CN1098863C

CN1098863C - 光固化交联透明质酸凝胶、其制备方法和生物医学材料

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Publication number: CN1098863C
Application number: CN96199650A
Authority: CN
Inventors: 胁道典; 宫本建司
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1995-11-15
Filing date: 1996-11-14
Publication date: 2003-01-15
Anticipated expiration: 2016-11-14
Also published as: KR100509882B1; US6031017A; HK1015799A1; ES2179215T3; NO982212D0; HUP0000390A3; EP0861270B1; DE69622575T2; AU7587296A; NO982212L; ATE221086T1; JPH11512778A; HU224697B1; CA2237192A1; EP0861270A1; CN1207744A; KR19990067621A; AU722250B2; JP3439481B2; CA2237192C

Abstract

一种光固化交联透明质酸凝胶，以频率10赫兹下动态粘弹性表示，其储能模量(G′)为50～1500帕，损耗模量(G″)为10～300帕，以及损失正切δ(G″/G′)为0.1～0.8；它是一种按下述方法制备的水凝胶，该方法包括：对有光反应交联基化学键合到透明质酸官能基上的光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，使光反应相互交联基交联；以及制备该凝胶的方法和其作为生物医学材料的应用。

Description

光固化交联透明质酸凝胶，其制备方法和生物医学材料

技术领域

本发明涉及一种生物相容的光固化交联透明质酸凝胶，它是一种具有特殊物理性能的水凝胶，以及其制备方法和作为生物医学材料的应用。

技术背景

透明质酸存在于动物组织内，具有生物相容性和生物降解能力。关于物理性能，它具有诸如吸水性能高等优良性能，还有其水溶液具有高粘性。

水凝胶由下述方法得到：化学改性透明质酸；采用某些方法使改性的透明质酸交联，形成网格结构；以及把含水介质如水加到网络结构中。水凝胶呈现粘弹性和粘性。

交联透明质酸表观上形成了大分子，而与成键方式无关。交联透明质酸的生物降解能力可以通过调节交联度控制。

有各种交联方式。例如：已知使用疏水键合或离子结合的交联方式，通过引入亲核试剂使透明质酸交联[JP-W-3-502704，(相当美国专利4937270)，本文用语“JP-W”意指未审查的已公开的国际专利申请]，通过使透明质酸酯化借助于疏水键合交联(美国专利4851521)，通过多价离子借助于离子键合交联(欧洲专利0507604A2)。因为与共价键比较，它们是通过弱键合力交联的，所以对外界变化的影响敏感，例如：pH，离子强度和温度等。另外，当将它们用作生物压学材料时，在生物体内的保持能力低，还有也难以控制其在体内的保持能力于适当水平以“保持透明质酸对生物体的生理作用。

此外，还已知通过共价键合将透明质酸分子键合的交联方式，借助于二乙烯基砜(divinglsulfone)交联[JP-B-4-30691(相当于美国专利4582865)，本文用语“JP-B”意指已审查的日本专利出版物]，以及借助环氧化物的交联[JP-W-61-502729(相当美国专利4,886,787)，JP-A-5-140201，本文用语“JP-A”意指未审查的已公开的日本专利申请]。然而，在这类交联中所使用的交联剂或交联化合物是有毒的。还有，当将二乙烯基砜、环氧化物等引入透明质酸的同时通过交联构成三维网络结构，所形成的交联透明质酸凝胶不溶于诸如水等溶剂。这样进入网络结构的未反应的低分子化合物就难于分离和脱除。

另一方面，还已知采用紫外线辐射进行光固化交联反应使透明质酸交联[JP-A-6-73102(相当美国专利5462976)，美国人工内脏学会志(ASAIO Journal)，38，M154～M157(1992)]。这种交联方式的优点是，引入了光反应交联基的光反应透明质酸衍生物在光固化交联之前是水溶性的，同时未形成三维网络结构，所以容易除去未反应的低分子化合物：该光反应本身是一种在生成的光固化交联透明质酸衍生物中不含未反应的低分子化合物的纯净反应(cleanreaction)；所产生的交联结构由共价键形成，因此通过控制交联度能够容易地控制光固化交联透明质酸衍生物的保持能力。

另外，当上述光固化交联透明质酸衍生物是用来作诸如抗粘连材料的生物医学材料时，已经研究类似薄膜状的材料[美国人工内脏学会志， 38，M154～M157(1992)]，但是难以预防在组织或器官的细小部位中的粘连。因此，需要一种能够注入这种细小部位的可注入的光固化交联透明质酸凝胶。

然而，本发明公开的光固化交联透明质酸的水凝胶及其制备方法尚属未知。

传统交联透明质酸水凝胶难以除去诸如未反应的低分子化合物等杂质，并且也难以控制水凝胶的物理性能。此外，制备具有目的物理性能水凝胶的条件也难以形成。

发明内容

本发明的第一个目的是，提供一种含有水介质的光固化交联透明质酸凝胶，该凝胶由下述方法制得：对引入光反应交联基的光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射；使光反应相互交联基二聚；形成环丁烷环，并借此形成网络结构；以及提供易于制备上述凝胶的方法。

本发明的第二个目的是提供一种可注入的生物医学材料，该材料包含一种安全性、生物相容性和生物降解能力均优良的光固化交联透明质酸凝胶。

作为本发明者充分研究的结果，采用下述各项成功地达到了上述目的：

1)一种光固化交联透明质酸凝胶，

以动态粘弹性表示，其储能模量(G＇)为50～1500帕，损耗模量(G″)为10～300帕，损失正切δ(G″/G＇)为0.1～0.8；其测定方法是采用流变仪在下述条件下进行：

测定方法：振动试验法，应力控制

测定温度：37℃

测定外形尺寸：4厘米

间隙：800微米

频率：10赫兹；以及

它是一种按下述方法制备的水凝胶，该方法包括：对其中含化学键合到透明质酸官能基上的光反应交联基的光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，使光反应交联基相互交联；

2)一种光固化交联透明质酸凝胶，

其交联度为每摩尔透明质酸二糖成分单元的0.01～0.5％；以及

它是一种按下述方法制备的水凝胶，该方法包括：对其中含化学键合到透明质酸官能基上的光反应交联基的光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，使光反应相互交联基交联；

3)一种光固化交联透明质酸凝胶，

其吸水率为2000～15000％，吸水率的定义如下：

吸水率(％)＝吸收的水的重量/干凝胶重量×100，以及

4)按照上述1)～3)中任何一项的光固化交联透明质酸凝胶，

其中所述的光反应交联基，是一种含有间隔基的肉桂酸衍生物，并且是化学键合到透明质酸官能基上，从而提供所述的光反应透明质酸衍生物；

使所述光反应透明质酸衍生物的所述光反应相互交联基通过紫外线辐射二聚，形成环丁烷环，借此形成网络结构；以及

所述的凝胶是一种在所述网络结构中含有水介质的水凝胶；

5)按照上述4)的光固化交联透明质酸凝胶，其中所述的间隔基是从氨基醇、氨基酸或肽衍生的基团；

6)按照上述4)或5)的光固化交联透明质酸凝胶，其中所述光反应交联基用如下通式(1)或(2)表示：

-NH(CR¹R²)_nOCOCH＝CH-Ph (1)式中：R¹和R²彼此独立代表氢原子或含1～8个碳原子的烷基；Ph代表苯基；而n代表整数2～18；

-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR³ (2)式中，R³代表含1～8个碳原子的烷基或芳烷基；A代表-(NHCR⁴R⁵CO)_m-或-NH(CR⁴R⁵)_hCO-；R⁴和R⁵彼此独立代表氢原子或含1～8个碳原子的烷基；-Ph-代表对亚苯基；m代表整数1～6；以及h代表整数1～18；

7)按照上述1)～6)中任何一项的光固化交联透明质酸凝胶，其中引入的所述光反应交联基的比例为每摩尔二糖单元成分的0.05～10％；

8)一种光固化交联透明质酸凝胶，

测定方法：振动试验法，应力控制

测定温度：37℃

测定外形尺寸：4厘米

间隙：800微米

频率：10赫兹；以及

它是一种按下述方法制备的水凝胶，该方法包括：对其中含化学键合到透明质酸官能基上的光反应交联基的光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，使光反应相互交联基交联，然后对交联产物进行热处理；

9)一种光固化交联透明质酸凝胶，

测定方法：振动试验法，应力控制

测定温度：37℃

测定外形尺寸：4厘米

间隙：800微米

频率：10赫兹；以及

它是一种按下述方法制备的水凝胶，该方法包括：对其中含化学键合到透明质酸官能基上的光反应交联基的光反应透明质酸衍生物进行热处理；然后对加热过的光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，使光反应相互交联基交联；

10)一种光固化交联透明质酸凝胶，

测定方法：振动试验法，应力控制

测定温度：37℃

测定外形尺寸：4厘米

间隙：800微米

频率：10赫兹；以及

它是一种按下述方法制备的水凝胶，该方法包括：对其中含化学键合到透明质酸官能基上的光反应交联基的光反应透明质酸衍生物进行热处理；然后对加热过的光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，使光反应相互交联基交联，以及然后再对交联产物进行热处理；

11)按照上述1)～10)中的任何一项的光固化交联透明质酸凝胶，其中凝胶的内毒素含量为0.25EU/g(内毒素单位/克)或者更低；

12)一种制备光固化交联透明质酸凝胶的方法，包括：

对含有0.5～10％重量的光反应透明质酸衍生物的水介质溶液进行紫外线辐射，其中透明质酸的官能基上化学键合了光反应交联基；和

通过光反应相互交联基二聚，形成分子间和/或分子内交联，得到网络结构；

13)按照上述12)制备光固化交联透明质酸凝胶的方法，其中，在用紫外线辐射所述光反应透明质酸衍生物的水介质溶液之前和/或之后，对其进行热处理；

14)按照上述13)制备光固化交联透明质酸凝胶的万法，其中，所述热处理采用高压蒸汽在100～125℃下进行5～30分钟；

15)一种生物医学材料，它包含按照上述1)～11)中任何一项的光固化交联透明质酸凝胶；

16)按照上述15)的生物医学材料，它具有抗粘连作用；

17)一种生物医学材料器材，它包含交联透明质酸凝胶，和以可取出的形式装有所述凝胶的容器；

18)按照上述17)的生物医学材料器材，其中，所述容器是能够将所述凝胶排出以便注入的容器；

19)一种生物医学材料器材，它包含1)～11)中任何一项叙述的光固化交联透明质酸凝胶，和以可取出的形式装有所述凝胶的容器；以及

20)按照上述19)的生物医学材料器材，其中所述容器是能够将所述凝胶排出以便注入的容器。

附图简述

图1表示在光反应透明质酸衍生物溶液中进行光固化交联的基本原理。

图2是光固化交联透明质酸凝胶的DS(取代度)和吸水率关系图。

实施本发明的最佳方案

现将本发明详细解释如下。

本发明使用的术语“光固化交联透明质酸衍生物”，作为一个概念，是用来包括一种用下述方法制备的衍生物，该方法包括：对其中含有化学键合的光反应交联基的光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，以及使光反应相互交联基二聚，使透明质酸衍生物交联并借此形成网络结构。本发明所使用的术语“光固化交联透明质酸凝胶”，作为一个概念，意指一种水凝胶，在光固化交联透明质酸(下文有时简称为“本发明的凝胶”)的网络结构(三维网络结构)中，包含水介质，例如：水、缓冲剂、生理盐水缓冲生理盐水、含有作为分散介质的可溶于水的有机溶剂的水溶液。本发明所使用的术语“透明质酸官能基”是用来包括存在透明质酸中的、能够与光反应交联基化学键合的官能基。官能基的典型实例是羧基和羟基。本发明所使用的术语“低级烷基”或“低级烷氧基”是用来包括含有1～8个碳原子的烷基或烷氧基，优选1～4个碳原子。

在本发明凝胶中，首先以粘弹性表示其物理性能，其次以交联度表示交联结构。

对本发明的光反应透明质酸衍生物中的光反应交联基没有特别限制，只要所述基团含有能够通过紫外线辐射二聚形成环丁烷环的1，2-亚乙烯基，并且所述的基团衍生自肉桂酸或其取代衍生物[例如：下述肉桂酸衍生物等，其中在肉桂酸苯环上的任何位置的一个或两个氢被以下基团取代：低级烷基(如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和叔丁基等)、低级烷氧基(如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基等)、氨基和羟基等]，羧基-低级烷基胸腺嘧啶[例如：1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶等]，羧基-低级烷基取代的香豆素(例如：7-香豆酰氧乙酸等)等等。其中，特别优选引入了从肉桂酸或其衍生物衍生的基团的光反应交联基。另外，作为光反应交联基，还优选从键合了间隔基的光反应化合物如肉桂酸等衍生的基团。所优选的间隔基包括有两个或两个以上官能基的间隔基，这些官能基能够键合到诸如肉桂酸等光反应化合物的官能基以及透明质酸的官能基上。具体地说，所优选的是氨基酸或其衍生物、肽和氨基醇等，更具体地说，最优选的是氨基醇。可以将光反应交联基引入透明质酸的糖化物成分的任何官能基上，例如N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸，但是特别优选的是把所述的交联基引入D-葡糖醛酸的羧基上。

就应用肉桂酸作光反应交联基、氨基醇作间隔基而论，例如，优选具有如下结构的光反应透明质酸衍生物，其肉桂酸的羧基通过酯键化学键合到氨基醇的羟基上，而氨基醇的氨基通过酰胺键化学键合到透明质酸的羧基上。就应用氨基肉桂酸作光反应交联基、氨基酸或肽作间隔基而论，优选具有如下结构的光反应透明质酸，其间隔基的羧基通过酰胺键化学键合到氨基肉桂酸的氨基上，而所述的氨基酸或肽的氨基通过酰胺键化学键合到透明质酸的羧基上。

具体地说，对于键合了间隔基的光反应交联基，特别优选的是下述通式(1)或通式(2)表示的那些基团。

-NH(CR¹R²)_nOCOCH＝CH-Ph (1)在式(1)中，R¹和R²彼此独立代表氢原子或低级烷基(优选含有1～4个碳原子)；Ph代表苯基，它不仅可以是用C⁶H⁵表示的基团，而且也可以是包含下述取代苯环的基团，即在苯环任何位置的一个或两个氢原子被一个或两个取代基取代，取代基选自含有1～4个碳原子的低级烷基或烷氧基、氨基和羟基等；n代表整数2～18，优选2～12。

通式(1)所表示的光反应交联基是化学键合到，例如通过酰胺键化学键合到透明质酸的羧基上，形成光反应透明质酸衍生物。

-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR³ (2)在式(2)中，R³代表低级烷基，优选含1～4个碳原子的烷基(例如：甲基、乙基等)或含有7～20个碳原子的芳烷基，优选苄基或苯乙基；A代表-(NHCR⁴R⁵CO)_m-或NH(CR⁴R⁵)_hCO-；R⁴和R⁵彼此独立代表氢原子或低级烷基(优选含有1～4个碳原子)；Ph代表对亚苯基，它不仅可以是由-C₆H₄-表示的基团，也可以是包含下述取代苯环的基团，即苯环上邻位或间位的氢原子被含1～4个碳原子的低级烷基或烷氧基、氨基、羟基等取代；m代表整数1～6，优选为1～3；h代表整数1～18，优选为1～12。

对用于本发明的透明质酸没有特殊限制；然而，通常使用重均分子量为10,000～5,000,000的透明质酸作原料。可以按照用途选择不同分子量。优选重均分子量为500,000～3,000,000，更优选800,000～2,500,000。在如下合成方法中，优选使用透明质酸的水溶性盐，例如碱金属盐(如钠盐、钾盐等)，碱土金属盐(如钙盐等)等，但是也能使用其他盐或游离酸，只要它们溶于所使用的反应溶剂，且不干忧反应。下文使用的术语“透明质酸”往往包括它的盐。

用于本发明的光反应透明质酸衍生物的制备方法，包括：将透明质酸溶解于，例如，水或水溶液中，后者含有可与水溶混的有机溶剂[例如：二噁烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酰胺、醇(例如：甲醇、乙醇)、吡啶等]；然后在水溶性碳化二亚胺[例如：1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺氢氯化物(下文缩写为“EDC·HCl”、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺甲碘化物、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺氢氯化物]和缩合辅助剂(例如，N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基苯并三唑等)存在下，通过，例碳二亚胺法，引入光反应交联基。

反应后能够以普通方法提纯所得产物，例如：乙醇沉淀或透析(dialysis)。在提纯和干燥之后，可以采用分光光度计测定产物在约269纳米下的吸光度，从而得到所得光反应透明质酸衍生物的取代度(下文缩写为“DS”，DS是每个透明质酸的二糖成分单元所引入的光反应交联基的比率)。

无菌的和基本无内毒素(例如内毒素含量为0.25EU/g或更低)的光反应透明质酸衍生物和光固化交联透明质酸凝胶可以通过使用无菌或基本无内毒素的试剂、水和容器等、并注意制备工作环境的无菌处理得到。

将光反应交联基引入透明质酸所使用的具体化合物包括下列通式(1-1)或(2-1)所表示的化合物：

H₂N(CR¹R²)_nOCOCH＝CH-Ph (1-1)式中：R¹、R²、Ph和n与上述限定相同。

H-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR³ (2-1)式中：A，-Ph-，和R³与上述限定相同。

化合物(1-1)和(2-1)优选以盐的形式应用，例如，酸加成盐如氢氯化物、氢溴化物、氢氟化物等，特别优选氢氯化物。

具体地说，化合物(1-1)的氢氯化物(1-2)能按照如下反应路线合成：

第一反应

第二反应

式中：R⁶代表能够用酸裂开的氨基保护基，例如：叔-丁氧基羰基等；X代表卤原子，例如：氯原子等。

这里，具体地说，本发明按下述方法合成化合物(1-2)。

将有机溶剂(如氯仿等)加到化合物(3)中，然后，在冰冷却下向其中加入有机碱(如三乙基胺等)。顺次向其中加入化合物(4)和碱性催化剂(如：4-二甲基-氨基吡啶等)。在室温下搅拌该混合物后，向反应混合物中加入有机溶剂(如醋酸乙酯等)，然后依次用下述洗涤该混合物，包括：几份弱酸水溶液、水、几份弱碱水溶液、水和饱和氯化钠水溶液等。所分离出的有机溶液层置于无水硫酸钠等上方干燥。过滤除去干燥剂等。在减压下干燥滤液得到化合物(5)。

在冰冷却下，将1～5M的氯化氢有机溶剂(如：二噁烷等)的溶液加入化合物(5)，随后搅拌。加有机溶剂(如二乙醚等)于其中，过滤收集所沉淀的结晶。用有机溶剂洗涤该结晶，然后在减压下干燥，得到化合物(1-2)。

具体地说，能够按下述反应路线合成化合物(2-1)的氢氯化物(2-2)：

第一反应

第二反应式中：R³和R⁶如上述所限定。

另外，具体地说，按下述方法合成化合物(2-2)。

将有机溶剂(如氯仿等)加到化合物(6)中，再在有机碱(如三乙胺等)存在下加入活化剂(如：二甲基～硫膦基氯化物等)，同时用冰冷却，借此使化合物(6)的羧基活化。化合物(6)活化后，在有机碱(如三乙基胺等)存在下将化合物(7)加入其中，同时冰冷却，随后在室温下搅拌。向反应混合物加入有机溶剂(如醋酸乙酯等)，依次用下述洗涤所得混合物，包括：几份弱酸水溶液、水、几份弱碱水溶液、水、饱和氯化钠水溶液等。所分离出的有机溶剂层置于无水硫酸钠等上方，干燥。过滤除去干燥剂等，在减压下干燥滤液，得到化合物(8)。

在冰冷却下，将A1～5M氯化氢有机溶剂(如二噁烷等)的溶液加到化合物(8)中，随后搅拌。向其中加入有机溶剂(如二乙醚等)，过滤收集沉淀的结晶，用有机溶剂洗涤，在减压下干燥，得到化合物(2～2)。

加到光反应交联基中的间隔基的存在对改善光反应透明质酸衍生物的光反应性起很大作用，这种改善取决于间隔基的自由度和疏水键合性能。间隔基引起的光反应性敏感性的改善，使得在低引入比例的光反应交联基存在下就能够实现光固化交联，迄今光固化交联还难以在这种条件下进行。

按照传统工艺，当对上述光反应透明质酸衍生物进行光辐射交联时，首先将光反应透明质酸衍生物的水溶液置于一个容器等上，干燥成薄膜或类似形状，然后用紫外线辐射，得到光固化交联透明质酸薄膜。薄膜不仅易传输紫外线，而且，在薄膜成形期间，因为光反应交联基的疏水性，当薄膜脱水或蒸发水时，使其彼此取向靠近。已经证实，所形成的这种状况有利于光反应。例如：在光反应交联基是肉桂酸残基的情况下，当肉桂酸残基彼此之间的距离为4时，通过特定波长的紫外线辐射，分子能二聚，即交联，但是在其他分子间距离下不能。所以，认为能使光反应交联基彼此靠近的薄膜形成是实现光反应的重要步骤。另外，反式肉桂酸在上述条件下通过紫外线辐射能二聚，而其他几何异构体(即顺式肉桂酸)对于二聚而言是不活泼的。当对传统光反应透明质酸衍生物水溶液用紫外线辐射时，认为交联难以进行，因为水分子似乎妨碍光反应交联基彼此靠近，并且比起二聚来主要进行反式成为顺式的异构化作用。

本发明者发现，形成光固化交联透明质酸凝胶的步骤包括：制备高浓度光反应透明质酸衍生物的水溶液，以便光反应交联基彼此更频繁地靠近；使溶液层成为紫外线易于透射的形状，随后对其进行紫外线辐射。

按照本发明，当对光反应透明质酸进行紫外线辐射时，通过适当选择光反应条件，如光反应溶液浓度、紫外线辐射时间等，或者DS，能够得到具有诸如粘弹性等目的物理性能的光固化交联透明质酸凝胶。

优选待光辐射的在水介质中的光反应透明质酸衍生物溶液的浓度(下文往往称为“光反应浓度”)为约0.5～10％重量。用分子量约1,000,000的光反应透明质酸衍生物时，更优选浓度为1～4％重量。在较低浓度下，如下文所述，异构化作用发生优于二聚作用。相反，在较高浓度下，难以得到均匀凝胶。

当对低于所述规定浓度的较稀水溶液进行紫外线辐射时，如上所述，倾向于优先产生异构体。当继续用紫外线辐射时，透明质酸糖化物链本身因受紫外线的作用而分解，结果分子量降低。从这些观点出发，重要的是创造一种光固化交联反应有效进行而对透明质酸的糖化物链无有害影响的反应环境。所以必需制备上述规定浓度的水溶液。图1表示在水介质中进行光固化交联的基本原理，其中，(a)表示在稀溶液中紫外线辐射光反应透明质酸衍生物的变化。水分子妨碍光反应交联基彼此进行易于交联的分子排列，主要结果是异构化作用。(b)表示在规定浓度的溶液中，进行紫外线辐射，光反应透明质酸衍生物的变化。与在稀溶液中比较，疏水光反应交联基受水分子干扰较少，似乎通过疏水键合力彼此吸引，取得了易于交联的分子排列。这样光反应交联基通过辐射而二聚，同时包含水介质，借此实现交联。为了改善在规定浓度的溶液中交联作用的光反应性，特别优选使用引入了含有上述间隔基的具有高柔韧性的光反应交联基的光反应透明质酸衍生物。

上述光反应浓度取决于引入到透明质酸中的光反应交联基的取代度(DS)。DS能够以每个透明质酸的二糖成分单元引入的光反应交联基的比率(％)为基础计算。例如：每个二糖成分单元有一个光反应交联基的光反应透明质酸衍生物的DS是100％，或者每200个糖化物成分单元含有一个，则DS是1％。在相同光辐射条件下DS越低，交联比越小。

在本发明中，为了在上述规定的光反应浓度下实现交联，在透明质酸分子量等于或大于500,000的情况下，光反应透明质酸衍生物的DS可以约为0.05～10％，优选约为0.3～5％，更优选约为0.5～3％，然而可以依起始透明质酸的分子量变化。

作为待光辐射的光反应透明质酸衍生物溶液的溶剂，水介质包括水、缓冲剂、生理盐水、缓冲生理盐水等。对于生物医学材料应用，特别优选缓冲剂、生理盐水、缓冲生理盐水[例如：磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)等]。当应用含水介质而不是水时，能用介质种类和溶质浓度精细控制本发明所制凝胶的物理性能，取决于用途进行适当选择。

光反应透明质酸衍生物溶液通常由下述的方法制得：光反应透明质酸衍生物只要从合成反应系统分离并提纯出来，就溶于水介质中。作为光反应透明质酸衍生物溶液，在某些情况下，光反应透明质酸衍生物可以照合成反应系统中的原来样子使用，或者以其浓缩状态使用。

当光反应透明质酸衍生物的DS固定时，形成环丁烷环的比例，即交联比，往往随着上述光反应浓度的范围的变化而变化，因此所制凝胶的物理性能也变化。随着光反应浓度的增加，交联比似乎也增加，正如测定光固化交联透明质酸凝胶的粘弹性所证实的那样，凝胶的弹性也增加。随着交联比的增加，网络结构变得较致密。在光固化交联透明质酸凝胶中的环丁烷环的比例可称为交联度，交联度是DS和交联比的乘积，并以每个透明质酸二糖成分单元的二聚体摩尔比率(％)表示。优选交联度的范围为每摩尔透明质酸二糖成分单元0.01～0.5％。

干燥了的光固化交联透明质酸凝胶(下文简称“干凝胶”)的吸水率受交联度的影响，因此吸水率就成了交联度的一种度量。以下式表示吸水率：

吸水率(％)＝所吸收的水的重量/干凝胶的重量×100随着交联度即交联比的增加，网络结构变得较致密，所吸收的水减少，因此干凝胶的吸水率下降。当干凝胶吸水率是将其在作为含水介质的生理盐水(0.9％氯化钠水溶液)中浸渍24小时之后进行测定时，本发明的干凝胶吸水率通常约为20(×100％)～150(×100％)，优选30(×100％)～120(×100％)，更优选40(×100％)～100(×100％)。

本发明的凝胶可以是含有0.5～10％重量光固化交联透明质酸衍生物的凝胶，按透明质酸含量计。特别是，优选从重均分子量为约1,000,000的光反应透明质酸衍生物制备的光固化交联透明质酸凝胶中透明质酸含量为1～4％重量。

能够以动态粘弹特性表示凝胶的粘弹性方面的物理性能，例如：储能模量(G＇)、损耗模量(G″)和损失正切δ(tanδ：G″/G＇)等。储能模量高；损耗模量低，表示弹性高，意味着是硬凝胶。相反，损耗模量高，储能模量低，意味着凝胶具有高弹性。

本发明凝胶的物理性能，以频率10赫兹下动态粘弹性表示，其储能模量(G＇)为50～1500帕，优选为100～500帕；损耗模量(G″)为10～300帕，优选为50～150帕；损失正切δ(tanδ；G″/G＇)为0.1～0.8，优选为0.2～0.5。

在光辐射即紫外线辐射中，紫外线种类没有特别的限制。通常采用下述光源进行几秒钟至几分钟光辐射或紫外线辐射，所采用的光源提供含有光反应必须波长的光，即200～450纳米(例如：高压汞灯、金属卤化物灯等)，同时采用遮挡紫外线的滤波器等[如：派热克斯玻璃(商品名)等]遮挡二聚不需要的短波。对辐射方式没有特别限制，可按其用途适当选择各种方式。例如：将光反应透明质酸衍生物溶液装入作为盛本发明凝胶市售最终产品的容器中，然后按下述进行辐射；将所述溶液置于一对用透射紫外线的板材制的带式运输器之间，然后在运动中辐射；或者，将光反应透明质酸溶液送入并使其通过透射紫外线的材料制造的管的内部，并在送料的同时用紫外线辐射。

在制备本发明凝胶的过程中，即使光反应透明质酸衍生物水溶液，在用紫外线辐射之前和/或之后，用100～125℃高压蒸汽热处理5～30分钟(压热器处理)，也能得到具有上述规格粘弹性的凝胶。这种热处理相当于医用器具或医药所需要的消毒过程。

对于待紫外线辐射的光反应透明质酸衍生物溶液的状况，容纳该光反应溶液进行光反应的容器材料和形状、以及受紫外线照射的部分的材料和形状没有特别限制，只要紫外线能够透过就行。例如：它们可以是层状、管状、注射器状或小瓶状等。考虑到交联反应均匀性，其形状应利于紫外线能均匀充分地透过。使紫外线辐射薄溶液层特别适于得到均匀交联的凝胶。光反应容器的形状应能装光反应透明质酸衍生物溶液和所制得的光反应系统中的本发明的凝胶，该容器并不一定总需要是密闭容器。例如：容器可以是简单的板形。

在应用本发明凝胶作生物医学材料如抗粘连材料之处，优选保存本发明凝胶的容器的形状，应能够直至应用均能消毒保存所制得的本发明的凝胶，并且能从该容器适当地取出凝胶供应用。这种保存用的容器也可以用作光反应容器。直至应用时凝胶均能消毒保存的、并且凝胶易于被施加到给药体或部位(当凝胶用于抗粘连材料时，物体或部位是应防结连的损伤部位)的容器实例包括诸如注射器、管等容器。另外，易于取出和施加凝胶的容器的实例还包括诸如小瓶等容器。

当光反应透明质酸衍生物装到容器中、所装的光反应透明质酸衍生物被紫外线辐射进行上述光反应时，容器的材料必须选择透射紫外线并且不发生紫外线降解的材料。此外，在本发明凝胶是用来作为生物医学材料施加到人体的情况下，可以优选对光反应之后的凝胶采用，例如，高压蒸气(压热器处理)，进行消毒。当装到容器中的光固化交联凝胶采用压热器消毒进行消毒时，可以优选容器材料是玻璃、塑料以及抗热性达到某种程度的其他材料。对装入所述容器的凝胶量没有特别限制，然而，例如从操作，经济和其他方面考虑，其量约为0.5～500毫升。

上述光辐射得到的水凝胶可以脱水，例如：采用干燥等方法，然后通过加入需要量的水介质溶胀，提供具有本发明的上述物理性能的凝胶。在这种情况下，优选，采用对透明质酸糖化物链及交联结构没有有害影响的方法，进行干燥。

光固化交联透明质酸凝胶也有可能以上述干燥固体凝胶的形式贮存或运输，在应用之前用适当的水介质将其溶胀，紧接着以再溶胀的状态应用。

本发明凝胶作为生物医学材料具有很大用途。透明质酸所固有的高生物相容性和通过交联新增加的适于作生物医用材料使用的特性相结合，如在生物体内的持续时间延长(保持能力改进)以及改善的物理化学性能如粘弹性等，使本发明的凝胶非常适于在医用领域中应用。

因为本发明凝胶所包含的大部分是无害无毒水介质，所以对生物体没有毒性，并且具有高安全性。

更具体地说，本发明凝胶单次量大鼠腹膜内投药100毫升/千克[相当于每千克2000毫克透明质酸]，没有发生起因于凝胶的致死和严重异常。

此外，为研究自动过敏性进行了抗原性试验，实验中对豚鼠腹膜内用20毫克或2毫克本发明的凝胶致敏，然后再腹膜内给药40毫克该凝胶。结果，没有引起过敏性反应。

当用本发明的凝胶用作生物医学材料如抗粘连材料时，认为凝胶弹性增加，改善了组织间的阻隔效应和在体内的保持能力，而粘性增加改善了对组织的粘着性以及对受伤部位的可注射性。所以，对于这些应用理想的是，优选凝胶具有弹性和粘性的优良平衡。如果凝胶的G＇超过1500，或者损失正切δ小于0.1，则成为高弹性凝胶，所谓硬而脆的凝胶，难以注到受伤部位。另一方面，如果凝胶G＇小于50，或者损失正切δ超过0.8，那末成为其行为象溶液的高粘性凝胶，不能提供理想硬度，并且还失去了抗粘连作用所需要的阻隔效应。因此，认为本发明的凝胶具有作为抗粘连材料的最适合的物理化学性能。

器官粘连，例如：往往发生在手术之后，从临床观点看是不希望发生的，据此需要开发有效的抗粘连材料。抗粘连材料的理想特性是，该材料(1)在易发生粘连的器官之间具有阻隔作用；(2)在伤口部位具有覆盖性能；(3)不延缓伤口的愈合；(4)在伤口愈合期间保持在体内，并优选在愈合之后在体内分解并被吸收；(5)无害、无毒、生物相容等。

通过光固化交联得到的、具有优良生物相容性和安全性的本发明光固化交联透明质酸凝胶，达到了上述全部要求。特别重要的阻隔效应由交联凝胶的物理化学性能得到，而体内保持能力由形成的光固化交联网络结构得到。

凝胶的无定形性，例如，使凝胶能经注射嘴或针注射，即将凝胶装到注射器中，注射到微细损伤部位(例如创伤部位等)。就此而论，本发明凝胶的特征在于，具有比透明质酸溶液高得多的弹性，而且具有的硬度柔软得使其可通过注射器的针头。该凝胶也能通过较小直径的管子(注射嘴)注射到损伤部位，还期待着将其施用于腹腔镜显微手术等。

简言之，包含上述本发明凝胶的抗粘连材料的特征如下：

(1)具有优良抗粘连作用；

(2)是一种具有能注射到损伤部位的物理性能的水凝胶；

(3)当注射或施用时，具有对组织的高粘着性，也具有对组织的优良附着性，借此在必要的抗粘连期间内保持在损伤部位；

(4)无需除去，可以从施用目的部位如腹腔等被吸收、引起代射和排泄；以及

(5)具有安全性，在任何单次量毒性试验、多次量毒性试验和抗原性试验的动物实验中均没有发现安全向题。

当用本发明凝胶作抗粘连材料时，应用领域举例说明如下：

(1)产科和妇科领域：

与骨盆内手术同时发生的粘连的抗粘连，这些手术包括不孕症治疗、子宫手术、管的手术、卵巢手术、子宫内膜异位治疗手术、剖腹产术、骨盆内粘连切离术等。

(2)胃肠手术领域

在腹部手术等之后与肠粘连同时发生的粘连的抗粘连。

(3)矫形外科手术

与下述手术同时发生的粘连的抗粘连，包括跟腱手术、屈肌和腱的手术、关节成形术、椎板切除术等。

本发明凝胶作为生物医学材料应用于医学领域，除了上述的抗粘连材料之外，还有如下所述。

(1)眼科手术辅药。例如：在诸如眼内晶状体植入、全角膜移植术等手术中，将凝胶注入前房；或者在视网膜脱离等中，用凝胶保持眼内压；或者用凝胶补充玻璃体。

(2)关节功能改善剂。例如：将凝胶注入关节腔，其目的是减轻疼痛、改善关节可动范围、在诸如膝关节变形性关节炎、肩关节关节周炎等关节炎治疗中使生病滑液等正常化。

(4)成形外科领域缺损修复术。

(5)褥疮或烧伤敷料。

(6)缓释药品材料或制剂。

关于用本发明凝胶作抗粘连材料，不能规定对损伤部位施加的凝胶量，因为该量依施加部位的类型(如器官的种类等)、尺寸或状况和施加目的而变化。通常约为0.5～500毫升/部位，优选约为1～100毫升/部位，更优选约为2～50毫升/部位。

本发明光固化交联透明质酸凝胶具有三维网络结构。将药品加到网络中能够提供一种缓释(sustained release)药品的有用制剂。能够通过把干凝胶浸入含药品的溶液中将药品加到凝胶中。另外，因为光固化交联凝胶在交联后不需提纯，可以先将药品加到待辐射的光反应透明质酸衍生物的溶液中。上述任何方法均可以应用。

另外，能够将药品通过化学键(共价键、离子键等)化学键合到光反应透明质酸衍生物上，然后可以进行光反应交联。例如：当药品以共价键引入时，借助酰胺键或酯键可以使药品和光反应透明质酸衍生物的羧基或羟基结合在一起，然后进行紫外线辐射。另外，当通过离子键引入药品时，能借助离子键键合到透明质酸的羧基上的阳离子药品可以与光反应透明质酸混合，然后进行紫外线辐射。此外，含有键合药品的光反应交联基的光反应透明质酸衍生物也可以进行交联光反应。

实例

现参照制备实例、实例和试验实例较详细地叙述本发明，但是不言而喻，并不认为本发明仅限于此。

制备实例1

光反应透明质酸衍生物(DS 0.53％)的制备

在1.5升水中溶解10克(25毫摩尔二糖单元)透明质酸钠[Seikagaku公司的产品，重均分子量(Mw)为950,000]，然后将750毫升1，4-二噁烷加到该溶液中。每隔5分钟，向所得溶液顺序加入50毫升含有288毫克(2.5毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺的二噁烷溶液，50毫升含有1240毫克(1.25毫摩尔)EDC·HCl的水溶液和50毫升含有355毫克(1.25毫摩尔)HCl·H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh的水溶液，同时用冰冷却。在室温下搅拌该混合物8小时之后，加入10克氯化钠的水溶液，随后搅拌1小时。将所得溶液倒入5升乙醇中。离心过滤(4000转/分钟×15分钟)收集如此形成的目的沉淀物，顺序用3份80％乙醇和1份乙醇洗涤，然后干燥，得到9.73克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为0.53％，内毒素含量为0.8pg/mg)。

该制备实例和以下制备实例及实例中的内毒素含量采用ToxicolorSystem LS-20仪、DIA仪和Et-1仪测定。所有仪器均购自Seikagaku公司(商标名，下同)

光固化交联透明质酸凝胶的内毒素含量的测定方法，包括：先将实例中叙述的光固化交联透明质酸凝胶用酶(如：软骨素酶(chondroitinase)ABC，Seikagaku公司等产品)消化溶解，然后用上述方法进行测定。

关于内毒素含量，一个内毒素单位(EU)相当于345pg内毒素。

制备实例2

光反应透明质酸衍生物(DS 0.75％)的制备

本衍生物按与制备实例1相同的方法进行制备，使用10克(25毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)、65毫升0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺(3.25毫摩尔)二噁烷溶液、65毫升0.025M的EDC·HCl(1.625毫摩尔)水溶液，和65毫升0.025M HCl.H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh(1.625毫摩尔)水溶液。得到9.74克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为0.75％，内毒素含量为2.5pg/mg)。

制备实例3

光反应透明质酸衍生物(DS 0.90％)的制备

本衍生物按与制备实例1相同的方法进行制备，使用2.0克(5.0毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)、3毫升含有69毫克(0.6毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液、3毫升含有58毫克(0.3毫摩尔)EDC·HCl的水溶液，以及3毫升含有85毫克(0.3毫摩尔)HCl·H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh的水溶液。得到2.1克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为0.90％，内毒素含量为2.4pg/mg)。

制备实例4

光反应透明质酸衍生物(DS 1.06％)的制备

本衍生物按与制备实例1相同的方法进行制备，使用10克(25毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)、100毫升0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺(5.0毫摩尔)二噁烷溶液、100毫升0.025M的EDC·HCl(2.5毫摩尔)水溶液，和100毫升0.025M HCl·H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh(2.5毫摩尔)水溶液。得到9.64克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为1.06％，内毒素含量为3.2pg/mg)。

制备实例5

光反应透明质酸衍生物(DS 1.26％)的制备

本衍生物按与制备实例1相同的方法进行制备，使用5克(12.5毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)、50毫升的288毫克(2.5毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺的二噁烷溶液、50毫升的240毫克(1.25毫摩尔)EDC·HCl的水溶液，以及50毫升的355毫克(1.25毫摩尔)HCl·H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh的水溶液。得到4.9克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为1.26％，内毒素含量为1.0pg/mg)。

制备实例6

光反应透明质酸衍生物(DS 1.29％)的制备

本衍生物按与制备实例1相同的方法进行制备，使用10克(25毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)、50毫升0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(5.0毫摩尔)二噁烷溶液、50毫升0.05M的EDC·HCl(2.5毫摩尔)水溶液，和50毫升0.05M HCl.H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh(2.5毫摩尔)水溶液。得到10.0克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为1.29％，内毒素含量为2.5pg/mg)。

制备实例7

光反应透明质酸衍生物(DS 1.55％)的制备

本衍生物按与制备实例1相同的方法进行制备，使用10克(25毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)、150毫升0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺(7.5毫摩尔)二噁烷溶液、150毫升0.025M的EDC·HCl(3.75毫摩尔)水溶液，和150毫升0.025M HCl·H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh(3.75毫摩尔)水溶液。得到9.92克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为1.55％，内毒素含量为1.2pg/mg)。

制备实例8

光反应透明质酸衍生物(DS 1.93％)的制备

在600毫升水中溶解4.0克(10.0毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)，再加入300毫升1.4二噁烷于该溶液中。每间隔5分钟向所得溶液中顺序加入10毫升含有230毫克(2.0毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液，10毫升含有192毫克(1.0毫摩尔)EDC·HCl的水溶液以及10毫升含有284毫克(1.0毫摩尔)HCl·H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh的水溶液，同时用冰冷却。在室温下搅拌所得混合物24小时之后，将2.0克氯化钠的水溶液加入其中，随后搅拌。将所制得的溶液倒入3.0升乙醇中。离心分离(4000转/分钟×15分钟)收集如此形成的目的沉淀物，顺序用80％乙醇洗涤3次，用乙醇洗涤1次，干燥，得到4.1克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为1.93％，内毒素含量为2.1pg/mg)。

制备实例9

光反应透明质酸衍生物(DS 2.87％)的制备

本衍生物按与制备实例1相同的方法进行制备，使用10克(25毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)、50毫升含有864毫克(7.5毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺的二噁烷溶液、50毫升含有718毫克(3.75毫摩尔)EDC·HCl的水溶液、以及50毫升含有1.06克(3.75毫摩尔)HCl·H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh的水溶液。得到10克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为2.87％，内毒素含量为2.8pg/mg)。

制备实例10

光反应透明质酸衍生物(DS 2.28％)的制备

本衍生物按与制备实例1相同的方法进行制备，使用50克(125毫摩尔二糖单元)透明质酸钠(Seikagaku公司产品，Mw为950,000)、250毫升含有3.45克(30毫摩尔)N-羟基琥珀酰亚胺水溶液、250毫升含有2.88克(15毫摩尔)EDC·HCl的水溶液、以及250毫升含有15毫摩尔HCl·H₂N(CH₂)₆OCOCH＝CHPh的水溶液。得到49克光反应透明质酸衍生物白色固体(DS为2.28％，内毒素含量为3.2pg/mg)。

实例1

本实例涉及用下述制备方法得到的光固化交联透明质酸凝胶，该方法包括：在水溶液中使制备实例6中制得的光反应透明质酸衍生物进行光固化交联，随后用1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)置换介质。

将制备实例6制得的光反应透明质酸衍生物(DS为1.29％)的1.4％重量水溶液置于一对派热克斯耐热玻璃板之间，每板厚度为2.5毫米，其间隔为1.0毫米，每侧均用紫外线(3千瓦金属卤化物灯)辐射4分钟(总计8分钟)，然后在45℃下干燥。将1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)加到所制得的干燥凝胶之中，调节浓度至2％重量。然后将干燥凝胶溶胀1天，得到光固化交联透明质酸凝胶(内毒素含量为0.11EU/g)。

实例2

本实例涉及用下述制备方法得到的光固化交联透明质酸凝胶，该方法包括：对1.4％重量的在制备实例1，4和7中制得的光反应透明质酸衍生物的在1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)中的溶液进行光固化交联。

将在1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)中的制备实例1、4和7制得的光反应透明质酸衍生物(DS分别为0.53％、1.06％和1.55％)的1.4％重量的溶液分别置于一对派热克斯耐热玻璃板之间，每块玻璃板的厚度为2.5毫米，其间隔为1.0毫米，每侧用紫外线(3千瓦金属卤化物灯)辐射4分钟(总计8分钟)，得到光固化交联透明质酸凝胶。

在DS分别为0.53％、1.06％和1.55％的凝胶中，内毒素含量分别为0.03、0.12、和0.05EU/g。

实例3

本实例涉及用下述制备方法得到的光固化交联透明质酸凝胶，该方法包括：对2.0％重量的在制备实例1～9中制得的光反应透明质酸衍生物的在1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)中的溶液进行光固化交联。

将在1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)中的制备实例1～9中制得的光反应透明质酸衍生物(DS分别为0.53％、0.75％、0.90％、1.06％、1.26％、1.29％、1.55％、1.93％和2.87％)的2.0％重量的溶液分别置于一对派热克斯耐热玻璃板之间，每板厚度为2.5毫米，其间隔为1.0毫米，每侧均用紫外线(3千瓦金属卤化物灯)辐射4分钟(总计8分钟)，得到光固化交联透明质酸凝胶。

实例4

本实例涉及用下述制备方法得到的光固化交联透明质酸凝胶；该方法包括：对3.2％重量的在制备实例1、4和7中制得的光反应透明质酸衍生物的在1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)中的溶液进行光固化交联。

将在1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)中的制备实例1，4和7中制得的光反应透明质酸衍生物(DS分别为0.53％、1.06％、1.55％)的3.2％重量的溶液分别置于一对派热克斯耐热玻璃板之间，每板厚度为2.5mm，其间隔为1.0毫米，每侧均用紫外线(3千瓦金属卤化物灯)辐射4分钟(总计8分钟)，得到光固化交联透明质酸凝胶。

实例5

本实例涉及按下述方法得到的光固化交联透明质酸凝胶，该方法包括：对实例3中的DS分别为1.55％和2.87％的光固化交联透明质酸凝胶进行热处理。

将实例3中从DS分别为1.55％和2.87％的光反应透明质酸衍生物制得的光固化交联透明质酸凝胶分别装于10毫升安瓿中，在121℃压热器中进行8分钟热处理。

物理性能测定

测定下述材料的动态粘弹性[储能模量G＇，损耗模量G″、损失正切δ，tanδ(G″/G＇)]、动态粘度(η)和吸水率；这些材料是，制备实例1，4，5和7中制得的制备浓度(溶液浓度以透明质酸浓度表示)分别为1.4％重量、2.0％重量或3.2％重量的光反应透明质酸衍生物的溶液，实例2～4制备的制备浓度分别为1.4％重量、2.0％重量或3.2％重量的光固化交联透明质酸凝胶，以及在实例5中制备的热处理了的光固化交联透明质酸凝胶。按如上所述，还测定了所制备的透明质酸溶液的物理性能，其制备浓度与上述光固化交联透明质酸凝胶的制备浓度相同。采用Carri-Med公司制造的CSL-50型流变仪在下述条件下测定动态粘弹性和动态粘度。

测定方法：振动试验法，应力控制

测定温度：37℃

测定外形尺寸(geometry)：4厘米

间隙：800微米

频率：10赫兹

吸水率按照如下所述的使用欧洲专利0205674A1中公开的兰色葡聚糖(Blue Dextran)(下文缩写为“B.D”)通过紫外线吸光度法进行测定。使用生理盐水(0.9％氯化钠水溶液)作为水介质。

当干凝胶置于B.D.溶液中时，凝胶仅吸收水，因为具有高分子量的B.D.不能进入凝胶。所以，未吸收的剩余B.D.溶液浓度，与初始浓度比起来，随着水被吸收而增加。这种浓度差异得自吸光度(610纳米)，然后按下述方程计算吸水率：

吸水率(×100％)＝(1-y¹/y²)/A×1000式中：y¹是初始浓度为每克0.1％重量B.D.溶液中干凝胶A毫克时的吸光度，y²是在B.D溶液中溶涨24小时之后的吸光度。

另外，还对在实例3中从DS为0.53％、0.75％、0.90％、1.26％、1.55％和1.93％的光反应透明质酸衍生物制备的光固化交联透明质酸凝胶干样品进行了吸水率测定。

关于动态粘弹性等的某些测定结果示于表1。DS与吸水率的关系示于图2。在表1中，分析样品的实测浓度是通过按照咔唑-硫酸反应法测定凝胶的透明质酸成分含量得到的。

表1

浓度浓度

频率 10Hz实例序号 DS (制备) (实测) 热处理 G＇ G″ tanδ η

(％) (％) (％) (Pa) (Pa) (Pa·s)

2 0.53 1.4 1.22 - 66 41 0.63 0.7

1.06 1.4 1.37 - 146 65 0.45 1.0

1.55 1.4 1.24 - 149 64 0.43 1.0

透明质酸 1.4 1.38 - 46 44 0.97 0.7

3 0.53 2.0 1.96 - 146 78 0.53 1.2

1.06 2.0 1.81 - 339 109 0.32 1.7

1.26 2.0 1.70 - 273 96 0.35 1.5

1.55 2.0 2.04 - 342 105 0.31 1.7

2.87 2.0 1.62 - 427 103 0.24 1.7

透明质酸 2.0 2.00 - 241 102 0.42 1.6

4 0.53 3.2 2.63 - 550 216 0.39 3.4

1.06 3.2 2.77 - 818 223 0.27 3.5

1.55 3.2 2.78 - 1002 248 0.25 3.9

透明质酸 3.2 3.35 - 560 304 0.54 4.8

5 1.55 2.0 2.04 121℃，8分钟 173 86 0.50 1.4

2.78 2.0 1.62 121℃，8分钟 310 101 0.32 1.6

透明质酸 3.2 3.02 121℃，8分钟 407 281 0.69 4.5

实例6

本实例涉及按下述方法制备的光固化交联透明质酸凝胶，该方法包括：对2.0％重量的在制备实例10中制得的光反应透明质酸衍生物的在1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)中的溶液，在不同条件下进行紫外线辐射，并进行热处理。

将制备实例10中制备的DS为2.28％的光反应透明质酸衍生物溶解于1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)中，成为2.0％重量的溶液。按照下述三种方法对所制得的溶剂进行紫外线辐射。在紫外线辐射之前和/或之后，在下述条件下，对溶液(或凝胶)进行热处理。测定所得凝胶的交联比、交联度和粘弹特性。

紫外线辐射(UV辐射)条件

(1)与实例2～4相同的方法。将光反应透明质酸衍生物的水溶液置于一对派热克斯耐热玻璃板之间，每板厚度为2.5毫米，其间隔为1.0毫米，用3千瓦金属卤化物灯的紫外线从每侧辐射4分钟(共计8分钟)。

(2)将该溶液置于一对聚乙烯薄膜之间，用400瓦高压汞灯的紫外线从一侧辐射3秒钟。

(3)将该溶液在送入并通过直径5毫米石英管的同时用400瓦高压汞灯辐射。

执处理条件(压热器处理法)

A.在UV辐射之后，121℃，8分钟

B.在UV辐射之前，121℃，8分钟

C.在UV辐射之前，121℃，8分钟；然后，在UV辐射之后，100℃，10分钟

D.在UV辐射之后，121℃，15分钟

测试结果示于下表2。

其中交联比用如下方程计算。

交联比(％)＝二聚的肉桂酸摩尔数×2/引入的肉桂酸摩尔数×100

更具体地说，将肉桂酸或其二聚物从光固化交联透明质酸凝胶中化学裂解并提取出来。利用肉桂酸和其二聚体之间的分子量差异，通过凝胶渗透色谱法(GPC)将提取物分离成肉桂酸和其二聚体，定量测定每个组分，得到各自的摩尔数。然后按上述方程计算交联比。

交联度从下述方程计算。

交联度(％)＝DS×交联比/100

正如从上述方程所见，当交联比是以引入的肉桂酸为基础计算的数值时，交联度(交联比和DS的乘积)能以每个透明质酸的二糖单元成分的二聚体的摩尔比(％)表示。

表2

光辐热处

频率：10赫兹DS 射条件理条件交联比交联度 G＇ G″ tanδ η(％) (％) (％) (帕) (帕) (帕秒2.28 (1) A 4.1 9.4×10^-2 161 68 0.42 1.12.28 (2) A 1.9 4.4×10^-2 122 56 0.46 0.92.28 (3) B 2.5 5.6×10^-2 146 70 0.48 1.：2.28 (3) C 2.5 5.6×10^-2 144 84 0.59 1.：2.28 (2) D 1.9 4.4×10^-2 108 84 0.78 1.

试验实例1

在大鼠子宫角模型中的抗粘连作用

本试验实例涉及下述材料在大鼠子宫角粘连模型中的抗粘连作用，这些材料是，实例1、3、5和6制得的凝胶，以及为比较用的，如实例1和3那样制备的紫外线辐射前的光反应透明质酸衍生物溶液(下文称为未交联透明质酸凝胶)、市售的抗粘连材料TC7[Interceed(商品名)，Johnson & Johnson公司生产]，以及在1.5mM磷酸盐缓冲生理盐水中的3.2％重量透明质酸溶液。

1.试验动物

购置七周Crj：SD(SPF.)雌大鼠，试验前喂养一周。每组五只

2.试验方法

2-1大鼠子宫角粘连模型的准备方法

在戊巴比妥钠麻醉下，对大鼠腹进行备皮。划约4厘米长中线切口。

(a)用眼科手术环锯将右腹壁切至肌层，并用镊子剥离肌层。

(b)暴露子宫角，从卵巢下约1厘米向子宫颈以2～3毫米间距划4个横切口。每次切开随时用电灼术止血。

(c)将从子宫角上横切口端约3～4毫米的部位以及从腹壁损伤端3～4毫米部位合拢，用8/0单股缝线将上述(a)和(b)中造成的外伤缝合。

2-2给药

试验组：

在腹壁损伤部位和子宫角切口部位间注入或嵌入下述材料，它们是均为1毫升的上述光固化交联透明质酸凝胶、未交联透明质酸凝胶和透明质酸溶液，以及面积为1.5×1.5厘米²的市售TC7。更具体地说，上述凝胶按如下方式给药。将精确计量的各1毫升上述凝胶装入1毫升注射器[Terumo注射器，用于结核菌素(tukerculin)(商品名)，经r-射线消毒，管内径约4毫米，端部内径约1毫米]，经注射器端部注入腹壁损伤部位和子宫角切口部位之间。

对照组：

在用于实验组的同一动物左侧腹壁和子宫角进行相同操作，但是没有嵌入抗粘连材料。

3.评判

植药后七天，将大鼠在乙醚麻醉下经颈动脉驱血杀死。解剖之后，按如下记分系统，评判经受粘连部位的粘连程度。

0 无粘连

1 稍粘连但易分开

2 中等粘连但可分开

3 严重粘连且不可分开

4.结果

试验结果示于下表3。在表3中，紫外线辐射条件和热处理条件与实例6所述相同。

表3

光辐热处抗粘连效果实例序号 DS 射条件理条件试验组对照组

(％)

1 1.29 (1) - 0，0，0，0，0 2，2，2，2，2

- 1.29 未辐射 - 2，2，2，2，2 2，2，2，2，2

3 1.06 (1) - 1，1，0，0，0 2，2，2，2，2

3 1.26 (1) - 2，0，0，0，0 2，2，2，2，2

- 1.26 未辐射 - 2，2，2，2，0 2，2，2，2，2

3 1.55 (1) - 0，0，0，0，0 2，2，2，2，2

5 1.55 (1) A 0，0，0，0，0 2，2，2，2，2

3 2.87 (1) - 0，0，0，0，0 2，2，2，2，2

5 2.87 (1) A 0，0，0，0，0 2，2，2，2，2

6 2.28 (2) A 1，0，0，0，0 2，2，2，2，2

6 2.28 (3) D 1，0，1，0，0 2，2，2，2，2

比较例：

TC7 - - - 2，2，2，2，2 2，2，2，2，2

3.2％透明质酸溶液 A 2，2，2，2，2 2，2，2，2，2

正如从表3的结果所见，市售抗粘连薄膜TC7在本粘连模型中不完全有效，而按照本发明的光固化交联透明质酸凝胶在本模型中具有充分有效的抗粘连作用。

具有与光交联凝胶相似的粘弹性和粘度的未交联凝胶或3.2％透明质酸溶液没有抗粘连效果，据此，可以认为本发明光固化交联透明质酸凝胶的抗粘连作用归因于光固化交联。

试验实例2

本试验实例涉及在与试验实例1相同的大鼠子宫角粘连模型中本发明凝胶的抗粘连作用，只是没有对腹壁损伤部位和子宫角切口部位进行止血。

本发明凝胶的抗粘连作用采用与试验实例1相同的方法进行试验和评价，不同之处在于，本实例没有对腹壁和子宫角切口止血，所采用的是0.5毫升浓度为2％、DS为2.5％的光固化交联透明质酸凝胶，并且在紫外线辐射之前对其在105℃下进行了10分钟热处理，在紫外线辐射之后对其在121℃下进行了8分钟热处理(n＝10)。

作为对照试验，采用与试验实例1相同的方法对实验组所使用的同一动物进行了试验，但没有嵌入抗粘连材料。

所得结果示于表4。

表4

动物号对照组实验组

1 2 0

2 2 0

3 2 0

4 2 0

5 2 0

6 2 0

7 2 0

8 2 2

9 2 0

10 2 0

0.5毫升剂量的光固化交联透明质酸凝胶对未接受止血的模型具有显著抗粘连作用。换句话说，表4结果证明，光固化交联透明质酸凝胶优于市售TC7，后者不能施加到未进行止血的损伤部位。

试验实例3

光固化交联透明质酸凝胶在大鼠类肠粘连模型中的抗粘连效果

1.试验材料

光固化交联透明质酸凝胶，浓度为2％，DS为2.5％；在紫外线辐射前在105℃下进行10分钟热处理，并且在紫外线辐射后在121℃进行8分钟热处理。

2.试验动物

购置七周SD雌大鼠，在试验前喂养一周。

3.粘连模型的准备方法

对从回肠至结肠的浆液膜成直线地进行剥离，剥离长度为20厘米，宽度为3～4毫米，不进行止血。

4.给药和分组

从1毫升注射器注射规定量(0.5毫升、1.0毫升或2毫升)凝胶，施加到损伤部位。敷用之后，将肠管移入腹腔，然后封闭腹部。未敷用凝胶的粘连模型作为对照组。敷用0.5毫升、1.0毫升和2.0毫升凝胶的模型分别作为0.5毫升、1.0毫升和2.0毫升组。每组10只大鼠。

5.评判和结果

植药后七天，将大鼠在乙醚麻醉下经颈动脉驱血杀死。解剖后，按与试验实例1相同的记分系统评判粘连程度。所得结果示于下表5。

表5

试验组

动物序号对照组 0.5毫升 1.0毫升 2.0毫升

1 2 0 0 0

2 2 0 0 0

3 2 1 0 0

4 2 0 0 0

5 2 0 0 0

6 2 0 0 1

7 2 0 0 0

8 1-2 0 0 0

9 1-2 1-2 0 0

10 1-2 0 0 0

与对照组相比，三个试验组全部具有显著抗粘连作用。表5结果说明本发明凝胶不仅对抗粘连有效，而且，在考虑到有力的肠蠕动的情况下，在对组织的粘着性以及与组织的生物相容性方面，它均显示优越性能。

另外，在上述试验实例1和2动物试验中，植药后七天解剖时，肉眼观察得知大部分植入的光固化交联透明质酸凝胶消失。如此，显示了本发明凝胶的生物降解能力。

如上所述并证明，光固化交联透明质酸凝胶易于通过用紫外线辐射高浓度光反应透明质酸衍生物水溶液制备。本发明的光固化交联透明质酸凝胶在保持透明质酸固有优良性能的同时，如：无毒、非抗原性、生物相容性、生物降解能力等，还具有如下物理性能，如：适当的粘弹性、组织亲合力和生物降解能力等。所以，预期它将作为高度安全的医学材料用于各种领域，例如：作为抗粘连材料、作为缓解药品的载体等。另外，该凝胶能够借助注射器、管等注射到机体受伤细微部位，所以预期会应用于显微外科等。

Claims

1.一种光固化交联透明质酸凝胶，以动态粘弹性表示，其储能模量G＇为50～1500帕，损耗模量G″为10～300帕，损失正切δ为0.1～0.8；其测定方法是采用流变仪在下述条件下进行：

测定方法：振动试验法，应力控制

测定温度：37℃

测定外形尺寸：4厘米

间隙：800微米

频率：10赫兹；

所述凝胶是按下述方法制备的：对光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，使光反应透明质酸衍生物二聚形成环丁烷环，并由此形成网络结构，其中在所述光反应透明质酸衍生物中，含有间隔基的肉桂酸衍生物被化学键合到透明质酸官能基上，所述凝胶是在所述网络结构中含有水介质的可注入的水凝胶，其交联度为每摩尔透明质酸二糖成分单元的0.01～0.5摩尔％，其中引入的光反应交联基的比例为每摩尔二糖单元成分的0.05～10摩尔％，所述的间隔基是衍生自氨基醇、氨基酸或肽的基团。

2.权利要求1的光固化交联透明质酸凝胶，其吸水率为2000～15000％，吸水率的定义如下：

吸水率＝吸收的水的重量/干凝胶重量×100％。

3.权利要求1或2的光固化交联透明质酸凝胶，其中所述光反应交联基如通式(1)或(2)表示：

-NH(CR¹R²)_nOCOCH＝CH-Ph (1)式中：R¹和R²彼此独立代表氢原子或具有1～8个碳原子的烷基；Ph代表苯基；而n代表整数2～18；

-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR³ (2)式中，R³代表具有1～8个碳原子的烷基或芳烷基；A代表-(NHCR⁴R⁵CO)_m-或-NH(CR⁴R⁵)_hCO-；R⁴和R⁵彼此独立代表氢原子或具有1～8个碳原子的烷基；-Ph-代表对亚苯基；m代表整数1～6；以及h代表整数1～18。

4.权利要求1或2的光固化交联透明质酸凝胶，其中所述水凝胶是用下述方法得到的：在水介质中对光反应透明质酸衍生物进行紫外线辐射，然后对交联产物进行热处理。

5.权利要求1或2的光固化交联透明质酸凝胶，其中所述水凝胶是用下述方法得到的：对所述光反应透明质酸衍生物进行热处理；然后在水介质中对其进行紫外线辐射。

6.权利要求5的光固化交联透明质酸凝胶，其中在辐射之后进行进一步热处理。

7.权利要求1或2的光固化交联透明质酸凝胶，其中凝胶的内毒素含量为0.25内毒素单位/克或者更低。

8.权利要求1或2的光固化交联透明质酸凝胶，其能够被从一个容器排出。

9.制备权利要求1的光固化交联透明质酸凝胶的方法，其包括：

通过对光反应相互交联基进行二聚，形成分子间和/或分子内交联，得到网络结构。

10.权利要求9的制备光固化交联透明质酸凝胶的方法，其中，在用紫外线辐射所述光反应透明质酸衍生物的水介质溶液之前和/或之后，对其进行热处理。

11.权利要求10的制备光固化交联透明质酸凝胶的方法，其中，所述热处理采用高压蒸汽在100～125℃下进行5～30分钟。

12.一种生物医学材料，它包含权利要求1～8中任何一项的光固化交联透明质酸凝胶。

13.权利要求12的生物医学材料，它具有抗粘连作用。

14.权利要求12的生物医学材料，其中所述凝胶包含在容器中，并可被可取出。

15.权利要求14的生物医学材料，其中所述容器是能够将所述凝胶排出以便注入的容器。