CN108570102A - 一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种具有抗菌活性的多肽Pv26‑3,属于基因工程药物技术领域,其采用色氨酸W替换了母分子Pv26的氨基酸序列的七号位、十一号位、二十一号位、二十五号位的氨基酸,并采用赖氨酸K替换了一号位、十二号位、二十号位和二十四号位的氨基酸,增强了母分子Pv26的疏水性和正电荷性。由于疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用,故疏水性的提高有利于抗菌肽发挥抗菌作用;抗菌肽通过静电作用结合在膜上,促进疏水基团结合到膜内,继而破坏膜结构,造成细胞死亡,因此正电荷性是影响抗菌肽与膜结合的关键因素;疏水性和正电荷性的提高可以增强抗菌肽与膜的结合能力,提高了抗菌肽的抗菌活性和抑菌效果,同时降低了抗菌肽的作用浓度。
Description
技术领域
本申请实施例涉及基因工程药物技术领域,特别涉及一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3。
背景技术
目前,抗生素滥用现象严重,导致具有耐药性效果的致病菌层出不穷。抗菌肽因其独特的杀菌机理,不易产生耐药性的优点,已成为替代抗生素的理想选择。抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)是一类具有抗菌活性的多肽,最早在昆虫体内被发现,被认为是先天免疫系统必不可少的组成成分。抗菌肽为小分子多肽,相对分子质量较小,一般在10kDa以下。通常认为抗菌肽的抗菌作用机理是通过改变细胞膜通透性,破坏细菌细胞膜后引起细胞渗透压改变和内容物渗出导致细菌死亡。
因此,亟待通过基因工程开发设计一种具有抗菌活性的多肽替代广谱抗生素,提高抗菌肽的抑菌效果,同时降低抗菌肽的作用浓度。
发明内容
本申请实施例提供了一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3,旨在通过截短和定向氨基酸改变的方式获取高磷蛋白衍生抗菌多肽,替代广谱抗生素,提高抗菌肽的抑菌效果,同时降低抗菌肽的作用浓度。
本发明提供了一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3,所述多肽Pv26-3为基于高磷蛋白序列截断获得的母分子Pv26的突变体,所述母分子Pv26的氨基酸序列为DTSSG SAAASFEQMQ KQNRF LGNDIP,所述多肽Pv26-3的氨基酸序列为KTSSG SWAAS WKQMQ KQNRKWGNKWP。
可选的,所述高磷蛋白为卵黄高磷蛋白,所述卵黄高磷蛋白为卵黄蛋白降解的衍生蛋白质。
可选的,所述母分子Pv26为一段含有26个氨基酸残基的α螺旋状氨基酸,所述母分子Pv26的疏水率为30%,所述α螺旋状氨基带有一个负电荷。
可选的,所述母分子Pv26的氨基酸序列的七号位为丙氨酸A、十一号位为苯丙氨酸F、二十一号位为亮氨酸L、二十五号位为异亮氨酸I。
可选的,所述母分子Pv26的氨基酸序列的一号位为天冬氨酸D、十二号位为谷氨酸E、二十号位为苯丙氨酸F和二十四号位为天冬氨酸D。
可选的,所述多肽Pv26-3的氨基酸序列的七号位、十一号位、二十一号位、二十五号位均为色氨酸W。
可选的,所述多肽Pv26-3的氨基酸序列的一号位、十二号位、二十号位和二十四号位均为赖氨酸K。
本申请实施例提供的技术方案带来的有益效果是:
本发明实施例提供的一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3,其采用基于高磷蛋白序列截断获得的母分子Pv26通过基因替换获得,由于其采用色氨酸W替换了母分子Pv26的氨基酸序列的七号位的丙氨酸A、十一号位的苯丙氨酸F、二十一号位的亮氨酸L、二十五号位的异亮氨酸I,并采用赖氨酸K替换了母分子Pv26的氨基酸序列的一号位的天冬氨酸D、十二号位的谷氨酸E、二十号位的苯丙氨酸F和二十四号位的天冬氨酸D,将特定位点的氨基酸替换为色氨酸或者赖氨酸,增强了多肽的疏水性和正电荷,而且疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用,因此疏水性的提高有利于抗菌肽发挥抗菌作用,正电荷是影响抗菌肽与膜结合的关键因素,抗菌肽通过静电作用结合在膜上,竞争性的取代2价阳离子,促进疏水基团结合到膜内,继而破坏膜结构,形成孔洞,造成细胞死亡,增加抗菌肽的正电荷数量,可以增强抗菌肽与膜的结合能力,有利于提高抗菌活性,进而提高本发明实施例的抗菌肽的抑菌效果,同时降低了本发明实施例的抗菌肽的作用浓度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是透射电镜下本发明实施例的多肽Pv26-3的对细菌的影响结果示意图;
图2是免疫酶标分析本发明实施例的多肽Pv26-3的对与LPS、LTA和PGN结合结果示意图;
图3是膜电位变化分析本发明实施例的多肽Pv26-3的膜电位变化结果示意图;
图4是本发明实施例的多肽Pv26-3的流式细胞仪分析结果示意图;
图5是本发明实施例的多肽Pv26-3的溶血作用分析结果示意图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
下面将对本发明实施例的一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3进行详细说明。
本发明实施例的一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3为基于高磷蛋白序列截断获得的母分子Pv26的突变体,其中,母分子Pv26的氨基酸序列为DTSSG SAAAS FEQMQ KQNRFLGNDIP,本发明实施例的多肽Pv26-3的氨基酸序列为KTSSG SWAAS WKQMQ KQNRK WGNKWP。
具体的,本发明实施例采用的高磷蛋白为卵黄高磷蛋白,该卵黄高磷蛋白为卵黄蛋白降解的衍生蛋白质。卵黄蛋白的功能在早期一直被认为是在胚胎发育过程中提供营养物质,我们在近期的研究中发现它还有免疫相关功能。其中,卵黄高磷蛋白是卵黄蛋白降解的衍生蛋白质之一。实验室前期试验研究发现重组的斑马鱼卵黄高磷蛋白具有抑菌能力,同时使用氨基端截短表达的方法,我们发现羧基端的一段氨基酸仍具有免疫活性。因此我们使用该段氨基酸作为模板进一步的截短,获得了母分子Pv26,通过对母分子Pv26特定位点氨基酸的替换,我们获得了母分子Pv26的3个突变体Pv26-1、Pv26-2、Pv26-3。
其中,母分子Pv26的突变体Pv26-1的氨基酸序列如下所示:DTSSGSWAASWEQMQKQNRFWGNDWP,母分子Pv26的突变体Pv26-2的氨基酸序列为:KTSSGSAAASFKQMQKQNRKLGNKIP。
具体的,母分子Pv26为一段含有26个氨基酸残基的α螺旋状氨基酸,母分子Pv26的疏水率为30%,其α螺旋状氨基带有一个负电荷。大量研究表明影响抗菌肽抗菌活性的主要性质包括疏水性和正电荷性。疏水基团的存在使得肽链在溶液中更易形成多聚体,增加了抗菌肽形成两亲性α螺旋的能力,而α螺旋的增加也提高了抗菌肽的稳定性。
结构分析显示Pv26呈现较为完整的α螺旋性,因此是较为理想的抗菌肽模板。但Pv26疏水性不高,且带有负电荷,不利于其与细菌互相识别结合以及发挥抑菌作用。同时由于疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用,故一定范围内疏水性的提高有利于抗菌肽发挥作用。正电荷是影响抗菌肽与膜结合的关键因素,抗菌肽通过静电作用结合在膜上,竞争性的取代2价阳离子,促进疏水基团结合到膜内,继而破坏膜结构,形成孔洞,造成细胞死亡。因此增加抗菌肽的正电荷数量,可以增强抗菌肽与膜的结合能力,有利于提高抗菌活性。
研究表明色氨酸(W)有利于促进抗菌肽与细菌细胞膜相互作用,能有效提高多肽疏水性,而赖氨酸(K)携带一个正电荷,可以提升多肽的正电荷性。因此本研究从增强疏水性和增加正电荷两个方面考出发,对Pv26进行了改造。螺旋轮预测分析显示Pv26疏水基团和亲水基团交替分布在抗菌肽的两侧,形成了疏水面和亲水面。本研究对疏水面和亲水面分别进行改造,选取特定位点的氨基酸替换为色氨酸或赖氨酸以增强氨基酸的疏水性和电荷性。
具体的,本申请采用色氨酸替换多肽Pv26七号位的丙氨酸(A)、十一号位的苯丙氨酸(F),二十一号位的亮氨酸(L)和二十五号位的异亮氨酸(I),得到突变多肽Pv26-1。采用赖氨酸替换多肽Pv26一号位的天冬氨酸(D)、十二号位的谷氨酸(E)、二十号位的苯丙氨酸和二十四号位的天冬氨酸(D),得到突变多肽Pv26-2。
进一步的,采用色氨酸W替换了母分子Pv26的氨基酸序列的七号位的丙氨酸A、十一号位的苯丙氨酸F、二十一号位的亮氨酸L、二十五号位的异亮氨酸I,并采用赖氨酸K替换了母分子Pv26的氨基酸序列的一号位的天冬氨酸D、十二号位的谷氨酸E、二十号位的苯丙氨酸F和二十四号位的天冬氨酸D,得到突变多肽Pv26-3。
通过实验分析发现,多肽Pv26-1相较母分子Pv26提高了疏水性,多肽Pv26-2相较母分子Pv26提高了正电荷性,而多肽Pv26-3相较母分子Pv26同时提高了疏水性和正电荷性。
本发明实施例提供的一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3,其采用基于高磷蛋白序列截断获得的母分子Pv26通过基因替换获得,由于其采用色氨酸W替换了母分子Pv26的氨基酸序列的七号位的丙氨酸A、十一号位的苯丙氨酸F、二十一号位的亮氨酸L、二十五号位的异亮氨酸I,并采用赖氨酸K替换了母分子Pv26的氨基酸序列的一号位的天冬氨酸D、十二号位的谷氨酸E、二十号位的苯丙氨酸F和二十四号位的天冬氨酸D,将特定位点的氨基酸替换为色氨酸或者赖氨酸,增强了多肽的疏水性和正电荷,而且疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用,因此疏水性的提高有利于抗菌肽发挥抗菌作用,正电荷是影响抗菌肽与膜结合的关键因素,抗菌肽通过静电作用结合在膜上,竞争性的取代2价阳离子,促进疏水基团结合到膜内,继而破坏膜结构,形成孔洞,造成细胞死亡,增加抗菌肽的正电荷数量,可以增强抗菌肽与膜的结合能力,有利于提高抗菌活性,进而提高本发明实施例的抗菌肽的抑菌效果,同时降低了本发明实施例的抗菌肽的作用浓度。
通过实验分析,本发明实施例提供的一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3具有以下特性:
一、多肽Pv26-3具有广谱抗菌作用
先导实验采用微量稀释分析法(microdilution assay)分析3种新型多肽(Pv26-1、Pv26-2、Pv26-3)的抗菌活性,实现结果如下表1所示,发现其中Pv26-3抗E.coli和S.aureus的活性最强,最小抑菌浓度分别为1.8和1.2mM,比其母分子Pv26抑菌作用还强大。生物实验分析Pv26-3抗革兰氏阴性细菌E.coli、V.anguillarum和A.hydrophila,革蓝氏革兰氏阳性细菌S.aureus和B.subtilis,以及耐药菌株E.coli 577、K.pneumoniae 2182和A.baumannii 7225作用,发现Pv26-3可以显著抑制各种所测试细菌的生长,具有广谱抑菌活性。
表1多肽Pv26-3的最小抑菌浓度
二、Pv26-3破坏细菌细胞壁
采用电子显微镜分析Pv26-3对E.coli和S.aureus细胞影响。参考图1所示,为PBS(A、C)或者Pv26-3(B、D)与E.coli以及S.aureus在25℃共育1小时对细菌的影响;结果表明:Pv26-3可以造成E.coli和S.aureus细胞壁损伤,使细胞壁变薄甚至造成细胞壁破坏,失去完整性。Pv26-3还可以造成细胞内容物流出细胞外。
三、Pv26-3可以结合LPS、LTA和PGN
免疫酶标法(ELISA)分析重组多肽Pv26-3与LPS、LTA和PGN的结合。参考图2所示,为重组表达多肽Pv26-3与LPS、LTA和PGN结合结果;结果表明:Pv26-3可以与革蓝氏阴性细菌表面保守分子LPS结合,可以与革蓝氏阳性细菌表面保守分子LTA结合,也可以与细菌表面分子PGN结合。
四、Pv26-3对细菌细胞膜产生去极化作用。
选用DiSC3-5荧光染料,检验细菌细胞膜电位变化。参考图3所示,为重组表达多肽Pv26-3与E.coli 25922、S.aureus 25922、E.coli 577、K.pneumoniae 2182和A.baumannii7225作用后膜电位变化结果;发现加入Pv26-3后细菌的荧光强度增加,发生了去极化现象。
五、Pv26-3破坏细菌细胞壁
采用荧光染料PI作为细胞通透性改变的指示剂,并用流式细胞仪进行检测,参考图4所示,为重组表达多肽Pv26-3对E.coli 25922、S.aureus 25922、E.coli 577、K.pneumoniae 2182和A.baumannii 7225细胞膜完整性的破坏作用;发现Pv26-3使细菌细胞膜通透性发生改变。
六、Pv26-3对RAW264.7细胞无毒性
采用MTT法测试重组多肽Pv26-3对RAW264.7细胞成活率影响,实验结果如下表2所示。结果表明:Pv26-3对大鼠RAW264.7生长没有影响,对大鼠RAW264.7细胞无毒性。
表2多肽Pv26-3对Raw264.7细胞成活影响
七:Pv26-3对人血红细胞没有破坏作用
参考图5所示,溶血作用分析表明:重组多肽Pv26-3对人的人血红细胞无毒,不会造成血红细胞溶解,没有溶血作用。
以上所述仅为本申请的较佳实施例,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 1
Asp Thr Ser Ser Gly Ser Ala Ala Ala Ser Phe Glu Gln Met Glu Thr
1 5 10 15
Gln Lys Gln Asn Arg Phe Leu Gly Asn Asp Ile Pro
20 25
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(25)
<223> 采用色氨酸替换7,11,21,25号位原有氨基酸
<400> 2
Asp Thr Ser Ser Gly Ser Trp Ala Ala Ser Trp Glu Gln Met Glu Thr
1 5 10 15
Gln Lys Gln Asn Arg Phe Trp Gly Asn Asp Trp Pro
20 25
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(24)
<223> 采用赖氨酸替换1,12,20,24号位原有氨基酸
<400> 3
Lys Thr Ser Ser Gly Ser Ala Ala Ala Ser Phe Lys Gln Met Glu Thr
1 5 10 15
Gln Lys Gln Asn Arg Lys Leu Gly Asn Lys Ile Pro
20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(25)
<223> 采用色氨酸替换7,11,21,25号位原有氨基酸,采用赖氨酸替换1,12,20,24号位原有氨基酸
<400> 4
Lys Thr Ser Ser Gly Ser Trp Ala Ala Ser Trp Lys Gln Met Glu Thr
1 5 10 15
Gln Lys Gln Asn Arg Lys Trp Gly Asn Lys Trp Pro
20 25
Claims (7)
1.一种具有抗菌活性的多肽Pv26-3,其特征在于,所述多肽Pv26-3为基于高磷蛋白序列截断获得的母分子Pv26的突变体,所述母分子Pv26的氨基酸序列为DTSSG SAAAS FEQMQKQNRF LGNDIP,所述多肽Pv26-3的氨基酸序列为KTSSG SWAAS WKQMQ KQNRKWGNKWP。
2.根据权利要求1所述的多肽Pv26-3,其特征在于,所述高磷蛋白为卵黄高磷蛋白,所述卵黄高磷蛋白为卵黄蛋白降解的衍生蛋白质。
3.根据权利要求1所述的多肽Pv26-3,其特征在于,所述母分子Pv26为一段含有26个氨基酸残基的α螺旋状氨基酸,所述母分子Pv26的疏水率为30%,所述α螺旋状氨基带有一个负电荷。
4.根据权利要求1所述的多肽Pv26-3,其特征在于,所述母分子Pv26的氨基酸序列的七号位为丙氨酸A、十一号位为苯丙氨酸F、二十一号位为亮氨酸L、二十五号位为异亮氨酸I。
5.根据权利要求1所述的多肽Pv26-3,其特征在于,所述母分子Pv26的氨基酸序列的一号位为天冬氨酸D、十二号位为谷氨酸E、二十号位为苯丙氨酸F和二十四号位为天冬氨酸D。
6.根据权利要求1所述的多肽Pv26-3,其特征在于,所述多肽Pv26-3的氨基酸序列的七号位、十一号位、二十一号位、二十五号位均为色氨酸W。
7.根据权利要求1所述的多肽Pv26-3,其特征在于,所述多肽Pv26-3的氨基酸序列的一号位、十二号位、二十号位和二十四号位均为赖氨酸K。
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