapie. Um in diesen Situationen nach Gewebeverlust die Eingliederung von Zahnersatz zu ermöglichen und dadurch Kau- und Sprechfunktion zu ermöglichen, werden in der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie sogenannte präprothetische Operationen durchgeführt. Diese Eingriffe umfassen neben Operationen am Hartgewebe vor allem auch Operationen am Weichgewebe. Als Standardoperationstechniken werden Zungenlösung und vor allem die offene Vestibulumplastik durchgeführt. Diese Techniken sind auch häufig in Kombination mit Dentalimplantaten erforderlich, um im atrophierten oder wieder augmentierten Kiefer fixierte Gingiva periimplantär zu schaffen.
Bei all diesen Eingriffen wird eine Wundfläche mit Epitheldefekt geschaffen. Die epitheliale Abheilung solcher Defekte kann grundsätzlich auf zwei verschiedene Weisen erfolgen:
Zum einen durch Epithelzellmigration vom Rand der Wunde her als sekundäre Epithelisation; dies ist verbunden mit starker Schrumpfung. Zum anderen durch Deckung des Defektes mit epithelialem Gewebe in Form verschiedener Transplantate; hierdurch soll die narbige Schrumpfung verhindert und ein optimales Lager für den Zahnersatz geschaffen werden.
Als Routinetechniken für den Ersatz von Mundschleimhaut mit epithelialem Gewebe stehen die freie Transplantation von Spalthaut oder Schleimhaut zur Auswahl. Bei der Transplantation freier Spalthaut wird aber stets ortsfremdes Epithel in die Mundhöhle verpflanzt, das auch nach Jahren noch seine ursprünglichen Charakteristika zeigt, sich also nicht zu Mukosa differenziert. Schleimhauttransplante zeigen zwar diese Nachteile nicht, stehen aber nur begrenzt zur Verfügung.
Mit der Transplantation von autolog kultivierten Keratinozyten haben sich seit mehr als einem Jahrzehnt neue Möglichkeiten für die Therapie von Epitheldefekten ergeben. Für die Übertragung von kultivierten Hautkeratinozytentransplantaten und kultivierten Mundschleimhautkeratinozyten sind im Wesentlichen zwei Verfahren etabliert. Zum einen die sogenannte "Sheet"-Technik und zum anderen die Fibrinkleber-Zellmischungs-Technik.
Bei der "Sheet"-Technik werden die Zellen als Verband enzymatisch vom Kulturflaschenboden abgelöst. Zum Transfer und zur Aufbringung auf die Wunde wird das Keratinozyten-"Sheet" auf Vaselinegaze aufgenommen und auf den Hautdefekt übertragen. Durch das enzymatische Ablösen des kultivierten Epithelverbandes vom Kulturflaschenboden schrumpft dieser aber und es kann somit nur eine kleinere Wundfläche abgedeckt werden. Ein weiterer Nachteil der "Sheet"-Technik ist, dass der abgelöste kultivierte Epithelverband sehr leicht zerreißt, dadurch wird das Aufbringen auf eine Vaselinegaze schwierig. Der gesamte Epithelverband-Vaselinegaze-Komplex haftet nur unzureichend auf dem Wundgrund, insbesondere intraoral. Der Keratinozytenverband wird erst in einem ausgewachsenen konfluenten Stadium übertragen, das bedeutet, dass die Zellproliferation niedriger ist und die Wundheilung dadurch langsamer vonstatten geht.
Bei der Applikation von Gingivakeratinozyten in Fibrinkleber wird ein Zellverband in eine Einzelzellsuspension aufgelöst und dann Fibrinkleber beigemengt. Diese Methode ist hauptsächlich aus dem Anwendungsbereich der Haut bekannt und hat den Vorteil, dass eine raschere Wundheilung mit geringerer Schrumpfung stattfindet. Diese Methode ist aber in der Mundhöhle nicht anwendbar, da sich der Fibrinkleber in der feuchten Mundhöhle von der Schleimlhaut ablöst. Weiterhin unterbricht die Trypsinbehandlung unmittelbar vor der Transplantation die beginnende Konfiguration eines Gewebeverbandes und damit die Proliferation der Zellen.
US 5,885,829 offenbart Verfahren zur Kultivierung von Zellen auf verschiedenen synthetischen Matrices.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein vorteilhaftes Transplantat zur intraoralen Wundabdeckung zur Verfügung zu stellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine Nylon-Silikonmembran, die in vitro mit Mundschleimhautzellen besiedelt worden ist, sehr gut auf intraoralen Wunden anhaftet und ein rasches Abheilen der Wunde bewirkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines Transplantats zur Abdeckung von Defekten der Mundhöhle, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Membran, die eine mit einer Schicht aus Nylongewebe fest verbundene Silikonfolie umfasst, in vitro mit Zellen besiedelt, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Membran umfasst eine Silikonfolie, die vorzugsweise sehr dünn ausgebildet ist. Die Dicke der Silikonfolie beträgt üblicherweise 10-100 µm, vorzugsweise 50-60 µm. Fest mit der Silikonfolie verbunden ist eine Schicht aus Nylongewebe. Die Verbindung ist vorzugsweise mechanischer Art. Das Nylongewebe kann teilweise in die Silikonfolie eingearbeitet sein. Das Nylongewebe stellt vorzugsweise eine dreidimensionale Struktur von Nylonfasern dar. Blut und Serum aus einer Wunde können in dieser dreidimensionalen Nylonmatrix gerinnen, wodurch eine feste Verbindung der Membran zum Wundgrund entsteht. Als Nylon im Sinne der Anmeldung sind alle Polyamide zu verstehen, insbesondere Polymere, die durch Kondensation von Dicarbonsäuren mit Diaminen entstehen. Unter Silikonen im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind siliciumorganische Verbindungen zu verstehen. Die dünne Silikonfolie kann auch als für Wasser semipermeable Folie ausgebildet sein. Die Gesamtdicke der Membran beträgt 10-100 µm, vorzugsweise 50-60 µm.
Die Membran ist flexibel und passt sich dadurch leicht an Oberflächenunebenheiten an.
Die Membran kann auf der Seite des Nylongewebes weiterhin mit pharmazeutisch verträglichen Substanzen beschichtet sein, die die Adhärenz der Membran an die Wunde und/oder die Adhärenz von Zellen an die Membran in vitro erhöhen. Mögliche Beschichtungsmaterialien sind Laminin, Fibronektin, Kollagen oder weitere Bestandteile der extrazellulären Matrix. In einer besonderen Ausführungsform ist die Membran mit Kollagen oder einem oder mehreren Derivaten davon beschichtet. Vorzugsweise ist die Membran mit Peptiden beschichtet, die Fragmente von Schweinekollagen sind.
In der bevorzugtesten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Membran die Membran "Biobrane®" verwendet, die von der Firma Bertek Pharmaceuticals Inc. USA erhältlich ist. Biobrane® findet weite Anwendung auf dem Gebiet der Verbrennungsmedizin und dient dort zur Abdeckung von Verbrennungswunden.
Erfindungsgemäß wird zur Herstellung des Transplantats die Membran in vitro mit Zellen besiedelt, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen. Es kann sich um autologe oder allogene Zellen handeln, autologe Zellen sind aber bevorzugt. Die Zellen stammen vorzugsweise aus einer Biopsie der Mundschleimhaut. Als Gewebe der Mundhöhle kommen beispielsweise die Schleimhaut am harten Gaumen, im Bereich des Alveolarfortsatzes oder Trigonum retromolare in Frage. Aus solchen Gewebeproben können im Labor unter sterilen Bedingungen der epitheliale Anteil und der bindegewebige Anteil diseziert werden. Vorzugsweise wird die Membran in vitro mit Mundschleimhautkeratinozyten und/oder -fibroblasten besiedelt.
Üblicherweise werden die Keratinozyten und die Fibroblasten zunächst in der Primärkultur angezüchtet. Nach 12 bis 16 Tagen können die Zellen vom Boden der Kulturschale oder -flasche abgelöst und auf der Membran ausgesät werden. Als Medien kommen gängige Zellkulturmedien wie RPMI 1640 oder DMEM in Frage. Es kann auch Serum zugesetzt werden, vorzugsweise autologes Serum.
Als Zellpopulation sind hauptsächlich Mundschleimhautkeratinozyten und Mundschleimhautfibroblasten vorgesehen. Die Zellen können mit Markern (z. B. Cytokeratin für Epithelzellen oder Vimentin, Aktin für Fibroblasten) nachgewiesen werden. Dem Fachmann ist klar, dass es sich bei den auf die Membran zu übertragenden Zellen meist nicht uni 100% reine Zellpopulationen wie Keratinozyten oder Fibroblasten handelt. In der Regel sind die Zellen - aufgrund ihrer Herkunft aus einer Biopsie - mit anderen Zelltypen vermischt. Vorzugsweise enthalten die Zellpopulationen wenigstens 50% des angegebenen Zelltyps, bevorzugter wenigstens 75%, am bevorzugtesten wenigstens 90%.
Es ist auch möglich, Vorläuferzellen von Keratinozyten oder Fibroblasten zu isolieren und anschließend in Keratinozyten oder Fibroblasten zu differenzieren. Ein Verfahren zur Isolierung von Keratinozyten-Stammzellen über den Zelloberflächen-Phänotyp offenbaren beispielsweise Li et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3902-3907. Es ist grundsätzlich möglich, die Membranen auch mit Vorläuferzellen zu besiedeln.
Die Besiedelung der Membran mit Zellen erfolgt so, dass die Nylon-Seite der Membran besiedeltt wird, nicht die Silikonseite. In einer Ausführungsform wird die Membran im Wesentlichen mit Gingivakeratinozyten besiedelt. In einer anderen Ausführungsform wird die Membran zunächst mit Gingivakeratinozyten (104-106 Zellen/cm2, vorzugsweise ca. 105 Zellen/cm2) besiedelt und für weitere 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise 24 bis 36 Stunden kultiviert, damit sich die Keratinozyten an der Membran anheften können. Anschließend werden auf dem Membran-Keratinozytenverband Gingivafibroblasten ausgesät. Das resultierende Membran-Zellenkonstrukt wird weiterhin kultiviert. Die Kultivierung unter Vermehrung der auf der Membran aufgebrachten Zellen erfolgt in der Regel so lange, bis die Zellen 75 bis 85% Konfluenz erreicht haben. Vorzugsweise findet die Kultivierung bis zum subkonfluenten Stadium statt. Das fertige Transplantat kann nun zur Abdeckung eines intraoralen Defekts eingesetzt werden.
Eine Besonderheit des Transplantats liegt darin, dass es "upside down" mit der Membranseite nach außen und der Zellseite zur Wunde hin aufgelegt wird. Es zeigt sich dann folgende Schichtung: Wundfläche/Fibroblasten/Gingivakeratinozyten/Membran.
Dieses Transplantat wirkt als lebender Wundverband, der entsprechend der Größe und Gestalt der abzudeckenden Wundfläche zugeschnitten werden kann und eine raschere Abheilung bewirkt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers bereitgestelltes Transplantat zur Abdeckung von Defekten der Mundhöhle, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist.
Ein derartiges Transplantat ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine Membran enthält, die eine mit einer Schicht aus Nylongewebe fest verbundene Silikonfolie umfasst und mit Zellen besiedelt ist, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen.
Die verschiedenen Merkmale und bevorzugten Ausführungsformen der Membran des Transplantats sind bereits oben beschrieben worden. In einer Ausführungsform ist das Transplantat im Wesentlichen mit Gingivakeratinozyten besiedelt, in einer anderen Ausführungsform ist die Membran im Wesentlichen mit Gingivakeratinozyten und Gingivafibroblasten besiedelt, wobei die Gingivakeratinozyten eine Schicht bilden, die zwischen der Membran und einer Schicht aus Gingivafibroblasten liegt. Diese Anordnung trägt der besonderen Applikationsform Rechnung, bei der das Transplantat "upside down" auf die Wunde aufgelegt wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Membran, die eine mit einer Schicht aus Nylongewebe fest verbundenen Silikonfolie umfasst, zur in vitro-Herstellung eines Zellen enthaltenden Transplantats zur Abdeckung von Defekten in der Mundhöhle. Die Merkmale und besonderen Ausführungsformen der zu verwendenden Membran und Zellen wurden oben bereits dargestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Transplantat zur Verfügung, das wie Spalthauttransplantate oder Spaltschleimhauttransplantate zu übertragen ist. Im Gegensatz zu dem leicht zerreißlichen Epithelzellfilm auf Vaselingaze bei der "Sheet"-Technik ist der Verbund aus Gingivakeratinozyten und Gingivafibroblasten mit der Membran stabiler. Somit wird mit diesem Vorgehen eine wesentlich einfachere Übertragung gezüchteter Zellen möglich. Desweiteren wird aufgrund der Eigenschaften der Membran ein enger Kontakt der auf der Membran gezüchteten Zellen zur Wunde erzielt. Die Membran saugt sich gleichsam auf dem Wundgrund fest. Im Vergleich zu den konventionellen Methoden kann mit dieser Technik eine wesentlich größere Wundfläche über die Amplifikation in der Zellkultur aus einer kleinen Gewebeprobe abgedeckt werden. Die mit Zellen besiedelte Membran dient als lebende Wundabdeckung, durch die mit übertragenen Gingivakeratinozyten und Gingivafibroblasten eine schnellere Wundabheilung erreicht werden kann.
Fig. 1 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme (Phasenkontrast) von kultivierten Gingivakeratinozyten.
Fig. 2 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme (Phasenkontrast) von kultivierten Gingivafibroblasten.
Fig. 3 zeigt einen Schnitt durch ein erfindungsgemäßes Transplantat.
Gingivakeratinozyten, Nylonfasern und die Silikonfolie sind gekennzeichnet.
Fig. 4 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Transplantats. Es ist zu sehen, wie sich die Gingivakeratinozyten mit den Nylonfasern verbinden.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1 Gewinnung von Zelten
Für die Anzüchtung der Zellen wurde in der Regel gesundes Gewebe der fixen Gingiva verwendet, das in Lokalanästhesie Patienten anlässlich eines Routineeingriffs im Bereich der Schleimhaut entnommen wurde. Die Biopsien (Größe circa 10 mm2) stammten aus folgenden drei Regionen der Mundhöhle: Harter Gaumen, Bereich des Alveolarfortsatzes oder Trigonum retromolare. Die Gewebeproben bestanden aus Epithel und Anteilen des darunter liegenden Bindegewebes.
Unmittelbar nach Entnahme wurden die Proben in steriler Kochsalzlösung aufgenommen. Aus den Gewebeproben wurden im Labor unter sterilen Bedingungen unter der Lupenbrille der epitheliale Anteil und der bindegewebige Anteil diseziert. Der epitheliale Anteil wurde dann in kleinste Stücke zerschnitten, circa 1 mm groß, in steriler Kochsalzlösung gewaschen und in einer Zellkulturflasche ausgebracht. Der Boden der Kulturflasche wurde zunächst mit wenig Medium beschickt. Innerhalb weniger Tage wuchsen aus diesen kleinen Explantaten die Epithelzellen aus. Epithelzellen wachsen sehr viel rascher aus als die Fibroblasten. Für die Kultivierung der Gingivakeratinozyten wurde als Grundmedium "Dulbecco's modified eagle medium" (DMEM) mit "Ham's Salzen F12" im Verhältnis 3 : 1 benutzt. Es enthielt folgende Substanzen in den angegebenen Konzentrationen: 24 mg/l Adenin; 8,5 mg/l Choleratoxin; 10 mg/l epidermaler Wachstumsfaktor; 200 mg/l Hydrocortison; 5 mg/l Insulin; 1,36 mg/l Trijodothyronin; 5 mg/l Transferrin; 10,5 mg/l Spermin; 100 000 I.U. Penicillin G und 100 mg/l Streptomycin.
Zur Anzüchtung der Fibroblasten wurde das zuvor als Bindegewebe abgetrennte Material ebenfalls in ungefähr 1 mm große Stücke geschnitten und in Zellkulturflaschen ausgebracht. Die Kultivierung der Fibroblasten erfolgt mit RPMI 1640-Medium mit den antibiotischen Zusätzen 100 000 I.E./l Penicillin D und 100 mg/l Streptomycin.
Die Keratinozyten oder Fibroblasten wurden anschließend für 12 bis 16 Tage bei 37°C und 5% CO2 in wasserdampfgesättigter Atmosphäre kultiviert.
Beispiel 2 Kultivierung der Zeilen auf Biobrane®-Membran
Unter sterilen Kautelen wird eine Biobrane®­Membran (z. B. Größe 5 × 5 cm) in eine sterile Petrischale (Durchmesser 10 cm) gelegt. Die in Primärkultur für 12 bis 16 Tage gewachsenen Gingivakeratinozyten werden mit Trypsin in eine Einzelzellsuspension überführt. Die Zellen in der Einzelzellsuspension werden in DMEM 3 × gewaschen. Dann wird das Volumen der Suspension reduziert auf ca. 1 × 104 Zellen pro 100 µl Medium. Auf die Folienseite mit Nylonschlingen werden dann pro cm2 1 × 104 Zellen in 100 µl Medium ausgesät. Diese Tropfen der Zellsuspension werden für ca. 1 Stunde stehen gelassen. In dieser Zeit setzen sich die Zellen auf der Folie bzw. an den Nylonfäden ab. Dann wird die Folie zusätzlich mit serumhaltigem Medium überschichtet und für 12 bis 24 Stunden inkubiert.
Beispiel 3 Ergebnisse
Mit der in Beispiel 2 beschriebenen Methode können Gingivakeratinozyten und Gingivafibroblasten kultiviert werden. Die Gingivakeratinozyten sind an der pflastersteinförmigen Morphologie, die sie bei der Verwendung des DF-Mediums entwickeln, typischerweise zu erkennen (vergleiche Fig. 1).
Die Gingivafibroblasten sind an der typischen spindelförmigen Morphologie zu identifizieren (Fig. 2).
Die Besiedlung der Biobrane®-Membran mit 1 × 104 Zellen in 100 µl Medium pro cm2 führt zu einem Anhaften von Gingivakeratinozyten auf den Nylonschlaufen und auf der Folie (vergleiche Fig. 3 und 4).
Derart mit Gingivakerationozyten besiedelte Biobrane®-Membranen wurden als autologe Transplantate bei Vestibulumplastiken an Patienten eingesetzt. In der klinischen Verlaufsbeobachtung zeigten sich folgende Vorteile:
Bei der Applikation der Transplantatfolie zeigte sich eine sehr gute Anhaftung auf dem Wundgrund, so dass auf zusätzliche Maßnahmen zur Sicherung wie Überknüpfverband teilweise verzichtet werden konnte.
Ein weiterer Vorteil war in der Abheilung der Wundfläche zu sehen. Die Abheilung der Wundfläche anhand der Epithelisierung wurde dabei beurteilt. An 5 Patienten zeigten sich folgende Resultate, die in Tabelle 1 zusammengefasst sind.
In Tabelle 1 sind die Zeiträume bis zur kompletten klinischen Abheilung aufgeführt.
Tabelle 1
Zum Vergleich wurde die Abheilungsdauer bei Patienten bestimmt, deren epithelialer Defekt (bei anteriorer Vestibulumplastik) mit Schleimhaut vom Gaumen gedeckt wurde. Die dazu verwendete freie Schleimhaut wurde mit dem Mukotom vom Gaumen entnommen und zur Deckung auf die Wundfläche aufgebracht. Die in diesem Versuch bestimmte Abheilungsdauer ist in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Überraschenderweise heilt das erfindungsgemäße Transplantat (Tabelle 1) sogar schneller ab als Transplantate aus freier Schleimhaut (Tabelle 2).

Claims (21)

1. Transplantat zur Abdeckung von Defekten der Mundhöhle, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Membran enthält, die eine mit einer Schicht aus Nylongewebe fest verbundene Silikonfolie umfasst und mit Zellen, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen, besiedelt ist.
2. Transplantat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran mit Kollagen oder einem oder mehreren Derivaten davon beschichtet ist.
3. Transplantat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran mit Fragmenten von Schweinekollagen beschichtet ist.
4. Transplantat nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Gingivakeratinozyten, Gingivaepithelzellen und Gingivafibroblasten.
5. Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran im wesentlichen mit Gingivakeratinozyten besiedelt ist.
6. Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran im wesentlichen mit Gingivakeratinozyten und Gingivafibroblasten besiedelt ist, wobei die Gingivakeratinozyten eine Schicht bilden, die zwischen der Membran und einer Schicht aus Gingivafibroblasten liegt.
7. Transplantat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran in vitro von den Zellen besiedelt wurde.
8. Verfahren zur Herstellung eines Transplantats zur Abdeckung von Defekten der Mundhöhle, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Membran, die eine mit einer Schicht aus Nylongewebe fest verbundene Silikonfolie umfaßt, in vitro mit Zellen besiedelt, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen, von einer Biopsie der Mundschleimhaut stammen.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, die von einem Gewebe der Mundhöhle herstammen, im wesentlichen Gingivakeratinozyten und/oder Gingivafibroblasten sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor der Besiedelung der Membran in vitro kultiviert werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-11, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran im wesentlichen mit Gingivakeratinozyten besiedelt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran zunächst mit Gingivakeratinozyten besiedelt wird, anschließend für wenigstens 12 Stunden kultiviert wird und dann weiterhin mit Gingivafibroblasten besiedelt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-13, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Membran mit Kollagen oder einem oder mehreren Derivaten davon beschichtet ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit Fragmenten von Schweinekollagen beschichtet ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-15, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Aufbringen der Zellen auf die Membran das entstehende Membran-Zellkonstrukt in vitro unter Vermehrung der Zellen kultiviert wird, ohne daß Konfluenz der Zellen erreicht wird.
17. Transplantat, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 8-16.
18. Verwendung einer Membran, die eine mit einer Schicht aus Nylongewebe fest verbundene Silikonfolie umfasst, zur in vitro-Herstellung eines Zellen enthaltenden Transplantats zur Abdeckung von Defekten in der Mundhöhle.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran mit Kollagen oder einem oder mehreren Derivaten davon beschichtet ist.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran mit Fragmenten von Schweinekollagen beschichtet ist.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 18-20, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran für Wasser semipermeabel ist.
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