KR19990067621A - 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 10Hz의 주파수하의 동점탄성에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고, 광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔, 이의 제조방법 및 생의학적 재료로서의 이의 용도에 관한 것이다.
Description
하이알루론산은 동물 조직에 존재하고 생적합성과 생분해성을 지닌다. 이의 물리적 성질에 관해서 언급하면, 이는 고도의 흡수성을 지닌다는 면에서 탁월한 특성을 지니고 있으며 이의 수용액은 점도가 높다.
하이드로겔은 하이알루론산을 화학적으로 변형시키고, 이와 같이 변형된 하이알루론산을 몇몇 방법에 의해 가교결합시켜 망상 구조를 형성시킨 다음, 물과 같은 수성 매질을 상기와 같은 망상 구조물에 혼입시킴으로써 수득한다. 이러한 하이드로겔은 점탄성 뿐만 아니라 점성을 나타낸다.
가교결합된 하이알루론산은 결합 양상과 상관없이 거대분자를 형성한다. 이러한 가교결합된 하이알루론산의 생분해성은 가교결합도를 조정함으로써 조절될 수 있다.
각종 가교결합 방법이 있다. 예를 들면, 소수성 결합 또는 이온성 결합을 이용하는 가교결합 방법으로서, 친핵성 제제를 하이알루론산에 도입함으로써 이를 가교결합시키는 방법[JP-W-3-502704(미국 특허 제4,937,270호), 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "JP-W"는 "심사되지 않은채로 공개된 국제 특허원을 의미한다], 하이알루론산을 에스테르화함으로써 소수성 결합을 통하여 가교결합시키는 방법[미국 특허 제4,851,521호] 및 다가 이온에 의한 이온성 결합을 통하여 가교결합시키는 방법[EP 0507604 A2]이 공지되어 있다. 이들은 공유 결합에 비해 약한 결합력에 의해 가교결합되기 때문에, pH, 이온 강도, 온도 등의 외부 변화의 영향을 받기 쉽다. 또한, 이들을 생의학적 재료로서 사용하는 경우에는, 생체내에서의 잔존 능력이 단축되고 생체에 대한 하이알루론산의 생리학적 효과를 유지하도록 생체내에서의 잔존 능력을 적절하게 조절하기가 어렵다.
더욱이, 공유 결합에 의해 하이알루론산 분자를 결합시키는 가교결합 방법으로서, 디비닐설폰을 통한 가교결합 방법[JP-B-4-30691(미국 특허 제4,582,865), 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "JP-B"는 "심사된 일본 특허공보"를 의미한다] 및 에폭사이드를 통한 가교결합 방법[JP-W-61-502729(미국 특허 제4,886,787호), JP-A-5140201, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "JP-A"는 "심사되지 않은 채로 공개된 일본 특허원"을 의미한다]이 공지되어 있다. 그러나, 이들 가교결합에 사용된 가교결합제 또는 가교결합 화합물은 독성이 있다. 그 밖에도, 디비닐설폰, 에폭사이드 등이 하이알루론산 내로 도입됨과 동시에 가교결합에 의해 3차원적 망상 구조가 형성되며, 이로써 형성된 가교결합된 하이알루론산 겔은 물 등의 용매에 불용성이 된다. 이와 같이 망상 구조물 내로 혼입된 반응되지 않은 저분자 화합물은 분리 및 제거가 곤란하다.
한편, 자외선 조사를 통한 광경화 가교결합 반응에 의해 하이알루론산을 가교결합시키는 방법이 또한 공지되어 있다[참조:JP-A-6-73102(미국 특허 제5,462,976호),ASAIO Journal,38, M154-M157(1992)]. 이러한 가교결합 방법은 광반응성 가교결합 그룹이 도입된 광반응성 하이알루론산 유도체가 광경화된 가교결합 이전에 수용성이고 이때 3차원적 망상 구조가 형성되지 않기 때문에 반응되지 않은 저분자 화합물이 용이하게 제거될 수 있다는 장점을 지니고 있으며; 여기서 광반응 자체는 반응되지 않은 저분자 화합물이 없는, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 유도체를 산출시키는 순수한 반응이며; 생성되는 가교결합된 구조는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 유도체의 잔존능력에 대한 조절이 가교결합도 조절에 의해 용이하게 수행될 수 있도록 공유 결합에 의해 형성된다.
또한, 상기 언급된 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 유도체를 생의학적 재료, 예를 들면, 유착 방지용 재료로서 사용하고자 하는 경우에는, 필름 유사 형태의 유도체가 연구되긴 하였지만[참조: ASAIO Journal, 38, M154-M157(1992)], 이것으로 조직 또는 기관의 미세한 부분에서의 유착을 방지시키기는 어려웠다. 따라서, 이러한 미세한 부위로 주입될 수 있는, 주입가능하고 광경화되며 가교결합된 하이알루론산 겔을 요구되어 왔다.
그러나, 본 발명에서 기술되는 바와 같은 광경화되고 가교결합된 하이알루론산의 하이드로겔 및 이의 제조 방법은 공지된 바가 없다.
통상의 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔은 반응되지 않은 저분자 화합물 등과 같은 불순물을 제거하고 이러한 하이드로겔의 물리적 성질을 조절하는 것이 곤란하였다. 더욱이, 목적하는 물리적 성질을 지닌 하이드로겔을 제조하기 위한 조건을 설정하는 것이 곤란하였다.
본 발명은 특정의 물리적 성질을 지닌 하이드로겔인 생적합성의 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔, 이의 제조 방법 및 생의학적 재료로서의 이의 용도에 관한 것이다.
도 1은 광반응성 하이알루론산 유도체에서 광경화된 가교결합의 개념을 나타내는 도면이다.
도 2는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 DS(치환도)와 수분 흡수율 간의 관계를 나타내는 그래프이다.
본 발명을 실시하기 위한 최선의 양태
본 발명은 다음에 보다 상세히 설명될 것이다.
본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "광경화되고 가교결합된 하이알루론산 유도체"는 개념적으로는, 광반응성 가교결합 그룹이 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 광반응성 가교결합 그룹을 서로 이량체화하여 하이알루론산 유도체를 가교결합함으로써 망상 구조를 형성시킴으로써 수득된 유도체를 포함하고 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔"은 개념적으로는, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산의 망상 구조 내에 분산 매질로서 물, 완충액, 생리 식염수, 완충 생리 식염수, 수용성 유기 용매를 함유하는 수용액 등의 수성 매질을 함유하는 하이드로겔(이는 종종 단순히 "본 발명의 겔"로서 후술된다)을 포함하고 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "하이알루론산의 작용성 그룹"은 하이알루론산 내에 존재하고 광반응성 가교결합 그룹에 화학적으로 연결될 수 있는 작용성 그룹을 포함하고 있다. 이러한 작용성 그룹의 대표적인 예는 카복실 그룹 및 하이드록실 그룹이다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "저급 알킬" 또는 "저급 알콕시"는 탄소수 1 내지 8, 바람직하게는 1 내지 4의 알킬 그룹 또는 알콕시 그룹을 포함한다.
본 발명의 겔에서는, 일차적으로 이의 물리적 성질이 점탄성 측면에서 특정화되고 이차적으로는 가교결합 구조가 가교결합도 측면에서 특정화된다.
본 발명의 광반응성 하이알루론산 유도체에 있어서의 광반응성 가교결합 그룹은 이러한 그룹이 자외선 조사에 의해 이량체화될 수 있는 비닐렌 그룹을 함유하여 사이클로부탄 환을 형성하고 또한 이러한 그룹이 신남산 또는 이의 치환된 유도체[예를 들면, 신남산의 벤젠 환의 어떠한 위치에서의 1개 또는 2개의 수소 원자가 저급 알킬 그룹(예: 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸 등), 저급 알콕시 그룹(예: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시 등), 아미노 그룹, 하이드록실 등으로 치환되는 신남산 유도체], 카복실-저급-알킬 티민(예: 1-(2-카복시에틸)티민 등), 카복시-저급-알킬 치환된 쿠마린(예: 7-쿠마릴옥시아세트산 등) 등으로부터 유도되는 한은 특별히 한정되지는 않는다. 이들 중에서, 신남산 또는 이의 유도체로부터 유도된 그룹이 도입되는 광반응성 가교결합 그룹이 특히 바람직하다. 더욱이, 광반응성 가교결합 그룹으로서, 스페이서가 신남산 등과 같은 광반응성 화합물에 연결되어 있는 특정 화합물로부터 유도된 그룹이 또한 바람직하다. 바람직한 스페이서로는 신남산 등의 광반응성 화합물의 작용성 그룹과 하이알루론산의 작용성 그룹 모두에 연결될 수 있는 둘 이상의 작용성 그룹을 갖는 것이 있다. 구체적으로는, 아미노산 또는 이의 유도체, 펩티드 및 아미노 알콜 등이 바람직하고 특히 아미노 알콜이 가장 바람직하다. 광반응성 가교결합 그룹을 하이알루론산의 구성분인 삭카라이드 잔기, 즉 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산의 어떠한 작용성 그룹에도 도입할 수 있으나, 상기 가교결합 그룹을 D-글루쿠론산의 카복실 그룹에 도입하는 것이 특히 바람직하다.
광반응성 가교결합 그룹으로서 신남산을 사용하고 스페이서로서 아미노 알콜을 사용하는데 있어서, 예를 들면, 신남산의 카복실 그룹이 아미노 알콜의 하이드록실 그룹에 에스테르 결합에 의해 화학적으로 연결되어 있고, 아미노 알콜의 아미노 그룹이 하아알루론산의 카복실 그룹에 아미드 결합에 의해 화학적으로 연결되어 있는 구조를 갖는 광반응성 하이알루론산 유도체가 바람직하다. 광반응성 가교결합 그룹으로서 아미노신남산을 사용하고 스페이서로서 아미노산 또는 펩티드를 사용하는데 있어서, 상기 스페이서의 카복실 그룹이 아미노신남산의 아미노 그룹에 아미드 결합에 의해 화학적으로 연결되어 있고, 상기 아미노산 또는 펩티드의 아미노 그룹이 하아알루론산의 카복실 그룹에 아미드 결합에 의해 화학적으로 연결되어 있는 구조를 갖는 광반응성 하이알루론산이 바람직하다.
구체적으로 언급하면, 스페이서가 결합되어 있는 광반응성 가교결합 그룹 중에서, 다음 화학식 1 또는 2로 나타낸 그룹이 특히 바람직하다:
화학식 1
-NH(CR1R2)nOCOCH=CH-Ph
화학식 2
-A-NH-Ph-CH=CHCOOR3
상기식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹(바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알킬 그룹이다)이고;
Ph는 C6H5-로서 표현된 그룹뿐만 아니라 어떠한 위치에서도 1개 또는 2개의 수소 원자가 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬 또는 알콕시 그룹, 아미노 그룹, 하이드록실 그룹 등 중에서 선택된 1개 또는 2개의 치환체에 의해 치환되는 치환된 벤젠 환을 포함하는 그룹일 수 있는 페닐 그룹을 나타내며;
n은 2 내지 18, 바람직하게는 2 내지 12의 정수이고;
R3은 저급 알킬 그룹, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알킬 그룹(예: 메틸, 에틸 등), 또는 탄소수 7 내지 20의 아르알킬 그룹, 바람직하게는 벤질 또는 펜에틸이며;
A는 -(NHCR4R5CO)m- 또는 -NH(CR4R5)hCO-이고;
R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹(바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알킬 그룹)이며;
-Ph-는 -C6H4-로서 표현된 그룹뿐만 아니라 벤젠 환의 오르토 또는 메타 위치에서의 수소 원자가 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬 또는 알콕시 그룹, 아미노 그룹, 하이드록실 그룹에 의해 치환되는 치환된 벤젠 환을 포함하는 그룹일 수 있는 파라-페닐렌 그룹이고;
m은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 3의 정수이고;
h는 1 내지 18, 바람직하게는 1 내지 12의 정수이다.
화학식 1의 광반응성 가교결합 그룹은, 예를 들면, 하이알루론산의 카복실 그룹에 아미드 결합에 의해 화학적으로 연결되어 광반응성 하이알루론산 유도체를 형성한다.
본 발명에서 사용하기 위한 하이알루론산은 특별히 제한되지는 않지만, 중량 평균 분자량이 10,000 내지 5,000,000인 하이알루론산이 출발 물질로서 통상적으로 사용된다. 사용 목적에 따라서 각종 분자량이 선택될 수 있다. 이러한 중량 평균 분자량은 바람직하게는 500,000 내지 3,000,000, 더욱 바람직하게는 800,000 내지 2,500,000이다. 알칼리 금속 염(예: 나트륨 염, 칼륨 염 등), 알칼리 토금속 염(예: 칼슘 염 등) 등과 같은 하이알루론산의 수용성 염이 다음 합성 방법에 사용하기 바람직하지만, 기타 염 또는 유리 산도 이들이 사용된 반응 용매에 가용성이고 반응을 방해하지만 않는다면 사용될 수 있다. 다음에 종종 사용되는 바와 같은 용어 "하이알루론산"은 이의 염도 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 광반응성 하이알루론산 유도체는 하이알루론산을, 예를 들면, 물 단독 또는 수-혼화성 유기 용매[예를 들면, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 아세트아미드, 알콜(예:메탄올, 에탄올), 피리딘 등]을 함유하는 수용액에 용해시키고; 광반응성 가교결합 그룹을, 예를 들면, 수용성 카보디이미드[예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드("EDC·HCl"로서 약칭 후술됨), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 메트요오다이드, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카보디이미드 하이드로클로라이드] 및 축합 보조제(예:N-하이드록시석신이미드, N-하이드록시벤조트리아졸 등)의 존재하에서 카보디이미드 방법에 의해 도입함으로써 제조할 수 있다.
상기 반응 후에 수득된 생성물의 정제는 통상적인 방법, 예를 들면, 에탄올 침전 또는 투석으로 수행할 수 있다. 정제 및 건조 후, 생성된 광반응성 하이알루론산 유도체의 치환도("DS"로서 약칭 후술됨; 이는 하이알루론산의 구성분 디삭카라이드 단위 당 광반응성 가교결합 그룹의 도입 비율이다)는 분광 광도계를 이용하여 생성물의 269nm에서의 흡광도를 측정함으로써 수득할 수 있다.
멸균성이고 내독소를 거의 함유하고 있지 않은(예를 들면, 내독소 함량이 0.25EU/g 이하이다) 광반응성 하이알루론산 유도체 및 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 멸균성이거나 내독소를 거의 함유하고 있지 않은 시약, 물, 용기 등을 사용하고 제조 과정에 있어서의 작업 환경의 살균에 주의를 기울임으로써 수득할 수 있다.
광반응성 가교결합 그룹을 하이알루론산에 도입하는데 사용된 특정 화합물로는 다음 화학식 1-1 또는 2-1의 화합물이 있다:
상기식에서,
R1, R2, R3, Ph, A, -Ph- 및 n은 앞서 정의한 바와 같다.
화합물(1-1) 및 (2-1)은 바람직하게는 염의 형태, 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로플루오라이드 등과 같은 산 부가염의 형태로 사용되며, 하이드로클로라이드가 특히 바람직하다.
구체적으로는, 화합물(1-1)의 하이드로클로라이드(1-2)는 다음 반응식에 따라서 합성할 수 있다:
제1 반응
R6HN(CR1R2)nOH (3) + XCOCH=CH-Ph (4) →
R6HN(CR1R2)nOCOCH=CH-Ph (5)
제2 반응
(5) + HCl → HCl·H2N(CR1R2)nOCOCH=CH-Ph (1-2)
상기식에서,
R6은 산에 의해 절단될 수 있는 아미노 보호 그룹, 예를 들면, t-부톡시카보닐 그룹 등이고;
X는 할로겐 원자, 예를 들면, 염소 원자 등이다.
본원에서, 구체적으로, 화합물(1-2)은 다음과 같이 합성된다.
유기 용매(예: 클로로포름 등)를 화합물(3)에 가하고, 이에 유기 염기(예: 트리에틸아민 등)를 빙냉하에 가한다. 화합물(4) 및 염기성 촉매(예: 4-디메틸-아미노피리딘 등)를 이에 연속적으로 가한다. 상기 혼합물을 실온에서 교반시킨 후, 유기 용매(예: 에틸 아세테이트 등)를 반응 혼합물에 가하고, 이 혼합물을 수 분획의 약산 수용액, 물, 수 분획의 약 알칼리 수용액, 물, 포화 염화나트륨 수용액 등으로 연속적으로 세척한다. 분리된 유기 용매 층을 무수 황산나트륨 등으로 건조시킨다. 건조제 등을 여과시켜 제거하고, 여액을 감압하에 건조시켜 화합물(5)을 수득한다.
유기 용매(예: 디옥산 등) 중의 염화수소 1 내지 5M 용액을 빙냉하에 화합물(5)에 가한 다음 교반시킨다. 이에 유기 용매(예: 디에틸 에테르 등)를 가하고 침전된 결정을 여과시켜 수집한다. 이러한 결정을 유기 용매로 세척하고 감압하에 건조시켜 화합물(1-2)을 수득한다.
구체적으로, 화합물(2-1)의 하이드로클로라이드(2-2)는 다음 반응식에 따라서 합성할 수 있다:
제1 반응
R6-A-OH (6) + H2N-Ph-CH=CHCOOR3(7) →
R6-A-NH-Ph-CH=CHCOOR3(8)
제2 반응
(8) + HCl → HCl·H-A-NH-Ph-CH=CHCOOR3(2-2)
상기식에서,
R3및 R6은 앞서 정의한 바와 같다.
더욱이, 화합물(2-2)은 구체적으로 다음과 같이 합성된다.
유기 용매(예: 클로로포름 등)를 화합물(6)에 가하고, 이에 활성화제(예: 디메틸포스피노티오일 클로라이드 등)를 유기 염기(예: 트리에틸아민 등)의 존재하에서 빙냉하에 가함으로써, 화합물(6)의 카복실 그룹을 활성화시킨다. 화합물(6)을 활성화시킨 후, 이에 화합물(7)을 유기 염기(예: 트리에틸아민 등)의 존재하에서 빙냉하에 가한 다음 실온에서 교반시킨다. 유기 용매(예: 에틸 아세테이트 등)를 반응 혼합물에 가하고, 이 혼합물을 수 분획의 약산 수용액, 물, 수 분획의 약 알칼리 수용액, 물, 포화 염화나트륨 수용액 등으로 연속적으로 세척한다. 분리된 유기 용매 층을 무수 황산나트륨 등으로 건조시킨다. 건조제 등을 여과시켜 제거하고, 여액을 감압하에 건조시켜 화합물(8)을 수득한다.
유기 용매(예: 디옥산 등) 중의 염화수소 1 내지 5M 용액을 빙냉하에 화합물(8)에 가한 다음 교반시킨다. 이에 유기 용매(예: 디에틸 에테르 등)를 가하고 침전된 결정을 여과시켜 수집한다. 이러한 결정을 유기 용매로 세척하고 감압하에 건조시켜 화합물(2-2)을 수득한다.
광반응성 가교결합 그룹 내로 혼입된 스페이서의 존재는 광반응성 하이알루론산 유도체의 광반응성 증진에 상당한 기여를 하지만, 이러한 증진은 스페이서의 자유도와 소수성 결합 성질에 좌우된다. 이러한 스페이서에 의해 야기된 광반응성에서의 증진된 민감도로 인해, 광반응성 가교결합 그룹의 낮은 도입 비율에서도 광경화된 가교결합을 달성할 수 있게 되는데, 지금까지는 이러한 조건하에서 광경화된 가교결합을 달성하기가 곤란하였다.
통상적인 기술에 따르면, 앞서 기술된 광반응성 하이알루론산 유도체를 광 조사에 의해 가교결합시키는 경우, 광반응성 하이알루론산 유도체의 수용액을 먼저 용기 등 상에서 건조시켜 필름 등으로 만든 다음, 자외선을 조사하여 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 필름을 수득한다. 자외선이 용이하게 필름을 투과할 뿐만 아니라, 광반응성 가교결합 그룹의 소수성으로 인해 이들 그룹이 서로 근접하게 배향되긴 하지만, 이러한 필름은 탈수되거나 필름 형성 동안에 물이 증발된다. 이와 같이 형성된 상황이 광반응에 유리하게 작용하는 것으로 인식되어 왔다. 예를 들면, 광반응성 가교결합 그룹이 신남산 잔기인 경우, 신남산 잔기 상호간의 거리가 4Å이면, 이러한 분자들이 특정 파장의 자외선으로의 조사에 의해 이량체화, 즉 가교결합될 수 있지만, 기타 다른 분자간 거리에서는 그렇지 않다. 따라서, 광반응성 가교결합 그룹을 서로 보다 근접하게 만드는 필름 형성은 광반응을 달성하는데 중요한 단계로서 여겨져 왔다. 추가로, 트랜스-신남산이 상기 언급된 조건하에서 자외선으로의 조사에 의해 이량체화될 수 있지만, 이의 기하학적 이성체(즉, 시스-신남산)는 이량체화될 수 없다. 통상의 광반응성 하이알루론산 유도체의 수용액을 자외선으로 조사하면, 가교결합이 어려워질 수 있는 것으로 간주되어 왔는데, 이는 물 분자가 서로 광반응성인 가교결합 그룹들이 보다 근접하게 위치하는 것을 방지하는 것으로 여겨지고 트랜스-대-시스 이성체화가 이량체화 보다 우선적으로 일어나기 때문이다.
본 발명의 발명자들은 서로 광반응성인 가교결합 그룹이 더욱 자주 근접하게 위치하도록 고농도의 광반응성 하이알루론산 유도체의 수용액을 제조하고, 이러한 용액 층을 자외선 투과가 용이한 형태로 만든 다음, 이에 자외선을 조사함으로써, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 형성할 수 있다는 사실을 밝혀내었다.
본 발명에 따르면, 광반응성 하이알루론산을 자외선으로 조사하는 경우, 광반응 용액의 농도, 자외선의 조사 시간 등의 광반응 조건 또는 DS를 적절히 선택함으로써 점탄성 등과 같이 목적하는 물리적 성질을 지니는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 수득할 수 있다.
빛으로 조사되어 지는 수성 매질 중의 광반응성 하이알루론산 유도체 용액의 바람직한 농도(이는 종종 "광반응 농도"로서 후술됨)는 약 0.5 내지 10중량%이다. 분자량이 약 1,000,000인 광반응성 하이알루론산 유도체를 사용하는데 있어서, 1 내지 4중량%의 농도가 더욱 바람직하다. 보다 저농도에서는, 후술되는 바와 같이 이량체화보다 우선적으로 이성체화가 이루어진다. 이와는 달리, 보다 고농도에서는, 균질한 겔을 수득하기가 곤란하다.
상기와 같이 특정화된 농도 이외의 농도의 보다 희석된 수용액을 자외선으로 조사하는 경우, 앞서 기술된 바와 같이 이성체가 우선적으로 생성되는 경향이 있다. 자외선으로의 조사를 지속시키면, 하이알루론산의 삭카라이드 쇄 자체가 자외선의 영향을 받아 절단되어, 분자량이 감소될 것이다. 이러한 관점에서 보면, 광경화된 가교결합 반응이 하이알루론산의 삭카라이드 쇄에 불리한 영향을 끼치지 않고 효과적으로 진행되는 반응 상황을 만드는 것이 중요하다. 따라서, 앞서 구체적으로 제시된 농도의 수용액을 제조하는 것이 중요하다. 도 1은 수성 매질 중에서의 광경화된 가교결합의 개념 도면이며, 여기서 (a)는 자외선으로의 조사시 희석된 용액 중에서의 광반응성 하이알루론산 유도체의 변화를 나타낸다. 수 분자가 서로 광반응성인 가교결합 그룹이 가교결합을 하기 위한 분자 배열을 취하지 못하도록 하기 때문에, 그 결과 이성체화가 우선적으로 발생된다. (b)에서는, 자외선으로의 조사시 특정화된 농도의 용액 중에서의 광반응성 하이알루론산 유도체의 변화가 나타나 있다. 희석된 용액에서 보다 수 분자의 방해를 덜 받기 쉬운 소수성 광반응성 가교결합 그룹은 소수성 결합력으로 서로 끌어당겨 가교결합하기 위한 분자 배열을 취하도록 한다. 따라서, 광반응성 가교결합 그룹은 수성 매질을 포함하는 동안 조사에 의해 이량체화됨으로써 가교결합을 수행한다. 특정화된 농도의 용액 중에서의 가교결합에 있어서 증진된 광반응성을 보장하기 위해서는, 상기 언급된 스페이서를 함유하고 유연성이 높은 광반응성 가교결합 그룹으로 혼입된 광반응성 하이알루론산 유도체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
앞서 언급된 광반응 농도는 하이알루론산 내로 혼입된 광반응성 가교결합 그룹의 치환도(DS)에 좌우된다. DS는 하이알루론산의 구성분 디삭카라이드 단위 당 광반응성 가교결합 그룹의 도입 비율(%)을 기준으로 하여 산정될 수 있다. 예를 들면, 구성분 디삭카라이드 단위당 또는 구성분 200 삭카라이드 단위당 1개의 광반응성 가교결합 그룹을 갖는 광반응성 하이알루론산 유도체의 DS는 각각 100% 또는 1%이다. 빛을 이용한 동일한 조사 조건하에서, DS가 보다 낮을수록, 가교결합 비율도 보다 낮아진다.
본 발명에서, 상기 언급된 바와 같이 특정화된 광반응 농도에서 가교결합을 달성하기 위한 광반응성 하이알루론산 유도체의 DS는 분자량이 500,000 이상인 하이알루론산의 경우에는 약 0.05 내지 10%, 바람직하게는 약 0.3 내지 5%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 3%이며, 이는 출발 하이알루론산의 분자량에 따라서 다양해진다.
광 조사될 광반응성 하이알루론산 유도체 용액의 용매로서의 수성 매질로는 물, 완충액, 생리 식염수, 완충 생리 식염수 등이 있다. 생의학적 재료용으로는, 완충액, 생리 식염수 및 완충 생리 식염수(예: 인산염 완충된 생리 식염수(PBS) 등)이 특히 바람직하다. 물 이외의 수성 매질이 사용되는 경우, 매질의 종류와 용질의 농도를 이용하여 생성되는 본 발명의 겔의 물리적 성질을 세밀하게 조절할 수 있으며 이는 사용 목적에 따라서 적절하게 선택한다.
광반응성 하이알루론산 유도체 용액은 통상적으로 합성 반응 시스템으로부터 분리되고 정제된 광반응성 하이알루론산 유도체를 수성 매질에 용해시킴으로써 제조한다. 이러한 광반응성 하이알루론산 유도체 용액에 대해서, 몇몇 경우에는, 합성 반응 시스템 내에 존재하는 그 자체로서의 광반응성 하이알루론산 유도체 또는 농축된 상태의 광반응성 하이알루론산 유도체를 사용할 수 있다.
광반응성 하이알루론산 유도체의 DS를 고정시키면, 사이클로부탄 환 형성 비율, 즉 가교결합 비율은 상기 언급된 광반응 농도 범위의 변화와 함께 변화되는 경향이 있으며 이에 따라서 생성되는 겔의 물리적 성질이 변화된다. 광반응 농도가 증가하는 경우, 가교결합 비율은 증가되는 것으로 보이며, 겔의 탄성은 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 점탄성에 관한 측정에 의해 입증된 바와 같이 증가된다. 가교결합 비율이 증가하는 경우, 망상 구조가 더 조밀해 진다. 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔 중에서의 사이클로부탄 환의 비율은 DS와 가교결합 비율의 산물인 가교결합 정도로서 정의되며, 하이알루론산의 구성분 디삭카라이드 단위당 이량체의 몰 비(%)로서 표현된다. 바람직한 가교결합 정도는 하이알루론산의 구성분 디삭카라이드 단위당 0.01 내지 0.5%의 범위이다.
광경화되고 가교결합된 하이알루론산 건조 겔(간단히 "건조 겔"로서 후술됨)의 수분 흡수율은 가교결합도에 의해 영향을 받으므로, 가교결합도의 측정치가 된다. 이러한 수분 흡수율은 다음 식으로 표현된다:
수분 흡수율(%) = 흡수된 물의 중량/건조 겔의 중량 x 100
가교결합도, 즉 가교결합 비율이 증가됨에 따라, 망상 구조가 더 조밀해지고, 물의 흡수가 저하되면 건조 겔의 흡수율이 감소된다. 본 발명에 따르는 건조 겔의 흡수율은 이러한 건조 겔의 흡수율을 수성 매질로서 생리 식염수(0.9% 염화나트륨 수용액)에서 24시간 동안 침수시킨 후 측정할 때, 통상적으로 약 20(x100%) 내지 150(x100%), 바람직하게는 30(x100%) 내지 120(x100%), 더욱 바람직하게는 40(x100%) 내지 100(x100%)이다.
본 발명의 겔은 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 유도체를 하이알루론산 함량 측면에서 0.5 내지 10중량% 함유하는 겔일 수 있다. 특히, 중량 평균 분자량이 약 1,000,000인 광반응성 하이알루론산 유도체로부터 제조된 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 바람직하게는 겔 중에 1 내지 4%의 하이알루론산 함량을 지니고 있다.
점탄성에 의한 당해 겔의 물리적 성질은 저장 계수(G'), 손실 계수(G"), 탄젠트 델타(tanδ; G"/G') 등의 동 점탄성 특징으로 표현된다. 높은 저장 계수와 낮은 손실 계수는 고 탄성을 지시하는데, 이는 경질 겔을 의미한다. 역으로, 높은 손실 계수와 낮은 저장 계수는 고점도의 겔을 의미한다.
저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa, 바람직하게는 100 내지 500Pa이고; 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa, 바람직하게는 50 내지 150Pa이며 10Hz의 주파수하의 동점탄성에서의 탄젠트 델타(tanδ; G"/G')가 0.1 내지 0.8, 바람직하게는 0.2 내지 0.5의 범위인 물리적 성질을 나타낸다.
광 조사, 즉 자외선으로의 조사에 있어서, 자외선의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 광 또는 자외선으로의 조사는 통상적으로, 광보호에 필요한 파장, 즉 200 내지 600nm, 바람직하게는 200 내지 450nm을 함유하는 빛을 제공하는 광원(예를 들면, 고압 수은 램프, 금속 할라이드 램프 등)을 사용하여 수 초 내지 수 분 동안 수행하는데, 이때 이량체화에 바람직하지 못한 단파장은 자외선 절단 필터 등(예를 들면, 피렉스 유리(상표명) 등)을 이용하여 절단한다. 조사 방식은 특별히 제한되지 않으며 목적에 따라서 각종 조사 방식이 적절하게 선택된다. 예를 들면, 광반응성 하이알루론산 유도체 용액을 본 발명의 겔의 최종 시판품으로서 공급될 용기에 채우고; 이러한 용액을 자외선 투과성 물질의 시트로 만든 한 쌍의 벨트 컨베이어 사이에 유지시키고 움직이는 동안에 조사하거나; 광반응성 하이알루론산 용액을 자외선 투과성 물질로 만든 튜브 내부를 통하여 공급하고 공급되는 동안에 자외선으로 조사한다.
본 발명의 겔을 제조하는 방법에 있어서, 상기 광반응성 하이알루론산 유도체 용액을 100 내지 125℃의 고압 스팀을 이용하여 5 내지 30분 동안(오토클레이빙) 자외선으로 조사하기 전 및/또는 후에 열처리시키는 경우일지라도 상기 언급된 점탄성 요구 사항을 충족시키는 겔이 수득될 수 있다. 이러한 열 처리는 의학 장치 또는 의약에 요구되는 살균 공정에 상응할 수 있다.
자외선으로 조사될 광반응성 하이알루론산 유도체 용액의 조건, 및 광반응하기 위해 이를 수용하기 위한 용기의 재료와 외형 및 자외선 수용 부분의 재료와 외형은 자외선이 이들 내로 투과될 수 있는 한은 특별하게 제한되지는 않는다. 예를 들면, 이들은 층과 유사하거나, 튜브와 유사하거나, 주사기와 유사하거나 또는 바이알 등과 유사할 수 있다. 가교결합 반응의 일관성을 고려한다면, 상기 외형은 자외선이 균질하고도 충분하게 투과되도록 해야 한다. 박층으로 성형된 용액 층에 대한 자외선 조사는 균질하게 가교결합된 겔을 수득하는데 특히 적합하다. 광반응용 용기는 광반응성 하이알루론산 유도체 용액과 생성되는 본 발명의 겔을 광반응 시스템 내에 유지시킬 수 있는 외형을 가질 수 있고 항상 밀폐된 용기가 필요하지는 않다. 예를 들면, 당해 용기는 단순한 플레이트 외형을 지닐 수도 있다.
본 발명의 겔을 유착 방지용 재료와 같은 생의학적 재료로서 사용하는 경우, 본 발명의 겔을 보존하기 위한 용기는 바람직하게는 생성되는 본 발명의 겔이 사용될 때까지 멸균적으로 보존할 수 있고 겔을 사용할 때 이를 적절하게 꺼낼 수 있는 외형을 지닐 수 있다. 이러한 보존용 용기는 광반응용 용기에 사용할 수도 있다. 당해 겔을 사용할 때까지 이를 멸균적으로 보존할 수 있고 이러한 겔을 투여 대상 또는 부위(겔을 유착 방지용 재료로서 사용하는 경우, 대상체 또는 부위는 유착을 방지시켜야만 하는 환부이다)에 용이하게 적용할 수 있는 용기의 예로는 주사기, 튜브 등의 용기가 있다. 더욱이, 겔을 용이하게 꺼내어 이를 적용할 수 있는 용기의 예로는 바이알 등의 용기가 있다.
광반응성 하이알루론산 유도체를 용기에 채우고 이와 같이 채워진 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 상기 언급된 바와 같이 광반응을 진행시키는 경우, 용기 재료는 자외선을 투과하고 자외선에 의한 분해를 야기시키지 않는 재료 중에서 선택해야만 한다. 추가로, 본 발명의 겔을 생의학적 재료로서 인체에 적용하고자 하는 경우에는, 광반응 후의 겔을, 예를 들면, 고압 스팀(오토클레이빙)에 의해 살균시키는 것이 바람직할 수 있다. 용기에 충전된 바와 같은 광경화되고 가교결합된 겔을 오토클레이브된 살균에 의해 살균시키는 경우에는, 용기 재료가 바람직하게는 어느 정도 내열성을 지닌 유리, 플라스틱 등으로 만들 수 있다. 상기 용기에 충전될 겔의 양은 특별히 제한되지는 않지만, 기능상 측면과 경제적인 측면 등을 고려하면, 예를 들어, 약 0.5 내지 500ml이다.
상기 언급된 바와 같이 광조사하여 수득된 하이드로겔은, 예를 들면, 건조시켜 탈수시킨 다음 목적하는 양의 수성 매질을 가함으로써 팽윤시켜 상기 언급된 본 발명의 물리적 성질을 갖는 겔을 제공할 수 있다. 이러한 경우, 건조는 하이알루론산 삭카라이드 쇄와 가교결합된 구조에 불리한 영향을 끼치지 않는 방법으로 수행하는 것이 바람직하다.
앞서 언급된 바와 같이 목적하는 고체 겔의 형태의 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 저장 또는 수송하는 것이 또한 가능하고 사용하기 직전에 적절한 수성 매질을 이용하여 재-팽윤된 상태로 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 겔은 생의학적 재료로서 상당히 유용하다. 생의학적 재료로서 사용하기에 적합한 생체내에서의 지속 시간 연장(잔존 능력의 증진) 및 점탄성 등과 같은 물리화학적 성질의 개선 등의 가교결합을 통해 새로이 부가된 특징들과 조합된 하이알루론산의 본래 고유의 높은 생적합성으로 인해, 본 발명의 겔은 의학 분야에서 사용하기에 훨씬 더 적합해진다.
본 발명의 겔은 대부분의 경우에 무해하고 무독성인 수성 매질을 포함하기 때문에, 생체에 독성을 나타내지 않으며 생체에 대한 안전성이 매우 높다.
보다 구체적으로 언급하면, 본 발명의 겔을 랫트에게 100ml/kg(이는 하이알루론산 2000mg/kg에 상응함)으로 복강내로 1회분 용량으로 투여하면 사망을 유발하지 않을 뿐만 아니라 이러한 겔에 기인되는 어떠한 심각한 장애도 야기되지 않는다.
더욱이, 활성 아나필락시를 검사하기 위하여 항원성 시험을 수행하는데, 이러한 시험에서는 기니아 피그에게 본 발명의 겔 20mg 또는 2mg을 복강내 감작화시킨 다음, 겔 40mg을 복강내로 재투여한다. 그 결과, 어떠한 아나필락시 반응도 유도되지 않았다.
본 발명의 겔을 생의학적 재료, 예를 들면, 유착 방지용 재료로서 사용하는 경우, 겔의 탄성 증가는 조직간의 장벽 효과와 생체 내에서의 잔존 능력을 개선시켜 주는 반면, 점도 증가는 조직에 대한 부착성 증진과 환부 내로의 주입되는 능력을 증진시켜 준다. 따라서, 이러한 용도의 겔은 잘 균형된 탄성과 점도를 지니는 것이 바람직하다. G'가 1500을 초과하거나 탄젠트 델타가 0.1 미만이면, 당해 겔은 고도의 탄성을 지닌, 소위 결질의 부서지기 쉬운 겔이 되고 겔을 환부에 주입하기가 곤란해진다. 한편, G'가 50 미만이거나 탄젠트 델타가 0.8을 초과하면, 당해 겔은 용액과 같이 작용하는 고도의 점성인 겔이 되고, 목적하는 경도를 제공하지 못하며 유착 방지 효과에 요구되는 장벽 효과가 상실된다. 즉, 본 발명의 겔은 유착 방지용 재료로서 가장 적합한 물리화학적 성질을 지니는 것으로 간주된다.
예를 들면, 수술 후에 종종 발생되는 기관의 유착은 임상적 측면에서 바람직하지 못하며, 이러한 측면에서 효과적인 유착 방지용 재료의 개발이 요망되어 왔다. 유착 방지용 재료에 바람직한 특징들로는 다음과 같다: 상기 재료는 (1) 유착되기 쉬운 기관사이에 장벽 효과를 지녀야만 하고, (2) 상처 부위 전반을 덮는 성질을 지녀야 하고, (3) 상처 치유를 지연시키지 말아야 하며, (4) 치유 기간 동안에 생체 내에 잔존해야 하며 바람직하게는 치유 후에는 생체 내에서 분해 및 흡수되어야 하고, (5) 무해하고 무독성이며 생적합성이어야 한다.
광경화된 가교결합에 의해 수득되고 우수한 생적합성과 안전성을 지니는 본 발명의 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 상기 언급된 요구 사항들을 모두 충족시킨다. 특별히 중요한 장벽 효과는 당해 가교결합된 겔의 물리화학적 성질에 의해 확실해지며, 생체 내에서의 잔존 능력은 광경화되고 가교결합된 망상 구조를 형성함으로써 달성된다.
당해 겔의 비결정성은, 예를 들면, 당해 겔이 주입 노즐 또는 바늘을 통하여 주입될 수 있게, 즉 주사기 내로 충전될 수 있게 해주고 미세한 환부(예를 들면, 상처 부위 등) 내로 주입될 수 있게 해준다. 이와 연관하여, 본 발명의 겔은 하이알루론산 용액의 탄성 보다 상당히 고탄성을 지니지만 주사기 바늘을 통과할 수 있는 유연성을 나타내는 경도를 지니는 것을 특징으로 한다. 당해 겔은 또한 직경이 작은 튜브(주입 노즐)를 통하여 환부에 주입될 수 있으며 복강경 현미수술 등에 적용되는 것으로 예상된다.
간략히 언급하면, 상기 언급된 바와 같은 본 발명의 겔을 포함하는 유착 방지용 재료는 다음과 같이 특징화된다:
(1) 유착 방지 효과가 탁월하고;
(2) 환부에 주입될 수 있는 물리적 성질을 지닌 하이드로겔이며;
(3) 조직에 대한 높은 부착성을 나타내고 또한 주입되거나 투여될 때 조직에 대한 탁월한 부착성을 나타냄으로써, 유착 방지에 필요한 기간 동안 환부에 잔존하고;
(4) 제거될 필요가 없고 또한 복강 등과 같은 적용 대상 부위로부터 흡수 될 수 있고, 대사되어 분비되며;
(5) 안전하고; 단일 용량 독성 시험, 반복된 용량 독성 시험 및 항원성 시험의 어떠한 동물 시험에서도 안전성에 문제가 전혀 관찰되지 않았다.
본 발명의 겔을 유착 방지용 재료로서 사용하는 경우에 적용될 수 있는 분야는 다음과 같이 예시된다:
(1) 산과 및 부인과학 분야:
불임증, 자궁 수술, 이관 수술, 난소 수술, 자궁내막증 치료 수술, 제왕절개, 골반내 유착제거술 등을 치료하기 위한 골반내 수술을 수반하는 유착에 대한 유착 방지.
(2) 위장 수술 분야:
복부 수술 후의 장 유착 등을 수반하는 유착에 대한 유착 방지.
(3) 정형외과학 분야:
아킬레스건에 대한 수술, 굴근 근육 및 건에 대한 수술, 관절형성술, 척추궁절제술 등을 수반하는 유착에 대한 유착 방지.
본 발명의 겔을 앞서 기술된 바와 같은 유착 방지용 재료 이외의 생의학적 재료로서 의학 분야에 적용하는 것은 다음에 제시되어 있다.
(1) 안과 수술용 보조제. 예를 들면, 당해 겔을 안내 렌즈 삽입, 총 각막 이식 등과 같은 수술에서 전방 챔버 내로 주입하거나, 또는 당해 겔을 망막 박리에서 안내압을 유지시키거나 초자체를 보충하기 위해 사용한다.
(2) 관절 기능 증진제. 예를 들면, 당해 겔을, 슬관절에서의 관절염 기형, 어깨 관절에서의 관절주위염 등과 같은 관절염을 치료하는데 있어서 고통을 경감시키고, 관절 이동 범위를 증가시키고, 병적인 활액을 정상화시킬 목적으로 관절강에 주입한다.
(4) 성형술 분야에서 결손 보철.
(5) 욕창 또는 화상용 드레싱.
(6) 약물의 서방출을 위한 재료 또는 제제.
본 발명의 겔을 유착 방지용 재료로서 사용하는 경우, 환부에 적용될 겔의 양은 특정화될 수 없는데, 이는 유형(예를 들면, 기관 등의 종류), 적용 부위의 크기 또는 상태 및 적용 목적에 따라서 다양하기 때문이다. 이러한 양은 통상적으로 약 0.5 내지 500ml/부위, 바람직하게는 약 1 내지 100ml/부위, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 50ml/부위이다.
본 발명에 따르는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 3차원 망상 구조를 갖는다. 약물을 이러한 망상 구조 내로 혼입하면 약물을 지속적으로 방출시키는데 유용한 제제가 제공될 것이다. 당해 겔 내로의 약물 혼입은 건조 겔을 약물을 함유하는 용액에 침지시킴으로써 수행할 수 있다. 또한, 당해 광경화되고 가교결합된 겔은 가교결합 후에 정제할 필요가 없기 때문에, 조사될 광반응성 하이알루론산 유도체의 용액에 약물을 미리 가할 수 있다. 상기 언급된 어떠한 방법도 사용할 수 있다.
더욱이, 약물은 광반응성 하이알루론산 유도체에 화학적 결합(공유 결합, 이온 결합 등)을 통하여 화학적으로 결합된 다음 광반응되어 가교결합될 수 있다. 예를 들면, 약물을 공유 결합에 의해 도입하는 경우, 이러한 약물과 광반응성 하이알루론산 유도체의 카복실 또는 하이드록실 그룹은 아미드 또는 에스테르 결합을 통하여 결합된 다음 자외선으로 조사되어질 수 있다. 또한, 약물을 이온 결합에 의해 도입하는 경우, 이온 결합을 통하여 하이알루론산의 카복실 그룹에 결합될 수 있는 양이온성 약물이 광반응성 하이알루론산과 혼합된 다음 자외선으로 조사되어질 수 있다. 더욱이, 약물이 연결되어 있는 광반응성 가교결합 그룹을 함유하는 광반응성 하이알루론산 유도체를 광반응시켜 가교결합시킬 수 있다.
본 발명의 첫 번째 목적은 광반응성 가교결합 그룹이 도입된 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 이량체화하여 사이클로부탄 환을 형성함으로써 망상 구조를 형성시켜 수득되는, 수성 매질을 함유하는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔, 및 이러한 겔을 용이하게 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 안전성, 생적합성 및 생분해성이 우수한 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 포함하는, 주입 가능한 생의학적 재료를 제공하는 것이다.
광범위한 연구 결과, 본 발명의 발명자들은 다음 구성에 의해 상기 목적들을 달성하는데 성공하였다:
1) 10Hz의 주파수하의 동점탄성에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
2) 하이알루론산의 구성분 디삭카라이드 단위 1몰 당 가교결합도가 0.01 내지 0.5%이고, 광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사함으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
3) 상기 1) 또는 2)에 있어서, 상기 광반응성 가교결합 그룹이 스페이서를 함유하는 신남산 유도체이고 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 상기 광반응성 하이알루론산 유도체를 제공하고;
이러한 광반응성 하이알루론산 유도체의 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 자외선으로 조사시킴으로써 이량체화하여 사이클로부탄 환을 형성시키고 이로써 망상 구조를 형성시키며;
상기 겔이 상기와 같은 망상 구조 내에 수성 매질을 함유하는 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
4) 상기 3)에 있어서, 상기 스페이서가 아미노 알콜, 아미노산 또는 펩티드로부터 유도된 그룹인 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
5) 상기 3) 또는 4)에 있어서, 광반응성 가교결합 그룹이 다음 화학식 1 또는 2로 나타내어지는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
상기식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이고;
Ph는 페닐 그룹을 나타내며;
n은 2 내지 18의 정수이고;
R3은 저급 알킬 그룹 또는 아르알킬 그룹이며;
A는 -(NHCR4R5CO)m- 또는 -NH(CR4R5)hCO-이고;
R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이며;
-Ph-는 파라-페닐렌 그룹이고;
m은 1 내지 6의 정수이고;
h는 1 내지 18의 정수이다.
6) 상기 1) 내지 5) 중의 어느 하나에 있어서, 광반응성 가교결합 그룹이 구성분 디삭카라이드 단위 1몰당 0.05 내지 10%의 비율로 도입되는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
7) 10Hz의 주파수하의 동점탄성에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시킨 다음 이와 같이 가교결합된 생성물을 열처리시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
8) 10Hz의 주파수하의 동점탄성에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 열처리한 다음, 이와 같이 열처리된 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
9) 10Hz의 주파수하의 동점탄성에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고, 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 열처리한 다음, 이와 같이 열처리된 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시키고, 이어서 이와 같이 가교결합된 생성물을 다시 열처리시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
10) 상기 1) 내지 9) 중의 어느 하나에 있어서, 겔의 내독소 함량이 0.25 내독소 단위(EU)/g 이하인 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔;
11) 광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체 0.5 내지 10중량%를 함유하는 수성 매질 용액을 자외선으로 조사하는 단계; 및
서로 광반응성인 가교결합 그룹을 이량체화하여 분자간 및/또는 분자내 가교결합을 형성하여 망상 구조를 제공하는 단계를 포함하는, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 제조 방법;
12) 상기 11)에 있어서, 광반응성 하이알루론산 유도체의 수성 매질 용액을 자외선으로 조사하기 전 및/또는 후에 열처리를 수행하는, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 제조 방법;
13) 상기 12)에 있어서, 열처리를 고압 스팀을 이용하여 100 내지 125℃에서 5 내지 30분 동안 수행하는, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 제조 방법;
14) 상기 1) 내지 10) 중의 어느 하나에 따르는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 포함하는 생의학적 재료;
15) 상기 14)에 있어서, 유착 방지 효과를 지니는 생의학적 재료;
16) 가교결합된 하이알루론산 겔과 이러한 겔을 꺼낼 수 있는 상태로 함유하는 용기를 포함하는 생의학적 재료 키트;
17) 상기 16)에 있어서, 상기 용기가 상기 겔을 주입하기 위해 밀어낼 수 있는 용기인 생의학적 재료 키트;
18) 상기 1) 내지 10) 중의 어느 하나에 기술된 바와 같은 가교결합된 하이알루론산 겔과 이러한 겔을 꺼낼 수 있는 상태로 함유하는 용기를 포함하는 생의학적 재료 키트;
19) 상기 18)에 있어서, 상기 용기가 상기 겔을 주입하기 위해 밀어낼 수 있는 용기인 생의학적 재료 키트.
본 발명은 다음 제조 실시예, 실시예 및 시험 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 예시될 것이지만, 본 발명이 이로써 제한되는 것은 아니라는 것을 인지해야만 한다.
제조 실시예 1
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 0.53%)의 제조
물 1.5ℓ에 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; 중량 평균 분자량(Mw): 950,000) 10g(25mmol 디삭카라이드 단위)을 용해시키고 이 용액에 1,4-디옥산 750ml를 가한다. 이 용액에 N-하이드록시석신이미드 288mg(2.5mmol)을 함유하는 디옥산 용액 50ml, EDC·HCl 1240mg(1.25mmol)을 함유하는 수용액 50ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh 355mg(1.25mmol)을 함유하는 수용액 50ml를 빙냉시키면서 5분 간격으로 연속적으로 가한다. 이 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반시킨 후, 염화나트륨 10g의 수용액을 이에 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 생성된 용액을 에탄올 5ℓ에 따라 붓는다. 이로써 형성된 목적하는 침전물을 원심분리(4000rpm x 15분)시켜 수집하고, 3분획의 80% 에탄올 및 단일 분획의 에탄올로 연속적으로 세척한 다음, 건조시켜 광반응성 하이알루론산 유도체 9.73g을 백색 고체로서 수득한다(DS: 0.53%, 내독소: 0.8pg/mg).
본 제조 실시예, 및 다음 제조 실시예 및 실시예에서의 내독소는 Toxicolor System LS-20 세트, DIA 세트 및 Et-1 세트(모두 Seikagaky Corporation 으로부터 시판되는 상품명임)를 사용하여 측정한다.
본 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 내독소 함량은 실시예에서 기술된 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 효소(예를 들면, 콘드로이티나제 ABC, Seikagaky Corporation 의 제품 등) 분해에 의해 가용된 후에 상기 언급된 방법으로 측정한다.
내독소 함량에 있어서, 1 내독소 단위(EU)는 내독소 345pg에 상응한다.
제조 실시예 2
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 0.75%)의 제조
이는 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; Mw: 950,000) 10g(25mmol 디삭카라이드 단위),디옥산 중의 N-하이드록시석신이미드 (3.25mmol)의 0.05M 수용액 65ml, EDC·HCl (1.625mmol)의 0.025M 수용액 65ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh (1.625mmol)의 0.025M 수용액 65ml를 사용하여 제조 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제조한다. 이로써 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체는 백색 고체로서 9.74g이다(DS: 0.75%; 내독소: 2.5pg/mg).
제조 실시예 3
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 0.90%)의 제조
이는 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; Mw: 950,000) 2.0g(5.0mmol 디삭카라이드 단위), N-하이드록시석신이미드 69mg(0.6mmol)을 함유하는 수용액 3ml, EDC·HCl 58mg(0.3mmol)을 함유하는 수용액 3ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh 85mg(0.3mmol)을 함유하는 수용액 3ml를 사용하여 제조 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제조한다. 이로써 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체는 백색 고체로서 2.1g이다(DS: 0.90%; 내독소: 2.4pg/mg).
제조 실시예 4
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 1.06%)의 제조
이는 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; Mw: 950,000) 10g(25mmol 디삭카라이드 단위),디옥산 중의 N-하이드록시석신이미드 (5.0mmol)의 0.05M 수용액 100ml, EDC·HCl (2.5mmol)의 0.025M 수용액 100ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh (2.5mmol)의 0.025M 수용액 100ml를 사용하여 제조 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제조한다. 이로써 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체는 백색 고체로서 9.64g이다(DS: 1.06%; 내독소: 3.2pg/mg).
제조 실시예 5
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 1.26%)의 제조
이는 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; Mw: 950,000) 5g(12.5mmol 디삭카라이드 단위),디옥산 중의 N-하이드록시석신이미드 288mg(2.5mmol)의 용액 50ml, EDC·HCl 240mg(1.25mmol)의 수용액 50ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh 355mg(1.25mmol)의 수용액 50ml를 사용하여 제조 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제조한다. 이로써 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체는 백색 고체로서 4.9g이다(DS: 1.26%; 내독소: 1.0pg/mg).
제조 실시예 6
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 1.29%)의 제조
이는 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; Mw: 950,000) 10g(25mmol 디삭카라이드 단위),디옥산 중의 N-하이드록시석신이미드 (5.0mmol)의 0.1M 용액 50ml, EDC·HCl (2.5mmol)의 0.05M 수용액 50ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh (2.5mmol)의 0.05M 수용액 50ml를 사용하여 제조 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제조한다. 이로써 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체는 백색 고체로서 10.0g이다(DS: 1.29%; 내독소: 2.5pg/mg).
제조 실시예 7
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 1.55%)의 제조
이는 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; Mw: 950,000) 10g(25mmol 디삭카라이드 단위),디옥산 중의 N-하이드록시석신이미드 (7.5mmol)의 0.05M 수용액 150ml, EDC·HCl (3.75mmol)의 0.025M 수용액 150ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh (3.75mmol)의 0.025M 수용액 150ml를 사용하여 제조 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제조한다. 이로써 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체는 백색 고체로서 9.92g이다(DS: 1.55%; 내독소: 1.2pg/mg).
제조 실시예 8
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 1.93%)의 제조
물 600ml에 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; 중량 평균 분자량(Mw): 950,000) 4.0g(10.0mmol 디삭카라이드 단위)을 용해시키고 이 용액에 1,4-디옥산 300ml를 가한다. 이 용액에 N-하이드록시석신이미드 230mg(2.0mmol)을 함유하는 수용액 10ml, EDC·HCl 192mg(1.0mmol)을 함유하는 수용액 10ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh 284mg(1.0mmol)을 함유하는 수용액 10ml를 빙냉시키면서 5분 간격으로 연속적으로 가한다. 이 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시킨 후, 염화나트륨 2.0g의 수용액을 이에 가한 다음, 교반시킨다. 생성된 용액을 에탄올 3.0ℓ에 따라 붓는다. 이로써 형성된 목적하는 침전물을 원심분리(4000rpm x 15분)시켜 수집하고, 80% 에탄올로 3회 세척한 다음 에탄올로 1회 연속적으로 세척하고, 이어서 건조시켜 광반응성 하이알루론산 유도체 4.1g을 백색 고체로서 수득한다(DS: 1.93%, 내독소: 2.1pg/mg).
제조 실시예 9
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 2.87%)의 제조
이는 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; Mw: 950,000) 10g(25mmol 디삭카라이드 단위), 디옥산 중의 N-하이드록시석신이미드 864mg(7.5mmol)의 용액 50ml, EDC·HCl 718mg(3.75mmol)의 수용액 50ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh 1.06g(3.75mmol)의 수용액 50ml를 사용하여 제조 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제조한다. 이로써 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체는 백색 고체로서 10g이다(DS: 2.87%; 내독소: 2.8pg/mg).
제조 실시예 10
광반응성 하이알루론산 유도체(DS 2.28%)의 제조
이는 나트륨 하이알루로네이트(Seikagaku Corporation의 제품; Mw: 950,000) 50g(125mmol 디삭카라이드 단위), N-하이드록시석신이미드 3.45g(30mmol)의 수용액 250ml, EDC·HCl 2.88g(15mmol)의 수용액 250ml, 및 HCl·H2N(CH2)6OCOCH=CHPh 15mmol의 수용액 250ml를 사용하여 제조 실시예 1에서와 동일한 방식으로 제조한다. 이로써 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체는 백색 고체로서 49g이다(DS: 2.28%; 내독소: 3.2pg/mg).
실시예 1
본 실시예는 제조 실시예 6에서 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체를 수용액 중에서 광경화된 가교결합시킨 다음, 상기 매질을 1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4)로 대체시킴으로써 수득되는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔에 관한 것이다.
제조 실시예 6에서 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체(DS: 1.29%)의 1.4중량% 수용액을 두께가 각각 2.5mm이고 1.0mm 간격으로 떨어진 한 쌍의 피렉스 유리판 사이에 유지시키고, 각 측면으로부터 4분 동안(총 8분) 자외선(3kW 금속 할라이드 램프)로 조사한 다음, 45℃에서 건조시킨다. 이로써 생성된 건조 겔에, 농도를 2중량%로 조정한 1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4)를 가한다. 이어서, 상기 건조 겔을 1일 동안 팽윤시켜 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 수득한다(내독소: 0.11EU/g).
실시예 2
본 실시예는 제조 실시예 1, 4 및 7에서 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체를 1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4) 중의 1.4중량% 수용액 중에서 광경화된 가교결합시킴으로써 수득되는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔에 관한 것이다.
1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4) 중의 제조 실시예 1, 4 및 7에서 수득된 각각의 광반응성 하이알루론산 유도체(DS: 각각 0.53%, 1.06% 및 1.55%)의 1.4중량% 수용액을 두께가 각각 2.5mm이고 1.0mm 간격으로 떨어진 한 쌍의 피렉스 유리판 사이에 유지시키고, 각 측면으로부터 4분 동안(총 8분) 자외선(3kW 금속 할라이드 램프)로 조사시켜 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 수득한다.
내독소 함량은 DS가 0.53%, 1.06% 및 1.55%인 겔에서 각각 0.03, 0.12 및 0.05EU/g이다.
실시예 3
본 실시예는 제조 실시예 1 내지 9에서 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체를 1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4) 중의 2.0중량% 수용액 중에서 광경화된 가교결합시킴으로써 수득되는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔에 관한 것이다.
1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4) 중의 제조 실시예 1 내지 9에서 수득된 각각의 광반응성 하이알루론산 유도체(DS: 각각 0.53%, 0.75%, 0.09%, 1.06%, 1.26%, 1.29%, 1.55%, 1.93% 및 2.87%)의 2.0중량% 수용액을 두께가 각각 2.5mm이고 1.0mm 간격으로 떨어진 한 쌍의 피렉스 유리판 사이에 유지시키고, 각 측면으로부터 4분 동안(총 8분) 자외선(3kW 금속 할라이드 램프)로 조사시켜 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 수득한다.
실시예 4
본 실시예는 제조 실시예 1, 4 및 7에서 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체를 1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4) 중의 3.2중량% 수용액 중에서 광경화된 가교결합시킴으로써 수득되는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔에 관한 것이다.
1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4) 중의 제조 실시예 1, 4 및 7에서 수득된 각각의 광반응성 하이알루론산 유도체(DS: 각각 0.53%, 1.06% 및 1.55%)의 3.2중량% 수용액을 두께가 각각 2.5mm이고 1.0mm 간격으로 떨어진 한 쌍의 피렉스 유리판 사이에 유지시키고, 각 측면으로부터 4분 동안(총 8분) 자외선(3kW 금속 할라이드 램프)로 조사시켜 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 수득한다.
실시예 5
본 실시예는 실시예 3에서 DS가 1.55% 및 2.87%인 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 열 처리시킴으로써 수득되는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔에 관한 것이다.
DS가 1.55% 및 2.87%인 광반응성 하이알루론산 유도체로부터 실시예 3에서 수득된 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 각각 10ml 앰풀에 충전시키고 121℃에서 8분 동안 오토클레이빙시킴으로써 열처리시킨다.
물리적 성질의 측정
1.4중량%, 2.0중량% 또는 3.2중량%의 제제 농도(용액 농도:하이알루론산 농도로서)를 갖는 제조 실시예 1, 4, 5 및 7에서 수득된 광반응성 하이알루론산 유도체, 1.4중량%, 2.0중량% 또는 3.2중량%의 제제 농도를 갖는 실시예 2 내지 4에서 제조된 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔 및 실시예 5에서 제조된 열처리된, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 동 점탄성[저장 계수 G', 손실 계수 G", 탄젠트 델타(G"/G')], 동점도(η) 및 흡수율을 측정한다. 제제 농도가 상기 언급된 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 것과 동일해지기 때문에 제조된 하이알루론산 용액의 물리적 성질은 앞서 기술된 바와 같이 측정한다. 동 점탄성 및 동점도는 다음 조건하에서 점도계 모델 CSL-50(Carri-Med에 의해 제조됨)을 사용하여 측정한다.
측정 방법: 진동 시험 방법, 응력 조절
측정 온도: 37℃
측정 기하: 4cm
갭: 800㎛
주파수: 10Hz
흡수율은 EP 0205674 A1에 기술된 블루 덱스트란("B.D."로서 약칭 후술됨)을 이용하여 자외선 흡광법으로 다음과 같이 산정한다. 생리 식염수(0.9% 염화나트륨 수용액)를 수성 매질로서 사용한다.
건조 겔을 B.D. 용액에 놓아 두면, 상기 겔은 물만을 흡수하는데, 이는 고분자량의 B.D.는 상기 겔 내로 유입될 수 없기 때문이다. 상응하게, 흡수되지 않은 채로 잔존하는 B.D. 용액의 농도는 흡수된 물에 따라서 초기 농도에 비해 증가된다. 이러한 농도차는 흡광도(610nm)로부터 획득되고 이때 흡수율은 다음 방정식에 따라서 산정할 수 있다:
수분 흡수율(x 100%) = (1-y1/y2)/A x 1000
상기식에서,
y1은 0.1중량% B.D.용액 1g당 건조 겔 A mg의 초기 농도에서의 흡광도이고,
y2는 B.D.용액에서 24시간 팽윤된 후의 흡광도이다.
추가로, 흡수율은 DS가 0.53%, 0.75%, 0.90%, 1.26%, 1.55% 및 1.93%인 광반응성 하이알루론산 유도체로부터 실시예 3에서 제조된 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 건조 샘플에 대해서 검사한다.
동 점탄성 등의 몇몇 측정 결과는 표 1에 나타나 있으며 DS와 흡수율 간의 관계는 도 2에 나타나 있다. 표 1에서, 분석중인 샘플의 실측 농도는 카바졸-황산 반응 방법에 따라서 겔의 하이알루론산 성분 함량을 측정함으로써 수득된다.
| 실시예 번호 | DS(%) | 농도(준비)(%) | 농도(실측)(%) | 열처리 | 주파수:10Hz | |||
| G'(Pa) | G"(Pa) | tanδ | η(Pa·s) | |||||
| 2 | 0.53 | 1.4 | 1.22 | - | 66 | 41 | 0.63 | 0.7 |
| 1.06 | 1.4 | 1.37 | - | 146 | 65 | 0.45 | 1.0 | |
| 1.55 | 1.4 | 1.24 | - | 149 | 64 | 0.43 | 1.0 | |
| 하이알루론산 | 1.4 | 1.38 | - | 46 | 44 | 0.97 | 0.7 | |
| 3 | 0.53 | 2.0 | 1.96 | - | 146 | 78 | 0.53 | 1.2 |
| 1.06 | 2.0 | 1.81 | - | 339 | 109 | 0.32 | 1.7 | |
| 1.26 | 2.0 | 1.70 | - | 173 | 96 | 0.35 | 1.5 | |
| 1.55 | 2.0 | 2.04 | - | 342 | 105 | 0.31 | 1.7 | |
| 2.87 | 2.0 | 1.62 | - | 427 | 103 | 0.24 | 1.7 | |
| 하이알루론산 | 2.0 | 2.00 | - | 241 | 1.0 | 0.42 | 1.6 | |
| 4 | 0.53 | 3.2 | 2.63 | - | 550 | 216 | 0.39 | 3.4 |
| 1.06 | 3.2 | 2.77 | - | 818 | 223 | 0.27 | 3.5 | |
| 1.55 | 3.2 | 2.78 | - | 1002 | 248 | 0.25 | 3.9 | |
| 하이알루론산 | 3.2 | 3.35 | - | 560 | 3.4 | 0.54 | 4.8 | |
| 5 | 1.55 | 2.0 | 2.04 | 121℃,8분 | 173 | 86 | 0.50 | 1.4 |
| 2.78 | 2.0 | 1.62 | 121℃,8분 | 310 | 101 | 0.32 | 1.6 | |
| 하이알루론산 | 3.2 | 3.02 | 121℃,8분 | 407 | 281 | 0.69 | 4.5 |
실시예 6
1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4) 중의 제조 실시예 10에서 수득된 각각의 광반응성 하이알루론산 유도체의 2.0중량% 용액을 상이한 조건하에서 자외선으로 조사한 다음 열처리함으로써 수득되는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔에 관한 것이다.
제조 실시예 10에서 제조되는, DS 2.28%의 광반응성 하이알루론산 유도체를 2.0중량% 용액 중의 1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수(pH 7.4)에 용해시킨다. 생성된 용액을 다음 3가지 방법에 따라서 자외선으로 조사한다. 자외선으로 조사하기 전 및/또는 후에, 용액(또는 겔)을 다음 조건하에서 열처리한다. 생성되는 겔의 가교결합 비율, 가교결합 정도 및 점탄성 특징을 측정한다.
자외선 조사(UV 조사)의 조건:
(1) 실시예 2 내지 4에서와 동일한 방법. 광반응성 하이알루론산 유도체의 수용액을 두께가 각각 2.5mm이고 1.0mm 간격으로 떨어진 한 쌍의 피렉스 유리판 사이에 유지시키고, 각 측면으로부터 4분 동안(총 8분) 3kW 금속 할라이드 램프의 자외선으로 조사한다.
(2) 용액을 한 쌍의 폴리에틸렌 필름 사이에 유지시키고 한 측면으로부터 3초 동안 400W 고압 수은 램프의 자외선으로 조사한다.
(3) 용액을 직경이 5mm인 석영으로 만든 튜브를 통하여 공급되어지는 동안 400W 고압 수은 램프를 이용하여 조사한다.
열처리 조건(오토클레이빙 방법):
A: UV 조사 후; 121℃, 8분
B: UV 조사 전; 121℃, 8분
C: UV 조사 전; 121℃, 8분, 그 다음 UV 조사 후; 100℃, 10분
D: UV 조사 후; 121℃, 15분
측정 결과는 다음 표 2에 나타나 있다.
여기서, 가교결합 비율은 다음 방정식으로부터 산정한다:
가교결합 비율(%) = 이량체화된 신남산의 몰 수 x 2/도입된 신남산의 몰 수 x 100
보다 구체적으로 언급하면, 신남산 또는 이의 이량체를 화학적으로 절단한 다음 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔로부터 추출한다. 신남산과 이의 이량체 간의 분자량 차이를 고려하면, 이러한 추출물은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 신남산과 이의 이량체로 분리되고, 각 성분을 정량적으로 측정하여 각각의 몰 수를 수득한다. 이어서, 가교결합 비율을 상기 방정식에 근거하여 산정한다.
가교결합 정도는 다음 방정식으로부터 수득한다:
가교결합 정도(%) = DS x 가교결합 비율/100
상기 방정식으로부터 알 수 있는 바와 같이, 가교결합 비율이 도입된 신남산을 기준으로 한 값이긴 하지만, 가교결합 정도(가교결합 비율과 DS의 산물)는 하이알루론산의 구성분 디삭카라이드 단위당 이량체의 몰 비(%)로서 표현될 수 있다.
| DS(%) | 광조사 조건 | 열처리 조건 | 가교결합비율(%) | 가교결합 정도(%) | 주파수: 10Hz | |||
| G'(Pa) | G"(Pa) | tanδ | η(Pa·s) | |||||
| 2.28 | (1) | A | 4.1 | 9.4x10-2 | 161 | 68 | 0.42 | 1.1 |
| 2.28 | (2) | A | 1.9 | 4.4x10-2 | 122 | 56 | 0.46 | 0.9 |
| 2.28 | (3) | B | 2.5 | 5.6x10-2 | 146 | 70 | 0.48 | 1.1 |
| 2.28 | (3) | C | 2.5 | 5.6x10-2 | 144 | 84 | 0.59 | 1.3 |
| 2.28 | (2) | D | 1.9 | 4.4x10-2 | 108 | 84 | 0.78 | 1.3 |
시험 실시예 1
랫트 자궁각 모델에서의 유착 방지 효과
본 시험 실시예는 랫트 자궁각 유착 모델에 있어서 실시예 1, 3, 5 및 6에서 수득된 겔과, 비교를 위해 실시예 1 및 3에서 제조된 바와 같은 자외선으로 조사하기 전의 광반응성 하이알루론산 유도체 용액("가교결합되지 않은 하이알루론산 겔"로서 후술됨), 시판용 유착 방지용 재료 TC7[Interceed(상표명), Johnson & Johnson 제조] 및 1.5mM 인산염 완충된 생리 식염수의 3.2중량% 용액의 유착 방지 효과에 관한 것이다.
1. 시험 동물
7주생 Crj:SD(SPF.) 암컷 랫트를 구입하고 시험하기 전 1주일 동안 사육한다. 각 그룹은 5마리 랫트로 이루어진다.
2. 시험 방법
2-1. 랫트 자궁각 유착 모델의 제조
랫트의 복부를 마취하에 넴부탈로 면도한다. 중간 라인에서 길이 약 4cm로 절개한다.
(a) 우측 복부벽을 안과 수술을 위한 트레핀을 이용하여 근육층이 되도록 절단하고 이러한 근육층을 겸자를 이용하여 스트립핑한다.
(b) 자궁각을 노출시키고, 난소 아래 약 1cm로부터 경관 쪽으로 2 내지 3mm 간격으로 횡측 방향으로 4군데를 절개한다. 전기 소작에 의해 각 절단 동안의 어떠한 시간에 지혈을 수행한다.
(c) 자궁각 상의 횡측 절개의 말단으로부터 약 3 내지 4mm 부위 및 복벽 내의 결손 말단으로부터 3 내지 4mm 부위를 단일 8/0 봉합과 함께 조합하여 상기 (a) 및 (b)에서 만든 외상을 만들어 낸다.
2-2. 투여
시험 그룹:
상기 언급된 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔, 가교결합되지 않은 하이알루론산 겔 및 하이알루론산 용액, 및 면적이 1.5 x 1.5㎠인 시판용 TC7 각 1ml를 복부벽의 결손 부분과 자궁각의 절개 부분 사이에 주입 또는 삽입한다. 보다 구체적으로 언급하면, 상기 겔을 다음과 같이 투여한다. 정확하게 칭량된 상기 언급된 겔 각 1ml를 1ml 주사기[튜베르쿨린용의 Terumo 주사기(상표명); γ선 멸균된 튜브의 내부 직경: 약 4mm; 팁의 내부 직경: 약 1mm]에 넣고 주사기의 팁을 통하여 복부벽의 결손 부분과 자궁각의 절개 부분 사이에 주입한다.
대조군 그룹:
물질의 삽입 없이 시험 그룹에 대해 사용된 것과 동일한 동물의 좌측 상의 복부벽과 자궁각에서 동일한 수술을 수행한다.
3. 평가
주입한지 7일 후에, 상기 랫트를 에틸 아테르로 마취시키면서 경동맥을 통하여 사혈시킴으로써 희생시킨다. 해부 후, 다음 점수 체계에 따라서 유착 정도로써 유착 부위를 평가한다.
0 ... 유착이 없음
1 ... 용이하게 박리될 수 있는 미약한 유착
2 ... 박리 가능한 중간 정도의 유착
3 ... 박리될 수 없는 심각한 유착
4. 결과
시험 결과가 다음 표 3에 제시되어 있다. 표 3에서, 자외선 조사 조건과 열처리 조건은 실시예 6에서 기술된 바와 동일하다.
| 실시예 번호 | DS(%) | 광조사 조건 | 열처리 조건 | 유착 방지 효과 | |
| 시험 그룹 | 대조군 그룹 | ||||
| 1 | 1.29 | (1) | - | 0,0,0,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| - | 1.29 | 조사되지않음 | - | 2,2,2,2,2 | 2,2,2,2,2 |
| 3 | 1.06 | (1) | - | 1,1,0,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| 3 | 1.26 | (1) | - | 2,0,0,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| - | 1.26 | 조사되지않음 | - | 2,2,2,2,0 | 2,2,2,2,2 |
| 3 | 1.55 | (1) | - | 0,0,0,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| 5 | 1.55 | (1) | A | 0,0,0,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| 3 | 2.87 | (1) | - | 0,0,0,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| 5 | 2.87 | (1) | A | 0,0,0,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| 6 | 2.28 | (2) | A | 1,0,0,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| 6 | 2.28 | (3) | D | 1,0,1,0,0 | 2,2,2,2,2 |
| 비교: | |||||
| TC7 | - | - | - | 2,2,2,2,2 | 2,2,2,2,2 |
| 3.2% 하이알루론산 용액 | A | 2,2,2,2,2 | 2,2,2,2,2 |
표 3에 제시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 시판용 유착 방지 필름 TC7은 본 유착 모델에서 전적으로 유효하지는 않는 반면, 본 발명에 따르는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 본 모델에서 충분한 정도로 유착 방지 효과가 있는 것으로 입증되었다.
가교결합되지 않은 겔 또는 광가교결합된 겔과 유사한 점탄성과 점도를 지니는 3.2% 하이알루론산 용액으로부터는 어떠한 효과도 유추되지 않는다는 사실로부터, 본 발명의 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 유착 방지 효과는 광경화된 가교결합에 기인된 것으로 여겨질 수 있다.
시험 실시예 2
본 시험 실시예는 복부벽의 결손 부분과 자궁각의 절개 부분에 대한 지혈없이 시험 실시예 1에서와 동일한 랫트 자궁각 유착 모델에서 본 발명에 따르는 겔의 유착 방지 효과에 관한 것이다.
복부벽과 자궁각의 절단 부분에 대한 어떠한 지혈도 수행하지 않으며 농도가 2%이고 DS가 2.5%이며 자외선으로 조사하기 전에 105℃에서 10분 동안 열처리시키고 자외선으로 조사한 후 121℃에서 8분 동안 열처리시킨 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔 0.5ml를 사용하는 것을 제외하고는, 본 발명에 따르는 겔의 유착 방지 효과를 시험 실시예 1에서와 동일한 방식으로 검사 및 평가한다(n=10). 대조군으로서, 시험 그룹에 사용된 것과 동일한 동물을 시험 실시예 1에서와 동일한 방식으로 재료의 삽입없이 검사한다.
수득된 결과가 표 4에 제시되어 있다.
| 동물 번호 | 대조군 그룹 | 시험 그룹 |
| 1 | 2 | 0 |
| 2 | 2 | 0 |
| 3 | 2 | 0 |
| 4 | 2 | 0 |
| 5 | 2 | 0 |
| 6 | 2 | 0 |
| 7 | 2 | 0 |
| 8 | 2 | 2 |
| 9 | 2 | 0 |
| 10 | 2 | 0 |
0.5ml용량의 당해 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 어떠한 지혈도 받지 않은 모델에서 상당한 유착 방지 효과를 나타내었다. 달리 말하면, 표 4의 결과는 당해 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔이 지혈을 수행하지 않고서는 환부에 적용될 수 없는 시판품 TC7에 비해 우수하다는 것을 입증하고 있다.
시험 실시예 3
랫트 장 유착 모델에서 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 유착 방지 효과
1. 시험 물질:
농도가 2%이고 DS가 2.5%이며; 자외선으로 조사하기 전에 105℃에서 10분 동안 열처리시키고 자외선으로 조사한 후 121℃에서 8분 동안 열처리시킨 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
2. 시험 동물:
7주생 SD 암컷 랫트를 구입하고 시험하기 전 1주일 동안 사육한다.
3. 유착 모델의 제조:
회장에서부터 결장까지의 장막을 길이 20cm 및 폭 3 내지 4mm로 직선으로 벗겨낸다. 지혈을 수행하지는 않는다.
4. 투여 및 그룹 형성:
예정된 양(0.5ml, 1.0ml 또는 2.0ml)의 겔을 1ml 주사기로부터 주입하여 환부에 투여한다. 투여 후, 장관을 복강 내로 복귀시키고 복부를 닫는다. 당해 겔을 투여하지 않은 유착 모델을 대조군으로 한다. 겔 0.5ml, 1.0ml 및 2.0ml 투여된 모델을 각각 0.5ml, 1.0ml 및 2.0ml 모델로 한다. 각 그룹은 10마리 랫트로 구성된다.
5. 평가 및 결과
주입한지 7일 후에, 상기 랫트를 에틸 에테르로 마취시키면서 경동맥을 통하여 사혈시킴으로써 희생시킨다. 해부 후, 시험 실시예 1에서와 동일한 점수 체계에 따라서 유착 정도를 평가한다. 수득된 결과는 다음 표 5에 제시되어 있다.
| 동물 번호 | 대조군 그룹 | 시험 그룹 | ||
| 0.5ml | 1.0ml | 2.0ml | ||
| 1 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 4 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 5 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | 2 | 0 | 0 | 1 |
| 7 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 8 | 1-2 | 0 | 0 | 0 |
| 9 | 1-2 | 1-2 | 0 | 0 |
| 10 | 1-2 | 0 | 0 | 0 |
3가지 시험 그룹 모두는 대조군 그룹에 비해 상당한 유착 방지 효과를 나타내었다. 표 5의 결과는 본 발명에 따르는 겔의 유착 방지에 대한 유효성 뿐만 아니라 장내 격렬한 연동 운동을 고려하여 조직-부착성과 조직-생적합성이 우수하다는 것을 보여준다.
더욱이, 상기 시험 실시예 1 및 2의 동물 시험에서 주입 7일 후 해부시, 투여된 대부분의 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 시야에서 사라졌다. 본 발명에 따르는 겔의 생분해성이 나타난 것이다.
앞서 기술되고 입증된 바와 같이, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 광반응성 하이알루론산 유도체의 고농도 수용액을 자외선으로 조사함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔은 무독성, 무항원성, 생적합성, 생분해성 등의 하이알루론산의 탁월한 고유 성질을 보유하면서, 적합한 점탄성, 조직-친화성, 생분해성 등과 같은 물리적 성질을 지닌다. 따라서, 안전성이 높은 의학 재료, 예를 들면, 유착 방지용 재료, 약물의 지속적인 방출을 위한 담체 등으로서 각종 분야에 적용되는 것으로 여겨진다. 더욱이, 당해 겔은 주사기, 튜브 등을 통하여 신체 환부의 미세한 부분으로 주입될 수 있으므로 현미 수술 등에 적용 가능한 것으로 예상된다.
Claims (19)
10Hz의 주파수하의 동점탄성(dynamic viscoelasticity)에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
하이알루론산의 구성분 디삭카라이드 단위 1몰 당 가교결합도가 0.01 내지 0.5%이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사함으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 광반응성 가교결합 그룹이 스페이서를 함유하는 신남산 유도체이고 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 광반응성 하이알루론산 유도체를 제공하고;
이러한 광반응성 하이알루론산 유도체의 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 자외선으로 조사시킴으로써 이량체화하여 사이클로부탄 환을 형성시키고 이로써 망상 구조를 형성시키며;
상기 겔이 상기와 같은 망상 구조 내에 수성 매질을 함유하는 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
제3항에 있어서, 상기 스페이서가 아미노 알콜, 아미노산 또는 펩티드로부터 유도된 그룹인 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
제3항 또는 제4항에 있어서, 광반응성 가교결합 그룹이 다음 화학식 1 또는 2로 나타내어지는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
화학식 1
-NH(CR1R2)nOCOCH=CH-Ph
화학식 2
-A-NH-Ph-CH=CHCOOR3
상기식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이고;
Ph는 페닐 그룹을 나타내며;
n은 2 내지 18의 정수이고;
R3은 저급 알킬 그룹 또는 아르알킬 그룹이며;
A는 -(NHCR4R5CO)m- 또는 -NH(CR4R5)hCO-이고;
R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹이며;
-Ph-는 파라-페닐렌 그룹이고;
m은 1 내지 6의 정수이고;
h는 1 내지 18의 정수이다.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 광반응성 가교결합 그룹이 구성분 디삭카라이드 단위 1몰당 0.05 내지 10%의 비율로 도입되는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
10Hz의 주파수하의 동점탄성에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시킨 다음 이와 같이 가교결합된 생성물을 열처리시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
10Hz의 주파수하의 동점탄성에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 열처리한 다음, 이와 같이 열처리된 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하에 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
10Hz의 주파수하의 동점탄성에 있어 저장 계수(G')가 50 내지 1500Pa이고 손실 계수(G")가 10 내지 300Pa이며 탄젠트 델타(G"/G')가 0.1 내지 0.8이고,
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체를 열처리한 다음, 이와 같이 열처리된 광반응성 하이알루론산 유도체를 자외선으로 조사하여 서로 광반응성인 가교결합 그룹을 가교결합시키고, 이어서 이와 같이 가교결합된 생성물을 다시 열처리시킴으로써 수득된 하이드로겔인, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 겔의 내독소 함량이 0.25 내독소 단위(EU)/g 이하인 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔.
광반응성 가교결합 그룹이 하이알루론산의 작용성 그룹에 화학적으로 연결되어 있는 광반응성 하이알루론산 유도체 0.5 내지 10중량%를 함유하는 수성 매질 용액을 자외선으로 조사하는 단계; 및
서로 광반응성인 가교결합 그룹을 이량체화하여 분자간 및/또는 분자내 가교결합을 형성하여 망상 구조를 제공하는 단계를 포함하는, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 제조 방법.
제11항에 있어서, 광반응성 하이알루론산 유도체의 수성 매질 용액을 자외선으로 조사하기 전 및/또는 후에 열처리를 수행하는, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 제조 방법.
제12항에 있어서, 열처리를 고압 스팀을 이용하여 100 내지 125℃에서 5 내지 30분 동안 수행하는, 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔의 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔을 포함하는 생의학적 재료.
제14항에 있어서, 유착 방지 효과를 지니는 생의학적 재료.
가교결합된 하이알루론산 겔과 이러한 겔을 꺼낼수 있는 상태로 함유하는 용기를 포함하는 생의학적 재료 키트.
제16항에 있어서, 상기 용기가 상기 겔을 주입하기 위해 밀어낼 수 있는 용기인 생의학적 재료 키트.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기술된 바와 같은 광경화되고 가교결합된 하이알루론산 겔과 이러한 겔을 꺼낼 수 있는 상태로 함유하는 용기를 포함하는 생의학적 재료 키트.
제18항에 있어서, 상기 용기가 상기 겔을 주입하기 위해 밀어낼 수 있는 용기인 생의학적 재료 키트.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP95-319825 | 1995-11-15 | ||
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