KR20030087430A - Ｔｉ 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝을 통하여 선별한 Ti 금속에 특이적으로 부착하는서열번호 1내지서열번호 7로 기재되는 올리고 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 펩타이드는 Ti 금속과 생체분자간의 연결물질(linker)로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｔｉ 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드{Oligopeptide which binds specifically to Ti metal}

본 발명은 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝을 통하여 선별한 Ti 금속에 특이적으로 부착하는서열번호 1내지서열번호 7로 기재되는 올리고 펩타이드에 관한 것이다.

영구치는 한 번 빠지면 다시 나지 않으나 이제는 치과용 임플란트(implant)가 빠진 영구치를 대신할 수 있게 되었다. 1952년 스웨덴의 의학연구소에서 티타늄(Titanium) 금속이 뼈에 단단하게 부착되는 골융합현상을 발견하였으며, 상기 특성을 이용하여 정형외과 등의 여러 의학 분야뿐만 아니라 치과에도 도입되어 결손된 치아 부위를 수복하는데 획기적인 시술방법의 전환이 일어나게 되었다.

임플란트란 인공치근 이식술을 의미하는 것으로서, 치아가 빠진 부분에 Ti 금속으로 만들어진 인공 치근을 턱뼈에 이식하여 뼈와 엉겨붙게 고정시킨 후 이것을 이용하여 인공적으로 치아를 해 넣는 방법이다.

현대 치의학의 궁극적인 목적은 치아가 손실 또는 상실된 경우 정상적인 치아의 형태, 기능, 심미성, 편안함, 발음 그리고 건강을 회복하는 데 있다. 구강 내에서 자연치가 상실된 경우 보편적으로 사용되고 있는 방법은 상실된 치아가 많은 경우에는 틀니, 상실된 치아가 적은 경우에는 고정성보철물(크라운 ,브릿지)로 시행되고 있는데, 이러한 시술의 경우에는 치아삭제로 인한 인접 치아의 손상을 가져오고 또한 틀니 자체의 근원적인 불편함으로 인하여 이공치아 이식술이 도입되었다. 즉, 인공치아 이식술이란 구강내에 치아가 상실된 경우 인공적인 대치물을 턱뼈 속으로 삽입하여 뼈에 고정시킴으로써 원래의 자연치와 유사하게 작용할 수 있도록 도와주는 것이다. 이러한 인공치아(임플란트)는 자연치가 상실된 여러 환자들이 자연스러운 미소와 발음을 할 수 있고, 또한 편안하게 저작할 수 있도록 도와준다.

임플란트는 여러 가지 장점이 있는데, 먼저 브릿지처럼 치아를 갈아서 손상시키지 않도록 하고, 틀니나 브릿지처럼 남아 있는 치아에 전혀 부담을 주지 않으므로 치아의 수명이 길어지게 되며, 틀니처럼 끼웠다 뺐다 하는 불편이 없고, 틀니처럼 식사나 이야기 도중 빠질 염려가 전혀 없으며, 틀니처럼 이물감이나 입안 가득 무엇이 들어 있는 듯한 감각이 없으므로 자기 치아와 같은 편안함을 준다. 또한, 틀니를 오래 쓸 경우 턱뼈가 흡수되어 줄어들거나 약해지지만 임플란트는 턱뼈를 건강한 상태로 유지시켜주고 심리적으로도 안정시켜 주기 때문에 대인관계나 생활에 자신감을 갖게 해 준다.

인공치아의 재료는 거의 대부분은 CP Ti 금속을 사용하는데, 각 제조회사에서는 그들의 특성에 따라 여러 종류의 형태와 특수한 표면 처리로 제품화하여 시판하고 있다. 이들 중 대부분은 루트 형태(root form)로서, 표면의 형태는 스크루(screw) 모양이고 표면의 처리는 마모시킨(polished) 형태, 분사(sandblast)시킨 형태, Ti 플라즈마 분사(plasma-sprayed) 및 HA 플라즈마 분사 형태인 것이 대부분을 차지한다.

상기와 같이, 치과용 임플란트 재료로 중요하게 사용되는 Ti 금속은 인공치아를 외과적으로 삽입한 후 골의 유착을 위하여 3 내지 6개월씩 기다려야 하기 때문에 환자들이 많은 고통을 호소하는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝을 통해서 Ti금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드를 선별하였으며, 상기 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드가 치과용 임플란트로서 많이 사용되고 있는 Ti 금속과 생체에 대한 친화성을 높이는데 필요한 생체분자간의 연결물질(linker)로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드를 제공하는 것이다.

도 1은 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 본 발명의 올리고 펩타이드의 서열을 분석한 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 올리고 펩타이드는서열번호 1내지서열번호 7로 기재되며, Ti 금속에 특이적으로 부착한다. 상기 올리고 펩타이드는 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝을 통하여 선별되며, 치과용 임플란트로서 많이 사용되고 있는 Ti 금속과 생체에 대한 친화성을 높이는데 필요한 생체분자간의 연결물질로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 대장균에서 발현되는 펩타이드 라이브러리의 제조

본 발명자들은 Ti 금속에 부착하는 무작위의 아미노산 부위를 스크리닝하기 위하여, 티오레독신(thioredoxin)의 활성 부위에 발현될 수 있는 융합 단백질 형태로 무작위의 아미노산 서열을 발현시켰다. 구체적으로, 무작위의 아미노산 서열을 티오레독신의 활성부위를 포함하는 pFLITRIX 벡터에 삽입시켜 티오레독신과 융합된 단백질이 세포표면에 노출될 수 있도록 하였다. 상기의 방법으로 발현되는 FLITRIX 펩타이드는 PL 프로모터에 의해 발현이 조절되고 박테리오파지(bacteriophage) cI 억제제(repressor)에 의해 발현이 억제된다. 상기 박테리오파지 유래의 cI 억제제는 단백질의 발현을 강력하게 억제하는 역할을 하며, PL 프로모터의 조절 하에 있는 FLITRIX 펩타이드의 발현을 억제하게 된다. 그러나, 배지에 트립토판이 첨가되면 트립토판-trp 억제제의 복합체가 형성되며, 트립토판-trp 억제제의 복합체는 trp 오퍼레이터(operator)에 결합하게 된다. trp 오퍼레이터에 결합하게 되면 cI 억제제의 발현이 억제되고 cI 억제제의 조절하에 있는 FLITRIX 펩타이드의 발현이 유도된다.

<실시예 2> 대장균에서 발현되는 펩타이드 라이브러리를 이용한 스크리닝

본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 pFLITRIX 벡터를 대장균(E. coli)에 형질전환 시킨 후 암피실린이 첨가되어 있는 IMC 선택배지에서 배양하였다. 15시간동안 배양한 후 트립토판을 첨가하여 6시간동안 더 배양함으로써 FLITRIX 펩타이드의 발현을 유도하였다. 미리 Ti 금속을 고정한 배양접시를 블록시킨 후, 상기에서 발현이 유도된 대장균 형질전환체를 부착시켰다. 상기의 과정을 반복적으로 시행하여 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 펩타이드 후보군을 선별하였다.

<실시예 3> 자동염기서열 분석기를 이용한 펩타이드의 서열 분석

본 발명자들은 자동염기서열분석기(ABI Prism 377, 퍼킨엘머사, 미국)를 이용하여 ABI PRISMTMDye 종결 순환 시퀀싱(terminator cycle sequencing) 방법으로 염기서열 분석은 실시하였다. 구체적으로, PCR 증폭산물을 QIAquick PCR 정제 키트(QIAGEN사, 미국)를 이용하여 PCR 산물만을 정제해내었다. 상기 PCR 정제산물을 GeneQuant(파마시아사, 미국)를 이용하여 정량하였다. 자동염기서열분석을 위한 PCR 반응은 다음과 같다. 8.0 ㎕의 종결 반응 혼합물(terminator ready reaction mix, 퍼킨엘머사, 미국), 10-30 ng/㎕ 농도의 정제한 PCR 산물 5 ㎕, 6.4 pmole의 PCR 프라이머 쌍 1 ㎕ 및 증류수 6 ㎕를 첨가하여 전체 반응액의 부피를 20 ㎕가 되도록 조정하였다. PCR 반응은 GeneAMP PCR system 9600(퍼킨엘머사, 미국)을 이용하여 96℃에서 핫 스타트(hot start) PCR을 시작하여 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분으로 25 사이클(cycle)을 시행한 후 4℃로 급냉시켰다. 각각의 PCR 증폭산물에 3 M의 나트륨 아세트산(sodium acetate, pH 5.2) 1 ㎕와 100% 에탄올 25 ㎕를 가한 후 얼음에 30분간 정치시켜 PCR 산물의 침전반응을 증가시켰으며, 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 PCR 침전물(pellet)을 수집하였다. 상층액을 제거한 후, 염을 제거하기 위하여 70% 에탄올로 세척한 후 공기중에서 건조시켰다. 탈이온화된 포름아마이드(deionized formamide)와 25 mM EDTA/ 50 ㎎/㎖ 블루 덱스트란(bule dextran)을 5 대 1의 비율로 혼합한 시퀀싱 로딩 버퍼(sequencing loading buffer) 6 ㎕을 이용하여 침전시킨 PCR 산물을 부유시켰다. 상기 부유물을 90℃에서 2분동안 방치하여 변성시킨 후 얼음에서 급냉시켰다. 자동염기서열분석용 겔을 제조하기 위하여 18 g의 요소(urea)를 25 ㎖의 증류수에 용해시키고 5.625 ㎖의 40% 아크릴아마이드를 첨가한 후, 0.5 g의 혼합된 비드 레진(mixed bed resin)을 첨가하여 15분간 잘 교반함으로써 탈이온화(deionization)시켰다. 진공펌프를 이용하여 겔 용액을 0.2 μM 여과지로 거른 후 5분간 가스를 제거시켰다(degassing). 여기에 5 ㎖의 10×TBE를 첨가하고 최종부피가 50 ㎖가 되도록 증류수를 채운 후 4.5% 아크릴아마이드/6 M 요소(urea)/1×TBE 겔을 제조하였다. 자동 염기서열 분석기에 겔을 장치한 후 염기서열분석을 위하여 급냉시켰던 PCR 산물을 로딩하였다. 2×Run, 1,680 볼트로 7시간동안 전기영동을 실시한 후 ABI Prism Sequence Navigator와 ABI Prism Factura 등의 ABI Prism DNA 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.

상기의 방법으로 DNA 염기 서열을 결정함으로써, 본 발명자들은 Ti 금속에특이적으로 부착하는서열번호 1내지서열번호 7로 기재되는 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 Ti 금속에 특이적으로 부착하는 펩타이드는 치과용 임플란트로서 많이 사용되고 있는 Ti 금속과 생체에 대한 친화성을 높이는데 필요한 생체분자간의 연결물질로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

1. Ti 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드.
2. 제 1항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고 펩타이드.
3. 제 1항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고 펩타이드.
4. 제 1항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고 펩타이드.
5. 제 1항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고 펩타이드.
6. 제 1항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고 펩타이드.
7. 제 1항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고 펩타이드.
8. 제 1항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고 펩타이드.