CN1997410B - 非细胞依赖性制造组织等效物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及模仿细胞生物重建并产生组织化生物材料的非细胞依赖性方法，所述生物材料具有适用作功能性组织植入物的机械特性和活细胞密度。所述生物材料如此生产：提供包含骨架纤维基质和间隙流体的凝胶；和塑性压缩凝胶以产生所述生物材料。该生物材料可以包含3D结构比如细胞和基质的分层、匹配和介观带状不均匀性，其模仿天然组织结构。本文所述的具有仿生结构的生物材料可以用于很多治疗性应用。

Description

非细胞依赖性制造组织等效物
本发明涉及一种用于制备组织等效植入物的方法，该植入物用于修复和/或替代个体中的受损组织、和由此方法产生的植入物。
传统上，组织工程的目的在于将初始的细胞-骨架构造物转化为具有仿生功能的组织样结构。这种转化过程通常涉及在培养中基于细胞的重建。然而，在大部分情况下，基于细胞的重建已经被证明是缓慢的(经常几周时间)、难以控制并且成本仅限于能构造人造生物材料或‘组织’(M.Eastwood et al，Cel. Motil.Cytoskel.19984013；D.Huang，et al Ann.Biomed.Eng.1993 21289)。对此可部分归因于涉及组织密度的灌注/缺氧的限制性(例如韧带、皮肤和肌肉中)。进一步还包括对细胞实际上如何产生特定天然微结构(即3D细胞-基质结构)的理解有限。材料组成和，更具体的，生物人工工程化构造物的3D纳-微级(介观)结构是它们成功的关键(R.A.Brown，in FutureStrategies for Tissue and Organ Replacement(Eds：J.M.Polak，L.L.Hench，P.Kemp)，World Scientific Publishing，Singapore(2002)48；R.A.Brown etal Wound Rep.Reg.(1997)5 212)。
天然基质骨架(例如胶原、纤维蛋白、透明质酸、纤连蛋白)已经被用于制造适宜的仿生3D介观结构以用于细胞/组织生长。然而，我们有限的在该量级上控制仿生结构组装的能力，尤其是使用天然蛋白和活细胞的能力已经限制了这方面的发展。对此部分是由于对天然蛋白质聚合物3D组装的了解有限(F. Volrath，D.P.Knight，Nature 2001，410，541)，这使得必需依赖细胞来实施必要的组装/重建过程。
种植细胞的胶原凝胶是优异的仿生起点，但是它的机械性非常弱(Z.Feng et al Artificial Organs 2003，27，84；L.Krishnan et al Tissue Eng.200410 241)并且在培养中使其变得更强是很慢的。常规的基于细胞制造的实例已经使用了很多系统。它们中最简单的是，根本不使用支持骨架，准备开发一种超汇合2D培养物(S.Calve et al Tissue.Eng.2004，10，755)。Huang et al(Huang et al 1993同上)使用胶原凝胶在单轴内源张力(uniaxialendogenous tension)下制造出韧带样组织，在12周之后其抗断应力(breakstresses)达到0.14MPa。Feng et al(Feng et al 2003同上)发现非负荷、非定向胶原凝胶在经过10周培养后直径降低85％，并产生约0.1MPa的屈服应力(yield stress)。Garvin et al(Garvin，J.et al Tissue Eng.2003，9，967)报导了应用负荷产生细胞/原纤维匹配和产生腱外膜样(epitenon-like)表面层。用1小时/天、1％应变(strain)、1Hz循环负荷(cyclical loading)，7天构造物的破断应力从0.11上升到0.33MPa(模量1.8MPa)。
不溶性胶原海绵(I.V.Yannas et al Science(1982)215，174)(例如IntegraTM)比胶原凝胶具有更大的强度。胶原海绵是无规则多孔结构，其源自广泛预聚合的纤维、片(sheets)或网(meshes)并且其经常是通过在高温下热压(即完全在蛋白质正常变性温度之上；例如＞60℃)由重构的或分裂的碎片化不溶性聚合物(例如来自皮肤、腱等的动物胶原)来制造。胶原海绵的微结构因此既不是仿生的又不易由细胞重建。用高温强化不溶性胶原海绵和压缩的技术，其用于药物递送最近已经被描述(Z.Rusczcak，W.Friess，Adv.Drug Delivery Rev.2003 55 1679；US 2003095997；US 2003133967)。其它实用的替代物包括‘小肠粘膜下层’(SIS)胶原膜(S.F. Badylak et al.J.Biomed.Mater.Res.1995 29 977)。尽管SIS具有优越的机械和细胞生长特性，它仍然是一种收获的、加工的动物产品。因此，它是非细胞的并且其胶原结构和3D组织化被动物组织预先确定。
本发明涉及令人吃惊的发现很少或不需要细胞参与的物理过程(即不依赖于细胞的过程)能有效模仿细胞生物重建并产生组织化的骨架-细胞基质，其具有适用作功能性组织植入物的机械特性和活细胞密度。也能够形成细胞和基质的3D组织样结构比如分层、匹配和介观级带状不均匀性，模仿天然组织比如腱、神经和皮肤的结构。具有本文所述仿生结构的组织模板，其纳-微级、非细胞依赖性建造可以用于很多治疗应用。
本发明一方面提供一种生产生物材料的方法，其包括：提供一种凝胶，其包含骨架纤维基质和间隙流体；和塑性压缩凝胶以产生所述生物材料。
例如，塑性压缩可以增加骨架基质的密度和机械强度。由本方法产生的生物材料例如可以用于生产组织等效植入物。
组织等效植入物是一种用于植入个体以修复或替代内源性组织的装置，例如，该组织可以被破坏或患病。可以用组织等效植入物修复或替代的疾病组织的实例包括神经、腱、软骨、皮肤、骨、泌尿生殖元件、肝、心肺组织、肾、眼组织、血管、肠和腺体。
优选的是，组织等效植入物是一种宿主组织的结构仿生物，和尤其是在细胞水平上模仿其结构(即纳微米、介观量级)。组织等效植入物可以包含如在天然组织中以介观级分布于适当层、区(zones)、贮库(depots)和通道中的细胞。
细胞在不同组织中的结构和分布在本领域中是众所周知的。介观级层的实例可以包括皮肤中的上皮(角化细胞)和基质(皮肤成纤维细胞)层；在神经再生导管中的进-(entry-)、连接-和退(exit)-弛豫区(ramp zones)：在血管中的内皮(衬层)、平滑肌可收缩基质(两或更多)和外膜(outeradventitia)层。植入物中通道的实例可以包括植入后神经的毛细血管侵入的通道。所述区(zone)的实例可以包括保持在与灌注毛细管床接近的构造物中激素分泌细胞的贮库(depot)。
通常，合适的骨架材料可以包括任何自发聚集或原纤维形成性水凝胶，其中在生理pH条件下纤维没有强离子表面电荷。骨架材料的纤维优选未交联或未实质性聚合。优选的骨架材料具有低水合/膨胀特性以辅助塑性压缩。很多合适的原纤维形成性骨架材料在本领域是已知的。原纤维形成材料包含可溶性单体分子，其能通过包装自我结合而形成离散的(不溶性)原纤维和纤维。
合适的骨架纤维包括天然聚合物，例如蛋白质，比如丝、纤维蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白或胶原(例如I型胶原)、糖蛋白比如纤连蛋白、或多糖比如壳多糖或纤维素。在一些优选实施方案中，骨架纤维由胶原构成。天然原纤维形成性胶原类型是优选的，包括的胶原类型是I、II、III、V、VI、IX和XI型及其组合(例如I、III、V或II、IX、XI)。例如，I型胶原可以用作骨架材料。
在另一些实施方案中，骨架可以是合成聚合物，即非天然存在于人或动物体中的聚合物。合适的聚合物包括有机聚合物比如聚内酯(polylactone)、polyglycone和polycapryolactone和无机聚合物比如磷酸盐玻璃。合成聚合物可以被改造以降低在所选pH(通常约中性)下的固有膨胀潜力。膨胀通常是由表面电荷和渗透压引起的。在此情况中，聚合物的表面化学性质可以被修饰以确保适当的亲水性而没有明显的固定电荷密度。
骨架可以是包含两或多种不同类型纤维的复合材料。例如，骨架可以包含纤连蛋白和胶原、胶原和聚交酯(polylactide)、纤维蛋白和胶原、可溶性玻璃纤维和胶原或纤维蛋白、或纤维蛋白、胶原和纤连蛋白。
随着原纤维在最初容纳单体的水性间隙液体周围形成连续网络，通过聚并和延长骨架材料的原纤维而形成如本文所述的凝胶。例如，三螺旋胶原单体可以在开始时溶解于稀酸中，随后被诱导聚合(聚集)成原纤维(例如在37℃和中性pH)。随着原纤维聚合，会发生相转变并且原纤维的固体网络以大约相同的体积和形状‘支持’余下的间隙液体-即它被凝胶化。
从可溶性单体向固体聚合物的相转变是凝胶的特征并且在提供本文所述的特征方面是重要的。凝胶与‘海绵’明显不同，海绵可以从预聚合的纤维形成。
无限制压缩凝胶可排出间隙液体并且它在去除负荷后不恢复：即凝胶经历了塑性压缩。在未处理凝胶中的骨架基质通常是整体水合形式。凝胶的塑性压缩破坏了骨架结构，但未丧失结构细节，使凝胶中的骨架脱水，并导致密度和强度增加。
间隙液体通常是水性液体，尽管其它有机溶剂可以用于某些非生物应用中。例如，该液体可以是其中溶解了溶质比如盐和蛋白的水。在一些实施方案中，间隙液体是适于细胞生长和增殖的细胞培养基。
优选的是，凝胶用细胞种植，尤其是人或其它哺乳动物细胞。当凝胶被压缩成生物材料时，这些细胞仍然保持活力。
凝胶可以包含赋予组织功能性并提供替代或促进内源组织修复其结构的细胞。例如，凝胶可以包含一种或多种肌肉细胞以提供可收缩结构，脉管和/或神经细胞以提供传导元件，代谢活性分泌细胞比如肝细胞、激素合成细胞、皮脂细胞、胰岛细胞或肾上腺皮质细胞以提供分泌结构，干细胞比如源自骨髓的或胚胎干细胞、皮肤成纤维细胞、皮肤角化细胞、(和两种的组合层)、施万细胞(Schwann cells)用于神经植入物，平滑肌细胞和内皮细胞用于脉管结构，尿道上皮和平滑肌细胞用于膀胱/尿道结构和骨细胞、软骨细胞和腱细胞用于骨和腱结构。在一些实施方案中，种植于凝胶的细胞可以包括成纤维细胞。
细胞可以以任何排列方式分布在凝胶间隙内。例如，细胞可以均匀遍布于凝胶中或分布在凝胶内确定的带、区域或层。
细胞优选在压缩前种植在凝胶中，例如当浇铸凝胶时。可以通过将细胞与液体骨架基质混合然后允许液体基质固化成凝胶从而将细胞种植在基质中。在凝胶形成之前，基质种植优选在合适的温度、pH、离子强度和剪切条件下实施以维持细胞活力。
任选地，当需要将细胞附着于骨架时，可以在压缩之前在所述凝胶中孵育细胞24小时或更短、12小时或更短、6小时或更短、3小时或更短、或1小时或更短，最优选0-2小时。
由压缩引起的凝胶体积减少与凝胶中细胞密度的增加负相关。因此，本文所述的凝胶压缩可以增加细胞密度5-200倍，更优选10-100倍。
凝胶中初始细胞密度可以是从约1×104到1×107细胞/ml，更优选从约5×105到1×106细胞/ml。压缩后的细胞密度可以是从1×107到1×109细胞/ml，更优选从5×107到5×108细胞/ml。
通过改变起始细胞密度和/或压缩量，压缩凝胶中最终细胞密度可以变化，这取决于压缩凝胶的目标应用。例如，对于需要高细胞密度的组织构造物(比如肝、肾或腺体构造物)，种植于凝胶的细胞量和/或压缩量可以被增加。最终细胞密度可以通过按本文所述的二次压缩被进一步增加。
在压缩生物材料中的细胞比例将部分依赖于细胞大小。小细胞比如血红细胞可以相对于更大细胞比如成纤维细胞占压缩生物材料的更小比例，甚至当以相同细胞密度存在时也是如此。通常，细胞可以占压缩生物材料的至少1％v/v，至少5％v/v或至少10％v/v。对于最佳物理特性，生物材料构造物可以包含少于50％v/v、少于40％v/v或少于30％v/v的细胞。
生物材料或植入物的特性可以按特定用途或应用通过改变生物材料中个别组分的组成(例如％v/v)进行调节。例如，可以改变基质组分的比例以改变生物材料的强度，可以改变细胞的比例以改变生物材料的细胞活性和/或可以改变微通道的比例以改变生物材料的灌注特性。
塑性压缩过程可以被优化以从标准起始凝胶实现胶原、细胞和通道形成插入物的期望最终比率。例如，标准凝胶可以包含1-4％胶原、0.2-10×106细胞/ml和0.2-2％通道纤维或颗粒(granules)。
压缩生物材料中的细胞对干燥是敏感的。为减少与干燥相关的细胞死亡和/或损伤，凝胶可以在含水液体中被压缩，例如培养基中，比如DMEM、Ham’s或Eagle’s培养基或生理缓冲液比如Ringer’s或PBS。对于非细胞生物材料，任何与骨架基质相容的溶剂都可以使用。
细胞对由于压缩生物材料中高细胞密度引起的缺氧导致的细胞死亡和/或损伤也是敏感的。为降低和/或防止细胞死亡或损伤，植入物或生物材料可以保存在维持存活但不支持细胞生长的条件下，直至准备使用。例如，植入物或生物材料可以保存在低温下，比如0-5℃，优选4℃。
本文所述的塑性压缩表示使对象比如凝胶变形以减小其体积，使得对象基本保持其新体积，即使在压缩因素被去除后也是如此。塑性压缩是快速的、非细胞依赖性过程，其是由对凝胶进行物理处理比如外力或压力所产生的，其从凝胶中排出间隙液体。塑性压缩与细胞驱动收缩的缓慢过程是不同的，所述细胞驱动的收缩是通过凝胶中生长细胞的内在作用产生的，即塑性压缩不是细胞介导的并且不是通过在凝胶中培养的细胞的作用而产生的。
细胞介导的收缩只能产生按本文所述塑性压缩引起压缩的小比例。而且，细胞收缩发生在随机方向上，因此总收缩向量是对整个细胞群体的平均值。塑性压缩应用具有在一个、两个或更多确定方向上的向量，并且压缩的方向、比率和程度是可控制的。
塑性压缩允许精确确定生物材料的细胞含量、基质密度和流体含量。而且，在生物材料内一个或多个这些参数的局部增强是可能的，并且这些局部增强的空间位置和模式是可控制的，例如以产生层、带或通道。
在一些实施方案中，进行塑性压缩的对象基本没有任何膨胀趋势，所述膨胀趋势随后可以在不需要进一步细胞培养或处理步骤的条件下逆转压缩。
在另一些实施方案中，组织等效植入物可以在使用中经历一些再膨胀。例如，尽管含有软骨细胞的压缩胶原基质最初没有再膨胀，生长的软骨细胞合成蛋白聚糖/GAG，其吸收液体并使植入物膨胀。膨胀的植入物结构在模仿软骨结构中是特别有用的。
根据生物材料的用途，压缩量或程度可以被改变。凝胶的压缩，例如通过压力，可以导致在凝胶的一或多个方向上减小至少5倍、至少10倍或至少20倍。所述一或多个方向可以被减小200倍或更少、150倍或更少、或100倍或更少。在优选实施方案中，凝胶厚度通过压缩被减小。
例如，凝胶的体积通过塑性压缩可以减小50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、99％或更多、99.9％或更多。
压缩所需的时间将少于细胞驱动收缩所需的时间并且将根据压缩方法和所用条件而变化。例如，压缩可以发生在少于12小时、少于6小时、少于3小时、少于1小时、少于30分钟或少于10分钟。在一些优选实施方案中，凝胶可以在2分钟或更少、或1分钟或更少时间中被压缩。
凝胶的塑性压缩可以与从所述凝胶中丧失或去除一些或所有间隙流体相关。
例如，通过塑性压缩从凝胶丧失或去除的流体量可以是凝胶初始流体含量的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％、或至少99.9％。
优选的是，一些间隙液体在压缩后仍保留，例如凝胶初始流体含量的至少10％、至少1％或至少0.1％。在优选实施方案中，在塑性压缩之后，凝胶不进行干燥或脱水，例如加热-、冷冻-、气流或真空干燥，因为脱水杀死细胞并破坏生物材料的结构。
压缩的程度可以依赖于骨架材料的表面电荷和水合平衡。超出水合平衡的压缩可以引起当压缩骨架置于水环境中时部分再膨胀(即压缩是部分非塑性的)。
塑性压缩可以从凝胶中驱出间隙液体或将间隙液体从凝胶中脱出。不止一种方法可以被用来压缩凝胶，或者依次或者同步。在一些优选实施方案中，压缩发生在一或多个确定方向并且间隙液体从凝胶中通过一或多个确定的流体离去表面被排出。为了在按本文所述的生物材料内产生确定的结构，比如片层，可以选择压缩方向和流体离去表面的数量和排列。
间隙液体可以通过向凝胶施加机械力而被排出，例如施加正或负压。
机械力可以包括压缩力。为达到期望压缩而施加于凝胶的压缩力的量依赖于特定环境并且技术人员可以很容易的确定。例如，适合的压缩力可以是0.1-10N，例如1N。优选的是，当向凝胶施加压缩力时，凝胶无界限限制。
向凝胶施加压缩力的任何合适的方法都可以被使用。
例如，凝胶可以通过以下一种或多种方法被压缩：向凝胶施加静态载荷(例如死重量)、通过水压或凸轮(cam)或将凝胶通过滚轮来施加负荷。
在一些实施方案中，通过使凝胶通过收缩孔挤出来压缩凝胶。例如，收缩孔可以包含锥形室，当凝胶通过锥形室时被压缩。锥形室可以包含多孔壁以允许从凝胶排出间隙液体以促进压缩。
在一些实施方案中，通过扩张凝胶中的气囊来施加压缩力以对固体表面压缩所述凝胶。例如固体表面可以在凝胶周围形成管，其允许形成管状植入构造物。
在一些实施方案中，通过离心施加压缩力。离心在干离心管底部的标准水合凝胶，通过塑性压缩减少构造物的流体含量一将间隙液体排出至或者干的多孔支持物或者收集室中。流体损失的量可以通过离心速度和持续时间来调节。
在凝胶保持静止条件下压缩的方法(例如向凝胶施加死重量或水压或凸轮施加负荷)已知是“静态”压缩方法。压缩期间凝胶运动的方法已知是“动态”压缩方法(例如使凝胶通过滚轮或使凝胶通过收缩孔挤出)。
作为替代和/或除此之外，间隙液体可以从凝胶被脱出以引起压缩。任何去除液体的合适方法都可以被使用。例如，可以通过排水、蒸发、抽吸、毛细压力、渗透或电渗方法中的一种或多种去除液体。
通过将凝胶吸印(blot)在吸收材料上通过毛细压力可以去除液体。吸收材料可以是纸，尤其是吸水纸。所述材料在压缩后可以从凝胶去除。例如，可以通过支持性宽编织(＞100微米)尼龙网吸印到一沓多孔滤纸中将水合凝胶的实体成分减少至其起始方向的分数并同时增加密度，从而来压缩所述水合凝胶(例如胶原凝胶)。该压缩速率比包括机械压缩的方法速率更慢。然而，可以通过在凝胶的上表面添加第二个网和吸印层来增加压缩速率。
通过蒸发可以去除液体，例如通过在有利于蒸发的条件下孵育凝胶，例如在低于大气压和/或高于室温的条件下。当凝胶含有细胞时，这通常更不优选，因为蒸发去除了水但没有去除溶质以致于凝胶的渗透压将随着它被压缩形成生物材料而增加。
通过抽吸可以从凝胶去除液体。例如，对置于0.45微米滤膜上的标准水合胶原凝胶施加真空(例如多孔板系统中的机械泵)，导致流体含量经过几分钟被减少，这取决于构造物的方向和类型以及真空水平。
在一些实施方案中，可以通过倾斜凝胶来方便的排出液体。在重力和梯度的机械作用下液体随后从凝胶排出。例如，以一定角度取向在其自重作用下在室温的湿室中标准水合胶原凝胶的排水将引起合适的液体损失并由此经过3小时的压缩，并且流体以指数式丧失，经过3天凝胶实体减少6倍。
某些塑性压缩方法，比如渗透、电渗、或蒸发方法，具体说是从凝胶中去除溶剂但没有去除溶质。这可以改变凝胶中流体的离子特性(例如盐浓度、pH)。
当细胞种植于凝胶的骨架内时，优选将凝胶环境维持在细胞存活的生理条件(例如温度、pH、水合作用和离子强度)。在这样的益生性实施方案中，塑性压缩优选并不从生理条件明显改变凝胶流体的离子特性。
在非益生性实施方案中，当凝胶不含有细胞时，凝胶环境不需要是生理条件并且任何塑性压缩方法都是合适的，包括那些改变凝胶流体离子特性的方法，比如渗透方法。
两或多种不同压缩方法可以被用来压缩凝胶，它们或者依次或者同时应用。例如凝胶可以通过机械压缩被塑性压缩，并且优选同时，液体可以从凝胶中通过以下一种或多种方法被提取：抽吸、毛细压力、渗透、电渗。在一些实施方案中，毛细压力和机械压缩的组合可以用于快速压缩。
按本文所述的方法可以包括超过一个，例如2、3、4或更多个不同的塑性压缩阶段。
如上所述，间隙液体可以通过凝胶确定的流体离去表面脱离凝胶。在一些实施方案中，在塑性压缩期间，例如在胶原凝胶的塑性压缩期间，凝胶的外部‘皮肤’(流体离去表面)可以当作为滤器，其允许流体和溶质排出但仍保留胶原原纤维、细胞和/或其它大分子聚合物，比如在凝胶表面的颗粒内含物、生长因子贮库/小泡和矿化颗粒(例如骨矿物或陶瓷仿生微粒)。除此之外或作为替代，凝胶可以被支持在多孔片或膜上，其有利于从凝胶中滤除液体。这可以导致在凝胶表面一些区域的不均匀性压缩，特别是在有特异性流体‘退出’表面的地方。细胞、胶原或其它大分子聚集体的致密层因此可以定位在凝胶表面。这种片层结构可用于生产组织等效植入物。这种制造技术的量级可以调整，例如，用来产生纳米或微米水平的结构特征或结构。
骨架基质的特性在确定由细胞如何构造组织的修复或再生中是重要的，并且初始骨架结构有效指导大部分其后的下游3D结构。因此对于很多应用，它对于组织等效植入物中细胞和纤维的匹配排布是有用的。
骨架基质的细胞和/或纤维可以被匹配排列，例如通过施加跨凝胶的张力。可以在塑性压缩之前、期间和/或之后施加张力。
张力优选是单轴向的并且可以使凝胶经受5-50％单轴向应变(strain)，优选10-30％的单轴向应变。纤维和可能存在的种植细胞，可以在与主应变方向平行的方向上匹配排列。
例如对于胶原凝胶，可以施加5-30％的应变，优选20-25％。
本文所述的方法可以包括对凝胶施加张力以使所述骨架材料纤维和/或所述细胞匹配排列。
例如，可以在塑性压缩过程的起始时、或半途中(例如20-60％压缩)将凝胶置于单轴向张力负荷之下，并随后回到塑性压缩方案，使得由拉伸应变引起的原纤维匹配排列被固定于凝胶中，产生匹配排列的致密复合材料，其在一些实施方案中可以含有活细胞。
作为替代，可以在凝胶被塑性压缩之前，通过夹住凝胶的末端并施加跨其长轴的单轴向应变使纤维匹配排列。
在骨架基质内细胞和纤维的匹配排列描述于Eastwood et al(1998)。
除了骨架、细胞和间隙液体，凝胶可以包括其它组分。尤其是，凝胶可以包括固体元件，例如毛细纤维或多孔珠。毛细纤维可以是刚性、固体聚合物的不溶或可溶性纤维。合适纤维的直径优选小于约100μm。
插入凝胶内的可溶性纤维可以溶解，以在凝胶内形成毛细通道。这些凝胶内的毛细通道是有用的，例如用于以下一个或多个方面：灌注，使药物和/或基因和/或介质递送到骨架中；和与接受者的循环系统吻合。
合适的可溶性纤维可以从可溶性磷酸盐玻璃、polycapryolacetone、聚醋酸酯(polyacetate)、聚羟基乙酸、丝、多糖、或熔盐或结晶盐进行制备。
不溶性纤维是有用的，其可用于递送光学治疗(delivering opticaltherapies)、光学监测、信号传播和/或应变检测。合适的不溶性纤维可以从玻璃制备。
毛细纤维可以在铸制前被插入到凝胶的层之间、添加到凝胶中或可以在铸制后插入到凝胶中。在包括超过一种浇铸凝胶的实施方案中，例如，纤维可以被夹到凝胶之间。
在一些实施方案中，凝胶可以包含多孔珠。凝胶基质的塑性压缩迫使骨架纤维进到多孔珠的孔中以提供紧密结合的结构。例如，当用成骨细胞或软骨细胞种植时，这可以用作人造骨或钙化软骨替代组织。
合适的多孔珠直径可以是大约100-500微米并且可以是任何固体材料，例如多孔陶瓷、玻璃、磷酸盐玻璃、羟基磷灰石、或骨矿物质制备物(从天然骨去除有机相)。
颗粒：凝胶：细胞的比率将取决于颗粒大小和所需的组织特性(例如致密或松散包装的硬组织)。
在一些实施方案中，线性构造物(例如杆状、带状或卷状构造物)可以在末端含有按本文所述的多孔珠，以促进构造物的体内附着，例如通过直接旋入骨中。
多层生物材料是有用的，因为天然组织在微米水平上是分层的并且这些层可以在细胞组织构建的组织化和细胞功能的分离中发挥作用。
本文所述的方法允许产生微结构化生物材料，例如具有多层(即两层或更多层)的生物材料。这些生物材料在生产组织等效植入物中特别有用。
所述的层在移植后也促进组织运动的移位(滑动弯曲屈服(complaint)层)，帮助层中和层间灌注，允许沿着层或层之间各向异性营养物快速迁移例如在腱中，并指引植入后毛细血管、神经、基质等的生长(在最小阻力的平面或通道中生长)。
一种生成生物材料的方法可以包括：
重叠第一和第二凝胶，其中每个凝胶包括骨架纤维基质和间隙流体；和
塑性压缩所述凝胶以产生生物材料，所述第一和第二凝胶在所述生物材料中形成层。
在一些实施方案中，第一和第二凝胶可以是相同凝胶的不同区域，其相互接触，例如通过折叠或卷绕凝胶。
在另一些实施方案中，第一凝胶和第二凝胶可以是不同的凝胶，即可以重叠两个或多个凝胶。
两个或多个凝胶可以有不同的功能和/或活性并且可以在一个或多个物理特性上具有差异。例如，所述凝胶可以在以下一个或多个方面不同：骨架中纤维的组织化、纤维的类型、骨架密度、和存在于凝胶中的大分子聚集体、多孔颗粒、和/或生物贮库(例如生长因子、激素、酶和/或小基质蛋白)的浓度、类型或混合物。
所述凝胶可以被塑性压缩以形成有两层或多层的单片生物材料。
优选的是，所述凝胶被充分融合以致于在机械负荷下不容易分开，例如界面可以对层自身的1-10％的抗断应力保持稳定，更优选5-10％。
两个或更多凝胶的融合允许一层接一层的构建复杂的组织和器官。这可以用于，例如，生产植入物，用于修复或替代神经、腱、软骨、皮肤、骨、泌尿生殖元件、肝、心肺组织、肾、眼组织、血管、肠和腺体。
用于修复神经组织(PNS或CNS)的植入物，例如，可以用胶原外鞘和神经引导材料(例如纤连蛋白)核心周围的细胞来生产。细胞/生长因子(例如NGF)贮库可以被定位在进口和出口。
用于韧带修复的植入物，例如，可以如下生产，通过将羟基磷灰石珠或颗粒掺入PC胶原棒的末端，以在用于位置固定的每个末端形成具有坚硬骨附着的韧带植入物。
用于软骨修复的植入物可以被生产，例如，通过产生种植关节软骨细胞的胶原的卷状或螺旋构造物(举例)，向该卷状物(垂直于长轴)施加第二压缩并在标准生长培养基中培养约7天。驻留的软骨细胞将再次膨胀构造物(通过蛋白聚糖的合成和吸水)从而形成软骨植入物。
结缔(或其它)组织植入物可以用预先确定的脉管通道来生产，通过形成螺旋(或分层)如上具有胶原的构造物，但是使平行纤维(理想直径为20-200微米)间插于层间，其可以从快速可溶的磷酸盐玻璃制备。当玻璃纤维溶解于水介质时(例如植入后或在生物反应器中)，它们穿过胶原植入物离开通道，所述植入物被当作引导毛细(神经)生长的轨道。这种结构跟随并填充这些通道，因为其是最小阻力的路径。
本文所述方法可以使用适于向凝胶施加合适机械负荷(例如方向性压缩和拉伸，优选作为预编程顺序的部分)的机械生物反应器来方便地实施，例如作为集成、自动培养工艺的部分。机械生物反应器优选被改造使得可以培养和/或培育三维组织等效植入物，并且可以，例如，包含单轴向拉伸装置(例如对构造物赋予循环或驰豫负荷张力)以及光学和电化学(O2加葡萄糖)传感器。
作为替代，组织等效植入物(细胞的或非生物的)可以使用具有一系列步骤的连续流过工艺(“传送带”型)来制备，其包括塑性压缩步骤。
本发明的一个方面提供一种从按上述方法生产的生物材料来生产组织等效植入物的方法。例如，生产组织等效植入物的方法可以包括以下的一个：
a)塑性压缩包含骨架纤维基质和间隙液体的凝胶以产生生物材料，或
b)重叠两个或多个凝胶，其中每个凝胶包含骨架纤维基质和间隙液体；和塑性压缩凝胶以产生具有两层或更多层的生物材料；
和，
从所述生物材料生产所述植入物。
每个凝胶可以进一步包含如上所述的活细胞。
塑性压缩可以按前述实施。在一些优选实施方案中，凝胶可以进行机械压缩。
可以引入跨凝胶的张力以匹配排列细胞和骨架纤维。可以在凝胶的塑性压缩之前、期间或之后施加张力。
如上所述，本发明的方法可以在低于室温的条件下实施，例如在大约4℃以使种植的细胞仍保持存活，尽管随着细胞密度增加，灌注距离也随之增加。可以按本文所述增加另外的凝胶层。
植入物的细胞密度和机械特性通过塑性压缩的条件来确定。
例如，生物材料可以被模制和/或成形以产生所述植入物。凝胶可以被模制成预定形状，例如在浇铸和/或塑性压缩期间。在一些实施方案中，在塑性压缩步骤之后形状可以被进一步模制和/或进行进一步压缩。
组织等效植入物可以被成形或模制成任何方便的植入物形式，例如，块、管、带、条、环、卷状、片或线形。组织等效植入物的最终形状将取决于其所应用的具体环境。
组织等效植入物可以被模制成柔韧形，以使其适于进一步成形。塑性压缩，例如，可以是对称的或非对称的。
塑性压缩和产生植入构造物以后，该构造物可以被马上植入到个体中或进行进一步培育以调整骨架基质的精细特性比如硬度、弹性模量等。
在一些实施方案中，通过塑性压缩生成片状生物材料，该生物材料片可以被卷起以形成卷状生物材料。
这允许快速组装三维植入物，例如其可以由外科医生从一个或多个平的二维生物材料层方便地进行操作。
在另一些实施方案中，通过塑性压缩生产片状生物材料，该生物材料可以被折叠以生产包含两或更多层的构造物。此构造物还可以按需要被切割或成形。
构造物可以围绕中心纤维/针卷绕或折叠以产生有中心通道的植入物。
可溶性纤维(例如磷酸盐玻璃)可以定位在构造物的层之间。这些纤维随后溶解从而留下供体内新血管生成或神经再支配的通道。
构造物可以围绕感觉/监测纤维(例如用于O2监测的100-200微米光纤)被卷绕或折叠以获得细胞基质结构状态的连续实时测量，例如植入后或在生物反应器中。
卷绕或折叠的多层生物材料可以被直接用作组织等效物或可以被进一步塑性压缩，例如，使层粘附在一起、获得期望维度、增加细胞密度或改善其它特性。
二次压缩显著改善了生物材料的特性。例如，一旦被形成，包含活细胞的多层构造物可以进行二次压缩以排出更多的间隙液体并提供更大的强度。卷状构造物的二次压缩通常去除60％的剩余液体并产生具有致密带状强材料，其抗断应力可一直增加高达3倍或更多(0.6兆帕到2兆帕)。二次压力或压缩可以使用上述技术实施。
卷绕或折叠的构造物可以保持在维持细胞存活但降低或防止细胞生长的条件下。例如，卷状物可以保存在0-5℃。这防止了与高细胞密度相关的细胞死亡或损伤，例如缺氧性细胞损伤。
如果生物材料有一或多个层或区，所述层或区可以被排列以提供由分开的带或区组成的复杂卷绕或螺旋组装物，其可用于特定的移植应用。例如，所述层可以是共心的，具有外层和一或多个内层。此外，在不同方向卷绕所述片能够提供不同几何形状的构造物。
例如，包含有4个不同区的用于修复和/或替代神经组织的卷状植入构造物显示于图23。所述构造物的组装是通过重叠外片1、神经进入衬底(nerveentry substrate)2、长程纤维引导材料3和含有生长因子的神经退出材料4，压缩所述层并且随后卷起它们以形成最终的螺旋组装物。
折叠或卷绕的生物材料可以用作组织等效植入物，即它可以被引入人或动物体内用于内源组织的修复或替代。
本发明的另一方面提供一种治疗个体中受损组织的方法，其包括：
使用本文所述方法生产组织等效植入物和，
固定所述植入物到所述受损组织以修复和/或替代所述组织。
所述植入物可以通过任何方便的技术进行固定。例如，它可以被在位缝合或粘合。
所有本文所述的构造物，例如卷绕、折叠、二次压缩的生物材料，将进行缝合并且能够手术缝合到身体部位，甚至在肌肉负荷时。
本发明的另一方面提供一种由本文所述方法产生的生物材料或组织等效植入物。
现在将参考附图和以下的实验例以举例而非限制的方式来举例说明本发明的一些方面。本发明进一步的方面和实施方案对本领域普通技术人员是显而易见的。
在本说明书中提及的所有文件在此通过引用并入本文。
图1显示通过机械压缩对(a)各向同性凝胶和(b)各向异性凝胶进行塑性压缩。
图2显示对凝胶进行塑性压缩和吸印的组合。
图3显示对凝胶自我压缩的凝胶量减少(即流体损失％)：在其自重下：具有增加的预压缩胶凝时间：对于水平和45°倾斜的凝胶(点表示平均值±标准偏差，n＝3)。
图4显示在空气中固化的构造物的水分丧失。
图5显示压缩构造物的扫描电子显微镜图，下图是用25％单轴向张力进行预匹配排列之后的图，上图是未进行前述处理的图。(在两个图中白色条＝100μm)。
图6显示经纸和尼龙多孔层的液体吸收(吸印)的相对重要性。
图7显示在一定范围的死重负荷和压缩时间下，同样的胶原凝胶的压缩作用。
图8显示在PC和对照无细胞构造物中和样品片的边缘和主体之间的胶原原纤维密度的差异，通过透射电子显微镜照片的图像分析进行评估(注：对照凝胶允许自我压缩到57％；PC构造物到93％)。框和须线图显示中值原纤维密度，还显示对照和PC构造物的边缘及主体的总体(条)和四分位值之间(框)的范围[对照平均值是～1％(差异不显著)和PC构造物分别是9.9％(边缘)和6.6％(p＜0.005)n＝13-17]。PC和对照构造物之间原纤维密度在各自区域增加7-8倍(*和**p＜0.0001)。
图9显示从提供塑性压缩结构的核心提供压缩脉冲的方案。
图10显示锥形流室，其用于连续流挤出-塑性压缩。
图11显示标准矿化组织生物材料的多孔珠悬液塑性压缩成胶原构造物，作为仿生形骨。
图12显示PC构建片制备和螺旋组装成3D结构的概述，指出卷成3D构造物后边缘层状结构和螺旋层。
图13显示螺旋构造物的末端视图的扫描电镜照片，其显示胶原片的层(界面收缩：直径～2mm)。
图14显示非细胞的(零时)螺旋组装构造物的典型拉伸测试的应力-应变曲线，其显示材料的衰减行为和模量的补充图。构造物的线指示趾区、线性延伸区和屈服点(导致断裂点)。
图15显示细胞和非细胞的螺旋构造物的趾区、屈服点、最大抗断应力和模量直方图(平均值±标准偏差；n＝6-8)。
图16显示的是一个直方图，其显示趾区、屈服点和最大抗断点的应变值。测试构造物或者是非细胞的或者种植人皮肤成纤维细胞(HDF)，它们不培养或培养2周。
图17显示二次压缩胶原凝胶的拉伸应力应变行为。
图18显示单(30μm)PC胶原片内的多薄层结构的SEM外观，其厚度通常＜1-2μm。
图19显示的示意图指示介观结构(薄层)的变化，其能够通过在塑性压缩期间控制流体离去表面和流体离去方向来产生。清楚的板表示多孔、吸收性表面，暗色的板表示不能渗透的片，其不允许流体流过。
图20显示流体流向上局部扰动的影响。清晰的板表示多孔、能吸收的表面和暗色的板表示不能渗透的片，其不允许流体流过。
图21显示螺旋构造物末端视图的扫描电镜照片，其显示由羟基磷灰石增强的胶原片层(界面收缩：直径～2mm)。
图22显示螺旋构造物末端视图的扫描电镜照片，其显示由可溶性玻璃纤维(箭头)增强的胶原片层(界面收缩：直径～2mm)。
图23显示通用“分层”设计的示意图，其用于复杂神经植入构造物的螺旋自组装。
图24显示随体内移植时间变化的血红蛋白指数。
图25显示体内植入物中全部CD31阳性细胞的百分比。
图26显示体内植入物中全部CD45阳性细胞的百分比。
图27显示体内植入物中每个载玻片(slide)的平均细胞数。
图28显示从0时起植入构造物的抗断应变的变化。非细胞构造物以暗菱形表示，细胞构造物以浅方形表示。
图29显示从0时起植入构造物的破断力的变化。非细胞构造物以暗菱形表示，细胞构造物以浅方形表示。
图30显示体内植入物的平均弹性模量。
图31显示当植入后构造物被回收时它们的直径(暗色是非细胞的，浅色是细胞的)。
表1显示胶原构造物在压缩3阶段的平均厚度(单层)。
表2显示在压缩过程期间各个阶段的细胞活力，从起始细胞制备物和新浇铸的凝胶(压缩前)到压缩后，并施加拉伸或干燥。
方法
形成细胞和非细胞胶原凝胶
按前述[1，21]通过用5 M氢氧化钠(Merk，Leicestershire，UK)中和2.4mL无菌鼠尾I型胶原(0.6％乙酸中2.16 mg.mL-1蛋白：First Link(UK)Ltd，West Midlands，UK)、0.3mL 10×浓度Eagle最低基本培养基(EMEM)(Gibco Chemicals，Invitrogen，Scotland，UK)和0.3mL Earle平衡盐溶液(EBSS)(Sigma-Aldrich Co.，Dorset，UK)来制备非细胞胶原凝胶。对于种植细胞的凝胶，悬浮于0.3mL含10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中的106人皮肤成纤维细胞在中和后马上与胶原溶液混合，其代替EBSS。在浇铸点的细胞密度是0.33×106 ml-1胶原凝胶。凝胶被浇铸入矩形模中(33×13×4mm)，并在37℃的CO2孵箱中固化/稳定，对于非细胞凝胶进行70分钟(试验范围35-180分钟)和对于细胞凝胶为1-3小时之间以允许细胞附着。从胶原凝胶丧失流体(自压缩)的确定是基于含水量的降低％。使用定做的平刮铲从浇铸室转移凝胶，其中浇铸室中定位初始含水量，随后在密封的湿室(室温)中孵育进行最低程度的处理，并在0.5、1、2、3、4、24、48、120小时之后再称重(或者水平或者倾斜45°：对于每个测定n＝3)。几乎含水量的所有变化都出现在最初3小时，因此水平3小时自压缩的凝胶被用作稳定对照(获得57％压缩)。
细胞培养和细胞活力测试
如前述[21，22]，通过剥离和脱脂的人皮肤(从手术室在乳房缩小或腹部整形术后新鲜获得，完全获得伦理学批准)的常规外植体培养来制备正常人皮肤成纤维细胞。从2-4mm贴壁组织片段长出的成纤维细胞在5％CO2、37℃条件下在含10％FCS(First Link(UK)Ltd.)和链霉素/青霉素(分别为500μg/ml和500单位/ml：ICN Biochemicals，Thyne，UK.)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM：Gbico，Paisley，Scotland)中扩增。在塑性压缩的每个阶段通过在含1μM钙黄绿素AM(calcein AM，定位活细胞)和1μM的溴乙啡锭同二聚体(ethidium homodimer)(染死细胞)的DMEM+10％FCS中孵育构造物1小时来测定细胞存活。通过荧光显微镜观察活和死细胞分别显示绿色和红色，并且通过显微照片网格计数(从随机区域计数总共4000个细胞)来评估细胞的活：死比率。
塑性压缩和拉伸预匹配
固化和孵育后，如图1所示通过使用多层网和纸片的压缩和吸印组合对凝胶进行常规压缩。简要的说，165μm厚不锈钢网(网孔大小～300μm)和一层尼龙网(网孔大小～50μm)被置于具有两个不锈钢间隔物(300μm厚，图1a)的双层吸收性纸上。胶原凝胶被置于(间隔物之间)尼龙网上，用第二尼龙网覆盖，并在室温负载50g平塑料块(Delrin聚合物)5分钟，获得保护在2个尼龙网之间的平胶原片(20-40μm厚)。单独塑性压缩(即不用吸印增强)的特征是没有吸收性纸。
吸印必然对最终压缩起到一些作用，因为所施加的负荷被330μm间隔垫片限制。凝胶在压缩前和后被称重以获得压缩百分比。负荷和持续时间处于10-50g和从10秒到5分钟之间。压缩后构造物的厚度直接从组织学样品的横切面测量(稳定化对照：57％，对比凝胶重量压缩到87％和91％)。对于‘拉伸预排配’压缩的胶原片(有或没有细胞)在培养室中被水平夹持(在每个末端重叠夹住6-7mm)并且用螺纹位移经～1分钟应变到25％。应变的凝胶被固定于在pH7.4、0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中的4％多聚甲醛中用于显微分析。
胶原片和复合物的螺旋组装
PC胶原片在压缩后马上从它们的尼龙网沿着它们的短轴被卷起，以产生紧的螺旋卷绕棒，13mm×1.75mm直径(图2a)。胶原：纤连蛋白(Fn)和胶原：羟基磷灰石(HA)被用作异源螺旋组装的实例。如前所述[23]在搅动的超滤池中制备定向纤连蛋白垫。简单的说，血浆纤连蛋白[19](Fn：在2M尿素中1-2mg.mL-1.Bio-Products Lab，Elstree UK)在4℃搅拌的超滤池中被浓缩(10kDa分子量截留膜-Millipore，Watford，UK)。获得的Fn垫被冲洗，冷冻干燥并在共压缩前即刻再水化。在压缩层叠中胶原凝胶被定位成与Fn垫互抵(部分覆盖)。复合物的螺旋组装与前相同，从偏移的Fn边缘开始。例如对于胶原：HA，约200mg的HA颗粒(106-180μm：由Plasma BiotalLtd.，Derbyshire，UK友好赠送)被均匀铺展到新鲜浇铸的胶原凝胶的长边缘表面上(至宽度5mm)。此类型构造物的压缩仅将流体吸印至下面的纸层，没有任何上部尼龙网或负荷。此构造物的螺旋组装物(在其短边缘周围)获得了致密的胶原缆(cable)，其具有硬的、嵌入HA的、压缩的末端片。
机械检测
单PC胶原片的机械检测是不可靠的，因为它们的薄结构(20-40μm)以及全部使用螺旋组装的构造物。构造物在检测前保存在EBSS中，检测时在其每端用由氰基丙烯酸酯超级粘合剂增强的2mm薄钢网条夹住，固定到动态机械分析仪(Dynamic Mechanical Analyser)(DMA-7e：Perkin Elmer，Buckinghamshire，UK)中。在以200 mN.min-1负荷速率的单轴向拉伸条件下实施机械检测(83 KPa.min-1的应力速率(stress rate))，直至断裂，其中通过施加缓冲液使之具有恒定的样品水化。每次机械检测的准动态应力-应变值通过连有PyrisTM版本5.02软件(Perkin Elmer，Buckinghamshire，UK)的DMA-7e获得。统计学分析在微软的ExcelTM软件上进行。
成像和图像分析
光学显微镜样品用在pH7.4、0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中的4％多聚甲醛中固定，应用常规蜡包埋和切片(5-8μm)和苏木精/曙红(H&E)或Picro-Sirius Red染色(增强胶原原纤维的双折射)。样品在Olympus BH-2光学显微镜上进行检查。透射电镜(TEM)用于分析胶原原纤维密度，PC构造物(93％压缩)固定于4％多聚甲醛、0.1M pH7.4的二甲胂酸钠缓冲液和2％戊二醛中，并在二甲胂酸盐缓冲液中漂洗，随后用1％(w/v)四氧化锇处理，常规脱水并包埋在Spurr树脂中(Agar Scientific，Stansted，UK)和进行超薄切片。染色切片(2％(w/v)硝酸双氧铀(uranyl nitrate)和Reynold’s柠檬酸铅)在Philips CM12仪器中进行观察。来自PC构造物复本的边缘和凝胶体的随机图像(相同放大倍数)被数字化并画出轮廓以确定胶原原纤维所占的总视野面积的百分比(％)(即确定原纤维的密度)。使用OpenlabTM3.1.5版图像分析软件(Improvision
Figure 200580022828610000210003_0
，Coventry，UK)分析捕获的影像。使用Graphpad PrismTM软件，4版(GraphPad Software
Figure 200580022828610000210003_1
，San Diego，USA)进行统计学分析。对于扫描电镜(SEM)，PC构造物被固定于4％多聚甲醛(在pH7.4的0.1M二甲胂酸钠缓冲液中；2小时)，进一步在0.05M二甲胂酸钠缓冲液中的1％丹宁酸中进行固定(1小时)，并通过一系列醇脱水到六甲基二硅氮烷中并风干。干样品被沿着一个边缘撕开以显露其内部结构，用金钯溅射机包被并在Joel 5500LV SEM(L. Wollweber et alJ.Microsc.1981，121，185)中观察。
结果
塑性压缩
包埋有细胞(总共1百万)的胶原凝胶被压缩，所述压缩使用如图1和2中所示的系统，使用死重(50g)和多孔纸去除所排出的液体。浇铸凝胶是13mm宽、33mm长和～4mm深。尽管在1和5分钟的压缩几乎是相同的，但是使用5分钟的标准化压缩时间。设计‘停止’垫片以得到300μm厚的PC构造物(即～10×压缩)，但是发现因为大的多孔纸片的毛细作用使得该方法运行过度，以致于测量时最终片状构造物为30-50μm厚。这代表＞100倍量级的压缩(从约1.72到0.0172ml)。
凝胶中细胞的起始浓度是约5.8×105/ml和压缩后其增加到5.8×107/ml。假设细胞是10μm半径的球形，细胞构成起始凝胶的约0.18％v/v和最终片状构造物的18％v/v。当然，相同密度的更大细胞代表更大比例的构造物而更小细胞代表更小的比例。
构造物的组成
在压缩过程的结尾(5分钟；50克)细胞密度以总构造物体积计约是15-20％(假设球形，名义体积细胞)。在此阶段，流体的总损失以重量计被确定98.4％，片状构造物湿重为43.5mg。在37℃空气干燥24小时的凝胶重5.4mg，这指示片状构造物包含18％凝胶和82％流体。15-20％v/v细胞(假设为10μm半径的球形细胞)、～20％胶原和平衡水的基本组成与一些简单或天然组织相当。对于5μm半径的球形细胞，细胞含量降到2％v/v。
构造物的细胞活力和培养
在胶原凝胶中包含活的大鼠腱成纤维细胞的构造物按上面所述被组装和压缩。
压缩后立即准确确定成纤维细胞的活力(在40μm厚片的阶段)。使用双荧光染色技术，其中构造物培养物使用在DMEM培养基中的1μm溴乙非啶同二聚体和1μm钙黄绿素AM在37℃处理1小时。当通过荧光显微镜观察时，这导致(分别)在死细胞核中沉积红色荧光色素并使得活细胞质发绿色荧光。对跨构造物的随机视野拍照(在所有情况中应用40×物镜)，(各自舍总共2-300个细胞)，并借助于25mm网格在照片中每个视野计数红色和绿色荧光细胞。从15-20个视野的～4000个细胞确定活/死细胞的比率/确定和表示为存活百分比平均值+/-SD(表2)。
胶凝过程自身(完全水化)对细胞存活没有明显影响，对细胞存活很少有影响(～10％损失)。即使在此处所用构造物的相对高的压缩/收缩比(5分钟内缩减100倍)，在塑性压缩期间活力只有很小降低(～6％)，并且没有由于拉伸匹配阶段而产生另外损失。然而，压缩的构造物是约40μm厚的片形并且作为结果其对脱水非常敏感。表2显示当简单的将其保持在无菌流动罩中流动的室温空气中时(分别为20秒和1分钟)，由于脱水观察到细胞活力快速丧失。这在20秒的时间导致～70％细胞死亡并且仅1分钟后完全丧失活力(即完全干燥)。在此阶段，或者是在液体(培养基/PBS)中或者是在100％湿室中进行操作将减少细胞死亡。
应注意的是在需要更多控制厚度的试验中，去除吸水纸并且在培养基下只用死重实施该方法。
凝胶成熟
因为以任何形式的举起/操作引起液体损失和因此其密度/特性发生改变，所以非压缩胶原凝胶被认为在水环境之外是‘不稳定材料’。通过在湿(100％)室中简单的让凝胶或者平置或者以45度倾斜的非多孔板上，研究与早期液体损失速率相关的不稳定性程度。
图3显示在37℃下增加培育期(在初始固化后，胶原凝胶继续稳定化约2小时)后凝胶随时间的质量(液体)损失。质量在前2小时中急速下降证明了一旦从液体中取出，其固有的机械不稳定性。在与稳定化时期长度相关的水合水平上自压缩突然降到慢压缩速率。
在自压缩期间为增加流动梯度使凝胶倾斜45°，这增加了初始快速压缩的持续期(图3)和明显更大水平的塑性压缩。自压缩180分钟，导致质量减少～57％，其被用来产生稳定化的‘对照’凝胶。
构造物在空气中脱水/水分损失
无细胞胶原构造物(在此情况中在卷动前是压缩的40μm片)按上述新鲜制备(3个平均)并且以精细平衡置于空气中(无流动，室温)以测量由于蒸发导致的水分损失，测量重量的下降(图4)。对于第一阶段重量损失是线性的并且曲线的拐点(～42分钟)表明仅40分钟后就达到几乎完全脱水(注意是在静止空气中没有干燥剂)。这反应了空气干燥的预期时间。
压缩构造物中的匹配排列
标准水化胶原凝胶按上面所述制备并进行塑性压缩。
塑性压缩过程中，凝胶被置于单轴向拉伸负荷下(25％应变)并随后返回塑性压缩方案。观察到由拉伸应变引起的原纤维匹配排列并通过塑性压缩被固定在凝胶中，其提供匹配排列的、致密的复合物。在过程开始时种植于凝胶中的细胞在完成的复合物中是活的。
拉伸预匹配排列的胶原PC片的扫描电镜
通过施加单轴向拉伸负荷以产生总共25％施加应变，从而导致胶原原纤维的拉伸预匹配排列，在此之后用扫描电镜检查无细胞胶原PC构造物(片形)的外观。在JOEL半环境SEM中检查之前，样品在戊二醛中固定，在SEM柱(stubs)上封片，临界点干燥并溅射喷涂金膜用于常规SEM。
图5(上图)显示压缩后的表面拓扑图，其具有尼龙支持网的坚固压印图样(具有从＜1到＞100μm的纤维样结构)。观察该材料表面是由胶原的厚平行纤维组成(与起始胶原原纤维～50-100nm的直径相比增加了许多倍)。施加25％单轴向应变使该压印图样重排成表面槽，其与所施加的应变平行。因为该方法是一种塑性变形，表面的重新构造也是塑性的，导致稳定的、压印的拓扑图样，其通过组合压印和拉伸预匹配排列来控制。因此，在去除所施加张力后此μm和亚μm各向异性图样是稳定的并且包含压缩胶原原纤维的方向性薄层状结构也是可见的(图5(下图))。
吸印的作用
研究通过两个多孔层(纸和尼龙)的液体吸收(吸印)的相对重要性。
此两种材料的矩形条在含有蓝色染料(为了易于显现)的PBS溶液中保持垂直并测量每个液体前沿随时间升高的高度。结果显示在图6中。
尽管观察到两种物质对液体吸收模式的差异，但两者都能显著促进吸印作用。
在本文的一些试验中，为了降低吸印对总流体去除的作用，所述纸层被去除。
这降低了而不是消除了吸印作用。因此有层下纸进行的压缩被称为增强吸印过程。非增强的压缩只使用尼龙层进行。
在液体下实施的压缩，例如为降低脱水作用，完全消除了吸印作用。
压缩条件
在一定范围的死重负荷和压缩时间下，压缩胶原凝胶复本(没有增强吸印)，其中没有多孔纸层的吸印。在每种情况下，构造物起始和完成(压缩)的重量被测量以获得凝胶重量减少的百分比(％)，其结果显示在图7中。
10g负荷10秒的平均压缩是57％，当施加50g进行1分钟时，压缩增加到88％(图7)。使用50g压缩重量进行2分钟后没有观察到进一步压缩并且延长压缩时间到5分钟没有增加流体损失，尽管它确实降低了构造物之间的差异。50g进行5分钟垂直压缩的方案被采用作为标准化方法。这种PC方案降低了初始构造物的厚度，其从凝胶的约3.6mm降到胶原片的23-48μm(表1)，即收缩因子是＞2个数量级。这种胶原片通常含18％胶原和82％流体。胶原密度随构造物种植的细胞而增加，因为这降低了流体的相对含量，最终细胞密度为10-20％(v/v)，其取决于初始种植密度和未贴壁(球形)细胞的直径。这些组成与一些成熟前的结缔组织相当并且适合用于早期组织移植。
通过比较有/无吸印增强的2和5分钟压缩来分析复合影响。对于2或5分钟，吸印增强没有观察到额外的压缩作用。
胶原原纤维密度
确定标准构造物(40μm厚的压缩片：50g进行5分钟)相对于对照构造物的胶原原纤维密度，其中允许通过在湿室中平板上依靠重力压缩而使对照构造物稳定到初始重量的～50％。
从TEM图象通过分析相对于(％)总视野面积的胶原原纤维面积的图像分析来直接确定原纤维密度(所有都是相同放大倍率)。
胶原样品进行常规透射电镜准备，在Philips CM12显微镜检查之前，用戊二醛固定(2.5％在二甲胂酸盐缓冲液中，pH7.5)，包埋于Spurs树脂，进行超薄切片(约40μm厚)和用柠檬酸铅常规染色。从测试凝胶的随机良好质量区域进行高质量显微照像(对于中心-边缘比较，从构造物中心线的两侧随机采取‘中心’区域)。随后这些图象被扫描进图象分析系统(Improvision-Mackintosh，Birmingham，UK)并且胶原原纤维复本在复本区域中描出轮廓以区分纤维间空间和原纤维区。随后图象分析模式产生每区域的原纤维密度％的定量估计。中值密度表示为标准偏差和范围(框和线图)。对照和压缩构造物间密度的比较显示原纤维密度大大增加。
在压缩构造物核心和边缘区中胶原原纤维的密度，包括没有和有细胞，进行比较(图8)。在边缘和核心区，胶原原纤维的密度正如所预期在细胞构造物中都更高，因为测量排除了由细胞占据的体积(因而这有效取代了胶原含量)。边缘区中增加了～50％而核心区增加100％，在两种情况中p＜0.002。非细胞构造物边缘区中原纤维密度比中心区大了约50％(p＝0.0038)。然而，这种差异在种植细胞的构造物中完全消失(显然是由于采样技术和细胞也区域性分离的事实)。正如基于对在压缩期间从胶原凝胶表面液体有效过滤行为的预计(上面)，胶原原纤维朝向构造物边缘分离(即形成薄层或不均匀性)并且胶原原纤维完全保留在该界面处。
管状构造物
压缩超水化材料(凝胶)-细胞构造物的一种替代方案是从结构核心提供压缩脉冲(图9)。这可以用于，例如形成薄壁管。该材料(凝胶)装置在柱形气囊的外表面上形成，使得中心气囊的膨胀扩张构造物(必要时施加期望的机械负荷)，相对多孔(大柱形)模压缩其外表面，由此实现受控的流体表达。对于所产生层的尺度(例如宽孔、薄壁)、分层结构、流体‘离去’方向(即微流向量)、以及向支持物中驻留细胞和纤维施加机械力(例如进行匹配排列)的方面，这是非常有益的。
连续流挤出-塑性压缩
连续流挤出-塑性压缩可以通过锥形流动室的流体表达、组织收缩/压缩来实现(图10)。(胶原)浓液(dope)制备物的预胶凝溶胶(如果需要具有细胞)被处理以使其同时经历方向性剪切力、浓度和流体粘度的增加。
这能够通过利用几分钟的胶凝时间来实现(其能够通过维持温度在4℃和提高到37℃进行受控制的延长)。胶原的预胶凝溶液(或其它相似的液晶聚合物，例如纤连蛋白、丝蛋白或纤维蛋白原)被制备并沿着逐渐变窄的锥形室被缓慢泵送，锥形室的壁是多孔的，允许间隙流体的表达。随着凝胶-溶胶流体沿着室移动它经历方向性剪切力(匹配排列并聚集聚合物纤维)；流体被压出浓液进入多孔壁(大分子聚合物被半透性衬膜保留)随其凝胶化而压缩该材料；溶胶快速固化形成凝胶，随着它从锥形室的远端、收缩孔被挤出其被快速压缩并固化。获得匹配排列‘组织’的一种挤出、致密的缆或线。
多层构造物
按Mudera et al.2000和Prajapati et al. 2000的描述，让三种成纤维细胞定居的构造物(平、矩形胶原凝胶)在单轴向限制(tethered)构造中收缩16小时以实现细胞和胶原原纤维的匹配排列。在零时，每种构造物(或“小片”)约3mm厚，使得总厚度为9mm。在收缩培养完成时，每个小片是2mm厚(总共为6mm)。
3个小片从限制中(tethers)被释放并置入35mm培养皿中，其由(1)粗尼龙网、(2)70μm孔无菌滤膜片支持。所述小片随后用DMEM培养基覆盖(Dulbecco改良Eagle培养基)并置于Dartech机械测试设备的压缩盘之下，并置于37℃、二氧化碳细胞培养箱中。
三个小片构造物在培养中维持5天，以使总构造物为1.5mm厚(即从纤维原匹配排列和塑性压缩阶段使密度共增加6倍)。获得的构造物更致密(光学)、更硬并且3个小片的每一个牢固附着到其相邻片从而获得完全整合的单个构造物。
这证明令人惊奇高效的塑性压缩机制，其在压缩下使胶原原纤维构造物脱水并在培养期结束时整合生物反应器片(获得期望的厚度和物理强度)。所得构造物不回复到它的原始尺度(即没有密度损失)，含有活细胞、并且被机械整合并还是强的。
毛细纤维构造物
按上述制备标准水化胶原凝胶。精细玻璃纤维(35微米直径的磷酸盐玻璃)以平行排列覆盖在胶原凝胶表面。第二胶原凝胶在此复合物表面形成，使得整体结构通过如上所述的塑性压缩被整合。
观察到所得材料是由生物材料的三明治结构组成，其含有活细胞，细引导纤维穿过其长度方向。
骨仿生材料
除了在胶原骨架的纤维中分散大量多孔珠之外，按上述制备标准水化胶原凝胶(图11)。
在胶原凝胶中压缩标准矿物化组织仿生材料的多孔珠悬液，产生适用作仿生骨的材料。
制造卷绕构造物
大约30μm厚，PC胶原片难以操作并且很脆，其导致开发螺旋组装阶段(图12)。这涉及围绕其短轴卷绕片以产生3D杆样‘组织’构造物。螺旋组装的构造物方便用于操作、培养和机械检测。该方法也用来通过堆积PC胶原层产生复杂的三维介观结构，产生范围在10-100μm的结构。
按本文所述从13mm宽×33mm长×～4mm厚的起始凝胶(有或没有细胞)制备标准化螺旋组装的构造物。细胞密度初始时是约5.8×105/ml并且在压缩后增加到5.8×107。通过塑性压缩厚度降低到30-50μm之间后，片沿着其较短(13mm)边缘被卷绕成螺旋组装的杆，得到13mm长、1.75mm直径的构造物。横切该构造物末端的SEM(条＝200μm)显示于图13。
此外，螺旋组装构造物的组织学分析显示当构造物被置于培养之后很多星期，细胞是存活的、有活力的和活动的。
卷绕构造物的组织学分析
从随机定向胶原凝胶(即未经拉伸预匹配排列)形成卷绕螺旋构造物。这些构造物的结构和细胞特征通过标准技术在不同的时间点进行组织学检查(即在二甲胂酸盐缓冲液的甲醛中常规固定，蜡包埋，切片(平行和垂直于长轴)并用H&E染色)。
零时的新组织(压缩后即刻)含有正常、存活外观的致密、均匀间隔的细胞。压缩过程也在30μm片内产生更小量级的结构(即＜10μm)。这种‘结构’由胶原原纤维的压缩薄层组成，其与流体离去表面(FLS)平行，在此情况下是基底表面。这是流体的方向性外出的结果，主要是从单个表面。作为结果，特定材料(胶原原纤维和细胞)被保留在离去界面，有点象在过滤表面的物质压缩。精细的胶原薄层(＜1μm厚)明显遍布于压缩胶原片的深度中，但是在流体离去表面形成最大、最致密的层，并与之平行，正如在双折射模式中所见。
观察到压缩片内的细胞与这些薄层匹配排列。在螺旋组装前，驻留细胞看起来正常和有活性，并通过培养3小时铺展开和附着于胶原基质。
在培养0和14天后(自由漂浮在DMEM培养基中，10％胎牛血清，37℃，在5％CO2孵箱中)，这些细胞铺展开并且附着到基质，并呈现出组织中成纤维细胞的正常3D外观，并均匀分布且没有活性、存活力的明显损失或细胞死亡。在14天阶段，在卷绕构造物的胶原薄层内，细胞是伸长的或盘状的。
5周培养后(无限制的)，观察到致密、活细胞分布在构造物的全部厚度中(即没有无细胞的核心)。有迹象显示通过构造物表面上和在其末端驻留细胞形成新组织，并且据此形成明显区域的分层和结构，使得核心基质和细胞通常以纵向定向，而外细胞层更多是环绕的(通过比较相同构造物平行和垂直平面的切片来确定)。在此阶段，构造物的末端是相对无规则的非结构化生长。在此阶段的明显组织层之间，明确的细胞化薄层(具有插入通道)是显而易见的，尽管不清楚它们形成的时间。在构造物周围的片中突出的胶原层是显而易见的，并且驻留的平盘状细胞位于胶原层内。因此5周构造物与早期天然结缔组织在形态学上是相似的，其在很多胶原纤维层之中或之间包埋有健康细胞。
因此在整个培养期间在致密的3D基质内，细胞无疑是存活和附着的。在更长的培养期间基质的结构逐渐变化(细胞/基质在表面上明显并且在核心内形成通道)，但是遍布于整个构造物(即包括核心)中活跃的活细胞周围的致密结缔组织一般保持恒定。
卷绕构造物的机械特性
已经确认，在构造之后几天和几周时间中，构造物保持活性和有活细胞(具有致密基质)，构造物的机械特性按上述检测。
图14显示非细胞(零时)螺旋组装构造物的典型拉伸检测应力-应变曲线，其显示材料断裂(failure)行为和模量的补充散点图。构造物线指示趾区、线性延展区和屈服点(导致破断点)。观察到细胞凝胶具有减少的或缺少趾区，并且相对于非细胞凝胶其断裂应力和应变降低。
细胞凝胶的细胞成分包含构造物总体积的实质性部分并且该部分比压缩的胶原基质明显更弱。
通过标准PC技术(50g、5分钟)制造的非细胞构造物具有功能有用的的平均拉伸破裂强度(0.6MPa±0.11)以及1.5MPa±0.36的模量，其在培养2周后没有明显改变。用成纤维细胞种植构造物导致PC后高细胞密度，并不令人吃惊的是这分别使屈服强度和模量降低71和34％(图15)，并且使在零时培养点的趾区消失(图16)。尽管模量降低了三分之一，破断应力几乎没有被细胞种植改变(0.55MPa±0.06)。
图15和16显示对于细胞的和非细胞的构造物在零时和对于细胞构造物在2周时平均破断强度和弹性模量的总结(平均值±SD)。
培养2周后，细胞构造物的材料特性几乎已经提高到无细胞构造物的水平，清楚证明新胶原骨架的功能性细胞重建。相对于零时的细胞构造物，屈服应力和模量两者都有增加(分别是约1.5和2倍)，而破断应力保持相同。显著的趾区应变再次出现(几乎从非细胞凝胶损失-2％-)并且屈服应变从13％升高到23％。
这些数据是对应无胶原原纤维拉伸预匹配排列而制备的构造物。对于预匹配排列的构造物，其负荷平行于胶原原纤维取向时，破断应变(strain tofailure)将大大降低(从50％的高水平)。
双重压缩
按上述制造的胶原卷状(即螺旋)构造物使用相似技术进行第二次压缩(二次压缩)以产生平条的致密胶原材料。
已发现细胞和胶原密度与流体损失成正比。由于二次压缩引起的平均重量损失(流体排出)接近(螺旋构造物的)60％。
构造物的机械特性按上述检测并且结果显示在图17中。发现破断应力接近2MPa，模量接近2.5Mpa并且破断时应变可高达70％。因此，发现二次压缩进一步改善了构造物的机械特性。
在正交平面(即平行于其长轴)中螺旋杆状物的压缩产生相似的压缩特性并且所得材料是变平的盘状胶原。
纳-微珠级结构和不均匀分层
两个另外水平的组织化，其内已发现3D结构通过本文所述方法而可控地产生。由于流体从‘流体离去表面’的过滤而预测会形成薄层，并且首先从在极性光照下它们的双折射而被鉴定。薄层在TEM下也能见到并且可测量作为基质边缘和主体之间平均胶原原纤维密度的差异(图18)。薄层总是平行于主流体离去表面。不仅在稳定对照和PC处理的构造物之间发现平均原纤维密度有7-8倍增加，而且在构造物的边缘和主体之间原纤维密度也明显增加。
在塑性压缩期间通过控制流体离去表面和流体离去方向可产生的介观结构的定向和位置的变化显示在图19中。
定向的胶原薄层形成邻近并平行于流体离去表面(对抗多孔层)但是对不渗透层较少如此，产生了简单的不对称(图19A和B)。垂直于第一方向的第二流动方向可以被用来压缩第二平面中的薄层(图19C)。这可以从图19C中形成的压缩薄层产生平行(单轴向)纤维束取向(显示于图19D)。在图19A和19B中，胶原薄层包含包装的原纤维，其平行于离去表面但在垂直平面上随机定向。同时，如图19D所示，双轴向流体吸出将产生两个对称平面，进一步压缩垂直于图19B所示薄层的胶原薄层，以产生与天然胶原原纤维束相当的结构。吸印层和单平面压缩负荷的组合可以用来控制流速。
在流体流动方向的局部扰动的作用显示在图20中。图20A显示含有交替多孔
Figure A20058002282800371
和非多孔[
Figure 200580022828610000210003_2
]条的改进的多孔吸印层(此处凝胶的上表面)，其被压到凝胶表面(非多孔片例如通过涂清漆来产生)上。在非多孔片之下的液体将被迫与离去表面平行流动，其趋向形成垂直于表面的‘部分’薄层。然而，在多孔部分之下，这种移位的流体流动将与主要的、垂直外流的流动融合，形成常规薄层，平行于离去表面。这将产生正交模式的薄层(有过渡区)，其有效产生通过表面胶原片的通道。这种通道具有引导潜能，用于预模式化神经、脉管或上皮的生长。例如，可以利用不同的非多孔模式(例如盘状)，例如与第二、垂直离去表面组合，用于调节薄层和通道结构(图20B)。此外，在一个平面中施加压缩以控制流速率。
螺旋组装使该介观级结构以100微米量级掺入为第二水平的立体组织化。复合PC构造物通过添加或纤连蛋白(Fn)或羟基磷灰石(HA)颗粒来制造。尽管比胶原的程度更小，水化的Fn材料也经历塑性压缩。纤维Fn层被共压缩入胶原中，此两层以偏移(offset)螺旋方式卷绕在一起以产生围绕Fn中心的外部胶原管或鞘，层间具有良好的整合。结构的复杂性也能被控制，用来沿着构造物长度形成区带，正如向构造物形成‘硬组织’末端所示的。这是通过在压缩前沿着凝胶表面的长边缘置放一层HA颗粒来实现的。围绕短边缘螺旋此结构产生‘韧带模型’，其在胶原缆的任一末端具有硬结节。所述复合物的横截图(图21)显示HA颗粒，其包装在共中心的胶原层之间。羟基磷灰石(HA)末端区带允许极好的固定到机械-生物反应器，以及允许在体内固定(例如旋拧)到骨。
有或没有细胞的这些实例举例说明了构造介观级结构的空间和组成范围的可能性。
复合组装
如上所述，具有一定特性和含量范围的多层预构造薄细胞片可以被组装。这些元件自身可以部分使用塑性压缩进行预构造以获得等级强度和组织组成的优势。所述元件利用螺旋组装方法实现微米(介观)量级立体生物复合，用最终压缩阶段将元件结合到一起。例如，对于神经修复植入物，可以向强外部鞘提供非粘性外表面，内建的开-关弛豫(on-and off ramps)(促进细胞(神经突)存活、内生和后期的外生和再整合)并且分级生长因子含量的微贮库被建立在核心部分中。
图23显示这种神经植入物的共中心、螺旋组装。共中心轴确定再生生长轴(2-号箭头)。最终构造物的每个元件或功能形式(鞘、轴突引导丝、持续释放贮库、特化弛豫等)或者被构造为片(＜50μm厚，即细胞尺度)或者构造为片间插入纤维。部分切除的实例具有外部细胞种植层[1](理想地缓慢释放透明质酸，用于抗粘附)，随后是注入所述片[2]的生长因子贮库，其中生长因子等(具有不同组成的贮库)被胶囊化。一片常规纤维状轴突引导‘板’材料，在此也存在纤连蛋白[3]。末端层[2]可以有附属物[4]，其形成设备关弛豫(device offramp)(例如趋触性介观材料(meso-material))。
如从基部(箭头和插入物)所示卷起此复合物将多个介观量级元件自动组装为所需的空间阵列(具有重叠、顺序、界面、空间)。它也具有将2D纳米分层技术的主要优势(使用薄层)转用于具有复杂3D空间/方向组织化的大装置。其发展需要标绘和监测在纳米-(电子显微镜)水平形成的空间模式。
体力植入
如上所述，螺旋状构造物通过塑性压缩制备，其或者有或者没有包埋兔腱成纤维细胞(异源)。多组PC植入物被缝合在兔的肋间肌肉层之间并锚定在肋骨之间，使得它们随动物呼吸产生应变。1、3、5周后植入物被回收并且在它们仍在原位和完整时，对它们的细胞内生的量和模式、胶原沉积(双折射)、炎性细胞的鉴定、毛细管内生进行组织学分析。毛细管的内生也被监测为处死时血红蛋白和氧化血红蛋白的水平，其使用后向散射光谱分析法检测与(氧化)血红蛋白相关的吸光度变化。最后，检测回收构造物在体内机械强度随时间的变化(如前所示在DMA拉伸检测设备上进行)。
在无细胞构造物中细胞生长1周是适度的但是在细胞构造物中更大，其主要在表面上并且在螺旋物周围接着短距离进入更深材料中。很少有新胶原沉积的迹象并且没有脉管内生。
3周的细胞构造物的脉管化更加显而易见，同时非细胞构造物内却没有多少脉管化。对于细胞构造物，细胞内生仍然是更大的，并且在多细胞层中沉积胶原是大量的，其中所述多细胞层生长出更向外和更深的片间螺旋表面。种植细胞的直接参与似乎是最小的，因为它们仍保留在PC胶原材料的深处，而细胞种植构造物中所有的活性在组织学上、一致地大于无细胞构造物。
5周时间在两种类型中都见到细胞生长的进一步增加，并且在细胞种植类型中构造物的核心被完全占据。无细胞构造物在此阶段被充分脉管化并且在两种类型中许多新胶原已经被沉积到螺旋之间和表面上。
后向散射光谱方法显示血红蛋白指数在1-3周之间快速增加，其中该指数在3周时细胞的比非细胞的构造物大～3倍(图24)。非细胞构造物在接下来的2周才达到该水平。这表明细胞构造物在3周时比没有种植细胞的构造物更加脉管化。
尽管在细胞和非细胞类型之间的差异没有达到统计学显著性，细胞的渗透被定量并且在每个时间点都显著增加。在3周后Cd31染色细胞在所有构造物中都增加(图25)。CD45白细胞染色的百分比(％)(图26)始终都相对恒定。在1-3周之间总细胞密度轻微增加(只有细胞构造物有显著性)，但是在3-5周之间快速增加(共增加＞50％)(图27)。
在回收后确定构造物的机械强度。无细胞构造物的破断应力经过初始3周的下降，然后开始恢复。相反地，细胞构造物没有经历弱化并且在体内在3-5周之间强度增加(图28)。对于细胞构造物，破断的总应变更大并且在植入期间有轻微(NS)增加(图29)。非细胞的弹性模量大于移植前细胞构造物。在所有被植入的构造物中，其值降低到移植前值的50％到30％-即被移植的构造物变得更硬(图30)。
细胞构造物的直径在0-5周之间明显增加，但是非细胞构造物没有，并且在5周时在相同点上细胞构造物明显大于非细胞构造物。明显地，质量的任何初始损失在两种构造物类型中至少都有替代(图31)。
总结
本文所述是一种根本性新方法，用来快速工程化具有可控介观量级结构的新组织或人工生物材料。本方法的简便性和极度快速是它的关键特征。本方法在生物医学领域范围内，比如从组织工程、再生和重建外科到持续药物递送材料将具有立即的影响。
塑性压缩(PC)构造产生可重复和可控制的结构，其具有与一些天然组织相近的拉伸特性。该结构仍然比最强的组织弱许多倍(例如腱～100MPa15)，但是现在它们能在体内被缝合和负荷用于进一步重建。机械特性进一步增加可以通过使卷绕或折叠的构造物进行二次压缩来产生，例如与卷绕构造物的长轴平行压缩。这控制了二次压缩，进一步降低流体含量直至60％，其被发现是可重复性增加破断应力直至100％。
构造物机械特性的控制通过选择所用压缩技术和排出间隙液体的程度(或阶段)是可能的。在自压缩期间的阶段1可以观察到由于缓慢的流体损失而产生机械脆性的材料。阶段2中代表为使用单独活动压缩和螺旋(50g、5分钟)，同时第三活动阶段能够通过进行二次压缩来实现，其施用于螺旋自身。在实践中，为了更有效控制流体的去除和由此胶原片的厚度，快速、初步压缩可以被放慢，例如通过仅使用吸印层进行压缩。
通过经螺旋组装的胶原薄层形成、表面形状特征、分带和分层来实现结构特征的介观量级制造，是为了急需的构造局部仿生结构的需要。例如这能够被用来提供用于外周神经再生的独特内生、穿透生长(through-growth)和外生结构(H.M.Geller et al Exp.Neurol.2002，174，125)。显示在本文中的两个螺旋组装实例代表神经再生的模板(胶原鞘和Fn神经突引导核心(J.Phillips et alBiomaterials 2003，25，2769)和韧带模型(胶原缆和用于锚定的硬组织末端))。
体外构造物明显经历了主动重建，即使在最简单的培养系统中也是如此，并且机械负荷将进一步改善拉伸特性。细胞采取组织样分布和形态，其沿着许多胶原薄层排列，具有变平的纺锤形或盘状。这种在胶原层间形成的通道帮助灌注和增强组织样结构。
进行机械检测的构造物中没有进行拉伸预匹配排列并且因此胶原在X和Y平面中基本上是非定向的(即在薄层中原纤维定向是在‘Z’平面中)和这对相对高的依从性可以是有帮助的。诱导X-Y原纤维各向异性产生与天然组织具有更大相似性的物质，尤其是相对于原纤维匹配排列轴的刚度。此外，在本研究中破断应力和屈服应力使用对整个样品中进行测量的横截面积。清楚的是，手动螺旋过程在层之间形成一些通道，其意味着破断强度可能被低估。在培养中改善了机械特性的发现证明了胶原基质经历了天然细胞重建，这提示所述构造物将在体内进行功能性整合。
上述实验数据显示按本文所述的PC制造：(a)基本不降低驻留细胞的活力，(b)产生具有功能性机械特性(强度和依从性)的胶原基质，(c)能够以预测方式控制以产生：(i)具有完全范围细胞和基质-密度组成的复合物，(ii)适合于精确仿生结构的螺旋/带状不均匀性和结构各向异性的特性。发现，(a)驻留的成纤维细胞耐受相对高的流体剪切(即在＜5分钟内＞100倍的收缩)显示出此方法可以被用来进行超快速制造，从而绕开组织制造中的当前瓶颈。具有组织样机械强度的基质的产生(b)意味着构造物能够被直接植入或简单培养后植入。而且，可重复的限制压缩程度的能力，作为流体排出，意味着尺度和机械特性是可控的。以前的差拉伸特性使得不经化学交联或用其它材料增强要缝合胶原凝胶很困难或者不可能，并且由此降低了对天然基质的模仿。
不需要驻留细胞参与的益处是：(i)低温PC制造的潜力，将缺氧和营养需要最小化；(ii)在促进分化前在组织模板内安置干细胞或祖细胞的能力，和(iii)产生具有复杂介观级结构的非细胞生物材料(P.Vadgama etal.，in Institute of Materials，Mineral，Mineral and Mining，London(reportnumber：FMP/03/01/IOM3)，2004，PP.14-18)。其它形式的水化凝胶，例如纤连蛋白、纤维蛋白或合成聚合物可以被用来进一步提供介观量级的组织化。此外，这种方法可以依从大规模生产或床边的‘个体化’制造。
％重量(流体)损失   57％     87％   91％ 0％
胶原厚度   229.0(±14.0)μm(n＝20)     48.2(±8.7)μm(n＝20)   21.8(±5.3)μm(n＝20) 3.6(±0.22)mm(n＝20)
表1
Figure G05822828620070109D000391
参考文献
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Claims (52)

1.一种生产生物材料的方法，其包括：
提供包含支架纤维基质和间隙流体的凝胶；和
塑性压缩该凝胶以生产所述生物材料，其中所述凝胶还包含在所述间隙液体中的活细胞并且该凝胶被塑性压缩以产生包含所述活细胞的生物材料。
2.根据权利要求1的方法，其中活细胞选自肌肉细胞、肝细胞、肾细胞、心细胞、肺细胞、肠细胞、支气管细胞、眼细胞、生殖细胞、脉管细胞、神经细胞、分泌细胞、干细胞、成纤维细胞、施万细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、尿道上皮细胞、骨细胞、软骨细胞和腱细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中在压缩前所述细胞被培养在所述凝胶中少于6小时。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中凝胶具有的细胞密度至少为1×105细胞/ml。
5.根据权利要求4的方法，其中所述压缩生物材料的细胞密度至少为1×107细胞/ml。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述凝胶被压缩少于1小时。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述凝胶在水性液体中被压缩。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中塑性压缩包括减少所述凝胶的体积至少50％。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述凝胶通过从所述凝胶去除间隙液体被塑性压缩。
10.根据权利要求9的方法，其中所述液体通过凝胶的流体离去表面被去除，并且所述生物材料包含与流体离去表面匹配排列的一或多个薄层。
11.根据权利要求9或权利要求10的方法，其中通过向凝胶施加机械力来从所述凝胶去除间隙液体。
12.根据权利要求9的方法，其中所述机械力是压缩力。
13.根据权利要求9或权利要求10的方法，其中通过排出、蒸发、抽吸、毛细压力、渗透或电渗中一种或多种方法来去除间隙液体。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括向凝胶施加拉伸以匹配排列支架纤维和/或细胞。
15.根据权利要求14的方法，其中向凝胶施加10-50％的应变。
16.根据权利要求14或权利要求15的方法，其中在塑性压缩前施加拉伸。
17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述凝胶包含毛细纤维。
18.根据权利要求17的方法，其中毛细纤维是可溶性的并且所述纤维的溶解在所述生物材料中产生毛细通道。
19.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述凝胶还包含多孔珠并且所述塑性压缩驱动支架的纤维进入多孔珠的孔中。
20.根据前述权利要求中任一项的方法，其中塑性压缩形成生物材料片。
21.根据权利要求20的方法，其包括卷起所述片以形成生物材料卷。
22.根据权利要求20的方法，其包括折起所述片以形成具有两或多层的折叠生物材料。
23.根据权利要求21或权利要求22的方法，其包括塑性压缩所述卷绕或折叠的生物材料。
24.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述支架纤维是胶原纤维。
25.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述间隙液体是细胞培养基。
26.根据前述权利要求中任一项的方法，其包括在维持所述细胞存活但不支持细胞生长的条件下保存所述生物材料。
27.根据前述权利要求中任一项的方法，其包括在0-5℃保存所述生物材料。
28.一种根据权利要求1-27中任一项的方法生产的生物材料。
29.一种包含权利要求28所述生物材料或由其组成的组织等效植入物。
30.一种包含塑性压缩凝胶的组织等效植入物，其中所述凝胶包含支架纤维基质和间隙液体；其中所述间隙液体包含活细胞。
31.根据权利要求30的组织等效植入物，其中所述塑性压缩凝胶是卷绕的片。
32.根据权利要求30的组织等效植入物，其中所述塑性压缩凝胶是折叠的片。
33.根据权利要求31-32中任一项的组织等效植入物，其中所述折叠的或卷绕的片已经进行了进一步塑性压缩。
34.根据权利要求1生产生物材料的方法，其包括：
将第二凝胶覆盖在所述凝胶上，其中第二凝胶包括支架纤维基质和间隙液体；和
一起塑性压缩凝胶以生产生物材料，其中所述凝胶在所述生物材料中形成离散的层。
35.根据权利要求34的方法，其中凝胶是相同凝胶的不同区域。
36.根据权利要求34的方法，其中凝胶是不同的凝胶。
37.根据权利要求36的方法，其中覆盖两或多个凝胶。
38.根据权利要求37的方法，其中所述两个或多个凝胶具有根据以下一或多个特征上的差异：
纤维在支架材料中组织化、凝胶中支架的密度、纤维类型。
39.根据权利要求34-38中任一项的方法，其中塑性压缩形成具有两或多层的生物材料片。
40.根据权利要求39的方法，其包括折叠起所述片以形成折叠的生物材料。
41.根据权利要求39的方法，其包括卷起所述片以形成生物材料卷。
42.根据权利要求41的方法，其中所述卷是螺旋组装物，其具有以下一种或多种特征：
层间空间；
相邻层之间的部分重叠；和
沿着所述卷在不同轴向位置处各层的不同组合或变换。
43.根据权利要求40-42中任一项的方法，其包括塑性压缩所述卷绕或折叠的生物材料。
44.根据权利要求34-43中任一项的方法，其包括模制和/或使其成形所述生物材料。
45.根据权利要求34-44中任一项的方法，其中支架纤维是胶原纤维。
46.根据权利要求34-45中任一项的方法，其中间隙液体是细胞培养基。
47.根据权利要求34-46中任一项的方法，其中一或多个所述凝胶包含活细胞。
48.根据权利要求47的方法，其中活细胞选自肌肉细胞、肝细胞、肾细胞、心细胞、肺细胞、肠细胞、支气管细胞、眼细胞、生殖细胞、脉管细胞、神经细胞、分泌细胞、干细胞、成纤维细胞、施万细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、尿道上皮细胞、骨细胞、软骨细胞和腱细胞。
49.一种根据权利要求34-48中任一项的方法生产的生物材料。
50.一种组织等效植入物，其包含根据权利要求49的生物材料或由其组成。
51.根据权利要求29-33和50中任一项的组织等效植入物，用于治疗个体中受损组织的方法中。
52.根据权利要求29-33和50中任一项的组织等效植入物在制造用于治疗受损组织的药物中的用途。
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