DE19755801A1 - Mit die Zelladhäsion vermittelnden Peptiden beschichtete Implantate und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Mit die Zelladhäsion vermittelnden Peptiden beschichtete Implantate und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Abstract
Die Erfindung beschreibt die Möglichkeit der Biofunktionalisierung von Biomaterialien, insbesondere Implantaten, durch deren maßgeschneiderte Beschichtung mit synthetisierten zell- bzw. gewebeselektiven RGD-Peptiden, die in vitro die Adhäsion vorwiegend derjenigen Zell-Spezies stimulieren, die jeweils die Gewebeintegration des entsprechenden Biomaterials vollführen sollen.
Description
Die Erfindung betrifft Implantate allgemeiner Art für den menschlichen und tieri
schen Körper, welche mit Peptiden beschichtet sind, die die Adhäsion spezifischer
Zellen in der jeweiligen Umgebung des Implantats selektiv zu vermitteln vermögen.
Insbesondere betrifft die Erfindung mit RGD-Peptiden beschichtete Implantate und
Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Erfindung beruht auf dem Prinzip der zielgerichteten Adhäsionsstimulierung
ausgewählter Zell-Spezies auf Oberflächenbeschichtungen von Biomaterialien im
allgemeinen und Implantaten im speziellen zum Zweck der gewebeselektiven, be
schleunigten und verstärkten Integration derselbigen nach operativem Einbringen in
das entsprechende Gewebe.
Auf diese Weise können verschiedene Oberflächenteile eines Implantats mit ver
schiedenen, die Zelladhäsion vermittelnden Peptiden, insbesondere RGD-Peptiden
beschichtet und zur Verfügung gestellt werden, die der speziellen Gewebeumge
bung, in welcher die Implantat eingebracht werden, Rechnung tragen.
Auf diese Weise wird zudem im Hinblick auf "Tissue Engineering" die Generation
"intelligenter" biohybrider Organe durch Selbstorganisation möglich, die die biolo
gische Information zu einer Organregeneration durch gezielte Aktivierung verschie
dener Zell-Spezies durch verschiedene Peptide in unterschiedlichen Regionen der
Implantatoberfläche tragen.
Der Terminus "erfindungsgemäße Peptide" umfaßt im folgenden, wenn nicht spe
ziell anderes oder zusätzliches gesagt wird, alle Peptide, die die Zelladhäsion zu
vermitteln vermögen. Hierunter sind vorallem solche gemeint, die die Aminosäuren
Argenin (R), Glycin (G) und Asparaginsäure (D) hintereinander enthalten (RGD-
Peptide). Beispiele von geeigneten RGD-Peptiden und geeigneten nicht RGD
haltigen Peptiden sind weiter unten aufgeführt. Umfaßt sind ferner entsprechende
Peptide, die nicht die RGD-Sequenz enthalten, aber dennoch die Zelladhäsion be
einflussen. Im weitesten Sinne umfaßt die Erfindung auch nicht-peptidische Verbin
dungen, welche qualitativ die gleiche biologische Aktivität wie die besagten pepti
schen Verbindungen aufweisen.
Als Biomaterialien oder Implantate im erfindungsgemäßen Sinn werden Materialien
bezeichnet, die in den menschlichen oder tierischen Körpers eingebracht werden
können, um die Funktion des entsprechenden funktionsgeschädigten natürlichen
Gewebes wiederherzustellen. Hierzu zählen beispielsweise Hüftendoprothesen,
künstliche Kniegelenke, Kieferimplantate, Sehnenersatz, Hautersatz, Gefäßprothe
sen, Herzschrittmacher, künstliche Herzklappen, Brustimplantate, Stents, Katheder
und Shunts.
Das Integrationsverhalten von Implantaten in den Körper erweist sich nach wie vor
als problematisch. Die Gewebeintegration der Materialien verläuft häufig zu lang
sam und zu unvollständig, um eine für die Funktionalität ausreichende mechanische
Stabilität der Gewebe/Biomaterial-Bindung herzustellen. Ursächlich verantwortlich
hierfür ist häufig die Beschaffenheit der Implantatoberfläche, die aufgrund ihrer un
zureichenden Grenzflächenkompatibilität bzw. Bioverträglichkeit eine aktive Anla
gerung von umliegendem gesunden Gewebe bzw. Zellen behindert. Dies erschwert
die Ausbildung einer stabilen Gewebe-Implantat-Grenzschicht und führt damit zu
einer inadäquaten Gewebeintegration, die wiederum in Lockerungen, Gewebere
sorption, Infektionen, Entzündungen, Allergien, Microthrombenbildung (Restenose)
resultieren. In der Folge werden Revisionseingriffe zum Austausch der Implantate
(z. B. Hüftendoprothesen, Kieferimplantate, Katheder oder externe Fixateure) und
damit erneute operative Eingriffe erforderlich (Malchau und Herberts, 1996, Pro
gnosis of the Total Hip Arthroplasty, 63. Annual Meeting of the American Academy
of Orthopaedic Surgeons, Atlanta; Haddad et al. 1996, The Journal of Bone and Jo
int Surgery, 78-B: 546-549; Collinge et al., 1996, Pin Tract Infections).
Darüber hinaus erweist sich insbesondere bei Hüftendoprothesen die sogenannte
aseptische Implantatlockerung als problematisch, bei der nicht, wie gewünscht,
Knochenzellen und damit Knochengewebe die direkte Verbindung zum Biomaterial
ausbilden, sondern als störende Elemente Fibroblasten und Bindegewebe auftreten.
In der Konsequenz wird die Prothese dadurch anstelle von Knochengewebe von
Bindegewebe umkleidet, wobei die resultierende Stabilität der Prothese-
Bindegewebe-Bindung nicht ausreicht, um den mechanischen Anforderungen an die
Kraftübertragung eines künstlichen Hüftgelenks gerecht zu werden. Dies kann in der
Folge zu einer Auslockerung der Prothese führen (Pilliar et al., 1986, Clin. Orthop.,
208: 108-113) und erfordert ebenfalls eine Revision.
Besonders schwerwiegend wirkt der Mangel an Integrierbarkeit von Biomaterialien
bzw. Implantaten in den Körper im Falle von kompletten Ersatzorganen, da hier die
verschiedenartigen Zelltypen in Kontakt mit dem Implantat treten und die erforder
liche Integrierbarkeit zielgerichtet sein sollte. Um extrem aufwendige Transplanta
tionsprozeduren mit Hilfe anderer Patienten zu vermeiden, wird beispielsweise an
gestrebt, die Therapie des Funktionsversagens von Leber, Pankreas, Niere und Milz
immer häufiger im Rahmen des "Tissue Engineering" mittels sogenannter biohybri
der Organe zu vollführen, die aus Trägermaterialien bestehen, welche mit lebenden
Zellen belegt sind und als funktionelle Einheit implantiert werden können. Meistens
werden hierzu funktionsfähige, gesunde Zellen in vitro in resorbierbare oder nicht
resorbierbare Membranen eingeschlossen bzw. verkapselt und als künstliche biohy
bride Organe oder Hohlorgane in den Patienten transplantiert (z. B.: Lim et al.,
1980, Science 210, 908-912; Altman et al., 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12, 43-45;
Zekorn et al., 1989, Transplantation Proceedings 21, 2748-2750; Altman et al.,
1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12, 43-45; EP 0 504 781 B1). Allerdings treten auch
hier sehr oft die beschriebenen Problematiken der fibrösen Einscheidung mit ver
bundener mangelnder Nährstoffversorgung der Transplantate, immunologischer
Abwehrreaktionen durch Zell-Freisetzung aus den Kapseln sowie die Bildung von
Blutgerinnseln aufgrund der Thrombogenität der Materialoberflächen auf.
Es ist bekannt, die Gewebeintegration von Biomaterialien/ Implantaten durch Be
schichtung derselben mit Peptiden, die die Zell-Adhäsion vermitteln, zu stimulieren.
Hierzu kennt man zum einen solche Peptide, die die Tripeptid-Aminosäure-Sequenz
Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD), bzw. deren nicht-peptidische Analoga und
zum anderen zelladhäsionsvermittelnde, nicht RGD-haltige Peptide (Beispiele siehe
unten), bzw. deren nicht-peptische Analoga enthalten, welche bekanntermaßen als
integrale Bestandteile vieler Proteine u. a. der extrazellulären Matrix (z. B. Kollagen
Typ I, Fibronectin, Laminin, Vitronectin, Entactin, Osteopontin, Thrombospondin)
oder der Blutgerinnungskaskade (Fibrinogen, von Willebrand Faktor) als zentrale
Erkennungsmuster für die Adhäsion von eukaryontischen Zellen fungieren (z. B.:
Pierschbacher und Ruoslahti, 1984, Nature, 309: 30-33; Yamada, 1991, J. Biol.
Chem., 266: 12809-12812). Die erfindungsgemäß definierten Sequenzen werden von
den jeweiligen Rezeptoren auf der Zell-Oberfläche, den Integrinen, erkannt und ge
bunden. Da die Adhäsion von Zellen an die entsprechenden Proteine durch eine
Vielzahl verschiedener Integrine vermittelt wird, ist das Integrin-Expressionsmuster
einer Zell-Spezies entscheidend für deren Adhäsionseigenschaften an diese Proteine.
Das maßgeschneiderte Design und die Synthese von zumeist kurzkettigen, mit den
entsprechenden Sequenzen ausgestatteten Peptiden, die selektiv und spezifisch nur
an bestimmte Integrine binden können, ermöglicht die zielgerichtete Aktivierung
nur derjenigen Zell-Spezies, die diese Integrine exprimieren. So kennt man z. B.
RGD-Peptide, die selektiv an alphav-Integrin-Rezeptoren binden und damit bevor
zugt die Bindung (Adhäsion) von alphavbeta3-/alphavbeta5-tragende Zellen
(Osteoblasten, Osteoclasten, Endothelzellen) stimulieren können (Haubner et al.,
1996, 7, Am. Chem. Soc., 118: 7461).
Die Beschickung von Implantatoberflächen mit synthetisch zugänglichen, erfin
dungsgemäß definierten Peptiden ist bekannt. Dabei werden die Peptide entweder
durch Adsorption oder aber durch kovalente Bindung auf der Oberfläche mehr oder
weniger fixiert. In der DE 197 06 667 werden zum Beispiel Biomaterialien be
schrieben, die Knochenersatzmaterialien betreffen, die auf einem porösen Polymer
material basieren, das eine durch Adsorption bedingte Oberflächenbelegung mit
Peptiden mit RGD-Aminosäuresequenz aufweist. Aus der WO 91-05036 sind wei
terhin metallische Prothesen, insbesondere aus Titan bzw. Titanlegierungen bekannt,
an deren Oberflächen Peptide, die u. a. auch RGD-Sequenzen aufweisen können, ko
valent gebunden sind. Valentini et al. (May 1997, Transactions of the 23rd Annual
Meeting of the Society for Biomaterials, New Orleans, USA) beschreiben die Kova
lente Anbindung von RGD-Peptiden an mit einer fluorinierten Ethylenpropylen-
Zwischenschicht versehene Titanschrauben. Rezania et al. berichten auf der gleichen
Veranstaltung von Siliciumdioxid- bzw. Titandioxid-Oberflächen welche über kova
lente Bindung mit aminofunktionalen Organosilanen beschichtet sind und vollfüh
ren mittels eines heterobifunktionalen Quervernetzers wiederum kovalent die An
bindung thiolhaltiger RGD-Peptide.
Diese technischen Lösungen gehen jedoch nicht auf das Erfordernis ein, Implantate
bzw. Biomaterialien zur Verfügung zu stellen, deren Oberfläche gezielt mit erfin
dungsgemäß definierten Peptiden beschichtet sind, die selektiv an den jeweiligen
Zelltyp des das betreffende Implantat umgebenden Gewebes angepaßt sind.
Es wäre daher wünschenswert, Biomaterialien in der Art verändern zu können, daß
gezielt diejenigen Gewebe oder Zell-Spezies, die auch nach Einbringen des Implan
tats in den Körper mit diesem aktiv in Funktion treten sollen, also z. B. Knochenzel
len bei Hüftendoprothesen oder Epithelzellen für Haut-, Haar- oder Zahnersatz, aus
schließlich oder bevorzugt zu deren Gewebeintegration veranlaßt werden.
Es wäre ferner eine wünschenswerte und attraktive Strategie, Implantate mit denje
nigen erfindungsgemäß definierten Peptiden (bzw. deren nicht-peptidischen Analo
ga) zu beschichten, die die Adhäsion derjenigen ausgewählten Zelltypen ausschließ
lich oder zumindest bevorzugt stimulieren, welche die entsprechenden komplemen
tären Integrine tragen, was in der Folge zur beschleunigten in vivo-Synthese des
entsprechenden ausgewählten Gewebes führt.
Hinsichtlich der Entwicklung kompletter biohybrider Organe (Haut, Blutgefäße,
Harnwege, Blase, Ösophagus, Pankreas, Leber, Milz, Niere) wäre es ein entschei
dender Fortschritt, die jeweils für ein bestimmtes Organ gewünschten verschiedenen
Zell-Spezies durch Beschichtung unterschiedlicher Oberflächenteile eines Implan
tats mit verschiedenen zellselektiven erfindungsgemäß definierten Peptiden zielge
richtet, räumlich definiert und koordiniert zur Durchführung unterschiedlicher zellu
lärer in vivo-Prozesse aktivieren zu können.
Die vorliegende Erfindung beschreibt nun die Möglichkeit der Biofunktionalisie
rung von Biomaterialien, insbesondere Implantaten für alle denkbaren Organe durch
deren Beschichtung mit synthetisierten zell- bzw. gewebeselektiven erfindungsge
mäß definierten RGD-Peptiden, die in vitro die Adhäsion vorwiegend derjenigen
Zell-Spezies stimulieren, die jeweils die Gewebeintegration des entsprechenden
Biomaterials vollführen sollen. Mit der Verwendung solcher Beschichtungen ist eine
beschleunigte und die verstärkte Integration verschiedener Biomateriali
en/Implantate mit verbesserter Langzeitstabilität nach deren Einbringen in den Kör
per zu erzielen.
Darüber hinaus bestehen mit diesem Konzept der Beschichtung verschiedener Ma
terialoberflächenteile eines Implantats mit unterschiedlichen erfindungsgemäß defi
nierten Peptiden alle Möglichkeiten zur Entwicklung von "intelligenten", biohybri
den Organen ("Tissue Engineering"), die die biologisch Information zur selektiven
Aktivierung verschiedener Zielgewebe bzw. Zielzellen tragen und damit durch
Selbstorganisation in den Körper integriert werden und hierdurch eine Gewebeinte
gration verstärken oder gar erst ermöglichen können.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Implantat, welches geeignet für unter
schiedliche menschliche und tierische Organe ist, bestehend im wesentlichen aus ei
ner Trägermatrix und einer diese Matrix umhüllenden Peptid-Beschichtung, die zur
zielgerichteten Adhäsionsstimulierung von menschlichen oder tierischen Körperzel
len Peptide enthält, welche Sequenzen aufweisen, die Bindungsstellen auf den für
die Adhäsion verantwortlichen Integrin-Rezeptoren auf humanen oder tierischen
Zellen erkennen, wobei die Trägermatrix reaktive bindungsfähige Gruppen an ihrer
Oberfläche aufweist, die dazu befähigt sind mit entsprechenden funktionellen reak
tiven Gruppen besagter Peptidschicht eine stabile kovalente Bindung einzugehen,
wobei das Implantat sich dadurch auszeichnet, daß besagte Peptide so lokal unter
schiedlich auf der Oberfläche des Implantats angeordnet sind, daß sie aufgrund ihrer
entsprechend unterschiedlichen strukturbedingten, zelladhäsions-stimulierenden
Aktivität spezifisch dem natürlichen unterschiedlichen komplementären Integrin
muster der in jeweiligen Region an sie angrenzenden Gewebezellen entsprechen, in
die das Implantat eingebracht werden soll, wodurch ein lokal differenziertes und
selektives bioaktives Beschichtungsmuster der Implantatoberfläche vorliegt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von für Orga
ne/Gewebe geeigneten Implantaten auf Basis einer anorganischen Trägermatrix, die
eine Oberfläche besitzen, welche mit die Zelladhäsion stimulierenden Peptiden be
schichtet sind, wobei die besagten Peptide selektiv in Bezug auf das komplementäre
Integrinmuster der an das Implantat unmittelbar angrenzenden Gewebezellen sind,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man nach an sich bekannten Methoden (i) in
vitro die Integrinrezeptor-Struktur der Zielzellen bzw. des Zielgewebes, in welches
das Implantat in vivo eingebracht werden soll, bestimmt, (ii) die Peptide mit der ent
sprechenden komplementären Struktur auswählt bzw. synthetisiert und (iii) die be
sagten Peptide an die betreffende Oberfläche des Implantats bindet.
Insbesondere sind Gegenstand der Erfindung Verfahren und Implanta
teßiomaterialien mit folgenden Charakteristika: die besagten Peptide, insbesondere
RGD-Peptide sind durch kovalente Bindung, gegebenenfalls über verzweigte, ober
flächenvergrößernde Moleküle und/oder Molekülanker an die Implantatoberfläche
fixiert; bevorzugt werden RGD-Peptide verwendet, die alphavbeta3-/alphavbeta5-
tragende Zellen, insbesondere also beispielsweise die Adhäsion von Osteoblasten,
Osteoclasten, Endothelzellen stimulieren können; als Trägermatrices werden ge
formte oder ungeformte Teile aus Keramik, Polymermaterial oder Metall oder ein
biohybrides Organ oder Hohlorgan eingesetzt.
Die erfindungsgemäß definierten Peptide sind auf molekularer Ebene im wesentli
chen aus folgenden Bestandteilen konzipiert:
- - einer die für die Adhäsion zuständige Aminosäuresequenz-tragenden Domäne (z. B. die genannte RGD-Sequenz), die selektiv eine ausgewählte Zell-Spezies er kennt und bindet.
- - einem Abstandshalter, um die zellerkennende und die Erkennungssequenz tragende Domäne den Zellen in solcher Art zu präsentieren, daß eine Zellbindung unter sterischen Gesichtspunkten erst möglich wird.
- - einem Molekülanker, der die stabile Anbindung des betreffenden Peptid-Derivats an die Biomaterial- bzw. Implantatoberfläche vollzieht.
- - optional kann die Zell-Adhäsion durch zusätzliche Kopplung der erfindungsgemäß definierten Peptide an verzweigte Molekülstrukturen (sogenannte Dendrimere oder Tentakel) die einen oberflächenvergrößernden Effekt ausüben, bevor die Bindung an die Biomaterialoberfläche erfolgt, gesteigert werden.
Unter der Oberfläche des Biomaterials bzw. Implantats ist erfindungsgemäß nicht
nur die unmittelbare Oberfläche der Trägermatrix zu verstehen, sondern auch eine
gegebenenfalls vorhandene zusätzliche Beschichtung aus beispielsweise polymerem
Material, natürlichen oder artifiziellen Knochenmaterialien, Proteinen oder Protein
derivaten.
Als Trägermatrix eigenen sich vorallem Materialien aus Keramik, Metall, Polymer
materialien (z. B. PMMA) oder vorzugsweise resorbierbaren Knochenersatzmateria
lien. Besonders geeignet sind resorbierbare bzw. bio-abbaubare Werkstoffe, z. B.
aus Polylactiden, insbesondere racemische D,L Polylactid-Verbindungen oder re
sorbierbare Calciumphosphat-bzw. Hydroxyl-apatit-Mischungen, die bewirken
können, daß der ursprüngliche Gewebezustand wiederhergestellt werden kann und
wie sie beispielsweise aus der WO 96/36562 oder der EP 0 543 765 bekannt sind. Je
nach Einsatzgebiet kann als Trägermatrix auch Collagen oder Agar geeignet sein.
Unter dem Begriff "biohybrides Organ" ist eine üblicherweise anorganische Matrix
zu verstehen, die mit lebenden Zellen auf irgendeine Weise beladen bzw. verbunden
sind (siehe oben). Erfindungsgemäß ist darunter auch eine entsprechende Anordnung
zu verstehen, die frei von Zellen ist und nur die entsprechenden verschiedenartigen
erfindungsgemäß definierten Peptide auf unterschiedlichen Implantat-Oberflächen
teilen aufweist, welche, in das defekte Gewebe eingebracht, selektiv die umgeben
den Zellen zu aktivieren vermögen. Der Vorteil solcher azellulärer biohybrider Or
gane besteht darin, daß "intelligente", biokompatible Implantate, die kostengünstig
und kontrollierbar produziert werden können, die biologische Information zu einer
Organregeneration tragen. Die Integration solcher biohybriden Organe in den Kör
per wird dann durch körpereigene Regenerationsprozesse mittels Selbstorganisation
vollzogen, wodurch immunologische Abwehrreaktionen, wie sie beispielsweise
durch implantierte Fremd-Zellen oder Fremd-Proteine oft auftreten, vermieden wer
den können.
Die Implantate liegen erfindungsgemäß in der Regel in Formkörpern bzw. Prothesen
vor, wobei der Formkörper dem jeweiligen Gewebe-/Knochendefekt angepaßt sein
sollte. Im Falle biohybrider Organe können die Prothesen lediglich aus mit oder oh
ne entsprechende Zellen und den erfindungsgemäß definierten Peptiden beschichte
teten Membranen oder Folien bestehen oder aber die Anordnungen, wie sie z. B. aus
der EP 0 504 781 bekannt sind, aufweisen.
Als erfindungsgemäß einsetzbare Peptide kommen alle Peptide und deren Verbin
dungen mit nicht-peptidischen Substituenten, die eine für die Zelladhäsion verant
wortliche Domäne bzw. Aminosäuresequenz enthalten und die über ihre peptidi
schen und nicht-peptidischen Substituenten auf den Implantatoberflächen binden
können, in Betracht. Insbesondere kommen entsprechende Peptide mit einer RGD-
Sequenz in Frage.
Folgende Aufzählungen von bevorzugten Peptiden bzw. Peptidverbindungen soll
lediglich beispielhaften und keinerlei limitierenden Charakter haben, wobei folgen
de Abkürzungen verwendet werden:
Asp (D) = Asparaginsäure
Gly (G) = Glycin
Arg (R) = Arginin
Tyr(Y) = Tyrosin
Ser(S) = Serin
Phe(F) = Phenylalanin
Lys (K) = Lysin
DPhe (f) = D-Phenylalanin
Pro(P) = Prolin
Leu(L) = Leucin
Ile(I) = Isoleucin
Val(V) = Valin
Glu(E) = Glutaminsäure
Thre(T) = Threonin
Ala(A) = Alanin
Asp (D) = Asparaginsäure
Gly (G) = Glycin
Arg (R) = Arginin
Tyr(Y) = Tyrosin
Ser(S) = Serin
Phe(F) = Phenylalanin
Lys (K) = Lysin
DPhe (f) = D-Phenylalanin
Pro(P) = Prolin
Leu(L) = Leucin
Ile(I) = Isoleucin
Val(V) = Valin
Glu(E) = Glutaminsäure
Thre(T) = Threonin
Ala(A) = Alanin
RGD (Arg-Gly-Asp),
GRGD (Gly-Arg-Gly-Asp),
GRGDY (Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr),
RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser),
GRGDS (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser),
RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe),
GRGDF (Gly-Arg-Gly-Asp-Phe),
cyclo-RGDfK (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin),
GRGD (Gly-Arg-Gly-Asp),
GRGDY (Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr),
RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser),
GRGDS (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser),
RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe),
GRGDF (Gly-Arg-Gly-Asp-Phe),
cyclo-RGDfK (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin),
LDV (Leu-Asp-Val),
LGTIPG (Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly),
REDV (Arg-Glu-Asp-Val),
IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val),
YIGSRG (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly),
LRE (Leu-Arg-Glu),
PDSGR (Pro-Asp-Ser-Gly-Arg),
DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala),
RYVVLPR (Arg-Tyr-Val-Val-Leu-Pro-Arg).
LGTIPG (Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly),
REDV (Arg-Glu-Asp-Val),
IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val),
YIGSRG (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly),
LRE (Leu-Arg-Glu),
PDSGR (Pro-Asp-Ser-Gly-Arg),
DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala),
RYVVLPR (Arg-Tyr-Val-Val-Leu-Pro-Arg).
Die erfindungsgemäß definierten Peptide können sowohl linear als auch zyklisch
sein. Die oben genannten Peptide bzw. Peptidsequenzen können auch innerhalb län
gerer Peptide mit je nach ausgewähltem erfindungsgemäßen Peptid etwa insgesamt
4 bis 20 Aminosäuren vorkommen. Ebenso sind Aminosäuren, welche D- oder L-
Konfiguration aufweisen oder die C- und/oder N-alkyliert sind, erfindungsgemäß
mit umfaßt. Unter zyklischen Peptiden werden erfindungsgemäß solche Peptide
verstanden, die über eine Amidbindung ringförmig geschlossen sind, wobei im
Molekül vorzugsweise keine freien Carboxyl- oder Amino-Gruppen vorhanden sind.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß RGD-Peptide, insbesondere solche aus
der oben genannten Liste und hiervon besonders das Pentapeptid RGDfK, welches
in seiner zyklischen Form aus der DE-OS-195 38 741 bekannt ist.
Entsprechende erfindungsgemäß definierte lineare und zyklische Peptide sind zum
Beispiel in folgenden Patentanmeldungen beschrieben: EP 0 632 053, EP 0 655 462,
EP 0578 083, EP 0 770 622, DE 195 38 741. Insbesondere sind jene Peptide geeig
net, die selektiv an alphavbeta3-/alphavbeta5-Integrin-exprimierende Zell-Spezies
(z. B. Osteoblasten, Osteoclasten, Endothelzellen) binden. Die Peptide sowie die ent
sprechenden Derivate können nach Standardmethoden leicht synthetisiert werden,
sofern sie nicht anderweitig erhältlich sind.
Prinzipiell können die erfindungsgemäß definierten Peptide an die Oberfläche des
Biomaterials durch Adsorption oder Kovalenzbindung fixiert sein. Die Adsorpti
onsmethode ist bei Verwendung unterschiedlicher Peptide an ein und demselben
Implantat weniger gut geeignet, da die erfindungsgemäß lokal selektive unter
schiedliche Belegung der Oberfläche mit dieser Technik nur schwer zufriedenstel
lend zu bewerkstelligen ist.
Die Kopplung der Peptide bzw. deren nicht-peptidische Analoga an Trägeroberflä
chen durch Kovalenzbindung meist mittels sogenannter Molekülanker ist per se hin
reichend bekannt und beschrieben worden, so beispielsweise bei Singer et al. (1987,
J. Cell. Biol. 104: 573); Brandley, Schnaar (1989, Develop. Biol. 135: 74); Massia,
Hubbell (1990, Anal. Biochem. 187: 292); Hirano et al. (1991, J. Biomed. Mat. Res.
25: 1523); Lin et al. (1992, Biomaterials 13: 905); Nicol at al. (1992, J. Biomed.
Mat. Res. 26: 393); Dee et al. (1995, Tissue Engin. 1: 135), ohne daß dabei aller
dings auf die Beschichtung von Implantaten im allgemeinen und im speziellen in ir
gend einer Weise eingegangen wäre.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind nun neue Anwendungen von an sich
bekannten Beschichtungsmethoden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Implan
tate, wie zum Beispiel das "Kevloc"-Verfahren (EP 0 712 621), welches erstmals
erfindungsgemäß zur Kopplung der genannten Peptide (bzw. deren nicht-peptidische
Analoga) an Oberflächen, welche Acryolyl- bzw. Methacryolyl-Ankerkomponenten
enthalten, eingesetzt wurde, oder das "Silicoater"-Verfahren (DE-OS 42 25 106),
das hier erfindungsgemäß zur Kopplung der entsprechenden Peptide mittels Acry
loyl- oder Methacryloyl-Ankerkomponenten in der Regel über eine Acryloyl-
/Methacryloyl-Silanderivat-Zwischenschicht (z. B. 3-Methacryloxypropyl-trimeth
oxysilan) an die entsprechenden Trägermatrices verwendet wurde. Eine weitere
Möglichkeit, die erfindungsgemäß definierten Peptide an die Oberfläche der Trä
germatrix bzw. des Implantats zu binden, besteht in der analogen Anwendung eines
Silanisierungsverfahrens, das in der DE-OS 43 21 005 beschrieben ist, welches ur
sprünglich die technische Lehre der Beschichtung von Perlglanzpigmenten für Was
serlacksysteme für Metalle und Kunststoffe in der Automobil- und Kunststoffindustrie
darlegt. Ferner ist erfindungsgemäß ein Verfahren für die Beschichtung von Gol
doberflächen mit thiolgruppentragenden Peptiden geeignet, das ursprünglich in ei
nem anderen Zusammenhang beschrieben wurde (Heuvel et al., 1993, Analytical
Biochem. 21 S. 223).
Die geschilderten Verfahren sind bislang für die Beschichtung von Implantaten
zwecks deren Bioaktivierung noch nicht eingesetzt worden.
Die Kopplung der entsprechenden erfindungsgemäß definierten Peptide an die Im
plantatoberfläche erfolgt erfindungsgemäß über entsprechende Ankermoleküle, d. h.
das Peptid wird in der Regel nicht unmittelbar selbst auf die Implantatoberfläche fi
xiert. Die Einfügung eines solchen, unten näher definierten Moleküls hat vor allem
den Sinn, den sterischen Erfordernissen des biologischen Rezeptors auf den Zielzel
len in Zusammenhang mit der Bindung des entsprechenden Peptids Rechnung zu
tragen.
Die Implantatoberfläche muß hierzu entsprechende funktionelle Gruppen bzw. re
aktive Einheiten tragen, welche eine Bindung der entsprechenden funktionellen
Gruppe des Ankermoleküls ermöglichen. Die funktionellen Gruppen, die auf der
Implantatoberfläche bereitzustellen sind, richten sich wiederum nach der Beschaf
fenheit der eigentlichen je nach Erfordernis unterschiedlichen Trägermatrix (Metall,
Kunststoff, Knochenmaterialien). Bei Metallimplantaten, kann man beispielsweise
eine für SH-Reste des Ankermoleküls reaktive Oberflächenschicht durch Bedamp
fung mit Gold erzeugen. Die Silanisierung von Metalloberflächen nach bekannten
Verfahren (siehe oben) führt ebenfalls zu reaktiven Oberflächen, welche mit den
geeigneten erfindungsgemäßen Ankermolekülen, ggf. unter Verwendung von silan
haltigen Haftvermittlern, Verbindungen eingehen können (siehe unten). Implantate
aus natürlichen Knochen oder naturähnlichen Knochenmaterialien (z. B. Calcium
phosphat-Zemente) können Ankermoleküle binden, welche eine reaktive Phos
phonatgruppe enthalten (Prinzip beschrieben bei Chu, Orgel, 1997, Bioconjugates
Chem. 8: 103). An Implantate aus Kunststoff auf Acrylatbasis (z. B. PMMA) oder
aus anderen Materialien mit einer entsprechenden Kunststoffbeschichtung können
wiederum erfindungsgemäße Ankermoleküle angekoppelt werden, die ihrerseits
selbst einen reaktiven Acrylatrest aufweisen.
Ankermoleküle im Sinne der Erfindung sind also Moleküle auf Basis von modifi
zierten bzw. substituierten Alkylketten bzw. Kohlenstoffketten, die zumindest zwei
unterschiedliche funktionelle Gruppe aufweisen, wobei eine funktionelle Gruppe in
der Regel ein freier Carboxyl-Rest ist, der mit einer freien NH2-Gruppe einer Sei
tenkette eines erfindungsgemäß definierten Peptids, insbesondere eines RGD-
Peptids, eine Amidbindung (-CO-NH-) erzeugt, und die andere funktionelle Gruppe,
welche vorzugsweise am anderen Ende der C-Kette des Ankermoleküls lokalisiert
ist und eine direkte oder indirekte Bindung mit der Implantatoberfläche bewirkt, je
nach Beschaffenheit bzw. Erfordernis der Implantatoberfläche, vorzugsweise ein
(meth)acrylathaltiger Rest oder eine Mercaptogruppe ist. Prinzipiell können auch
andere funktionelle Gruppen verwendet werden, die mit den jeweiligen reaktiven
Gruppen unmittelbar auf der Implantatoberfläche oder auf einer geeigneten Zwi
schenschicht zu einer stabilen Bindung zu reagieren vermögen.
Die Ankermoleküle der Erfindung besitzen, wie bereits angedeutet, gleichzeitig die
Funktion von Abstandshaltern oder Spacern, weisen also neben ihren geschilderten
Verknüpfungsoptionen eine entsprechende gegebenenfalls spezifisch angepaßte
Länge auf, um zu ermöglichen, daß die für die Zelladhäsionsstimulierung verant
wortliche Domäne den richtigen Abstand zur Zielzelle hat, so daß eine Zellbindung
unter sterischen Gesichtspunkten verbessert oder erst ermöglicht werden kann.
Die biologische Funktion der zellerkennenden und die entsprechende Aminosäure
sequenz-tragenden Domäne wurde beispielhaft anhand eines selektiv an alphavbeta3-
/alphavbeta5-Integrin-exprimierende Zell-Spezies (z. B. Osteoblasten, Osteoclasten,
Endothelzellen) bindendes synthetisiertes Peptid bewiesen (Haubner et al., 1996, J.
Am. Chem. Soc., 118: 7461-7472).
Die Ankermoleüle der Erfindung weisen vorzugsweise folgende lineare Strukturen
auf, wobei die erfindungsgemäß definierten Peptide über die NH2-Gruppe einer ihrer
Aminosäure-Seitenketten, vorzugsweise Lysin-Seitenkette an das freie Carboxyl-
Ende des jeweiligen Ankermoleküls gebunden werden.
- a) Mercapto(amido)carbonsäure-Derivate:
-CO-(CH2)k-X-SH,
wobei X eine Einfachbindung oder -CO-NH-(CH2)1-,
k = 2 bis 12 und 1 = 2 bis 4 bedeutet; - b) Acrylamidocarbonsäure-Derivate:
-CO-(CH2)m[NWCO-(CH2)n]p-NH-CO-CH=CH2,
wobei m, n = 2 bis 8; p = 0 bis 2 bedeuten, - c) Acrylamido-amidotriethylenglycolsäure-Derivate:
(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)q-CO-(CH2)r-NH-CO-CH=CH2,
wobei q = 1 bis 3 und r = 2 bis 8 bedeutet.
Bevorzugt sind insbesondere die folgenden Typen spezieller Ankermoleküle: - d) CO-CH2-CH2-SH (Mercaptopropionsäure),
- e) CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH (Mercaptoethylamidobernsteinsäure),
- f) -CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2 (Acrylamidohexansäure),
- g) -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2 (Acrylamidohexansäure-amidohexansäure),
- h) -CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2 (Acrylamidohexansäure-amidotriethylenglycolsäure),
- i) -(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)2-CO-(CH2)5-NH-CO- CH=CH2 (Acrylamidohexansäure-di-amidotriethylenglycolsäure).
Generell sind erfindungsgemäß jene Ankermolekülstrukturen bevorzugt, welche in
der linearen C-Kette mindestens sechs C-Atome aufweisen. Es wurde nämlich über
raschend gefunden, daß diese Länge des Ankermoleküls besonders günstig ist, um
optimale Ergebnisse in bezug auf die beschleunigte und verstärkte Gewebeintegra
tion des Implantats zu erzielen. Die Angabe von mindestens sechs C-Atomen in der
linearen Kette bezieht sich erfindungsgemäß auf die Gesamtlänge des Moleküls
zwischen Peptid und Implantatoberfläche. So sind auch Ankermoleküle der oben
gezeigten Strukturen mit kürzerer Kette (z. B. Typ ia) geeignet, falls noch andere
nicht genannte, kettenverlängernde Kopplungskomponenten zwischen Peptid und
Implantatoberfläche eingefügt werden.
Die Ankermoleküle werden nach Standardmethoden mit den erfindungsgemäß de
finierten Peptiden über die Carboxyl-Funktion amidartig verbunden, wodurch
Strukturen des Typs Peptid-NH-CO-Ankermolekül entstehen, welche wiederum,
wie dargelegt, auf dem Implantat fixiert werden, wodurch wiederum Konstrukte des
folgenden Typs entstehen:
Peptid-NH-CO-Ankermolekül-Implantat(oberfläche).
Bevorzugt sind entsprechende Implantat-Konstrukte, welche sich zusammensetzen
aus einem der oben einzeln genannten definierten Peptide, insbesondere RGD-
Peptide, einem der oben einzeln aufgeführten allgemeinen und speziell definierten
Ankermoleküle und einem entsprechend oberflächenreaktiven Implantat. Besonders
bevorzugt sind folgende Implantate:
cyclo-RGDfK NH-CO-Thiol-Derivate (Typ: i)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivate (Typ: ii)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivate (Typ: iii)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivate (Typ: ii)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivate (Typ: iii)-Implantat,
worin die lineare C-Kette des gesamten Ankermoleküls mindestens sechs C-Atome
aufweist.
Darunter sind inbesondere bevorzugt:
cyclo-RGDfK NH-CO-Thiol-Derivat (Typ: ib)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iia)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivat (Typ: iiia)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivat (Typ: iiib)-Implantat.
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iia)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivat (Typ: iiia)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivat (Typ: iiib)-Implantat.
Die Herstellung dieser bevorzugten Strukturen erfolgt nach Standardmethoden, bzw.
ist weiter unten, oder in der am gleichen Tag angemeldeten Parallelanmeldung des
Anmelders, die die Peptid-Ankerstrukturen als solche zum Gegenstand hat, be
schrieben.
Wie bereits weiter oben angesprochen, werden zur Verankerung der beschriebenen
zell- bzw. gewebeselektiven Peptid-Derivate an Biomaterialoberflächen gemäß der
Erfindung im wesentlichen drei Alternativwege verfolgt, wobei das molekulare Er
kennungsmuster der die jeweilige RGD-Sequenz tragenden Domäne selektiv für ei
nen bestimmten Zelltyp sowie der Abstandshalter unverändert bleiben können, wäh
rend der Molekülanker je nach den aufgeführten Kopplungsvarianten, variiert wer
den kann, beispielsweise durch:
- - Kopplung von Thiol-Peptid-Derivaten an goldbeschichtete Biomaterialoberflä chen (z. B. mit Typ (i) Ankermolekülen);
- - Kopplung von (Meth)Acryloyl-Peptid-Derivaten an acrylat- bzw. methacrylat beschichtete Biomaterialoberflächen. (z. B. mit Typ (ii) Ankermolekülen);
- - Kopplung von (Meth)Acryloyl-Peptid-Derivaten an silanbeschichteten Bioma terial-oberflächen mit einem (Meth)Acryloyl-Silanderivat als Haftvermittler bzw. Zwischenschicht (z. B. 3-Methacryloxypropyl-trimethoxysilan).
Die Erzielung der kritischen Mindestlänge des Ankermoleküls für verschiedene
Peptid-Kopplungsvarianten an Biomaterialoberflächen erfolgt durch Synthese der
erfindungsgemäß definierten Peptide mit den erfindungsgemäß definierten Anker
molekülen von einer Kettenlänge mit vorzugsweise 6 bis 18 C-Atomen und wahl
weise unterschiedlichen Hydrophobie-/Hydrophilie-Eigenschaften (z. B. durch
Verwendung zahlenmäßig unterschiedlicher Einheiten von -CH2- und/oder Ami
dohexansäure oder Ethylenglycol nach an sich Standardmethoden und anschließen
der Testung der biologischen Wirksamkeit durch Bestimmung der Zelladhäsion in
vitro nach Beschichtung entsprechender Biomaterialoberflächen).
Auf die beschriebene Weise kann je nach den Materialeigenschaften des Implantats
ein geeignetes Beschichtungsverfahren zur Konditionierung der Oberflächen vor der
eigentlichen Kopplung mit den erfindungsgemäßen Peptid-Derivaten ausgewählt
werden. Darüber hinaus ist in Abhängigkeit vom Gewebetyp bzw. dem Zelltyp, der
die Integration des Biomaterials/Implantats vollführen soll, die Beschichtung mit
anderen Peptiden möglich, die wiederum zielgerichtet die Integrine der entspre
chenden Ziel-Zell-Spezies aktivieren, wie z. B. das alpha6beta4-Integrin von Epit
helzellen (z. B. zum Einsatz von Knochen-, Kiefer-, Haut- oder Haarimplantaten)
oder das alphaIIbbeta3-Integrin von Blutplättchen. Alphavbeta3-spezifische RGD-
Peptide weisen eine Selektivität gegenüber Endothelzellen auf, wodurch sie sich
z. B. zur Beschichtung von Gefäßprothesen eignen würden. Hierdurch kann für Im
plantate auf dem Gebiet des Knochen,- Gefäß, Zahn-, Haut- und Haarersatzes für
nahezu jedes beliebige Organ eine geeignete bioaktivierende Oberflächenbeschich
tung realisiert werden.
Ehe entsprechende erfindungsgemäße Implantate oder biohybride Organe bereitge
stellt werden können, müssen zuvor die für den jeweiligen Zelltyp geeigneten Pepti
de in einem in vitro-Testsystem auf biologische Wirksamkeit geprüft und ermittelt
werden, um später eine gezielte und selektive Beschichtung des Implantats, welches
in das ausgesuchte Gewebe eingebracht werden soll, vorzunehmen zu können.
Die hierfür notwendige Analyse der Integrin-Rezeptor-Struktur des Zielgewebes
bzw. der Zielzellen, in welches das Implantat eingebracht werden soll, erfolgt mit
tels gängiger, bekannter, immunhistologischer Verfahren, wie z. B. mittels Immun
fluoreszenz oder der Immunhistochemie von Gewebeproben. Die hierfür erforderli
chen Antikörper gegen verschiedene Integrin-Rezeptoren bzw. deren Untereinheiten
sind mittlerweile bekannt und stehen zur Verfügung oder können entsprechend mit
tels an sich bekannter Standardmethoden, wie beispielsweise geeigneter Immunisie
rungen, erzeugt werden.
Die erfindungsgemäß definierten Peptide werden in verschiedenen Konzentrationen
kovalent an Kulturoberflächen beispielsweise aus mit Rinderserumalbumin (BSA)
beschichteten Polystyrol gekoppelt. Das Material dieses Testträgers spielt bei der
Ermittlung der geeigneten Peptide keine essentielle Rolle. Ebenso ist die angewen
dete Kopplungsmethode hier noch von geringer Bedeutung. Aus praktischen Grün
den kann die Kopplung bei diesen Ermittlungen auch mittels Inkubation und Ad
sorption der besagten Peptide an den Testträger erfolgen.
Anschließend wird die Adhäsion von ausgesuchten Gewebe-Zellkulturen (z. B.
Osteoblasten), die den Zellen, die in vivo im natürlichen Gewebe aktiviert werden
sollen, in ihren Adhäsionseigenschaften zu entsprechen vermögen, an die entspre
chend beschichteten Oberflächen untersucht. Das Kriterium zur Auswahl geeigneter
Zellkulturen für die Adhäsionsexperimente besteht im vergleichbaren Integrations
expressionsmuster zu den Zielzellen in vivo nach Implantation, zum Beispiel deren
alphavbeta3-/alphavbeta5-Expression, die mittels fluoreszenzmarkierten Antikörpern
gegen alphavbeta3 -und alphavbeta5-Integrine bzw. gegen die alphav-, die beta3-
bzw. gegen die beta5-Untereinheiten des Integrin-Rezeptors anhand eines Fluore
scence Activated Cell Sorter (FACS) verifiziert wird. Bei anderen Ziel-Zell-Spezies
in vivo mit unterschiedlichen Integrinrezeptor-Muster müssen entsprechend andere
Antikörper eingesetzt werden. Solche sind mittlerweile bekannt und stehen zur Ver
fügung oder können entsprechend bekannter Standardmethoden z. B. mittels geeig
neter Immunisierung erzeugt werden.
Die verschiedenen selektierten Zell-Spezies werden auf mit den in Frage kommen
den Peptiden beschichteten, BSA-vorbehandelten Polystyrol-Kulturoberflächen an
gesät und inkubiert. Anschließend werden nicht adherierte Zellen abgewaschen.
Das Bindungsverhalten der unterschiedlichen, ausgewählten Zell-Spezies an den mit
unterschiedlichen erfindungsgemäß definierten Peptiden beschichteten Testoberflä
chen entspricht im positiven Fall, das heißt, wenn eine ausreichende Spezifität vor
liegt, jeweils einer Titrationskurve mit einer maximalen Adsorptionsrate von etwa
60 bis 100% der angesäten Zellen sowie einer halbmaximalen Zellanbindung bei
einer RGD-Peptid-Konzentration in der Beschichtungslösung von etwa 5 nM bis
5 µM.
In ähnlicher Weise, wie für die Kopplung geeigneter Peptide an BSA-
vorbeschichteten Polystyroloberflächen beschrieben, sind Verankerungsstrategien
an modifizierte bzw. konditionierte Biomaterialoberflächen unter Verwendung ver
schiedener Haftvermittlungszwischenschichten möglich.
Zusammengefaßt, läßt sich folgendes sagen:
Die Implantate des Standes der Technik weisen folgende Nachteile auf:
Die Implantate des Standes der Technik weisen folgende Nachteile auf:
- - unvollständige, langsame Implantatintegration ins Gewebe,
- - eingeschränkte Akzeptanz im Gewebe,
- - unzureichende funktionelle Stabilität der Implantat/Gewebegrenzschicht
- - mangelnde stimulierende Wirkung des Implantats auf die Gewebeneogenese
- - unphysiologische Eigenschaften der Implantatoberfläche.
Als Konsequenzen hieraus ergaben sich weitere Probleme:
- - aseptische Implantatlockerungen (z. B. fibröse Kapselbildung)
- - lokale Bildung von Mikrothrombi,
- - Infektionen,
- - Entzündungen,
- - Geweberesorptionen,
- - Revisonen.
Diese Probleme können durch das bereitgestellte erfindungsgemäße Verfahren bzw.
der hierdurch erzeugten Implantate weitgehend beseitigt werden. Die erfindungsge
mäßen Gegenstände zeichnen sich aus durch:
- - maßgeschneidertes Design von Adhäsionspeptiden, welche komplementär zum Integrin-Expressions-muster der Zielgewebe/Zielzellen sind;
- - selektive Stimulierung der Zelladhäsion der Zielzellen, die die Gewebeneoge nese vollführen sollen;
- - Beschichtungen höherer Stabilität mittels neuartiger Peptid-Anker-Moleküle;
- - Beschleunigung und Verstärkung des Implantat-Integrationsprozesses in das Gewebe.
Es konnte gezeigt werden, daß der kritische sterische absolute Mindestabstand zwi
schen Zellerkennungssequenz auf dem Peptid und unbeschichteter Matarialoberflä
che zwischen 2,0 und 3,5 nm, vorzugsweise zwischen 2,5 und 3,5 nm liegt. Maxi
male Belegungsraten (80-100%) können bei einem Mindestabstand von 3,0 bis 5,0
nm erzielt werden.
Abb.
1:
Analyse der Integrinzusammensetzung von primären Human- Osteoblasten durch FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) mittels fluoreszenzkonjugierter Antikörper gegen alphav
Analyse der Integrinzusammensetzung von primären Human- Osteoblasten durch FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) mittels fluoreszenzkonjugierter Antikörper gegen alphav
beta3
- und alphav
beta5
-
Integrine.
x-Achse: Fluoreszenzintensität (Counts)
y-Achse: Zellzahl
M21: alphav
x-Achse: Fluoreszenzintensität (Counts)
y-Achse: Zellzahl
M21: alphav
beta3
- und alphav
beta5
-Positivkontrollen
O1-O3: Kulturen primärer Human-Osteoblasten aus drei verschiede nen Patienten.
O1-O3: Kulturen primärer Human-Osteoblasten aus drei verschiede nen Patienten.
Abb. 2:
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden über BSA beschichteten Polystyrol-Testoberflächen.
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung, (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%);
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-CH2-CH2-S-(Sulfo-SMPB) ("Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat"), SMPB = Succinimidyl-4(p-Maleimido phenyl)-Butyrat;
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-S- (Sulfo-SMPB) ("Thiolpeptid 2-SMPB-Derivat")
untere Kurve: Thiolpeptid-Kontrolle: cyclo-RßADfK-NH-CO-CH2- CH2-S-(Sulfo-SMPB).
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden über BSA beschichteten Polystyrol-Testoberflächen.
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung, (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%);
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-CH2-CH2-S-(Sulfo-SMPB) ("Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat"), SMPB = Succinimidyl-4(p-Maleimido phenyl)-Butyrat;
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-S- (Sulfo-SMPB) ("Thiolpeptid 2-SMPB-Derivat")
untere Kurve: Thiolpeptid-Kontrolle: cyclo-RßADfK-NH-CO-CH2- CH2-S-(Sulfo-SMPB).
Abb. 3:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat be schichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2):
x-Achse: Peptidkonzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%),
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere obere Kurve: primäre humane Osteoprogenitorzellen
mittlere untere Kurve: primäre humane Osteoblasten
untere Kurve: primäre Ratten-Osteoblasten.
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat be schichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2):
x-Achse: Peptidkonzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%),
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere obere Kurve: primäre humane Osteoprogenitorzellen
mittlere untere Kurve: primäre humane Osteoblasten
untere Kurve: primäre Ratten-Osteoblasten.
Abb. 4:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPP-Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. Abb. 2)
x-Achse: Konzentr. an gelöstem cyclo-RGDfK (ohne Molekülanker) im Anhaftungsmedium (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%);
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: primäre Ratten-Osteoblasten.
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPP-Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. Abb. 2)
x-Achse: Konzentr. an gelöstem cyclo-RGDfK (ohne Molekülanker) im Anhaftungsmedium (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%);
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: primäre Ratten-Osteoblasten.
Abb. 5:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. Abb. 2),
x-Achse: Zahl angesäter Zellen/cm2
y-Achse: Zahl adherierter Zellen/cm2
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: BSA-Negativbeschichtung.
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. Abb. 2),
x-Achse: Zahl angesäter Zellen/cm2
y-Achse: Zahl adherierter Zellen/cm2
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: BSA-Negativbeschichtung.
Abb. 6:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2),
x-Achse: Zahl angesäter Zellen/cm
y-Achse: berechneter Flächenbedarf/Zellen (µm2)
obere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten.
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2),
x-Achse: Zahl angesäter Zellen/cm
y-Achse: berechneter Flächenbedarf/Zellen (µm2)
obere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten.
Abb. 7:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2),
x-Achse: Zeit (min)
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
untere Kurve: primäre Human-Osteoblasten.
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2),
x-Achse: Zeit (min)
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
untere Kurve: primäre Human-Osteoblasten.
Abb. 8:
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten Knochenzement-PMMA-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDJK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib),
mittlere untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iia).
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten Knochenzement-PMMA-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDJK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib),
mittlere untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iia).
Abb. 9:
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten, porösen PMMA/PHEMA-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib).
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten, porösen PMMA/PHEMA-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib).
Abb. 10:
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten, porösen PMMA/Plex Y7H-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib).
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten, porösen PMMA/Plex Y7H-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib).
Abb. 11:
Maximale Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD-Peptiden verschiedener Moleküllängen beschichteten Knochen zement-PMMA- bzw. Polystyrol-BSA-SMPB-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid-Moleküllängen (nm)
y-Achse: maximaler Belegungsgrad (%).
Maximale Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD-Peptiden verschiedener Moleküllängen beschichteten Knochen zement-PMMA- bzw. Polystyrol-BSA-SMPB-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid-Moleküllängen (nm)
y-Achse: maximaler Belegungsgrad (%).
- a) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Mercaptopropionsäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO-Thiol-Derivat Typ: ia) wurde entsprechend dem Verfahren aus der DE 195 38 741 durchgeführt. Ana log wurde die Synthese des in seiner biologischen Wirkung inaktiven entsprechen den cyclo-RßADfK-Derivats sowie des cyclo-RGDfK-Derivats ohne Ankermolekül durchgeführt.
- b) cyclo (R(Pbf)GD(tBu)fK(Z)) (Pbf = pentamethyl-benzofuran-sulfonyl; tBu = tert. Butyl) wurde durch Festphasenpeptidsynthese (Merrifield, Angew. Chem. 1985, 97: 801) und anschließender Cyclisierung (z. B. nach Zimmer et al., 1993, Liebigs Ann. Chem: 497) erhalten. Nach selektiver Abspaltung der Z- Schutzgruppe nach Standardmethodik kann die Lysinseitenkette durch Umsetzen von 0.1 mmol cyclo (R(PbfJGD(tBu)fK) mit 0.2 mmol Bernsteinsäureanhydrid (bsa) in 5 ml Dimethylformamid zu cyclo (R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K]) verlängert werden.
- c) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Mercaptoethylamidobernsteinsäure (→ cyclo-RGDtK NH-CO-Thiol- Derivat Typ: ib = cyclo(RGDf[Thiol-bsa-K]) wurde wie folgt, durchgeführt: 10 mmol Cysteaminhydrochlorid und eine äquimolare Menge (eq.) an Triphenylmetha nol wurden bei 60°C in Eisessig gelöst und unter Rühren mit 1.1 eq. BF3-Etherat versetzt. Nach 50 minütigem Rühren wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung neu tralisiert und mit Essigester extrahiert. Das aus dem Extrakt verbleibende Öl wurde zur Überführung in das Hydrochlorid in tert.-Butanol gelöst, mit verdünnter Salz säure auf pH = 2 gebracht und gefriergetrocknet. Ausbeute 99%. Der so erhaltene Baustein wird mit EDCl×HCl nach Standardmethoden an cyclo (R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K]) gekuppelt und die Seitenschutzgruppen werden abgespal ten.
- d) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit
dem Anker Acrylamidohexansäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO-Acryl-Derivat Typ:
iia = cyclo(RGDf[Acryl-ahx-K]) wurde wie folgt, durchgeführt:
Das Acrylankersystem wurde seperat synthetisiert und als Aktivester an die Pep tidseitenkette gekuppelt. Dazu wurden 10 mmol 6-Aminohexansäure und 1.8 eq. Calciumhydroxid in Wasser suspendiert und bei 0°C 1,2 eq. Acrylsäurechlorid zuge geben. Unlösliches Calciumhydroxid wurde abfiltriert und das Filtrat mit konzen trierter Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Das ausgefallene Produkt wurde aus Essige ster rekristallisiert. Ausbeute: 65%. 10 mmol der kristallinen 6-Acryl amidohexansäure wurden in 50 ml Dichlormethan suspendiert, mit 1 eq. N- Hydroxysuccinimid versetzt und bei 0°C 1.2 eq. EDCl×HCl zugegeben. Nach ein stündigem Rühren wurde die Reaktion durch Zusatz von 10 µl Eisessig gestoppt. Es wurde mehrfach mit kalter, gesättigter Natriumcarbonatlösung und mit Wasser ex trahiert und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Ausbeute: 52%. Der nun vorliegende Aktivester wurde in DMF an cyclo(R(Pbf)GD(tBu)fK) angekuppelt und die Seitenkettenschutzgruppen nach Standardvorschriften abgespalten. - e) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit
dem Anker Acrylamidohexansäure-amidohexansäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO-
Acryl-Derivat Typ: iib = cyclo(RGDf[Acryl-ahx-ahx-K]) wurde wie folgt, durchge
führt:
Zur Synthese des Acrylankersystems werden 10 mmol Aminohexansäure in wäßri gem Natriumphosphatpuffer (pH 8) gelöst und auf 0°C gekühlt. 2 mmol Acrylami dohexansäureaktivester (siehe (d)) wurden in Ethanol/CHCl3 gelöst und langsam zugegeben. Der pH-Wert wurde mit verdünnter NaOH konstant auf 8 gehalten.
Nach Abdestillieren der organischen Lösungsmittel wurde die wäßrige Phase mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2.6 angesäuert und der ausfallende Feststoff abfil triert, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute: 70%. Das nun vorliegende Acrylankersystem wird mit EDCl×HCl nach an sich be kannten Methoden an die Peptidseitenkette gekuppelt und die Schutzgruppen abge spalten. - f) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit
dem Anker Acrylamidohexansäure-amidotriethylenglycolsäure (→ cyclo-RGDfK
NH-CO-Acryl-Derivat Typ: iiia = cyclo(RGDf[Acryl-ahx-tEG-K]) wurde wie folgt,
durchgeführt:
Das Acrylankersystem wurde durch Festphasenpeptidsynthese (siehe oben) darge stellt. Als letzter Baustein wurde die Acrylamidohexansäure (siehe oben) gekuppelt. Ausbeute: 97%. Das nun vorliegende Acrylankersystem wird mit EDC×HCl nach an sich bekannten Methoden an die Peptidseitenkette gekuppelt und die Schutzgrup pen abgespalten. - g) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Acrylamidohexansäure-amidotriethylenglycolsäure-amidotriethylen glycolsäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO-Acryl-Derivat Typ: iiib = cyclo(RGDf [Acryl-ahx-tEG-tEGK]) erfolgte analog zu (f). Ausbeute: 85%.
In Anlehnung an die etablierten Verfahren von Singer et al., 1987, J. Cell. Biol.
104: 573, bzw. von Ruoslahti et al. (1982, Methods. Enzymol., 82: 803-831) wurde
die kovalente Kopplung der erfindungsgemäßen Peptide mit Sulfo-Succinimidyl-4
(p-Maleimidophenyl)-Butyrat (Sulfo-SMPB) an mit Rinderserumalbumin (BSA)
vorbeschichteten Kulturoberflächen aus Polystyrol vollzogen.
Hierzu wurden 48-Wells (Costar, "non-tissue culture treated", Art. Nr. 3547) mit je
250 µl PBS (phosphate buffered sahne), pH = 8,3, 2% BSA, pro Vertiefung über
schichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um eine auf dem Polystyrol
befindliche BSA-Schicht zu generieren. Anschließend wurde mit 250 µl PBS, pH =
8,3 pro Vertiefung gewaschen und mit je 250 µl einer Lösung mit 100 µg/ml SMPB
in PBS, pH 8,3, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte ein drei
maliges Waschen der Wells mit je 250 µl PBS, pH 8,3. Zur Herstellung der Be
schichtungslösungen wurde das entsprechende Thiol-RGD-Peptid in folgenden
Endkonzentrationen in PBS, pH 8,3, angesetzt: 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10
µM, 100 µM, und 1 mM. Nach Zugabe von je 250 µl Beschichtungslösung/Well
wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend dreimal mit PBS,
pH 8,3, gewaschen. Durch Zugabe von je 250 µl einer 5%igen BSA-Lösung in PBS,
pH 7,4, anschließender Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur und Waschen
mit PBS, pH 7,4, wurden unspezifische Zellbindestellen blockiert. Als Beschich
tungs-Negativkontrollen fungierten Polystyroloberflächen, die ab der Beschichtung
mit einer 5%igen BSA-Lösung identisch wie die Positivproben behandelt wurden.
Anschließend wurde die Adhäsion von vier Zellkulturen, die aus drei unterschiedli
chen Spezies gewonnen wurden, an die oben genannten mit RGD-Peptid beschichte
ten Oberflächen untersucht:
- - primäre humane Osteoblasten aus der Femurkopfspongiosa adulter Patienten (Siggelkow et al., 1997, Bone 20: P231);
- - primäre humane Osteoprogenitorzellen aus dem Knochenmark adulter Patienten (Vilamitjana-Amedee et al., 1993, In vitro Cell Dev. Biol. 29: 699);
- - primäre Osteoblasten aus der Kalvaria neonataler Ratten, deren Präparation und Kultivierung in Anlehnung an die Methode von Yagiela und Woodbury (1977, The Anatomical Record, 188: 287-305) erfolgte; und
- - Osteoblasten-Zellinie MC3T3 H1, gewonnen aus der Kalvaria neonataler Mäuse (Heermeier et al., 1995, Cells and Materials, 5: 309-321).
Bevor diese Zell-Spezies zu den Adhäsionsexperimenten eingesetzt wurden, wurde
deren Integrin-Expression mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper gegen die al
phavbeta3- bzw. alphavbeta5-Rezeptoren sowie gegen die Integrin-Untereinheiten al
phav, beta3 und beta5 anhand eines Becton-Dickenson Fluorescence Activated Cell
Sorter (FACS) verifiziert. Es zeigte sich dabei eine starke Expression der besagten
Integrine (Abb. 1).
Die beschriebenen Zell-Spezies wurden mit einer Ansaatdichte von 48.000 Zel
len/cm2 in, wie oben beschrieben, mit RGD-Peptid beschichteteten Costar-48-Wells,
angesät und anschließend 1 Stunde bei 37°C, 95% Luftfeuchte und 5% CO2 inku
biert. Anschließend wurden während des Experiments nicht adherierte Zellen zwei
mal mit PBS, pH 7,4, abgewaschen.
Die Quantifizierung der adherierten Zellen erfolgte indirekt über die Aktivitätsbe
stimmung des zellulären Enzyms N-Acetyl-Hexosaminidase unter Verwendung ei
ner entsprechenden Standardkurve nach der Methode von Landegren (1984, J. Im
munol. Methods, 67: 379-388).
Die Beschichtung von BSA-vorbehandelten Polystyrol-Zellkulturoberflächen mit
den alphavbeta3- bzw. alphavbeta5-selektiven Thiolpeptiden 1-, 2-(Sulfo-SMPB)-
Derivaten führt zu einer starken und dosisabhängigen Stimulierung der Adhäsion
von kultivierten Maus MC3T3 H1-Osteoblasten (s. Abb. 2). Im Gegensatz hierzu
hat die biologisch inaktive Thiolpeptid-Kontrolle keinen signifikanten Effekt, wo
durch die hohe Selektivität und die hohe Spezifität der Integrin-RGD-Peptid Wech
selwirkung gezeigt wird.
Das Bindungsverhalten der unterschiedlichen Zell-Spezies an mit Thiolpeptid 1-
(Sulfo-SMPB)-Derivat oder Thioplpeptid 2-(Sulfo-SMPB)-Derivat beschichtete,
BSA-vorbehandelte Polystyroloberflächen entspricht einer Titrationskurve mit ei
ner maximalen Adsorptionsrate von ca. 70% (primäre Ratten-Osteoblasten), ca. 80%
(primäre humane Osteoblasten und primäre humane Osteoprogenitorzellen) und ca.
90-100% (MC3T3 H1- Maus-Osteoblasten) der angesäten Zellen sowie einer halb
maximalen Zellanbindung bei einer RGD-Peptid-Konzentration in der Beschich
tungslösung von 50-1000 nM (Abbildung3).
Die beschriebenen Zell-Adsorptionsraten sind gegenüber mit 5% BSA-beschich
teten Oberflächen, welche zu keiner signifikanten Zell-Adhäsion für alle eingesetz
ten Osteoblasten Kulturen führen, ca. 20-40fach erhöht.
Das ähnliche Verhalten der genannten Osteoblasten-Kulturen belegt, daß die adhä
sionsstimulierenden Effekte osteoblastenspezifisch jedoch speziesunabhängig sind.
Die Bindung der oben genannten Osteoblasten-Zellkulturen an mit Thiolpeptid 1-
Sulfo-SMPB-Derivat beschichteten BSA-vorbehandelten Polystyroloberflächen
kann durch Zugabe von gelöstem zyklischen RGDfK im Anhaftungsmedium voll
ständig inhibiert werden (Abb. 4). Dieses Ergebnis beweist, daß die beobachteten
Zelladhäsionsphänomene alleine durch RGD-Peptide vermittelt werden.
Die Abhängigkeit der Zelladhäsion von primären humanen Osteoblasten bzw. von
MC3T3 H1-Zellen auf den genannten Thiolpeptid 1,2 (Sulfo-SMPB) beschichteten,
BSA-vorbehandelten Polystyroloberflächen von der Anzahl angesäter Zellen liefert
eine Sättigungskurve (Abb. 5). Auf der BSA-Negativbeschichtung dagegen ist keine
signifikante Zellanhaftung zu erkennen. Die bei maximaler Zellaussaatdichte be
rechnete durchschnittliche Fläche pro adherierte Zelle von ca. 400 bis 500 µm2 lie
fert auf dieser Oberfläche einen durchschnittlichen Zell-Zell-Abstand von < 20 µm
(Abb. 6). Da der Osteoblasten-Zelldurchmesser ca. 10 bis 15 µm beträgt, wird
deutlich, daß die Peptidbeschichtung Zellanhaftungsstellen in solcher Zahl bereit
stellt, daß eine mit Osteoblasten dicht belegte Oberfläche erzielt werden kann, bei
der die Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander angeordnet sind. Der zeit
liche Verlauf des Zellanhaftungsprozesses auf der genannten Oberfläche zeigt eine
schnelle Adhäsion der Zellen, die, je nach Zelltyp, nach etwa 45 bis 60 Minuten ab
geschlossen ist (Abb. 7). Signifikante Unterschiede zwischen den beiden verwende
ten Thiolpeptid-Derivaten sind bei diesen Versuchen nicht erkennbar.
Zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Peptidmoleküllängen und damit des
Abstandes zwischen der zellerkennenden RGD-Sequenz und der Materialoberfläche
auf das Ausmaß der Osteoblasten-Adhäsion wurden vier verschiedene Acrylat-
RGD-Peptide (cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iia, iib, iiia, iiib), mit
unterschiedlichen molekularen Abstandshalterlängen hergestellt.
Die Synthesen der cyclo-RGD-Peptide wurden, wie in Beispiel 1 angegeben oder
entsprechend den Verfahren von Pless et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 2340-2349
bzw. von Gurrath et al., 1992, Eur. J. Biochem. 210: 911-921 durchgeführt.
Die entsprechenden Moleküllängen dieser Peptide betragen etwa 2,6 nm
(Acrylatpeptid 1, Typ iia), 3,5 nm (Acrylatpeptid 2, Typ iib), 3,7 nm (Acrylatpeptid
3, Typ iiia) bzw. 4,2 nm (Acrylatpeptid 4, Typ iiib).
Zur kovalenten Kopplung dieser Peptide an αuspolymerisierte PMMA
(Polymethylmethacrylat)-Oberflächen wurden entsprechende Formkörper unter
schiedlicher Porosität (Durchmesser: 10 mm; Höhe: 2 mm) aus drei verschiedenen
PMMA-Komponenten hergestellt.
- - Knochenzement auf PMMA-Basis (Fa. Merck KGaA, Germany, Zul. Nr. 5181.00.00) entsprechend der Produktbeschreibung (40 g Pulver + 20 ml Flüssig keit).
- - 10 g PMMA/PHEMA (Polyhydroxyethylmethacrylat)-Granulat, Partikelgröße 0,5-0,6 mm (Fa. Biomet) wurden mit 1,3 ml einer HEMA-Lösung (68,6% HEMA, 29,4% TEGMA, [Triethylenglykoldimethacrylat], 2% tBPB, [tert. Butylperoxyben zoat]) vermischt und dadurch zu einem porösen Trägermaterial verklebt.
- - 10 g PMMA-Granulat (Plex Y7H, Röhm, Germany), Kornfraktion 0,7-2 mm wur den mit 1,5 ml einer Methylmethacrylat (MMA)-Lösung (68,6% MMA, 29,4% TEGMA 2% tBPB) vermischt und dadurch zu einem porösen Trägermaterial ver klebt.
Zur kovalenten Kopplung der Acrylatpeptide an die vorpolymerisierten PMMA-
Formkörper wurden Stammlösungen der Acrylatpeptide 1, 2, 3 und 4 in einer End
konzentration von jeweils 100 µM in DMSO/0,2% Campherchinon (w/v) herge
stellt. Anschließend wurden durch Verdünnung mit Isopropanol/0,2% Campher
chinon (w/v) Konzentrationsreihen mit Peptidendkonzentrationen von jeweils 1 nM,
10 nM, 100 nM, 1 µM und 10 µM hergestellt. Die Formkörper wurden 2 Stunden
bei Tageslicht und Raumtemperatur inkubiert und anschließend in trockenem Zu
stand bei 4°C gelagert. Vor Gebrauch wurden die Proben zur Entfernung ungebun
dener Peptide dreimal mit PBS, pH 7,4, gewaschen und über Nacht in PBS, pH 7,4,
bei 4°C gelagert.
Durch Zugabe von je 250 µl/Formkörper einer 5%igen BSA-Lösung in PBS, pH
7,4, und anschließender Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur und einmali
gem Waschen mit PBS, pH 7,4, wurden unspezifische Zellbindestellen blockiert.
Als Negativkontrollen fungieren PMMA-Formkörper, die anstelle mit den Peptidlö
sungen mit einer Lösung aus Isopropanol/0,2% Campherchinon (w/v) behandelt
wurden.
Im Anschluß wurde die Adhäsion von Osteoblasten der MC3T3 H1-Linie, gewon
nen aus der Kalvaria neonataler Mäuse (Heermeier et al., 1995, Cells and Materials
5: 309-321) an o. b. peptidbeschichtete Oberflächen untersucht.
Die MC3T3 H1-Osteoblasten wurden mit einer Ansaatdichte von 48.000 Zellen/cm2
auf, wie oben beschrieben, in Costar-48-Wells befindlichen, mit RGD-Peptid be
schichteten, PMMA-Formkörpern angesät und anschließend 1 Stunde bei 37°C,
95% Luftfeuchte und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurden während des Expe
riments nicht adherierte Zellen zweimal mit PBS, pH 7,4, abgewaschen.
Die Quantifizierung der adherierten Zellen erfolgte indirekt über die Aktivitätsbe
stimmung des zellulären Enzyms N-Acetyl-Hexosaminidase unter Verwendung ei
ner entsprechenden Standardkurve nach der Methode von Landegren (1984, J. Im
munol. Methods, 67: 379-388).
Das Bindungsverhalten der MC3T3 H1-Osteoblasten an mit genannten Acrylat-
RGD-Peptiden 1 (Typ iia), 2 (Typ iib), 3 (Typ iiia) und 4 (Typ iiib) beschichteten,
unterschiedlichen PMMA-Formkörpern entspricht jeweils einer Titrationskurve. Die
maximalen Adsorptionsraten betragen ca. 20% für Acrylatpeptid 1 und ca. 80-100%
für die Acrylatpeptide 2, 3 und 4. Die halbmaximale Zellanbindung erfolgen bei ei
ner RGD-Peptidkonzentration in der Beschichtungslösung von ca. 1-10000 nM für
die Acrylatpeptide 2, 3 und 4.
Die beschriebenen Zell-Adsorptionsraten auf RGD-Peptid-beschichteten Knochen
zement-Formkörpern sind gegenüber unbeschichteten Oberflächen ca. 1,5fach
(Acrylatpeptid 1) und ca. 5-15fach (Acrylatpeptide 2, 3 und 4) erhöht (Abb. 8).
Die beschriebenen Zell-Adsorptionsraten auf RGD-Peptid-beschichteten porösen
PMMA/PHEMA-Granulat-Formkörpern sind gegenüber unbeschichteten Oberflä
chen 2-5fach (Acrylatpeptide 2, 3 und 4) erhöht (Abb. 9).
Die beschriebenen Zell-Adsorptionsraten auf RGD-Peptid-beschichteten porösen
Plex Y7H-Granulat-Formkörpem sind gegenüber unbeschichteten Oberflächen 2-3
fach (Acrylatpeptide 2, 3 und 4) erhöht (Abb. 10).
Für PMMA/PHEMA- bzw. für PMMA-Plex Y7H-Proben werden sowohl eine grö
ßere Schwankungsbreite der Zelladhäsionswerte als auch eine stärkere Anhaftung
der Osteoblasten an unbeschichtete Kontrollproben bei gleichbleibenden maximalen
Anhaftungsraten an RGD-Peptid-beschichtete Proben beobachtet als für PMMA-
Knochenzementformkörper.
Für die Acrylatpeptide 2, 3 und 4 werden sowohl im Vergleich untereinander als
auch im Vergleich zu den auf der Test-BSA-Kontrolle beschichteten Thiolpeptiden
1 und 2 sehr ähnliche Stimulierungen der Zell-Adhäsion beobachtet, das kürzeste
Peptid, Acrylatpeptid 1, ist dagegen fast inaktiv. Daraus kann geschlossen werden,
daß ein kritischer Mindestabstand zwischen RGD-Zellerkennungssequenz und der
Materialoberfläche von ca. 2,5-3,5 nm erforderlich ist, um eine sterisch erfolgreiche
Zell-Adhäsion vollziehen zu können (Abb. 11).
Die höhere Aktivität von Acrylatpeptid 3 auf dem Knochenzement-PMMA-Träger
weist auf eine für die Zellanhaftung optimale Molekülstruktur hinsichtlich sowohl
der Moleküllänge als ggf. auch der Hydrophilie/Hydrophobie-Verteilung bzw. -Ver
hältnis im Abstandshalter hinweisen.
Claims (14)
1. Implantat, geeignet für unterschiedliche menschliche und tierische Organe, beste
hend im wesentlichen aus einer Trägermatrix und einer diese Matrix umhüllenden
Peptid-Beschichtung, die zur zielgerichteten Adhäsionsstimulierung von menschli
chen oder tierischen Körperzellen Peptide enthält, welche Sequenzen aufweisen, die
Bindungsstellen auf den für die Adhäsion verantwortlichen Integrin-Rezeptoren auf
humanen oder tierischen Zellen erkennen, wobei die Trägermatrix reaktive bin
dungsfähige Gruppen an ihrer Oberfläche aufweist, die dazu befähigt sind mit ent
sprechenden funktionellen reaktiven Gruppen besagter Peptidschicht eine stabile
kovalente Bindung einzugehen, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Peptide so auf
der Oberfläche des Implantats angeordnet sind, daß sie aufgrund ihrer entsprechend
unterschiedlichen strukturbedingten, zelladhäsions-stimulierenden Aktivität spezi
fisch dem natürlichen unterschiedlichen komplementären Integrinmuster der in der
jeweiligen Region an sie angrenzenden Gewebezellen entsprechen, in die das Im
plantat eingebracht werden soll, wodurch ein lokal differenziertes, selektives, bio
aktives Beschichtungsmuster der Implantatoberfläche vorliegt.
2. Implantat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Peptide mit
Hilfe von Ankermolekülen auf der Oberfläche des Implantats fixiert sind.
3. Implantat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ankermoleküle aus
einer der folgenden Strukturen bestehen:
-CO-(CH2)k-X-SH, (i)
wobei X eine Einfachbindung oder -CO-NH-(CH2)-,
k = 2 bis 12 und 1 = 2 bis 4 bedeutet;
-CO-(CH2)m-[NH-CO-(CH2)n]p-NHCO-CH=CH2, (ii)
wobei m, n = 2 bis 8; p = 0 bis 2 bedeuten;
-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)q-CO-(CH2)r-NH-CO-CH=CH2, (iii)
wobei q = 1 bis 3 und r = 2 bis 8 bedeutet.
-CO-(CH2)k-X-SH, (i)
wobei X eine Einfachbindung oder -CO-NH-(CH2)-,
k = 2 bis 12 und 1 = 2 bis 4 bedeutet;
-CO-(CH2)m-[NH-CO-(CH2)n]p-NHCO-CH=CH2, (ii)
wobei m, n = 2 bis 8; p = 0 bis 2 bedeuten;
-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)q-CO-(CH2)r-NH-CO-CH=CH2, (iii)
wobei q = 1 bis 3 und r = 2 bis 8 bedeutet.
4. Implantat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ankermoleküle aus
einen der folgenden Strukturen ausgewählt werden:
-CO-CH2-CH2-SH; (ia)
-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH; (ib)
-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2; (iia)
-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2; (iib)
-CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2; (iiia)
-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)2-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2 (iiib)
-CO-CH2-CH2-SH; (ia)
-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH; (ib)
-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2; (iia)
-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2; (iib)
-CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2; (iiia)
-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)2-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2 (iiib)
5. Implantat nach einen der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Pepti
de über die Carboxyl-Gruppe des Ankermoleküls durch Amid-Bindung und die An
kermoleküle über die Mercapto- oder Acrylat-Gruppe an die Implantatoberfläche
gebunden sind.
6. Implantat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein solches Peptid-
Ankermolekül an der Implantatoberfläche fixiert ist, so daß ein sterisch kritischer,
absoluter Mindestabstand zwischen Zellerkennungsdomäne des Peptides und un
schichteter Materialoberfläche von 2,5 bis 3,5 nm, vorliegt.
7. Implantat nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide an αvβ3-
/αvβ5 exprimierende Zellen zu binden vermögen.
8. Implantat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es Pepti
de mit der Aminosäuresequenz RGD aufweist.
9. Implantat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es Peptide der Sequenz
cyclo-RGDfK aufweist.
10. Implantat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zwi
schem den besagten Peptiden bzw. Peptid-Ankermolekülen und der Oberfläche der
Trägermatrix eine haftvermittelnde Zwischenschicht und/oder verzweigte Molekü
le, die einen oberflächenvergrößernden Effekt bewirken, aufweist.
11. Implantat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die
Trägermatrix ein entsprechendes Formstück aus Keramik, Polymermaterial, Metall
ist oder ein strukturiertes Gebilde aus diesen Materialien darstellt, daß durch in vivo
oder in vitro Besiedlung mit Zellen als biohybrides Organ ausgebildet werden kann.
12. Verfahren zur Herstellung von Implantaten gemäß der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man
- a) die Integrin-Rezeptor-Struktur des Zielgewebes, in welches das Implantat in vivo eingebracht werden soll, mittels eines in-vitro Testsystems bestimmt,
- b) die besagten Peptide mit der entsprechenden komplementären Struktur auswählt bzw. synthetisiert und,
- c) die besagten Peptide direkt oder über die besagten Ankermoleküle an die jewei lige, gegebenenfalls modifizierte Oberfläche des Implantats kovalent bindet, wobei die lokale Anordnung unterschiedlicher Peptide auf der Oberfläche des Implantats der jeweiligen zuvor festgestellten lokalen Anordnung der Zielzellen mit dem kom plementären Integrinmuster entspricht, in die das Implantat eingebracht werden soll.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die in vitro-Bestimmung
der Integrin-Rezeptor-Struktur des Zielgewebes mittels immunhistologisch wirksa
mer Antikörper erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung
der besagten Peptide bzw. der Peptid-Ankermoleküle an die Implantatoberfläche
mittels für andere Beschichtungsarten bekannter Verfahren erfolgt.
Priority Applications (14)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19755801A DE19755801A1 (de) | 1997-12-16 | 1997-12-16 | Mit die Zelladhäsion vermittelnden Peptiden beschichtete Implantate und Verfahren zu ihrer Herstellung |
EP98925574A EP0983095B1 (de) | 1997-05-22 | 1998-05-09 | Peptid-beschichtete implantate und verfahren zu ihrer herstellung |
AT98925574T ATE277645T1 (de) | 1997-05-22 | 1998-05-09 | Peptid-beschichtete implantate und verfahren zu ihrer herstellung |
CN98805227A CN1256635A (zh) | 1997-05-22 | 1998-05-09 | 肽包被的植入物及其制备方法 |
CA002290481A CA2290481C (en) | 1997-05-22 | 1998-05-09 | Peptide-coated implants and processes for their preparation |
DE59812035T DE59812035D1 (de) | 1997-05-22 | 1998-05-09 | Peptid-beschichtete implantate und verfahren zu ihrer herstellung |
US09/423,347 US6280760B1 (en) | 1997-05-22 | 1998-05-09 | Peptide-coated implants and methods for producing same |
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