CN1546654A - 一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法，首先用软骨细胞分离培养或基质干细胞分离培养诱导为软骨细胞即获取种子细胞，然后取新西兰兔或人胚胎长骨和干骺端松质骨构建骨基质凝胶BMG，将分离培养收获的种子细胞按4－10万/mm2密度接种于皮质骨或松质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次即可。由于本发明采用骨基质明胶具有较好的生物相容性、可降解性，较强的诱导骨、软骨生长、分化作用的优势，克服植入体内后吸收过快、机械强度不足的问题；能够获得正常或接近正常结构与功能的骨软骨组织的良好效果。
Description
技术领域
本发明属于体外再建软骨组织，特别涉及一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法。
背景技术
目前国内外组织工程研究的进展为软骨疾病的研究和治疗开辟了新的途径，是未来医学由“替代”向“重建”转变的重要手段之一，其发展前景令人鼓舞。随着分子生物学和细胞生物学的飞速发展，对各种疾病的基础理论研究，已不仅在整体动物、离体器官和组织水平上，人们日益认识到，从分子和细胞水平，尤其从活组织细胞的角度研究细胞的形态和功能，对研究各种疾病的病因、发病机理、病理变化以及治疗等问题，具有非常重要的意义。组织工程是生物医学和材料科学交叉融合的产物，其含义是应用生命科学和工程学原理及方法，认识哺乳动物正常和病理组织的结构功能关系，研究、开发生物代用品，以修复、维持或改善人体组织和器官的形态和功能。目前国内外有个别报道用骨基质明胶(bone matrix gelatin，BMG)植入肌肉组织，能诱导骨、软骨生成。而目前的研究中尚存在不少问题亟待解决：1).种子细胞：组织工程的先决条件是足够数量的、具有再生能力和功能的种子细胞。软骨组织工程中软骨种子细胞的主要来源是软骨和间充质干细胞(是以骨髓为主的)；目前，国内外采用人或动物的软骨，用酶消化、分离、培养，能获得高存活率、高纯度、足够数量的软骨细胞，方法比较成熟。但软骨细胞长期培养、传代，容易发生去分化，逐渐变为扁平的成纤维细胞样细胞，丧失软骨细胞的分化表型。给予骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)等细胞因子，能促进软骨细胞的分化和保持其表型。骨髓间充质干细胞(亦有用脂肪基质干细胞、胚胎干细胞等)作为软骨种子细胞的来源，日益受到重视，分离的骨髓间充质干细胞加入TGF和成纤维细胞生长因子(FGF)培养，可分化为具合成分泌II型胶原等软骨特异性标记物的软骨细胞，用其修复关节软骨取得良好的效果。且因骨髓具有取材方便、对供体损伤小等优点，其应用前景更为看好。但骨髓基质干细胞是由多种细胞组成的，需要进一步纯化，并需选择合适的条件诱导其向软骨细胞分化。因此，如何在体内外调控软骨细胞的增殖、分化，并维持其表型特征是需要进一步研究的问题。2).三维细胞支架：种植软骨细胞的支架也是软骨组织工程成功的关键。支架材料应具有良好的生物相容性、无毒副作用、具多孔三维结构、生物可降解性、良好的细胞贴附界面、可塑性和一定的机械强度。目前，国内外研究的生物材料很多，如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、骨基质明胶(BMG)、胶原海绵、藻酸盐、透明质酸等，但各材料还都存在一些问题。如目前国内外较为看好，应用也最广泛的PGA和PLA是人工合成的高分子聚合物，具良好的生物相容性、可降解性和可塑性等，但两者均为疏水性物质，对细胞吸附力较弱，降解产物为酸性，对细胞生长不利。目前虽采取了许多改进措施，但作为合成材料，仍存在缺乏细胞识别信号、费用昂贵等缺点。BMG以天然骨材料制备而来，具有很好的生物相容性、可降解性，并因其含有BMP，故具有较强的诱导骨、软骨生长、分化和维持其表型的作用，但也存在材料孔隙不均一，植入体内后吸收过快、机械强度不足和人骨材料来源不足等缺点，这些都是需要进一步研究解决的问题。3).组织工程软骨的形成：软骨种子细胞与骨基质明胶构建组织工程化软骨的稳定性融合是最终要解决的问题。将软骨细胞-支架复合物植入无胸腺裸鼠皮下，是产生组织工程软骨的常用方法。我国学者曹谊林等在耳形PGA支架上接种软骨细胞，经体外培养后植入裸鼠背部皮下，成功地再造了人耳形软骨。目前对人鼻形软骨、支气管软骨、半月板软骨和关节软骨等也有研究。在有免疫功能的动物体内，也已成功地移植自体或同种异体软骨细胞-支架复合物，形成软骨组织或修复关节软骨缺损。植入早期局部有轻度炎症反应，或淋巴细胞浸润，以后逐渐消退，一般不影响软骨的生成。4).组织工程软骨的评价和临床应用：组织工程软骨在应用于临床之前必须通过严格的生物学、机械力学评价和动物实验验证。通过大体观察、组织形态学、组织化学、免疫组织化学和原位杂交等技术，分析组织工程软骨的外形特征，软骨细胞的形态、分布及活性，软骨基质的成分、含量比例等。通过对比测试组织工程软骨的压缩模数、表面渗透性、聚集模数等，了解其机械性能。通过各种动物实验，研究组织工程软骨移植到实验动物模型的有效性、安全性和免疫反应性等。目前研制的组织工程软骨只能替代缺损组织的部分功能，维持时间较短，离永久性功能重建尚有一定距离。而对于人类临床应用，除需解决以上述及的问题外，还需就如何建立评价体系，保证组织工程软骨的质量，以及移植物对机体的长期效果和安全性如何等问题予以深入的研究和解决。在生物支架材料研究方面，目前国内外采用的种类很多，在具有良好的生物相容性、无毒副作用、具多孔三维结构、生物可降解性、良好的细胞贴附界面、可塑性和一定的机械强度等要素上各有所长和一些有待改善的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法，用本发明构建的组织工程软骨能够获得正常或接近正常结构与功能的骨软骨组织。
为达到上述目的，本发明采用的制备方法是：
1)种子细胞获取
软骨细胞的分离培养
①取材：出生4周左右的新西兰兔1只，处死脱毛，洗涤干净，用0.1％的新洁尔灭浸泡20-30分钟；或以无菌操作获取水囊引产2小时内的人胚胎1个，经皮肤消毒后，以无菌操作截取肱骨近端，股骨近、远端和胫骨近端，置于含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液中，清除一切软组织，片状削下各关节面软骨，置入盛有含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液的容器内，而后吸出液体弃去，用10ml质量百分比浓度为0.05％的透明质酸酶室温下消化3分钟，弃去酶液，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液洗涤后，将软骨切成1mm3大小的小粒；
②细胞分离：将软骨小粒转入消化小室内室，加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力搅拌下消化30分钟，而后吸出酶液弃去，再加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胶原酶，于37℃磁力搅拌下消化60分钟，吸出含细胞酶液，置入对半盛有含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液的10ml离心管内，在1500rpm离心3分钟，弃去上清收集细胞，重复消化一次后合并两次收集的细胞，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液或含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液洗涤1-2次；
③原代培养：以40万个/瓶将细胞接种于5cm×5cm×3cm的培养瓶中，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液4ml，于37℃的CO2培养箱中培养，首次换液间隔72小时，以后则隔日换液，直至形成细胞单层；
④传代培养：将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比浓度为0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分钟，将含细胞酶液倒入50ml离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液或含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液2ml洗涤1-2次，使瓶内细胞全部洗脱下来，于1500rpm离心3分钟，弃去上清即获得软骨细胞；
2)骨基质凝胶BMG的制备：
①相对无菌条件下取新西兰兔或人胚胎长骨和干骺端松质骨，除去所有软组织及骨髓后用蒸馏水洗净；
②用3mol/L的叠氮钠冲洗2～3次再用蒸馏水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室温磁力搅拌下过夜脱脂，蒸馏水洗；
③用0.6mol/L的盐酸在4℃磁力搅拌脱钙，期间每4小时换液一次，直至骨块变软且具一定弹性时终止脱钙，再用蒸馏水洗至中性；
④4℃磁力搅拌下：用2mol/L氯化钙处理1小时，蒸馏水洗；0.5mol/L的EDTA处理1小时，蒸馏水洗；8mol/L氯化锂处理1小时，蒸馏水洗；
⑤无菌蒸馏水55℃处理1小时；
⑥将处理好的BMG修剪成实验设计所需的尺寸，冻干，60钴源照射灭菌后于0℃～-20℃冰箱内保存备用；
3)组织工程软骨的构建：
将分离培养收获的种子细胞按4-10万/mm2密度接种于皮质骨或松质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次。
本发明种子细胞获取还可用基质干细胞分离培养诱导为软骨细胞，采用密度梯度离心和粘附分离法获取骨髓间充质干细胞：取四月龄左右新西兰纯种兔或成人行骨髓穿刺，抽取骨髓按1∶1的体积比缓慢注于70％的Percoll细胞分离液表面，于1500转离心20分钟，吸取上层和中层之间的含有骨髓间充质干细胞的液层，用含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液将骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液，计数有核细胞后接种于培养瓶中进行单层培养，第一次5天，以后每3天更换含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液一次，约2周形成细胞单层后进行传代；将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比浓度为0.25％ trypsin+0.02％ EDTA的消化酶液于37℃消化10分钟，将含细胞酶液倒入离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液或含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液2ml洗涤，使瓶内细胞全部洗脱下来，1500rpm离心3分钟弃去上清，用含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液制成细胞悬液，计数细胞后接种进行传代培养，此时加入诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的诱导因子：10ng/ml转化生长因子β1，10ng/ml胰岛素样生长因子和50μg/ml维生素C，以诱导骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞。
本发明在计数有核细胞后接种于培养瓶中进行单层培养时可在培养瓶底预铺以5μg/ml纤维粘连蛋白，以促进骨髓间充质干细胞的粘附。
由于本发明采用骨基质明胶，发挥其具有较好的生物相容性、可降解性，较强的诱导骨、软骨生长、分化作用的优势，克服植入体内后吸收过快、机械强度不足的问题；开展异种骨基质明胶使用的实验研究以克服人骨材料来源不足等问题，将取得用本发明构建的组织工程软骨能够获得正常或接近正常结构与功能的骨软骨组织的良好效果。
附图说明
图1是本发明软骨细胞复合皮质骨BMG培养6天的切片HE染色图，10X；
图2是本发明软骨细胞复合松质骨BMG培养6天的切片HE染色图，10X；
图3是本发明软骨细胞复合皮质骨BMG培养12天的切片HE染色图；，10X；
图4是本发明软骨细胞复合松质骨BMG培养12天的切片PG染色图，10X；
图5是本发明软骨细胞复合皮质骨BMG培养18天的切片HE染色图，10X；
图6是本发明软骨细胞复合松质骨BMG培养18天的切片HE染色图，10X；
图7是本发明软骨细胞复合皮质骨BMG培养18天的切片PG染色图，10X；
图8是本发明软骨细胞复合松质骨BMG培养18天的切片PG染色图，20X；
图9是本发明软骨细胞复合皮质骨BMG培养24天的切片HE染色图；，10X；
图10是本发明软骨细胞复合松质骨BMG培养24天的切片胶原染色图，10X；
具体实施方式
实施例1：
1)种子细胞获取
软骨细胞的分离培养
①取材：出生4周左右的新西兰兔1只，以空气拴塞或击枕后部处死，质量百分比浓度为8％的硫化钠脱毛，流水洗涤干净，用0.1％的新洁尔灭浸泡20-30分钟；以无菌操作截取肱骨近端，股骨近、远端和胫骨近端，置于盛有含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液的容器中，清除一切软组织，片状削下各关节面软骨，置入含P/S各100个单位/m1的D-Hanks′液的容器内，而后吸出液体弃去，用10ml质量百分比浓度为0.05％的透明质酸酶室温下消化3分钟，弃去酶液，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液洗涤后，将软骨片切成1mm3大小的软骨小粒；
②细胞分离：将软骨小粒转入消化小室内室，加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力搅拌下消化30分钟，而后吸出酶液弃去，再加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胶原酶，于37℃磁力搅拌下消化60分钟，吸出含细胞酶液，置入对半盛有含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液的10ml离心管内，在1500rpm离心3分钟，弃去上清，收集细胞，重复消化一次后合并两次收集的细胞，用D-Hanks′液洗涤1-2次；
③原代培养：以40万个/瓶将细胞接种于5cm×5cm×3cm的培养瓶中，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液4ml，于37℃的CO2培养箱中培养，培养中每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况，原代培养一般在24小时内细胞贴壁，48-72小时细胞开始有伸突，并开始分裂增殖，兔软骨细胞在10天左右可行成单层，人胚软骨细胞要相应推迟2天，首次换液间隔72小时，以后则隔日换液，直至形成细胞单层；
④传代培养：将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比为0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分钟，在倒置显微镜下观察细胞脱壁后，将含细胞酶液倒入50ml离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液2ml洗涤1-2次，使瓶内细胞全部洗脱下来，于1500rpm离心3分钟，弃去上清即获得细胞；
此方法动物和消化酶用量均较少，基质消化完全，细胞获得量较多，一只兔子或一个人胚胎可获得软骨细胞一千万以上。但因酶作用强度大以及消化时间长，细胞在分离时受损伤较大，原代接种后死亡比率相对较大，为了使实验结果更可靠，而且为了增加细胞数量，一般多于传第一代细胞进行实验研究。传代细胞基本都能成活，而且细胞获得数量大(可上亿)，实验重复性好，结果较为稳定。
2)骨基质凝胶(BMG)的制备：
①相对无菌条件下取新西兰兔或人胚胎长骨和干骺端松质骨，除去所有软组织及骨髓后用蒸馏水洗净；
②用3mol/L的叠氮钠冲洗2～3次，蒸馏水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室温磁力搅拌下过夜脱脂，蒸馏水洗；
③用0.6mol/L的盐酸在4℃磁力搅拌脱钙，期间每4小时换液一次，直至骨块变软且具一定弹性时终止脱钙，再用蒸馏水洗至中性；
④4℃磁力搅拌下用2mol/L氯化钙处理1小时，蒸馏水洗；0.5mol/L EDTA处理1小时，蒸馏水洗；8mol/L氯化锂处理1小时，蒸馏水洗；
⑤无菌蒸馏水55℃处理1小时；
⑥将处理好的BMG修剪成实验设计所需的尺寸，冻干，60钴源照射灭菌后于0℃～-20℃冰箱内保存备用；
3)组织工程软骨的构建：
将分离培养收获的种子细胞按4-10万/mm2密度接种于皮质骨或松质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次。
实施例2：
1)种子细胞获取
软骨细胞的分离培养
①取材：以无菌操作获取水囊引产2小时内的人胚胎1个，碘酒和酒精消毒皮肤后，以无菌操作截取肱骨近端，股骨近、远端和胫骨近端，置于盛有含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液的容器中，清除一切软组织，片状削下各关节面软骨，置入含有含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液的容器内，而后吸出液体弃去，用10ml质量百分比浓度为0.05％的透明质酸酶室温下消化3分钟，弃去酶液，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液洗涤后，将软骨切成1mm3大小的软骨小粒；
②细胞分离：将软骨小粒转入消化小室内室，加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力搅拌下消化30分钟，而后吸出酶液弃去，再加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胶原酶，于37℃磁力搅拌下消化60分钟，吸出含细胞酶液，置入对半盛有含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液的10ml离心管内，在1500rpm离心3′，弃去上清，收集细胞，重复消化一次后合并两次收集的细胞，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液洗涤1-2次；
③原代培养：以40万个/瓶将细胞接种于5cm×5cm×3cm的培养瓶中，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液4ml，于37℃的CO2培养箱中培养，培养中每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况，原代培养一般在24小时内细胞贴壁，48小时-72小时细胞开始有伸突，并开始分裂增殖，人胚软骨细胞在两周左右可行成单层，首次换液间隔72小时，以后则隔日换液，直至形成细胞单层；
④传代培养：将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比浓度为0.25％的trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分钟，在倒置显微镜下观察细胞脱壁后，将含细胞酶液倒入50ml离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液2ml洗涤1-2次，使瓶内细胞全部洗脱下来，于1500rpm离心3分钟，弃去上清即获得细胞；
2)骨基质凝胶(BMG)的制备：
①相对无菌条件下取新西兰兔或人胚胎长骨和干骺端松质骨，除去所有软组织及骨髓后用蒸馏水洗净；
②用3mol/L的叠氮钠冲洗2～3次，蒸馏水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室温磁力搅拌下过夜脱脂，蒸馏水洗；
③用0.6m0l/L的盐酸在4℃磁力搅拌脱钙，期间每4小时换液一次，直至骨块变软且具一定弹性时终止脱钙，再用蒸馏水洗至中性；
④4℃磁力搅拌下用2mol/L氯化钙处理1小时，蒸馏水洗；0.5mol/L EDTA处理1小时，蒸馏水洗；8mol/L氯化锂处理1小时，蒸馏水洗；
⑤无菌蒸馏水55℃处理1小时；
⑥将处理好的BMG修剪成实验设计所需的尺寸，冻干，60钴源照射灭菌后于0℃～-20℃冰箱内保存备用；
3)组织工程软骨的构建：
将分离培养收获的种子细胞按4-10万/mm2密度接种于皮质骨或密质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次。
实施例3：
1)种子细胞获取
软骨细胞的分离培养
基质干细胞分离培养诱导为软骨细胞：
①采用密度梯度离心和粘附分离法获取骨髓间充质干细胞：取四月龄左右新西兰纯种兔，抽取骨髓按1∶1的体积比缓慢注于70％的Percoll细胞分离液表面，于1500转离心30分钟，吸取上层和中层之间的含有骨髓间充质干细胞的液层，用含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液将骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液，计数有核细胞后接种于培养瓶中进行单层培养，第一次5天，以后每3天更换含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液一次，约2周形成细胞单层后进行传代；
②传代培养诱导转化为软骨细胞：将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比为0.25％trypsin+0.02％ EDTA的消化酶液，于37℃消化10分钟，将含细胞酶液倒入离心管内，在倒置显微镜下观察细胞脱壁后，将含细胞酶液倒入离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液2ml洗涤，使瓶内细胞全部洗脱下来，1500rpm离心3分钟弃去上清，用含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液制成细胞悬液，计数细胞后接种进行传代培养，此时加入诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的诱导因子：10ng/ml转化生长因子β1，10ng/ml胰岛素样生长因子和50μg/ml维生素C，以诱导骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞；
③其它如胚胎、脂肪干细胞等可参照骨髓间充质干细胞分离法获取。
2)骨基质凝胶(BMG)的制备：
①相对无菌条件下取新西兰兔或人胚胎长骨和干骺端松质骨，除去所有软组织及骨髓后用蒸馏水洗净；
②用3mol/L的叠氮钠冲洗2～3次，蒸馏水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室温磁力搅拌下过夜脱脂，蒸馏水洗；
③用0.6mol/L的盐酸在4℃磁力搅拌脱钙，期间每4小时换液一次，直至骨块变软且具一定弹性时终止脱钙，再用蒸馏水洗至中性；
④4℃磁力搅拌下用2mol/L氯化钙处理1小时，蒸馏水洗；0.5mol/L EDTA处理1小时，蒸馏水洗；8mol/L氯化锂处理1小时，蒸馏水洗；
⑤无菌蒸馏水55℃处理1小时；
⑥将处理好的BMG修剪成实验设计所需的尺寸，冻干，60钴源照射灭菌后于0℃～-20℃冰箱内保存备用；
3)组织工程软骨的构建：
将分离培养收获的种子细胞按4-10万/mm2密度分别接种于皮质骨和松质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次。
实施例4：
1)种子细胞获取
软骨细胞的分离培养
基质干细胞分离培养诱导为软骨细胞：
①采用密度梯度离心和粘附分离法获取骨髓间充质干细胞：对成人行骨髓穿刺，抽取骨髓按1∶1的体积比缓慢注于70％的Percoll细胞分离液表面，于1500转离心30分钟，吸取上层和中层之间的含有骨髓间充质干细胞的液层，用含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液将骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液，计数有核细胞后接种于培养瓶中进行单层培养，第一次5天，以后每3天更换含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液一次，约2周形成细胞单层后进行传代；
②传代培养诱导转化为软骨细胞：将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比为0.25％trypsin+0.02％ EDTA的消化酶液，于37℃消化10分钟，将含细胞酶液倒入离心管内，在倒置显微镜下观察细胞脱壁后，将含细胞酶液倒入离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液2ml洗涤，使瓶内细胞全部洗脱下来，1500rpm离心3分钟弃去上清，用含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液制成细胞悬液，计数细胞后接种进行传代培养，此时加入诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的诱导因子：10ng/ml转化生长因子β1，10ng/ml胰岛素样生长因子和50μg/ml维生素C，以诱导骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞；
③其它如胚胎、脂肪干细胞等可参照骨髓间充质干细胞分离法获取。
2)骨基质凝胶(BMG)的制备：
①相对无菌条件下取新西兰兔或人胚胎长骨和干骺端松质骨，除去所有软组织及骨髓后用蒸馏水洗净；
②用3mol/L的叠氮钠冲洗2～3次，蒸馏水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室温磁力搅拌下过夜脱脂，蒸馏水洗；
③用0.6mol/L的盐酸在4℃磁力搅拌脱钙，期间每4小时换液一次，直至骨块变软且具一定弹性时终止脱钙，再用蒸馏水洗至中性；
④4℃磁力搅拌下用2mol/L氯化钙处理1小时，蒸馏水洗；0.5mol/L EDTA处理1小时，蒸馏水洗；8mol/L氯化锂处理1小时，蒸馏水洗；
⑤无菌蒸馏水55℃处理1小时；
⑥将处理好的BMG修剪成实验设计所需的尺寸，冻干，60钴源照射灭菌后于0℃～-20℃冰箱内保存备用；
3)组织工程软骨的构建：
将分离培养收获的种子细胞按4-10万/mm2密度分别接种于皮质骨和松质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次。
按照本发明的制备方法制得的工程软骨，参见图1，2，种植于BMG的软骨细胞培养6d形成细胞薄层；参见图3、4，培养12d形成8～10层细胞的类软骨组织，细胞周围氨基多糖染色明显；参见图5、6、7、8，培养18d形成12～15层细胞的类软骨组织，细胞周围氨基多糖染色更明显并出现胶原成分；参见图9、10，培养到24d直至42d形成20层以上细胞的类软骨组织。不同的是，培养在皮质骨BMG形成的类软骨组织围绕于BMG表面，类似于关节表面软骨；培养在松质骨BMG形成的类软骨组织，细胞分布于松质骨BMG网眼中形成浑然一体。
I.复合皮质骨BMG组织工程软骨毒损实验：
采用细胞培养方法，将培养的人胚胎或新西兰纯种幼兔软骨细胞种植于自体皮质骨骨基质明胶(BMG)上，于体外再建软骨组织模型。采用配伍组设计，加入含不同浓度的可疑KBD致病因子T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和保护因子硒，作用于体外再建软骨组织，建立软骨变性坏死模型。结果见对照组BMG表面有多层软骨细胞。组间随着T-2、NIV和DON毒素浓度的增加，细胞密度降低，损伤加剧，并出现坏死；加硒后趋势不变，与相应未加硒组比较损伤减轻。
II.复合松质骨BMG组织工程软骨移植修复关节软骨缺损：
手术将体外培养12天形成的松质骨BMG-软骨细胞复合体植于同种异体兔膝关节的骨软骨缺损处(直径4mm)，术后2、4、8、12、24周进行功能评价及解剖显微镜、组织学、电镜等动态观察。结果见全部实验兔于术后10天内恢复正常活动；术后2周软骨细胞在松质骨BMG支架间分裂增殖形成软骨团块；随着术后2、4、8周时间的延长，BMG支架间形成的软骨细胞团块逐渐增大，BMG逐渐被吸收，至8周BMG被完全吸收，形成软骨组织；术后24周骨软骨缺损处以软骨组织修复。松质骨BMG在体内与宿主组织有较好的组织相容性，并具有可降解性，结合体外实验结果，认为松质骨BMG是一种合适的细胞支架，软骨细胞负载于松质骨BMG上能修复兔关节骨软骨缺损。
III.结论：
软骨细胞种植于骨基质明胶体外培养1～6周，能获得具分泌氨基多糖和胶原功能的类软骨组织；培养在皮质骨BMG形成的类软骨组织较适合用于体外功能代谢和损伤实验研究；培养在松质骨BMG形成的类软骨组织较适合用于移植修复骨软骨缺损。
本发明将体外分离培养或诱导培养的软骨细胞种植在骨基质明胶(BMG)上，构建组织工程软骨，已经获得近似于正常结构与功能的骨软骨组织，用于体外组织细胞功能和代谢研究及用于移植修复骨软骨缺损。
Claims (3)
1、一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法，其特征在于：
1)种子细胞获取
软骨细胞的分离培养
①取材：出生4周左右的新西兰兔1只，处死脱毛，洗涤干净，用0.1％的新洁尔灭浸泡20-30分钟；或以无菌操作获取水囊引产2小时内的人胚胎1个，经皮肤消毒后，以无菌操作截取肱骨近端，股骨近、远端和胫骨近端，置于含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液中，清除一切软组织，片状削下各关节面软骨，置入盛有含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液的容器内，而后吸出液体弃去，用10ml质量百分比浓度为0.05％的透明质酸酶室温下消化3分钟，弃去酶液，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液洗涤后，将软骨切成1mm3大小的小粒；
②细胞分离：将软骨小粒转入消化小室内室，加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力搅拌下消化30分钟，而后吸出酶液弃去，再加入5ml质量百分比浓度为0.2％的胶原酶，于37℃磁力搅拌下消化60分钟，吸出含细胞酶液，置入对半盛有含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液的10ml离心管内，在1500rpm离心3分钟，弃去上清收集细胞，重复消化一次后合并两次收集的细胞，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液或含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液洗涤1-2次；
③原代培养：以40万个/瓶将细胞接种于5cm×5cm×3cm的培养瓶中，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液4ml，于37℃的CO2培养箱中培养，首次换液间隔72小时，以后则隔日换液，直至形成细胞单层；
④传代培养：将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比浓度为0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分钟，将含细胞酶液倒入50ml离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液或含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液2ml洗涤1-2次，使瓶内细胞全部洗脱下来，于1500rpm离心3分钟，弃去上清即获得软骨细胞；
2)骨基质凝胶BMG的制备：
①相对无菌条件下取新西兰兔或人胚胎长骨和干骺端松质骨，除去所有软组织及骨髓后用蒸馏水洗净；
②用3mol/L的叠氮钠冲洗2～3次再用蒸馏水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室温磁力搅拌下过夜脱脂，蒸馏水洗；
③用0.6mol/L的盐酸在4℃磁力搅拌脱钙，期间每4小时换液一次，直至骨块变软且具一定弹性时终止脱钙，再用蒸馏水洗至中性；
④4℃磁力搅拌下：用2mol/L氯化钙处理1小时，蒸馏水洗；0.5mol/L的EDTA处理1小时，蒸馏水洗；8mol/L氯化锂处理1小时，蒸馏水洗；
⑤无菌蒸馏水55℃处理1小时；
⑥将处理好的BMG修剪成实验设计所需的尺寸，冻干，60钴源照射灭菌后于0℃～-20℃冰箱内保存备用；
3)组织工程软骨的构建：
将分离培养收获的种子细胞按4-10万/mm2密度接种于皮质骨或松质骨BMG上进行体外培养，培养基为含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液，每3天换液一次。
2、根据权利要求1所述的用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法，其特征在于：种子细胞获取还可用基质干细胞分离培养诱导为软骨细胞，采用密度梯度离心和粘附分离法获取骨髓间充质干细胞：取四月龄左右新西兰纯种兔或成人行骨髓穿刺，抽取骨髓按1∶1的体积比缓慢注于70％的Perco11细胞分离液表面，于1500转离心20分钟，吸取上层和中层之间的含有骨髓间充质干细胞的液层，用含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液将骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液，计数有核细胞后接种于培养瓶中进行单层培养，第一次5天，以后每3天更换含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液一次，约2周形成细胞单层后进行传代；将原代培养已形成细胞单层的各瓶中培养液弃去，用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液将细胞洗1-2次，加入4ml质量百分比浓度为0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分钟，将含细胞酶液倒入离心管内，再用含P/S各100个单位/ml的D-Hanks′液或含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液2ml洗涤，使瓶内细胞全部洗脱下来，1500rpm离心3分钟弃去上清，用含15％体积比的小牛血清和P/S各100个单位/ml的DMEM培养液制成细胞悬液，计数细胞后接种进行传代培养，此时加入诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的诱导因子：10ng/ml转化生长因子β1，10ng/ml胰岛素样生长因子和50μg/ml维生素C，以诱导骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞。
3、根据权利要求2所述的用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法，其特征在于：所说的计数有核细胞后接种于培养瓶中进行单层培养时可在培养瓶底预铺以5μg/ml纤维粘连蛋白，以促进骨髓间充质干细胞的粘附。
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