CN116903704B - 一种快速穿膜抗菌短肽组合物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种快速穿膜抗菌短肽组合物、制备方法及应用。该组合物包括六条多肽，氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：6。该组合物杀菌作用终浓度为0.125μM‑16μM。抑菌浓度为0.25μM‑16μM。本发明能在1min内快速穿透细胞膜，使其能够在短时间内快速杀菌，实现1min内80%细菌的高效杀伤。为设计新的抗菌短肽分子提供了模板，为抗生素替代品的创制及关联新药的开发提供检验指标和方案。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种快速穿膜抗菌短肽组合物、制备方法及应用。
背景技术
近年来，水产养殖业发展迅速，由细菌性疾病引发的水产动物病害问题愈发严重，抗生素类药物被广泛应用于细菌性疾病的治疗，在取得良好治疗效果的同时，带来的细菌耐药、药物残留及水环境污染等问题也引起了国际社会的高度关注。耐药细菌导致的感染性疾病成为危害全人类健康的严重灾难，由耐药菌引起的死亡人数相当于HIV、乳腺癌和前列腺癌致死人数的总和。因此寻找有效控制耐药细菌的新策略，开发安全可靠、无毒无害的饲料添加剂或药物来预防和治疗水产养殖动物疾病，是当今紧迫的研究目标。
抗生素针对细菌特定靶点或代谢通路发挥抗菌作用，易引起细菌耐药性，耐药细菌通过食物链传播和扩散会引发食品安全问题，也会导致水体环境和动物肠道微生物群系的结构破坏。在众多抗生素替代物中，抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）因其抗菌活性强、作用机制新而受到广泛关注。抗菌肽的抗菌机理与抗生素完全不同，通过破坏细菌细胞膜结构，使细菌内容物外渗而死亡，细菌不易对这类破膜机制产生耐药性。此外，抗菌肽能抑制细菌特异性酶或者DNA转录和蛋白质翻译，影响胞内蛋白质相互作用及酶促级联和胞质溶胶信号传导途径，这些作用机制都不容易引起细菌的耐药性，因此，抗菌肽有望解决耐药菌问题并替代抗生素，为应对抗生素滥用导致的一系列问题具有重要意义。
迄今被收录到抗菌肽数据库中的天然抗菌肽有3000多种，为开发抗菌肽类抗菌剂提供了丰富的资源。这些分子中大部分含有10-50个氨基酸，净电荷为0-+7，疏水含量为31-70%。然而，天然抗菌肽存在肽链较长、生产成本高、抗菌活性普遍不强、酶稳定性低等问题，且部分抗菌肽所带的正电荷使其仍然具有一定的细胞毒性。为解决这些问题，必须对天然抗菌肽分子进行结构优化和改造修饰，方法有序列截断、氨基酸替换、N-端乙酰化或C-端酰胺化等。
除了浮游状态，细菌生物膜也是一种重要的细菌生长形态，是细菌耐药性形成的重要原因。已有研究表明，SMAP-29、BMAP-27等能有效杀伤浮游细菌，但对生物膜的抵抗则表现得较差；TetraF2W等能够在一定程度上抑制生物膜的形成，但对浮游状态的E.coli等革兰氏阴性细菌的抗菌效果较差，对细菌及其生物膜的彻底杀伤需要1.5-24h以上，而杀菌时间的延长、细菌杀伤不彻底是细菌产生耐药性的重要原因。可见，目前缺少对多药耐药细菌及生物膜均可以进行高效快速杀伤的双抗菌-抗生物膜活性AMPs，快速穿膜以获得双抗菌-抗生物膜活性是目前AMPs抗菌研究的难点。
发明内容
为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种快速穿膜抗菌短肽组合物、制备方法及应用。
所述技术方案如下：一种快速穿膜抗菌短肽组合物，该组合物包括六条多肽，氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6。
进一步的，该组合物杀菌作用终浓度为0.125μM-16μM。
进一步的，抑菌浓度为0.25μM-16μM。
进一步的，该组合物在制备E.coli细菌细胞和S.aureus细菌细胞抗生物膜活性药物上的应用。
进一步的，该组合物在制备MDR-E.coli，MDR-A.baumannii多药耐药细菌抗菌药物上的应用。
该组合物应用于E.coli细菌细胞和S.aureus细菌细胞，验证杀菌、抑菌作用效果。
本发明的另一目的在于提供一种所述的快速穿膜抗菌短肽组合物在制备水产养殖业中用作避免多药耐药产生的杀菌剂上的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的快速穿膜抗菌短肽组合物在制备治疗皮炎抗菌药物上的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的快速穿膜抗菌短肽组合物在制备治疗伤口感染抗菌药物上的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的快速穿膜抗菌短肽组合物在制备治疗脓毒症抗菌药物上的应用。
本发明的另一目的在于提供一种快速穿膜抗菌短肽组合物的制备方法包括：
S1，氨基酸替代设计过程：使用色氨酸（W）依次取代Kassporin-KS1肽链上的I7、A12氨基酸，亮氨酸（L）依次取代Kassporin-KS1肽链上的A10、I11氨基酸，以稳定螺旋结构，改善疏水性，增强与膜的相互作用；
S2，赖氨酸（K）、精氨酸（R）依次取代Kassporin-KS1肽链上不带电的A3、A5氨基酸，以增加净电荷数，增强膜亲和力，得到FLKLRLWQELLWKLK；
S3，再使用GK、GR、KK、RR、RK、KR分别依次替换第8位的Q、第9位的E氨基酸，最终获得FLKLRLWGKLLWKLK、FLKLRLWGRLLWKLK、FLKLRLWKKLLWKLK、FLKLRLWRRLLWKLK、FLKLRLWKRLLWKLK、FLKLRLWRKLLWKLK六条抗菌短肽。
进一步的，在步骤S3中，六条抗菌短肽作为替代抗生素或抗生物膜表面的模板。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明对多药耐药细菌，尤其是被确定为致病菌之首的多药耐药鲍曼不动杆菌，具备高效的广谱抗菌活性。
本发明通过细胞膜破坏、氧化损伤等多重杀菌机制联合作用，对浮游状态的细菌及细菌生物膜都具备优异的破坏效果，具备了双抗菌-抗生物膜活性。
本发明提供的抗菌短肽能够通过引起细胞膜破坏、氧化损伤等机制杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，以及常见的耐药菌，具有优异的抗菌活性，并对细菌生物膜也具备优异的破坏效果，具备了双抗菌-抗生物膜活性。这主要在于其能在1min内快速穿透细胞膜，使其能够在短时间内快速杀菌，实现1min内80%细菌的高效杀伤。为设计新的抗菌短肽分子提供了模板，为抗生素替代品的创制及关联新药的开发提供检验指标和方案。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
图1是本发明实施例提供的快速穿膜抗菌短肽组合物的制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的六种抗菌短肽的三维结构示意图；
图3是本发明实施例提供的抗菌短肽杀菌动力学检测中调整E.coli菌浓度到4×104个/ml结果示意图；
图4是本发明实施例提供的抗菌短肽杀菌动力学检测中调整S.aureus菌浓度到4×104个/ml结果示意图；
图5是本发明实施例提供的抗菌短肽生物膜抑制活性的结晶紫染色实验结果示意图；
图6是本发明实施例提供的使用GraphPad Prism 7绘制生物膜质量柱状图；
图7是本发明实施例提供的抗菌短肽生物膜破坏活性的死活染色实验中E. coli的细菌悬液结果示意图；
图8是本发明实施例提供的抗菌短肽生物膜破坏活性的死活染色实验中S.aureus的细菌悬液结果示意图；
图9是本发明实施例提供的抗菌短肽的胞内共定位中S.aureus细菌示意图；
图10是本发明实施例提供的抗菌短肽的胞内共定位中E.coli细菌示意图；
图11是本发明实施例提供的E.coli和S.aureus细菌定量柱状图；
图12是本发明实施例提供的抗菌短肽处理前细菌E.coli的透射电子显微镜照片图；
图13是本发明实施例提供的抗菌短肽KR处理后细菌E.coli的透射电子显微镜照片图；
图14是本发明实施例提供的抗菌短肽处理前细菌S.aureus的透射电子显微镜照片图；
图15是本发明实施例提供的抗菌短肽KR处理后细菌S.aureus的透射电子显微镜照片图；
图16是本发明实施例提供的抗菌短肽处理前后细菌S.aureus细菌悬液内ROS定量示意图；
图17是本发明实施例提供的抗菌短肽处理前后细菌E.coli细菌悬液内ROS定量示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1，本发明实施例提供的快速穿膜抗菌短肽组合物，氨基酸序列分别为：GK（FLKLRLWGKLLWKLK）SEQ ID NO：1、GR（FLKLRLWGRLLWKLK）SEQ ID NO：2、KK（FLKLRLWKKLLWKLK）SEQ ID NO：3、RR（FLKLRLWRRLLWKLK）SEQ ID NO：4、KR（FLKLRLWKRLLWKLK）SEQ ID NO：5、RK（FLKLRLWRKLLWKLK）SEQ ID NO：6。
可以理解，快速穿膜抗菌短肽组合物作为杀菌剂，缩短杀菌时间，降低杀菌浓度，降低成本，且减少耐药产生，环境友好，具备一定商业价值；为耐药细菌快速杀伤问题提供方案；快速穿膜快速杀菌，解决耐药细菌的高效杀伤。
如图1所示，本发明实施例提供的快速穿膜抗菌短肽组合物的制备方法包括：
S1，氨基酸替代设计过程：使用色氨酸（W）依次取代Kassporin-KS1肽链上的I7、A12氨基酸，亮氨酸（L）依次取代Kassporin-KS1肽链上的A10、I11氨基酸，以稳定螺旋结构，改善疏水性，增强与膜的相互作用；
S2，赖氨酸（K）、精氨酸（R）依次取代Kassporin-KS1肽链上不带电的A3、A5氨基酸，以增加净电荷数，增强膜亲和力，得到FLKLRLWQELLWKLK；
S3，再使用GK、GR、KK、RR、RK、KR分别依次替换第8位的Q、第9位的E氨基酸，最终获得GK（FLKLRLWGKLLWKLK）、GR（FLKLRLWGRLLWKLK）、KK（FLKLRLWKKLLWKLK）、RR（FLKLRLWRRLLWKLK）、KR（FLKLRLWKRLLWKLK）、RK（FLKLRLWRKLLWKLK）六条抗菌短肽。
合成方法：以上抗菌短肽由吉尔生化公司（上海，中国）采用标准固相FMOC法合成。
实施例2，本发明将设计更短的肽（<20氨基酸），作为开发替代抗生素或抗生物膜表面的模板。这是因为短肽可以更有效地制备，短肽包含更少的单元进行优化，为工业降低了研发成本。本发明首先利用APD数据库鉴定了一个天然短肽模板。Kassporin-KS1（FLALALIQEAIAKLK，下文简称FA）模板来源于两栖动物，更不易产生耐药性，且来源丰富，对S.aureus、E.coli具有中等活性。为了增强肽的活性，本发明假设用色氨酸（W）、亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）对Kassporin-KS1中的部分氨基酸进行替代，得到GK（FLKLRLWGKLLWKLK）SEQ ID NO：1、GR（FLKLRLWGRLLWKLK）SEQ ID NO：2、KK（FLKLRLWKKLLWKLK）SEQ ID NO：3、RR（FLKLRLWRRLLWKLK）SEQ ID NO：4、KR（FLKLRLWKRLLWKLK）SEQ ID NO：5、RK（FLKLRLWRKLLWKLK）SEQ ID NO：6，六条抗菌短肽，以稳定螺旋结构，增强与膜的相互作用，增加正电荷，提高对微生物膜的渗透性，提高穿膜速度以获得双抗菌-抗生物膜活性。
具体的六条抗菌短肽写为：SEQ ID NO：1的核苷酸序列为：Phe Leu Lys Leu ArgLeu Trp Gly Lys Leu Leu Trp Lys Leu Lys；
SEQ ID NO：2的核苷酸序列为：Phe Leu Lys Leu Arg Leu Trp Gly Arg Leu LeuTrp Lys Leu Lys；
SEQ ID NO：3的核苷酸序列为：Phe Leu Lys Leu Arg Leu Trp Lys Lys Leu LeuTrp Lys Leu Lys；
SEQ ID NO：4的核苷酸序列为：Phe Leu Lys Leu Arg Leu Trp Arg Arg Leu LeuTrp Lys Leu Lys；
SEQ ID NO：5的核苷酸序列为：Phe Leu Lys Leu Arg Leu Trp Lys Arg Leu LeuTrp Lys Leu Lys；
SEQ ID NO：6的核苷酸序列为：Phe Leu Lys Leu Arg Leu Trp Arg Lys Leu LeuTrp Lys Leu Lys；
用分析信息学技术和计算机辅助药物分子设计软件分析其理化性质，通过ADP数据库网站，输入氨基酸序列，对多肽的疏水比例，正电荷数等结构参数进行计算（表1，通过螺旋轮预测网站，输入氨基酸序列，对多肽的两亲性螺旋轮模型进行模拟，图2螺旋轮表明抗菌肽具有两亲性结构。
表1抗菌短肽序列及理化性质：
；
其中，共性为，六条多肽序列中除了第8、9个氨基酸不同，分别为GK、GR、KK、RR、RK、KR，其余氨基酸序列均一致。在用途上：可用作抗生素替代品，在水产养殖业中可用作避免多药耐药产生的杀菌剂，在临床上可用做抗菌药物，用于各种细菌感染疾病，如皮炎、伤口感染、脓毒症等疾病的治疗。
通过蛋白二级结构预测网站，输入氨基酸序列以模拟多肽二级结构。在六种抗菌短肽的螺旋轮结构的螺旋轮投影中，带负电的残基以及带正电的残基均已不同形状形式出现。表明了所设计的抗菌肽具有α螺旋结构抗菌实验结果表明，六条抗菌短肽具有广谱抑菌和杀菌作用，并且对于普通致病菌及耐药菌的杀伤效果均得到了提升。此外胞内定位检测结果表明，抗菌短肽能在1min内快速穿膜，对其抗菌活性具有重要贡献。生物膜破坏检测实验结果表明，六条抗菌短肽能够抑制细菌生物膜的形成，还能对已成型的生物膜进行破坏，具备可靠的双抗菌-抗生物膜活性。
下面结合实验方法对本发明作进一步描述。
实验方法：
1.杀菌实验：调整菌浓度到4×104个/ml，用于后续的实验。肽的作用终浓度为0.125μM-16μM，PBS作为空白对照。将细菌与肽37℃共孵育0.5h之后，将混合液平均分为三份，涂布在三个含有LB固体培养基的培养皿上，37℃培养过夜。接下来对菌落进行计数，记录每个平板上的菌落数量，统计抗菌肽的杀菌率。最小杀菌浓度（minimum bactericidalconcentration，MBC）：杀死99.9%的细菌所需的最低药物浓度。见表2。
表2抗菌短肽的最小杀菌浓度（MBC）：
；
选用革兰氏阴性菌大肠肝菌（E.coli）、鲍曼不动杆菌（A.baumannii）和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus），以及多药耐药的大肠杆菌（MDR-E. coli）和多药耐药的鲍曼不动杆菌（MDR-A.baumannii）来研究抗菌肽的杀菌活性，杀菌实验结果表明，所设计的抗菌肽能直接杀死细菌和多药耐药菌，且杀菌活性显著提高至nM级别，远高于抗菌肽Kassporin-KS1的杀菌效果。
2.抑菌实验：调整菌浓度到106个/ml，用于后续的实验。将LB液体培养基、细菌、0.125μM-16μM不同浓度的抗菌肽稀释液混合后培养8h，期间每1小时取出用酶标仪测定595nm波长的吸光值。根据所得结果绘制细菌生长曲线，能完全抑制细菌生长的最小浓度即为最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），统计抗菌肽对不同细菌的抑菌活性和最小抑菌浓度（MIC）。见表3。
表3抗菌短肽的最小抑菌浓度（MIC）：
；
抑菌实验结果表明，所设计的抗菌肽上述细菌都有明显的抑制作用，抑制作用远大于Kassporin-KS1。
3.抗菌短肽的杀菌动力学实验：调整E.coli和S.aureus菌浓度到4×104个/ml，用于后续的实验。肽的作用终浓度为0.125μM-16μM，PBS作为空白对照。将细菌与肽在37℃分别共孵育1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min后，将混合液平均分为三份，涂布在三个含有LB固体培养基的培养皿上，37℃培养过夜。接下来对菌落进行计数，记录每个平板上的菌落数量，统计抗菌肽的细菌存活率随时间的变化情况。在图3抗菌短肽杀菌动力学检测中调整E.coli菌浓度到4×104个/ml；在图4抗菌短肽杀菌动力学检测中调整S.aureus菌浓度到4×104个/ml结果示意图。
4.细菌生物膜形成抑制实验：
使用结晶紫染色法评估AMPs对于细菌生物膜的生长抑制作用。如图5抗菌短肽生物膜抑制活性的结晶紫染色实验结果示意图；
将E.coli和S.aureus的细菌悬液（108CFU/mL）分别加入24孔板（每孔1mL），37℃静置培养12h后，去掉上清液并使用PBS清洗细菌，然后每孔加入1mL含有AMPs（8μM）的LB培养基以及空白LB培养基，继续37℃静置培养48h后，去除上清液，使用PBS清洗细菌生物膜，每孔加入500mL甲醇4℃固定20min，去除甲醇并使用PBS轻柔清洗生物膜，每孔加入500mL0.1%结晶紫染液，室温下染色30min，去除染液充分清洗后进行拍照记录。最后向孔中加入600mL无水乙醇，37℃下180rpm震荡30min以充分洗出胞内结晶紫，将洗出的上清液加入96孔板，使用酶标仪检测550nm处的吸光值，使用GraphPad Prism 7绘制生物膜质量柱状图，如图6所示。
细菌生物膜形成抑制实验结果表明，AMPs对形成初期（12h）细菌生物膜具有良好的抑制结果，能使生物膜的膜带明显破损，膜密度明显降低，生物膜质量明显降低。
5.细菌生物膜杀伤破坏实验：
使用死、活细胞染色方法评估AMPs对已经形成细菌生物膜的杀伤和破坏能力，并使用共聚焦显微镜观察其3D结构。
如图7抗菌短肽生物膜破坏活性的死活染色实验中E.coli的细菌悬液结果示意图；
如图8抗菌短肽生物膜破坏活性的死活染色实验中S.aureus的细菌悬液结果示意图；
将E.coli和S.aureus的细菌悬液（108CFU/mL）分别加入共聚焦小皿（每皿1mL），37℃静置培养7天，期间每12h换液一次。7天后，吸除培养液并用PBS洗涤，将生物膜暴露于1mLAMPs（24μM）或空白PBS中。37℃静置2h后，使用Calcein-AM/PI活/死双重染色试剂盒（Solarbio，CA1630）对细菌生物膜进行染色，PBS清洗三次后，使用共焦显微镜观察细菌生物膜的染色情况。
细菌生物膜杀伤破坏实验结果表明，针对已成型细菌生物膜AMPs也表现出明显的破坏结果，能将生物膜内细菌进行杀伤清除。可见，优化后的抗菌短肽不仅可在细菌生物膜形成初期抑制其生长增殖，还能够通过降低细菌生物膜的体积和厚度来引起已成型细菌生物膜的破坏和分散。
6.胞内共定位检测：
将E.coli和S.aureus（109CFU/mL，1mL）暴露于荧光基团NHS-5（6）Carboxyrhodamine修饰的KR（TMR-KR,8μM）中，共孵育1min、10min、30min。用PBS洗涤3次后，使用DAPI溶液（500μL,10μg/mL）室温下染色5min。使用PBS对细菌进行充分清洗3次，并使用20μLPBS将细菌重悬，取10μL细菌悬浮液滴于载玻片上，盖玻片覆盖后，使用共聚焦荧光显微镜观察胞内荧光成像。
其中，图9为抗菌短肽的胞内共定位中S.aureus细菌示意图；
图10为抗菌短肽的胞内共定位中E.coli细菌示意图；
图11为E.coli和S.aureus细菌定量柱状图；
胞内共定位检测结果表明，TMR-KR在1min内即与细菌细胞膜快速结合并穿透细胞膜；至10min后已经大量进入到细胞内，30min后，最终大量累积在细胞膜和DNA上。这是抗菌短肽能在短时间内快速高效杀菌的有力证明。
7.透射电子显微镜实验：
如图12为抗菌短肽处理前细菌E.coli的透射电子显微镜照片图；
如图13为抗菌短肽KR处理后细菌E.coli的透射电子显微镜照片图；
如图14为抗菌短肽处理前细菌S.aureus的透射电子显微镜照片图；
如图15为抗菌短肽KR处理后细菌S.aureus的透射电子显微镜照片图；
将E.coli和S.aureus培养到对数增长期。室温5000×g离心3分钟，去掉上层培养基，用灭过菌的PBS分别洗细菌，重复三次，最后将细菌重悬，调整菌浓度到109个/ml，用于后续的实验。将50μL菌液，与50μL的抗菌肽KR结合，设置KR的终浓度为8μM。PBS组作为空白对照。抗菌肽和菌液在37℃孵育半小时。把混合液与等体积的2.5%的戊二醛（用PBS配制）溶液混合，以固定细菌细胞。之后，吸取50μL细菌固定液在平板上，把载网浸入混合液，等待10分钟，让细菌吸附在载网上。随后，把用滤纸吸掉多余的液体，静置。把载网放到透射电镜中观察，拍照。
透射电镜实验结果表明，抗菌肽P-4孵育后都能够对细菌形态造成明显的改变，细菌菌体形状变得不规则，细胞内容物流出，还有的细菌细胞表面出现孔洞，这都是造成细菌死亡的重要机制。
8.细菌活性氧水平检测：
如图16为抗菌短肽处理前后细菌S.aureus细菌悬液内ROS定量示意图；
如图17为抗菌短肽处理前后细菌E.coli细菌悬液内ROS定量示意图；
将E.coli和S.aureus细菌悬液（1mL，109CFU/mL）在37℃下装载DCFH-DA（10mM）探针，30min后使用PBS充分洗涤。将细菌分别暴露于PBS、AMPs（2μM），37℃处理30min。经PBS充分洗涤并重悬后，加入黑色96孔板中（每孔100μL），立即使用酶标仪检测激发波长为488nm，发射波长为525nm的荧光强度，使用GraphPad Prism 7绘制荧光强度柱状图。
荧光成像结果表明，在与抗菌短肽作用后，细菌内ROS水平均有大幅度提升，比抗菌肽Kassporin-KS1作用后的ROS水平高很多，表明优化后的抗菌短肽可以通过引发细菌内强烈的氧化应激反应引发细菌死亡。
9．本发明实施例提供的快速穿膜抗菌短肽组合物对于MDR-E.coli，MDR-A.baumannii多药耐药细菌也具备快速杀伤。同时对于易导致耐药问题的E.coli和S.aureus细菌生物膜也具备同样抗生物膜活性，为耐药菌及生物膜耐药问题的解决提供了有效药物。而且快速穿膜抗菌短肽组合物穿膜速度快，能在半小时内有效清除细菌，具备可靠的应用前景。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种快速穿膜抗菌短肽组合物，其特征在于，该组合物包括六条多肽，氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6。
2.根据权利要求1所述的快速穿膜抗菌短肽组合物，其特征在于，该组合物杀菌作用终浓度为0.125μM-16μM；抑菌浓度为0.25μM-16μM。
3.一种根据权利要求1所述的快速穿膜抗菌短肽组合物在制备MDR-E.coli，MDR-A.baumannii多药耐药细菌抗菌药物上的应用。
4.一种制备方法，其特征在于，该制备方法用于制备权利要求1-2任意一项所述的快速穿膜抗菌短肽组合物，该制备方法包括：
S1，氨基酸替代设计过程：使用色氨酸（W）依次取代Kassporin-KS1肽链上的I7、A12氨基酸，亮氨酸（L）依次取代Kassporin-KS1肽链上的A10、I11氨基酸，以稳定螺旋结构，改善疏水性，增强与膜的相互作用；
S2，赖氨酸（K）、精氨酸（R）依次取代Kassporin-KS1肽链上不带电的A3、A5氨基酸，以增加净电荷数，增强膜亲和力，得到FLKLRLWQELLWKLK；
S3，再使用GK、GR、KK、RR、RK、KR分别依次替换第8位的Q、第9位的E氨基酸，最终获得FLKLRLWGKLLWKLK、FLKLRLWGRLLWKLK、FLKLRLWKKLLWKLK、FLKLRLWRRLLWKLK、FLKLRLWKRLLWKLK、FLKLRLWRKLLWKLK六条抗菌短肽。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，六条抗菌短肽作为替代抗生素或抗生物膜表面的模板。
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| 仿刺参β-胸腺素基因的克隆和表达分析;孙红娟等;《水产科学》;第42卷(第4期);第657-663页 * |
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