JP2011178674A

JP2011178674A - 抗菌剤

Info

Publication number: JP2011178674A
Application number: JP2010041850A
Authority: JP
Inventors: Eisaku Yoshihara; 栄策良原; Shigeki Mitsunaga; 滋樹光永; Hidetoshi Inoko; 英俊猪子
Original assignee: Tokai University
Current assignee: Tokai University
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2011-09-15

Abstract

【課題】グラム陰性菌のみならず、外膜構造を持たないグラム陽性菌に対しても有効な抗菌作用を有する物質を提供する。
【解決手段】アミノ酸配列ＬＸＬＲ（ＸはＴ又はＳ）を含む少なくとも４アミノ酸からなるペプチド分子のカルボキシ末端に疎水性基を結合してなる修飾ペプチド分子を提供する。前記疎水性基はβ−ナフチルアミンであるのが好ましい。また、前記修飾ペプチド分子を含んでなる抗菌剤、前記修飾ペプチド分子と抗生剤を含有する菌感染症の治療薬も提供される。
【選択図】図１

Description

本発明は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌に対する抗菌作用を持つ新規物質及び当該抗菌物質を含有する抗菌剤に関する。

多剤耐性の緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)やアシネトバクター・バウマニ (Acinetobacter baumannii)等のグラム陰性菌は院内感染症の主要起因菌であり、免疫力が低下した患者を重篤な病態に至らしめる場合がある。これらの菌は多剤耐性を示すために感染症の治療が難しく大きな問題となっている。

一方、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌は、健康な人でも常在性あるいは一過性に存在し、皮膚、消化管、咽頭、鼻腔等から検出される。ペニシリンの発見で、黄色ブドウ球菌感染の治療にも使われるようになったが、ペニシリンのβラクタム環を加水分解する酵素をもつ耐性菌が出現し、そのため分解酵素抵抗性のペニシリンであるメチシリンが開発され使われるようになった。しかし、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA) も出現している。ほとんどのMRSAはペニシリン系だけでなくセフェム系、カルバペネム系、ニューキノロン系、アミノグリコシド系薬剤など多剤耐性となっている。MRSAも健康な人からも検出されることがある。

免疫力が低下した人が多剤耐性菌（緑膿菌やMRSA）に感染すると、ほとんどの抗生剤が効かないため、肺炎、腹膜炎、敗血症、髄膜炎など様々な重症感染症の原因となり得る。そのため免疫力や抵抗力が低下した患者が多い医療機関での院内感染は非常に問題で、死亡例も多数報告されている。
これまでのところ、耐性菌の出現が少ないためバンコマイシンがMRSAの第一選択薬として治療に使用されているが、近年バンコマイシン抵抗性のMRSAも出現しており、新しいMRSA治療薬の出現が待望されている。

本発明者等は、グラム陰性菌である緑膿菌の多剤耐性獲得に寄与している多剤排出ポンプに着目して研究を進めてきた。中でも、MexAB-OprMポンプは、当該多剤排出ポンプを構成するサブユニットであるOprMのアミノ酸配列を改変することにより、緑膿菌の薬剤排出ポンプ機能を阻害し、抗生剤の薬効を増強することを見出した（特許文献１）。しかしながら、標的配列において変異が生ずると、当該方法の効果が失われる可能性があった。

さらに、グラム陰性菌のような外膜構造を持たないグラム陽性菌に対しては、多剤排出ポンプの機能阻害というアプローチを用いることができなかった。

国際公開第ＷＯ２００７／０９１３９５号パンフレット

本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、グラム陰性菌のみならず、外膜構造を持たないグラム陽性菌に対しても有効な抗菌作用を有する物質を提供することを目的とする。

本発明者等は、グラム陰性菌の外膜におけるYaeT複合体の形成を阻害することによって菌の生存に必要な外膜タンパク質（OMP）の輸送を遮断するという研究の過程において有効性が確認されたペプチド分子に化学修飾を施すことにより、グラム陰性菌のみならずグラム陽性菌に対しても優れた抗菌作用を有する物質を見出し、本発明をなすに至った。

即ち本発明は、アミノ酸配列ＬＸＬＲ（ＸはＴ又はＳ）を含む少なくとも４アミノ酸からなるペプチド分子のカルボキシ末端に疎水性基を結合してなる修飾ペプチド分子、及び当該修飾ペプチド分子を含む抗菌剤を提供する。

本発明の修飾ペプチド分子は、従来の抗生物質の不存在下でも、低用量で有効にグラム陰性菌及びグラム陽性菌（多剤耐性菌を含む）の生存を阻害することができる。従って、本発明の修飾ペプチド分子は極めて有効な抗菌剤となり得る。

本発明の修飾ペプチド分子等のPAO1株緑膿菌に対する殺菌作用の濃度依存性を示したグラフである。本発明の修飾ペプチド分子等のnalB株緑膿菌に対する殺菌作用の濃度依存性を示したグラフである。

本明細書における「グラム陰性菌」なる用語は、一般に用いられている意味で使用される。代表的なグラム陰性菌としては、大腸菌(Escherichia coli)、サルモネラ菌、シュードモナス、ヘリコバクター等のプロテオバクテリア及びシアノバクテリアが含まれる。医学に関連して分類すると、桿菌としては、呼吸器系の傷害を惹起する緑膿菌、インフルエンザ菌など、泌尿器系の障害を惹起する大腸菌、ミラビリス変形菌など、消化器系の障害を惹起するヘリコバクター・ピロリ、ゲルトネル菌などが挙げられ、球菌としては、髄膜炎菌、カタラリス菌、淋菌が挙げられる。

本明細書における「グラム陽性菌」なる用語は、一般に用いられている意味で使用される。グラム陽性菌の具体例には、球菌として、ブドウ球菌属（黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌など）、レンサ球菌属（双球菌、４連、８連球菌など；肺炎球菌、溶血連鎖球菌などが含まれる）；桿菌として、バシラス属（炭疽菌、枯草菌など）、クロストリジウム属（破傷風菌、ボツリヌス菌など）、コリネバクテリウム属（ジフテリア菌など）、リステリア属、乳酸桿菌（ラクトバシラス属、ビフィドバクテリウム属）、プロピオニバクテリウム属（ニキビの原因となるアクネ菌など）、放線菌（アクチノミセス属など）等が含まれる。

本発明者等は、グラム陰性菌の外膜構造に着目して研究を開始した。即ち、β−バレルプロテイン（外膜の孔を形成するタンパク質）生合成にYaeT複合体が必須であることが知られるに至り（Seokhee Kim等、Science、Vol. 317, pp.961-964 (2007)）、当該YaeT複合体の立体構造も解明されてきている（Rajeev Misra, ACS Chemical Biology, Vol. 2, pp.649-651 (2007)）という技術的背景に鑑み、YfgL、YfiO、NlpB及びSmpAなる４つのリポタンパク質と複合体を形成することにより外膜タンパク質（ＯＭＰ）の生合成を司っているYaeTの複合体形成を阻害することにより薬剤排出ポンプを含むＯＭＰの外膜への輸送を阻止することを試みた。その研究過程において見出された特定のアミノ酸配列を有するペプチド分子を化学修飾することによって得られたのが本発明の修飾ペプチド分子である。

グラム染色によって紫色に染まるものをグラム陽性、紫色に染まらず赤く見えるものをグラム陰性といい、この染色性の違いが細胞壁の構造の違いによることが知られている。グラム陽性菌はペプチドグリカン層が厚く脂質が少ない細胞壁を持ち、グラム陰性菌はペプチドグリカン層が薄く脂質が多い細胞壁を持つ。そしてこの細胞壁の構造の違いは、この両者が生物学的に大きく違うことを反映しており、グラム染色は細菌を分類する上で重要な手法になっている。従って、生物学的にも相違し、異なる細胞壁構造を有するグラム陰性菌とグラム陽性菌の双方に有効な抗菌物質が得られたのは驚くべきことである。

本発明の修飾ペプチド分子は、アミノ酸配列「ＬＸＬＲ（ＸはＴ又はＳ）」を含む少なくとも４アミノ酸からなるペプチド分子のカルボキシ末端に疎水性基を結合してなることを特徴とする。

本発明の修飾ペプチド分子を構成するアミノ酸配列「ＬＴＬＲ」及び「ＬＳＬＲ」は、グラム陰性菌のYaeT複合体形成を阻害する可能性のあるペプチド分子として見出されたものである。しかしながら、当該アミノ酸配列を含むペプチド分子のカルボキシ末端にβナフチルアミドを結合させた修飾ペプチド分子は、グラム陰性菌のみならずグラム陽性菌にも有効な抗菌作用を示す。

本発明の修飾ペプチド分子は、「ＬＴＬＲ」又は「ＬＳＬＲ」という４つのアミノ酸が連続した構造を含むことが必要であるが、本発明の効果を阻害しない限り、そのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に更にアミノ酸が結合したものでもよい。即ち、本発明の修飾ペプチド分子を構成するペプチドの長さとしては、少なくとも上記の４アミノ酸長であるが、５以上のアミノ酸長を有するものでもよく、適切に折りたたまれることにより本発明の作用を維持しているならば、例えば１０アミノ酸程度の長さを有するものであってもよい。

本発明者等は、グラム陰性菌のYaeT複合体形成を阻害する物質として見出された「ＬＴＬＲ」又は「ＬＳＬＲ」というペプチド分子に疎水性を付与して膜透過性を向上させるために疎水性基であるβ−ナフチルアミンを結合させたところ、上記の驚くべき効果が確認できたことから、前記ペプチド分子のカルボキシ末端にカップリングするのは、或る程度の嵩を持つ疎水性の基であれば特に限定されない。

そのような疎水性基の好ましい例としては、カルボキシル基とカップリング可能な官能基を有する疎水性炭化水素基、例えば、フェニルアミン、ジフェニルアミン、トリフェニルアミン、ナフチルアミン、アミノアントラセン、アミノフェナントレン等の芳香族基、ｔ−ブチルアミン、２−トリメチルエチルアミン等の飽和又は不飽和の炭化水素基、及びそれらの誘導体等が挙げられる。中でも、β−ナフチルアミンが特に好ましい。
また、疎水性基をペプチド分子のカルボキシ末端にカップリングさせる結合は、アミド結合、エステル結合などが挙げられる。

本発明の修飾ペプチド分子は、単独で使用しても低用量で抗菌作用を発揮する。従って、本発明は、前記修飾ペプチド分子を含有する抗菌剤を提供する。

一方、グラム陰性菌を標的とする場合には、抗菌剤が外膜を通過して作用することが必要な場合もあり得る。従って、特にグラム陰性菌に対して使用する場合は、本発明の修飾ペプチド分子を、外膜の透過性を向上させる薬剤と同時投与するのが好ましい。

外膜の透過性を向上させる作用を有する薬剤としては、特に限定されるものではないが、細胞膜変質作用を有する抗生剤が挙げられる。具体的には、ポリミキシンＢ、コリスチン等である。

従って、本発明は、前記修飾ペプチド分子と抗生剤とを含有する菌感染症の治療薬を提供する。
本発明に係る抗菌剤及び治療薬は、前記有効成分以外に、製薬上許容される媒体、賦形剤等を含有していてもよい。

以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下に示す実施例等において、グラム陰性菌又はグラム陽性菌の生菌数の測定方法は次の通りである。

３７℃で一晩培養した菌の一部をフレッシュなMH培地に添加して、同じ温度で培養を続ける。菌の濁度（６００ｎｍでの吸光度）が０．７〜０．８に達したとき、その菌液をMH培地に加えて１００〜２００倍希釈した菌液を調製し、実験に供する。
菌液６０〜８０μｌとペプチド等の溶液を加えて最終的に１００μｌにした溶液を３７℃で攪拌しながら一定時間（３時間）培養する。培養後、菌液をPBS溶液で希釈し、その希釈液をMH寒天プレートに播き、３７℃で一晩培養する。翌日プレートに生えたコロニーの数をカウントすることで生菌数を求める。

（実施例１）
上記の実験系で、緑膿菌標準株（PAO1株）を培養した。この時、ＬＴＬＲ（ロイシン−スレオニン−ロイシン−アルギニン）の配列をもつ４アミノ酸からなるペプチドのカルボキシ末端にβ−ナフチルアミンをアミド結合させた修飾ペプチド分子を種々の濃度で加えた条件で培養した。それぞれの条件下で、緑膿菌の生菌数を測定し、修飾ペプチド分子を添加しないときの生菌数に比べて生菌数がどのように変化するかを測定した。結果を図１（ａ）のグラフに示した。

上記の実験において、培地中にポリミキシンＢ(polymyxin B)(最終濃度は０．４μｇ/ｌ)（この濃度では緑膿菌の生存に影響がない）を添加したときの結果を図１（ｂ）に示し、本発明の修飾ペプチド分子に換えてＬＲＴＬ（ロイシン−アルギニン−スレオニン−ロイシン）の配列をもつ４アミノ酸からなるペプチドのカルボキシ末端にβ−ナフチルアミンをアミド結合させた比較例の修飾ペプチド分子を用いた場合の結果を図１（ｃ）に示す。

緑膿菌の生存率は本発明の修飾ペプチド分子の濃度依存的に低下し、５０μMの濃度でほぼ０％となった（ＩＣ_５０＝３４μＭ）。この効果は、０．４μｇ/ｍｌのポリミキシンＢ存在下で更に増強され、１０μＭの濃度でほぼ０％となった（ＩＣ_５０＝６μＭ）。それに対し、比較例の修飾ペプチド分子を用いた場合には、１００μＭでも生存率はほぼ１００％であり、本発明の効果が修飾ペプチド分子のアミノ酸配列に特異的であることが示された。

(実施例２)
実施例１で使用した標準株（PAO1株）の緑膿菌に代えて、nalB株(薬剤排出ポンプであるMexAB-OprMを高発現し、高度多剤耐性となった株)を用い、それらに対する本発明の修飾ペプチド分子の作用を測定した。その結果を図２（ａ）に示す。
標準株（実施例１）に比較して若干高濃度の修飾ペプチド分子を要したが、本発明の修飾ペプチド分子はnalB株に対しても濃度依存的な抗菌作用を示し、生存率は１００μＭの濃度でほぼ０％となった（ＩＣ_５０＝６４μM）。これに対して、実施例１で用いた比較例の修飾ペプチド分子を用いた場合には、１００μＭの濃度でもほぼ１００％が生存していた（図２（ｂ））。

（実施例３）
実施例１で使用した本発明の修飾ペプチド分子の、緑膿菌以外の細菌に対する抗菌作用を試験した。培養方法等は実施例１と同様だが、測定は、修飾ペプチド分子を添加しない場合と、１００μＭの濃度で添加した場合において実施した。それらの結果を下記の表１に示す。表中の生存率は、修飾ペプチド分子無添加の場合の菌数に対する生存菌数の割合（％）である。

上記の結果から、本発明の修飾ペプチド分子は、緑膿菌や大腸菌等のグラム陰性菌のみならず、黄色ブドウ球菌（メチシリン感受性株(MSSA)及びメチシリン耐性株(MRSA)を含む）に対しても、１００μＭ以下の低用量で、顕著な抗菌作用を示すことが確認された。

Claims

アミノ酸配列ＬＸＬＲ（ＸはＴ又はＳ）を含む少なくとも４アミノ酸からなるペプチド分子のカルボキシ末端に疎水性基を結合してなる修飾ペプチド分子。
前記疎水性基がβ−ナフチルアミンである、請求項１に記載の修飾ペプチド分子。
請求項１又は２に記載の修飾ペプチド分子を含んでなる抗菌剤。
請求項１又は２に記載の修飾ペプチド分子と抗生剤を含有する菌感染症の治療薬。