DE60125164T2 - Medizinische implantat-materialien - Google Patents

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Deborah Heath
Paul Buxton CHRISTIAN
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien zur Verwendung in der Medizin, insbesondere medizinische Implantations-Materialien. Die Erfindung schafft weiterhin ein Verfahren zur Verbesserung der Biokompatibilität eines medizinischen Implantations-Materials.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Verwendung von künstlichen Biomaterialien nimmt in einigen Bereichen der medizinischen Behandlung in erheblichem Maße zu. Beispielsweise werden Biomaterialien jetzt zur Reparatur von beschädigten Geweben (beispielsweise Knochen und Haut), in Prothesen, wie z.B. künstlichen Hüft- und Kniegelenken, Herzklappen und Blutgefäßen sowie in Medikamenten-Abgabevorrichtungen verwendet. Eine Herausforderung, die in diesem medizinischen Bereich jedoch immer noch besteht, ist die Bereitstellung von Biomaterialien, die verbesserte Biokompatibilitätseigenschaften besitzen und von Wirtszellen ohne weiteres besiedelt werden können.
  • Die Untersuchung von Implantat-Oberflächen- und Biomaterial-Gewebe-Grenzflächen-Reaktionen ist entscheidend für die ständige Verbesserung des Verhaltens von Implantaten. Eine Übersicht von Blitterwijk et al. (1991) erläutert die Wichtigkeit der Reaktionen von Zellen an Implantat-Oberflächen bei der Ermittlung der Biokompatibilität des Implantats (d.h., wie gut das Implantat von den umgebenden Geweben und dem Körper als Ganzem angenommen wird). Jüngste Untersuchungen zielen auf die Herstellung von „bioaktiven Materialien", die ohne weiteres die Integration des Materials in das Wirtsgewebe ermöglichen.
  • Es besteht ein beträchtliches Interesse an Poly(ε-Caprolacton (PCL) als potentem bioaktivem Material. Es wurde während der letzten 30 Jahre in großem Umfang für die Herstellung von resorbierbaren Nähten, biomedizinischen Implantaten, Medikamenten-Abgabesystemen und Impfstoff-Zubereitungen verwendet. Zur Zeit wird PCL in Bezug auf Knochen-Transplantat-Substitution (Coombes and Meikle, 1994) untersucht, da es die Probleme einer begrenzten Knochenversorgung, des Risikos einer Infektion wie z.B. HIV, zusätzlichen chirurgischen Operationen und langen Knochen-Verbindungszeiten überwinden könnte, die sowohl mit Autotransplantaten als auch Fremdtransplantaten verbunden sind.
  • PCL ist ein semi-kristallines, lineares, resorbierbares, synthetisches, aliphatisches Polyester (-O-(CH2)5-CO-)-: Wenn es in vivo implantiert wird, wird das Polymer ohne weiteres in nicht spezifischer Weise durch hydrolytische Enzyme, Esterasen und Carboxypeptidasen abgebaut. Pitt et al. (1981) zeigten, dass der Abbau von PCL in vivo und in vitro über hydrolytische Ketten-Durchtrennungen von Ester-Verbindungen fortschreitet, bis die Segmente ausreichend klein sind, um durch die Polymermasse hindurch zu diffundieren. Sobald das Polymer das Molekulargewicht von 5000 Dalton erreicht, wird ein signifikanter Gewichtsverlust beobachtet, der von der Teilchengröße abhängig ist. Es wurde auch gezeigt, dass eine Kettenauftrennung mit einem Anwachsen der Kristallinität einhergeht, die teilweise die Abbaurate bestimmt (siehe die Übersicht von Smith et al. 1990).
  • Die aus dem Abbau von PCL erzeugten Produkte werden entweder in den Tricarboxylsäure-Zyklus (TCA) eingebaut und von den Lungen in Form von Kohlendioxid und Wasser abgegeben, oder durch direkte Nierenabscheidung beseitigt. Taylor et al (1994) haben PCL in vitro hinsichtlich der akuten Giftigkeit von Abbauprodukten untersucht. Sie fanden, dass der pH-Wert von PCL in sterilem, destilliertem Wasser und Tris-Puffer über 16 Wochen hinweg relativ konstant bliebt und dass die Proben in Tris etwas stärker abgebaut wurden als in Wasser. Es wurde auch gefunden, dass die Hydroxy-Radikale, die von Entzündungszellen erzeugt werden, eine Hauptrolle beim Abbau von PCL in vitro (Ali et al. 1992, 1993) und in vivo (Ali et al. 1994) spielen. Die Bioresorbierbarkeit und Biokompatibilität von PCL wird in einer Übersicht von Vert et al. (1992) beschrieben.
  • Ein weiterer günstiger Faktor von PCL ist, dass es mit zahlreichen anderen Polymeren, beispielsweise Poly(L-Lactid) (PLA) vermischt werden kann, um Copolymere zu erzeugen, die optimierte Eigenschaften besitzen. PLA ist einer der festesten Polyester und besitzt eine Resorptionszeit von mehr als einem Jahr, wahrscheinlich im Bereich von 2 bis 3 Jahren. Dies wäre beispielsweise bei einem dreidimensionalen Gewebe-Konstrukt bzw. Gewebegerüst vorteilhaft, bei dem die Resorptionsrate des Implantats entsprechend der Gewebe-Reparaturrate eingestellt werden muss.
  • Feng et al. (1983) synthetisierten ein biologisch abbaubares Block-Copolymer von Poly(ε-Caprolacton) mit Poly(DL-lactid). Die Copolymere besaßen Freisetzungseigenschaften ähnlich wie Silikongummi (eines der ersten nicht abbaubaren Medikamenten-Abgabesysteme), doch waren ihre Abbauraten immer schneller als die von PCL- oder PLA-Homopolymeren. Sie beabsichtigten, die exzellente Permeabilität von PCL mit der schnelleren Bio-Abbaurate von PLA zu kombinieren. Pitt et al. (1979) untersuchten PCL, PLA und ihre Copolymere und zeigten, wie Variabilitäten bei der Permeabilität des Medikamenten-Abgabesystems unter Verwendung von Copolymeren von PCL und PLA erreicht werden konnten, weil PCL stärker permeabel ist als PLA.
  • Jianzhong et al., 1995, verwendeten PCL und Poly(Ethylenglykol)-Block-Copolymere (PEG) als Medikamenten-Freisetzungseinrichtung. Es wurde gezeigt, dass der zunehmende PEG-Gehalt des Copolymers eine Zunahme der Hydrophilität und eine Abnahme der Kristallinität des Copolymers bewirkte. Somit können das Medikamenten-Freisetzungsverhalten und die Abbaubarkeit des Copolymers dadurch gesteuert werden, dass man die Zusammensetzung des Copolymers einstellt.
  • Cha und Pitt (1990) testeten die Abbaubarkeit von PCL, wenn es durch Druckguss, gemeinsame Ausfällung und Lösemittelverdampfung hergestellt wurde und fanden, dass das Herstellungsverfahren und die sich ergebende Morphologie des Polymers eine kritische Rolle bei der Ermittlung ihrer relativen Raten des hydrolytischen Abbaus spielten.
  • Druckguss von PCL/Polyglykolsäure-co-L-Milchsäure-Mischungen erhöhte die Geschwindigkeit der Kettendurchtrennung im Vergleich zu anderen Herstellungsverfahren.
  • Ein Problem von PCL besteht darin, dass es bei Körpertemperatur plastisch ist. Seine mechanischen Eigenschaften machen es ideal für Medikamenten-Abgabesysteme aber nicht für eine interne Befestigung von Knochen. Lowry et al. (1997) stellten mit Phosphat-Glasfasern in der Form von intra-medullaren Stiften verstärktes PCL für die interne Befestigung von Knochen her. Diese Studie wurde am Kaninchenmodell durchgeführt und histologische Beweise zeigten, dass die Verbindung gut toleriert wurde, mit einer minimalen Entzündung um den Stift herum. Die Übersicht von Daniels et al. (1990) zeigt, dass die mechanischen Eigenschaften von Polymeren und Zusammensetzungen durch eine Verstärkung der Materialien mit Aluminium, Aluminium-Bor-Silikat, Kalzium-methaphosphat-Glasfasern und Kohlenstoff verbessert werden können.
  • Ebenso wie PCL mit anderen synthetischen Polymeren vermischt werden kann, um die Abbaurate zu steuern, die mechanischen Eigenschaften des Systems zu verbessern und seine Permeabilität zu verändern, kann PCL auch mit natürlichen Polymeren beispielsweise Kollagen, Fibronectin, Hyaluronsäure und Glykosaminoglycanen vermischt werden. Diese natürlichen Polymere sind alle Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM), welche die Zellen produzieren und abscheiden. Es wird angenommen, dass dadurch, dass natürliche Polymere mit synthetischen Polymeren verbunden werden, die Osteo-Konduktanz- und Biokompatibilitäts-Eigenschaften mit den physikalischen und mechanischen Eigenschaften der synthetischen Komponente kombiniert werden können, wodurch künstliche Bio-Polymere zu einem guten Ersatz für bioaktive Biomaterialien gemacht werden können.
  • Giusti et al (1994) diskutieren die Bedeutung der Vermischung von Kollagen mit Polymermaterialien zur Verwendung als medizinische Vorrichtungen, und zeigen, wie diese Vermischung auch die mechanischen und thermischen Eigenschaften im Vergleich zu den einzelnen Komponenten erhöht. Cascone et al. (1994) zeigten die Verwendung von Kollagen und Hyaluronsäure basierend auf polymeren bio-artifiziellen Polymeren als erfolgreiches Medikamenten-Abgabesystem für die Freisetzung von Wachstumshormonen.
  • Verschiedene Berichte haben die Bedeutung des ECM bei der Zellfunktion gezeigt (Ruoslahti et al., 1985 und Ellis und Yannis, 1996). Zellen heften sich zunächst an dem Biomaterial aufgrund von physiochemischen Faktoren an, beispielsweise aufgrund der Ladung, der freien Oberflächenenergie oder des Wassergehaltes des Biomaterials (Schamberger und Gardella, 1994) und haften dann fest an ECM-Proteinen, die auf der Biomaterial-Oberfläche abgeschieden worden sind. Wie das ECM auf einer speziellen Biomaterial-Oberfläche abgeschieden, stabilisiert und konfiguriert wird, ist noch immer nicht bekannt, doch wurde gefunden, dass Gewebe-Transglutaminase (tTG) beim Stabilisierungsprozess eine Rolle spielt. Es ist wichtig, diesen Prozess zu verstehen, um die zellulären Reaktionen auf Oberflächen zu steuern.
  • Transglutaminasen (Enzyme Commission System of Classification 2.3.2.13) sind eine Gruppe von multifunktionalen Enzymen, welche die Proteine in Geweben und Körperflui den quervernetzen und stabilisieren (Aeschlimann und Paulsson, 1994 und Greenberg et al., 1991). Bei Säugetieren sind sie kalziumabhängig und katalysieren die post-translationale Modifikation von Proteinen durch die Ausbildung von inter- und intramolekularen ε(γ-Glutamyl)-Lysin-Querverbindungen. Die so gebildeten Verbindungen sind stabil, kovalent und gegen Proteolyse widerstandsfähig, wodurch die Widerstandsfähigkeit von Geweben gegen chemische, enzymatische und physikalische Zerstörung erhöht wird. Im Gegensatz zu Transglutaminasen, die von Säugetieren1) stammen, sind mikrobielle Transglutaminasen im Allgemeinen nicht Ca2+-abhängig.
  • Die Anzahl von Proteinen, die als Glutaminylsubstrate für Transglutaminasen wirken, ist stark eingeschränkt, da sowohl die Primärstruktur als auch die Konformation kritisch sind. Im Gegensatz hierzu ist das einzige Erfordernis des Acyl-Akzeptor-Substrats das Vorhandensein eines geeigneten Primäramins, beispielsweise der ε-Amino-Gruppe von peptidgebundenen Lysin-Residuen und kleinen Primäraminen. Verschiedene Arten von Transglutaminase-Enzymen unterscheiden sich in ihrer Spezifizität für ein gegebenes Glutaminylsubstrat. Beispielsweise wirkt der Plasma-Transglutaminase-Blutgerinnungsfaktor XIIIa in einem eingeschränkten Bereich von Glutaminylsubstraten im Vergleich zu Gewebe (oder Typ II)-Transglutaminase (tTG). Anders als der Faktor XIIIa bindet tTG auch GTP und GDP, von dem angenommen wird, dass es bei seiner Regulierung durch Ca2+ wichtig ist (siehe Smethurst und Griftin, 1996). Ein weiterer Schlüssel-Unterschied zwischen den Arten von Transglutaminase liegt in ihrer Verteidigung.
  • Obwohl tTG hauptsächlich als ein cytosolisches Enzym beschrieben wurde und keine typische hydrophobe Führungssequenz für die Sekretion enthält, kann es in Abhängigkeit vom Zelltyp sowohl im Cytosol als auch der Membran zugeordnet gefunden werden. Die biologische Funktion von tTG wurde noch nicht ermittelt. Es gibt jedoch zunehmende Hinweise darauf, dass tTG an der Zelloberfläche wirken kann und dabei die Anhaftung der Zelle (Borge et al., 1996) und die Zellausbreitung (Jones et al, 1997) und die Modifikation der extrazellulären Matrix (ECM) erleichtert (Aeschlimann et al., 1995, Barsigian et al., 1991, Bowness et al., 1988 und Bendixen et al., 1993).
  • Die Fähigkeit von Transglutaminase-Enzymen Proteine quer zu vernetzen, wurde bei der Entwicklung von biologischen Klebstoffen untersucht, um die Adhäsion zwischen Gewebeoberflächen zu fördern. Beispielsweise sind biologische Klebstoff-Zusammensetzungen, die eine Gewebe-Transglutaminase enthalten, in WO 94/28949 beschrieben. Diese Zusammensetzungen umfassen auch einen divalenten Metallionen-Co-Faktor, der eine regulatorische Rolle bei der funktionalen Aktivität von Transglutaminase-Enzymen spielt (siehe Casadio et al., 1999, Eur. J. Biochem. 262, 672 bis 679). Die Verwendung einer Transglutaminase als biologischer Klebstoff, bei der das Enzym in einer aktiven Form verwendet wird, wird auch in EP-0 530 804 A (und den darin erwähnten Literaturstellen) beschrieben.
  • Anmerkung des Übersetzers: Der Kürze halber wird in diesem Text der englische Begriff „mammal" nur mit dem Ausdruck „Säugetier" wiedergegeben. Es sei aber ausdrücklich darauf hingewiesen, dass hierunter sowohl Säugetiere as auch Menschen verstanden werden. So kann „Säugetier-Transglutaminase" auch menschliche Transglutaminase bedeuten, usw
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein erster Gesichtspunkt der Erfindung schafft ein medizinisches Implantat-Material, das eine Säugetier1)-Transglutaminase und ein Polymer umfasst, wobei die Transglutaminase in Abwesenheit von freien divalenten Metallionen vorgesehen wird und wobei das Polymer einem Binde-Protein zum Binden der Transglutaminase zugeordnet ist.
  • Unter dem Ausdruck „medizinisches Implantat-Material" verstehen wir ein Material für die Implantation in den menschlichen oder tierischen Körper, wie z.B. ein Material zur Verwendung als künstliches Gewebe (beispielsweise Knochen, Zähne und Haut), Prothesen (beispielsweise Gelenke, Herzklappen, Blutgefäße) und Medikamenten-Abgabevorrichtungen.
  • Unter dem Ausdruck „Säugetier-Transglutaminase" verstehen wir ein Element aus der Gruppe von Enzymen, die durch die Nr. 2.3.2.13 (EC 2.3.2.13) des Enzyme Commission Systems of Classification identifiziert werden, wobei das Enzym direkt oder indirekt von einer Säugetierquelle gewonnen ist. Somit schließen wir hier Transglutaminasen, die aus Säugetier-Gewebeproben zubereitet (d.h. extrahiert) wurden, ebenso ein, wie Säugetier-Transglutaminasen, die durch Rekombinationsmethoden exprimiert sind. Wir schließen hier auch Varianten von natürlicherweise auftretenden Säugetier-Transglutaminasen mit ein.
  • Mit dem Ausdruck „freie divalente Metallionen" verstehen wir divalente Metallionen, die nicht in einem Chelat-Komplex enthalten sind, wie z.B. Ca2+-Ionen, die zur Verfügung stehen, um mit der Transglutaminase in Wechselwirkung zu treten und die funktionale Aktivität des Enzyms zu regulieren.
  • Unter dem Ausdruck „in Abwesenheit von freien divalenten Metallionen vorgesehen" verstehen wir Transglutaminasen, die in der Anwesenheit von divalenten Metallionen vorgesehen sind, die an einen Chelatbildner gebunden sind und somit nicht für eine Wechselwirkung mit dem Enzym zur Verfügung stehen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Gesichtspunktes der Erfindung ist die Transglutaminase eine Gewebe-Transglutaminase.
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist die Transglutaminase eine Plasma-Transglutaminase.
  • Vorzugsweise wird die Transglutaminase aus Säugetiergewebe oder Säugetier-Zellen zubereitet.
  • In stärker bevorzugter Weise wird die Transglutaminase aus menschlichem Gewebe oder menschlichen Zellen zubereitet. Beispielsweise kann die Transglutaminase aus menschlichen Gewebe-Quellen wie z.B. der Lunge, der Leber, der Milz, den Nieren, dem Herzmuskel, Skelettmuskeln, der Augenlinse, endothelialen Zellen, Erythrocyten, glatten Muskelzellen, Knochen und Makrophagen extrahiert werden. Vorteilhafterweise ist die Transglutaminase eine Gewebe-Transglutaminase, die von menschlichen roten Zellen (Erythrocyten) gewonnen wurde, oder eine Plasma-Transglutaminase, die entweder von einer menschlichen Plazenta oder menschlichem Plasma gewonnen wurde.
  • Alternativ kann die Transglutaminase aus einer Kultur menschlicher Zellen gewonnen werden, die eine Säugetier-Transglutaminase exprimiert, unter Verwendung der aus dem Stand der Technik allgemein bekannten Zellkultur-Methodologie. Vorzugsweise umfassen Zelllinien-Quellen für solche Transglutaminasen die menschliche Endothelial-Zelllinie ECV304 (für Gewebe-Transglutaminase) und die menschliche Osteosarkoma-Zelllinie MG63.
  • Der Fachmann erkennt, dass die Quelle für die Transglutaminase entsprechend der speziellen Verwendung des medizinischen Implantations-Materials (beispielsweise in Abhängigkeit vom Implantations-Ort) ausgewählt werden kann. Wenn beispielsweise das medizinische Implantations-Material als künstlicher Knochen verwendet werden soll, kann es für das Material vorteilhaft sein, wenn es eine vom Knochen gewonnene Transglutaminase umfasst.
  • Bei einer anderen Ausführungsform des ersten Gesichtspunktes der Erfindung ist die Transglutaminase eine rekombinante Transglutaminase. Beispielsweise wird die Herstellung des rekombinanten Faktors XIII in der europäischen Patentanmeldung EP-268 772 A beschrieben.
  • Nukleinsäure-Moleküle, die eine Transglutaminase kodieren, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise wird die kodierende Sequenz für das Polypeptid des menschlichen Koagulations-Faktors XIII A1 von Grundmann et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(21), 8024-8028 (Zugangs-Nr. NM 000129) beschrieben. Die kodierende Sequenz für Transglutaminase aus menschlichem Gewebe wird von Gentile et al., 1991, J. Biol. Chem. 266(1) 478-483 beschrieben (Zugangs-Nr. M55153).
  • Nukleinsäure-Moleküle, die eine Transglutaminase kodieren, können entsprechend bekannter Verfahren verwendet werden, die geeigneter Weise im Lichte der hier gegebenen technischen Lehre modifiziert sind, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle für die Expression und Produktion des Polypeptids gemäß der Erfindung zu transformieren. Verfahren der Expression von Proteinen in rekombinanten Zell-Linien sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt (siehe Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor (New York)). Beispielhafte Verfahren umfassen auch solche, wie sie in den US-Patentschriften 4,440,859 vom 3. April 1984 für Rutter et al., 4,530,901 vom 23. Juli 1985 für Weissman, 4,582,800 vom 15. April 1986 für Crowl, 4,677,063 vom 30. Juni 1987 für Mark et al., 4,678,751 vom 7. Juli 1987 für Goeddel, 4,704,362 vom 3. November 1987 für Itakura et al., 4,710,463 vom 1. Dezember 1987 für Murray, 4,757,006 vom 12. Juli 1988 für Toole, Jr. et al, 4,766,075 vom 23. August 1988 für Goeddel et al. und 4,810,648 vom 7. März 1989 für Stalker beschrieben sind, die alle hier durch Bezugnahme mit aufgenommen werden.
  • Das Nukleinsäuremolekül, beispielsweise cDNA, das die Transglutaminase kodiert, kann mit einer großen Vielzahl anderer DNA-Sequenzen für die Einführung in einen geeigneten Wirt verbunden werden. Die Begleit-DNA hängt von der Natur des Wirtes, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und davon ab, ob eine episomale Beibehaltung oder Integration gewünscht ist.
  • Allgemein wird die DNA in einen Expressionsvektor wie z.B. in ein Plasmid in geeigneter Orientierung und in dem für die Expression richtigen Leserahmen eingefügt. Erforderlichenfalls kann die DNA mit den geeigneten transkriptionalen und translationalen regulatorischen Steuer-Nukleotidsequenzen verbunden sein, die von dem gewünschten Wirt erkannt werden, obwohl solche Steuerungen generell in dem Expressionsvektor zur Verfügung stehen. Somit kann der DNA-Einsatz in arbeitsmäßiger Weise mit einem geeigneten Promotor verbunden sein. Bakterielle Promotoren umfassen die E. coli lacI- und IacZ-Promotoren, den T3- und den T7-Promotor, den gpt-Promotor, die Phagen-λ-PR und -PL-Promotoren, den phoA-Promotor und den trp-Promotor. Eukaryotische Promotoren umfassen den CMV-immediate-early-Promotor, den HSV-Thymidin-Kinase-Promotor, die Early- und Late-SV40-Promotoren und die Promotoren von retroviralen LTRs. Andere geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt. Alternativ kann das Baculovirus-Expressionssystem in Insektenzellen verwendet werden (siehe Richardson et al. 1995, Methods in Molecular Biology, Bd. 39, J. Walker, Herausgeber, Humana Press, Totowa NJ). Die Expressionskonstrukte umfassen wünschenswerter Weise auch Stellen für eine Auslösung und Beendigung der Transkription und in dem transkribierten Bereich eine Ribosom-Bindestelle für die Translation (Hastings et al., International Patent Nr. WO 98/16643, veröffentlicht am 23. April 1998).
  • Der Vektor wird dann mit Hilfe von Standardverfahren in den Wirt eingeführt. Im Allgemeinen werden nicht alle Wirtszellen durch den Vektor transformiert und es wird daher erforderlich sein, transformierte Wirtszellen zu selektieren. Ein Selektionsverfahren umfasst die das Aufnehmen eines DNA-Sequenz-Markers in den Expressionsvektor mit irgendwelchen erforderlichen Kontrollelementen, der für irgendeine auswählbare Eigenschaft in der transformierten Zelle kodiert. Diese Marker umfassen Dihydrofolat-Reduktase G418 oder Neomycin-Resistance für eukaryotische Zellenkulturen und Tetracyclin-, Kanamycin- oder Ampicillin-Widerstands-Gene für eine Kultur in E. coli und anderen Bakterien. Alternativ kann das Gen für eine solche wählbare Eigenschaft auf einem anderen Vektor angeordnet sein, der verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle zu cotransformieren.
  • Wirtszellen, die durch die rekombinante DNA der Erfindung transformiert worden sind, werden dann für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, unter Berücksichtigung der hier gegebenen technischen Lehre kultiviert, um die Expression der Transglutaminase zu ermöglichen, die dann gewonnen werden kann.
  • Die rekombinante Transglutaminase kann aus rekombinanten Zellkulturen durch allgemein bekannte Verfahren einschließlich der Ausfällung durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, Säureextraktion, Anionen- oder Kationen-Austausch-Chromatographie, Phos phozellulose-Chromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lecithin-Chromatographie gewonnen und gereinigt werden. Besonders bevorzugt ist es, mit hohem Durchsatz arbeitende Flüssig-Chromatographie (HPLC) für die Reinigung zu verwenden.
  • Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich der Systeme, die folgendes verwenden: Bakterien (z.B. E. coli und Bacillus subtilis), die beispielsweise mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressions-Vektoren transformiert worden sind; Hefen (z.B. Saccaromyces cerevisiae), die beispielsweise mit Hefe-Expressions-Vektoren transformiert worden sind; Insekten-Zellsysteme, die beispielsweise mit viralen Expressionsvektoren (beispielsweise Baculovirus) transformiert worden sind; Pflanzenzellen-Systeme, die beispielsweise mit viralen oder bakteriellen Expressions-Vektoren transfiziert worden sind; Tier-Zellsysteme, die beispielsweise mit Adenovirus-Expressionsvektoren transfiziert worden sind.
  • Die Vektoren umfassen ein prokaryotisches Replikon, wie z.B. das Col E1 ori, für eine Ausbreitung in einem Prokaryoten, selbst wenn der Vektor für eine Expression in anderen, nicht prokaryotischen Zelltypen verwendet werden soll. Die Vektoren können auch einen geeigneten Promotor wie z.B. einen prokaryotischen Promotor umfassen, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) der Gene in einer bakteriellen Wirtszelle, wie z.B. E. coli zu steuern, die mit ihm transformiert worden ist.
  • Ein Promotor ist ein Expressions-Steuerelement, das von einer DNA-Sequenz gebildet wird, die ermöglicht, dass die Bindung von RNA-Polymerase und die Transkription eintreten. Promotor-Sequenzen, die mit exemplarischen bakteriellen Wirtszellen kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmidvektoren vorgesehen, die bequeme Restriktions-Bereiche für das Einfügen eines DNA-Segments der vorliegenden Erfindung umfassen.
  • Typische, prokaryotische Vektorplasmide sind: pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, die von Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA) geliefert werden. pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 und pRIT5, die von Pharmacia (Piscataway, NJ, USA) geliefert werden, pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, die von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA) geliefert werden.
  • Ein typisches Säugetierzellen-Vektorplasmid ist pSVL, das von Pharmacia (Piscataway, NJ, USA) geliefert wird. Dieser Vektor verwendet den SV40-Late-Promotor um die Expression von klonierten Genen anzutreiben, wobei der höchste Pegel der Expression in T-Antigen erzeugenden Zellen wie z.B. COS-1-Zellen gefunden wird. Beispiele eines induzierbaren Säugetier-Expressions-Vektors sind pMSG, das ebenfalls von Pharmacia (Piscataway, NJ, USA) geliefert wird, und das Tetracyclin-(tet)-regulierbare System, das von Clontech geliefert wird. Der pMSG-Vektor verwendet den durch Glukocorticoid induzierbaren Promotor des langen End-Repeats des Mäuse-Brustdrüsen-Tumor-Virus, um die Expression des klonierten Gens anzutreiben. Das durch tet regulierbare System verwendet die Anwesenheit oder die Abwesenheit von Tetracyclin, um die Protein-Expression über den durch tet gesteuerten transkriptionalen Aktivator zu induzieren.
  • Nützliche Hefe-Plasmidvektoren sind pRS403-406 und pRS413-416 und werden im Allgemeinen von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA, 92037, USA) geliefert. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Hefe-Integrating-Plasmide (YIps) und umschließen die wählbaren Hefe-Marker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3. Die Plasmide pRS413-416 sind Hefe-Centromere-Plasmide (YCps).
  • Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, welche die kodierende Sequenz und z.B. geeignete transkriptionale und translationale Steuerungselemente enthalten. Ein solches Verfahren umfasst die Ligation mit Hilfe von homopolymeren Enden. Homopolymere polydA-(oder polydC)-Enden werden zu exponierten 3' OH-Gruppen an den DNA-Fragment angefügt, um durch Deoxynukleotidyl-Endtransferasen geklont zu werden. Das Fragment ist dann in der Lage, sich an die polydT-(oder polydC)-Enden anzulagern, die zu den Enden eines linearisierten Plasmidvektors hinzugefügt werden. Nach dem Anlagern (annealing) offen gebliebene Lücken können durch DNA-Polymerase gefüllt werden und an die freien Enden kann sich DNA-Ligase anschließen.
  • Ein anderes Verfahren umfasst die Ligation mit Hilfe von kohäsiven Enden. Kompatible kohäsive Enden können an dem DNA-Fragment und -Vektor durch die Wirkung geeigneter Restriktionsenzyme erzeugt werden. Diese Enden hänngen sich schnell durch komplementäre Basis-Paarung an, und verbleibende Kerben können durch die Wirkung von DNA-Ligase geschlossen werden.
  • Ein weiteres Verfahren verwendet synthetische Moleküle, die als Linker und Adaptoren bezeichnet werden. DNA-Fragmente mit stumpfen Enden werden durch Bakteriophage-T4-DNA-Polymerase oder E. coli DNA-Polymerase I erzeugt, die vorstehende 3'-Termini entfernen und vertiefte 3'-Enden auffüllen. Synthetische Linker, Teile von stumpfendiger, doppelsträngiger DNA, die Erkennungssequenzen für die definierte Restriktionsenzyme enthalten, können durch T4-DNA-Ligase an stumpfendige DNA-Fragmente angefügt werden. Sie werden danach mit geeigneten Restriktionsenzymen abgebaut, um kohäsive Enden zu erzeugen und dann an einen Expressionsvektor mit kompatiblen Termini angeheftet. Adaptoren sind ebenfalls chemisch synthetisierte DNA-Fragmente, die ein stumpfes Ende umfassen, das für eine Ligation verwendet wird, die aber auch ein vorgeformtes kohäsives Ende besitzen.
  • Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Restriktions-Endonuklease-Stellen enthalten, stehen im Handel von verschiedenen Lieferanten zur Verfügung, zu denen auch International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA gehört.
  • Ein wünschenswerter Weg der Modifizierung der Nukleinsäuremoleküle, die die Transglutaminase kodieren, besteht darin, die Polymerase-Kettenreaktion zu verwenden, wie dies von Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491 beschrieben wird. Bei diesem Verfahren wird das Nukleinsäuremolekül, beispielsweise DNA, das enzymatisch amplifiziert werden soll, von zwei spezifischen Oligonukleotid-Primern flankiert, die selbst in die amplifizierte DNA aufgenommen werden. Diese spezifischen Primery können Restriktions-Endonuklease-Erkennungs-Stellen enthalten, die für eine Klonierung in Expressionsvek toren unter Verwendung von Verfahren eingesetzt werden können, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
  • Günstigerweise ist die Säugetier-Transglutaminase eine variante Transglutaminase.
  • Unter einem „varianten Polypeptid" verstehen wir ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz einer natürlicherweise auftretenden Säugetier-Transglutaminase umfasst, wobei Aminosäure-Einfügungen, Ausschneidungen oder Substitutionen entweder konservativ oder nichtkonservativ so vorgenommen wurden, dass die Änderungen die Aktivität der Variante im Vergleich zur Aktivität der aktivierten, natürlicherweise auftretenden Säugetier-Transglutaminase nicht wesentlich vermindern. Beispielsweise kann die Variante im Vergleich zur Aktivität der natürlicherweise auftretenden Transglutaminase eine erhöhte Aktivität besitzen.
  • Alternativ kann die Variante eine erhöhte Fähigkeit besitzen, die Besiedelung von medizinischen Implantaten durch Zellen zu erleichtern, wobei diese erhöhte Fähigkeit unabhängig von der Enzymaktivität der Variante ist, aber in Beziehung zu bestimmten anderen Eigenschaften der Variante steht. Beispielsweise kann die erhöhte Fähigkeit der varianten Transglutaminase zur Erleichterung der Besiedelung von medizinischen Implantaten durch Zellen mit einer erhöhten Fähigkeit einhergehen, endogene (d.h. Wirts-)Proteine, wie z.B. Rezeptoren zu binden.
  • Die Enzymaktivität von varianten Säugetier-Transglutaminasen kann durch das Biotin-Cadaverin-Untersuchungsverfahren gemessen werden, wie dies in den Beispielen beschrieben ist und von Jones et al., 1997, J. Cell. Sci. 110, 2461-2472 veröffentlicht wurde. Beispielsweise führt die verminderte Expression von Gewebe-Transglutaminase in einer menschlichen Endothelial-Zelllinie zu Veränderungen in der Zell-Ausbreitung, Zell-Anhaftung und zu einer verminderten Polymerisation von Fibronectin. Alternativ kann die Transglutaminase-Aktivität durch die Inkorporation von [14C]-Putrescin-Incorporation in N,N'-Dimethylcasein gemessen werden, wie dies von Lorand et al., 1972, Analytical Biochemistry 50, 623 beschrieben wird. Die erhöhte Fähigkeit des varianten Enzyms die Anhaftung und Ausbreitung von Zellen auf medizinischen Implantaten zu erleichtern, kann durch die hier beschriebenen Verfahren gemessen werden.
  • Variante Transglutaminasen können unter Verwendung von Verfahren der Protein-Konstruktion und der stellen-gerichteten Mutagenese hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind (siehe beispielsweise Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York).
  • Vorzugsweise ist die variante Säugetier-Transglutaminase eine inaktive Gewebe-Transglutaminase, wobei ihr aktives Stellen-Cystein (beispielsweise Cys 277 der menschlichen Gewebe-Transglutaminase; siehe Gentile et al., 1992, supra und Zugangs-Nr. M 55153) zu einem Serin-Residuum mutiert ist.
  • Vorteilhafterweise ist die variante Säugetier-Transglutaminase ein Fragment einer natürlicherweise auftretenden Gewebe-Transglutaminase oder von Faktor XIIIa, das bzw. der die Fähigkeit der natürlicherweise auftretenden Transglutaminase beibehält, die Biokompatiblität zu fördern. Die Fähigkeit von Transglutaminase-Fragmenten, die Biokompatiblität zu fördern, kann dadurch ermittelt werden, dass die Anhaftungs-Eigenschaften von solchen varianten Proteinen beispielsweise dadurch gemessen werden, dass die künstlichen Polymere mit dem oder den varianten Enzymen mit oder ohne Vorbeschichtung mit Fibronectin beschichtet werden und dass dann die Fähigkeit von Zellen untersucht wird, sich an diese beschichteten Polymere anzuheften und sich auf ihnen auszubreiten.
  • Es wird vom Fachmann ohne weiteres gesehen, dass die medizinischen Implantatmaterialien gemäß der Erfindung natürlicherweise auftretende Polymere, synthetische Polymere, Copolymere solcher Polymere und Mischungen hiervon umfassen können.
  • Vorzugsweise ist das Polymer ein natürlicherweise auftretendes Polymer. In stärker bevorzugter Weise ist das Polymer ein natürlicherweise auftretendes, extrazelluläres Matrix-Molekül, wie z.B. Kollagen, Fibronectin, Fibrin, Fibrillin, Glykosoaminoglycan und Hyaluronsäure.
  • Vorteilhafterweise ist das Polymer ein synthetisches Polymer. In stärker bevorzugter Weise ist das Polymer ein synthetisches Polymer, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgende Mitglieder umfasst: Poly(ε-Caprolacton) (PCL), Poly(L-Lactid) (PLA), Poly(glycolid) (PGA), Poly(DL-Lactid-co-glycolid) (PLG) und Copolymere und Mischungen hiervon. Andere synthetische Polymere umfassen Methacrylat-poly(ethylmethacrylat), Ethylacrylat, Tetrahydrofurfurylmethacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Silastic, Poly(Tetrafluorethylen), Medpore (poröses Polyethylen), Poly(orthoester) und Poly(dioxan).
  • In am meisten bevorzugter Weise umfasst das medizinische Implantat-Material Poly(ε-Caprolacton).
  • Es sei darauf hingewiesen, dass die Polymere biologisch abbaubar oder biologisch nicht abbaubar sein können. Vorzugsweise ist das Polymer biologisch abbaubar. In stärker bevorzugter Weise ist das Polymer ein biologisch abbaubares Polymer, das eine biologische Abbaurate besitzt, die die gleiche oder langsamer ist als die Rate der Regeneration des Gewebes, für das das medizinische Implantat als vorübergehender Ersatz dient. Somit sollte das biologisch abbaubare Polymer erst dann resorbiert werden, wenn es seinem Zweck als Gerüst für die Regeneration von neuem Gewebe erfüllt hat. Es sei weiter darauf hingewiesen, dass das Polymer und seine Abbauprodukte im Wesentlichen nichttoxisch und nicht entzündungserregend sein sollten.
  • Bei dem medizinischen Implantat-Material gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung ist das Polymer einem Bindeprotein zugeordnet, das eine Transglutaminase bindet.
  • Unter dem Ausdruck „Bindeprotein" wird ein Protein oder Polypeptid verstanden, das in der Lage ist, sich an eine Säugetier-Transglutaminase zu binden, d.h. ein Transglutaminase-Binde-Protein. Vorzugsweise bindet sich das Transglutaminase-Binde-Protein an die Säugetier-Transglutaminase mit einer Bindungsaffinität von mehr als 103 L/mol. In stärker bevorzugter Weise ist die Affinitätskonstante größer als 104 L/mol, beispielsweise größer als 105 L/mol, 106 L/mol, 107 L/mol, 108 L/mol, 109 L/mol, 1010 L/mol oder 1011 L/mol.
  • Vorteilhafterweise ist das Transglutaminase-Binde-Protein ein Transglutaminase-Substrat oder umfasst ein solches.
  • Unter dem Ausdruck „ein Transglutaminase-Substrat" wird hier ein Protein oder Polypeptid verstanden, das eine Transglutaminat-Substrat-Stelle umfasst.
  • Vorzugsweise wird das Transglutaminase-Binde-Protein aus einer Gruppe von Transglutaminase-Substraten ausgewählt, die Fibronectin, Fibrin, Fibrinogen, Kollagen, Entactin, Osteonectin, Osteopontin, Thrombospondin, Vitronectin, β-Lactoglobulin und Kasein oder Fragmente hiervon umfasst, die in der Lage sind, sich an eine Transglutaminase zu binden.
  • In bevorzugter Weise ist das Transglutaminase-Binde-Protein Fibronectin oder ein Fragment hiervon, das in der Lage ist, sich an eine Transglutaminase zu binden.
  • In am meisten bevorzugter Weise ist das Transglutaminase-Binde-Protein ein menschliches Fibronectin-Fragment, das das N-terminale Fragment von Fibronectin (d.h. die Aminosäuren 32-608) oder Fragmente in dieser Domäne, beispielsweise die wahrscheinliche tTgase-Binde-Stelle (Aminosäuren 229-273), die Kollagen-Binde-Stelle (Aminosäuren 308-608) oder die Fibrin-Heparin-Binde-Stelle 1 (Aminosäuren 52-272) oder Kombinationen dieser verschiedenen Fragmente umfasst. Aus GenBank X02761 (Literaturstelle Kornblititt et al. EMBO. J. (1985) 4, 1755-1759) für menschliches Fibronectin.
  • Der Fachmann sieht, dass spezielle Kombinationen von Transglutaminase und Transglutaminase-Binde-Protein bevorzugt sein können. Beispielsweise kann es vorzuziehen sein, eine Gewebe-Transglutaminase in Kombination mit Fibronectin (oder einem Fragment hiervon) zu verwenden. In ähnlicher Weise kann es vorzuziehen sein, eine Plasma-Transglutaminase (beispielsweise Faktor XIII) in Kombination mit Fibrin (oder einem Fragment hiervon) und Fibronectin (oder einem Fragment hiervon) zu verwenden. Zusätzlich können die medizinischen Implantat-Materialien des ersten Gesichtspunktes der Erfindung Mischungen von verschiedenen Transglutaminasen und Transglutaminase-Binde-Proteinen umfassen.
  • Bei den medizinischen Implantat-Materialien der vorliegenden Erfindung kann das Polymer dem Transglutaminase-Binde-Protein unter Verwendung von Verfahren zugeordnet werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Unter „zugeordnet" verstehen wir ein Polymer, das mit einem Transglutaminase-Binde-Protein beschichtet, imprägniert, an es kovalent gebunden oder mit ihm auf andere Weise vermischt ist.
  • Vorzugsweise ist das Polymer mit dem Binde-Protein beschichtet. Unter „beschichtet" wird hier verstanden, dass das Transglutaminase-Binde-Protein auf die Oberfläche des Polymers aufgebracht wird. So kann das Polymer mit einer Lösung bestrichen oder besprüht werden, die ein Transglutaminase-Binde-Protein umfasst. Alternativ kann das Po lymer in einen Behälter mit Transglutaminase-Binde-Protein-Lösung eingetaucht werden. Vorzugsweise ist das Polymer vorgeformt, so dass es das medizinische Implantat bildet, bevor es mit einem Transglutaminase-Binde-Protein beschichtet wird.
  • Vorteilhafterweise wird das Polymer mit dem Binde-Protein imprägniert. Unter „imprägniert" wird hier verstanden, dass das Transglutaminase-Binde-Protein in das Polymer aufgenommen oder mit ihm auf andere Weise vermischt wird, so dass es durch das medizinische Implantat-Material hindurch verteilt ist.
  • Beispielsweise kann das Polymer über Nacht bei 4°C in einer Lösung inkubiert werden, die ein Transglutaminase-Binde-Protein umfasst. Alternativ kann ein Transglutaminase-Binde-Protein an der Polymer-Oberfläche durch Verdampfen oder durch Inkubation bei Zimmertemperatur immobilisiert werden.
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist das Transglutaminase-Binde-Protein kovalent mit dem Polymer verknüpft, d.h. an der äußeren Oberfläche des Polymers.
  • Somit wird eine kovalente Bindung zwischen einer geeigneten funktionalen Gruppe an dem Transglutaminase-Binde-Protein und einer funktionalen Gruppe an dem Polymer-Träger gebildet. Verfahren der kovalenten Bindung von Proteinen an Polymer-Träger fallen in eine Reihe von Gruppen, die eine kovalente Verknüpfung über ein Diazonium-Zwischenglied durch Ausbildung von Peptid-Verbindungen, durch Alkylierung von Phenol-, Amino- und Sulphydryl-Gruppen an das Binde-Protein, unter Verwendung eines polyfunktionalen Zwischenglieds, beispielsweise Glutardialdehyd und andere verschiedene Verfahren umfassen, beispielsweise die Verwendung von silyertem Glas oder Quarz, wobei die Reaktion von Trialkoxysilanen die Derivatisierung der Glasoberfläche mit vielen verschiedenen funktionalen Gruppen ermöglicht. Hinsichtlich der Einzelheiten siehe „Enzyme immobilisation" von M. Griffin, E.J. Hammonds und C.K. Leach (1993) in Technological Applications of Biocatalysts (BIOTOL SERIES), S. 75-118, Butterworth-Heinemann. Siehe auch den Übersichtsartikel mit dem Titel „Biomaterials in Tissue Engineering" von J.A. Hubbell (1995) Science 14: 565-576.
  • Sobald es mit dem Polymer verbunden ist, kann das Transglutaminase-Binde-Protein ein Mittel zum Verbinden der Säugetier-Transglutaminase mit dem Polymer sein.
  • Das dem Binde-Protein zugeordnete Polymer kann mit der Säugetier-Transglutaminase unter Verwendung der gleichen Methoden behandelt werden, wie sie oben beschrieben wurden. Somit kann das Polymer (oder das medizinische Implantations-Material, das dieses Polymer umfasst) beschichtet, imprägniert, kovalent gebunden oder auf andere Weise mit einer Säugetier-Transglutaminase verbunden bzw. vermischt werden.
  • Vorzugsweise wird das Polymer mit einer Säugetier-Transglutaminase beschichtet. Beispielsweise kann das Polymer mit einer Lösung bestrichen oder besprüht werden, die eine Transglutaminase umfasst. Alternativ kann das Polymer in einem Behälter mit einer Transglutaminase-Lösung eingetaucht werden. In stärker bevorzugter Weise wird das Polymer mit einer Transglutaminase unmittelbar vor der Implantation des medizinischen Implantat-Materials in den menschlichen oder tierischen Körper beschichtet. Beispielsweise kann das Polymer mit der Transglutaminase an dem gleichen Tag beschichtet werden, an welchem das medizinische Implantat verwendet werden soll, beispielsweise ungefähr eine Stunde vor dem Implantation.
  • Vorteilhafterweise wird das Polymer mit einer Säugetier-Transglutaminase imprägniert.
  • Günstigerweise ist das Polymer kovalent an eine Säugetier-Transglutaminase entweder direkt oder indirekt über das Binde-Protein gebunden.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass das Transglutaminase-Binde-Protein mit dem Polymer beschichtet, imprägniert, an es kovalent gebunden oder mit ihm auf andere Weise vermischt werden kann. Dies kann gleichzeitig mit oder vor der Behandlung des Polymers mit einer Säugetier-Transglutaminase geschehen. Vorzugsweise wird das Polymer dem Binde-Protein zugeordnet, bevor es mit einer Säugetier-Transglutaminase behandelt wird.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein medizinisches Implantations-Material geschaffen, das ein Polymer umfasst, welches zuerst mit einem Transglutaminase-Binde-Protein und dann mit einer Säugetier-Transglutaminase beschichtet wird.
  • In den medizinischen Implantations-Materialien gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird die Transglutaminase in Abwesenheit von freien divalenten Metallionen vorgesehen.
  • Die Anwesenheit von freien divalenten Metallionen, beispielsweise Ca2+-Ionen spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Säugetier-Transglutaminase-Aktivität. Somit macht die Abwesenheit freier divalenter Metallionen in der Nachbarschaft bzw. Umgebung der Transglutaminase das Enzym in vitro im Wesentlichen inaktiv.
  • Unter dem Ausdruck „in Abwesenheit von" werden hier Umgebungen verstanden, in denen die Konzentration von freien divalenten Metallionen, wie z.B. Ca2+-Ionen kleiner als 10 μM ist. Vorzugsweise ist die Konzentration kleiner als 1 μM.
  • Vorzugsweise wird die Transglutaminase in Abwesenheit freier Ca2+-Ionen vorgesehen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Gesichtspunktes der Erfindung werden freie divalente Metallionen in der Nachbarschaft der Transglutaminase dadurch vermindert oder beseitigt, dass in das medizinische Implantations-Material ein Chelatbildner eingeschlossen wird. Beispielsweise können die medizinischen Implantations-Materialien ein Polymer umfassen, das in eine Lösung eingetaucht worden ist, die eine Transglutaminase und einen Chelatbildner enthält, so dass das Polymer mit der Transglutaminase und dem Chelatbildner beschichtet ist.
  • Vorzugsweise ist der Chelatbildner EDTA oder EGTA.
  • In stärker bevorzugter Weise wird das Implantations-Material mit EDTA oder EGTA mit Konzentrationen zwischen 5 mM und 0,1 M versehen.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des ersten Gesichtspunktes der Erfindung umfasst das medizinische Implantations-Material weiterhin einen Verstärkungs-Wirkstoff.
  • Der Verstärkungs-Wirkstoff kann irgendein im Wesentlichen nicht toxisches Material sein, das mit dem Polymer/Transglutaminase-Komponenten des medizinischen Implantations-Materials vermengt oder vermischt werden kann, um dessen Festigkeit zu erhöhen.
  • Vorzugsweise wird das Verstärkungsmittel aus einer Gruppe ausgewählt, die Aluminium, Aluminium-Bor-Silizium, Kalzium-Metaphosphat-Glasfasern, Titan und Kohlenstoff umfasst.
  • Der Fachmann sieht, dass die medizinischen Implantations-Materialien gemäß der Erfindung weiterhin ein oder mehrere zusätzliche Polymere umfassen können. Somit wird ein medizinisches Implantations-Material geschaffen, das ein Copolymer oder vermischte Polymere und eine Säugetier-Transglutaminase umfasst.
  • Günstigerweise sind das eine oder die mehreren Polymere synthetische Polymere.
  • Vorteilhafterweise sind das eine oder die mehreren zusätzlichen Polymere natürliche Polymere.
  • Vorzugsweise sind das eine oder die mehreren zusätzlichen Polymere ein natürliches Polymer, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Kollagen, Fibronectin, Fibrin, Fibrillin, Hyaluronsäure und Glykosaminoglycane umfasst.
  • Ein zweiter Gesichtspunkt der Erfindung sieht die Verwendung von Säugetier-Transglutaminase bei einem Verfahren zur Verbesserung der Biokompatibilität eines medizinischen Implantations-Materials vor, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (i) Bereitstellen eines medizinischen Implantations-Materials, das ein Polymer umfasst, das mit einem Binde-Protein zum Binden der Transglutaminase verknüpft ist, und
    • (ii) Behandeln dieses Materials mit einer Säugetier-Transglutaminase, wobei die Transglutaminase in Abwesenheit von freien divalenten Metallionen vorgesehen wird.
  • Unter „Biokompatibilität" wird die Fähigkeit des medizinischen Implantations-Materials verstanden, seine Besiedelung durch Wirtszellen zu erleichtern und die Proliferation bzw. Vermehrung von Wirtszellen in ihm zu verstärken. Somit soll der Ausdruck „Biokompatibilität" nicht ein bloßes Anhaften von Wirtszellen an den medizinischen Implantations-Materialien bezeichnen sondern bezieht sich stattdessen auf eine Wechselwirkung zwischen den Wirtszellen und den Implantations-Materialien, die es ermöglicht, dass eine Besie delung auftritt. Insbesondere umfasst der Ausdruck „Biokompatibilität" die Fähigkeit des besagten Materials, die Zellen-Anhaftung, Zellen-Ausbreitung, Zellen-Vermehrung und Zellen-Differentiation zu unterstützen.
  • Die Biokompatibilität eines medizinischen Implantations-Materials kann durch die Verwendung von Verfahren erreicht werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind (siehe Beispiele). Beispielsweise geht die erhöhte Biokompatibilität eines medizinischen Implantations-Materials mit einer Erhöhung der Fähigkeit des Materials einher, die Zellen-Anhaftung, Zellen-Ausbreitung, Zellen-Vermehrung und Zellen-Differentiation zu erleichtern. Darüber hinaus sollte das Material keinen merklichen Verlust in der Verfügbarkeit der Zellen induzieren, d.h. das Absterben von Zellen entweder durch Apoptose oder Nekrose nicht induzieren. Die Differentiation eines Zelltyps wird in Abhängigkeit von dem in Rede stehenden Zelltyp auf unterschiedliche Weisen gemessen. Beispielsweise kann für Osteoblast-Zellen in einer Kultur alkalisches Phosphat zusammen mit der extrazellulären Matrix-Abscheidung (ECM), d.h. Kollagen 1, Fibronectin, Osteonictin und Osteopontin als Marker verwendet werden. Darüber hinaus ist die Fähigkeit von Zellen zur Vermehrung und zur Abscheidung von ECM für jedes Material wichtig, das als Implantat verwendet werden soll, und dies umfasst endotheliale Zellen, Chondrocyten und epitheliale Zellen usw.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform des zweiten Gesichtspunkts der Erfindung schafft die Verwendung einer Säugetier-Transglutaminase zur Erleichterung der Besiedelung eines medizinischen Implantations-Materials durch Wirtszellen.
  • Die Säugetier-Transglutaminase für die Verwendung gemäß des zweiten Gesichtspunkts der Erfindung kann irgendeine Transglutaminase sein, die im Zusammenhang mit dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung beschrieben wurde. Vorzugsweise ist die Transglutaminase eine Gewebe-Transglutaminase. Vorteilhafterweise wird die Transglutaminase von menschlichem Gewebe oder menschlichen Zellen gewonnen. Geeigneterweise ist die Transglutaminase eine rekombinante Transglutaminase. Günstigerweise ist die Transglutaminase eine variante Transglutaminase.
  • Der zweite Gesichtspunkt der Erfindung sieht die Verwendung einer Säugetier-Transglutaminase zur Verbesserung der Biokompatibilität irgendeines Materials vor, das ein Polymer umfasst, das mit einem Transglutaminase-Binde-Protein versehen ist, das für medizinische Implantate verwendet werden kann.
  • Vorzugsweise ist das medizinische Implantations-Material ein Polymer, wie es oben in Bezug auf den ersten Gesichtspunkt der Erfindung definiert wurde, oder umfasst ein solches.
  • Somit kann das medizinische Implantations-Material ein natürlicherweise auftretendes Polymer, beispielsweise ein natürlicherweise auftretendes Polymer umfassen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die extrazelluläre Matrix-Moleküle wie z.B. Kollagen, Fibronectin, Fibrin, Fibrillin, Glykosaminoglycane und Hyaluronsäure umfasst.
  • Alternativ oder zusätzlich hierzu kann das medizinische Implantations-Material ein synthetisches Polymer umfassen, beispielsweise ein Polymer, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Poly(ε-Caprolacton) (PCL), Poly(L-Lactid) (PLA), Poly(glycolid) (PGA), Poly(DL-Lactid-co-glycolid) (PLG) und Copolymere und Mischungen hiervon umfasst. Andere synthetische Polymere umfassen Methylacrylat-poly(ethylmethacrylat), Ethylacrylat, Tetrahydrofurfurylmethacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Silastic, Poly(Tetrafluorethylen), Medpore (poröses Polyethylen), Poly(orthoester) und Poly(dioxan).
  • Vorzugsweise ist das medizinische Implantations-Material das Polymer Poly(ε-Caprolacton) oder umfasst dieses.
  • Bei der Verwendung gemäß dem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung kann die Behandlung des medizinischen Implantations-Materials mit einer Säugetier-Transglutaminase das Beschichten, Imprägnieren, die kovalente Verbindung oder eine auf andere Weise erfolgende Vermischung des medizinischen Implantations-Materials mit der Transglutaminase umfassen.
  • Vorzugsweise umfasst der Schritt (ii) die Beschichtung des medizinischen Implantations-Materials mit einer Transglutaminase. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst der Schritt (ii) das Imprägnieren des medizinischen Implantations-Materials mit einer Transglutaminase. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst der Schritt (ii) die kovalente Bindung der Transglutaminase an das medizinische Implantations-Material (siehe die oben beschriebenen Verfahren).
  • Der Schritt der Behandlung des medizinischen Implantations-Materials mit einer Transglutaminase wird in Abwesenheit von freien divalenten Metallionen durchgeführt, so dass die Transglutaminase in vitro im Wesentlichen inaktiv ist. Beispielsweise wird der Schritt der Behandlung des medizinischen Implantations-Materials mit einer Transglutaminase in der Anwesenheit eines Chelatbildners für divalente Metallionen, wie z.B. EDTA oder EGTA ausgeführt.
  • In dem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung umfasst das medizinische Implantations-Material ein Polymer, das mit einem Transglutaminase-Binde-Protein verbunden ist. Das Polymer und das Binde-Protein können miteinander auf eine Vielzahl von Wegen verbunden sein, wie dies im Zusammenhang mit dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung beschrieben wurde.
  • Wie im Fall des ersten Gesichtspunktes der Erfindung sieht der Fachmann, dass bestimmte Kombinationen von Transglutaminasen und Transglutaminase-Binde-Proteinen bevorzugter Weise verwendet werden können, beispielsweise eine Gewebe-Transglutaminase mit Fibronectin (oder einem Fragment hiervon) oder eine Plasma-Transglutaminase mit Fibrin (oder einem Fragment hiervon). Darüber hinaus können Mischungen verschiedener Transglutaminasen und Transglutaminase-Binde-Proteine verwendet werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform des zweiten Gesichtspunktes der Erfindung sieht die Verwendung einer Säugetier-Transglutaminase vor, um die Biokompatibilität eines medi zinischen Implantations-Materials zu verbessern, das zusätzlich einen Verstärkungs-Wirkstoff enthält.
  • Vorteilhafterweise wird der Verstärkungswirkstoff aus einer Gruppe ausgewählt, die Aluminium, Aluminium-Bor-Silikat, Kalzium-methaphosphat-Glasfasern, Kohlenstoff und Titan umfasst.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des zweiten Gesichtspunktes der Erfindung schafft die Verwendung einer Säugetier-Transglutaminase zur Verbesserung der Biokompatibilität eines medizinischen Implantations-Materials, das weiterhin ein oder mehrere zusätzliche Polymere umfasst. Somit kann das medizinische Implantations-Material ein Copolymer oder eine Mischung von Polymeren sein.
  • Günstigerweise ist es günstig, wenn das eine oder die mehreren zusätzlichen Polymere ein synthetisches Polymer sind. Vorteilhafterweise sind das eine oder die mehreren zusätzlichen Polymere ein natürliches Polymer. Vorzugsweise sind das eine oder die mehreren zusätzlichen Polymere ein natürliches Polymer, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Kollagen, Fibronectin, Fibrin, Fibrillin, Hyaluronsäure und Glykosaminoglycane umfasst.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform des ersten oder zweiten Gesichtspunktes der Erfindung ist das medizinische Implantations-Material ein künstlicher Knochen.
  • Die Erfindung wird nun im Einzelnen unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und Beispiele beschrieben:
  • 1 zeigt die Fotografie der Morphologie von menschlichen Osteoblast-Zellen (HOBs) auf PCL nach 24 Stunden, wenn sie in einem 10% Serum enthaltenden Medium ausgesät wurden, (Darstellung unter Verwendung von Lichtmikroskopie, ursprüngliche Vergrößerung 63-fach).
  • 2 zeigt eine Fotografie der Morphologie von menschlichen Osteoblast-Zellen auf PCL nach 4 Tagen, wenn sie in einem 10% Serum enthaltenden Medium ausgesät wurden (Darstellung unter Verwendung von Lichtmikroskopie, ursprüngliche Vergrößerung 63-fach).
  • 3 zeigt eine Fotografie der Morphologie von menschlichen Osteoblast-Zellen auf einer Gewebekultur-Plastik nach 24 Stunden, wenn sie in einem 10% Serum enthaltenden Medium ausgesät wurden (Darstellung unter Verwendung von Lichtmikroskopie, ursprüngliche Vergrößerung 63-fach).
  • 4 zeigt eine Fotographie der Morphologie von menschlichen Osteoblast-Zellen auf Gewebekultur-Plastik nach 4 Tagen, wenn sie in einem 10% Serum enthaltenden Medium ausgesät wurden (Darstellung unter Verwendung von Lichtmikroskopie, ursprüngliche Vergrößerung 63-fach).
  • 5 zeigt die Standardkurve für die Bindung von Fibronectin an Poly(ε-Caprolacton) (PCL) gemessen unter Verwendung des ELISA-Verfahrens (siehe Beispiele). Das Fibronectin wurde durch Übernacht erfolgende Verdampfung bei Zimmertemperatur immobilisiert (siehe Abschnitt 2.4.2 bezüglich der Einzelheiten). Die Daten stellen Mittelwerte +/– S.D. dar (n = 3).
  • 6 zeigt die Standardkurve für die Bindung von Gewebe-Transglutaminase an Poly(ε-Caprolacton) (PCL), das mit Fibronectin beschichtet war, gemessen unter Verwendung des ELISA-Verfahrens (siehe Beispiele). Das tTG wurde durch Übernacht erfolgende Verdampfung bei Zimmertemperatur immobilisiert (bezüglich der Details siehe Abschnitt 2.4.2.). Die Daten stellen Mittelwerte +/– S.D. dar (n = 3).
  • 7 zeigt die Standardkurve für die Bindung von Gewebe-Transglutaminase an Poly(ε-Caprolacton) (PCL), das mit Fibronectin beschichtet war, gemessen unter Verwendung des ELISA-Verfahrens (siehe Beispiele). Das tTG wurde auf der Oberfläche 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur immobilisiert (bezüglich der Einzelheiten siehe Abschnitt 2.4.3.). Die Daten stellen Mittelwerte +/– S.D. dar (n = 3).
  • 8 zeigt die quantitative Bewertung der Aktivität von tTG wenn dieses auf PCL in Lösung mit Fibronectin (FN) über Nacht bei 4°C immobilisiert wurde unter Verwendung der Biotin-Cadaverin-Inkorporation (siehe Beispiele). Ein Vergleich mit einer Immobilisierung auf Gewebekultur-Plastik ist ebenfalls dargestellt. HB bedeutet einen Puffer, der 5 mN Tris-HCl (pH 7,4), 0,25 M Sucrose, 3,85 mM DTT enthält. Kalzium wird mit einer Konzentration von 5 mM und EDTA mit einer Konzentration von 5 mM zugegeben. Die Daten stellen Mittelwerte +/– S.D. dar (n = 3). Eine statistische Analyse unter Verwendung der Einweg-Analyse der Varianz (Anova) wurde mit den Daten durchgeführt (** = P < 0,01 und ns = nicht signifikant verschieden).
  • 9 zeigt die quantitative Bewertung der Aktivität von tTG, wenn es auf mit Fibronectin beschichtetem PCL durch Verdampfung immobilisiert wurde, unter Verwendung des Biotin-Cadaverin-Untersuchungsverfahrens (siehe Beispiele). Ein Vergleich mit einer Immobilisierung auf Gewebekultur-Plastik ist ebenfalls dargestellt. Die Daten stellen Mittelwerte +/– S.D. dar (n = 3). Statistische Analyse unter Verwendung der Einweg-Analyse der Varianz (Anova) wurde mit den Daten durchgeführt (** = P < 0,01 und ns = nicht signifikant verschieden).
  • 10 zeigt die quantitative Bewertung der Aktivität von tTG bei Immobilisierung auf mit Fibronectin beschichtetem PCL durch Inkubation bei Zimmertemperatur über 1 Stunde unter Verwendung des Biotin-Cadaverin-Untersuchungsverfahrens (siehe Beispiele). Die Daten stellen Mittelwerte +/– S.D. dar (n = 3). Statistische Analyse unter Verwendung der Einweg-Analyse der Varianz (Anova) wurde mit den Daten durchgeführt (*** = P < 0,001, ** = P < 0,01, * = P < 0,05 und ns = nicht signifikant verschieden).
  • 11 zeigt eine Mikrofotographie von menschlichen Osteoblast-Zellen auf PCL in einem serumfreien Medium, 30 Minuten nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Ver wendung von E.S.E.M.). Alle Zellen haben auf der Biomaterial-Oberfläche eine runde Morphologie.
  • 12 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen in einem serumfreien Medium auf mit Fibronectin beschichtetem PCL, 30 Minuten nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Die Zellen haben sich an das Biomaterial angeheftet und einige Zellen haben begonnen, sich auszubreiten.
  • 13 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen in einem serumfreien Medium auf mit Fibronectin und Gewebe-Transglutaminase beschichtetem PCL, 30 Minuten nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Die Zellen haben sich angeheftet und die Mehrzahl breitet sich gut aus, wobei die Zellen eine flache Morphologie besitzen.
  • 14 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen in einem Serum enthaltenden Medium auf Gewebekultur-Plastik, 30 Minuten nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Die Zellen haben sich angeheftet und begonnen, sich schwach auszubreiten.
  • 15 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen auf PCL in serumfreiem Medium, 60 Minuten nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Die Zellen, die sich an das PCL angeheftet haben, beginnen, sich leicht auszubreiten.
  • 16 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen in serumfreiem Medium auf mit Fibronectin beschichtetem PCL, 60 Minuten nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Die Ergebnisse zeigen eine gemischte Morphologie mit runden, leicht ausgebreiteten und abgeflachten Zellen.
  • 17 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen in serumfreiem Medium auf mit Fibronectin und Gewebe-Transglutaminase beschichtetem PCL, 60 Minuten nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Alle Zellen haben sich auf dieser speziellen Oberfläche ausgebreitet und haben eine flache Morphologie.
  • 18 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen in einem Serum enthaltenden Medium auf Gewebekultur-Plastik, 60 Minuten nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Die Zellen haben begonnen, sich auszubreiten und manche Zellen haben eine flache Morphologie.
  • 19 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen auf PCL in einem serumfreien Medium 3 Stunden nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Die Zellen haben alle eine runde Morphologie. Einige der Zellen haben sich von der Oberfläche abgelöst.
  • 20 zeigt eine Mikrofotografie von menschlichen Osteoblast-Zellen in einem serumfreien Medium mit Fibronectin auf beschichtetem PCL 3 Stunden nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Alle Zellen haben eine flache Morphologie und bilden eine Mono-Schicht über der Oberfläche des Biomaterials.
  • 21 zeigt eine Mikrofotographie von menschlichen Osteoblast-Zellen in serumfreiem Medium auf mit Fibronectin und Gewebe-Transglutaminase beschichtetem PCL 3 Stunden nach dem Aussähen der Zellen (Darstellung unter Verwendung von E.S.E.M.). Die Zellen haben alle eine flache Morphologie und bilden eine vollständige Mono-Schicht auf der Oberfläche dieses Biomaterials.
  • 22 zeigt HOB-Zellen, die sich auf Poly(ε-Caprolacton) (PCL) ausbreiten, wenn dieses entweder mit Fibronectin (FN) oder Fibronectin und Gewebe-Transglutaminase (FN + tTG) beschichtet ist, 30 Minuten nach dem Aussähen der Zellen. Die Zellen wurden als Typ I-III bewertet (wobei es sich beim Typ I um Zellen handelt, die sich gerade angeheftet haben und beim Typ III um Zellen, die sich im späten Stadium der Ausbreitung befinden). Diese Ergebnisse wurden alle mit Gewebekultur-Plastik (TCP) mit (+) und ohne (-) Serum in dem Medium verglichen, die als positive bzw. negative Kontrollen verwendet worden waren.
  • 23 zeigt menschliche Osteoblast-Zellen, die sich auf Poly(ε-Caprolacton) (PCL) ausbreiten, wenn dieses entweder mit Fibronectin (FN) oder Fibronectin und Gewebe-Transglutaminase (FN + tTG) beschichtet ist, 60 Minuten nach dem Aussähen der Zellen. Die Zellen wurden als Typ I-III bewertet (wobei es sich beim Typ I um Zellen handelt, die sich gerade angeheftet haben und beim Typ III um Zellen, die sich im späten Stadium der Ausbreitung befinden). Diese Ergebnisse wurden alle mit Gewebekultur-Plastik (TCP) mit (+) und ohne (–) Serum in dem Medium verglichen, die als positive bzw. negative Kontrollen verwendet worden waren.
  • 24 zeigt die Vermehrung von HOBs auf Gewebekultur-Plastik über 8 Tage unter Verwendung verschiedener Mengen von fötalem Kälberserum im Medium. Die Zellenzahlen wurden durch Messung der Gesamt-DNA unter Verwendung des Verfahrens analysiert, wie es in Abschnitt 2.9.1.1. beschrieben ist. Die Daten stellen Mittelwerte +/– S.D dar. (n = 4). Die Ergebnisse wurden statistisch unter Verwendung des t-Tests analysiert.
  • 25 zeigt die Vermehrung von menschlichen Osteoblast-Zellen auf PCL in DMEM, das verschiedene Mengen von fötalem Kälberserum enthält; die Untersuchung wurde unter Verwendung des DNA-Höchst-Untersuchungsverfahrens durchgeführt. Die Daten stellen Mittelwerte +/– S.D. dar (n = 3). Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Einweg-Analyse der Varianz (Anova) analysiert (** = P < 0,01, * = P < 0,05 und ns = nicht signifikant verschieden).
  • BEISPIELE
  • Verfahren und Materialien
  • Poly(ε-Caprolacton)-Scheiben-Zubereitung
  • Poly(ε-Caprolacton) (PCL) (PCL650; Solvay Interox) wurde in Pellet-Form gekauft und in einem quadratischen Hohlraum bei einer Temperatur oberhalb des Schmelzpunktes gepresst, um eine 4 mm dicke Schicht zu bilden. PCL-Scheiben (mit einem Durchmesser von 6 mm) wurden dann aus der Polymerschicht unter Verwendung eines Korkbohrers ausgestanzt und unter UV-Licht 1 Stunde lang auf jeder Seite vor ihrer Verwendung sterilisiert.
  • Zellkultur
  • Menschliche Osteoblast-Zellen (HOB) wurden aus Explantaten trabekulärer Knochen isoliert, die von Oberschenkelknochen-Köpfen nach einer orthopädischen Operation abgetrennt worden waren (wie von DiSilvio 1995 beschrieben). Alle Zellen wurden in vitro in einer Kultur unter Verwendung von Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) angesetzt. Dies wurde mit 10%-igem fötalem Kälberserum, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 150 μg/ml Ascorbinsäure (BDH, Poole, U.K.), 2 mM L-Glutamin, 0,02 M [4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure], (HEPES), 1% Penicillin/Streptomycin (alle von Gibco, BRL, Paisley, U.K. lieferbar) ergänzt. Die Zellen wurden bei 37°C in einem Gasgemisch mit 5% CO2 und 95% Luft inkubiert.
  • Optische Darstellung von menschlichen Osteoblast-Zellen auf PCL über 4 Tage hinweg unter Verwendung der Toluidine-Blue-Anfärbung und Überfragungs-Elektronen-Mikroskopie (T. E. M.)
  • HOB-Zellen wurden auf dem PCL in 10% Serum enthaltendem DMEM wachsen gelassen, um zunächst die Wechselwirkung von Zellen mit dieser speziellen Polymeroberfläche abzuschätzen. Die Toluidine-Blue-Anfärbung ermöglichte es, das Anhaften, Ausbreiten und die Vermehrung der Zellen auf dem PCL zu beobachten. Die Transmissions-Elektronen-Mikroskopie ermöglichte es, die Ultra-Struktur der Zellen auf dem Biomaterial zu beobachten. Beide Verfahren sollten anzeigen, ob das Polymer mit dem jeweiligen Zelltyp biokompatibel ist.
  • Toluidine-Blue
  • PCL-Scheiben wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen (3 Replikate pro Probe) angeordnet und es wurden menschliche Osteoblast-Zellen (HOBs) auf das Biomaterial in 10% Serum enthaltendem DMEM mit einer Dichte von 1,7 × 105/cm2 ausgesät. Die Gewebekultur-Plastik (TCP) wurde als positive Kontroll- bzw. Vergleichsoberfläche verwendet.
  • Die Platte wurde dann bei 37°C in 5% CO2 inkubiert. An den Tagen 1 und 4 nach dem Aussähen der Zellen wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden in steriler, mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen wurden in 4% Paraformaldehyd und 2% Sucrose 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur fixiert und dann zweimal in PBS gewaschen. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit 1% Toluidine Blue angefärbt, das in sterilem PBS aufgelöst war. Die Proben wurden dann mehrere Male in PBS gewaschen und unter Verwendung von Lichtmikroskopie (Olympus SZ-PT) optisch inspiziert.
  • Überfragungs-Elektronen-Mikroskopie (T.E.M.)
  • PCL-Scheiben wurden in einer Platte mit 48 Vertiefungen (3 Replikate pro Zeitpunkt) angeordnet und HOB-Zellen wurden auf dem Biomaterial in 10% Serum enthaltendem DMEM mit einer Dichte von 1,7 × 105/cm2 ausgesät. Thermanox wurde als positive Vergleichsoberfläche verwendet. Die Platte wurde dann bei 37°C in 5% CO2 inkubiert. An den Tagen 1, 2, 4 und 8 nach dem Aussähen der Zellen wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden in sterilem PBS gewaschen. Die Proben wurden über Nacht in 1,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium-Kakodylat-Puffer (pH 7,4) fixiert und dann in dem gleichen Puffer gewaschen und ein zweites Mal unter Verwendung von 1% Osmiumtetroxid in Millonig's-Puffer 1 Stunde lang fixiert. Die Proben wurden in Puffer gewaschen, worauf ein Entwässerungsschritt durch eine Reihe von Alkoholen mit 50%, 70%, 90%, 96% und 100% mit 10-minütigem Wechsel für jeden Alkohol und 30 Minuten in 100% Alkohol folgte. Araldit CY212-Harz wurde zugegeben, so dass sich ein Verhältnis von 3:1 mit dem Alkohol ergab, es folgte eine Fixierung für 1 Stunde und dann eine Übertragung in eine 1:1-Harz/Alkohol-Mischung, die über Nacht stehengelassen und dann über 2 Stunden hinweg unter Vakuum-Infiltration in reines Harz eingebracht wurde. Das reine Harz wurde zweimal gewechselt (2 Stunden für jeden Wechsel) und dann in Blöcke geformt. Die Polymere wurden dann eingebettet und bei 45°C in einem Ofen 48 Stunden lang ausgehärtet (diese Temperatur wurde verwendet, um das PCL am Schmelzen zu hindern). Ultradünne Schnitte wurden dann unter Verwendung eines Reichert Ultracut E Ultramicrotoms angefertigt, auf Kupfergittern gesammelt und mit 3% Uranylacetat in 50% Methanol 6 Minuten lang und dann mit Reynold's Bleicitrat 6 Minuten lang gefärbt. Die Proben wurden unter Verwendung eines EM410 Transmissions-Elektronen-Mikroskops von Philips bei 80 kV untersucht.
  • Immobilisierung auf PCL von Meerschweinchen-Lebergewebe-Transglutaminase vom Typ II
  • Meerschweinchen-Lebergewebe-Transglutaminase (d.h. Typ II Transglutaminase, tTG), das von Sigma geliefert wird, wurde auf PCL unter Verwendung von drei Verfahren immobilisiert, wie im Folgenden erläutert wird. Jedes Verfahren verwendet die Idee, dass tTG auf dem PCL mit Hilfe von Fibronectin zu immobilisieren, weil Fibronectin eine tTG-Binde-Stelle besitzt. Das tTG muss nicht aktiv sein, um sich an das Fibronectin zu binden (d.h. Kalziumionen sind nicht erforderlich). Ethylendiamintetra-Essigsäure (EDTA) wurde dem tTG zugegeben, um das Enzym in seiner inaktiven Form zu halten und das Enzym daran zu hindern, dass Fibronectin oder sich selbst während der Immobilisierung zu vernetzen. Das tTG konnte dem PCL in Tropfenform zugegeben werden, weil die Oberfläche des PCL hydrophob war. Eine Menge von 60 μl war genug, um die gesamte Oberfläche zu bedecken, wobei sich an der Oberfläche ein Meniskus ausbildete.
  • (i) Immobilisierung bei 4°C
  • Eine Lösung von 15 μg/ml Rinderplasma-Fibronectin (Gibco) und 10 μg/ml Gewebe-Transglutaminase (tTG) in 0,1 M EDTA (pH 7,4) wurden zu den sterilen PCL-Scheiben (60 μl pro Scheibe) hinzu gegeben. Dies wurde dann über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Nach der Inkubation wurde die Lösung entfernt und das PCL wurde dreimal mit 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) jeweils 5 Minuten gewaschen. Die Scheiben wurden dann auf die Gewebe-Kulturplatten übertragen.
  • (ii) Immobilisierung durch Verdampfung über Nacht
  • Eine Teilmenge von 60 μl Rinderplasma-Fibronectin in sterilem, destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 30 μg/ml wurde jeder sterilen PCL-Scheibe zugegeben und über Nacht in der Gewebekultur-Haube stehen gelassen, um eine Verdampfung zu ermöglichen. Sobald das Wasser verdampft war, wurde eine Teilmenge von 60 μl Gewebe-Transglutaminase in 5 mM EDTA (pH 7,4) mit einer Konzentration von 20 μg/ml dem PCL zugegeben. Dies wurde in der Gewebekultur-Haube über Nacht für eine Verdampfung stehen gelassen und die Scheiben wurden dann dreimal für jeweils 5 Minuten in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) gewaschen. Die Scheiben wurden dann auf die Gewebekultur-Platten überführt.
  • (iii) Immobilisierung durch Inkubation bei Zimmertemperatur
  • Eine Teilmenge von 60 μl Rinderplasma-Fibronectin in sterilem, destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 30 μg/ml wurde jeder sterilen PCL-Scheibe zugegeben und über Nacht in der Gewebekultur-Haube für ein Verdampfen stehen gelassen. Sobald das Wasser verdampft war, wurde eine Teilmenge von 60 μl von 20 μg/ml Gewebe-Transglutaminase in 5 mM EDTA (pH 7,4) zu jeder PCL-Scheibe hinzu gegeben. Dies wurde dann 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die tTG-Lösung wurde entfernt und dann wurden die Scheiben dreimal jeweils für 5 Minuten in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) gewaschen und auf die Gewebekultur-Platten überführt.
  • ELISA für Fibronectin
  • PCL-Scheiben wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Fibronectin (0 bis 50 μg/ml) durch das oben beschriebene Verdampfungs-Verfahren beschichtet. Das Fibronectin wurde unter Verwendung des ELISA-Untersuchungsverfahrens (Gaudry, 1998) detektiert. Die Polymere wurden anfangs mit 3 × 100 μl PBS gewaschen und dann mit 100 μl 3%-igem (Gew./Vol.) Rinderserum-Albumin (BSA) in PBS blockiert. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert und dann mit 3 × 100 μl PBS vor der Zugabe von 100 μl des primären Antikörpers gewaschen (polyklonales Anti-Human-Kaninchen-Plasma-Fibronectin, verdünnt 1:5000 in Blockierpuffer). Die Platte wurde 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur inkubiert, dann in 3 × 100 μl PBS gewaschen, bevor 100 μl des sekundären Antikörpers (HRP konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen, verdünnt 1:5000 in Blockierpuffer) zugegeben wurde. Die Platte wurde 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert und dann in 3 × 100 μl vor der Zugabe von 100 μl von 0,1 M Natriumacetat gespült. Das HRP wurde unter Verwendung von 100 μl des Entwicklers detektiert (20 ml NaOAc, 150 μl TMB und 10 μl H2O2) und die Reaktion wurde mit 50 μl von 2,5 M H2SO4 gestoppt. Die Ergebnisse wurden dann in ein Colorimeter (Titertek Multiskan MCC/340MK2) bei einer Wellenlänge von 450 nm eingelesen.
  • Fibronectin-ELISA für Gewebe-Transglutaminase
  • Das ELISA-Verfahren, das verwendet wurde, um tTG zu detektieren, war eine Modifikation des ELISA-Verfahrens, das von Achyuthan et al. (1995) entwickelt wurde. Es beruht auf der Fähigkeit von tTG, sich speziell an immobilisiertes Plasma-Fibronectin zu binden.
  • PCL-Scheiben wurden unter Verwendung der beiden oben beschriebenen Verfahren mit 60 μl einer Lösung von 30 μg/ml Fibronectin in sterilem, destilliertem Wasser und dann mit verschiedenen Konzentrationen von tTG (0-50 μg/ml) beschichtet. Die Scheiben wurden in 3 × 100 μl PBS gewaschen und dann 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit 100 μl von 3% Gew./Vol BSA in PBS geblockt. Die PCL-Scheiben wurden mit 3 × 100 μl PBS gespült und gebundenes tTG wurde unter Verwendung von 100 μl von anti-monoklonalem Antikörper CUB7402 (verdünnt 1:1000 in Blockierpuffer) detektiert. Der primäre Antikörper wurde 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur auf dem Polymeren gelassen und dann in 3 × 100 μl PBS vor der Zugabe von 100 μl des sekundären Antikörpers gewaschen (HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-lgG (Sigma) 1:5000 in Blockierpuffer verdünnt) gewaschen. Dann wurden die Proben 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen und es wurde das HRP detektiert (wie oben beschrieben).
  • Ermittlung, ob sich tTG in seiner aktiven Form befindet, wenn es auf der PCL-Oberfläche immobilisiert ist
  • Um zu ermitteln, ob Fibronectin und tTG auf der Oberfläche des PCL vorhanden sind, wurde das Biotin-Cadaverin-Untersuchungsverfahren verwendet (Jones et al., 1997). Dieses Verfahren ermöglicht es auch, die Aktivität von tTG an der Oberfläche des Biomaterials zu quantifizieren.
  • Vier Gewebekultur-Plastik-Mulden (TCP) und vier PCL-Scheiben wurden so, wie oben beschrieben, mit Fibronectin beschichtet (3 Replikate pro Probe wurden verwendet). Für eine der mit Fibronectin beschichteten PCL-Proben wurde das tTG auf der PCL-Oberflä che durch Verwendung eines der drei oben beschriebenen, verschiedenen Verfahren immobilisiert. Nach dem Waschen des mit Fibronectin/tTG beschichteten PCL in 3 × 100 μl 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) wurden 100 μl von Homogenisierungspufter, der aus 0,25 mM Sucrose, 5 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 2 mM EDTA (pH 7,4) bestand, hinzu gegeben und für unterschiedliche Zeiträume bis zu 15 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden dann hinsichtlich der tTG-Aktivität untersucht. Die anderen drei mit Fibronectin beschichteten PCL-Scheiben wurden für Kontrollzwecke verwendet, in dem tTG in direkt homogenisierendem Puffer zugegeben wurde, der entweder Kalzium (positive Kontrolle) oder EDTA (negative Kontrolle) enthielt. Die andere negative Kontrolle war der Homogenisierungspuffer allein. Die vier mit Fibronectin beschichteten TCP-Mulden wurden, um zu ermöglichen, dass die tTG-Aktivität im Homogenisierungspuffer analysiert wird, von der mit Fibronectin und tTG beschichteten PCL-Oberfläche und für drei Kontrollen genommen, welche die gleichen sind, wie oben erwähnt.
  • Die PCL oder TCP wurden zunächst mit 100 μl von 3% BSA in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang blockiert und dann mit 3 × 100 μl 0,1 M Tris-HCl gewaschen. Für die positiven Kontrollen wurde 100 μl der folgenden Lösung den mit Fibronectin beschichteten TCP und PCL zugegeben: 20 μg/ml Meerschweinchen-tTG, 5 mM CaCl2, 3,85 mM DTT und 0,4% Biotin-Cadaverin im Homogenisierungs-Puffer. Für die negativen Kontrollen wurden 100 μl der folgenden Lösung den mit Fibronectin beschichteten TCP und PCL zugegeben: 20 μg/ml Meerschweinchen-tTG, 5 mM EDTA, 3,85 mM DTT und 0,4% Biotin-Cadaverin in Homogenisierungs-Puffer. Um jegliche Biomaterial-Wechselwirkung mit den Untersuchungsmaterialien auszuschließen, wurde eine weitere Kontrolle verwendet, die darin bestand, die folgende Lösung in mit Fibronectin beschichteten PCL und TCP zuzugeben: 5 mM CaCl2, 3,85 mM DTT und 0,4% Biotin-Cadaverin in Homogenisierungs-Puffer. Dies wurde auch den mit Fibronectin und tTG beschichteten PCL zugegeben. Zu den 100 μl Homogenisierungs-Puffer, die mit der immobilisierten Fibronectin/tTG-Oberfläche inkubiert worden waren, wurden 10 mM CaCl2, 3,85 mM DTT und 0,4% BC zugegeben.
  • Die Proben wurden dann 2 Stunden lang bei 37°C stehen gelassen. Nach dieser Zeit wurden 100 μl von 5 mM EDTA in 0,1 M Tris-HCl zu den Mulden zugegeben, dann 10 Minuten stehen gelassen und danach in 2 × 100 μl of 0,1 M Tris-HCl gewaschen. Es wurden 100 μl Extravidinperoxidase in 3% BSA zugegeben (Verdünnung 1:5000) und bei 37°C eine Stunde lang stehen gelassen. Die Mulden wurden mit 3 × 100 μl von 0,1 M Tris-HCl und 100 μl von 0,1 M NaOAc (pH 6,0) gewaschen. 100 μl des Entwicklers wurden zugegeben (20 ml NaOAc, 150 μl TMB und 10 μl H2O2) und die Reaktion mit 50 μl von 2,5 M H2SO4 gestoppt. Die Ergebnisse wurden dann in ein Colorimeter bei einer Wellenlänge von 450 nm eingelesen.
  • Ermittlung des Effektes, den Gewebe-Transglutaminase auf die Ausbreitung von menschlichem Osteoblast-Zellen auf Poly(ε-Caprolacton) hat
  • Zunächst wurden sterile PCL-Scheiben mit Fibronectin und tTG in der oben beschriebenen Weise beschichtet. Die Kontrollen bestanden aus PCL, mit Fibronectin beschichteten PCL und TCP. Die HOB-Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin gesammelt, worauf eine Blockierung in einem Serum enthaltenden Medium erfolgte, und dann zweimal in serumfreien Medium resuspendiert. Die Zellen wurden auf die Proben mit 3,4 × 105 Zellen/cm2 in serumfreien Medium ausgesät. Die Zellen wurden auch auf TCP in Serum enthaltenden Medium ausgesät (positive Kontrolloberfläche). Alle Proben wurden dreifach angesetzt.
  • Raster-Elektronen-Mikroskopie
  • Nach 1, 2, 4 und 6 Stunden wurden die Proben zweimal mit PBS gewaschen und in 1,5% Paraformaldehyd in Natrium-Cocodylat-Puffer 30 Minuten bei Zimmertemperatur fixiert. Die Proben wurden in einer abgestuften Serie von Ethanol (60%-100%) dehydriert und dann für eine Verdampfung über Nacht in Hexomethyldisilazan (HMDS) stehen gelassen. Die Proben wurden dann mit Gold beschichtet und unter Verwendung eines Philips 501 B Raster-Elektronen-Mikroskops betrachtet.
  • Umgebungs-Raster-Elektronen-Mikroskopie
  • Nach 30 Minuten, 1 Stunde und 3 Stunden wurden die Proben in 2 × 200 μl PBS gewaschen und 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur in 200 μl von 1,5% Paraformaldehyd in 0,1 M Natrium-Cocodylat-Puffer (pH 7,4) fixiert. Die Zellen wurden dann in 2 × 200 μl sterilem, zweifach destilliertem Wasser gewaschen und unter Verwendung eines Philips XL 30-Enviromental Raster-Elektronen-Mikroskops im nassen Zustand beobachtet, das mit einem Feld-Emmissions-Gun (FEG-ESEM) ausgerüstet war. Der Grad der Zellenausbreitung wurde als Typ I-III bewertet (Sinha et al., 1994).
  • Ermittlung des Effektes, den Gewebe-Transglutaminase auf die Differentiation von menschlichen Osteoblast-Zellen auf Poly(ε-Caprolacton) hat
  • (i) Ermittlung der minimalen Menge von fötalem Kälberserum in DMEM, die erforderlich ist, um die Vermehrung von menschlichen Osteoblast-Zellen auf PCL zu stimulieren
  • Zunächst wurde die minimale Menge von fötalem Kälberserum (FCS) im Medium ermittelt, die erforderlich ist, um die Vermehrung von HOB-Zellen zu stimulieren. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin gesammelt, worauf eine Blockierung in einem Serum enthaltenden Medium erfolgte, und hierauf wurden sie zweifach in serumfreiem Me dium resuspendiert. Die Zellen wurden dann in eine 96-Gewebe-Kulturplatte (Falcon) in jeweils 100 μl von 0%, 2%, 4%, 6% oder 10% FCS mit einer Dichte von 1,7 × 105 Zellen/cm2 ausgesät. Die verwendete Negativkontrolle bestand aus Medium ohne Zellen und die positive Kontrolle bestand aus Zellen in einem 10% Serum enthaltendem Medium. Die Zellen wurden für 1, 2, 4, 6 oder 8 Tage bei 30°C unter 5% CO2 inkubiert. Zu jedem dieser Zeitpunkte wurde das Medium aus den Mulden entfernt und die Zellen in 2 × 100 μl sterilem PBS gewaschen. Jeder Mulde wurden 100 μl steriles, doppelt destilliertes Wasser zugegeben und die Zellen wurden durch ein Gefrier/Auftau-Verfahren lysiert, das die Schritte umfasste, die Proben bei –80°C 20 Minuten einzufrieren und dann bei 37°C 15 Minuten lang aufzutauen. Dies wurde dreimal wiederholt. Der DNA-Gehalt einer jeden Probe wurde unter Verwendung des DNA-Höchst-Untersuchungsverfahrens ermittelt (Rago et al., 1990) (siehe unten).
  • Das oben beschriebene Experiment wurde unter Verwendung von PCL statt von TCP wiederholt, doch wurden 7% und 10% FCS im Medium verwendet und die Zellen wurden entweder 1 oder 3 Tage inkubiert. Die negative Kontrolle bestand aus Medium ohne Zellen. Die positive Kontrolle bestand aus Zellen in 10% Serum enthaltenden Medium auf TCP.
  • (i) DNA-Höchst-Untersuchungsverfahren (Rago et al., 1990)
  • Dieses Untersuchungsverfahren ermöglicht es, den zellulären DNA-Gehalt unter Verwendung von Fluorochrom und Bisbenzimidazol zu quantifizieren (Hoechst 33258; Sigma). Es arbeitet durch eine Verschiebung in der Emissionswellenlänge von Hoechst 33258 bei der Bindung von zellulärer DNA. Dies führt zu einer linearen Relation zwischen der Fluoreszenz und dem DNA-Gehalt über einen weiten Bereich von DNA. Es wurde gezeigt, dass diese Reaktion in hohem Maße spezifisch ist und dass andere zelluläre Inhalte, wie z.B. RNA, Protein und Kohlenstoffhydrate keine merkliche Fluoreszenz verursachen.
  • Höchst 33258 wurde in sterilem, deionisiertem Wasser auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml aufgelöst und dann 1:50 mit TNE-Puffer verdünnt (pH 7,4). Der TNE-Puffer bestand aus 10 mM Tris (BDH), 2 mM Natriumchlorid (Sigma) und 1 mM Diaminoethantetra-Essigsäure (EDTA) (Fisons). Es wurde zuvor gezeigt, dass rohe Zellextrakte, die in Anwesenheit hoher Salzkonzentrationen (wie in TNE-Puffer) untersucht wurden, aufgrund einer Dissoziation von DNA und Chromatin mit einer verbesserten Exposition von DNA-Binde-Stellen eine höhere Fluoreszenz ergeben.
  • 100 μl des verdünnten Hoechst 33258 wurde dann zu 100 μl der Zell-Lysate zusammen mit einem Bereich von positiven DNA-Kälber-Thymus-Standards (Bereich 0-20 μg/ml) (von Sigma beziehbar) hinzu gegeben. Die Fluoreszenz wurde dann bei 360 nm (Anregungsfilter) und 460 nm (Emissionsfilter) unter Verwendung eines CytoFluorTM Fluoreszenz-Plattenlesers (Millipore) gelesen.
  • (ii) Differentiation von menschlichen Osteoblast-Zellen auf den mit Fibronectin/Gewebe-Transglutaminase beschichteten PCL unter Verwendung des Alkalin-Phosphatase-Untersuchungsverfahrens
  • Die sterilen PCL-Scheiben wurden mit Fibronectin und tTG beschichtet, wie im Abschnitt 2.4.3 beschrieben. Die Kontrollen bestanden aus PCL, PCL mit FN beschichtet und auch aus TCP. Die HOB-Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin gesammelt, worauf eine Blockierung in einem Serum enthaltendem Medium folgte, und wo dann zweimal in serumfreien Medium resuspendiert. Die Zellen wurden auf den Polymeren und dem TCP mit 1,7 × 105 Zellen/cm2 in einem 10% Serum enthaltenden Medium angesetzt. Die Zellen wurden 2 Tage lang bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach diesem Zeitraum wurde das Medium entfernt, 100 μl PBS hinzu gegeben und dann wurden 100 μl von sterilem, destilliertem Wasser hinzugefügt. Die Zellen wurden unter Verwendung des Einfrier/Auftau-Verfahrens lysiert, bei dem die Zellen bei –80°C 20 Minuten lang eingefroren und dann 15 Minuten lang bei 37°C aufgetaut wurden (dies wurde dreimal wiederholt). Die Proben wurden dann 1:2 mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser verdünnt. Das DNA-Höchst-Untersuchungsverfahren (siehe oben) und das Alkalin-Phosphatase-Untersuchungsverfahren wurden dann an den Zell-Lysaten durchgeführt (siehe weiter unten).
  • (iv) Alkalin-Phosphatase-Untersuchungsverfahren (ALP) (Granutest-Teilsatz von Merck beziehbar)
  • Alkalin-Phosphatase (ALP) ist ein Marker für die frühe Knochenzellen-Differentiation. Dieses photometrische Untersuchungsverfahren ermöglicht es, die ALP-Aktivität zu quantifizieren. Das Prinzip des Untersuchungsverfahrens ist die Konversion von 4-Nitrophenylphosphat (Substrat) und Wasser zu Phosphat und 4-Nitrophenolat in Anwesenheit von aktiver ALP.
  • 25 ml-Puffer (pH 9,8) (der 1,0 Mol/l Diethanolamin, 0,5 mmol/l MgCl2 und 0,225 mMol/l NaCl enthielt) wurde zu 0,35 g des Substrates hinzu gegeben (das aus 255 μMol 4-Nitrophenylphosphat bestand). 50 μl dieser Lösung wurden dann 50 μl der Zell-Lysat-Probe zugegeben und die Absorption in einem Cytofluorimeter gemessen (Anthos Labtec Instruments) bei einer Wellenlänge von 450 nm (Messfilter) und 620 nm (Referenzfilter).
  • Ergebnisse
  • Menschliche Osteoblast-Morphologie auf Poly(ε-Caprolacton) (PCL)
  • Menschliche Osteoblast-Zellen wurden auf dem PCL in einem 10% Serum enthaltenden DMEM wachsen gelassen, um zunächst die Wechselwirkung der Zellen mit dieser speziellen Polymer-Oberfläche abzuschätzen. Die Anfärbung mit Toluidine Blue ermöglichte es, dass Anhaften, das Ausbreiten und die Vermehrung der Zellen auf dem PCL zu beo bachten. Die Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (T.E.M.) ermöglichte es, die Ultrastruktur der Zellen zu beobachten, um ihre Reaktion auf die Biomaterial-Oberfläche zu ermitteln. Hieraus kann sich ein Hinweis darauf ergeben, ob das Polymer mit diesem speziellen Zelltyp biokompatibel ist.
  • Die 1 und 2 zeigen HOB-Zellen, die mit Toluidine Blue an den Tagen 1 bzw. 4 auf PCL angefärbt wurden. Die 3 und 4 zeigen HOB-Zellen, die an den Tagen 1 und 4 auf TCP mit Toluidine Blue angefärbt wurden.
  • Diese Ergebnisse zeigen klar, dass HOB-Zellen sich an das PCL in einem 10% fötales Kälberserum enthaltenden DMEM, ebenso anhaften und ausbreiten, wie bei der positiven Kontrolle (TCP). Es ist auch ein deutliches Anwachsen der Zell-Population von Tag 1 zum Tag 4 sowohl auf dem TCP- als auch dem PCL-Oberflächen zu beobachten.
  • Die T.E.M.-Ergebnisse zeigen auch, dass sich die HOB-Zellen auf der PCL-Oberfläche vermehren, wie dies durch die im Laufe der Zeit erfolgende Mehrschicht-Ausbildung gezeigt wird. Es wurde gesehen, dass die Ultra-Struktur der HOB-Zellen auf PCL normal war. Nach 8 Tagen der Kultur in einem 10% fötales Kälberserum enthaltendem DMEM, zeigte sich jedoch, dass sehr wenige Zellen auf der Oberfläche blieben. Es wurde angenommen, dass die Zellen während des Waschvorganges abgelöst worden waren.
  • Detektion von Fibronectin und Gewebe-Transglutaminase (tTG) auf PCL
  • Das ELISA-Verfahren zeigte deutlich die Bindung von Fibronectin an PCL (siehe 5). Die Konzentration des gebundenen Fibronectins wuchs proportional bis zu 50 μg/ml.
  • Das modifizierte ELISA-Verfahren zeigte auch die Bindung von tTG an mit Fibronectin beschichtetes PCL, wenn das tTG entweder durch Verdampfung über Nacht oder durch eine einstündige Inkubation bei Zimmertemperatur immobilisiert worden war (siehe 6 und 7). Die 6 und 7 zeigen deutlich, dass tTG an PCL durch die Verwendung beider Verfahren immobilisiert werden kann. Die maximale Konzentration von tTG, die an dem mit Fibronectin beschichteten PCL immobilisiert werden kann, ist bei beiden Immobilisations-Verfahren ungefähr 30 μg/ml und die halbe maximale Bindungskapazität ist ungefähr 15 μg/ml.
  • Aktivität der Gewebe-Transglutaminase nach Immobilisation an der Biomaterial-Oberfläche
  • (i) Quantitative Bewertung der Aktivität von tTG an PCL, wenn eine Immobilisation in einer 0,1 M EDTA-Lösung zusammen mit Fibronectin bei einer Inkubation bei 4°C durchgeführt wurde
  • Die Aktivität von tTG an der PCL-Oberfläche wurde unter Verwendung des Biotin-Cadaverin-Inkorporation-Untersuchungsverfahrens (siehe oben) bewertet. 15 μg/ml von Fibronectin und 10 μg/ml tTG wurden auf der PCL-Oberfläche durch eine Inkubation zusammen in einer 0,1 M EDTA-Lösung über Nacht bei 4°C immobilisiert. Die Daten in 8 zeigen, dass das tTG an der PCL-Oberfläche oder in dem von dieser Oberfläche entfernten Homogenisierungs-Puffer nicht aktiv ist. Dies deutet darauf hin, dass entweder das Fibronectin auf dem PCL unter Verwendung dieses Verfahrens nicht immobilisiert worden war (was unter Verwendung des ELISA-Verfahrens bestätigt werden muss) oder dass das an das PCL adsorbierte Fibronectin sich in einer Konfiguration befand, dass für die tTG-Quervernetzung ungünstig ist. Die positive Kontrolle für PCL zeigte ebenfalls keine signifikante tTG-Aktivität, was wiederum darauf hinweist, dass das Fibronectin an der Oberfläche nicht vorhanden ist oder aufgrund seiner ungünstigen Konfiguration für eine tTG-Vernetzung nicht zugänglich ist. Eine Alternative würde darin bestehen, dass sich das tTG nicht an das Fibronectin gebunden hat und in einer inaktiven Form vorlag, da keine Aktivität auch im Homogenisierungs-Puffer gesehen wurde.
  • In weiteren Experimenten wurden die Fibronectin- und tTG-Konzentrationen erhöht. Es wurde auch angenommen, dass die 0,1 M EDTA-Lösung eine zu hohe Konzentration für die tTG-Bindung besaß, da das EDTA bei dieser Konzentration in eine störende Wechselwirkung mit der tTG-Binde-Stelle an dem Fibronectin-Molekül treten könnte. 5 mM EDTA wurden in den vorausgehenden Experimenten verwendet (was üblicherweise im Biotin-Cadaverin-Inkorporations-Untersuchungsverfahren verwendet wird, weil es hoch genug ist, um die tTG-Aktivität zu hemmen und doch auch nieder genug, um es dem tTG zu ermöglichen, sich an das Fibronectin zu binden).
  • (ii) Quantitative Bewertung der Aktivität von tTG an mit Fibronectin beschichteten PCL in 5 mM EDTA, wenn eine Immobilisierung durch Verdampfung stattgefunden hat
  • Die Aktivität von tTG auf der PCL-Oberfläche wurde unter des Verwendung Biotin-Cadaverin-Inkorporations-Untersuchungsverfahrens ermittelt (siehe oben). Das tTG wurde auf dem PCL dadurch immobilisiert, dass zunächst die Oberfläche mit 30 μg/ml Fibronectin durch Verdampfung beschichtet wurde. Eine 5 mM Lösung von 20 μg/ml tTG wurde dann dem PCL auf die gleiche Weise zugegeben (hinsichtlich der Einzelheiten siehe oben). Die Daten in 9 zeigen, dass das Verdampfungs-Verfahren es dem Fibronectin ermöglicht, auf dem PCL in einer Konfiguration immobilisiert zu werden, die für eine tTG-Vernetzung günstig ist (siehe PCL-Positiv-Kontrolle, die zeigt, dass die Zugabe von tTG zu einer Biotin-Cadaverin-Inkorporation auf der mit Fibronectin beschichteten PCL-Oberfläche führt). Die Anwesenheit von Fibronectin auf der PCL-Oberfläche, das durch dieses Verfahren immobilisiert worden war, wurde auch durch die ELISA-Untersuchung (siehe 5) bestätigt. 9 zeigt auch, dass das immobilisierte tTG auf dem PCL nicht aktiv ist, wenn es durch über Nacht erfolgende Verdampfung immobilisiert wird, obwohl die ELISA-Ergebnisse zeigen, dass es auf der Oberfläche vorhanden ist (siehe 6). Es gab keine signifikante tTG-Aktivität in dem Homogenisierungs-Puffer, der von der Fibronectin/tTG-PCL-Oberfläche entfernt worden war, was ebenfalls bestätigt, dass das tTG an der Oberfläche des Polymers vorhanden ist.
  • (iii) (iii) Quantitative Bewertung der Aktivität von tTG an mit Fibronectin beschichteten PCL, wenn eine Immobilisierung durch Inkubation in 5 mM EDTA 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur erfolgte
  • Die Aktivität von tTG auf der PCL-Oberfläche wurde unter Verwendung des Biotin-Cadaverin-Inkorporations-Untersuchungsverfahrens durchgeführt (siehe Abschnitt 2.7 hinsichtlich der Einzelheiten). Das tTG wurde auf dem PCL dadurch immobilisiert, dass zunächst die Oberfläche mit 30 μg/ml Fibronectin durch Verdampfung beschichtet wurde. Eine 5 mM Lösung von 20 μg/ml tTG wurde dann dem PCL für 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben (siehe oben bezüglich der Einzelheiten). Die 9 und 10 zeigen beide, dass es das Verdampfungsverfahren ermöglicht, dass das Fibronectin auf der Biomaterial-Oberfläche in einer Konfiguration immobilisiert wird, die für eine tTG-Vernetzung günstig ist (siehe die PCL-Positiv-Kontrolle, die zeigt, dass die Zugabe von tTG zu einer Biotin-Cadaverin-Inkorporation auf der mit Fibronectin beschichteten PCL-Oberfläche führt). 10 zeigt auch, dass immobilisiertes tTG auf der Biomaterial-Oberfläche vorhanden und aktiv ist, wenn es 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur immobilisiert wurde. Das ELISA-Verfahren (siehe 7) bestätigt, dass das tTG durch dieses Verfahren immobilisiert werden kann. Der Homogenisierungs-Puffer, der von dem PCL entfernt worden war, das zuvor mit Fibronectin und tTG beschichtet worden war, zeigte keine tTG-Aktivität im Vergleich zu der TCP-Negativ-Kontrolle, was bestätigt, dass das tTG an dem PCL immobilisiert worden war.
  • Ausbreitung von menschlichen Osteoblast-Zellen an mit Gewebe-Transglutaminase/Fibronectin beschichtetem PCL
  • HOB-Zellen an einer Gewebekultur-Plastik (TCP) mit und ohne 10% Serum in dem Medium und PCL, PCL + Fibronectin und PCL + Fibronectin + tTG in serumfreiem Medium wurden 2 oder 4 Stunden lang kultiviert. Danach wurden sie fixiert und unter Verwendung der Raster-Elektronen-Mikroskopie (S.E.M.) beobachtet. Die Ergebnisse zeigten klar, dass eine Zellausbreitung vor 2 Stunden an der mit Fibronectin/tTG beschichteten PCL-Oberfläche auftrat. Es trat eine gewisse Verzerrung der PCL-Oberfläche während des Hydrations-Schrittes bei der S.E.M.-Probenzubereitung auf. Das Experiment wurde daher unter Verwendung kleinerer Zeitpunkte wiederholt und es erfolgte eine Betrachtung unter Verwendung der Enviromental-Raster-Elektronen-Mikroskopie (E.S.E.M.), bei der kein Hydrations-Schritt bei der Vorbereitung der Probe erforderlich ist. Die Proben wurden im nassen Zustand betrachtet und die Ergebnisse sind in den 11 bis 21 dargestellt.
  • Die 11-14 zeigen das Ausmaß der Ausbreitung von menschlichen Osteoblast-Zellen an verschiedenen Substraten 30 Minuten nach dem Aussähen der Zellen. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass sich die Zellen in 30 Minuten an der mit Fibronectin/tTG beschich teten PCL-Oberfläche angeheftet und ausgebreitet haben. Einige der Zellen befinden sich bereits in späten Stadien der Zellausbreitung. Die Rate, mit der sich diese Zellen ausbreiteten, war größer als bei Zellen, die in einem Serum enthaltenden Medium auf TCP oder an der mit Fibronectin beschichteten PCL-Oberfläche ausgesät worden waren. Man sieht deutlich, dass die Zellen, die nur am PCL allein angesetzt worden waren, eine abgerundete Morphologie besitzen und keinerlei Anzeichen einer Ausbreitung zu diesem speziellen Zeitpunkt zeigen.
  • Nach 1 Stunde Inkubation an den verschiedenen Oberflächen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt (siehe 15-18). Die Zellen breiteten sich an PCL, das mit Fibronectin + tTG beschichtet worden war, schneller aus als an PCL, das mit Fibronectin beschichtet worden war oder TCP. Die Zellen an den mit Fibronectin + tTG beschichteten PCL zeigten eine stärker abgeflachte Morphologie als man sie nach 30 Minuten sehen konnte. Die Zellen am PCL blieben zu diesem Zeitpunkt immer noch abgerundet.
  • Die 19-21 zeigen das Ausmaß der Ausbreitung 3 Stunden nach dem Aussähen der HOB-Zellen in einem serumfreien Medium. Die Zellen blieben deutlich bei ihrer abgerundeten Morphologie an dem PCL. Eine große Anzahl von Zellen hatte sich von der Biomaterial-Oberfläche abgelöst, was zeigt, das HOB-Zellen Adhäsions-Proteine benötigen, um sich auf PCL auszubreiten. Nach 3 Stunden an dem PCL + Fibronectin- und PCL + Fibronectin + tTG-Oberflächen hatten die Zellen eine flache Morphologie und hatten eine Mono-Schicht gebildet.
  • Die 22 und 23 zeigen graphische Daten, um die Effekte zusammenzufassen, die tTG hinsichtlich der HOB-Zellen-Ausbreitung nach 30 und 60 Minuten besitzt (beobachtet unter Verwendung von E.S.E.M.). Das Ausmaß der Zellausbreitung wurde als Typ I-III bewertet. Als Typ I wurden Zellen eingestuft, die sich an die Oberfläche angeheftet hatten, aber eine runde Morphologie beibehielten. Typ II-Zellen sind solche Zellen, die sich an die Oberfläche angeheftet haben und mit der Ausbreitung begonnen haben. Typ III-Zellen sind solche Zellen, die sich an die Oberfläche angeheftet und flach ausgebreitet haben (späte Stufe der Ausbreitung).
  • Aus den 16-23 kann daher geschlossen werden, dass HOB-Zellen augenblicklich auf das tTG an der PCL-Oberfläche reagieren, was danach eine frühere Zellausbreitung veranlasst. Diese Oberfläche ist gegenüber dem reinen PCL oder PCL, das mit Fibronectin beschichtet ist, bei weitem vorzuziehen.
  • Differentiation von menschlichen Osteoblast-Zellen an PCL, das mit Gewebe-Transglutaminase/Fibronectin beschichtet ist
  • Zunächst wurde der minimale Serumsgehalt des Mediums untersucht, der für die HOB-Zellen erforderlich ist, um sich auf TCP zu vermehren. Die Absicht war, eine minimale Störung des tTG durch Serumproteine zuzulassen, wenn seine Rolle bei der Differentiation von HOB-Zellen bei einer Beschichtung auf PCL untersucht wurde. 24 zeigt deutlich, dass sich HOB-Zellen in serumfreiem Medium auf TCP nicht vermehren können. Sie können sich aber bereits mit einer so geringen Menge wie 2% Serum im Medium vermehren. Die Vermehrungsrate ist jedoch signifikant niedriger als die von Zellen in dem Medium, das einen Serumsgehalt von 4% oder mehr aufweist.
  • Als die Vermehrung von HOB-Zellen auf PCL in Medium mit variierenden Serumsmengen untersucht wurde, zeigte sich, dass ein wesentlich höherer Serumsgehalt erforderlich war (siehe 25). Es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der DNA-Konzentration zwischen Tag 1 und Tag 3, wenn die Zellkultur in einem Medium angesetzt wurde, das 7% Serum enthielt. Die DNA-Konzentration war jedoch zwischen Tag 1 und Tag 3 für Zellen signifikant höher, die in einem Medium kultiviert worden waren, das 10% Serum enthielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass der minimale Serumsgehalt in DMEM, der für eine HOB-Zellen-Vermehrung auf PCL erforderlich ist, 10% beträgt. Am Tag 3 war die Anzahl von Zellen an der Gewebekultur-Plastik signifikant größer als die Anzahl von Zellen an PCL, wenn beide in einem 10% Serum enthaltenden Medium kultiviert wurden.
  • Diskussion
  • Das Studium von Implantat-Oberflächen- und Biomaterial-Gewebe-Grenzflächenreaktionen ist wichtig für die fortgesetzte Verbesserung des Verhaltens von Implantaten. Eine Übersicht von Blitterwijk et al. (1991) erläutert die Wichtigkeit der Reaktionen von Zellen an Implantat-Oberflächen bei der Ermittlung der Biokompatibilität des Implantats. Zurzeit durchgeführte Forschungen umfassen die Herstellung von bioaktiven Materialien, welche die Integration des Materials im Körper ermöglichen. Viele Forscher haben das Konzept eingeführt, synthetische Polymere mit natürlichen Polymeren zu kombinieren, um die Biokompatibilität zu erhöhen.
  • Bei der vorliegenden Studie wurde Poly(ε-Caprolacton) (PCL) gewählt und das natürliche Polymer Fibronectin wurde auf einer Oberfläche immobilisiert. Bei einem weiteren Versuch, die Zellen-Biomaterial-Grenzfläche zu stabilisieren und ihre Kompatibilität zu verbessern, wurde auch das Enzym Gewebe-Transglutaminase (tTG) an der mit Fibronectin beschichteten PCL-Oberfläche immobilisiert. Dieses Enzym katalysiert die posttranslationale Modifikation von Proteinen durch die Ausbildung von inter- und intea-molekularen ε(γ-Glutamyl)-Lysin-Vernetzungen in inter- und intrazellulären Proteinen. Die Bindungen, die sich bilden, sind stabil, kovalent und gegen eine chemische, enzymatische und physikalische Zerstörung resistent. Es wird angenommen, dass die Vernetzung von extrazellulären Proteinen die zellulären Reaktionen wie z.B. das Anhaften der Zellen, das Ausbreiten und die Differentiation an der Biomaterial-Grenzfläche erhöht. Das tTG kann jedoch auch ohne eine Protein-Vernetzung über seine Wechselwirkung mit den B1- und B3-Integrinen als rezeptoradhäsives Protein wirken, (siehe Gaudry et al., 1999, Exp. Cell. Res. 252, 104-113; Akimov et al., 2000, J. Cell. Biol. 140, 852-858).
  • Jurgensen et al. (1997) zeigten, dass tTG ein neuer biologischer „Klebstoff" für Knorpel-Knorpel-Grenzflächen sein könnte. Gewebe-TG hatte eine um 62% größere Haftfestigkeit als Tissucol, eine kommerziell zur Verfügung stehende Fibrin-Kleber-Zubereitung. Jones et al. (1997) zeigten dass menschliche Endothelial-Zellen, die mit einem Anti-Sens-tTG transfiziert worden waren, eine Abnahme bei der Zell-Anhaftung und Ausbrei tung zeigten. Die Theorie, dass tTG bei der Zell-Anhaftung eine Rolle spielt, wird auch durch die Ergebnisse von Gentile et al. (1992) gestützt, die Balb-c 3T3-Fibroblasten verwendeten, durch Borge et al. (1996), die Chondrocyten verwendeten und durch Verderio et al. (1998), die Swiss 3T3-Fibroblasten verwendeten.
  • Bei der vorliegenden Studie wurden drei verschiedene Verfahren verwendet, um zu versuchen, Fibronectin und tTG zu immobilisieren. Alle Verfahren basierten auf der Theorie, dass sich tTG an das immobilisierte Fibronectin an dem PCL binden würde, weil Fibronectin eine tTG-Binde-Stelle besitzt (Jeong et al. 1995). Es wurde gezeigt, dass diese Bindung mit den ersten sieben Residuen an der N-Terminal-Domäne von tTG verknüpft ist. Die Reduktion und Alkylierung von Fibronectin zerstört jedoch seine Fähigkeit, sich mit dem tTG zu verbinden, was darauf hinweist, dass einige Merkmale seiner tertiären Struktur für die Bindung des Enzyms nötig sind.
  • Das tTG wurde auf der mit Fibronectin beschichteten PCL-Oberfläche entweder in 0,1 M oder 5 mM EDTA immobilisiert, um zu verhindern, dass eine tTG-Vernetzung auftrat, bevor das Biotin-Cadaverin-Experiment durchgeführt wurde. Die Hoffnung war, dass dies die Bindungseigenschaften des Enzyms nicht beeinflussen würde. Jeong et al. (1995) zeigten, dass eine Bindung in Abwesenheit von Ca2+ auftritt und dass die Änderung in der Konformation des Enzyms für die Formation des Fibronectin-tTG-Komplexes nicht wesentlich ist.
  • Die drei Verfahren der Immobilisierung von tTG an PCL waren a) Zugabe von Fibronectin und tTG in Lösung über Nacht bei 4°C, b) Immobilisierung von Fibronectin auf der Oberfläche durch Verdampfung und dann Immobilisierung von tTG auf der Oberfläche durch Verdampfung, c) Immobilisierung von Fibronectin auf der Oberfläche durch Verdampfung und dann Zugabe von tTG und Stehen lassen für 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
  • Die ELISA-Verfahren zeigten die Anwesenheit von Fibronectin auf PCL, wenn es durch Verdampfung immobilisiert worden war, und zeigten auch die Anwesenheit von tTG auf mit Fibronectin beschichteten PCL, wenn eine Immobilisierung entweder durch Verdampfung über Nacht oder durch Inkubation für 1 Stunde bei Zimmertemperatur erfolgte.
  • Die Aktivität von tTG an der PCL-Oberfläche wurde unter Verwendung des Biotin-Cadaverin-Inkorporations- Untersuchungsverfahrens ermitelt. Es wurde gefunden, dass tTG an der Oberfläche von PCL nicht aktiv war, wenn es in Lösung zusammen mit Fibronectin immobilisiert worden war. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass Fibronectin für eine tTG-Vernetzung aufgrund seiner unvorteilhaften Konfiguration nicht zugänglich ist oder, alternativ, dass sich das Fibronectin an das PCL bei 4°C nicht gebunden hat. Es wurde auch gefunden, dass tTG auf der mit Fibronectin beschichteten PCL-Oberfläche nicht aktiv war, wenn das tTG durch das Verdampfungs-Verfahren immobilisiert worden war. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass das Verdampfungs-Verfahren das tTG inaktiv macht, da gezeigt wurde, dass unter diesen Umständen tTG an der PCL-Oberfläche vorhanden ist (wie durch das ELISA-Verfahren gezeigt). Wenn das tTG durch Inkubation über 1 Stunde bei Zimmertemperatur immobilisiert wurde, zeigte sich jedoch, dass es an der Oberfläche aktiv ist.
  • Gewebe-Transglutaminase wird durch Kalzium und Nukleotide gesteuert (Smethurst und Griffin, 1996). Sie fanden, dass tTG bei 100 μM Kalzium und dann, wenn ATP oder GTP nicht vorhanden oder nur in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden waren, aktiv war. Im Cytoplasma einer ruhenden, energiereichen Zelle können die ATP-Pegel bis zu 8 bis 11 mM und die GTP-Pegel zwischen 50 und 300 μM hoch sein, wobei ein Anteil hiervon jeweils an cytosolische Proteine gebunden ist, was zu niedrigeren freien Nukleotid-Konzentrationen führt. Im Ruhezustand beträgt das freie Kalzium ungefähr 100 bis 200 nM. Unter diesen Bedingungen legen ihre Daten nahe, dass tTG-Aktivität im Cytosol abgeschaltet würde. In DMEM (dem Medium, in welchem menschliche Osteoblast-Zellen kultiviert werden) oder in der in vivo Situation sind jedoch mehr als 100 μM Kalzium vorhanden, was ausreicht, um das tTG an der Biomaterial-Oberfläche zu aktivieren.
  • Wenn die menschlichen Osteoblast-Zellen an der mit Fibronectin/tTG beschichteten Oberfläche von PCL ausgesät wurden, hatte das tTG einen tief greifenden Effekt auf die Zell-Morphologie (wie unter Verwendung von E.S.E.M. gezeigt werden konnte). Die Ergebnisse haben deutlich gezeigt, dass die Zell-Ausbreitung in einem serumfreien Medium 30 Minuten nach dem Aussähen der Zellen im Gegensatz zu den Zellen an der PCL-Oberfläche erfolgte, die abgerundet blieben, und anders als bei den Zellen an der PCL + Fibronectin-Oberfläche, die gerade erst angefangen hatten, sich auszubreiten. Die Zellen an der mit Fibronectin/tTG beschichteten Oberfläche breiteten sich schneller aus als Zellen, die an Gewebekultur-Plastik in einem 10% Serum enthaltenden Medium ausgesät wurden (positive Kontrolle).
  • Nach 1 Stunde Inkubation an den verschiedenen Oberflächen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt, und 3 Stunden nach dem Aussähen der Zellen hatten die menschlichen Osteoblast-Zellen eine Mono-Schicht auf PCL + Fibronectin, PCL + Fibronectin + tTG und auf der Gewebekultur-Plastik gebildet. Die Zellen an PCL hatten jedoch immer noch eine abgerundete Morphologie und nur einige wenige Zellen waren vorhanden, was darauf hinwies, dass sich während der Stunde wahrscheinlich einige Zellen abgelöst hatten.
  • Es kann daher aus den E.S.E.M.-Ergebnissen geschlossen werden, dass menschliche Osteoblast-Zellen augenblicklich auf das tTG an der PCL-Oberfläche ansprechen, was in der Folge eine frühere Zell-Ausbreitung verursacht. Diese Oberfläche ist weit mehr zu bevorzugen als PCL allein, als PCL, das nur mit Fibronectin beschichtet ist und als Gewebekultur-Plastik.
  • Die Zellen heften sich anfänglich an das Biomaterial durch physikalisch-chemische Faktoren an, d.h. aufgrund der Ladung, der freien Oberflächeenergie oder des Wassergehaltes des Biomaterials (Schamberger und Gardella, 1994), und haften dann stark an ECM-Proteinen, die an der Biomaterial-Oberfläche abgeschieden worden sind. Es wird angenommen, dass sich die Zellen anfänglich an die mit Fibronectin beschichtete PCL-Oberfläche anheften. Augenscheinlich vernetzt das tTG das Fibronectin mit anderen an die Zell-Oberfläche gebundenen Proteinen, wodurch eine stabilisierte extrazelluläre Matrix auf der Biomaterial-Oberfläche gebildet wird. Die Vernetzung der oberflächengebundenen Proteine kann auch die Aktivierung von Integrinen auslösen. Die Zelle kann auch das tTG als ein Adhäsions-Protein in Verbindung mit dem β1-Integrin verwenden, um sich an die Biomaterial-Oberfläche anzuheften. Gaudry et al. (1999) haben gezeigt, dass tTG sich an gleichen Stellen anordnet wie das β1-Integrin und Akimov et al., 2000, J. Cell. Biol. 148, 825-8 haben vorgeschlagen, dass tTG die Wechselwirkung zwischen den B1- und B3-Integrinen und Fibronectin vermitteln könnte.
  • Die Differentiation von menschlichen Osteoblast-Zellen auf der mit tTG beschichteten PCL-Oberfläche wurde untersucht. Es war erforderlich, zunächst die niedrigste Menge von Serum herauszufinden, die in DMEM erforderlich ist, um eine Osteoblast-Vermehrung zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass sich Zellen bereits in 2% Serum enthaltendem Medium auf Gewebekultur-Plastik vermehren können, dass sie jedoch einen Serumsgehalt von mindestens 10% im Medium benötigen, wenn sie auf PCL kultiviert werden. Die Vermehrungsrate ist also auf PCL niedriger als auch Gewebekultur-Plastik.
  • Die Differentiation der Zellen auf dem TCP, PCL, PCL + FN und PCL + FN + tTG-Oberflächen wurde 2 Tage nach dem Aussähen der Zellen unter Verwendung des Alkalin-Phosphatase-Aktivitäts-Untersuchungsverfahrens gemessen und in μg DNA ausgedrückt. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass tTG keinerlei nachteiligen Einfluss auf die Alkalin-Phosphatase-Aktivität/Differentiation von HOB-Zellen auf PCL im Vergleich zu PCL hat, das mit Fibronectin beschichtet ist. Dies muss jedoch zu späteren Zeitpunkten noch genauer untersucht werden. Kaartinen et al. (1999) glauben jedoch, dass die Vernetzung von Osteopontin (ein hauptsächliches nichtkollagenes Knochen-Protein) durch tTG seine Kollagen-Bindungs-Eigenschaften erhöht. Dies lässt uns glauben, dass tTG ein Promotor der Zell-Differentiation sein könnte, weil es nicht nur extrazelluläre Proteine vernetzt sondern auch bei der ECM-Molekül-Beschaffung hilft.
  • Poly(ε-Caprolacton), das mit Fibronectin und Gewebe-Transglutaminase beschichtet ist, ist ein bioaktives Biomaterial, das die Zell-Anhaftung und die Ausbreitung von Zellen verstärkt und die extrazelluläre Matrix an der Biomaterial-Oberfläche stabilisiert und die Grenzfläche zwischen menschlichen Osteoblasten und Biomaterial stabil macht. Dieses Biomaterial hat gute Anwendungsmöglichkeiten bei der Knochentransplantation, bei der die Zellen das Biomaterial schnell kolonisieren müssen, um neuen Knochen zu erzeugen. Das PCL könnte auch verstärkt werden, um ihm die mechanische Festigkeit zu geben, die für Hüft- und Knieprothesen erforderlich ist.
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Claims (68)

  1. Medizinisches Implantationsmaterial, das eine Transglutaminase von einem Säugetier oder Menschen und ein Polymer umfasst, bei dem die Transglutaminase in Abwesenheit von freien divalenten Metall-Ionen vorgesehen ist und bei dem das Polymer einem Bindungsprotein zum Binden der Transglutaminase zugeordnet ist.
  2. Material nach Anspruch 1, bei dem die Transglutaminase eine Gewebe-Transglutaminase ist.
  3. Material nach Anspruch 1, bei dem die Transglutaminase eine Plasma-Transglutaminase ist.
  4. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Transglutaminase aus Gewebe oder Zellen von Säugetieren oder Menschen zubereitet ist.
  5. Material nach Anspruch 4, bei dem die Transglutaminase aus menschlichem Gewebe oder menschlichen Zellen zubereitet ist.
  6. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Transglutaminase eine rekombinante Transglutaminase ist.
  7. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Transglutaminase eine variante Transglutaminase ist.
  8. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Polymer ein natürlicherweise auftretendes Polymer ist.
  9. Material nach Anspruch 8, bei dem das natürlicherweise auftretende Polymer ein natürlicherweise auftretendes extra-zelluläres Matrix-Molekül, vorzugsweise Collagen, Fibronectin, Fibrin, Fibrillin, ein Glukosoaminoglykan oder Hyaluronsäure ist.
  10. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Polymer ein synthetisches Polymer ist.
  11. Material nach Anspruch 10, bei dem das synthetische Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, die Poly-Caprolacton (PCL), Poly-L-Lactid (PLA), Poly-Glykolid (PGA), Poly-DL-Lactid-Coglykolid) (PLG), Methacrylat-Poly-Ethylmethacrylat, Ethylacrylat, Tetrahydrofurfurylmethacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Silicongummi, Poly-Tetrafluorethylen, Medpor (poröses Polyethylen), Poly-Orthoester, Poly-Dioxan und Co-Polymere und Mischungen hiervon umfasst.
  12. Material nach Anspruch 10 oder 11, bei dem das Polymer Poly-ε-Caprolacton ist.
  13. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das medizinische Implantationsmaterial ein Polymer umfasst, das mit einem Transglutaminase-Binde-Protein beschichtet, imprägniert, kovalent gebunden oder diesem auf andere Weise beigemischt ist.
  14. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem das Polymer mit dem Transglutaminase-Binde-Protein beschichtet ist.
  15. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem das Polymer mit dem Transglutaminase-Binde-Protein imprägniert ist.
  16. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem das Polymer kovalent an das Transglutaminase-Binde-Protein gebunden ist.
  17. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem das Transglutaminase-Binde-Protein ein Transglutaminase-Substrat ist.
  18. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem das Transglutaminase-Binde-Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die Fibronectin, Fibrin, Fibrinogen, Collagen, Entactin, Osteonectin, Osteopontin, Thrombospondin, Vitronectin, β-Lactoglobulin und Kasein umfasst.
  19. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem das Transglutaminase-Binde-Protein Fibronectin oder ein Fragment hiervon ist, das in der Lage ist, sich an eine Transglutaminase zu binden.
  20. Material nach Anspruch 19, bei dem das Fibronectin-Fragment Aminosäuren 32-608 des N-Terminus von Fibronectin oder ein Fragment hiervon umfasst.
  21. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem das Transglutaminase-Binde-Protein Fibrin oder ein Fragment hiervon ist, das in der Lage ist, sich an eine Transglutaminase zu binden.
  22. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das medizinische Implantationsmaterial weiterhin ein Verstärkungsmittel umfasst.
  23. Material nach Anspruch 22, bei dem das Verstärkungsmittel aus einer Gruppe ausgewählt ist, die Aluminium, Aluminiumoxid-Boroxid-Siliziumoxid, Kalzium-Methaphosphat-Glasfasern, Titan und Kohlenstoff umfasst.
  24. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das medizinische Implantationsmaterial weiterhin wenigstens ein zusätzliches Polymer umfasst.
  25. Material nach Anspruch 24, bei dem das wenigstens eine zusätzliche Polymer ein synthetisches Polymer ist.
  26. Material nach Anspruch 24, bei dem das wenigstens eine zusätzliche Polymer ein natürliches Polymer ist.
  27. Material nach Anspruch 24 oder 26, bei dem das wenigstens eine zusätzliche Polymer ein natürlicherweise auftretendes extra-zelluläres Matrix-Molekül, wie z.B. Collagen, Fibronectin, Fibrillin, Fibrin, ein Glukosoaminoglykan oder Hyaluronsäure ist.
  28. Material nach den Ansprüchen 1 bis 27, bei dem das Polymer mit der Transglutaminase beschichtet ist.
  29. Material nach den Ansprüchen 1 bis 27, bei dem das Polymer mit der Transglutaminase imprägniert ist.
  30. Material nach den Ansprüchen 1 bis 29, bei dem die Transglutaminase kovalent mit dem Polymer entweder direkt oder indirekt über das Bindeprotein verknüpft ist.
  31. Material nach den Ansprüchen 1 bis 30, bei dem die Transglutaminase mit einem Chelatbildner versehen ist.
  32. Material nach Anspruch 31, bei dem der Chelatbildner EDTA oder EGTA ist.
  33. Material nach Anspruch 31 oder 32, bei dem der Chelatbildner in einer Konzentration zwischen 5 mM und 0,1 M vorgesehen ist.
  34. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das medizinische Implantationsmaterial künstlicher Knochen ist.
  35. Verfahren zur Verbesserung der Biokompatibilität eines medizinischen Implantationsmaterials, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (i) Bereitstellen eines medizinischen Implantationsmaterials, das ein einem Binde-Protein zur Bindung der Transglutaminase zugeordnetes Polymer umfasst und (ii) Behandeln dieses Materials mit einer von einem Säugetier oder einem Menschen stammenden Transglutaminase, wobei die Transglutaminase in der Abwesenheit von freien divalenten Metall-Ionen vorgesehen ist.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, bei dem die Transglutaminase eine Gewebe-Transglutaminase ist.
  37. Verfahren nach Anspruch 35, bei dem die Transglutaminase eine Plasma-Transglutaminase ist.
  38. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 37, bei dem die Transglutaminase aus Gewebe oder Zellen von Säugetieren oder Menschen zubereitet ist.
  39. Verfahren nach einem der Ansprüche 38, bei dem die Transglutaminase aus menschlichem Gewebe oder menschlichen Zellen zubereitet ist.
  40. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 39, bei dem die Transglutaminase eine rekombinante Transglutaminase ist.
  41. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 40, bei dem die Transglutaminase eine variante Transglutaminase ist.
  42. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 41, bei dem das Polymer ein natürlicherweise auftretendes Polymer ist.
  43. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem das natürlicherweise auftretende Polymer ein natürlicherweise auftretendes extra-zelluläres Matrix-Molekül, vorzugsweise Collagen, Fibronectin, Fibrin, Fibrillin, ein Glukosoaminoglykan oder Hyaluronsäure ist.
  44. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 43, bei dem das Polymer ein synthetisches Polymer ist.
  45. Verfahren nach Anspruch 44, bei dem das synthetische Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, die Poly-Caprolacton (PCL), Poly-L-Lactid (PLA), Poly-Glykolid (PGA), Poly-DL-Lactid-Coglykolid) (PLG), Methacrylat-Poly-Ethylmethacrylat, Ethylacrylat, Tetrahydrofurfurylmethacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Silicongummi, Poly-Tetrafluorethylen, Medpor (poröses Polyethylen), Poly-Orthoester, Poly-Dioxan und Co-Polymere und Mischungen hiervon umfasst.
  46. Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, bei dem das Polymer Poly-ε-Caprolacton ist.
  47. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 46, bei dem das medizinische Implantationsmaterial ein Polymer umfasst, das mit einem Transglutaminase-Binde-Protein beschichtet, imprägniert, kovalent gebunden oder diesem auf andere Weise beigemischt ist.
  48. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 47, bei dem das Polymer mit dem Transglutaminase-Binde-Protein beschichtet ist.
  49. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 48, bei dem das Polymer mit dem Transglutaminase-Binde-Protein imprägniert ist.
  50. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 49, bei dem das Polymer kovalent an das Transglutaminase-Binde-Protein gebunden ist.
  51. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 50, bei dem das Transglutaminase-Binde-Protein ein Transglutaminase-Substrat ist.
  52. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 51, bei dem das Transglutaminase-Binde-Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die Fibronectin, Fibrin, Fibrinogen, Collagen, Entactin, Osteonectin, Osteopontin, Thrombospondin, Vitronectin, β-Lactoglobulin und Kasein umfasst.
  53. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 52, bei dem das Transglutaminase-Binde-Protein Fibronectin oder ein Fragment hiervon ist, das in der Lage ist, sich an eine Transglutaminase zu binden.
  54. Verfahren nach Anspruch 53, bei dem das Fibronectin-Fragment Aminosäuren 32-608 des N-Terminus von Fibronectin oder ein Fragment hiervon umfasst.
  55. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 54, bei dem das Transglutaminase-Binde-Protein Fibrin oder ein Fragment hiervon ist, das in der Lage ist, sich an eine Transglutaminase zu binden.
  56. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 55, bei dem das medizinische Implantationsmaterial weiterhin ein Verstärkungsmittel umfasst.
  57. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem das Verstärkungsmittel aus einer Gruppe ausgewählt ist, die Aluminium, Aluminiumoxid-Boroxid-Siliziumoxid, Kalzium-Methaphosphat-Glasfasern, Titan und Kohlenstoff umfasst.
  58. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 57, bei dem das medizinische Implantationsmaterial weiterhin wenigstens ein zusätzliches Polymer umfasst.
  59. Verfahren nach Anspruch 58, bei dem das wenigstens eine zusätzliche Polymer ein synthetisches Polymer ist.
  60. Verfahren nach Anspruch 58, bei dem das wenigstens eine zusätzliche Polymer ein natürliches Polymer ist.
  61. Verfahren nach Anspruch 59 oder 60, bei dem das wenigstens eine zusätzliche Polymer ein natürlicherweise auftretendes extra-zelluläres Matrix-Molekül, wie z.B. Collagen, Fibronectin, Fibrillin, Fibrin, ein Glukosoaminoglykan oder Hyaluronsäure ist.
  62. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 61, bei dem der Schritt (ii) das Beschichten des medizinischen Implantationsmaterials mit Transglutaminase umfasst.
  63. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 61, bei dem der Schritt (ii) das Imprägnieren des medizinischen Implantationsmaterials mit einer Transglutaminase umfasst.
  64. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 61, bei dem der Schritt (ii) das kovalente Verknüpfen der Transglutaminase mit dem medizinischen Implantationsmaterialumfasst.
  65. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 64, bei dem der Schritt der Behandlung des medizinischen Implantationsmaterials mit einer Transglutaminase in Anwesenheit eines Chelatbildners durchgeführt wird.
  66. Verfahren nach Anspruch 65, bei dem der Chelatbildner EDTA oder EGTA ist.
  67. Verfahren nach Anspruch 65 oder 66, bei dem der Chelatbildner in einer Konzentration zwischen 5 mM und 0,1 M vorhanden ist.
  68. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 67, bei dem das medizinische Implantationsmaterial künstlicher Knochen ist.
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