CN113150074B - 一种抗菌肽gk-19和fk-20及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗菌肽GK‑19和FK‑20及其制备方法及应用。本发明的抗菌肽GK‑19,其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明的抗菌肽FK‑20,其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明具有分子量小、人工合成方便，杀菌作用强、抗菌谱广等优点，此外GK‑19和FK‑20有效浓度区间无溶血效应，对包括人正常肝细胞、人胚肾细胞、人脐静脉内皮细胞及大鼠肺动脉血管平滑肌细胞均无明显毒性。此外，动物实验结果表明其活体安全性较高。

Description

一种抗菌肽GK-19和FK-20及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及两种抗菌肽序列GK-19和FK-20的序列设计、多肽人工合成及纯化，以及其在制备抗菌药物中的用途。

背景技术

近几十年来，由于全球过度滥用或乱用抗生素，导致越来越多耐药菌甚至超级细菌的出现。然而，目前抗生素的研发成本高，且研发周期远久于耐药菌的繁殖速度，新型抗生素的数量也在不断减少，因此，寻找一种可替代抗生素且不易产生耐药性的新型抗菌剂，以应对目前面临的细菌耐药性上升的巨大困境就显得尤为重要。

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是动植物体内的一种天然“防御武器”，目前已在植物、昆虫、鱼类、鸟类、哺乳动物、真菌、细菌等体内发现了上千种抗菌肽。这些具有天然抗生素之称的抗菌肽对革兰氏细菌有较强的杀伤作用，其杀菌机制复杂，但大多数理论都认为带有阳离子的抗菌肽可以直接与带负电的细菌细胞膜结合，使其细胞膜通透性增加从而导致细菌死亡，或者通过在细胞膜形成孔洞，使膜内物质流出而导致细胞死亡，或者作用于细胞内的蛋白质、核酸来杀死细胞，但对宿主细胞的毒性极低。

近年来，抗菌肽的多种生物活性逐渐得到确认，其抗细菌、抗真菌、免疫调节、抗癌细胞、抗病毒和抗寄生虫等作用在医药领域具有广泛的应用前景。抗菌肽取代抗生素已逐渐成为可能，与抗生素相比，抗菌肽的优势在于它具有更广泛的抗菌谱和高效的抗微生物活性，通过不同的作用机制，对细菌、真菌、寄生虫和病毒等均有抑制和杀灭作用。除了对微生物的作用外，抗菌肽在一定程度上可以促进巨噬细胞、淋巴细胞等的增殖，影响免疫系统的作用，抗菌肽甚至可以通过刺激血管生成来中和革兰阴性菌产生的内毒素，对传统抗生素耐药的微生物可以在抗菌肽的作用下快速和直接的被清除。

抗菌肽的安全性和稳定性是医药领域开发应用面临的挑战，随着人们对其抗菌机制的进一步认识和新的抗菌肽的发现，如今人们不仅可以从生物体内直接分离纯化得到抗菌肽，也可以对原有的天然抗菌肽进行结构改造或重新设计，比如更换某些氨基酸残基或根据需要直接设计抗菌肽氨基酸的一级结构，以期获得活性更高、更有针对性同时对宿主细胞无毒害作用的抗菌肽。

此外，截止2018年，依据抗菌肽数据库，目前共有4849个抗菌肽，其中包含4256个天然多肽和593个人工合成多肽。其中大约有70个多肽有望作为生物医药。在这70个抗菌肽中，有34个处于临床前研究阶段，27个处于临床研究阶段，有10个多肽在临床二期或者三期实验中失败了。目前已有一种抗菌肽(达托霉素，礼来公司)获FDA批准可作为抗生素。蝎毒液已被证明是一个丰富的抗菌肽的来源，实验证明，这些抗菌肽均可以杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、真菌、病毒和肿瘤细胞。其中AamAP1是从北非蝎Androctonus amoeruxi中分离出来的一种新型宿主防御肽，因其膜破坏性的抗菌机制，以及对革兰氏阳性菌的广谱抗菌作用，有望成为解决耐药微生物感染的有力武器，然而AamAP1在使用过程中存在以下缺点1、只对革兰氏阳性菌有杀伤作用，且杀菌能力较弱，最小抑菌浓度>150μM；2、天然AamAP1获取困难且纯度非常低；3、在生物体内稳定性差，半衰期<2h。这些都极大的限制了其临床应用前景。因此，直接模拟天然蝎毒抗菌肽正电性与两亲性的独特结构，人工设计并合成同样具有广谱抗菌活性的衍生抗菌肽是个良好的解决方案。

发明内容

为解决背景技术中存在的上述问题，本发明提供了两种抗菌肽序列GK-19和FK-20的序列设计、多肽人工合成及纯化，以及其在制备抗菌药物中的用途。

本发明的技术解决方案是：本发明为一种抗菌肽GK-19，其特殊之处在于：所述抗菌肽GK-19,其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种制备上述的抗菌肽GK-19的方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：

1)依据蝎毒肽AamAP1和AamAP1-Lysine的多肽序列，采用ExPasy,ProtromicsTools以及SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD工具和多肽设计软件，设计并优化多肽序列；采用固相化学合成法人工合成其全部序列；

2)通过反相高效液相色谱法对所合成多肽进行纯化。

一种上述的抗菌肽GK-19在抗菌方面的应用。

一种上述的抗菌肽GK-19在制备抗菌药物中的用途。

一种抗菌肽FK-20，其特殊之处在于：所述抗菌肽FK-20,其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

一种制备上述的抗菌肽FK-20的方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：

1)依据蝎毒肽AamAP1和AamAP1-Lysine的多肽序列，采用ExPasy,ProtromicsTools以及SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD工具和多肽设计软件，设计并优化多肽序列；采用固相化学合成法人工合成其全部序列；

2)通过反相高效液相色谱法进行纯化。

一种上述的抗菌肽FK-20在抗菌方面的应用。

一种上述的抗菌肽FK-20在制备抗菌药物中的用途。

本发明的有益效果在于：本发明中的抗菌肽GK-19和FK-20为人工合成，具有分子量小、人工合成方便，杀菌作用强、抗菌谱广等优点，此外GK-19和FK-20有效浓度区间无溶血效应，对包括人正常肝细胞、人胚肾细胞、人脐静脉内皮细胞及大鼠肺动脉血管平滑肌细胞均无明显毒性且动物实验结果表明其活体安全性较高。

附图说明

图1为本发明的抗菌肽GK-19和FK-20的物理化学性能；

图2显示GK-19和FK-20对五种细菌的杀伤能力，以多肽浓度为横坐标；E.Coli大肠杆菌(a),肺炎克雷伯杆菌(b),铜绿假单胞菌(c),耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(d),粪肠球菌(e)。数据以不同浓度抗菌肽和各种细菌共孵育12小时后残余细菌的百分比表示；

图3为GK-19和FK-20在体外条件下对不同细胞生长的抑制作用图；不同浓度的抗菌肽分别与大鼠肺动脉血管平滑肌细胞、人脐静脉内皮细胞、正常肝脏细胞和人胚肾细胞共孵育；GK-19对四种细胞的生存能力的抑制作用(a)，FK-20对四种细胞的生存能力的抑制作用(b)，数据以不同浓度抗菌肽和细胞共孵育48小时后残留活细胞的细胞百分比表示；

图4为GK-19和FK-20的对人红细胞的溶血效应；

图5为GK-19和FK-20对正常昆明鼠的肝功和肾功的毒性分析；

图6为GK-19和FK-20对正常昆明鼠的活体毒性分析，静脉注射抗菌肽后七天内小鼠的体重增长表示。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述：

本发明的抗菌肽GK-19和FK-20为依据蝎毒肽AamAP1的多肽序列，对其氨基酸序列进行增减和替换，设计出的活性多肽，其中抗菌肽GK-19包含19个氨基酸残基，分子量为2219.84Da，等电点为11.38，静电荷为+6，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：

抗菌肽FK-20包含20个氨基酸残基，分子量为2348.01Da，等电点为11.45，静电荷为+7，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

实施例一：抗菌肽GK-19和抗菌肽FK-20的制备

Ⅰ、抗菌肽GK-19和FK-20的化学合成方法：依据蝎毒肽AamAP1和AamAP1-Lysine的多肽序列，采用ExPasy,Protromics Tools以及SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTIONMETHOD等工具和多肽设计软件，对抗菌肽的序列进行设计，采用固相化学合成法，人工合成其全部序列。

Ⅱ、采用反相高效液相色谱法对所合成的抗菌肽进行纯化；

Ⅲ、采用质谱对所合成的抗菌肽进行分子量测定；

Ⅳ、采用圆二色谱仪及紫外分光光度计对其性能及二级结构进行测定，采用等电聚焦电泳测定等电点，采用氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构；

Ⅴ、参见图1，两种抗菌肽的物理化学性能。抗菌肽GK-19包含19个氨基酸残基，分子量为2219.84Da，等电点为11.38，静电荷为+6，抗菌肽FK-20包含20个氨基酸残基，分子量为2348.01Da，等电点为11.45，静电荷为+7。

实施例二：抗菌肽GK-19和FK-20的抗菌实验：

最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)：为检测不到细菌生长的最低样品浓度。

参见图2，细菌接种于M-H液体培养基中，37℃环境温度中置于摇床以200rpm转速震荡培养14-16h。分别与不同浓度(0μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM、15μM、20μM)的抗菌肽在96孔板上进行孵育。每种多肽的同一浓度设置三个复孔，每个孔加50μL2×10⁶CFU/mL菌液和50μL一定浓度的多肽溶液，置于37℃，200rpm摇床进行震荡孵育。12h后测定其在600nm处的吸光度，以判断细菌生长情况，推断抗菌肽的抗菌性。

结果计算：取检测不到细菌生长的孔和与之相邻有细菌生长的孔样品浓度之和的平均值作为样品最小抑菌浓度。

GK-19和FK-20两条序列，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抗菌活性，且最小抑菌浓度(MIC)均小于5μmol/L。

实施例三：抗菌肽GK-19和FK-20的细胞毒性实验：

参见图3，将293(人胚肾细胞)、肺动脉血管平滑肌细胞、HUVECs(人脐静脉内皮细胞)和L02(正常肝脏细胞)以每孔5000细胞接种到96孔板中，24h后吸走上清，用100μL PBS清洗一次，加入不同浓度的多肽溶液(0μM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM)，其中293和肺动脉血管平滑肌细胞应使用DMEM培养基。L02使用1640培养基，HUVECs使用ECM培养基。孵育48h后加入10μLCCK-8，孵育1h后测其吸光度。

结果显示即使在25μmol/L的高浓度下，依然有高于50％的细胞存活。四种细胞半数死亡的浓度均远远高于其最小抑菌浓度，说明这两种多肽在其使用浓度范围内，对机体细胞几乎没有损伤。

实施例四：抗菌肽GK-19和FK-20的溶血效应

采用人红细胞对多肽诱导红细胞裂解的性能进行研究。用EOTA-K₂紫管抽血，4℃存放。4℃350g离心5min，血浆收集后冷冻保存，红细胞收集备用。将收集的红细胞加入PBS中小心吹打均匀，4℃下350g离心5min，弃上清，重复2次，得到红细胞，取80μL红细胞加920μL PBS将其制成1mL8％的红细胞悬液备用。

参见图4，将20μL红细胞悬液和20μL不同浓度多肽(100μg/mL、220μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)加入1.5mL EP管中，37℃1000rpm振荡1h。由99％的PBS和1％的Triton-x-100配制成1％Triton-x-100的PBS。阳性对照为20μL8％红细胞悬液和20μL 1％Triton-x-100的PBS混合。阴性对照为40μL4％红细胞悬液。每个重复3个EP管，37℃1000rpm振荡1h。350g，4℃离心5min，取20μL上清，加入180μL PBS混匀，测定576nm波长下的OD值。

结果表明，在高达400μmol/L的高浓度下，两种抗菌肽才能导致大约40％的红细胞裂解，这为两种抗菌肽通过静脉给药的方式进入机体提供了依据，说明了多肽的安全性特征。

实施例五：抗菌肽GK-19和FK-20的活体毒性实验：

参见图5、6，采用昆明鼠对抗菌肽的活体安全性进行研究，通过尾静脉给药5μmol/kg或者25μmol/kg不同抗菌肽，注射组每组6只，对照组3只，对25μmol/kg注射组的小鼠体重进行检测。同时，分别在1天、3天和7天时眼球取血和摘取小鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾，测定小鼠的肝功(ALT和AST)和肾功(尿素氮和肌酸酐)。

结果表明，两种抗菌肽均对小鼠肝肾功没有任何影响，同时25μmol/kg组小鼠体重稳步增长，七天平均增长体重均大于10g。

本发明内容及上述实施例中未具体叙述的技术内容同现有技术。

本发明不限于上述实施例，本发明内容所述均可实施并具有所述良好效果。

以上，仅为本发明公开的具体实施方式，但本发明公开的保护范围并不局限于此，本发明公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 西安交通大学医学院第一附属医院

<120> 一种抗菌肽GK-19和FK-20及其制备方法及应用

<130> 20210514

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Phe Leu Phe Lys Leu Ile Pro Lys Ala Ile Lys Lys Leu Ile Ser

1 5 10 15

Lys Phe Lys

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Phe Leu Phe Lys Leu Ile Pro Lys Ala Ile Lys Lys Leu Ile Ser Lys

1 5 10 15

Phe Lys Gly Lys

20

Claims (6)

1.一种抗菌肽GK-19，其特征在于：所述抗菌肽GK-19,其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种制备权利要求1所述的抗菌肽GK-19的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)依据蝎毒肽AamAP1和AamAP1-Lysine的多肽序列，采用ExPasy,Protromics Tools以及SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD工具和多肽设计软件，设计并优化多肽序列；采用固相合成法人工合成其全部序列；

2)通过反相高效液相色谱法进行纯化。

3.一种权利要求1所述的抗菌肽GK-19在制备抗菌药物中的用途。

4.一种抗菌肽FK-20，其特征在于：所述抗菌肽FK-20,其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种制备权利要求4所述的抗菌肽FK-20的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)依据蝎毒肽AamAP1和AamAP1-Lysine的多肽序列，采用ExPasy,Protromics Tools以及SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD工具和多肽设计软件，设计并优化多肽序列；采用固相合成法人工合成其全部序列；

2)通过反相高效液相色谱法进行纯化。

6.一种权利要求4所述的抗菌肽FK-20在制备抗菌药物中的用途。

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