CN115093458A - 一种酸激活穿膜多肽载体及其应用 - Google Patents

一种酸激活穿膜多肽载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酸激活穿膜多肽载体，属于生物医药技术领域。该多肽载体结构通式为：LaHbXn，三种氨基酸的排列顺序不限；其中X为正电荷氨基酸及类似物；a＝5、6、7、8、9、10；b＝4、5、6、7、8、9；n＝0、1、2、3、4。该类多肽载体结构简单，通过不同pH条件下的细胞摄取实验、体外抗肿瘤实验、溶血实验，均表明设计合成的多肽载体LaHbXn具有明显的酸激活穿膜活性、低毒性，并能有效携带抗肿瘤药物CPT进入肿瘤细胞内部发挥抗肿瘤活性，表现出肿瘤靶向性。此外该肽在携带CPT后表现出的快速破膜活性使其在制备抗肿瘤药物和抗多药耐药方面也有巨大的应用潜力。因此，该肽在制备临床应用药物方面具有良好的应用前景。

Description

一种酸激活穿膜多肽载体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一类具有酸激活穿透细胞膜活性的靶向多肽载体，本发明还包括该酸激活穿膜多肽载体在制备药物递送系统、抗肿瘤药物输送以及抗多药耐药方面的应用。
背景技术
近年来，穿膜肽CPPs因能作为药物载体携带多种药物和生物分子进入细胞内部并且不会产生明显的毒性而受到广泛关注[Biomaterials.,2013,7080-7993]。但是大多数穿膜肽带正电荷，它们会与带负电荷的细胞膜相互作用，从而缺乏选择性，这阻碍了它们的体内应用[Adv.Drug Deliv.Rev.,2005,529-545；J.Am.Chem.Soc.,2014,12868-12871]。
为了提高穿膜肽的选择性，降低它们的毒副作用，研究者们提出了很多解决办法，例如用可切割的PEG设计纳米载体来降低传统穿膜肽的非特异性渗透，但是PEG链在肿瘤部位不能被有效全部切断，从而削弱了CPPs的细胞渗透能力[ACS.Nano.,2012,6:3491-8；Mol.Pharm.,2010,7:1816-26]。而肿瘤细胞由于异常增殖使得肿瘤周围环境的pH值略低于正常组织[Mol.Pharm.,2011,8:2032-8]，这为设计酸靶向载体或药物递送系统提供了可能。
组氨酸作为一种独特的氨基酸，对生物系统具有缓冲能力，组氨酸中咪唑环的pKa值在6.5左右，所以组氨酸在酸性环境中能质子化带正电荷，而在生理pH条件下不带电[Protein.Sci.,2006,15:1214-8]。利用组氨酸这一独特的性质，研究者们设计了一系列pH敏感的富含组氨酸的酸靶向CPPs[Bioconjug.Chem.,2011,22:1410-5]。
TAT穿膜肽是近年来发现的一类富含碱性氨基酸的短链多肽，具有较强的穿透细胞膜的能力，与核酸分子、药物蛋白分子甚至病毒体表面分子链接后，能将这些物质顺利带入细胞内发挥作用，被称为"生物导弹"。在Tat穿膜肽和低聚精氨酸肽的启发下，研究者们设计了很多阳离子穿膜肽[Chem.Res.,2013,46(12):2944-2954；J.Med.Chem.,2002,45(17):3612-3618；J.Am.Chem.Soc.,2015,137(23):7357-64]。
上述研究均表明，正电荷的数目对穿膜肽的穿膜活性有重要影响，适量增加肽链所带正电荷能有效提高其的穿膜活性[AIChE.J,2019,65；J.Drug Target.,2011,19(8):675-680]。
发明内容
本发明的目的之一：提供一种结构简单、低毒、可被肿瘤酸性环境激活的穿膜多肽载体。
本发明的目的之二：提供上述酸激活穿膜多肽载体在制备药物递送系统中的应用。
本发明的目的之三：提供上述酸激活穿膜多肽载体在抗肿瘤药物制备中的应用。
本发明的目的之四：提供上述酸激活穿膜多肽载体在抗多药耐药中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
(一)一种酸激活穿膜多肽载体的结构设计
本发明涉及的一种酸激活穿膜多肽载体，其结构中富含亮氨酸、组氨酸及适量正电荷氨基酸，其结构通式为：LaHbXn(不限定三种氨基酸的排列顺序)，其中，
X＝K或者其它正电荷氨基酸及类似物；
a＝5、6、7、8、9、10；
b＝4、5、6、7、8、9；
n＝0、1、2、3、4。
具体地，本发明所述的一种酸激活穿膜多肽载体，其结构通式为：LeuaHisbXn(不限定三种氨基酸的排列顺序)，其中，
X＝Lys或者其它正电荷氨基酸及类似物；
a＝5、6、7、8、9、10；
b＝4、5、6、7、8、9；
n＝0、1、2、3、4。
作为本发明技术方案的优选，上述酸激活穿膜多肽载体代表类似物包括L6H8K0(LH)，L6H8K1(LH-K)，L6H8K2(LH-2K)，L5H9K0(L5H9)和L5H9(K-C6)1(L5H9K-C6)，依次记为：LH，LH-K,LH-2K，L5H9和L5H9K-C6，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示。
上述酸激活穿膜多肽载体均采用经典固相合成法制备得到。
(二)酸激活穿膜多肽载体穿膜活性研究
本发明以L6H8K0(LH)，L6H8K1(LH-K)，L6H8K2(LH-2K)，L5H9K0(L5H9)和L5H9(K-C6)1(L5H9K-C6)为例，进行靶向载体肽酸激活穿膜活性研究及其携带抗肿瘤药物发挥抗肿瘤活性的研究。
1.酸激活肽的细胞摄取实验
将Hela细胞接种在24孔板中，10万/孔，孵育24h后，吸出孔中原有的培养液。加入pH7.4或pH6.0的含有5μM FITC-肽的无血清培养基，作用1h后，收集细胞于1.5ml的EP管中，800rpm离心5min，用PBS清洗细胞，再将细胞重悬于500μLPBS中，用细胞流式仪分析肽进入细胞的情况。只用培养基作用的细胞作为空白对照。计算pH6.0条件下平均荧光强度与pH7.4条件下平均荧光强度的比值。重复三次独立平行实验。结果见图1。
图1表明，和对照相比，LH，LH-K,LH-2K，L5H9和L5H9K-C6在pH6.0条件下的平均荧光强度均明显高于pH7.4条件下，显示出酸激活穿膜活性。
将hela细胞接种在小皿中，6万/皿。培养24h后，用pH7.4或pH6.0的含5μMFITC-肽的无血清培养基作用于细胞1h，用PBS清洗细胞一次，每皿中加入1ml PBS，用激光共聚焦显微镜观察肽进入细胞的情况。重复三次独立平行实验。结果如图2所示。
从图2中可以看出，在pH7.4条件下，LH，LH-K,LH-2K，L5H9和L5H9K-C6几乎不发挥穿膜活性。而在pH6.0条件下，上述肽均显示出明显的酸激活穿膜活性，并且LH-K携带荧光染料FITC进入细胞内部的能力明显强于其他肽，显示出优越的酸激活穿膜活性。
2.体外抗肿瘤活性
将Hela细胞接种在96孔板中，5000/孔，孵育24h。用含不同浓度CPT或CPT-肽的pH7.4或pH6.0的无血清培养液作用于细胞1h，吸出原培养液，每孔中加入100μL含10％血清的培养液，继续培养72h，每孔中加入10μL MTT，孵育4h，然后吸出孔中液体，每孔中加入150μL DMSO，将细胞板置于微量振荡器上震5min，用酶标仪测490nm处的吸光值，计算细胞存活率。只加培养基的孔作为空白对照。重复三次独立平行实验。结果如图3所示。
从图3可以看出，与CPT(喜树碱)相比，CPT-LH，CPT-LH-K,CPT-LH-2K，CPT-L5H9和CPT-L5H9K-C6均显示出酸激活抗肿瘤活性。在pH6.0条件下显示出更优的抗肿瘤活性。另选MCF-7细胞同法操作，得到相似的结果，结果见图4。这也进一步说明LH，LH-K,LH-2K，L5H9和L5H9K-C6具有较优的酸激活穿膜活性，可以在pH6.0条件下携带更多的CPT进入细胞内部，发挥酸响应性的抗肿瘤活性。
3.毒性实验
(1)24h-MTT实验
将Hela细胞接种在96孔板中，5000/孔，培养24h后，用含不同浓度多肽载体的含5％血清的培养液(pH7.4)作用于细胞24h，每孔中加入10μL的MTT，继续孵育4h，吸出孔中液体，每孔中加入150μL的DMSO，将板子于微量振荡器上震5min，用酶标仪测490nm处的吸光值，计算细胞存活率。只加培养基的孔作为空白对照。重复三次独立平行实验。结果如图5所示。
图5结果表明，LH，LH-K,LH-2K，L5H9和L5H9K-C6在pH7.4条件下对Hela细胞具有较低的毒性。药物作用24h后，即使在最大浓度40μM时，细胞存活率依然高于70％。选用MCF-7细胞同法操作，依然得到相似结果，LH，LH-K,LH-2K，L5H9和L5H9K-C6对MCF-7细胞显示出较低的细胞毒性。结果见图6。
(2)溶血实验
收集小鼠新鲜血液，800rpm离心5min，弃上清，用PBS洗红细胞三次。将含8％红细胞的PBS溶液接种在96孔板中，100μL/孔。将用PBS配制的不同浓度的多肽载体溶液加入到含有红细胞的板子中，100μL/孔。将细胞板于微量振荡器上震1min，将细胞板置于37℃的培养箱中孵育1h后，1200g离心15min，从每孔中吸取100μL上清液转移到另一新的96孔板中，用酶标仪测上清液在490nm处的吸光值。计算多肽载体的溶血率。2％Triton X-100作用的孔作为阳性对照，PBS作用的孔作为阴性对照。重复三次独立平行实验。结果如图7所示。
从图7可以看出，酸激活穿膜肽载体LH，LH-K,LH-2K，L5H9和L5H9K-C6即使在最大浓度200μM条件下溶血率仍几乎为0，几乎不显示溶血毒性。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
1、本发明酸激活穿膜多肽载体，其结构中富含亮氨酸、组氨酸及适量正电荷氨基酸X，其结构通式为：LaHbXn，该类多肽载体结构简单，且不限定三种氨基酸的排列顺序。
2、本发明酸激活穿膜多肽载体通过电荷和疏水性优化最大限度地提高多肽载体的酸响应性的同时，降低多肽载体的毒性，研究显示：本发明酸激活穿膜多肽载体具有优越的酸激活穿膜活性，并能在pH6.0条件下有效携带抗肿瘤药物CPT进入细胞内部，显示出优越的酸激活抗肿瘤活性。并且本发明设计的酸激活穿膜多肽显示出较低的细胞毒性和溶血毒性。此外该肽在携带CPT后表现出的快速破膜活性使其在制备抗肿瘤药物和抗多药耐药方面也有巨大的应用前景。
附图说明
图1是细胞流式实验，多肽载体在pH6.0与pH7.4条件下平均荧光强度的比值图；
图2是多肽载体在不同pH条件下携带FITC进入细胞内部的激光共聚焦显微镜图；
图3是多肽载体连接CPT后作用于Hela细胞的体外抗肿瘤活性结果图；
图4是多肽载体连接CPT后作用于MCF-7细胞的体外抗肿瘤活性结果图；
图5是多肽载体在pH7.4条件下作用于Hela细胞24h的MTT实验结果图；
图6是多肽载体在pH7.4条件下作用于MCF-7细胞24h的MTT实验结果图；
图7是多肽载体的溶血结果图；
图8是LH的质谱图；
图9是FITC-LH的质谱图；
图10是Cys-LH的质谱图；
图11是2-(2-pyridinyldithio)-ethanol的质谱图；
图12是活化CPT的的质谱图；
图13是CPT-LH的质谱图；
图14是LH-K的质谱图；
图15是FITC-LH-K的质谱图；
图16是Cys-LH-K的质谱图；
图17是CPT-LH-K的质谱图；
图18是LH-2K的质谱图；
图19是FITC-LH-2K的质谱图；
图20是Cys-LH-2K的质谱图；
图21是CPT-LH-2K的质谱图；
图22是L5H9的质谱图；
图23是FITC-L5H9的质谱图；
图24是Cys-L5H9的质谱图；
图25是CPT-L5H9的质谱图；
图26是L5H9K-C6的质谱图；
图27是FITC-L5H9K-C6的质谱图；
图28是Cys-L5H9K-C6的质谱图；
图29是CPT-L5H9K-C6的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明具有酸激活穿膜活性的多肽载体的合成过程作进一步说明。
实施例1：LH、FITC/CPT-LH的合成
第一部分：LH的合成
将0.5g的MBHA树脂和12ml DCM置于合成仪中，搅拌30min溶胀树脂，用DMF清洗树脂三遍，用茚三酮显色法检定树脂。用含20％哌啶的DMF溶液洗树脂脱去氨基的保护基团。用DMF洗去残留的哌啶，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。将371.8mg的Fmoc-His(Trt)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU用DMF溶解后与0.2ml的DIEA混合，然后一起加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的氨基酸，茚三酮显色法检测树脂呈无色，得到Fmoc-His-MBHA。再用含20％哌啶的DMF溶液脱去组氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成Fmoc-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液脱去最后一个Leu的Fmoc基团。用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从树脂上切下，用去离子水和乙醚萃取合成的肽，冷冻干燥，得到粗肽，经HPLC纯化后得到纯肽LH。分子量为1793Da，质谱图如图8所示。
第二部分：FITC-LH的合成
将0.5g树脂用DCM溶胀搅拌30min。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂,脱去树脂上氨基的保护基团。用DMF洗去残留的哌啶。将371.8mg的Fmoc-His(Trt)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU用DMF溶解后，向其中加入0.2ml的DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，搅拌反应1h后，用DMF洗去残留的氨基酸。用茚三酮显色法检定树脂呈无色，得到Fmoc-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去组氨酸上的Fmoc基团，后续步骤同上，直至合成得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去亮氨酸上的Fmoc基团。用DMF溶解117mg的FITC，再向其中加入0.4ml的DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，避光搅拌反应过夜。用DMF洗去残留的FITC，用茚三酮显色法检定树脂呈黄色，得到FITC-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-MBHA。用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从树脂上切下，用去离子水和乙醚萃取合成的肽，冷冻干燥，得到粗肽，经HPLC纯化后得到纯肽FITC-LH。分子量为2295Da，质谱图如图9所示。
第三部分：CPT-LH的合成
(1)Cys-LH的合成
将0.5g的树脂用DCM溶胀，于多肽合成仪中搅拌30min。用DMF洗涤树脂3次。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂4次，脱去树脂上氨基的保护基团。用DMF洗去残留的哌啶，将371.8mg的Fmoc-His(Trt)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU溶于DMF中，再向其中加入0.2ml DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，搅拌反应1h后，用DMF洗去未反应的氨基酸，用茚三酮显色法检定氨基酸的耦合情况，树脂呈无色，则氨基酸耦合成功，得到Fmoc-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液脱去组氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成Fmoc-Cys-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液脱去半胱氨酸上的Fmoc基团，用切割剂(TFA：Triisopropylsilane：1,2-Ethanedithiol：H2O＝9.4:0.25:0.25:1v:v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽Cys-LH。分子量为1896Da，质谱图如图10所示。
(2)2-(2-pyridinyldithio)-ethanol的合成
将330mg的2,2-二硫二吡啶加入到50ml的圆底烧瓶中，在烧瓶中加入磁子，密封后，将烧瓶内部抽成真空状态，充入氩气。向烧瓶中加入5ml甲醇搅拌溶解。将87mg的巯基乙醇溶于5ml甲醇中，然后逐滴加入到圆底烧瓶中，搅拌反应3h。用硅胶柱纯化反应产物得到2-(2-pyridinyldithio)-ethanol，分子量为187Da，质谱图如图11所示。
(3)CPT的活化
将372.5mg CPT和356.6mg DMAP置于25ml的圆底烧瓶中，加入磁子，将烧瓶抽真空，充入氩气，加入5mL DCM，冰浴搅拌15min，将三光气溶于3ml DCM中，逐滴加入到圆底烧瓶中，继续冰浴反应15min，撤去冰浴。将前述得到的2-(2-pyridinyldithio)-ethanol溶于3ml DCM中，逐滴加入到烧瓶中，避光，反应过夜。将反应产物用硅胶柱纯化得到。分子量为562Da，质谱图如图12所示。
(4)CPT-LH的合成
在5ml的圆底烧瓶中放入磁子，密封，抽真空，充入氩气，将14.5mg的Cys-LH和6.5mg的活化CPT分别用1ml的DMSO溶解，加入到圆底烧瓶中，搅拌反应过夜，经HPLC纯化得到CPT-LH，分子量为2346Da，质谱图如图13所示。
实施例2：LH-K、FITC/CPT-LH-K的合成
第一部分：LH-K的合成
将0.5g的MBHA树脂用DCM搅拌溶胀30min，用DMF洗去DCM。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。用DMF溶解281.2mg的Fmoc-Lys(Boc)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2mlDIEA，混匀，加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的氨基酸，用茚三酮显色反应检定树脂显无色，得到Fmoc-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF洗树脂，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去最后一个亮氨酸的Fmoc基团。用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。接着用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽LH-K。分子量为1921Da，质谱图如图14所示。
第二部分：FITC-LH-K的合成
用DCM将0.5g MBHA树脂溶胀搅拌30min。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去树脂上氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶。用DMF溶解281.2mg的Fmoc-Lys(Boc)-OH、81.2m的HOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2ml DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去残留的氨基酸，用茚三酮显色反应检定树脂呈无色，得到Fmoc-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后续步骤同上，直至得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去亮氨酸上的Fmoc基团。将117mg的FITC溶于DMF中，再向其中加入0.4ml的DIEA，混合后加入到多肽合成仪中，避光搅拌反应过夜。用DMF洗去残留的FITC，用茚三酮显色法检定树脂呈黄色，得到FITC-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Lys-MBHA。接着用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽FITC-LH-K。分子量为2423Da，质谱图如图15所示。
第三部分：CPT-LH-K的合成
(1)Cys-LH-K的合成
将0.5g的MBHA树脂用DCM溶胀搅拌30min，用DMF洗涤树脂3次，用含20％哌啶的DMF溶液脱去氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶。将281.2mg的Fmoc-Lys(Boc)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU溶于DMF后，向其中加入0.2ml的DIEA，混合后一起加入合成仪中，搅拌反应1h后，用茚三酮显色法检定树脂呈无色，得到Fmoc-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂四次，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后续步骤同上，直至合成Fmoc-Cys-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去半胱氨酸上的Fmoc基团。用切割剂(TFA：Triisopropylsilane：1,2-Ethanedithiol：H2O＝9.4:0.25:0.25:1v:v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽Cys-LH-K。分子量为2024Da，质谱图如图16所示。
(2)2-(2-pyridinyldithio)-ethanol的合成
同实施例1
(3)CPT的活化
同实施例1
(4)CPT-LH-K的合成
在5ml的圆底烧瓶中放入磁子，密封，抽真空，充入氩气。将15.6mg的Cys-LH-K和6.5mg活化的CPT分别用1ml的DMSO溶解，加入到圆底烧瓶中，搅拌反应过夜，经HPLC纯化得到产物CPT-LH-K。分子量为2474Da，质谱图如图17所示。
实施例3：LH-2K、FITC/CPT-LH-2K的合成
第一部分：LH-2K的合成
将0.5g的MBHA树脂用DCM搅拌溶胀30min，用DMF洗去DCM。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。用DMF溶解281.2mg的Fmoc-Lys(Boc)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2mlDIEA，混匀，加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的氨基酸，用茚三酮显色反应检定树脂显无色，得到Fmoc-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF洗树脂，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Lys-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去最后一个亮氨酸的Fmoc基团。用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。接着用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽LH-2K。分子量为2049Da，质谱图如图18所示。
第二部分：FITC-LH-2K的合成
用DCM将0.5g MBHA树脂溶胀搅拌30min。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去树脂上氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶。用DMF溶解281.2mg的Fmoc-Lys(Boc)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2ml DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去残留的氨基酸，用茚三酮显色反应检定树脂呈无色，得到Fmoc-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后续步骤同上，直至合成得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Lys-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去亮氨酸上的Fmoc基团。将117mg的FITC溶于DMF中，再向其中加入0.4ml的DIEA，混合后加入到多肽合成仪中，避光搅拌反应过夜。用DMF洗去残留的FITC，用茚三酮显色法检定树脂呈黄色，得到FITC-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Lys-Lys-MBHA。接着用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽FITC-LH-2K。分子量为2551Da，质谱图如图19所示。
第三部分：CPT-LH-2K的合成
(1)Cys-LH-2K的合成
将0.5g的MBHA树脂用DCM溶胀搅拌30min，用DMF洗涤树脂3次，用含20％哌啶的DMF溶液脱去氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶。将281.2mg的Fmoc-Lys(Boc)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU溶于DMF后，向其中加入0.2ml的DIEA，混合后一起加入合成仪中，搅拌反应1h后，用茚三酮显色法检定树脂呈无色，得到Fmoc-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂四次，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后续步骤同上，直至合成Fmoc-Cys-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Lys-Lys-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去半胱氨酸上的Fmoc基团。用切割剂(TFA：Triisopropylsilane：1,2-Ethanedithiol：H2O＝9.4:0.25:0.25:1v:v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽Cys-LH-2K。分子量为2152Da，质谱图如图20所示。
(2)2-(2-pyridinyldithio)-ethanol的合成
同实施例1
(3)CPT的活化
同实施例1
(4)CPT-LH-2K的合成
在5ml的圆底烧瓶中放入磁子，密封，抽真空，充入氩气。将10.1mg的Cys-LH-2K和4mg活化的CPT分别用1ml的DMSO溶解，加入到圆底烧瓶中，搅拌反应过夜，经HPLC纯化得到产物CPT-LH-2K。分子量为2602Da，质谱图如图21所示。
实施例4：L5H9、FITC/CPT-L5H9的合成
第一部分：L5H9的合成
将0.5g的MBHA树脂和12ml DCM置于合成仪中，搅拌30min溶胀树脂，用DMF清洗树脂三遍，用茚三酮显色法检定树脂。用含20％哌啶的DMF溶液洗树脂脱去氨基的保护基团。用DMF洗去残留的哌啶，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。将371.8mg的Fmoc-His(Trt)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU用DMF溶解后与0.2ml的DIEA混合，然后一起加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的氨基酸，茚三酮显色法检测树脂呈无色，得到Fmoc-His-MBHA。再用含20％哌啶的DMF溶液脱去组氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成Fmoc-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液脱去最后一个Leu的Fmoc基团。用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从树脂上切下，用去离子水和乙醚萃取合成的肽，冷冻干燥，得到粗肽，经HPLC纯化后得到纯肽L5H9。分子量为1817Da，质谱图如图22所示。
第二部分：FITC-L5H9的合成
将0.5g树脂用DCM溶胀搅拌30min。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂脱去树脂上氨基的保护基团。用DMF洗去残留的哌啶。将371.8mg的Fmoc-His(Trt)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU用DMF溶解后，向其中加入0.2ml的DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，搅拌反应1h后，用DMF洗去残留的氨基酸。用茚三酮显色法检定树脂呈无色，得到Fmoc-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去组氨酸上的Fmoc基团，后续步骤同上，直至合成得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去亮氨酸上的Fmoc基团。用DMF溶解117mg的FITC，再向其中加入0.4ml的DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，避光搅拌反应过夜。用DMF洗去残留的FITC，用茚三酮显色法检定树脂呈黄色，得到FITC-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-MBHA。用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从树脂上切下，用去离子水和乙醚萃取合成的肽，冷冻干燥，得到粗肽，经HPLC纯化后得到纯肽FITC-L5H9。分子量为2319Da，质谱图如图23所示。
第三部分：CPT-L5H9的合成
(1)Cys-L5H9的合成
将0.5g的树脂用DCM溶胀，于多肽合成仪中搅拌30min。用DMF洗涤树脂3次。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂4次，脱去树脂上氨基的保护基团。用DMF洗去残留的哌啶，将371.8mg的Fmoc-His(Trt)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU溶于DMF中，再向其中加入0.2ml DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，搅拌反应1h后，用DMF洗去未反应的氨基酸，用茚三酮显色法检定氨基酸的耦合情况，树脂呈无色，则氨基酸耦合成功，得到Fmoc-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液脱去组氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成Fmoc-Cys-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液脱去半胱氨酸上的Fmoc基团，用切割剂(TFA：Triisopropylsilane：1,2-Ethanedithiol：H2O＝9.4:0.25:0.25:1v:v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽Cys-L5H9。分子量为1920Da，质谱图如图24所示。
(2)2-(2-pyridinyldithio)-ethanol的合成
同实施例1
(3)CPT的活化
同实施例1
(4)CPT-L5H9的合成
在5ml的圆底烧瓶中放入磁子，密封，抽真空，充入氩气，将15mg的Cys-L5H9和6.7mg的活化CPT分别用1ml的DMSO溶解，加入到圆底烧瓶中，搅拌反应过夜，经HPLC纯化得到CPT-L5H9，分子量为2370Da，质谱图如图25所示。
实施例5：L5H9K-C6、FITC/CPT-L5H9K-C6的合成
第一部分：L5H9K-C6的合成
将0.5g的MBHA树脂用DCM搅拌溶胀30min，用DMF洗去DCM。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。用DMF溶解384.5mg的Fmoc-Lys(mtt)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2mlDIEA，混匀，加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的氨基酸，用茚三酮显色反应检定树脂显无色，得到Fmoc-Lys(mtt)-MBHA。用含20％哌啶的DMF洗树脂，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-Lys(mtt)-MBHA。用含1％TFA的二氯甲烷溶液洗涤树脂，脱去Lys侧链的mtt基团，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色，用DMF溶解69.7mg的C6H12O2、81.2mg HOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2ml DIEA，混匀，加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的己酸，用茚三酮显色反应检定树脂显无色，得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-Lys(C6)-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去最后一个亮氨酸的Fmoc基团。用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。接着用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽L5H9K-C6。分子量为2043Da，质谱图如图26所示。
第二部分：FITC-L5H9K-C6的合成
将0.5g的MBHA树脂用DCM搅拌溶胀30min，用DMF洗去DCM。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。用DMF溶解384.5mg的Fmoc-Lys(mtt)-OH、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2mlDIEA，混匀，加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的氨基酸，用茚三酮显色反应检定树脂显无色，得到Fmoc-Lys(mtt)-MBHA。用含20％哌啶的DMF洗树脂，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-Lys(mtt)-MBHA。用含1％TFA的二氯甲烷溶液洗涤树脂，脱去Lys侧链的mtt基团，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色，用DMF溶解69.7mg的C6H12O2、81.2mg的HOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2ml DIEA，混匀，加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的己酸，用茚三酮显色反应检定树脂显无色，得到Fmoc-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-Lys(C6)-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去亮氨酸上的Fmoc基团。用DMF溶解117mg的FITC，再向其中加入0.4ml的DIEA，混合后一起加入到多肽合成仪中，避光搅拌反应过夜。用DMF洗去残留的FITC，用茚三酮显色法检定树脂呈黄色，得到FITC-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-Lys(C6)-MBHA。接着用切割剂(TFA:Triisopropylsilane:H2O＝9.5:0.25:0.25v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽FITC-L5H9K-C6。分子量为2545Da，质谱图如图27所示。
第三部分：CPT-L5H9K-C6的合成
(1)Cys-L5H9K-C6的合成
将0.5g的MBHA树脂用DCM搅拌溶胀30min，用DMF洗去DCM。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去氨基的保护基团，用DMF洗去残留的哌啶，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。用DMF溶解384.5mg的Fmoc-Lys(mtt)-OH、81.2mg的HOBT、227.6mg的HBTU后，加入0.2mlDIEA，混匀，加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的氨基酸，用茚三酮显色反应检定树脂显无色，得到Fmoc-Lys(mtt)-MBHA。用含20％哌啶的DMF洗树脂，脱去赖氨酸上的Fmoc基团，后面步骤同上，直至合成得到Fmoc-Cys-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-Lys(mtt)-MBHA。用含1％TFA的二氯甲烷溶液洗涤树脂，脱去Lys侧链的mtt基团，用茚三酮显色法检定树脂显蓝色，用DMF溶解69.7mg的C6H12O2、81.2mgHOBT和227.6mg的HBTU后，加入0.2ml DIEA，混匀，加入到合成仪中，搅拌反应1h。用DMF洗去未反应的己酸，用茚三酮显色反应检定树脂显无色，得到Fmoc-Cys-Leu-His-His-Leu-His-His-Leu-Leu-His-His-Leu-His-His-His-Lys(C6)-MBHA。用含20％哌啶的DMF溶液洗涤树脂，脱去最后一个半胱氨酸的Fmoc基团。用茚三酮显色法检定树脂显蓝色。接着用切割剂(TFA：Triisopropylsilane：1,2-Ethanedithiol：H2O＝9.4:0.25:0.25:1v:v:v:v)将肽链从MBHA树脂上切掉，用乙醚和水萃取，得到肽的水溶液，冷冻干燥。经HPLC纯化得到纯肽Cys-L5H9K-C6。分子量为2146Da，质谱图如图28所示。
(2)2-(2-pyridinyldithio)-ethanol的合成
同实施例1
(3)CPT的活化
同实施例1
(4)CPT-L5H9K-C6的合成
在5ml的圆底烧瓶中放入磁子，密封，抽真空，充入氩气，将10mg的Cys-L5H9K-C6和4.2mg的活化CPT分别用1ml的DMSO溶解，加入到圆底烧瓶中，搅拌反应过夜，经HPLC纯化得到CPT-L5H9K-C6，分子量为2596Da，质谱图如图29所示。
序列表
<110> 倪京满
王锐
<120> 一种酸激活穿膜多肽载体及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu His His Leu Leu His His Leu His His Leu Leu His His
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu His His Leu Leu His His Leu His His Leu Leu His His Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu His His Leu Leu His His Leu His His Leu Leu His His Lys Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu His His Leu His His Leu Leu His His Leu His His His
1 5 10
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu His His Leu His His Leu Leu His His Leu His His His Lys
1 5 10 15

Claims (7)

1.一种酸激活穿膜多肽载体，其特征是，所述多肽载体的结构通式为：LaHbXn；
其中，X为正电荷氨基酸及类似物，三种氨基酸的排列顺序不限，
a＝5、6、7、8、9、10；
b＝4、5、6、7、8、9；
n＝0、1、2、3、4。
2.如权利要求1所述的一种酸激活穿膜多肽载体，其特征是，所述X为K或其他正电荷氨基酸及类似物。
3.如权利要求2所述的一种酸激活穿膜多肽载体，其特征是，所述酸激活穿膜多肽载体代表类似物包括L6H8K0(LH)，L6H8K1(LH-K)，L6H8K2(LH-2K)，L5H9K0(L5H9)和L5H9(K-C6)1(L5H9K-C6)，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示；其中L5H9(K-C6)1是在肽链L5H9K的碳末端用正己酸修饰所得。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种酸激活穿膜多肽载体在作为靶向载体或制备药物递送系统中的应用。
5.如权利要求1-3任一项所述的一种酸激活穿膜多肽载体在制备临床药物中的应用。
6.如权利要求5所述的一种酸激活穿膜多肽载体在制备临床抗肿瘤药物中的应用。
7.如权利要求5所述的一种酸激活穿膜多肽载体在抗多药耐药中的应用。
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