KR20010012797A - 펩타이드 코팅된 이식물 및 그 제조 공정 - Google Patents

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플레믹 크리스티안
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Abstract

본 발명은 생물질의 생기능화 가능성, 특히 이식물에 관한 것으로, 이는 측정에 의해 만들어지고 합성된, 세포- 또는 조직-선택적이며, 각 경우에 있어서 적절한 생물질의 조직 혼입을 달성하기 위해 생체 외에서 세포 종류의 부착을 주로 자극하는, RGD 펩타이드 코팅에 의한 이식물의 가능성을 기술한다.

Description

펩타이드 코팅된 이식물 및 그 제조 공정{PEPTIDE-COATED IMPLANTS AND PROCESSES FOR THEIR PREPARATION}
본 발명은, 일반적인 생물질 및 이식물의 표면 코팅에 대한 선택된 세포 종류의 표적하는 부착 자극의 원리에 기초하여, 특히 적절한 조직내 외과적인 삽입 이후의, 조직 선택적이며 촉진 및 향상된 이들의 혼입 목적을 위한 것이다.
이러한 방식에 따라, 세포 부착을 매개하는 각종 펩타이드, 특히 이식물이 삽입되는 특정 조직 환경을 고려한 RGD 펩타이드로 이식물의 각종 표면 부분에 코팅되거나 적용될 수 있다.
나아가 이러한 방식에 따라, 조직 공학 관점에서, 기관 재생을 위한 생물 정보를 수반하는 "똑똑한" 생하이브리드 (biohybrid) 기관 생성이 이식물 표면의 상이한 지역 내의 각종 펩타이드에 의한 각종 세포 종류의 특이적 활성화에 따른 자체-조직화 (self-organization)에 의해 가능하게 된다.
본 발명은 인간과 동물 신체용의 일반적 성질의 이식물에 관한 것으로, 이는 이식물의 특수한 환경 내에서 특정 세포의 부착을 선택적으로 매개할 수 있는 펩타이드로 코팅된 것이다. 특히, 본 발명은 RGD 펩타이드로 코팅된 이식물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1: 알파v베타3- 및 알파v베타5-인테그린에 대항하는 형광-접합된 항체와 FACS (fluorescence-activated cell sorter)에 의한 인간 일차 골아세포의 인테그린 조성 분석.
x 축: 형광 강도 (수효)
y 축: 세포 개수
M21 : 알파v베타3- 및 알파v베타5- 양성 대조군
M21L : 알파v베타3- 및 알파v베타5- 음성 대조군
HOB: 인간 일차 골아세포 배양액
ROB: 래트 (rat) 일차 골아세포 배양액
도 2: BSA 를 통한, 각종 RGD 펩타이드로 코팅된 폴리스티렌 테스트 표면에 대한, MC3T3 H1 골아세포의 부착.
x 축: 코팅 용액 내의 RGD 펩타이드 농도 (μM),
y 축: 세포 코팅의 정도 (%),
상단 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-CH2-CH2-S- (설포-SMPB) ("티올펩타이드 1-SMPB 유도체"), SMPB = 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트;
중간 윗 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-S- (설포-SMPB) ("티올펩타이드 2-SMPB 유도체")
중간 아래 곡선: 시클로-RGDvE CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-S- (설포 SMPB) ("티올펩타이드 3-SMPB 유도체")
하단 곡선: 티올펩타이드 대조군: 시클로-RβADfK-NH-CO-CH2-CH2-S- (설포-SMPB).
도 3: 티올펩타이드 1-SMPB 유도체로 코팅된 테스트 표면에 대한 골아세포의 부착 (도 2 이하 참조).
x 축: 코팅 용액 내의 펩타이드 농도 (μM),
y 축: 세포 코팅의 정도 (%),
상단 곡선: MC3T3 H1 마우스 골아세포;
중간 윗 곡선: 인간 일차 골프로제니터 (osteoprogenitor) 세포
중간 곡선: 인간 일차 골아세포
중간 아래 곡선: 알파v베타3- 음성 대조군 세포 M21L
하단 곡선: 래트 일차 골아세포
도 4: 티올펩타이드 1-SMPB 유도체 (코팅 용액 내에 10μM)로 코팅된 테스트 표면에 대한, 골아세포의 부착 (도 2 참조).
x 축: 부착 매질내의, 용해된 시클로-RGDfK (분자 앵커 없음)의 농도 (μM),
y 축: 세포 코팅의 정도 (%),
상단 곡선: MC3T3 H1 마우스 골아세포;
중간 곡선: 인간 일차 골아세포
하단 곡선: 래트 일차 골아세포.
도 5: 티올펩타이드 1-SMPB 유도체 (코팅 용액 내에 10μM)로 코팅된 테스트 표면에 대한, 골아세포의 부착 (도 2 참조).
x 축: 1㎠ 당 접종된 세포 개수
y 축: 1㎠ 당 부착된 세포 개수
상단 곡선: 래트 일차 골아세포
중간 윗 곡선: MC3T3 H1 마우스 골아세포
중간 아래 곡선: 인간 일차 골아세포
하단 곡선: BSA 음성 코팅
도 6: 티올펩타이드 1-SMPB 유도체 (코팅 용액 내에 10μM)로 코팅된 테스트 표면에 대한, 골아세포의 부착 (도 2 이하 참조).
x 축: 1㎠ 당 접종된 세포 개수
y 축: 세포당 계산된, 표면적 조건 (μ㎡)
상단 곡선: 인간 일차 골아세포
중간 곡선: MC3T3 H1 마우스 골아세포
하단 곡선: 래트 일차 골아세포
도 7: 티올펩타이드 1-SMPB 유도체 (코팅 용액 내에 10μM)로 코팅된 테스트 표면에 대한, 골아세포의 부착 (도 2 이하 참조).
x 축: 시간 (분)
y 축: 세포 코팅의 정도 (%)
상단 곡선: MC3T3 H1 마우스 골아세포
중간 곡선: 인간 일차 골아세포
하단 곡선: 래트 일차 골아세포
도 8: 각종 RGD 펩타이드로 코팅된 골 시멘트-PMMA 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포의 부착:
x 축: 코팅 용액 내의 RGD 펩타이드 농도 (μM)
y 축: 세포 코팅의 정도 (%)
상단 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 3),
중간 윗 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iib 타입, 아크릴레이트 펩타이드 2),
중간 아래 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiib 타입, 아크릴레이트 펩타이드 4),
하단 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 1).
도 9: 각종 RGD 펩타이드로 코팅된 다공성 PMMA/PHEMA 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포의 부착:
x 축: 코팅 용액 내의 RGD 펩타이드 농도 (μM)
y 축: 세포 코팅의 정도 (%)
상단 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 3),
중간 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiib 타입, 아크릴레이트 펩타이드 4),
하단 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iib 타입, 아크릴레이트 펩타이드 2).
도 10: 각종 RGD 펩타이드로 코팅된 다공성 PMMA/Plex Y7H 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포의 부착:
x 축: 코팅 용액 내의 RGD 펩타이드 농도 (μM)
y 축: 세포 코팅의 정도 (%)
상단 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 3),
중간 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiib 타입, 아크릴레이트 펩타이드 4),
하단 곡선: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iib 타입, 아크릴레이트 펩타이드 2).
도 11: 다양한 분자 길이의 각종 RGD 펩타이드로 코팅된 골 시멘트-PMMA 또는 폴리스티렌-BSA-SMPB 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포의 최대 부착:
x 축: RGD 펩타이드 분자 길이 (nm)
y 축: 세포 최대 코팅 (%).
도 12: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 3) RGD 펩타이드로 코팅된 V4A 스테인리스 스틸 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포의 최대 부착. 스테인리스 스틸 표면은, 그 부분에 대해 각종 과정에 의해 선코팅된 것이다:
x 축: 코팅 용액 내의 RGD 펩타이드 농도 (μM)
y 축: 세포 코팅의 정도 (%)
상단 곡선: Kevloc코팅;
중간 곡선: Silicoater코팅;
하단 곡선: 색소 코팅.
도 13: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 3) RGD 펩타이드로 코팅된 골 시멘트-PMMA 표면상의 MC3T3 H1 골아세포의 증식.
x 축: 배양 기간 (일)
y 축: 세포 개수;
상단 곡선: 코팅 용액 내의 100μM 펩타이드;
중간 윗 곡선: 코팅 용액 내의 1μM 펩타이드;
중간 아래 곡선: 코팅 용액 내의 0.1μM 펩타이드;
하단 곡선: 비코팅된 대조군.
도 14: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 3) RGD 펩타이드로 코팅된 골 시멘트-PMMA 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포 및 혈소판의 부착.
x 축: 골아세포 단독 및 혈소판 단독을, 코팅 용액 내의 100μM, 10μM 및 1μM 각종 펩타이드 농도를 가지는 표면에 접종한다.
y 축: 세포 개수 (405nm 에서의 흡광도).
도 15: 시클로-RGDfKG NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 5) RGD 펩타이드로 코팅된 골 시멘트-PMMA 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포 및 혈소판의 부착.
x 축: 골아세포 단독 및 혈소판 단독을 ,코팅 용액 내의 100μM, 10μM 및 1μM 각종 펩타이드 농도를 가지는 표면에 접종한다.
y 축: 세포 개수 (405nm 에서의 흡광도).
도 16: 시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 3) RGD 펩타이드로 코팅된 골 시멘트-PMMA 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포, 혈소판 및 골아세포/혈소판 혼합물의 부착.
x 축: 골아세포 단독, 혈소판 단독, 및 골아세포/혈소판 혼합물을 코팅 용액 내의 100μM 펩타이드 농도를 가지는 표면에 접종한다.
y 축: 세포 개수 (405nm 에서의 흡광도).
도 17: 시클로-RGDfKG NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iiia 타입, 아크릴레이트 펩타이드 5) RGD 펩타이드로 코팅된 골 시멘트-PMMA 표면에 대한 MC3T3 H1 골아세포, 혈소판 및 골아세포/혈소판 혼합물의 부착.
x 축: 골아세포 단독, 혈소판 단독, 및 골아세포/혈소판 혼합물을 코팅 용액 내의 100μM 펩타이드 농도를 가지는 표면에 접종한다.
y 축: 세포 개수 (405nm 에서의 흡광도).
하기의 실시예는 제한 없이, 본 발명을 추가로 예시한다.
하기의 "본 발명에 따른 펩타이드"라는 표현은, 달리 또는 추가로 표현되지 않는 한, 세포 부착을 매개할 수 있는 모든 펩타이드를 포함한다. 이들 중, 아미노산 아르기닌 (R), 글라이신 (G), 및 아스파르트산 (D)이 연결된 펩타이드 (RGD 펩타이드)가 특히 선호된다. 적절한 RGD 펩타이드와 RGD를 함유하지 않는 적절한 펩타이드의 예는 이하에서 언급된다. 나아가, RGD 서열을 함유하지 않으면서도, 세포 부착에 영향을 미치는 해당 펩타이드가 포함되었다. 넓은 의미로, 본 발명은 상기 펩타이드 화합물과 정성적으로 동일한 생활성을 가지는 비-펩타이드 화합물을 또한 포함한다.
본 발명에 따른 생물질 및 이식물은, 기능적으로 손상된 해당 천연 조직의 기능을 복구하기 위해, 인간 또는 동물 신체에 도입될 수 있는 물질로 지정된다. 이는, 예로써, 골반 내부인공삽입물, 인공 무릎 관절, 턱 이식물, 인대 대치물, 피부 대치물, 혈관 인공삽입물, 심장 박동조절기, 인공 심장 밸브, 유방 이식물, 스텐트 (stents), 카테터 (catheters), 및 션트 (shunts)를 포함한다.
신체 내에서, 이식물의 혼입 양태가 아직도 문제가 되고 있다. 물질의 조직 혼입은 종종 너무 느리고 기능성에 필요한 조직/생물질 결합의 기계적 안정성을 제공을 위하여서는 매우 불완전하다. 주변의 건강한 조직 또는 세포에 의한 활성 흡착을 방해하는 불충분한 계면 상용성 또는 생상용성을 가지는 이식물 표면의 조성은, 종종 이에 대한 직접적인 책임을 가진다. 이는 안정한 조직-이식물 경계층의 형성을 어렵게 하여, 따라서 완화, 조직 흡수, 감염, 염증, 알레르기, 마이크로트롬비형성 (restenosis)를 낳게되는 불충분한 조직 융화를 낳게된다. 그 결과, 이식물 대치를 위한 보완작업 (예로써, 골반 내부인공삽입물, 턱 이식물, 카테터 및 외부 고정물) 및 새로운 외과 작업이 필요하게된다 (Malchau and Herberts, 1996, Prognosis of Total Hip Arthoplasty, 63. Annual Meeting of the American Academy of Orthopeadic Surgeons, Atlanta; Haddad 등, 1996, The Journal of Bone and Joint Surgery, 78-B: 546-549; Collinge 등, 1996, Pin Tract Infections).
또한, 골반 내부인공삽입물의 경우에서, 골세포 및 골 조직이, 목적한바 대로의 생물질에 대한 직접적 연결을 형성하지 않고, 섬유아세포 및 연결 조직이 방해 요소로 발생하는 이른바 방부성 이식물 완화가 문제시 되고 있다. 그 결과, 인공삽입물은 골 조직 대신 연결 조직으로 연결되어, 결과적인 인공삽입물-연결조직 결합의 안정성이 인공 골반 관절의 힘 전달을 위한 기계적 요건을 만족하지 못하게된다. 그 결과, 이는 이식물의 완화 (Pilliar 등, 1986, Clin. Orthop., 208: 108-113)와 이에 따른 보완을 필요로하게된다. 이식물에 부착되는 바람직하지 않는 세포 타입의 다른 예로는, 마이크로트롬비를 형성하여 이식물 혼입의 지장을 초래하는 혈소판이 있다 (Phillips 등, 1991. Cell 65, 359).
신체 내로의 생물질 또는 이식물의 혼입 결핍은, 전체적인 기관 이식의 경우에 있어 특히 심각한 효과를 가지는데, 이는 상이한 세포 타입이 이식물과 접촉하게되고, 필요한 혼입도가 표적화 되어야하기 때문이다. 다른 환자의 도움을 수반한 극히 복잡한 이식 과정을 피하기 위해, 일례로, 살아있는 세포로 덮여진 전달 물질로 구성되어 기능 단위로 이식될 수 있는 이른바 생하이브리드 기관을 이용한 간, 췌장, 신장 및 비장의 기능 장애 치료를 위한 시도가 조직 공학 분야에서 이루어져왔다. 대부분의 경우에서, 이러한 목적을 위해, 기능성의 건강 세포가 생체외로 흡수성 또는 비흡수성 막에 포함되거나 캡슐화되어 인공 생하이브리드 기관 또는 빈 기관으로써 환자에게 이식된다 (일례로: Lim 등, 1980, Science 210, 908-912; Altman 등, 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12, 43-45; Zekorn 등, 1989, Transplantation Proceedings 21, 2748-2750; Altman 등, 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12, 43-45; EP 0 504 781 B1). 그러나, 여기에서도 이식물에 대한 영양공급 결핍과 수반된 섬유성 결체화 (結締化), 캡슐에서 방출된 세포로 인한 면역 대항 반응 및 물질 표면의 혈전형성에 의한 빈발하는 혈액 응고 형성의 문제가 기술되어있다.
세포 부착을 매개하는 펩타이드로 코팅함으로써 생물질/이식물의 조직 혼입을 자극할 수 있음이 알려져왔다. 이러한 목적을 위해, 한편으로는, 아르기닌-글라이신-아스파르트산 (RGD)의 트리펩타이드 아미노산 서열을 함유하는 펩타이드, 또는 이들의 비펩타이드성 유도체, 또 다른 한편으로는, 세포 부착 매개, 비-RGD-함유 펩타이드 (아래에 예시), 또는 이들의 비펩타이드성 유도체로서, 알려진 바와 같은 많은 단백질의 구성요소이며 특히 세포 외부 매트릭스의 성분 (예, 콜라겐 타입 I, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 엔택틴, 오스테오폰틴, 트롬보스폰딘), 또는 혈액 응고 단계 (피브리노겐, von Willebrand factor)의 구성 요소가 진핵세포 부착을 위한 중심 인지 패턴으로 작용한다 (예; Pierschbacher와 Ruoslahti, 1984, Nature, 309: 30-33; Yamada, 1991. J. Biol. Chem., 266:12809-12812). 본 발명에 따라 정의된 서열은 세포 표면의 각 리셉터, 인테그린에 의해 인지되고 결합된다. 세포의 해당 단백질에 대한 결합이 많은 수의 상이한 인테그린에 의해 매개되므로, 세포 종류의 인테그린 발현 패턴은, 이들 단백질에 대한 세포의 부착성에 있어서 매우 중요하다. 측정하여 제작한 디자인과, 특정 인테그린에 대해 선택적이면서도 특이적으로 결합할 수 있는 적절한 서열을 결합시킨 대부분 단-사슬인 펩타이드의 합성은, 이러한 인테그린을 발현하는 세포 종류만의 표적화된 활성화를 가능하게 한다. 따라서, 일례로, 알파v-인테그린 리셉터에 선택적으로 결합하여, 불필요한 세포 종류, 예로써 αIIbβ3-함유 혈소판을 동시에 자극하지 않으면서, 알파v베타3-/알파v베타5-함유 세포 [골아세포(骨芽細胞; (osteoblast), 파골세포 (破骨細胞; osteoclast), 내피 세포]의 결합 (부착)을 선택적으로 자극하는 RGD 펩타이드가 알려져 있다 (Haubner 등, 1996, 7, Am. Chem. Soc., 118: 7461). 반면에, 다른 RGD 펩타이드는 반대의 효과를 보이면서, αIIbβ3-인테그린 리셉터에 선택적으로 결합하여, 예로써 혈소판에 대한 선택성을 나타낸다 (Phillips 등, 1991, Cell 65, 359).
이식물 표면을, 본 발명에 정의된 합성 가능한 펩타이드로 처리하는 것은 공지이다. 이 경우에, 펩타이드는 흡착 또는 다른 공유 결합에 의해 강하게 또는 약한 정도로 표면에 결합된다. DE 1 97 06 667 에는, 일례로, 흡착에 의해 RGD 아미노산 서열의 펩타이드로 표면이 덮여진 다공성 중합체 물질에 기초한, 골 대체 물질에 관련된 생물질이 기재되어있다. WO 91-05036 에는, 특히 RGD 서열을 가지는 펩타이드가 표면에 공유 결합된 금속 삽입보정물, 특히 티타늄 또는 티타늄 합금을 또한 기술하고 있다. Valentini 등은 (1997. 5. Transactions of the 23rd Annual Meeting of the Society for Biomaterials, New Orleans, USA) 불소화 에틸렌프로필렌 중간층을 가지는 티타늄 스크루에 RGD 펩타이드를 공유 결합시키는 것을 개시하고 있다. 상기 모임에서 Rezania 등은, 아미노 관능성 유기 실란과의 공유 결합에 의해 코팅된 실리콘 다이옥사이드 또는 티타늄 다이옥사이드 표면을 개시하면서, 헤테로이관능성 가교제에 의한 티올-함유 RGD 펩타이드의 공유적 결합을 도모하고 있다.
그러나 이러한 기술적 해결책은, 본 발명에서 정의된 펩타이드에 의해 특정하게 표면이 코팅되고 관심상의 이식물 주변 조직의 특정 세포 타입에 대해 선택적으로 제조되는 이식물 또는 생물질을 가능하게 하는 요건을 개시하고 있지 않다.
따라서, 또한 신체 내로 이식물의 삽입 이후, 예로써 골반 내부인공삽입의 골세포 또는 피부의 상피세포, 모발 또는 치아의 대체물과 기능적으로 활성으로 작용하는 조직 또는 세포 종류를, 이들의 조직 혼입을 위해 배타적으로 또는 바람직하게 배열시키고, 동시에 이러한 과정을 방해하는 세포 종류, 예로써, 마이크로트롬비 또는 연결 조직 캡슐의 형성을 촉진하는 혈소판 또는 섬유아세포가 이식물과 선택적으로 작용할 수 없도록 생물질을 변형시키는 것이 바람직하다.
상보적인 해당 인테그린을 함유하는 선택된 세포 타입의 부착을 배타적으로 또는 최소한 바람직하게 자극하는, 본 발명에서 정의한 펩타이드 (또는 이들의 비-펩타이드 유사체)로 이식물을 코팅하는 것은, 바람직하면서도 쓸모 있는 전략이며, 이는 결과적으로 선택된 해당 조직의 생체 내 합성을 촉진하게 된다.
본 발명에 의해 정의된 각종 세포-선택적인 펩타이드로 이식물의 상이한 표면 부분을 코팅함으로써, 각 경우마다 특정 기관을 위해 목적하는 각종 세포 종류를 상이한 생체내 세포 과정 수행을 위해 표적화되고 공간적으로 정의된, 협동적인 방식으로 활성화시키는 것은, 생하이브리드 기관 (피부, 혈관, 요관, 방광, 식도, 췌장, 간, 비장, 신장)의 완전 발생에 있어 결정적인 진보가 될 것이다.
본 발명은 이제, 생물질의 생기능화 가능성, 특히 각 경우에 있어서 주로 해당 생물질의 조직 혼입을 달성하는 세포 종류의 부착을 생체외에서 자극하면서도, 동시에 생체 외에서 이러한 과정을 방해하는 세포 종류의 월등한 부착을 자극하지 않는, 본 발명에서 정의된 합성 세포- 또는 조직 선택적인 RGD 펩타이드로 코팅된 모든 알려진 기관 이식물의 생기능화 가능성을 기술한다. 이러한 코팅을 이용하면, 신체 내 삽입 이후로도 장기간의 개선된 안정성을 수반한 각종 생물질/이식물의 촉진 및 향상된 혼입이 달성 가능하게된다.
나아가, 본 발명에서 정의한 상이한 펩타이드로 이식물의 각종 물질 표면 부분을 코팅하는 개념에 의거, 다양한 표적 조직 및 표적 세포의 선택적인 활성화를 위한 ,생물학적인 정보를 소지하며 따라서 신체 내에서 자체-조직화에 의해 혼입될 수 있는 "똑똑한" 생하이브리드 기관 ("조직 공학")의 개발에 관한 모든 가능성이 존재하게되며, 이러한 방법에 의해 조직 혼입을 향상시키는 것, 또는 최초 시도 또한 가능하게 된다.
따라서 본 발명은, 상이한 인간 및 동물 기관에 적당하고, 전달체 매트릭스와 이 매트릭스를 감싸는 펩타이드 코팅으로 기본적으로 구성되는 이식물에 관한 것으로, 펩타이드 코팅은 인간 또는 동물 신체 세포의 표적화된 부착의 자극을 위한, 동일하거나 상이한 펩타이드를 포함하며, 이러한 펩타이드는 인간 또는 동물 세포상의 부착을 담당하는 인테그린 리셉터에 대한 결합 부위를 가지는 서열을 가지며, 전달체 매트릭스는 그 표면상에 상기 펩타이드 층의 적절한 반응성 작용기와 안정한 공유 결합을 형성할 수 있는 결합 가능 반응기를 가지고, 이식물은, 펩타이드와 부합되는 상이한 구조관련 세포 부착-자극 활성에 의거하여, 이식물이 삽입되는 세포의 특정 지역 내에서 펩타이드와 결합하는 조직세포의 상이하며 상보적인 천연 인테그린 패턴에 대해, 펩타이드가 특이적으로 일치하도록 상기 펩타이드가 상이한 방식으로 이식물 표면에 배열된다는 점에서 특징을 가지며, 이러한 방식에 의해 지역적으로 차별화되고 선택적이면서 생활성인, 이식물 표면의 코팅 패턴이 존재하게 된다.
본 발명은 또한, 세포 부착-자극 펩타이드로 코팅된 표면을 가지는 무기 전달체 매트릭스에 기초한, 기관/조직에 적합한 이식물 제조 공정에 관한 것으로, 상기의 펩타이드는 이식물과 직접 연결되는 조직 세포의 상보적 인테그린 패턴에 대해 선택적이며, 알려진 하기의 방법에 의해 특징 지워진다; (i) 생체 내로 이식물이 삽입될 표적 세포 또는 표적 조직의 인테그린 리셉터 구조를 생체 외로 결정하고, (ii) 적절한 상보적 구조를 갖는 펩타이드를 선택 또는 합성하고, 그리고 (iii) 상기 펩타이드를 이식물의 관련 표면에 결합시킨다.
특히, 본 발명은 하기 특성을 소지한 이식물/생물질 및 공정에 관한 것이다: 상기의 펩타이드, 특히 RGD 펩타이드는 공유 결합, 또는 원하는 경우 분지되고 표면 확장 분자 및/또는 분자 앵커 (anchor)를 통해 이식물 표면에 연결된다; 알파v베타3-/알파v베타5-함유 세포, 특히 예로써 골아세포, 파골세포, 내피세포의 부착을 자극할 수 있으며, 동시에 혈소판 또는 섬유모세포의 부착을 자극하지 않는 RGD 펩타이드를 바람직하게 이용하고; 사용된 전달체 매트릭스는 세라믹, 중합체 물질 또는 금속 또는 생하이브리드 기관 또는 빈 기관으로 만들어진 성형 또는 비성형 부품이다.
분자 수준에서, 본 발명에서 정의된 펩타이드는 하기 구성으로부터 필수적으로 디자인된다:
- 선택된 세포 종류를 선택적으로 인식 및 결합하는, 부착 관련 아미노산 서열 함유 도메인 (예로써, 언급한 RGD 서열),
- 세포 결합이 입체적 관점에서만 가능한 방식으로써, 세포-인식 및 인식 서열-함유 도메인을 세포에 제공하기 위한 스페이서 (spcaer),
- 생물질 또는 이식물 표면에 대한 관심상 펩타이드 유도체의 안정한 결합에 영향을 미치는 분자 앵커,
- 임의로는, 생물질 표면에 대한 결합 발생 이전에, 본 발명에서 정의한 펩타이드에 표면 확장 효과를 나타내는 분지 분자 구조 (이른바 덴드리머 또는 Tentakels)를 추가로 커플링시켜, 세포 부착을 제고시킬 수 있다.
본 발명에 따른 생물질 또는 이식물의 표면은 전달체 매트릭스의 직접적인 표면뿐만 아니라, 예로써 중합체 물질, 천연 또는 인공 골 물질, 단백질 또는 단백질 유도체로 존재할 수 있는 부가의 코팅으로 이해되어져야한다.
적당한 전달체 매트릭스는 특히 세라믹, 금속, 중합체 물질 (예로써, PMMA)로 만들어진 물질, 또는 바람직하게는 재흡수성 골 대체 물질이다. 재흡수성 또는 생분해성 물질은, 예로써, 폴리락타이드, 특히 원래의 조직 상태를 복구할 수 있는 라세믹 D,L 폴리락타이드 화합물 또는 재흡수성 칼슘 포스페이트 또는 하이드록시아파타이트 혼합물로, 일례로 WO 96/36562 또는 EP 0 543 765 에 개시된 것이 특히 바람직하다. 사용 분야에 따라, 콜라겐 또는 아가 또한 전달체 매트릭스로서 적당하다.
"생하이브리드 기관"이라는 용어는 임의의 방식에 따라 살아있는 세포에 부가 또는 결합된 일반적인 무기 매트릭스로 이해되어진다 (상기 참조). 본 발명에 따르면, 무(無)세포이면서, 상이한 이식물 표면 부분 상의, 결합 조직 내로 삽입되어 주변 세포를 선택적으로 활성화할 수 있는 본 발명에서 정의된 상이한 타입의 해당 펩타이드만을 함유하는 해당 배열의 의미로 이해되어져야한다. 이러한 비세포 생하이브리드 기관의 장점은, 원가면에서 유리하면서 조절 가능한 방식으로 생산될 수 있는 "똑똑한", 생상용성의 이식물이 기관 재생을 위한 생물학적 정보를 함유한다는 것이다. 이러한 생하이브리드 기관의 신체 내로의 혼입은, 이후, 내재적인 재생 과정에 의한 자체-조직화와, 일례로 이식된 외래 세포 또는 외래 단백질에 의해 종종 발생하는 것과 같은 면역 방어 반응을 회피할 수 있는 방식에 의해 완성된다.
본 발명에 따르면, 원칙적으로 이식물은, 형성된 물체 또는 삽입보강물 내에 존재하며, 형성된 물체는 특정 조직/골 결함에 맞추어져야만 한다. 생하이브리드 기관에 있어서 삽입 보강물은, 해당 세포로 코팅 또는 비코팅된 필름 또는 막과 본 발명에 따라 정의된 펩타이드 등으로만 구성되며, 이러한 배열은 예로써 EP 0 504 781에 개시 되어있다.
본 발명에 따라 사용되는 적절한 펩타이드는, 세포 부착을 담당하는 도메인 또는 아미노산 서열을 함유하는 모든 펩타이드 또는 비-펩타이드 치환기를 가지는 이들의 화합물로, 이들은 펩타이드 및 비-펩타이드 치환기를 통하여 이식물 표면에 결합할 수 있는 것이다. 특히 RGD 서열을 가지는 해당 펩타이드가 가능하다.
하기의 목록은 바람직한 펩타이드 및 펩타이드 화합물로서, 이는 예시적인 의미일 뿐, 제한 특성 등을 소지하는 것은 아니며, 하기의 약호가 사용된다:
Asp (D) = 아스파르트산
Gly (G) = 글라이신
Arg (R) = 아르기닌
Tyr (Y) = 타이로신
Ser (S) = 세린
Phe (F) = 페닐알라닌
Lys (K) = 라이신
DPhe (f) = D-페닐알라닌
Pro (P) = 프롤린
Leu (L) = 루신
Ile (I) = 아이소루신
Val (V) = 발린
Glu (E) = 글루탐산
Thr (T) = 트레오닌
Ala (A) = 알라닌
(a) 적절한 RGD-함유 펩타이드의 예
(b) 적절한 비-RGD-함유 펩타이드의 예
본 발명에서 정의된 펩타이드는 직쇄형 또는 고리형일 수 있다. 상기의 펩타이드 및 펩타이드 서열은, 본 발명에 따라 선택된 펩타이드에 따라, 대략 총 4 내지 20개의 아미노산을 가지는 긴 펩타이드 내에 또한 존재할 수 있다. 유사하게, D 또는 L 배열의 아미노산 또는 C- 및/또는 N-알킬화된 아미노산 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 고리형 펩타이드는, 아미드 결합으로 폐환된 것, 바람직하게는 자유로운 카르복시 또는 아미노기가 분자 내에 존재하지 않는 펩타이드를 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 RGD 펩타이드가 특히 바람직하며, 특히 상기 목록의 것 및 특히 RGDfK 펩타펩타이드가 바람직한데, 그 고리형이 DE-A-1 95 38 741에 개시되어 있고 골아세포에 특이적이며, 이와 유사하게 고리형으로 존재하면서 트롬보사이트에 특이적인 RGDfKG 헥사펩타이드가 또한 바람직하다.
예로써, 하기의 특허 출원에, 본 발명에 따라 정의된 해당하는 직쇄 또는 고리형 펩타이드가 기술되었다: EP 0 632 053, EP 0 655 462, EP 0 578 083, EP 0 770 622, DE 1 95 38 741. 특히, 일례로, αIIbβ3-함유 세포 (예로써, 혈소판)에 동시에 결합하지 않으면서 알파v베타3-/알파v베타5-인테그린 함유 세포 종류 (예로써, 골아세포, 파골세포, 내피 세포)에 선택적으로 결합하는 펩타이드가 바람직하다. 펩타이드 및 해당 유도체는, 다른 방식에 의해 수득되지 못하는 경우, 표준 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있다.
원리상으로, 본 발명에 따라 정의된 펩타이드는, 생물질의 표면에 흡착 또는 공유 결합에 의해 부착될 수 있다. 하나의 동일한 이식물 상에 상이한 펩타이드를 사용할 때는 흡착법이 바람직하지 않은데, 이는 이러한 기술 사용 시에, 본 발명에 따른 지역에 따라 선택적으로 상이한 표면 코팅이 만족하지 못한 결과를 도모하기 때문이다.
펩타이드 또는 이들의 비-펩타이드 유사체를 전달체 표면에 이른바 분자 앵커로 대부분 공유결합시키는 커플링은 이전부터 공지이며, 예로써 하기와 같은 예에 기술되어있다: Singer 등 (1987, J.Cell.Biol. 104: 573), Brandley, Schnaar (1989, Develop.Biol. 135: 74); Massia, Hubbell (1990, Anal.Biochem. 187: 292); Hirano 등 (1991, J.Biomed.Mat.Res. 25: 1523); Lin 등 (1992, Biomaterials 13: 905); Nicol 등 (1992, J.Biomed.Mat.Res. 26: 393); Dee 등 (1995, Tissue Engin. 1: 135), 그러나 이와 같지 않은 경우에는, 이식물의 코팅은 매우 일반적인 것으로 특히 임의의 방식에 의한다.
이후, 본 발명은, 본 발명에 따른 이식물 제조를 위해 이미 공지의 코팅 방법을 신규 적용하는 것에 관련되는데, 예로써, 상기의 펩타이드를 아크릴로일 또는 메트아크릴로일 앵커 성분을 함유한 표면에 커플링시키기 위해 본 발명에서 최초로 사용한 "Kevloc" 공정 (EP 0 712 621), 또는 본 발명에 따라서, 원칙상 아크릴로일/메트아크릴로일 실란 유도체 중간층 (예로써, 3-메트아크릴-옥시프로필 트리메톡시실란)에서 해당 전달체 매트릭스로 통하는 아크릴로일 또는 메트아크릴로일 앵커 성분에 의해 해당 펩타이드를 커플링시키는데 사용되는 "Silicoater" 공정 (DE-A 42 25 106)이 있다. 본 발명에서 정의된 펩타이드를 전달체 매트릭스 또는 이식물의 표면에 결합시키는 다른 가능성은, 자동차 및 플라스틱 산업에서 금속 및 플라스틱의 수-기재 코팅 시스템을 위한 진주 광택 색소 코팅의 기술 내용을 처음으로 개시한 DE-A 43 21005 내용의 실란화 공정과 유사한 실시로서 구성된다. 다른 문헌 (Heuvel 등, 1993, Analytical Biochem. 215: 223)에 처음 기술된, 티올기 함유 펩타이드로 금 표면을 코팅하는 공정이 본 발명에 또한 적당하다.
지금까지 기술된 공정은, 이식물의 생활성화 목적을 위한 이식물의 코팅에 지금껏 도입된 적이 없는 것이다.
본 발명에서 정의된 해당 펩타이드의 이식물 표면으로의 커플링은, 발명에 따른 적절한 앵커 분자를 통하여 이루어지는데, 즉 펩타이드는 원칙상으로 이식물 표면에 그 자체가 직접 결합되지는 않는다. 하기에서 자세히 설명되는 이러한 분자의 삽입은, 특히 해당 펩타이드의 결합과 관련된 표적 세포의 생물학적 리셉터의 입체 조건을 고려하여야한다.
이러한 목적을 위하여, 이식물 표면은, 앵커 분자 해당 작용기의 결합을 가능하게 하는 적절한 작용기 또는 활성 단위를 소지하여야만 한다. 이식물 표면상에 만들어지는 작용기는, 따라서 요건 (금속, 플라스틱, 골 물질)에 따라 차이나는 실제 전달체 매트릭스의 조성에 의존한다. 금속 이식물의 경우에, 예로써, 금 (gold)의 증기 침착에 의해 앵커 분자에 SH 라디칼에 대하여 활성인 표면층을 제조하는 것이 가능하다. 공지 공정 (상기 참조)에 따른 금속 표면의 실란화 역시 유사한 활성 표면을 이루는데, 이는 실란 함유 흡착 프로모터 (하기 참조)를 적절히 사용하는 경우, 본 발명의 적절한 앵커 분자와 함께의 화합물이 된다. 천연 골 또는 천연-유사 골 물질 (예로써, 칼슘 포스페이트 시멘트)로 만들어진 이식물은, 반응성 포스포네이트 기를 함유한 앵커 분자와 결합할 수 있다 (Chu, Orgel, 1997, Bioconjugates Chem. 8: 103 에 원리가 기재됨). 본 발명에 따른 앵커 분자로 그 자체의 부분에 반응성 아크릴레이트 라디칼을 함유하는 것은, 아크릴레이트-기재 플라스틱 (예로써, PMMA) 또는 적절한 플라스틱 코팅을 소지한 기타 물질로 이루어진 이식물에 이후 커플링 될 수 있다.
본 발명 의미 내의 앵커 분자는 따라서, 하나의 작용기는 원칙적으로 본 발명에 따라 정의된 펩타이드, 특히 RGD 펩타이드에서, 분지쇄의 자유 카르복시기 (자유 COOH기)는 자유 아미노기 (자유 NH2기)와 함께 아미드결합 (-CO-NH)을 생성하며, 다른 작용기는 앵커 분자 C 쇄의 다른 한 끝에 선택적으로 위치하면서 이식물 표면과 직간접 결합을 형성하는 이식물 표면의 조성 및 요건에 따라 바람직하게는 (메트)아크릴레이트-함유 라디칼 또는 머르캅토기인, 두개 이상의 작용기를 가지는 변형 또는 치환된 알킬쇄 또는 탄화수소쇄에 기초한 분자이다. 원리상으로는, 안정한 결합을 형성하기 위해, 직접적으로 이식물 표면에 또는 적당한 중간층 상의 각 반응기와 반응할 수 있는 기타 작용기를 사용하는 것 또한 가능하다.
상기한 바와 같은 본 발명의 앵커 분자는, 동시에 스페이서 기능, 즉, 상기한 연결 기능 외에, 세포 부착 자극을 담당하는 도메인이 표적 세포와 적합한 거리를 가짐으로써, 세포 결합이 향상되거나 입체적 관점에서 가능해지도록 하는, 임의로 특정하게 제작된 적정한 길이를 소지할 수 있다.
세포-인식 및 해당 아미노산 서열-함유 도메인의 생물학적 기능은 알파v베타3-/알파v베타5-인테그린-발현 세포 종류 (예, 골아세포, 파골세포, 내피세포) 에 선택적으로 결합하는 합성 펩타이드에 의한 실시예에 의해 확인된다 (Haubner 등, 1996, J.Am.Chem.Soc., 118: 7461-7472).
본 발명의 앵커 분자는 바람직하게는 하기의 직쇄 구조를 가지며, 본 발명에 따라 정의된 펩타이드는, 이들 아미노산 분지쇄 중 하나의 아미노기, 바람직하게는 라이신 분지쇄가 각 앵커 분자의 자유 카르복시 말단에 결합된다.
(i) 머르캅토 (아미도)카르복시산 유도체:
-CO-(CH2)k-X-SH,
X는 단일 결합 또는 -CO-NH-(CH2)l-
k는 2 내지 12 및 l은 2 내지 4;
(ii) 아크릴아미도카르복시산 유도체:
-CO-(CH2)m-[NH-CO-(CH2)n]p-NH-CO-CH=CH2,
m과 n은 2 내지 8; p는 0 내지 2,
(iii) 아크릴아미도-아미도트리에틸렌 글리콜릭 유도체:
-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)q-CO-(CH2)r-NH-CO-CH=CH2,
q는 1 내지 3 및 r은 2 내지 8.
특히, 하기 타입의 특정 앵커 분자가 바람직하다:
(ia) -CO-CH2-CH2-SH (머르캅토프로피온산)
(ib) -CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH (머르캅토에틸아미도숙신산)
(iia) -CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2(아크릴아미도헥산산)
(iib) -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2(아크릴아미도헥산산-아미도헥산산)
(iiia) -CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CO-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2(아크릴아미도헥산산-아미도트리에틸렌글리콜릭산)
(iiib) -(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)2-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2(아크릴아미도헥산산-다이아미도트리에틸렌글리콜릭산).
일반적으로, 본 발명에 따르면, 직선 C쇄 내에 6개 이상의 탄소 원자를 가진 어떤 앵커 분자 구조도 바람직하다. 실제로, 이러한 길이의 앵커 분자는, 이식물의 촉진 및 향상된 조직 혼입을 위한 최적의 결과 달성을 위해 특히 선호된다. 본 발명의 직쇄 내 6개 이상의 탄소는, 본 발명에서 펩타이드와 이식물 표면간의 분자의 총 길이와 연관된다. 기타 언급되지 않은 쇄-연장 커플링 성분을 펩타이드와 이식물 표면간에 삽입시키면, 단쇄를 가지는 상기 구조의 앵커 분자 또한 (예로써, ia 타입) 적합하다.
앵커 분자는 카르복시기를 통해, 본 발명에서 정의된 펩타이드에 표준 방식에 의해 아미드 형태로 결합되며, 이에 따라, 펩타이드-NH-CO-앵커 분자의 형태 구조를 낳고, 이후, 기재된바와 같이 이식물에 연결되어, 이에 따라 이후 하기 타입의 구조를 얻는다:
펩타이드-NH-CO-앵커 분자-이식물 (표면).
해당하는 이식물 구조로는, 각기 상기에 언급되고 정의된 펩타이드 중의 하나, 특히 RGD 펩타이드와, 일반적 및 특정적으로 상기에 개별 언급된 앵커 분자, 및 적절하게 표면-반응성인 이식물로 구성된 것이 바람직하다. 하기의 이식물이 특히 바람직하다:
시클로-RGDfK NH-CO - 티올 유도체 (i 타입) - 이식물,
시클로-RGDfK NH-CO - 아크릴레이트 유도체 (ii 타입) - 이식물,
시클로-RGDfK NH-CO - 아크릴레이트-글리콜 유도체 (iii 타입) - 이식물,
시클로-RGDfKG NH-CO - 아크릴레이트-글리콜 유도체 (iii 타입) - 이식물
로서, 전체 앵커 분자의 직선 탄소쇄는 6 개 이상의 탄소 원자를 가진다.
이들 중 특히 바람직한 것은 하기와 같다:
시클로-RGDfK NH-CO - 티올 유도체 (ib타입) - 이식물,
시클로-RGDfK NH-CO - 아크릴레이트 유도체 (iia 타입) - 이식물,
시클로-RGDfK NH-CO - 아크릴레이트 유도체 (iib 타입) - 이식물,
시클로-RGDfK NH-CO - 아크릴레이트-글리콜 유도체 (iiia 타입) - 이식물,
시클로-RGDfKG NH-CO - 아크릴레이트-글리콜 유도체 (iiia 타입) - 이식물,
시클로-RGDfK NH-CO - 아크릴레이트-글리콜 유도체 (iiib 타입) - 이식물.
이러한 바람직한 구조의 제조는 표준 방법에 의해 실행되거나, 하기에 더 기재한대로, 또는 펩타이드 앵커 구조 등과 관련된, 동일자로 본 출원인에 의해 출원된 병렬 출원에 개시된 것에 의한다.
이미 상기에서 논의된 대로, 기술된 세포- 또는 조직-선택적인 펩타이드 유도체를 본 발명에 따른 생물질 표면에 앵커화시키기 위해서는, 기본적으로 세 종류의 다른 방식이 사용되며, 특정 세포 타입 및 스페이서에 있어서는 각각의 RGD 서열 함유 도메인의 분자인식 패턴이 선택적으로 불변으로 존재하나, 분자 앵커는 언급한 커플링 변이체에 따라 하기의 예와 같이 가변이다:
- 티올 펩타이드 유도체의 금-코팅 생물질 표면에 대한 커플링 (예로써, (i) 타입 앵커 분자에 대한 것);
- (메트)아크릴로일 펩타이드 유도체의 아크릴레이트- 또는 메트아크릴레이트-코팅된 생물질 표면에 대한 커플링 (예로써, (ii) 또는 (iii) 타입 앵커 분자에 대한 것);
- (메트)아크릴로일 실란 유도체를 부착 프로모터 또는 중간층 (예로써, 3-메트아크릴옥시프로필 트리메틸옥시실란)으로 사용한, (메트)아크릴로일 펩타이드 유도체의, 실리콘-코팅된 생물질 표면에 대한 커플링 (예로써, (ii) 또는 (iii) 타입 앵커 분자에 대한 것).
생물질 표면에 대한, 각종 펩타이드 커플링 변이체를 위한 앵커 분자의 최소 임계 길이의 결정은, 6 내지 24 개의 탄소 원자를 바람직하게 가지는 쇄 길이와 이와 다르게는 상이한 소수성/친수성 특성의, 본 발명에 따른 앵커 분자를 가지는, 본 발명에서 정의된 펩타이드의 합성에 의해 수행된다 (예로써, 먼저 표준 방법에 의거, -CH2- 및/또는 아미노헥산산 또는 에틸렌 글리콜 단위의 개수를 다르게 사용하고, 이후, 적절한 생물질 표면 코팅 이후 생체 외에서 세포 부착을 검증하여, 생활성 테스트를 실시한다).
기재한 방법에서, 이식물의 물질 특성에 따라, 본 발명에 따른 펩타이드 유도체와의 실제 커플링 이전에, 표면을 조절하기 위한 적절한 코팅 과정을 선택할 수 있다. 또한, 생물질/이식물의 혼입을 달성하고자 하는 조직 타입 또는 세포 타입에 따라, 코팅 이후 해당 표적 세포 종류의 인테그린, 예로써, 외피 세포의 알파6베타4-인테그린, 또는 혈소판의 알파IIb베타3-인테그린 등을 표적 방식으로 활성화하는 다른 펩타이드와의 코팅도 가능하다. 알파v베타3-특정 RGD 펩타이드는 내피 세포 및 골아세포에 선택성을 가지며, 그 결과 이들은, 예로써 혈관 삽입보정물 또는 골 이식물의 코팅에 적합하다. 이러한 방식에 의해, 골, 장기, 이, 피부 및 모발 대치 분야의 이식을 위한 거의 모든 목적 기관에 대한 적절한 생활성화 표면 코팅이 가능함을 인지할 수 있다.
본 발명에 따른 적절한 이식물 또는 생활성 기관이 사용되기 이전에, 미리 생체 외 테스트 시스템에서 특정 세포 타입에 적당한 펩타이드의 생활성을 테스트 및 측정하여, 이후 선택된 조직 내로 삽입될 이식물에 특이적이면서 선택적인 코팅을 시행할 수 있다.
이식물이 삽입되는 표적 조직 또는 표적 세포의 인테그린 리셉터 구조 분석은 이러한 목적을 위해 필수적인데, 이는 관습적으로 공지의 면역조직학 방법, 예로써, 조직 샘플의 면역형광 또는 면역조직화학법에 의해 실시된다. 한편, 이러한 목적을 위해 필요한, 각종 인테그린 리셉터 또는 이들의 소단위에 대항하는 항체가 공지 및 사용 가능하거나, 일례로, 적절한 면역화와 같은 잘 알려진 표준 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 정의된 펩타이드는, 다양한 농도로, 예로써, 소 혈청 알부민 (BSA)으로 코팅된 폴리스티렌의 배양 표면에 공유 결합된다. 이러한 테스트 지지 물질은 적절한 펩타이드 검증에 중요하지 않다. 유사하게, 여기에서 사용된 커플링 방법 또한 별로 중요하지 않다. 실질적인 이유로, 이러한 측정에서의 커플링은 테스트 지지상에서 상기 펩타이드의 흡착 및 배양 (incubation)에 의해 또한 시행 될 수 있다.
이후에, 생체 내의 천연 조직에서 활성화될 세포에 대한 부착 특성에 해당할 수 있는, 선택된 조직 세포 배양 (예로써, 골아세포)의 부착을 적절하게 코팅된 표면상에서 검사한다. 부착 실험을 위한 적절한 세포 배양의 선택 기준은, 이식 이후 생체내 표적 세포에 상응하는 혼입 발현 패턴, 예로써 인테그린 리셉터의 소단위인 알파v베타3-, 알파v베타5- 또는 알파IIb베타3-인테그린에 대항하는, 또는 알파v-, 알파IIb, 베타3-에 대항하는, 또는 베타5-에 대항하는 형광-표지화 항체를 이용하여 형광-활성화 세포 분류기 (FACS)로 알파v베타3-/알파v베타5- 또는 알파IIb베타3- 발현을 검증하는 것으로 구성된다. 상이한 인테그린 리셉터 패턴을 소지한 생체 내의 기타 표적 세포 종류의 경우에는, 그에 따른 기타 항체를 이용하여야만 한다. 한편, 이들은 공지이며 상용이거나, 공지의 표준 방법, 예로써, 적절한 면역화에 의해 제조할 수 있다.
선택된 각종 세포 종류는 접종되어, 목적하는 펩타이드로 코팅된 BSA-선(先) 처리된 폴리스티렌 배양 표면상에서 배양된다. 비-부착성 세포는 세척해버린다.
본 발명에서 정의된 상이한 펩타이드로 코팅된 테스트 표면에 대한 선택된 상이한 세포 종류의 결합 양상은, 양성인 경우, 즉 충분한 특이성이 존재하면, 각 경우에서 접종된 세포의 약 60 내지 100%의 최대 흡착률 및, RGD 펩타이드 농도가 약 5nM 내지 5μM인 코팅 용액에서 최대 세포 결합치의 절반치를 가지는 적정곡선에 해당한다.
유사한 방식으로, 적절한 펩타이드의 BSA-선 코팅된 폴리스티렌 표면에 대한 커플링에서 기재된 바와 같이, 변형 또는 조절된 생물질 표면에 대한 앵커화 전략은 각종 부착 프로모터 중간층을 사용함으로써 가능하다.
요약으로서, 하기를 기술하고자한다:
선행 기술의 이식물은 하기의 문제점을 소지한다:
- 조직 내로의 불완전하고, 더딘 이식물 혼입,
- 조직 내에서의 제한된 수용성 (受容性),
- 이식물/조직 경계층의 불충분한 기능 활성,
- 조직 신생 (neogenesis)에 대한 이식물의 자극 작용 결핍,
- 이식물 표면의 비-생리학적 성질.
이 결과 하기의 문제점이 발생한다:
- 방부성 이식물의 완화 (예로써, 섬유성 캡슐 형성),
- 마이크로트롬비의 국소 형성,
- 감염,
- 염증,
- 조직 재흡수,
- 수정.
이러한 문제는 본 발명에 따라 가능한 공정 또는 이에 의해 제조된 이식물에 의해 대부분 해소된다. 본 발명의 주제는 하기에 의해 특징 지워진다:
- 표적 조직/표적 세포의 인테그린 발현 패턴에 상보적인, 측정하여 제작된 부착 펩타이드의 측정하여 제작한 디자인;
- 과정을 억제하는 세포 부착을 동시에 초래함 없이, 조직의 신생을 달성하는, 표적 세포 세포 부착의 선택적인 자극;
- 신규 펩타이드 앵커 분자에 의한 고 안정성 코팅;
- 조직 내 이식물 혼입 과정의 촉진 및 향상.
비코팅 물질 표면과 펩타이드의 세포 인식 서열간의 임계 입체 절대 최소 거리는 2.0 내지 3.5nm, 바람직하게는 2.5 내지 3.5nm 임을 밝힐 수 있었다. 최대 코팅률 (80-100%)는 최소거리가 3.0 내지 5.0nm일 때 얻어진다.
실시예 1:
(a) 시클로-RGD 펩타이드 (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)와 앵커 머르캅토 프로피온산의 합성 (→시클로-RGDfK NH-CO-티올 유도체, ia 타입)은 DE 1 95 38 741 공정에 따라 수행한다. 생물학적으로 비활성인 해당 시클로-RβADfK 유도체와 앵커 분자가 없는 시클로-RGDfK 유도체의 합성 역시 유사하게 실시한다.
(b) 시클로(R(Pbf)GD(tBu)fK(Z)) (Pbf = 펜타메틸벤조퓨란설포닐; tBu = tert-부틸)을 고체상 펩타이드 합성 (Merrifield, Angew. Chem. 1985, 97:801)으로 제조하여, 이후 결정화한다 (예로써, Zimmer 등, 1993, Leibigs Ann. Chem: 497 에 따름). 표준 방법에 따라 Z-보호기를 선택적으로 제거한 후, 5ml의 다이메틸포름아마이드 내의 0.2mmol 숙신산 무수물 (sa)을 0.1mmol 시클로(R(Pbf)GD(tBu)fK)와 반응시킴으로써 라이신의 분지쇄를 연장시켜, 시클로(R(Pbf)GD(tBu)fp[sa-K]를 얻는다.
(c) 시클로-RGD 펩타이드 (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)와 앵커 머르캅토 에틸아미도숙신산의 합성 (→시클로-RGDfK NH-CO-티올 유도체, ib 타입 = 시클로(RGDf[티올]-sa-K])을 하기와 같이 수행한다: 10mmol 시스테아민 하이드로클로라이드와 동일 몰 량 (eq.)의 트리페닐메탄올을 60℃에서 빙초산에 용해시키고, 교반하면서 1.1 eq.의 BF3에테레이트로 처리한다. 50 분간 교반후, 혼합물을 포화 NaHCO3용액으로 중화하고, 에틸아세테이트로 추출한다. 추출물에 잔류하는 오일을, tert-부탄올에 용해하여 하이드로클로라이드로 전환하고, 묽은 염산으로 pH = 2로 만들어 동결 건조한다. 수율은 99%이다. 수득한 구조단위를 표준 방법으로 EDCl xHCl을 사용하여 시클로(R(Pbf)GD(tBu)f[sa-K])에 커플링하고, 측면 보호기를 제거한다.
(d) 시클로-RGD 펩타이드 (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)와 앵커 아크릴아미도헥산산의 합성 (→시클로-RGDfK NH-CO-아크릴릭 유도체, iia 타입 = 시클로(RGDf[아크릴릭-ahx-K])을 하기와 같이 수행한다:
아크릴릭 앵커 시스템을 개별적으로 합성하고, 활성 에스테르로서의 펩타이드 측쇄에 커플링시킨다. 이를 위해, 6-아미노헥산산 10mmol과 1.8 eq.의 칼슘 하이드록사이드를 물에 현탁하고, 0℃에서 1.2 eq.의 아크릴로일 클로라이드를 가한다. 비용해성 칼슘 하이드록사이드는 여과해버리고, 여과액을 진한 염산을 이용하여 pH=2로 산성화한다. 침전된 생성물을 에틸아세테이트로 재결정한다. 수율은 65%이다. 결정성 6-아크릴아미도헥산산 10mmol을 50ml 다이클로로메탄에 용해시키고, 1 eq.의 N-하이드록시숙신이미드로 처리하고, 1.2 eq.의 EDCl xHCl을 0℃에서 가한다. 1 시간 교반후, 10㎕의 빙초산을 가하여 반응을 정지시킨다. 냉각된 포화 소듐 카보네이트 용액과 물로 수회 추출 후, 추출물을 소듐 설페이트로 건조한다. 수율은 52%이다. 이렇게 존재하는 활성 에스테르를 DMF 내의 시클로(R(Pbf)GD(tBu)fK)에 커플링하고 측쇄 보호기를 표준 방법에 의거하여 제거한다.
(e) 시클로-RGD 펩타이드 (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)와 앵커 아크릴아미도헥산산-아미도헥산산의 합성 (→시클로-RGDfK NH-CO-아크릴릭 유도체, iib 타입 = 시클로(RGDf[아크릴릭-ahx-ahx-K])을 하기와 같이 수행한다:
아크릴릭 앵커 시스템 합성을 위해, 아미노헥산산 10mmol을 소듐 포스페이트 완충액 (pH 8) 수용액에 용해시켜 0℃로 냉각한다. 2mmol의 아크릴아미도헥산산 활성 에스테르 ((d) 참조)를 에탄올/CHCl3에 용해시켜 서서히 가한다. 희석 NaOH 를 사용하여, pH 8로 유지시킨다. 유기 용매를 증류 제거한 후, 수성층을 진한 염산을 이용하여 pH 2.6으로 산성화하고, 침전된 고체를 여과하고, 물로 세척하여 오산화인으로 건조시킨다. 수율은 70%이다. 이렇게 존재하는 아크릴릭 앵커 시스템을 EDCl xHCl을 사용하여 공지의 방법으로 펩타이드 측쇄에 커플링하고 보호기를 제거한다.
(f) 시클로-RGD 펩타이드 (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)와 앵커 아크릴아미도헥산산-아미도트리에틸렌 글리콜산의 합성 (→시클로-RGDfK NH-CO-아크릴릭 유도체, iiia 타입 = 시클로(RGDf[아크릴릭-ahx-tEG-K])을 하기와 같이 수행한다:
고체상 펩타이드 합성에 의해 아크릴릭 앵커 시스템을 제조한다 (상기 참조). 아크릴아미도헥산산을 (상기 참조) 마지막 성분으로 하여 커플링시킨다. 수율은 97%이다. 이렇게 존재하는 아크릴릭 앵커 시스템을 EDCl xHCl을 사용하여 공지의 방법으로 펩타이드 측쇄에 커플링하고 보호기를 제거한다.
(g) 시클로-RGD 펩타이드 (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)와 앵커 아크릴아미도헥산산-아미도트리에틸렌 글리콜산-아미도트리에틸렌 글리콜산의 합성 (→시클로-RGDfK NH-CO-아크릴릭 유도체, iiib 타입 = 시클로(RGDf[아크릴릭-ahx-tEG-tEGK])을 (f)와 유사하게 시행한다. 수율은 85%이다.
(i) 시클로-RGD 펩타이드 (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys-Gly)와 앵커 아크릴아미도헥산산-아미도트리에틸렌 글리콜산의 합성 (→시클로-RGDfK NH-CO-아크릴릭 유도체, iiia 타입 = 시클로(RGDf[아크릴릭-ahx-tEG-KG])을 (f)와 유사하게 시행한다. 수율은 81%이다.
실시예 2:
설포숙시닐이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (설포-SMPB)를 가지는 본 발명에 따른 펩타이드를, 소 혈청 알부민 (BSA)으로 선 코팅된 폴리스티렌 배양 표면에 공유 커플링시키는 것은 Singer 등 (1987, J.Cell.Biol. 104: 573), 또는 Ruoslahti 등 (1982, Methods.Enzymol., 82: 803-831)에 성립된 과정에 따라 수행한다.
이를 위해서, 48-웰 플레이트 (Costar, "비-조직 배양 처리된", Art. No. 3547) 각각을, 각 웰당 250㎕의 PBS (포스페이트-완충 식염수), pH=8.3, 2% BSA 로 코팅하고, 상온에서 밤새 배양하여 폴리스티렌 상에 BSA 층을 형성한다. 이후 플레이트를, 각 웰 당 pH=8.3의 PBS 250㎕로 세척하고, pH=8.3 PBS 내의 SMPB 100㎍/㎖ 함유 용액 250㎕ 각각과 함께 1시간 동안 상온에서 배양한다. 이후, 각 시기마다 pH=8.3의 PBS 250㎕로 웰을 3회 세척한다. 코팅 용액 제조를 위하여는, 적절한 티올-RGD 펩타이드를 하기 최종 농도로 PBS 내에서 제조한다: 1nM, 10nM, 100nM, 1μM, 10μM, 100μM, 및 1mM. 각 웰당 250㎕의 코팅 용액을 가한 후, 플레이트를 상온에서 밤새 배양하여, 이후 pH=8.3의 PBS 로 3회 세척한다. PBS 내의 5% 강도 BSA 용액 250㎕ 각각을 가한 후, 연속하여 상온에서 2시간 배양후, pH 7.4 PBS로 세척하여 비특이적 세포-결합 부위를 차단한다. 폴리스티렌 표면으로, 그 코팅이 양성 샘플과 동일하게 5% 강도의 BSA 용액으로 처리된 것을 음성 코팅 대조군으로 사용한다. 이후, 세 개의 상이한 종류에서 수득한 4 개의 세포 배양의 부착을, 상기한 RGD 펩타이드로 코팅된 표면상에서 측정한다:
- 성인 환자 대퇴골 해면질 머리의 인간 일차 골아세포 (Siggelkow 등, 1997, Bone 20: P231);
- 성인 환자 골수의 인간 일차 골프로제니터 세포 (Vilamitjana-Amedee 등, 1993, In vitro Cell Dev.Biol. 29: 699);
- Yagiela 와 Woodbury (1977, The Anatomical Record, 188: 287-305)의 방법에 의해 제조 및 배양을 시행한, 신생 래트 두개관의 일차 골아세포;
- 신생 마이스 두개관에서 수득한 골아세포주 MC3T3 H1 (Heermeier 등, 1995, Cells and Materials, 5: 309-321); 및
- 알파v베타3/알파vβ5-인테그린 음성 대조군으로서의 인간 멜라노마 세포주 M21L.
부착 실험을 위해 이러한 세포주를 사용하기 전에, 이들의 인테그린 발현을, 알파v베타3- 또는 알파v베타5-리셉터에 대항하는 항체와, 알파v, 베타3,및 베타5인테그린 소단위에 대항하는 항체를 이용하여, Becton-Dickenson 형광 활성 세포 분류기 (FACS)를 이용하여 확인한다. 이 경우 상기 인테그린의 강한 발현을 관측할 수 있다 (도 1).
기술한 세포 종류를, 상기한 바와 같이 RGD-펩타이드로 코팅된 Costar-48 웰 플레이트 내로 48,000세포/㎠의 접종 밀도로 접종하여, 95% 대기 습도 및 5% CO2하에서 1시간 동안 37℃로 배양한다. 실험중 부착되지 못한 세포는, pH 7.4의 PBS로 2회 세척해 버린다.
Landegren (1984, J.Immunol.Methods, 67: 379-388)의 방법에 따른 적절한 표준 곡선을 이용하여, 세포 효소 N-아세틸헥소스아미니다제의 활성을 측정함으로써 부착된 세포의 정량화를 간접적으로 실시한다.
BSA-선 처리된 폴리스티렌 세포 배양 표면을 알파v베타3- 또는 알파v베타5-선택적인 티올펩타이드 1-, 2-(설포-SMPB)유도체로 코팅하는 것은, 강하면서도 투여량-의존적인 양식의, 배양된 마우스 MC3T3 H1 골아세포의 부착 자극을 유도한다 (도 2 참조). 반면에, 생물학적으로 비활성인 티올펩타이드는 어떠한 주요 효과도 나타내지 않았는데, 이는 인테그린-RGD 펩타이드 상호작용의 고선택성과 고특이성을 시사하는 것이다. 알파v베타3- 또는 알파v베타5-에 대해 덜 선택적인 티올펩타이드 3-(설포-SMPB)(시클로-RGDvE-아미노시스테인아미도헥산산: Delforge 등, 1996, Anal.Biochem. 242, 180) 또한, 해당 티올펩타이드 1 및 2 유도체보다는 현저하게 낮은 효과를 나타낸다.
BSA-선 처리되었으며 1-(설포-SMPB)유도체 티올펩타이드 또는 2-(설포-SMPB)유도체 티올펩타이드로 코팅된 폴리스티렌 표면에 대한 상이한 세포 종류의 결합 양상은, 접종 세포의 약 70% (래트 일차 골아세포), 약 80% (인간 일차 골아세포 및 인간 일차 골프로제니터 세포), 및 약 90-100% (MC3T3 H1 마우스 골아세포)의 최대흡착률을 가지는 적정 곡선, 코팅 용액 50-100nM 내의 RGD 펩타이드와 최대치 절반의 세포 결합에 해당한다 (도 3). 이와 다르게, 알파v베타3- / 알파v베타5-음성 대조군 세포 (M21L)는 유의한 세포 부착을 나타내지 않는다. 기술된 세포 흡착률은, 사용된 모든 골아세포 배양에서 유의한 세포 부착을 나타내지 않는 5% BSA-코팅된 표면에 비해 약 20-40배 증가된 것이다.
언급된 골아세포 배양의 유사한 양태는, 부착-자극 효과가 골아세포-특이적이나, 종-독립적임을 확인해준다.
BSA-선 처리되었으며, 1-설포-SMPB 유도체 티올펩타이드로 코팅된 폴리스티렌 표면에 대한 상기의 골아세포 세포 배양의 결합은, 부착 매질 내에 용해된 시클릭 RGDfK를 가함으로써 완전 억제된다 (도 4). 이러한 결과는, 관측된 세포 부착 현상이 RGD 펩타이드 단독에 의해 매개됨을 증명한다.
인간 일차 골아세포 또는 MC3T3 H1 세포의, BSA-선 처리되고 상기 1,2 (설포-SMPB) 티올펩타이드로 코팅된 다수의 접종된 세포 상의 폴리스티렌 표면에 대한 세포 부착 의존성은 포화 곡선을 나타낸다 (도 5). 그러나, BSA 음성 코팅에서는 유의한 세포 부착이 관측되지 않았다. 최대 세포 접종 밀도 경우에 계산된, 부착된 세포 당 평균 표면적 200 내지 500μ㎡인 이러한 표면상에서, 평균 세포-세포 거리는 약 15-25㎛를 나타낸다 (도 6). 골아세포의 세포 직경이 10 내지 15㎛이므로, 세포가 다른 세포에 바로 인접하게 배열된, 골아세포로 조밀하게 코팅된 표면이 되도록 하는 수효의 세포 부착부위를 펩타이드 코팅이 가능하게 함이 명백하다. 상기한 표면상 세포 부착 과정의 시간 진행은, 세포 타입에 따라, 세포의 신속한 부착이 약 45 내지 60 분 이후에 완결된다 (도 7). 세포주 (예로써, MC3T3 H1)는 일차 세포 배양 (인간, 래트)에 비해 보다 신속한 부착 키네틱을 나타낸다. 이들 실험에서, 사용된 두 티올펩타이드 유도체간의 유의한 차이는 발견되지 않는다.
실시예 3:
골아세포 부착 정도에 대한, 각종 앵커 분자의 길이 효과와, 이에 따른 세포-인식 RGD 서열 및 물질 표면간 거리 효과 검증을 위해, 상이한 분자 스페이서 길이를 소지한 4 개의 상이한 종류의 아크릴레이트-RGD 펩타이드 (시클로-RGDfK NH-CO-아크릴레이트 유도체 (iia, iib, iiia, iiib 타입))를 제조한다.
시클로-RGD 펩타이드의 합성은, 실시예 1의 기재 또는 문헌의 해당 과정에 따라 실시한다 (Pless 등, 1983, J.Biol.Chem. 258: 2340-2349 또는 Gurrath 등, 1992, Eur.J.Biochem. 210: 911-921).
이들 펩타이드의 해당 앵커 길이는 약 2.6nm (아크릴레이트 펩타이드 1, iia 타입), 3.5nm (아크릴레이트 펩타이드 2, iib 타입), 3.7nm (아크릴레이트 펩타이드 3, iiia 타입), 및 4.2nm (아크릴레이트 펩타이드 4, iiib 타입)이다.
이들 펩타이드를 중합된 PMMA (폴리메틸 메트아크릴레이트) 표면에 공유 커플링시키기 위하여, 3 개의 상이한 PMMA 부품으로부터, 상이한 다공성 (직경: 10mm; 높이: 2mm)을 가지는 적당한 형태의 물품을 제조한다.
- 제품 명세서 (40g 분말 + 20ml 액체)에 해당하는 PMMA 기재 골 시멘트 (Merck KGaA, 독일, 허가번호 5181.00.00).
- 입자 크기 0.5-0.6mm (Biomet)의 PMMA/PHEMA (폴리하이드록시에틸 메트아크릴레이트) 과립 10g을 1.3ml의 HEMA 용액 (68.6% HEMA, 29.4% TEGMA [트리에틸렌 글리콜 다이메트아크릴레이트], 2% tBPB [tert-부틸 퍼옥시벤조에이트])과 혼합하고, 이에 의해 다공성 지지물질에 부착시킨다.
- 0.7-2mm의 입자 분율 PMMA 과립 (Plex Y7H, Rohm 독일) 10g을, 1.5ml의 메틸 메트아크릴레이트 (MMA) 용액 (68.6% MMA, 29.4% TEGMA, 2% tBPB)과 혼합하고, 이에 의해 다공성 지지물질에 부착시킨다.
아크릴레이트 펩타이드를 선 중합된 PMMA 성형 물품에 공유 커플링시키기 위하여, 각각 DMSO/0.2% 캠퍼퀴논(w/v) 내의 최종 농도 100μM의 아크릴레이트 펩타이드 1, 2, 3, 및 4 의 스탁 (stock)용액을 제조한다. 이후 이소프로판올/0.2% 캠퍼퀴논(w/v)으로 희석하여, 각각의 경우 최종 펩타이드 농도 0.1nM, 1nM, 10nM, 100nM, 1μM 및 10μM을 가지는 농도 시리즈를 제조한다. 성형 물품은 2시간 동안 상온 햇볕 하에서 방치한 후, 4℃에서 건조 상태로 저장한다. 사용 전에, 샘플은 pH 7.4 PBS로 세척하여 결합되지 않은 펩타이드를 제거하고, pH 7.4 PBS 내에서 밤새 4℃로 보관한다.
pH 7.4 PBS 내의 5% 강도의 BSA용액을 성형된 물품 당 250㎕ 가하고 연속적으로 상온에서 2 시간 동안 보관하고, pH 7.4 PBS로 1회 세척하여 비-특이적 세포-결합 부위를 차단한다.
펩타이드 용액 대신, 이소프로판올/0.2% 캠퍼퀴논(w/v) 용액으로 처리된 PMMA 성형 물품을 음성 대조군으로 삼는다.
연속적으로, 상기한 펩타이드-코팅된 표면에 대한 신생 마우스의 두개관에서 수득한 MC3T3 H1주 (Heermeier 등, 1995, Cells and Materials 5: 309-321) 골아세포의 부착을 조사한다.
MC3T3 H1 골아세포를 상기한 바와 같이 48,000세포/㎠의 접종 밀도로 Costar 48 웰 플레이트 내로, RGD-펩타이드로 접종된 PMMA-성형 물품과 함께 접종하여, 95% 대기 습도 및 5% CO2하에서 1시간 동안 37℃로 배양한다. 실험중 부착되지 못한 세포는, pH 7.4의 PBS로 2회 세척해 버린다.
Landegren (1984, J.Immunol.Methods, 67: 379-388)의 방법에 따른 적절한 표준 곡선을 이용하여, 세포 효소 N-아세틸헥소스아미니다제의 활성을 측정함으로써 부착된 세포의 정량화를 간접적으로 실시한다.
상기의 아크릴레이트 RGD 펩타이드 1 (iia 타입), 2 (iib 타입), 3 (iiia 타입), 및 4 (iiib 타입)로 코팅된 상이한 PMMA 성형물품에 대한 MC3T3 H1 골아세포의 결합 양상은, 각 경우에서 적정 곡선과 일치한다. 최대 부착률은 아크릴레이트 펩타이드 1의 경우 약 20% 이며, 아크릴레이트 펩타이드 2, 3, 및 4 의 경우는 약 80 내지 100%이다. 아크릴레이트 펩타이드 2, 3, 및 4 에 대해서, 코팅 용액 내의 RGD 펩타이드 농도가 약 1-10,000nM일 때 최대치 절반의 세포 결합이 발생한다.
RGD-펩타이드 코팅된 골 시멘트 성형 물품 상의 기재된 세포 부착률은, 비코팅된 표면에 비해 약 1.5 배 (아크릴레이트 펩타이드 1) 및 약 5-15 배 (아크릴레이트 펩타이드 2, 3, 및 4) 증가한다 (도 8).
RGD-펩타이드 코팅된 다공성 PMMA/PHEMA 과립 성형 물품 상의, 상기 세포 부착률은, 비코팅된 표면에 비해 2-5 배 증가한다 (아크릴레이트 펩타이드 2, 3, 및 4) (도 9).
RGD-펩타이드 코팅된 다공성 Plex Y7H 과립 성형 물품 상의, 상기 세포 부착률은, 비코팅된 표면에 비해 2-3 배 증가한다 (아크릴레이트 펩타이드 2, 3, 및 4) (도 10).
PMMA-골 시멘트 성형 물품에 비하여, PMMA/PHEMA 또는 PMMA-Plex Y7H 샘플 모두에 있어서, 광범위한 변위의 세포 부착값 및, RGD 펩타이드 코팅된 샘플에 대한 일정한 최대 부착률을 수반하는 대조군 샘플에 대한 골아세포의 강한 부착이 관측되었다.
아크릴레이트 2, 3, 및 4는, 상호비교 및 테스트 BSA 대조군상에 코팅된 티올펩타이드 1 및 2와의 비교 모두에 있어서, 매우 유사한 세포 부착 자극이 관측되었으나, 최단 펩타이드인 아크릴레이트 펩타이드 1은 거의 비활성이다. 이로부터, 입체적으로 성공적인 세포 부착을 수행하기 위한, 물질 표면과 RGD 세포 인식 서열간의 임계 최단 거리는 약 2.5-3.5nm가 필요한 것으로 결론지을 수 있다 (도 11).
골 시멘트-PMMA 전달체 상의 아크릴레이트 펩타이드 3의 고활성은, 분자 길이 및 임의로 친수성/소수성 분포 또는 스페이서 내의 비율 관점에서의, 세포 부착을 위한 최적의 분자 구조를 나타낸다.
실시예 4:
펩타이드 코팅된 금속 표면에 대한 골아세포의 세포 부착 테스트를 위해, 세 종류의 상이한 코팅 변이를 가진 V4A 스테인리스 스틸 성형 물품 (7x7x1 m㎥)을 준비하여, 이후에 각각의 경우를 RGD 펩타이드로 코팅한다. 이를 위해, 먼저 스테인리스 스틸 성형 물품을, 세척을 위해 15분간 60℃의 초음파 욕조에 담그고, 탈금속화 물로써 헹구어, 30 분간 아세톤에 담그고, 탈금속화 물로써 재차 헹구어 24시간 60℃에서 보관하여 건조시킨다.
스테인리스 스틸 판을 세 종류의 변이물로 이후 코팅한다:
a. Kevloc공정 (Heraeus Kulzer GbmH, Wehrheim, 독일):
Kevloc프라이머 용액을 얇게 도포하고 상온에서 3 분간 방치한다. 이후, Kevloc결합 용액을 유사하게 얇게 도포하고 180℃ 요 (窯; kiln)에서 20 분간 활성화한다. 이러한 코팅 변이는 금속 표면상에 자유 아크릴레이트 라디칼이 직접적으로 존재하도록 하므로, 중합된 PMMA-골 시멘트를 위한 실시예 3에서 기재된 바와 같이, iiia 타입의 아크릴레이트 펩타이드 3을 바로 공유 커플링시키는 것이 가능하다.
b. Silicoater공정 (Heraeus Kulzer GbmH, Wehrheim, 독일):
Siliseal용액을 얇게 도포하고 상온에서 5 분간 건조한다. 이후, Sililink 용액을 유사하게 얇게 도포하고 320℃ 노에서 3 분간 활성화한다. 금속 표면상에 자유 아크릴레이트 라디칼이 직접적으로 존재하도록 하기 위해, 선 처리된 스테인리스 스틸 성형 물품을 75℃로 가열된 탈금속화된 물에 담그고, NaOH를 사용하여 약 pH 8.00으로 조절한다. 이후, 1 시간 동안 교반하면서, 1% 3-메트아크릴옥시프로필트리메톡시실란 용액 (Huls AG, 독일)을 계량하며 pH가 약 6.50이 될때까지 가한다. 혼합물은 이후 75℃에서 1 시간 동안 교반하고; 이때의 pH는 약 6.35이다.
중합된 PMMA-골 시멘트를 위한 실시예 3에서 기재된 바와 같이, iiia 타입의 아크릴레이트 펩타이드 3의 결합을 실시한다.
c. 색소 코팅 (Merck KGaA, Darmstadt, 독일):
이 코팅 변이는, 자동차 및 플라스틱 산업에서 금속 및 플라스틱의 수-기재 코팅 시스템을 위한 진주 광택 색소 코팅의 기술 내용을 처음으로 개시한 DE-A 43 21005 내용의 실란화 공정에 따라 실시된다.
이를 위해, 스테인리스 스틸 성형 물품을, 75℃ 가열된 탈금속화 물에 담그고, NaOH를 사용하여 약 pH 8.00으로 조절한 후, 2 시간 동안 교반하면서 AlCl3용액을 계량하며 가한다. 이후 이와 유사하게, 2 시간 동안 교반하면서 5% 소듐실리케이트 용액을 계량하며 가한다. 그 다음 단계에서, 1% 3-메트아크릴옥시프로필트리메톡시실란 용액 (Huls AG, 독일)을 계량하며 1 시간 동안 교반하면서 가한다. 혼합물은 이후 75℃에서 1 시간 동안 교반하고; 이때의 pH는 약 6.40이다.
중합된 PMMA-골 시멘트에 대한 실시예 3의 기재와 같이, iiia 타입의 아크릴레이트 펩타이드 3의 결합을 실시한다.
iiia 타입의 아크릴레이트 펩타이드 3으로 스테인리스 스틸 성형 물품을 3 가지의 상이한 과정을 이용하여 코팅한 이후, MC3T3 H1 주의 골아세포의 세포 부착 을 조사한다. 이를 위해, 실시예 3에 기재한 방법을 사용한다.
상기의 아크릴레이트 펩타이드 3으로 코팅되고, 세 종류의 상이한 과정으로 선 처리된 V4A 스테인리스 스틸 성형 물품에 대한 MC3T3 H1 골아세포의 결합 양상은 각 경우에서, 적정 곡선과 일치한다 (도 12).
최대부착률은 색소 코팅의 경우, 약 60% 이며, Kevloc또는 Silicoater과정의 경우 약 80%이다. 세 종류 코팅 변이 모두에 대해서, 코팅 용액 내의 RGD 펩타이드 농도가 약 1-100nM일 때 최대치 절반의 세포 결합이 발생한다. RGD-펩타이드 코팅된 스테인리스 스틸 성형 물품 상의, 상기한 세포 부착은, 비코팅된 표면에 비해 약 3- 내지 8-배 증가한다.
Kevloc또는 Silicoater과정의 경우에, 각각의 경우 코팅은 단지 하나 만의 코팅 용액 (Kevloc프라이머 단독, Kevloc결합 단독, Siliseal단독, Sililink단독)을 사용하여, 추가의 코팅을 실시한다. 이러한 경우에, 각각의 2중 코팅 (Kevloc프라이머/결합, Siliseal/Sililink)에 비한, 세포 부착의 유의한 차이는 관측되지 않았다.
실시예 5:
골아세포 부착뿐만 아닌, RGD 펩타이드-코팅된 표면상에서의 이들의 증식의 보충적인 조사를 위한 방법은 하기와 같다:
중합된 PMMA 골 시멘트 성형 물품에 대한 iiia 타입 아크릴레이트 펩타이드 3의 공유 결합을 위해, 실시예 3에 기재된 코팅 과정을 선택한다.
실시예 3에 유사하게 기재된 바와 같이, 이후 MC3T3 H1 골아세포를 RGD-펩타이드로 코팅된 골 시멘트 성형 물품에 부착시키는데, 단 두 가지의 차이점이 있다: 48,000세포/㎠ 대신 12,000세포/㎠로 접종하고, 부착시간은 1 시간 대신 2 시간으로한다. 또한, 코팅 용액 내의 단지 3 종류의 상이한 펩타이드 농도만을 조사한다: 0.01μM, 1μM, 및 100μM.
비부착 세포를 세척해 버린 후, MC3T3 H1 골아세포를 혈청 포함 (10%) 배양매질에서 15 일간 95% 대기 습도 및 5% CO2하에서 37℃로 배양한다. 이러한 과정 중, 매질은 주당 2회 교체하고, 1, 2, 3, 4, 5, 10 및 15 일 후, 세포 개수를 Boehringer Mannheim (독일)의 WST-1 방법에 의거하여 측정한다. 각 경우에 있어서, 일반적인 지수 과정 (exponential course)을 가지는 배양된 골아세포 세포 증식이 나타난다 (도 13). 최대로 수득된 세포 개수는, 코팅 용액 내의 RGD-펩타이드의 농도에 직접적으로 의존한다. 따라서, 15일간의 배양후, 1㎠ 당, 약 1,000,000 세포 (100μM 펩타이드), 약 550,000 세포 (1μM 펩타이드), 약 300,000 세포 (0.01μM 펩타이드), 또는 약 230,000 세포 (펩타이드가 없는 대조군)가 수득된다. 100μM의 최대 펩타이드 농도에서, 비코팅된 샘플에 비해 약 4- 내지 5-배의 세포 증식의 증가가 나타난다.
실시예 6:
상이한 세포의 부착을 자극하기 위해, 국소적으로 차별화된 생활성 코팅 패턴을 소지는 이식물을 수득하기 위한, 상이한 세포 선택성의 RGD-펩타이드 물질 코팅을 위한 모델로는, 중합된 PMMA 골 시멘트 성형 물품을 사용한다. 여기에, 상이한 세포 선택성을 지니는 2 종류의 RGD 펩타이드를 공유 커플링시킨다. 이 경우, 알파v베타3- / 알파v베타5-인테그린 함유 골아세포에 대해 선택성을 가지는 iiia 타입의 아크릴레이트 펩타이드 3과, 알파IIIb베타3-양성 혈소판에 대해 선택성을 가지는 iiia 타입의 아크릴레이트 펩타이드 5를, 실시예 3에 기재한 바와 같이 PMMA 성형 물품에 결합시킨다.
a. 제 1 단계 실험으로, 각각, 코팅 용액 내에서 100μM, 10μM, 및 1μM의 농도를 가지는 아크릴레이트 펩타이드 3 및 5로서 PMMA 성형 물품을 코팅한다. 이들 RGD 펩타이드 코팅된 물질을 골아세포와 혈소판에 나란히 접종하여, 이들의 세포 부착을 측정한다.
MC3T3 H1 골아세포 (350,000 세포/㎠) 및 인간 혈소판 (5천만 세포/㎠) 각각을, 아크릴레이트 펩타이드 3- 및 아크릴레이트 펩타이드 5-로 코팅된 PMMA 성형 물품에 모두 나란히 접종하고, 이들의 세포 부착을 실시예 3에 개시된 바와 같이 측정한다.
인간 혈소판은 Shattil 및 Brass (J.Biol.Chem. 262:992-1000, 1987)의 방법에 따라 제조한다. 이러한 실험에 의해 두 RGD 펩타이드의 세포 선택성을 측정할 수 있다.
알파v베타3- / 알파v베타5-양성 골아세포는, 알파v베타3-/알파v베타5-음성 혈소판에 비교하여, 아크릴레이트 펩타이드 3 (알파v베타3-/알파v베타5-선택성)-코팅된 PMMA 성형 물품에 보다 선택적으로 부착된다 (도 14). 골아세포에 대한 계산된 흡광도 (Abs; 405nm)는 약 6.0 (코팅 용액 내의 100μM 펩타이드), 약 2.0 (코팅 용액 내의 10μM 펩타이드), 약 1.8 (코팅 용액 내의 1μM 펩타이드)인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 혈소판에 대해서는, 매우 낮은 세포 부착 값, 즉 약 3.0Abs (코팅 용액 내의 100μM 펩타이드), 약 1.5Abs (코팅 용액 내의 10μM 펩타이드), 약 0.2Abs (코팅 용액 내의 1μM 펩타이드)가 수득되었다. 그러나 아크릴펩타이드 5 (알파IIIb베타3-선택성)-코팅된 PMMA 성형 물품에 대해서는 반대의 효과가 수득되었다. 이 경우에, 알파IIb베타3-양성 혈소판은, 알파IIb베타3-음성 골아세포에 비해 보다 잘 부착된다 (도 15).
혈소판에 대한 계산된 Abs는 (405nm), 약 4.0Abs (코팅 용액 내의 100μM 펩타이드), 약 0.5Abs (코팅 용액 내의 10μM 펩타이드), 약 0.2Abs (코팅 용액 내의 1μM 펩타이드)가 수득되었다. 그러나, 골아세포에 대해서는, 매우 낮은 세포 부착 값, 즉 약 1.5Abs (코팅 용액 내의 100μM 펩타이드), 약 1.0Abs (코팅 용액 내의 10μM 펩타이드), 약 0.2Abs (코팅 용액 내의 1μM 펩타이드)가 수득되었다.
b. 제 2 단계 실험으로, 각각, 코팅 용액 내 100μM의 농도만의 아크릴레이트 펩타이드 3 및 5로서 PMMA 성형 물품을 유사하게 코팅한다. 이들 RGD 펩타이드 코팅된 물질을 골아세포, 혈소판, 및 골아세포/혈소판 혼합물에 나란히 접종하여, 이들의 세포 부착을 측정한다. MC3T3 H1 골아세포 (350,000 세포/㎠), 인간 혈소판 (5천만 세포/㎠), 세포 혼합물 (350,000 골아 세포/㎠ 또는 5천만 혈소판/㎠) 각각을, 아크릴레이트 펩타이드 3- 및 아크릴레이트 펩타이드 5-로 코팅된 PMMA 성형 물품에 모두 나란히 접종하고, 이들의 세포부착을 실시예 3에 개시된 바와 같이 측정한다.
알파v베타3-/알파v베타5-양성 골아세포 (약 6.0Abs)는, 알파v베타3-/알파v베타5-음성 혈소판 (약 3.0Abs)에 비교하여, 아크릴레이트 펩타이드 3-코팅된 PMMA 성형 물품에 보다 선택적으로 부착된다 (도 16). 양 세포 종류를 혼합물로 접종했을 때의 결과는 골아세포 단독의 결과와 일치한다 (약 6.5Abs).
그러나 아크릴펩타이드 5 (알파IIb베타3-선택성)-코팅된 PMMA 성형 물품에 대해서는 반대의 효과가 수득되었다. 알파IIb베타3-양성 혈소판 (약 4.0Abs)은 알파IIb베타3-음성 골아세포 (약 1.5Abs)에 비해 보다 잘 부착된다 (도 17). 양 세포 종류를 혼합물로 접종했을 때의 결과는 골아세포 및 혈소판 각각의 값을 합한 값과 거의 일치한다 (약 6.5Abs).
상기의 결과는, 각종 세포-선택성 RGD 펩타이드로 이식물 표면을 코팅하는 것이, 선택된 세포 종류의 바람직한 부착을 매개하는 이식물 제조에 사용될 수 있음을 확인해준다. 이 경우에, 골아세포와 혈소판 비교에 의해 하기를 알 수 있다;
- 인테그린-선택성 RGD 펩타이드로 표면 코팅하는 것은, 이러한 특수 인테그린이 결핍되었거나 소량만을 소지한 세포와 비교하여, 상보적인 인테그린 보충을 갖는 세포 종류의 부착을 현저하게 자극할 수 있고,
- 이러한 효과는 세포 혼합물, 즉 생체 내 상태와 매우 유사한 경우에도 유지된다.

Claims (14)

  1. 인간 및 동물의 상이한 기관에 적당하고, 전달체 매트릭스와 이 매트릭스를 감싸는 펩타이드 코팅으로 기본적으로 구성되는 이식물로서, 펩타이드 코팅은 인간 또는 동물 신체 세포의 표적화된 부착의 자극을 위한 동일하거나 상이한 펩타이드를 포함하며, 이러한 펩타이드는 인간 또는 동물 세포상의 부착을 담당하는 인테그린 리셉터에 대한 결합 부위를 인식하는 서열을 가지며, 전달체 매트릭스는 상기 펩타이드 층의 적절한 반응성 작용기와 안정한 공유 결합을 형성할 수 있는 결합 가능 반응기를 그 표면상에 가지고, 펩타이드와 부합되는 상이한 구조관련 세포 부착-자극 활성에 의거하여, 이식물이 삽입되는 세포의 특정 지역 내에서 펩타이드와 결합하는 조직세포의 상이하며 상보적인 천연 인테그린 패턴에 대해 펩타이드가 특이적으로 일치하도록 상기 펩타이드가 이식물 표면에 배열되어, 이러한 방식에 의해 지역적으로 차별화되고 선택적이면서 생활성인 이식물 표면의 코팅 패턴이 존재함을 특징으로하는 이식물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드가 앵커 분자의 도움으로 이식물 표면에 부착됨을 특징으로 하는 이식물.
  3. 제 1 항에 있어서, 앵커 분자가 하기 구조 중의 하나로 구성됨을 특징으로 하는 이식물:
    -CO-(CH2)k-X-SH, (i)
    X는 단일 결합 또는 -CO-NH-(CH2)l-,
    k는 2 내지 12 및 l은 2 내지 4,
    -CO-(CH2)m-[NH-CO-(CH2)n]p-NH-CO-CH=CH2, (ii)
    m과 n은 2 내지 8; p는 0 내지 2,
    -(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)q-CO-(CH2)r-NH-CO-CH=CH2, (iii)
    q는 1 내지 3 및 r은 2 내지 8.
  4. 제 3 항에 있어서, 앵커 분자가 하기 구조 중의 하나로 선택됨을 특징으로 하는 이식물:
    -CO-CH2-CH2-SH, (ia)
    -CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH, (ib)
    -CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2, (iia)
    -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2, (iib)
    -CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2, (iiia)
    -(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)2-CO-(CH2)5-NH-CO-CH=CH2(iiib).
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드는 앵커 분자의 카르복시기를 통한 아미드 결합에 의해 이식물 표면에 결합하고, 앵커 분자는 머르캅토 또는 아크릴레이트기를 통하여 이식물 표면에 결합됨을 특징으로 하는 이식물.
  6. 제 5 항에 있어서, 비코팅 물질 표면과 펩타이드의 세포 인식 도메인 간의 입체적인 임계 절대 최소 거리가 2.5 내지 3.5nm가 되도록, 이식물 표면에 상기 펩타이드 앵커 분자가 결합됨을 특징으로하는 이식물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드가 αvβ3-/αvβ5-발현 세포에 결합할 수 있음을 특징으로 하는 이식물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 RGD를 함유하는 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 이식물.
  9. 제 8 항에 있어서, 시클로-RGDfK 서열 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 이식물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 앵커 분자와 전달체 매트릭스 표면 사이에서 표면 확장 효과를 도모하는 부착-촉진 중간층 및/또는 분지 분자를 포함함을 특징으로 하는 이식물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 전달체 매트릭스는 적절하게 성형된 세라믹, 중합체 물질, 금속 물품 또는 이들 물질로 만들어진 구조 성형물로서, 생체내 또는 생체외에서 세포 군락화에 의한 생하이브리드 기관화될 수 있음을 특징으로하는 이식물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항에 따른 이식물 제조 공정으로서, 하기를 특징으로 하는 공정:
    (i) 생체내로 이식물이 삽입될 표적 기관의 인테그린 리셉터 구조를, 생체외 테스트 시스템에서 검증하고,
    (ii) 적절한 상보 구조를 소지한 상기 펩타이드를 선택 또는 합성하고,
    (iii) 상기 펩타이드는, 임의로 개질되는 각각의 이식물 표면에 직접적으로 또는 상기 앵커 분자를 통하여 공유 결합되며, 이식물 표면의 상이한 펩타이드의 지역적인 배열은 이식물이 삽입되는 상보적인 인테그린 패턴을 소지한 표적 세포의 미리 검증된 지역적인 배열에 관한 사실과 일치한다.
  13. 제 12 항에 있어서, 표적 조직 인테그린 리셉터 구조의 생체외 검증은, 면역조직학적으로 활성인 항체를 이용하여 시행함을 특징으로 하는 공정.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 앵커 분자의 이식물 표면에 대한 커플링은, 다른 타입의 코팅에 공지된 공정으로 시행함을 특징으로 하는 공정.
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