JP3459314B2 - 新規ペプチド、抗菌剤、新規ペプチド遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び新規ペプチドの製造法 - Google Patents

新規ペプチド、抗菌剤、新規ペプチド遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び新規ペプチドの製造法

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JP3459314B2 JP12544095A JP12544095A JP3459314B2 JP 3459314 B2 JP3459314 B2 JP 3459314B2 JP 12544095 A JP12544095 A JP 12544095A JP 12544095 A JP12544095 A JP 12544095A JP 3459314 B2 JP3459314 B2 JP 3459314B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗菌活性を誘導した蚕
体液中に存在する新規ペプチド、該ペプチドを有効成分
として含有することを特徴とする抗菌剤、該ペプチドを
コードする新規ペプチド遺伝子、該遺伝子を含む新規な
組み換え体ＤＮＡ及び新規ペプチドの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】昆虫の体腔内に細菌が侵入すると、生体
防御反応の一つとして、抗菌性タンパク質あるいはペプ
チドが体液中に誘導される。蚕の体液より得られる抗菌
性タンパク質あるいはペプチドとしては、リゾチーム、
セクロピン類等が知られている。しかしながら、リゾチ
ームは、ミクロコッカス等の極限られたグラム陽性細菌
に対して抗菌作用を示すのみであり、また、セクロピン
類は、種々のグラム陰性及び陽性細菌に対して抗菌作用
を示すものの、食中毒の原因細菌である黄色ブドウ球菌
やセレウス菌に対しては有効な抗菌作用を示さないとい
う問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
ペプチド及び該ペプチドを有効成分として含有する抗菌
剤を提供することにある。更に本発明の目的は、遺伝子
工学的手法を用いて該ペプチドを効率よく生産する方法
を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、抗菌活性を
誘導した蚕体液より、大腸菌、黄色ブドウ球菌、セレウ
ス菌等に対して優れた抗菌活性を示す新規抗菌性ペプチ
ドを単離することに成功し、さらに遺伝子工学の手法を
用いて該ペプチドを効率よく生産する方法を確立し、本
発明を完成した。
【０００５】すなわち本発明は、 １．配列番号１に記載のアミノ酸配列、または該アミノ
酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失
もしくは置換されており且つ抗菌活性をもたらすアミノ
酸配列で表される新規ペプチド。 ２．該ペプチドを有効成分として含有することを特徴と
する抗菌剤。
【０００６】３．配列番号１で表されるアミノ酸配列、
または該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ
酸が付加、欠失もしくは置換されており且つ抗菌活性を
もたらすアミノ酸配列をコードする新規ペプチド遺伝
子。 ４．該ペプチド遺伝子をベクターＤＮＡに挿入してなる
ことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
【０００７】５．エシェリシア属に属し、該組み換え体
ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、培養物からペ
プチドを採取することを特徴とする新規ペプチドの製造
法。を提供するものである。
【０００８】本発明の新規ペプチド（以下、「モリシ
ン」という）は、例えば抗菌活性を誘導した蚕体液よ
り、タンパク質を単離する通常の方法を用いて生産する
ことができる。また、通常のペプチド合成法、あるいは
遺伝子工学的手法を用いて生産することも可能である。
【０００９】遺伝子工学的手法としては、例えば、新規
ペプチド遺伝子が挿入された組み換え体ＤＮＡにより形
質転換又は形質導入された宿主細胞を用いて新規ペプチ
ドを生産する方法や、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等
を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて該組み換え体
ＤＮＡを翻訳してモリシンを生産する方法等を用いるこ
とができる。
【００１０】以下に、抗菌活性を誘導した蚕体液よりモ
リシンを単離する方法及び遺伝子工学的手法によるモリ
シンの生産方法について詳細に説明する。 〔１〕抗菌活性を誘導した蚕体液よりモリシンを単離す
る方法 モリシンを得るための出発原料は、抗菌活性を誘導した
蚕体液であれば如何なるものでもよい。抗菌活性の誘導
法としては、例えば蚕の幼虫の体腔内に、大腸菌の生理
食塩水懸濁液を注入する方法が挙げられる。
【００１１】抗菌活性の誘導後１８〜２４時間後に蚕の
足を切断して体液を集める。この体液を加熱した後、遠
心分離して上清を得る。
【００１２】次いで、得られた上清を塩析する。塩析に
用いる塩類としては、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。これらの
塩類を１５％〜７５％飽和となるように加え、沈澱する
画分を集める。
【００１３】次いで、得られた塩析物を蒸留水、酢酸ア
ンモニウム等の緩衝液に溶解し、ゲル濾過を行なう。こ
の操作により、タンパク質の分画及び脱塩処理を行なう
ことができる。ゲル濾過支持体は、通常のゲル濾過に用
いられるものであれば如何なるものでもよく、例えば商
品名：セファデックスＧ−５０、Ｇ−７５、Ｇ−１００
（いずれもファルマシア・ファインケミカル社製）、商
品名：トヨパールＨＷ−５５（東ソー社製）等が挙げら
れる。
【００１４】次いで、ゲル濾過によって得られた低分子
量タンパク質画分を、陽イオン交換カラムクロマトグラ
フィーに供す。陽イオン交換体としては、例えば商品
名：ＣＭセファロースＦＦ（ファルマシア・ファインケ
ミカル社製）、商品名：ＣＭトヨパール６５０（東ソー
社製）等が挙げられる。
【００１５】陽イオン交換カラム吸着画分のうち、最も
強い抗菌活性を示す画分を、逆相カラムを用いた高速液
体クロマトグラフィー（以下「逆相ＨＰＬＣ」という）
に供す。ここで用いる逆相カラムとしては、例えば商品
名：Ｃａｐｃｅｌｌ ＰａＫＣ８ ＳＧ３００、Ｃ１８
ＳＧ３００（いずれも資生堂社製）等が挙げられる。逆
相カラム吸着画分は、トリフルオロ酢酸を含むアセトニ
トリルの濃度勾配により溶出させることができる。
【００１６】ここで得られる吸着画分のうち、最も強い
抗菌活性を示す画分を、再度逆相ＨＰＬＣに供すことに
より、モリシンを単離することができる。
【００１７】なお、上記の単離精製工程において得られ
る画分の抗菌活性の測定は、平板培地での阻止円形成を
指標とし、検定菌として例えば黄色ブドウ球菌（Staphy
lococcus aureus subsp. aureus ATCC 6538P）を用いて
行なうことができる。
【００１８】〔２〕遺伝子工学的手法によるモリシンの
生産方法 以下に、モリシン遺伝子を含むＤＮＡを挿入した組み換
え体ＤＮＡにより、宿主細胞を形質転換又は形質導入
し、得られた組み換え微生物を用いてモリシンを生産す
る方法について説明する。
【００１９】モリシン遺伝子を含むＤＮＡは、蚕ゲノム
ＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の天然遺伝子をクローニング
することにより得られる。また、モリシンのアミノ酸配
列に基づきプライマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により
該ＤＮＡを増幅することもできる。さらには化学合成法
を用いて該ＤＮＡを構築することも可能である。尚、モ
リシン遺伝子がコードするアミノ酸配列は、抗菌活性を
失うことのない限り、１もしくは複数のアミノ酸が、付
加、欠失もしくは置換されていてもよい。抗菌活性を失
うことのない範囲でアミノ酸配列が変更されたモリシン
遺伝子は、全て本発明に含まれる。
【００２０】モリシン遺伝子を含むＤＮＡは、その両端
に適当な制限酵素、例えばEcoRI、SalI等の認識部位が
付与されていることが好ましい。これにより、該ＤＮＡ
のベクターＤＮＡへの挿入を効率よく行なうことができ
る。
【００２１】モリシン遺伝子を含むＤＮＡを化学合成す
る場合、該ＤＮＡを複数のオリゴヌクレオチドに分けて
化学合成し、これらをアニーリングした後、ＤＮＡリガ
ーゼにより結合する。その場合のコドンは、モリシンの
アミノ酸配列に影響を与えないコドンであって、かつ宿
主細胞で頻繁に使用されるコドンに置換することが好ま
しい。これにより、天然のモリシン遺伝子を用いた場合
に比べ、より大量のモリシンペプチドを生産することが
できる。
【００２２】モリシン遺伝子を含むＤＮＡは、下記の方
法により容易に増幅することができる。すなわち、該Ｄ
ＮＡを適当なベクターＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮ
Ａ、バクテリオファージＤＮＡ等に挿入して組み換え体
ＤＮＡを得る。次いで、該組み換え体ＤＮＡを用いて宿
主細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli JM109 宝酒
造社製）等を形質転換あるいは形質導入して組み換え微
生物を得る。この組み換え微生物を培養し、常法を用い
て組み換え体ＤＮＡを調製した後、適当な制限酵素を用
いてインサートＤＮＡを切り出し、これを精製すればよ
い。尚、組み換え微生物より組み換え体ＤＮＡを調製す
る際に、ジデオキシ法［Methods Enzymol.,101巻,20-78
頁（1983）］等により、インサートＤＮＡの塩基配列を
確認することが好ましい。
【００２３】モリシンを生産するための宿主細胞として
は、真核細胞及び原核細胞のいずれをも用いることがで
きる。真核細胞としては動物、植物、昆虫、酵母等の細
胞が、また原核細胞としては大腸菌、枯草菌、放線菌等
が挙げられる。宿主細胞として植物や昆虫の細胞を用い
る場合、培養細胞である必要はなく、植物体や虫体、具
体的にはタバコの植物体やカイコの幼虫等であってもよ
い。
【００２４】モリシンのような抗菌性ペプチドを大腸菌
等の原核細胞に生産させる場合、目的とするペプチド
を、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、マルト
ース結合タンパク質あるいはプロテインＡ等との融合タ
ンパク質として発現させることが好ましい。融合タンパ
ク質として発現されたモリシンは抗菌活性を示さないの
で、宿主である原核細胞の増殖を抑制しない。本発明に
おいて宿主として使用できる原核細胞としては、エシェ
リシア属の菌株、例えばEscherichia coli JM109、Esch
erichia coli HB101(ATCC33694)等を挙げることができ
る。
【００２５】融合タンパク質として発現された抗菌性ペ
プチドは、該融合タンパク質が可溶性である場合にはア
フィニティークロマトグラフィーを用いることにより、
また不溶性である場合には遠心分離処理を用いることに
より、容易に精製することができる。
【００２６】モリシンペプチドを発現させるためのベク
ターＤＮＡは、宿主細胞で複製可能なものであれば如何
なるものでもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテ
リオファージＤＮＡ等が挙げられる。宿主細胞が大腸菌
である場合のベクターＤＮＡとしては、例えばプラスミ
ドpMAL-C2（NEW England Labs社製）、pGEX-5X-1（ファ
ルマシア社製）、pXa1（ベーリンガー社製）等を用いる
ことができる。
【００２７】次いで、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素
部位にモリシン遺伝子を含むＤＮＡを挿入して組み換え
体ＤＮＡを調製する。ベクターＤＮＡとしてプラスミド
pXa1を用いる場合、これを制限酵素、例えばEcoRI、Sal
I等により消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。
次いで、モリシン遺伝子を含むＤＮＡと、切断されたベ
クターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、例えば
T4 DNAリガーゼを作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。
【００２８】上記の組み換え体ＤＮＡを用いて、宿主細
胞を形質転換あるいは形質導入することにより、組み換
え微生物を得ることができる。形質転換はディー・エム
・モーリソン法［Methods Enzymol.,68巻,326-331頁（1
979）］、塩化カルシウム法［Gene,6巻,23頁,(1979)］
等により、また形質導入はビー・ホーン法［MethodsEnz
ymol.,68巻,299-309頁（1979)］等により行なうことが
できる。
【００２９】次いで、この組み換え微生物を培地に培養
し、培養物からモリシンを採取する。
【００３０】宿主細胞として真核細胞を用い、モリシン
を単独の形で発現させる場合には、モリシンの採取方法
として、通常のタンパク質単離方法を用いることができ
る。すなわち、酵素を用いた溶菌処理、超音波破砕処
理、磨砕処理等により菌体を破壊し、モリシンを菌体外
に排出させる。次いで、蚕体液よりモリシンを単離する
時と同様の方法、すなわちゲル濾過法、イオン交換樹
脂、逆相ＨＰＬＣを用いることにより高度に精製された
モリシン標品を得ることができる。
【００３１】宿主細胞として真核細胞または原核細胞を
用い、モリシンを融合タンパク質として発現させた場合
は、菌体を破壊した後、遠心分離処理やアフィニティー
クロマトグラフィー等の組合せにより、融合タンパク質
を得る。次いで、臭化シアン等を用いた化学処理、ある
いはファクターＸａ（ベーリンガー・マンハイム社製）
等を用いた酵素処理により融合タンパク質からモリシン
ペプチドを切り出し、これを精製する。
【００３２】遺伝子工学的手法により得られるモリシン
は、抗菌活性を誘導した蚕体液より単離されたモリシン
と全く同様の抗菌活性を示すものである。
【００３３】モリシンは、例えば、米飯、パンなどの腐
敗を起こすバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)
、食中毒の原因菌である黄色ブドウ球菌(Staphylococc
us aureus) 、大腸菌(Escherichia coli)をはじめ、バ
チルス（Bacillus) 属、スタフィロコッカス(Staphyloc
occus)属、クロストリジウム(Clostridium)属、ストレ
プトコッカス(Streptococcus)属等のグラム陽性細菌、
エシェリシア(Escherichia)属、シュウドモナス(Pseudo
monas)属等のグラム陰性細菌等に広く抗菌活性を発揮し
うる。
【００３４】モリシンは、そのままで、または通常用い
られる固体担体、液体担体、乳化分散剤等により錠剤、
粉剤、水和剤、乳剤、カプセル剤等の形に製剤化して抗
菌剤として使用することができる。上記担体としては、
水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラク
トース、アラビアゴム、植物油等が挙げられる。
【００３５】上記でいう抗菌剤には、食品用防腐剤、医
療用抗菌剤、建材・塗料用防腐剤、農園芸用抗菌剤、家
畜飼料用防腐剤、養魚飼料用防腐剤等が包含され、広汎
な分野で利用することができる。
【００３６】モリシンを、食品用防腐剤として食品に添
加する場合は、食品中に混合する方法、食品表面に塗布
する方法等が例示される。その場合は、食品１ｋｇ当た
り２ｍｇ以上、好ましくは、５〜５０ｍｇ程度添加すれ
ばよい。
【００３７】適用できる食品としては、カマボコ、チク
ワ等の水産練り製品、ハム、ソーセージ等の畜肉加工
品、清涼飲料、果実飲料等の飲料類、ケーキ、プリン、
饅頭等の菓子類が例示される。
【００３８】モリシンを有効成分として含有する抗菌剤
は、さらに他の殺菌剤、医薬品、防腐剤、食品添加物等
と適宜混合して使用することも可能である。
【００３９】
【発明の効果】モリシンは、食中毒の原因細菌である黄
色ブドウ球菌やセレウス菌をはじめ、種々のグラム陰性
及び陽性細菌等に対して有効な抗菌作用を示すことか
ら、食品用防腐剤、医療用抗菌剤として好適である。
【００４０】以下に、抗菌活性を誘導した蚕体液からモ
リシンを単離する場合の実施例、遺伝子工学的手法によ
りモリシンを生産する場合の実施例及び抗菌活性試験例
により本発明を具体的に説明するが、これらにより本発
明の範囲が限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
〔実施例１〕 （１）抗菌活性を誘導した蚕体液からのモリシンの単離 蚕（品種名：東海×朝日、農林水産省蚕糸・昆虫農
業技術研究所より入手）５令幼虫７００頭に、大腸菌
（Escherichia coli HB101 ATCC33694）の生理食塩水懸
濁液（４×108個／ｍｌ）を０．００５ｍｌ／頭の割合
で体腔内に注入し、抗菌活性を誘導した。２０時間後、
蚕の足を切断して体液を集め、直ちに１００℃の湯浴上
にて５分間加熱した後、遠心分離した。
【００４２】 得られた遠心上清２００ｍｌに、１５
％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、塩析物を
遠心分離した。遠心上清に、７５％飽和となるように硫
酸アンモニウムを加え、塩析物を遠心分離して集めた。
この塩析物を蒸留水４０ｍｌに溶解した。
【００４３】 溶解液を、５０ｍＭ酢酸アンモニウム
（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−５０の
カラム（５×１００ｃｍ）に流してゲル濾過を行ない、
低分子量タンパク質画分を集めた。
【００４４】 低分子量タンパク質画分を５０ｍＭ酢
酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭセファ
ロースＦＦのカラム（２．５×４．４ｃｍ）に流した。
吸着画分は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）
と０．８Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）とを９．
５：０．５、９：１、８：２、７：３、６：４、５：
５、４：６、３：７の各体積比で混合したものを、５０
ｍｌずつ順次このカラムに流すことにより溶出させた。
溶出液は、塩濃度に応じて５０ｍｌずつ分取した。４：
６の混合液で溶出された画分が、最も強い抗菌活性を示
した。
【００４５】 ４：６の混合液で溶出された画分のう
ち１０ｍｌを、逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ
ＰａＫ Ｃ８ ＳＧ３００ １０×２５０ｍｍ）に付
した。吸着画分は、０．１％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの濃度勾配により溶出させた。残りの溶出
液についても同様に逆相ＨＰＬＣに供し、最も強い抗菌
活性を示す画分を集めた。
【００４６】 この画分を、再度逆相ＨＰＬＣ(カラ
ム：Ｃａｐｃｅｌｌ ＰａＫ Ｃ８ＳＧ３００ ４．６
×２５０ｍｍ)に供し、更に精製を行なった。吸着画分
は、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの
濃度勾配により溶出させた。溶出画分の一部を、トリシ
ンＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「トリ
シンＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という）に付し、泳動後のゲル
を商品名：クマシーブリリアントブルーＲ−250（ＢＲ
Ｌ社製）で染色したところ、単一の染色バンドを得た。
【００４７】 上記の方法により、蚕体液の遠心上清
２００ｍｌから、モリシン１５０μｇを得た。なお、モ
リシンを単離する際の抗菌活性の測定は、平板培地での
阻止円形成を指標とし[Nature, 292巻, 246頁（198
1）］、検定菌として黄色ブドウ球菌（Staphylococcus
aureus subsp. aureus ATCC 6538P）を用いて行なっ
た。
【００４８】また、タンパク質量の測定は、ローリー法
の改良法［Methods Enzymol. 91巻,95 頁（1983）］に
より行ない、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥは、［Anal. Bi
ochem. 166巻, 368 頁（1987）］記載の方法により行な
った。
【００４９】（２）構造解析 （ａ）アミノ酸組成 ０．１％フェノールを含む６Ｎ−塩酸中で加水分解（減
圧下、１１０℃、２４時間）した後、アミノ酸分析計
（８３５型 日立社製）により分析した結果を以下に示
す。 アミノ酸 モル数／モリシン１モル Ｌｙｓ ８．８ Ａｌａ ５．９ Ｉｌｅ ４．８ Ａｓｐ＋Ａｓｎ ４．０ Ｇｌｙ ３．１ Ｖａｌ ３．２ Ａｒｇ １．７ Ｌｅｕ ２．１ Ｐｈｅ ２．３ Ｐｒｏ １．９ Ｔｈｒ １．９ Ｈｉｓ １．４ Ｓｅｒ １．０
【００５０】（ｂ）分子量 質量分析計（ＡＰＩ−III 型 Perkin Elmer ScieX社
製）により分析した結果、４５４３．１±０．６Ｄａの
値を得た。
【００５１】（ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列 モリシンのＮ末端配列アミノ酸配列を、プロテインシー
ケンサー（４７３Ａ型アプライドバイオシステムズ社
製）を用いて、エドマン法により分析した結果、配列番
号２に記載のアミノ酸配列を得た。
【００５２】（ｄ）エンドプロテイナーゼ消化物のアミ
ノ酸配列 モリシンをエンドプロテイナーゼAsp−Ｎ（宝酒造社
製）で消化した後、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣ
で単離した。夫々の断片のアミノ酸配列をエドマン法に
より分析した結果、配列番号３及び配列番号４に記載の
アミノ酸配列を得た。
【００５３】（ｅ）アミノ酸分析、質量分析、エドマン
法による分析の結果より、モリシンは、配列番号１に記
載のアミノ酸配列を有するペプチドであると結論した。
【００５４】〔試験例１〕 抗菌活性試験（１） 種々の細菌に対するモリシンの抗菌活性を調べるため、
[Eur.J.Biochem., 187巻, 381-386 頁(1990)] 記載の方
法に準じて最小増殖阻止濃度（Ｍ.Ｉ.Ｃ.）を求めた。
得られた結果を表１に示す。
【００５５】（検定菌） 大腸菌（Escherichia coli JM109 宝酒造社製） 黄色ブドウ球菌（Stahpylococcus aureus subsp. aureu
s ATCC 6538P） セレウス菌（Bacillus cereus IFO3457）
【００５６】（試験用培地）検定菌として大腸菌及び黄
色ブドウ球菌を用いた場合にはブレインハートインフュ
ージョン培地（ＢＨＩ培地、ディフコ社製）を使用し、
また、セレウス菌を用いた場合にはニュートリントブロ
ス培地（ＮＢ培地、ディフコ社製）を使用した。
【００５７】（抗菌活性試験法）検定菌を４×１０4 個
／ｍｌとなるように懸濁した試験用培地に、モリシンを
各種濃度で含む同培地を等液量加えた後、３０℃で２０
時間培養した。培養後、６％ホルマリン溶液を等液量加
えて２倍に希釈し、菌の増殖の程度を６５０ｎｍでの吸
光度を測ることにより調べた。なお対照として、蚕由来
の公知の抗菌性ペプチドであるセクロピンＢ１［Comp.
Biochem. Physiol. 95B巻、551頁（1990）］を用いた。
【００５８】
【表１】
【００５９】〔試験例２〕 抗菌活性試験（２） 各種細菌に対する抗菌活性を、[Nature,292号,246頁(19
81)]記載の方法に準じて調べた。得られた結果を表２に
示す。
【００６０】（検定菌） 細菌 Escherichia coli JM109（宝酒造社製） Pseudomonas fluorescens IAM1179 Bacillus subtilis IAM1107 Bacillus megaterium IAM1030 Bacillus cereus IFO3457 Staphylococcus aureus ATCC6538P Staphylococcus aureus IFO3083 Staphylococcus epidermidis IFO12993 Staphylococcus xylosus IAM1312 Pseudomonas aeruginosa IAM1514 Streptococcus pyogenes ATCC21547
【００６１】（試験用培地）０．８％アガロースを含む
ＮＢ平板培地（場合によって食塩を１５０ｍＭ になる
ように添加）を使用した。ただし、検定菌としてStrept
ococcus pyogenesを用いた場合には０．８％アガロース
を含むＢＨＩ平板培地を使用した。
【００６２】（抗菌活性試験法） ５０μＭのモリシン溶液を調製し、検定菌を接種した平
板培地に設けたウエルに２μｌずつ供した。３０℃で一
晩培養後、形成された阻止円の直径を測定した。なお対
照としてセクロピンＢ１を用いた。また、ウエル直径
は、２．０ｍｍであり、阻止円の直径が２．０ｍｍの場
合は阻止円が形成されなかったことを示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】表１及び表２の結果より、モリシンは、食
中毒の原因細菌である黄色ブドウ球菌やセレウス菌をは
じめ、種々のグラム陰性及び陽性細菌等に対して強い抗
菌作用を示すことが判明した。
【００６５】〔実施例２〕 遺伝子工学的手法によるモ
リシンの生産 遺伝子工学的手法によるモリシンの生産は、下記の手順
により行なった。すなわち、化学合成法を用いてモリシ
ン遺伝子を含むＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを挿入したプ
ラスミドpUCMOR1を調製した。pUCMOR1を用いて大腸菌を
形質転換し、pUCMOR1を増幅した。ついで、pUCMOR1のイ
ンサートＤＮＡのサブクローニングによりモリシン発現
用プラスミドpXAMOR1を調製し、大腸菌を形質転換し
た。得られた組み換え微生物を用いてモリシン融合タン
パク質を生産し、これを臭化シアン処理、粗精製してモ
リシン粗精製物を得た。
【００６６】各工程を具体的に説明する。 １．化学合成法を用いたモリシン遺伝子を含むＤＮＡの
構築 （１）塩基配列の決定 大腸菌で高頻度に用いられるコドンを利用し［Ikemura,
T., J. Mol. Biol..151 巻 389-409頁 (1987)］、構築
すべきＤＮＡ、すなわちモリシン遺伝子を含むＤＮＡの
塩基配列を決定した。このＤＮＡの構成は、制限酵素Ec
oRIの認識部位の下流に、臭化シアンで切り出すための
メチオニンに対応するコドン（ＡＴＧ）、モリシン遺伝
子、２つの終止コドン（ＴＡＡ及びＴＡＧ）、次いでSa
lI認識部位となっている。決定されたモリシン遺伝子の
塩基配列を配列番号５に示した。
【００６７】（２）オリゴヌクレオチドの化学合成 モリシン遺伝子を含むＤＮＡを８個の部分（ｍｏｓｙ１
〜８）に分けて化学合成した。オリゴヌクレオチドの合
成は、ＤＮＡ合成機（ABI model 392 アプライド バイ
オシステムズ社製）を用いて、フォスフォアミダイト法
により行なった。
【００６８】ｍｏｓｙ１〜８の塩基配列は下記の通り。 mosy1 AATTCATGGCTAAAATCCCGATTAAGGCAATTAAA mosy2 ACTGTGGGCAAAGCTGTTGGTAAAGGTCTGCGTG mosy3 CTATCAACATCGCTTCTACCGCTAACGACGTATTCAA mosy4 CTTCCTGAAACCGAAGAAACGTAAACACTAATAG mosy5 CACAGTTTTAATTGCCTTAATCGGGATTTTAGCCATG mosy6 GTTGATAGCACGCAGACCTTTACCAACAGCTTTGCC mosy7 CAGGAAGTTGAATACGTCGTTAGCGGTAGAAGCGAT mosy8 TCGACTATTAGTGTTTACGTTTCTTCGGTTT
【００６９】（３）合成オリゴヌクレオチドの精製 合成オリゴヌクレオチドの精製は、QIYAGEN Plasmid Ki
t(フナコシ社製)を用いて行なった。先ず、（２）で合
成したオリゴヌクレオチドの一部を、ＭＯＰＳ溶液［50
mM MOPS(pH7.0)、0.1M NaCl］に溶解し、２０μｇ／ｍ
ｌのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。 平衡化溶液
[50mM MOPS(pH7.0)、0.1M NaCl、0.15%Triton X-100]２
ｍｌで平衡化した精製用チップ（QIYAGEN-tip 20）に、
上記のオリゴヌクレオチド溶液１ｍｌを供し、オリゴヌ
クレオチドを吸着させた後、ＭＯＰＳ溶液４ｍｌで洗浄
した。次いでキットの説明書の通りオリゴヌクレオチド
の溶出、沈殿、洗浄を行なった。得られた各オリゴヌク
レオチド（６〜１３μｇ）をＴＥ溶液[10mM Tris-HCl(p
H8.0)、1mM EDTA]１５μｌに溶解した。
【００７０】（４）オリゴヌクレオチドのリン酸化 ｍｏｓｙ２〜７の各オリゴヌクレオチドの５’末端を、
ＡＴＰとＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化した。反応は夫々別のチューブで行ない、その条件
は下記の通り。オリゴヌクレオチド３μｇ（ＴＥ溶液に
溶解したもの）、１０×カイネーションバッファー[500
mM Tris-HCl(pH7.6)、100mM MgCl2、50mM DTT、1mM spe
rmidine-HCl、1mM EDTA 日本ジーン社製]２μl、10mM A
TP 2μl、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ(日本ジーン社
製)２０Ｕ を混合したものに水を加えて総量20μlとし
た後、37℃で２時間反応させた。次いで９０℃で３分間
加熱し、反応を停止した。
【００７１】（５）モリシン遺伝子を含むＤＮＡの構築 オリゴヌクレオチドのアニーリング Ｍｏｓｙ ２〜７の各リン酸化反応液を一つのチューブ
にまとめて１２０μｌとし、これに３μｇのＭｏｓｙ１
及び３μｇのＭｏｓｙ８を添加した。更に１０×ライゲ
ーションバッファー[500mM Tris-HCl(pH7.9)、100mM Mg
Cl2、200 mM DTT、10mM ATP 日本ジーン社製]２０μｌ
を添加した後、水で総量１９７μｌとした。９０℃で５
分間加熱後、直ちに氷冷し、ヒートブロック( Dry Ther
mo Unitmodel AL-10 タイテック社製)により７５℃で１
０分間加熱した。次いでヒートブロックの電源を切り、
５時間放置した。
【００７２】 オリゴヌクレオチドのライゲーション 上記の反応液１９７μｌにＴ４ ＤＮＡリガーゼ(日本ジ
ーン社製)１８００Ｕを添加し、16℃で１４時間反応さ
せた。
【００７３】 ＤＮＡの精製 上記の反応液の一部（３０μl）にＢＰＢ溶液（0.1% BP
B、30% Glycerol）を３μl添加して、３％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約140bpの鎖長のバンドを切り出
した。ゲル中のＤＮＡを、凍結融解処理及びエタノール
沈殿処理により回収した。得られたＤＮＡ８００ｎｇ
を、１×カイネーションバッファー９μｌに溶解した。
【００７４】 モリシン遺伝子を含むＤＮＡのリン酸
化 上記のＤＮＡ溶液のうち8μlに、１０ｍＭ ＡＴＰ １μ
ｌ及びＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ１０Ｕを添加し
た後、３７℃で２時間反応させた。次いで９０℃で３分
間加熱し、反応を停止した。
【００７５】２．組み換え体ＤＮＡ（プラスミドpUCMOR
1）の調製 プラスミドpUCMOR1には、モリシン遺伝子を含むＤＮＡ
が挿入されている。このプラスミドは以下のようにして
得た。プラスミドpUC119(宝酒造社製)４μｇ、１０×Ｈ
バッファー[500mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、10
mM DTT、1000mM NaCl 宝酒造社製]４μｌ、制限酵素Eco
RI(GIBCO BRL社製)２０Ｕ、SalI(宝酒造社製）２０Ｕを
混合したものに水を加えて総量４０μｌとした後、３７
℃で２０時間消化した。次いで６５℃で１５分間加熱し
て反応を停止した。 上記の反応液２μｌ（プラスミド
２００ｎｇに相当）、上記１.（５）で調製したモリシ
ン遺伝子ＤＮＡ１０μｌ、１０×ライゲーションバッフ
ァー２μｌ、２μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ２μｌ、Ｔ４ ＤＮ
Ａ リガーゼ１２００Ｕを混合したものに水を加えて総
量２０μｌとした後、１６度で６時間ライゲーション反
応させた。
【００７６】上記のライゲーション反応液２０μｌを、
コンピテントセル（Escherichia coli JM109 日本ジー
ン社製)１００μｌと混合した後、氷上で３０分、３７
℃で２分間、氷上で５分間保持して形質転換を行なっ
た。次いで、High competent broth(日本ジーン社製)
４００μｌを添加して ３７℃で１時間振盪培養した
後、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭ ＩＰＴ
Ｇ、４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含む２×ＹＴ（1.6%
Trypton、1% Yeast extract、0.5% NaCl）寒天培地４枚
に等分して撒き、３７℃で２０時間培養して 約３００
個のアンピシリン耐性株を得た。
【００７７】これらのアンピシリン耐性株のうち、うす
青いコロニー２０株を選び、５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含むＬＢ（Gibco BRL社製）液体培地３ｍｌ中、３
７℃で１０時間培養した。培養液を遠心して集菌した
後、QIYAGEN Plasmid Mini Kit(フナコシ社製) を用い
てプラスミドＤＮＡを精製し、これを２０μｌのＴＥ溶
液に溶解した。上記のプラスミド溶液２μｌ、１０×Ｈ
バッファー１μｌ、制限酵素EcoRI ３Ｕ、制限酵素SalI
３Ｕを混合したものに、水を加えて総量１０μｌとし
た後、３７℃で９０分間反応させた。
【００７８】この反応液に、ＢＰＢ溶液１μｌを添加し
て４％アガロース電気泳動を行ない、制限酵素により切
り出されたインサートＤＮＡの鎖長を確認した。１２０
〜１４０ｂｐ程度の様々な大きさの断片が認められた。
【００７９】１４０ｂｐ程度のインサートＤＮＡをもつ
プラスミド１４個について、そのインサートＤＮＡの塩
基配列を決定した。塩基配列は、Taq Dye Primer Cycle
Sequencing Kit（アプライド バイオシステムズ社
製）、 GeneAmp PCR System 9600（Perkin Elmer Cetus
社製）、ＤＮＡシーケンサー（model 373A アプライド
バイオシステムズ社製）を用いて決定した。モリシン遺
伝子を含むＤＮＡが挿入されているプラスミドは４個で
あり、その１つを、pUCMOR1と命名した。
【００８０】３．モリシン発現用組み換え体ＤＮＡ（プ
ラスミドpXAMOR1）の調製 プラスミドpXAMOR1は、プラスミドpUCMOR1に挿入された
モリシン遺伝子を含むＤＮＡを、プラスミドpXa1のEcoR
I、SalI部位にサブクローニングすることにより得た。
このプラスミドはｌａｃプロモーター／オペレーターに
より制御され、β−ガラクトシダーゼ、コラーゲン断片
及びモリシンからなる融合タンパク質を発現する。この
プラスミドは以下のようにして得た。
【００８１】プラスミドpXa1 (ベーリンガー社製)５μ
ｇ、１０×Ｈバッファー１０μｌ、制限酵素EcoRI ２０
Ｕ、SalI ２０Ｕを混合したものに水を加えて総量１０
０μlとした後、37℃で２０時間消化した。次いで６５
℃で１５分間加熱して反応を停止し、切断されたプラス
ミドpXa1を得た。
【００８２】一方、プラスミドpUCMOR1をEcoRIとSalIで
消化して、インサートＤＮＡを切り出した後、アガロー
スゲル電気泳動を用いてインサートＤＮＡを精製した。
条件は以下の通りである。プラスミドpUCMOR1 １０μ
ｇ、１０×Ｈバッファー５μl、制限酵素EcoRI ２０
Ｕ、SalI ２０Ｕを混合したものに水を加えて総量５０
μlとした後、３７℃で２０時間反応させた。この反応
液 ５０μlに 上記の反応液にＢＰＢ溶液３μlを添加し
て、３％アガロースゲル電気泳動を行ない、約１４０ｂ
ｐの鎖長のバンドを切り出した。次いでゲル中のＤＮＡ
を、凍結融解処理及びエタノール沈殿処理により回収し
た。得られたインサートＤＮＡ６０ｎｇを１８μｌの水
に溶解した。
【００８３】次いで、精製したインサートＤＮＡ２０ｎ
ｇ、切断されたプラスミドpXa1 １μｌ（５０ｎｇ）、
１０×ライゲーションバッファー １μｌ、２μｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ １μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ ６００Ｕを混
合したものに水を加えて総量１０μｌとした後、１６℃
で５時間ライゲーション反応させた。上記ライゲーショ
ン反応液とコンピテントセル（Escherichia coli JM109
日本ジーン社製）１００μｌを混合し、氷上で３０
分、３７℃で２分間、氷上で５分間保持して形質転換を
行なった。この反応液を、５０μｇ／ｍｌ アンピシリ
ンを含む２×ＹＴ寒天培地２枚に撒き、３７℃で２０時
間培養して約１０００個のアンピシリン耐性株を得た。
【００８４】上記のアンピシリン耐性株のうち１４株を
選び、５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ液体培
地３ｍｌ中、３７℃で１０時間培養した。培養液を遠心
して集菌した後、QIYAGEN Plasmid Mini Kitを用いてプ
ラスミドを精製し、これを２０μｌのＴＥ溶液に溶解し
た。
【００８５】上記のプラスミド溶液２μｌ、１０×Ｈバ
ッファー １μｌ、制限酵素EcoRI３Ｕ、制限酵素SalI
３Ｕを混合したものに、水を加えて総量１０μｌとした
後、３７℃で９０分 間反応させた。この反応液に、Ｂ
ＰＢ溶液 １μｌを添加して４％ アガロース電気泳動を
行ない、制限酵素により切り出されたインサートＤＮＡ
の鎖長を確認したところ、いずれのプラスミドも１４０
ｂｐ程度の鎖長のインサートＤＮＡを含有することが確
認された。これらのプラスミドの１つを、pXAMOR1と命
名した。また、pXAMOR1を含有する組み換え大腸菌は、
(E.coli)JM109(pXAMOR1)と命名され、工業技術院生命工
学工業技術研究所にFERM BP-5099として寄託されてい
る。
【００８６】４．組み換え微生物によるモリシン融合タ
ンパク質の生産 （１）融合タンパク質の生産の確認 プラスミドpXAMOR1を含有する組み換え大腸菌(E.coli)J
M109(pXAMOR1)の１コロニー分を、LB液体培地２ｍｌに
植菌し、３７℃で２時間培養した。次いで１００ｍＭ
ＩＰＴＧ １０μｌを添加して融合タンパク質の発現を
誘導し、更に３７℃で２時間培養した。培養液０．５ｍ
ｌを遠心して集菌した後、菌体をサンプルバッファー
［62.5mM Tris-HCl(pH6.8)、10% glycerol、2% SDS、5%
2-メルカプトエタノール、0.0025% BPB]１００μｌに
懸濁し、１００℃で５分間加熱した。このうち３μｌを
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。一方、対照として、ＩＰＴ
Ｇを添加せずに培養した組み換え大腸菌の培養液をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥに供した。β−ガラクトシダーゼ、コラー
ゲン断片及びモリシンからなる融合タンパク質の予想さ
れる分子量は１２７．５ｋＤである。ＩＰＴＧを添加し
て培養した場合のみ分子量１２７．５ｋＤ付近にバンド
が見られ、融合タンパク質が発現されていることが確認
された。
【００８７】（２）融合タンパク質の粗精製 組み換え大腸菌を、アンピシリンを含む２×ＹＴ液体培
地４０ｍｌ中、３７℃で１４時間前培養した。次いで、
５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＹＴ液体培地３
００ｍｌを入れたフラスコ３本に、上記の前培養液を１
０ｍｌずつ加え、３７℃で２時間培養した。各フラスコ
に１００ｍＭ ＩＰＴＧ １．５ｍｌを添加して更に２時
間培養した後、培養液を遠心して集菌し、菌体３．７ｇ
を得た。
【００８８】この菌体を懸濁用溶液[20mM Tris-HCL(pH
7.4)、200mM NaCl、1mM EDTA(pH8.0)、10mM2-メルカプ
トエタノール]３５ｍｌに懸濁した。この懸濁液を凍結
融解処理、超音波処理（Sonifier Cell Disruptor W200
P BRANSON社製）して、菌体を破砕した。次いで破砕物
を遠心して得た沈殿を洗浄用溶液[0.5% Triton X-100、
10mM EDTA(pH8.0）]３５ｍｌに懸濁した。これを再度遠
心して上清を除き、タンパク質９ｍｇを得た。これを融
合タンパク質の粗精製物として、下記の臭化シアン処理
に供した。
【００８９】（３）臭化シアン処理 上記の方法で得られた融合タンパク質の粗精製物１ｍｇ
に、７０％ ギ酸 ２００μｌ、１００ｍｇ／ｍｌ臭化シ
アン（アセトニトリルに溶解したもの）１０μｌを添加
し、室温で２４時間反応させた後、減圧乾燥した。これ
をモリシン粗精製物として、下記の抗菌活性測定に供し
た。
【００９０】〔試験例３〕抗菌活性測定（３） モリシン粗精製物の、各種細菌に対する抗菌活性を、[N
ature, 292号, 246 頁(1981)]記載の方法に準じて調べ
た。得られた結果を表３に示す。
【００９１】（検定菌） 細菌 Staphylococcus aureus ATCC6538P Streptococcus pyogenes ATCC21547 Escherichia coli JM109（宝酒造社製） Pseudomonas fluorescens IAM1179
【００９２】（試験用培地）０．８％アガロースを含む
ＮＢ平板培地（Staphylococcus aureusを使用した場合
は食塩を１５０ｍＭ になるように添加）を使用した。
また、Streptococcuspyogenes を使用した場合は０．８
％アガロースを含むＢＨＩ平板培地を使用した。
【００９３】（抗菌活性試験法） モリシン粗精製物に蒸留水を加えて約１０μｇタンパク
質／μｌの懸濁液を調製し、検定菌を接種した平板培地
に設けたウエルに２μｌずつ供した。３０℃で一晩培養
後、形成された阻止円の直径を測定した。なお対照とし
て、pXa1を含有する組み換え大腸菌が生産した融合蛋
白（β−ガラクトシダーゼ及びコラーゲン断片）を臭化
シアン処理しないものpXa1を含有する組み換え大腸菌
が生産した融合蛋白を臭化シアン処理したものpXAMOR
1を含有する組み換え大腸菌が生産した融合蛋白（β−
ガラクトシダーゼ、コラーゲン断片及びモリシン）を臭
化シアン処理しないものを調製した。臭化シアン処理し
ない場合は、臭化シアン溶液１０μｌの代わりにアセト
ニトリル１０μｌを加えて同様の処理を行なった。
【００９４】
【表３】 ─────────────────────────────── 阻止円の直径（ｍｍ） ─────────────────── 対照 対照 対照 モリシン 粗精製物 ─────────────────────────────── Staphylococcus aureus 2 2 2 7.0 ATCC6538P ─────────────────────────────── Streptococcus pyogenes 2 2 2 5.3 ATCC21547 ─────────────────────────────── Escherichia coli JM109 2 2 2 5.9 ─────────────────────────────── Pseudomonas fluorescens 2 2 2 3.9 IAM1179 ───────────────────────────────
【００９５】表３の結果より、遺伝子工学的手法を用い
て組み換え大腸菌により生産されたモリシンは、蚕体液
から単離された天然型のモリシンと同様、グラム陽性及
びグラム陰性細菌に対して抗菌作用を示すことが判明し
た。また、モリシンは、融合タンパク質の状態では抗菌
活性を示さず、臭化シアン処理により融合タンパク質よ
り切り離された場合にのみ抗菌活性を示した。
【００９６】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Lys Ile Pro Ile Lys Ala Ile Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile Ala Ser Thr Ala Asn Asp Val Phe 20 25 30 Asn Phe Leu Lys Pro Lys Lys Arg Lys His 35 40
【００９７】配列番号：２ 配列の長さ：３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Lys Ile Pro Ile Lys Ala Ile Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile Ala Ser Thr Ala Asn Asp Val Phe 20 25 30 Asn
【００９８】配列番号：３ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Lys Ile Pro Ile Lys Ala Ile Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile Ala Ser Thr Ala Asn 20 25
【００９９】配列番号：４ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Val Phe Asn Phe Leu Lys Pro Lys Lys Arg Lys His 1 5 10
【０１００】配列番号：５ 配列の長さ：１２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCT AAA ATC CCG ATT AAG GCA ATT AAA ACT GTG GGC AAA GCT GTT GGT 48 Ala Lys Ile Pro Ile Lys Ala Ile Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly 5 10 15 AAA GGT CTG CGT GCT ATC AAC ATC GCT TCT ACC GCT AAC GAC GTA TTC 96 Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile Ala Ser Thr Ala Asn Asp Val Phe 20 25 30 AAC TTC CTG AAA CCG AAG AAA CGT AAA CAC 126 Asn Phe Leu Lys Pro Lys Lys Arg Lys His 35 40
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭57−188525（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−75498（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−176599（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， 1995, Ｖｏｌ．270， Ｎｏ．50， ｐ. 29923−29927 昆虫の抗菌タンパク質とその利用，植 物防疫，日本，1994年、第48巻、第８ 号，第329−332頁 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/00 - 19/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＨＳＴＰＬＵＳファイル（ＪＯＩＳ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列、また
    は該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が
    付加、欠失もしくは置換されており且つ抗菌活性をもた
    らすアミノ酸配列で表される新規ペプチド。
  2. 【請求項２】 請求項１記載のペプチドを有効成分とし
    て含有することを特徴とする抗菌剤。
  3. 【請求項３】 配列番号１で表されるアミノ酸配列、ま
    たは該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
    が付加、欠失もしくは置換されており且つ抗菌活性をも
    たらすアミノ酸配列をコードする新規ペプチド遺伝子。
  4. 【請求項４】 請求項３記載のペプチド遺伝子をベクタ
    ーＤＮＡに挿入してなることを特徴とする新規な組み換
    え体ＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 エシェリシア属に属し、請求項４記載の
    組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、培
    養物からペプチドを採取することを特徴とする新規ペプ
    チドの製造法。
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