CN104387463B - 中国林蛙抗菌肽Brevinin‑2CE改造体B2‑N26‑V5K及其应用 - Google Patents

中国林蛙抗菌肽Brevinin‑2CE改造体B2‑N26‑V5K及其应用 Download PDF

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Abstract

一种中国林蛙抗菌肽Brevinin‑2CE改造体B2‑N26‑V5K，含有26个氨基酸残基，分子量2613.21Da，理论等电点10.60，序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。在制备抗大肠杆菌药物、抗多重耐药大肠杆菌H1药物、抗肺炎克雷伯氏菌药物、抗粪嗜冷杆菌药物、抗鲍氏不动杆菌药物、抗痢疾志贺氏菌药物、抗金黄色葡萄球菌药物、抗枯草芽孢杆菌药物、抗藤黄微球菌药物中的用途。它具有结构简单、细胞毒性小、人工合成方便等优点。

Description

中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K及其应用
技术领域
本发明属于多肽技术领域，具体涉及到中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K。
背景技术
Brevinin-2抗菌肽是1992年在Japanese pond frog R.brevipoda的皮肤分泌物中首次被分离出来，近年来在蛙的胃部组织中也发现了brevinin-2家族抗菌肽。Brevinin-2具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、某些真菌具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药菌同样具有作用。除此之外，brevinin-2还具有刺激胰岛素释放的功能。针对brevinin-2的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。
随着青霉素等传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，在临床上已经出现了大量完全能够耐受青霉素等传统抗生素的微生物，已有的抗生素对这些病原微生物无能为力。抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，大多数抗菌肽分子量小于10000Da，带正电，富含疏水氨基酸残基，能够形成两亲性的结构。到目前为止，人们认为抗菌肽的杀菌机制主要是通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。而传统抗生素主要是作用于细菌细胞内的一些酶类。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易使细菌产生耐受性。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁的合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成。
很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufogargarizans)，大蹼铃蟾(Bombian maxima)，黑斑蛙(Pelophylax nigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药研发的热点。目前，国外有许多公司正在进行抗菌肽的研发工作，已有多种抗菌肽进入临床试验阶段。如来源于多粘杆菌的Polymixin B-Colistin-Colomycin用于治疗革兰氏阴性菌引起的皮肤感染，已上市。来源于非洲爪蟾magainin的MSI-78对糖尿病患者的足部溃疡有显著疗效且副作用小，已进入临床Ⅲ期试验阶段。来源于猪protegrin的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃疡，已进入临床Ⅰ期试验。来源于人lactoferrin的hLF-1-1用于治疗骨髓干细胞移植相关的感染，已进入临床Ⅱ期。除此之外，一些用于伤口愈合，内毒素感染，肿瘤，病毒感染的抗菌肽也已进入临床试验阶段。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。
发明人将本发明的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K全序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有的抗菌活性的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K。
本发明所要解决的另一个技术问题在于为中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K提供一种新用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体，命名为B2-N26-V5K，含有26个氨基酸残基，分子量2613.21Da，理论等电点10.60，序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
其合成方法如下：
(1)设计中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体序列
中国林蛙Brevinin-2CE的蛋白序列号为GenBank:ADD51562.1，通过截断Brevinin-2CE的C端11个氨基酸并将第五位的缬氨酸替换为赖氨酸，设计中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体，其序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
(2)合成中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K
采用固相合成法，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，得中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体，确定其纯度，应大于95％，用ESI-MS测其分子量，计算理论等电点。
本发明采用截短、替换方法设计Brevinin-2CE的改造体B2-N26-V5K，该抗菌肽不仅对多种致病菌有非常强的杀灭作用，而且对临床分离的多重耐药菌具有很好的抑制作用，具有结构简单、细胞毒性小、人工合成方便等有益特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于下述的实施例。
实施例1
中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体，命名为B2-N26-V5K，含有26个氨基酸残基，分子量2613.21Da，理论等电点10.60，序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
上述中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K的合成方法如下：
(1)设计中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体序列
中国林蛙Brevinin-2CE的蛋白序列号为GenBank:ADD51562.1，通过截断Brevinin-2CE的C端11个氨基酸并将第五位的缬氨酸替换为赖氨酸，设计中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体的序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL，是一种直链多肽，含有26个氨基酸残基。
(2)合成中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K
采用固相合成法，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，得中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K，确定其纯度，应大于95％。
(3)测试分子量、计算理论等电点
用ESI-MS测其分子量，分子量为2613.21Da。
用网站http://web.expasy.org/protparam/计算理论等电点，测定结果为：理论等电点为10.60。
实施例2
中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K(以下简称B2-N26-V5K)在制备抗大肠杆菌药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 2000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K2μg，成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
实施例3
B2-N26-V5K在制备抗多重耐药大肠杆菌H1药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 4000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4μg，成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
实施例4
B2-N26-V5K在制备抗肺炎克雷伯氏菌药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 8000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8μg，成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
实施例5
B2-N26-V5K在制备抗粪嗜冷杆菌药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 8000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8μg，成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
实施例6
B2-N26-V5K在制备抗鲍氏不动杆菌药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 15000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K15μg，成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
实施例7
B2-N26-V5K在制备抗痢疾志贺氏菌药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 4000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4μg，成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
实施例8
B2-N26-V5K在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 16000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K16μg，成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
实施例9
B2-N26-V5K在制备抗枯草芽孢杆菌药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 4000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K4μg，成人用量每天肌肉注射一次，每次1瓶2mL。
实施例10
B2-N26-V5K在制备抗藤黄微球菌药物中的用途，其使用方法如下：
B2-N26-V5K 8000μg
注射用水 加至1000mL
按药剂学注射剂的常规方法制备成注射剂，每毫升含活性成分B2-N26-V5K8μg，成人用量每天肌肉注射每天一次，每次1瓶2mL。
为了验证活性成分B2-N26-V5K的有益效果，发明人进行了细胞实验如下：
1、检测B2-N26-V5K抑菌活性
吸取4μL保存于甘油中的实验菌株接种到4mL MH液体培养基中，30℃或37℃220rpm震荡培养14-16h至对数生长期，利用稀释平板计数法对培养物进行计数，再用新鲜的肉汤液体培养基(MHB)稀释到106cfu/mL。
利用倍比稀释法配制抗菌肽B2-N26-V5K，取8个离心管，标记为1-8，每管中加入100μL MH液体培养基，然后取100μL 200μM的抗菌肽B2-N26-V5K加入第1管中，混匀后取100μL加入到第2管中，按照相同方法依次进行倍比稀释，最后从第8管中吸出100μL液体弃去。
向8管含有100μL抗菌肽B2-N26-V5K中加入已稀释好的菌液100μL，同时设置对照组100μL菌液+100μLMH液体培养基以及100μL菌液+100μL1％Triton X-100，混匀后放置30℃或37℃220rpm震荡培养18-20h，于595nm波长处测定吸光值。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低浓度。结果如表1所示：
表1 B2-N26-V5K抗菌活性
受试菌株 最小抑菌浓度(μM)
多重耐药大肠杆菌H1 1.5
大肠杆菌 0.75
肺炎克雷伯氏菌 3
粪嗜冷杆菌 3
鲍氏不动杆菌 6
痢疾志贺氏菌 1.5
金黄色葡萄球菌 6.25
枯草芽孢杆菌 1.5
藤黄微球菌 3
上述的菌株购自中国普通微生物菌种保藏中心。以上结果为三次独立重复实验平均值。
由表1可见，抗菌肽B2-N26-V5K对受试的9种菌株的最小抑菌浓度最低为0.75μM，最高为6.25μM，说明该抗菌肽具有广谱杀菌性。抗菌肽B2-N26-V5K不仅可以抑制野生型大肠杆菌，更对临床分离的耐药型大肠杆菌在1.5μM时有杀伤作用。另外，抗菌肽B2-N26-V5K对其他的受试菌株，尤其是痢疾志贺氏菌和枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度为1.5μM。
2、检测B2-N26-V5K溶血活性
将采集的人新鲜血液5mL与5mL阿氏液1:1(v:v)混匀，4℃保存。取上述红细胞悬液4mL，加生理盐水至12mL，轻轻颠倒混匀，2000rpm，离心5min，用移液器吸取并弃去上清，再次加入生理盐水10mL，同上操作，洗涤红细胞3次，至上清液不再呈现红色为止。洗涤好的红细胞用血球计数板计数后，将其稀释成6×107个细胞每毫升的红细胞稀释悬液。
取2mg/mL的抗菌肽母液，用10×生理盐水和超纯水将其统一稀释成200μM的抗菌肽溶液(NaCl终浓度为0.9％)，之后用无菌生理盐水稀释到100μM，50μM，25μM，12.5μM，分装备用。
将以上不同浓度的抗菌肽100μL分别与红细胞稀释液100μL按1:1(v:v)混合，轻轻振荡混匀后于37℃保温。孵育1h后，2000rpm离心5min，取上清150μL加到96孔细胞培养板，在450nm处检测吸光值。分别以100μL0.9％NaCl+100μL红细胞稀释液为阴性对照；以100μL1％TritionX-100+100μL红细胞稀释液为阳性对照，计算不同浓度人工合成抗菌肽对人血液红细胞的溶血率。溶血率计算用公式：溶血率(％)＝(OD450实验组-OD450阴性对照)/(OD450阳性对照-OD450阴性对照)×100％。
实验结果表明，当样品浓度为100μM时，B2-N26-V5K的溶血率为0，说明B2-N26-V5K具有极低的溶血活性，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在医药领域的进一步的开发应用。
3、检测B2-N26-V5K的细胞毒性
以HEK293细胞和Vero细胞为正常真核细胞的代表，用MTT法检测抗菌肽对细胞的毒性。将生长到对数期的细胞用PBS洗3遍，用胰蛋白酶消化3-5min，加入新鲜的DMEM培养基终止消化，并用细胞计数板进行计数，然后将细胞悬液稀释为7.5×104个细胞每毫升，同时取100μL加到96孔细胞培养板中，37℃5％CO2培养16h。分别向每孔中加入100μL终浓度为150μM，75μM，37.5μM,18.75μM,9.37μM的抗菌肽溶液，与之平行的1×PBS为阳性对照，1％TritionX-100为阴性对照，轻微混匀后在37℃5％CO2继续培养24h。避光条件下，向每孔中加20μL5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，37℃5％CO2孵育4h后，用移液器将96孔细胞培养板内上清弃干净，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，避光振荡使孔内沉淀快速溶解。在570nm处检测吸光值。上述实验均重复至少3次。抑肿瘤细胞活性用半数抑肿瘤细胞浓度(IC50)来评价，IC50被定义为抑制50％肿瘤细胞生长的抗菌肽浓度，用GraphPad prism软件计算。结果如表2：
表2 用B2-N26-V5K对HEK 293和Vero细胞毒性检测
细胞名称 IC50(μM)
293 115.2
Vero 85.85
由表2可知，当抗菌肽B2-N26-V5K浓度为115.2μM和85.85μM时，对正常细胞HEK293和Vero的抑制率达到50％，该浓度远大于抑制细菌时的浓度。

Claims (10)

1.一种中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K，其特征在于：它含有26个氨基酸残基，分子量2613.21Da，理论等电点10.60，序列为GLLSKFKGVLKTAGKNVAKNVAGSLL。
2.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗大肠杆菌药物中的用途。
3.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗多重耐药大肠杆菌H1药物中的用途。
4.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗肺炎克雷伯氏菌药物中的用途。
5.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗粪嗜冷杆菌药物中的用途。
6.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗鲍氏不动杆菌药物中的用途。
7.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗痢疾志贺氏菌药物中的用途。
8.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的用途。
9.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗枯草芽孢杆菌药物中的用途。
10.一种权利要求1所述的中国林蛙抗菌肽Brevinin-2CE改造体B2-N26-V5K在制备抗藤黄微球菌药物中的用途。
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