JP2003088386A - リンドウ由来の新規抗菌性タンパク質及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規抗菌性タンパク質、その遺伝子及びこれ
らの利用方法の提供。 【解決手段】 リンドウ由来の新規抗菌性タンパク質
（リンドウLTP1及びLTP2）とその遺伝子の単離。遺伝子
組換え技術による該タンパク質の生産、並びに該遺伝子
を導入することにより病害抵抗性を向上させた形質転換
植物の提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リンドウ由来の新
規抗菌性タンパク質とその遺伝子及びこれらの利用方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子工学技術を用いて植物に有
用遺伝子を導入し、有用物質の生産性の向上や特定病害
に強い病害耐性植物等を作出する試みが進められてい
る。たとえば、灰色かび病菌（Botrytis cinerea）、ジ
ャガイモ疫病菌（Phytophthora infestans）、うどんこ
病菌（Erysiphe cichoracearum）等の植物病原糸状菌、
タバコ立枯れ病菌（Ralstonia solanacearum）、イネ白
葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）等の植物病原細菌に対
する防御機構の強化を目的として、抗菌性タンパク質遺
伝子を植物細胞へ導入し、病気に対する抵抗性が高まっ
たという事例も報告されている（西澤ら : 化学と生物
37 : 295-305(1999)など）。

【０００３】植物は進化の過程で他の生物からの攻撃に
対する防御の仕組みを獲得してきた。植物は糸状菌、細
菌、ウイルスをはじめとする微生物の攻撃を受けると、
速やかに種々の防御応答を発現する。防御応答のうち代
表的なものとしてPR-タンパク質群（Huub & Linthorst
: Crit. Rev. Plant Sci. (1999)）の発現が挙げられ
る。 PR-タンパク質はその性質からPR 1〜14までが知ら
れている。代表的なものとして、β-1,3グルカナーゼ、
キチナーゼ、タウマチン様タンパク質、脂質輸送タンパ
ク質（Lipid transfer protein: LTP）等が挙げられ
る。これらPR-タンパク質の防御機構に着目し、該遺伝
子を植物に導入することによって、耐病性を獲得したと
いう報告もある（西澤ら：化学と生物 37 : 295-305 (1
999)）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、耐病性
をはじめとする植物のストレス耐性メカニズムについて
は未だ十分な解明はなされておらず、種間によるその違
いも大きいため、遺伝子組換え技術によって必ずしも期
待どおりの効果が得られるとは限らない。そこで、広い
種類の植物に対し、有用に機能しうる遺伝子の探索と特
定が望まれている。

【０００５】

【発明を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、リンドウ（Ge
ntiana triflora）由来の極めて強い抗菌活性を有する
新規タンパク質とその遺伝子の単離に成功し、これがLT
Pの1種であることを同定した。また発明者らは、該タン
パク質を微生物により生産させることに成功した。さら
に、該遺伝子をリンドウ、バラ、イネ、トルコギキョウ
などの植物に導入・形質転換することにより、植物の病
害耐性を強化しうることを見出し、本発明を完成するに
至った。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の（１）〜
（９）を提供するものである。 （１） 以下の（a）又は（b）の抗菌性タンパク質。 （a）配列番号2又は4で表されるアミノ酸配列からなる
タンパク質。 （b）配列番号2又は4で表されるアミノ酸配列において1
又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するタンパク
質。 （２） 以下の（a）又は（b）の抗菌性タンパク質をコ
ードする遺伝子。 （a）配列番号2又は4で表されるアミノ酸配列からなる
タンパク質。 （b）配列番号2又は4で表されるアミノ酸配列において1
又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するタンパク
質。 （３） 以下の（c）又は（d）のDNAからなる遺伝子。 （c）配列番号1又は3で表される塩基配列からなるDNA。 （d）配列番号1又は3で表される塩基配列からなるDNAと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ抗
菌活性を有するタンパク質をコードするDNA。 （４） 前記（２）又は（３）記載の遺伝子を含有する
組換えベクター。 （５） 前記（２）又は（３）記載の遺伝子を導入して
得られる形質転換体。 （６） 前記形質転換体が植物である、前記（５）記載
の形質転換体。 （７） 前記（５）又は（６）記載の形質転換体を培養
し、得られる培養物から抗菌性タンパク質を採取する、
抗菌性タンパク質の製造方法。 （８） 前記（２）又は（３）記載の遺伝子を導入する
ことにより、病害抵抗性を付与された形質転換植物。 （９） 前記（１）記載の抗菌性タンパク質を有効成分
として含む抗菌剤。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。

【０００８】本発明者らは、液体クロマトグラフィーを
駆使し、リンドウ葉から抗菌活性を示す各種の抗菌性ペ
プチドの単離を試みた。その結果、分子量約８kDaおよ
び約７kDaの抗菌性を有する特異なタンパク質を単離
し、精製することに成功した。本タンパク質の抗菌活性
を Terras らの方法（Terras et al. : J. Biol. Chem.
267 : 15301-15309）で検討した結果、灰色かび病菌（B
otrytis cinerea）、リンゴ斑点落葉病菌（Alternaria a
lternata）、トルコギキョウ根腐れ病菌（Fusarium sol
ani）の生育を著しく阻害することを見いだした。

【０００９】さらに、本抗菌性タンパク質の N 末端ア
ミノ酸配列に基づき、degenerateしたプライマーを設計
し、RT-PCR法によりリンドウで発現している本抗菌性タ
ンパク質遺伝子（タンパク質の全コード領域を含む）の
単離を試みた。その結果、2種の抗菌性タンパク質遺伝
子のクローニングに成功し、これがリンドウのLTP遺伝
子（リンドウLTP遺伝子１及びリンドウLTP遺伝子2）で
あることを同定した。

【００１０】すなわち、本発明の抗菌性タンパク質はリ
ンドウ由来のLTPである。LTPは脂質輸送タンパク質の1
種で、ある種の特定な糸状菌に対して抗糸状菌活性を持
ち、植物の防御応答に関連するタンパク質の１つである
と考えられており、PRタンパク質群の中ではPR-14の範
疇に類別されている。しかしながら、LTPについては、
それ以上の具体的な作用については知られておらず、組
換え植物等に利用されたとの報告もない。またリンドウ
科の植物から単離されたとの報告もない。

【００１１】本発明の抗菌性タンパク質の単離・精製・
抗菌活性評価は、たとえば以下のようにして行うことが
できる。 １．タンパク質の単離・精製 タンパク質の供給源としては、リンドウの葉、茎、葉
柄、花、根などが挙げられる。タンパク質の精製は、上
記植物組織を各種蛋白質分解酵素の阻害剤、たとえばPM
SF（phenylmethanesulfonyl fluoride）等を含むリン酸
緩衝液中で摩砕後、イオン交換カラム（SP-セファロー
ス：ファルマシア製）、逆相系カラム（フェニル5PWR
P：TOSO社製）、ゲルろ過化カラム（Superose12 カラ
ム：ファルマシア製）等、一般にタンパク質の精製に用
いられるカラムを用いて分画することにより行う。

【００１２】2．タンパク質の抗菌活性 ジャガイモデキストロース培地（PDA）で生育させた各
種微生物を用い、生育の阻害を指標として、単離したリ
ンドウLTPの抗菌活性の検定を行う（Terras etal. : J.
Biol. Chem. 267 : 15301-15309）。抗菌活性は、たと
えば吸光度測定、顕微鏡下での胞子発芽阻害率、伸長阻
害率の観察等により測定することが可能である。また、
PDAなどの培地上で本タンパク質溶液を含む抗生物質検
定用ペーパーディスク(ADVANTEC)を置床することによ
り、観察してもよい。

【００１３】また、本発明の抗菌性タンパク質遺伝子の
クローニングは、たとえば以下のようにして行うことが
できる。 3．リンドウLTP遺伝子のクローニング 1）cDNA の合成及び PCR mRNA の供給源としては、たとえばリンドウの葉、茎、
葉柄、花、根などが挙げられる。mRNA の調製は通常行
われる方法により行うことができ、たとえば、上記植物
組織を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して
全 RNA を得た後、特に発現量の低い遺伝子を除き、全
RNA を鋳型に PCR 反応を行う。必要に応じてオリゴ-dT
セルロースやセファロース2Bを担体とするポリＵセフ
ァロース等を用いたアフィニティーカラム法、あるいは
バッチ法によって、ポリ（A）⁺RNA（mRNA）を得ても良
い。さらに、必要であれば、ショ糖密度勾配遠心法等に
よりポリ（A）⁺RNAをさらに精細に分画しても良い。

【００１４】このようにして得られた全 RNA を鋳型に
オリゴ dT に M13プライマーM4（配列番号5） を付加し
たプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNA を合
成する。この一本鎖 cDNAを鋳型にリンドウLTPのアミノ
酸配列（配列番号2又は4）をもとに合成したプライマー
（配列番号6、7、8、9）とM13プライマーM4を用いてPCR
反応によって本発明の遺伝子を得ることができるが、
プライマーはこれらに限定されるものではない。

【００１５】2）塩基配列の決定 得られたPCR断片をpCR2.1（Invitrogen 社製）、pBlueS
criptSK(+)（Stratagene社製）等の適切なベクターにサ
ブクローニングした後、塩基配列の決定を行う。塩基配
列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13
ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等、
公知の手法により行うことができるが、自動塩基配列解
析装置（PERKIN-ELMER社製 ：ABI PRISM 377 DNA Seque
nce System 等）を用いる方法が簡便で好ましい。

【００１６】配列番号1及び3は、それぞれこうして特定
された、本発明のリンドウペルオキシレドキシン遺伝子
の塩基配列を示す。本発明にかかる抗菌性タンパク質を
コードする遺伝子は、上記配列に限定されず、これら
（配列番号1又は3）の遺伝子とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズすることができる他の遺伝子も含む
ものとする。

【００１７】ストリンジェントな条件とは、たとえば、
ナトリウム濃度が300-2000mM、好ましくは600-900mMで
あり、温度が40-75℃、好ましくは65℃の条件下を言
う。なお遺伝子の変異を導入する場合には、Kunkel法や
Grapped duplex 法等の公知の手法又はこれに準ずる方
法により、たとえば部位特異的突然変異誘発法を利用し
た変異導入キット（たとえば Mutant-K (Takara 社製）
や Mutant-G (Takara 社製））、あるいは LA PCR in v
itro Mutagenesis シリーズキット（Takara 社製）を用
いることができる。

【００１８】また配列番号2及び4は、それぞれ本発明の
リンドウLTPのアミノ酸配列を示す。本発明の抗菌性タ
ンパク質のアミノ酸配列はこれに限定されず、その産物
であるタンパク質が抗菌活性を有する限り、前記アミノ
酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付
加等の変異が生じたものであっても良い。かかる欠失、
置換、付加等の変異の数は、全アミノ酸数に対して好ま
しくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。

【００１９】一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定され
ると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNA
もしくはゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは
核塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリ
ダイズさせることによって、さらに本発明の遺伝子を得
ることができる。

【００２０】次に、本発明にかかる形質転換体の作出方
法、及び該形質転換体の植物病原菌に対する抵抗性につ
いて説明する。なお、以下の形質転換植物、及び植物病
原菌は例示であって、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

【００２１】4．リンドウLTP及び/又はLTP2遺伝子を導
入した形質転換植物の作製 公知の遺伝子工学的手法を用いることにより、本発明の
抗菌性タンパク質をコードする DNA を植物宿主に導入
して、植物病原糸状菌及び植物病原細菌に対して抵抗性
を有するトランスジェニック植物を作製することができ
る。すなわち、遺伝子工学的手法による栽培植物への本
発明の抗菌性タンパク質遺伝子の導入は、植物を植物病
原性糸状菌および植物病原細菌から防護する有効な手段
となる。

【００２２】1）ベクターの構築、及びアグロバクテリ
ウムの形質転換 前記１で得られた DNA はそのまま、又は適当な制限酵
素で消化し、あるいは、適当なリンカーを連結して使用
することができる。DNA を導入するベクターとしては、
pUC18、pUC19、pUC118、pUC119 等の pUC 系ベクタ
ー、pBI101、pBI121、pGA482 等のバイナリーベクター
を挙げることができる。特に、アグロバクテリウムのバ
イナリーベクターを用いる場合は、該バイナリーベクタ
ーの境界配列（LB, RB）間に外来遺伝子を挿入し、この
組換えベクターを大腸菌内で増幅する。次いで、増幅し
た組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス LBA4404、EHA101、EHA105、C58C1Rif^R 等に、凍結
融解法、エレクトロポレーション法等により導入し、こ
れを植物の形質転換体作出用に用いる。

【００２３】植物体内で外来遺伝子などを発現させるた
めには、構造遺伝子の前後に、それぞれ植物用のプロモ
ーターとターミネーターを配置させる必要がある。前記
プロモーターとターミネーターは特に限定されず、植物
体中で機能することが知られている任意のものを用いる
ことができる。たとえばプロモーター配列としては、カ
リフラワーモザイクウイルス (CaMV) 由来の 35S 転写
物［The EMBO J. 6:3901-3907 (1987)、トウモロコシ
のユビキチン［Plant Mol. Biol. 18: 675-689 (1992)
］、ノパリン合成酵素（NOS）遺伝子、オクトピン（OC
T）合成遺伝子のプロモーターが挙げられる。またター
ミネーター配列としては、たとえばカリフラワーモザイ
クウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミ
ネーター等が挙げられる。

【００２４】また、必要に応じてプロモーター配列とリ
ンドウLTP遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機
能を持つイントロン配列、たとえばトウモロコシのアル
コールデヒドロゲナーゼ (Adh 1)のイントロン配列［Ge
nes & Development 1: 1183-1200 (1987)］を導入する
ことができる。

【００２５】さらに効率的に目的の形質転換細胞を選抜
するために、有効な選択マーカー遺伝子を上記のリンド
ウLTP遺伝子と併用することが好ましい。該選択マーカ
ーとしては、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性
を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ（htp）遺伝子及びビアラフォスに対する抵抗性
を植物に付与するホスフィノスリシンアセチルトランス
フェラーゼ（bar）遺伝子等を挙げることができる。

【００２６】リンドウLTP及び/又はLTP2遺伝子ならびに
選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込
んでも良いし、それぞれを別個のベクターに組み込んだ
2種類の組換えDNAを用いてもよい。リンドウLTP遺伝子
は前記のようにプレプロ構造をなしており、活性型のリ
ンドウLTPが生産されるためには、小胞体通過の際に、
プレ配列であるシグナルペプチドが切断される必要があ
る。そこでリンドウLTP1及び/又はLTP2遺伝子のシグナ
ルペプチドが他の植物細胞内でうまく機能しない場合に
は、これらの遺伝子がその植物中でうまく切断される様
な配列をリンドウLTP及び/又はLTP2遺伝子上流に配し、
ベクターDNAに組み込むことができる。

【００２７】2）宿主植物への本発明リンドウLTP遺伝子
の導入 本発明において宿主植物とは、植物培養細胞、栽培植物
の植物全体、植物器官（たとえば葉、花弁、茎、根、根
茎、種子等）、又は植物組織（たとえば表皮、師部、柔
組織、木部、維管束等）のいずれをも意味するものであ
る。植物培養細胞、植物体、植物器官、又は植物組織を
宿主とする場合、採取した植物切片に本発明のタンパク
質をコードする DNA を、アグロバクテリウムのバイナ
リーベクター法、パーティクルガン法、又はポリエチレ
ングリコール法等を用いて導入することにより、宿主植
物を形質転換することができる。あるいはプロトプラス
トにエレクトロポレーション法で導入して形質転換植物
を作製してもよい。

【００２８】パーティクルガン法等による直接遺伝子導
入法では、選択マーカー遺伝子を含むベクターとリンド
ウLTP及び/又はLTP2遺伝子を含有するベクターとを混合
して同時に植物の細胞に撃ち込む、いわゆる co-transf
ormation 法により行うこともできる。形質転換の結果
得られるシュート、毛状根などは細胞培養、組織培養又
は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られ
ている植物組織培養法を用いて、適当な濃度の植物ホル
モンの投与などによって、さらに植物体に再生させるこ
とができる。

【００２９】リンドウLTP遺伝子が導入された植物細胞
は、選択マーカーによるスクリーニング、又はリンドウ
LTP遺伝子もしくはその発現産物の発現解析により、リ
ンドウLTP1及び/又はLTP2遺伝子を保有する形質転換細
胞を選抜することが可能である。得られた植物体は、土
壌又はバーミキュライトを詰めたポットで栽培し、株分
けすることによって増殖させることが可能である。この
ように増殖させたリンドウ LTP及び/又はLTP2遺伝子導
入植物も本発明のトランスジェニック植物の範囲に含ま
れる。本発明によりリンドウLTP及び/又はLTP2遺伝子を
導入された植物は、病原性糸状菌や病原性細菌が原因と
なる各種植物病害を含むストレスに耐性を有することが
期待される。

【００３０】3）本発明の遺伝子の植物組織での発現部
位の解析 得られた形質転換植物及びその次世代植物に、目的とす
るリンドウLTP及び/又はLTP2遺伝子が組み込まれている
ことの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従って
DNAを抽出し、公知の方法、たとえばPCR法又はサザン分
析法等により導入遺伝子を検出することによって行うこ
とができる。また、本発明の抗菌性タンパク質遺伝子の
組織内での発現部位は、たとえば各組織におけるmRNAの
発現又はタンパク質の発現を公知の方法により解析する
ことによって確認することができる。たとえば、RT-PCR
法、ノーザン解析法等により本発明の抗菌性タンパク
質遺伝子の発現を確認することができる。また本発明の
抗菌性タンパク質の発現の確認方法としては、該タンパ
ク質に対する抗体を用いたウエスタン解析法等が挙げら
れる。

【００３１】次に、上記遺伝子を用いた新規抗菌性タン
パク質の遺伝子工学的生産方法について説明する。 5．本発明の抗菌性タンパク質の遺伝子工学的手法によ
る生産 本発明の抗菌性タンパク質は、たとえば以下のようにし
て遺伝子工学的に生産ことができる。 1）組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、公知のベクターに本発明の
遺伝子を連結（挿入）することによって得ることができ
る。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特
に限定されず、たとえばプラスミドDNA、ファージDNA等
が挙げられる。

【００３２】前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来
のプラスミド（たとえば pBR322, pBR325, pUC18, pUC1
19, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラス
ミド（たとえば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラス
ミド（たとえば YEp13, YEp24,YCp50, pYE52 等）など
が、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。
さらにレトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動
物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクタ
ー、ジャガイモエックスウイルス等の植物ウイルスベク
ターなどを用いてもよい。

【００３３】前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
ベクターDNAの適当な制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用さ
れる。本発明の遺伝子はその遺伝子の機能を好適に発揮
できるよう、ベクターに組み込む必要がある。そのた
め、ベクターには本発明の遺伝子の他にプロモーター、
必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプラ
イシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカ
ー、リボソーム結合配列（SD配列）等を含有させること
ができる。なお選択マーカーとしては、たとえばジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオ
マイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。

【００３４】2）形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを目的
遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによっ
て得ることができる。ここで宿主としては、本発明のDN
Aを発現できるのもであれば特に限定されず、たとえ
ば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエ
ッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus sub
tilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pse
udomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム
・メリロテイ（Rhizobium melilotei）等のリゾビウム
属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Sa
ccharomyces cervisiae）、サッカロミセス・ポンベ
（S. pombe）等の酵母、サル細胞（COS細胞）、チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）等の動物細胞、
あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができ
る。

【００３５】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であると
ともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本発明遺伝
子、転写終結配列により構成されていることが望まし
い。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい
ても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. c
oli）K12、DH1、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としては
バチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21
等が挙げられる。

【００３６】前記プロモーターとしては、大腸菌等の宿
主で発現できるものであれば特に限定されず、たとえば
trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、
PRプロモーター等の大腸菌由来のプロモータを用いるこ
とができる。tacプロモーター等の人為的に設計された
プロモーターを用いてもよい。

【００３７】細菌への組換えベクターの導入方法は、細
菌にDNAを導入できる方法であれば特に限定されず、た
とえばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, SN et a
l. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (197
2)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

【００３８】酵母を宿主とする場合は、たとえばサッカ
ロミセス・セルビシエ（S. cervisiae）、サッカロミセ
ス・ポンベ（S. pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia
pastoris）等が用いられる。この場合、プロモーター
としては酵母で発現できるものであれば特に限定され
ず、たとえばgal1プロモーター、gal10プロモーター、
ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモ
ーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロ
モーター、ADHプロモーター、AOXプロモーター等を挙げ
ることができる。

【００３９】酵母への組換えベクターの導入方法は、酵
母にDNAを導入しうる方法であれば特に限定されず、た
とえばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et a
l. :Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、スフェ
ロプラスト法（Hinnen, A. etal. : Proc Natl. Acad.
Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（Ito
h, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を挙げ
ることができる。

【００４０】動物細胞を宿主とする場合にはサル細胞
（COS-7）、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞、
マウスL細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが用いら
れる。プロモーターとしては、SRαプロモーター、SV40
プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が
用いられる。また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺
伝子プロモーター等を用いても良い。動物細胞への組換
えベクターの導入方法は、たとえばエレクトロポレーシ
ョン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が
挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合には、Sf9細
胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベ
クターの導入方法は、たとえばエレクトロポレーション
法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が用い
られる。

【００４１】3）本発明の抗菌性タンパク質の生産 本発明の抗菌性タンパク質は、前記形質転換体を培養
し、その培養物から該タンパク質を採取することによっ
て得ることができる。本発明の形質転換体を培養する方
法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行わ
れる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形
質転換体を培養する培地としては、微生物が資化しうる
炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効
率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地の
いずれを用いても良い。

【００４２】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、デンプン、マルトース、デキストリン
等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ
ール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒
素源としてはアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の
無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含
窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティ
ープリカー、カザミノ酸、NZアミン等が用いられる。

【００４３】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
銅、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化コバルト等が用い
られる。培養は通常、振とう培養又は通気攪拌培養など
の好気的条件下で、約30℃で24〜96時間行う。培養期間
中、pH は5.0〜8.0に保持する。pH の調製は無機又は有
機の酸、アルカリ溶液による。

【００４４】培養中は必要に応じてアンピシリンやテト
ラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プ
ロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてイ
ンデューサーを培地に添加しても良い。たとえば、Lac
プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生
物を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現
ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イン
ドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。

【００４５】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般的に使用されているRPMl
1640培地、DMEN培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を
添加した培地が挙げられる。培養は通常、5％CO₂存在
下、20〜30℃で1〜7日間行う。培養中は必要に応じてア
ンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添
加しても良い。

【００４６】昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、Grace'sInsect Medium（Grac
e, T.C.C. : Nature, 195:788 (1962)）に牛胎児血清等
を添加した培地が挙げられる。培養は通常25℃で1〜7日
間行う。培養期間中、pHは6.0〜7.0に保持し、必要に応
じて通気や攪拌を加える。

【００４７】培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は
細胞内に生産される場合は、菌体内又は細胞を破砕す
る。一方、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に分
泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離
等によって菌体又は細胞を除去後上清を得る。タンパク
質の単離・精製には、一般的に、たとえば硫酸アンモニ
ウム沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等を単独であるいは適宜組み合わせて用いることによ
り、上記の培養物（細胞破砕液、培養液、又はそれらの
上清）から本発明の抗菌性タンパク質又はその塩を単離
・精製することができる。

【００４８】6．本発明の抗菌性タンパク質の化学合成 本発明のタンパク質の化学合成は通常のペプチド合成手
段によって行うことができる。たとえば、アジド法、酸
クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC 法、
活性エステル法、カルボイミダゾール法等が挙げられ
る。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法の何
れを適用してもよい。すなわち、本発明のタンパク質を
構成しうるアミノ酸と残余部分を縮合させて、生成物が
保護基を有する場合は保護基を脱離することによって目
的のタンパク質が合成される。縮合法や脱離方法は公知
の何れの方法を用いても良い。

【００４９】反応後は、通常の精製法、たとえば、溶媒
抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマト
グラフィー、再結晶を組み合わせて本発明のタンパク質
を精製できる。本発明のタンパク質はC末端が通常カル
ボキシル基（-COOH）、又はカルボキシレート（-COO-）
であるが、C末端がアミド（-COONH₂）、エステル（-COO
R）であってもよい。ここでエステルにおける R は炭素
数7〜12のアラルキル基、炭素数3〜10のシクロアラルキ
ル基、炭素数6〜12のアリール基、炭素数1〜12のアルキ
ル基等が挙げられる。さらに本発明のタンパク質にはN
末端アミノ酸残基が保護されているもの、あるいは糖鎖
が結合した糖ペプチド等の複合ペプチドも含まれる。

【００５０】7．本発明の抗菌性タンパク質の抗菌剤と
しての利用 本発明の抗菌性タンパク質は、植物病原性糸状菌に対し
てその抗菌作用を有し、かつ抗菌スペクトラムが広いた
め、特に抗菌剤としての利用することができる。また、
本抗菌性タンパク質は他の農薬と組み合わせた形態、た
とえば、殺虫剤（イネ害虫用殺虫剤等）との組み合わせ
による殺虫殺菌剤、植物成長調整剤（イネわい化剤等）
との組み合わせによる殺菌植物成長調整剤として使用す
ることができる。すなわち、本抗菌性タンパク質は単独
で、あるいは適当な液体、固体又は気体の単体と組み合
わせて使用することができる。さらに必要に応じて、液
化ガス、噴射剤（フレオン等）、表面活性剤（乳化剤、
分散剤、消泡剤等）等を添加し、乳剤、油剤、水和剤、
粉剤、粒剤、液剤等の製剤として使用することもでき
る。

【００５１】製剤に使用する液体担体としては、たとえ
ば、キシレン、トルエン、ベンゼン、アルキルナフタレ
ン等の芳香族炭化水素、クロロベンゼン、クロロエチレ
ン、塩化メチレン等の塩素化芳香族炭化水素、シクロヘ
キサン、パラフィン等の脂肪族炭化水素、鉱油成分、エ
タノール、ブタノール、グリコール等のアルコール及び
これらのエーテル類、ならびにエステル類、アセトン、
メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極
性溶剤が挙げられ、これらの1種又は2種以上を混合して
使用することができる。水が溶剤として用いられる場
合、純水又は無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム
等）、糖（グルコース、ショ糖等）もしくは糖アルコー
ル（D- ソルビトール、D- マンニトール等）の水溶液を
用いることができる。

【００５２】また、製剤に使用する固体担体としては、
たとえば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、
アタパルジャイト、モンモリナイト、珪藻土等の天然鉱
物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉
末、高分子性天然物（結晶性セルロース、コーンスター
チ、ゼラチン、アルギン酸等）が挙げられ、これらの1
種又は2種以上を混合して使用することができる。

【００５３】乳化剤、分散剤、消泡剤等として使用され
る表面活性剤としては、ポリオキエチレン-脂肪酸エス
テル、ポリオキエチレン脂肪アルコールエステル、アル
キルアリールポリグリコールエステル、アルキルスルフ
ォネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネ
ート、アルブミン加水分解物、メチルセルロース、アラ
ビアゴム等が挙げられる。

【００５４】有効成分である本発明の抗菌性タンパク質
は、乳剤では0.01〜50重量％、水和剤では0.01〜50重量
％、粉剤では0.01〜10重量％が適当であるが、使用目的
によってはこれらの濃度は適宜変更しても良い。乳剤、
水和剤の場合には、使用に際して水で希釈し、製品重量
の10〜5000倍で使用することができ、好ましくは500〜1
000倍で使用するとよい。

【００５５】本発明の抗菌剤は、噴霧法、ミスト法、ダ
スト法、散布法、注入法等を用いて植物病原菌に侵され
た植物に直接投与してもよく、あるいは物病原菌に汚染
された土壌に直接投与してもよい。使用法は使用目的に
応じて適宜選択されるが、いずれの場合にも、本発明の
抗菌性タンパク質が可能な限り均一に分散されることが
望ましい。本発明の抗菌剤の使用量は、その使用方法に
よって異なるが、たとえば噴霧法の場合10a当たり、有
効成分量で1〜1000gで噴霧することが好ましい。

【００５６】本発明の抗菌性タンパク質含む抗菌剤を使
用すべき対象となる植物病原菌としては、たとえば、灰
色かび病菌、アルタナリア菌、いもち病菌、うどんこ病
菌、苗立枯れ病菌等が挙げられる。これらの病原菌は具
体的には、灰色かび病菌はキュウリ（Cucumis sativu
s）、トマト（Lycopersicon esculentum ）、ピーマン
（Capsicum annum）、レタス（Lactuca sativa）、イチ
ゴ（Fragaria ananassa）、ブドウ（Vitis vinifer
a）、スターチス（Limonium Mill）、トルコギキョウ
（Eustoma grandiflorum）、リンドウ（Gentiana trifl
ora）、タバコ（Nicotiana tabacum）、及びホップ（Hu
mulus luplus）等の栽培植物を侵す病原菌であり、アル
タナリア菌はリンゴ（Malus domestica）、ナシ（Pyrus
L.）、イチゴ及びタバコ等の栽培植物を侵す病原菌で
あり、いもち病菌はイネ（Oryza sativa）等の栽培植物
を侵す病原菌であり、うどんこ病菌はリンゴ、ブドウ及
びピーマン等の栽培植物を侵す病原菌であり、苗立枯れ
病菌はイネ、レタス等の栽培植物を侵す病原菌である。
従って、これらの病原菌による病害の防除又は予防する
ことを目的として、前記の植物に本発明の抗菌性タンパ
ク質を含む抗菌剤を使用することが好適となる。

【００５７】さらに、本発明の抗菌性タンパク質は医薬
組成物として使用することもできる。本発明のタンパク
質を有効成分として含む医薬組成物は、医薬的に許容さ
れる担体又は添加物を共に含むものであってもよい。こ
のような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容
される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ア
ルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシ
メチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガ
ム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセ
リン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ス
テアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソル
ビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界
面活性剤等が挙げられる。使用される添加物は、本発明
の剤型に応じて上記の中から適宜組み合わせて選択され
る。

【００５８】本発明の抗菌性タンパク質を抗菌剤又は医
薬組成物として使用する場合、その使用対象は特に限定
されず、たとえば真菌症の診断、治療又は予防を目的と
して用いることができる。これらの疾病は、単独又は併
発したものもしくは上記以外の他の疾病を併発したもの
であってもよい。本発明の抗菌性タンパク質を含む医薬
組成物は、経口的又は非経口的に投与することができ
る。

【００５９】本発明の抗菌性タンパク質を経口的に投与
する場合は、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、丸
剤などの固形製剤、あるいは液剤、シロップ剤などの液
体製剤などとすればよい。とくに顆粒剤及び散剤は、カ
プセル剤として単位量投与形態とすることができ、液体
製剤の場合は使用する際に再溶解させる乾燥生成物にし
てもよい。これら剤型のうち、経口用固形剤は、通常そ
れらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、賦形
剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤などの添加剤を含有する。ま
た、経口用液体製剤は、通常それらの組成物中に製剤上
一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳
香剤、着色剤などの添加剤を含有する。

【００６０】本発明の抗菌性タンパク質を非経口的に投
与する場合は、注射剤、坐剤などとすればよい。注射の
場合は、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器の状
態で提供され、使用する際に適当な担体、たとえば発熱
物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体であってもよ
い。これらの剤型は通常それらの組成物中に製剤上一般
に使用される乳化剤、懸濁剤などの添加剤を含有する。
注射手法としては、たとえば点滴静脈内注射、静脈内注
射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射が挙
げられる。また、その投与量は、投与対象の年齢、投与
経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることがで
きる。

【００６１】この場合、投与の剤型及びその投与量につ
いては被検体（ヒト及び動物を包含する）及び疾病の種
類、症状を勘案して、本発明による抗菌効果が認められ
る限り任意の選択が可能である。たとえば、投与量は約
0.001〜10mg/kg 体重であり、好ましくは約0.025〜0.5m
g/kg 体重である。

【００６２】8．食品及び飼料添加物としての利用 さらに、本発明の抗菌性タンパク質は、胃や腸に存在す
る蛋白質分解酵素によって容易に分解されるため、少な
くとも結果的には経口投与される場合にはその毒性はほ
とんどないことが予測される。したがって、本発明の抗
菌性タンパク質は食品又は飼料添加物として利用するこ
とも可能である。たとえば、本抗菌性タンパク質を固体
のまま、又は液体、好ましくは水に適当な濃度になるよ
うに溶解し、食品又は飼料に、たとえば、混合、浸積、
塗布、噴霧等の方法で添加しうる。その結果、本タンパ
ク質は食肉、魚、野菜等の生鮮食品、又は加工食品、あ
るいは豆粉、魚粉飼料等のかび等の発生を防ぐことがで
きる。たとえば、有効成分である本発明の抗菌性タンパ
ク質を水溶液として用いる場合、0.00005〜0.05重量
％、好ましくは、0.0001〜0.01重量％とすることができ
る。

【００６３】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではな
い。 ［実施例１］リンドウの新規抗菌性タンパク質（リンド
ウLTP）の精製 1）抗菌性タンパク質の精製 リンドウ系統（矢巾系）の葉、約100gを10 mM NaH₂P
O₄、15 mM Na₂HPO₄、100mM KCl、2 mM EDTA、1.5% PV
P、2 mM thiourea、1 mM PMSF を含む１リットルの溶液
中で摩砕後、ガーゼで繊維部（細胞壁画分）を得た。繊
維部（細胞壁画分）より2M LiCl₂によって細胞壁結合タ
ンパク質を抽出し、蛋白質画分を滅菌水に対して１晩透
析し（分子量 1000 以下排除）、50 mM MES (pH6.0) に
調製し、50 mM MES (pH6.0) で平衡化した SP-sepharos
e カラムに供した。非吸着画分を 50mM MES (pH6.0) に
て洗浄後、 0.5 M NaCl 吸着画分を溶出した。本画分
について滅菌水に対して１晩透析後（分子量 1000 以下
排除）、本画分に最終濃度 0.1% になるように TFA を
加え、0.1 % TFA を含む滅菌水で平衡化した逆相 HPLC
に供し、 0 - 50 % のアセトニトリルのグラディエン
トによって溶出した。

【００６４】2）抗菌活性の測定 ポテトデキストロース寒天培地（PDA培地）で生育させ
た糸状菌の胞子を後述の低イオン強度液体培地に懸濁
後、胞子数 1×10⁵に調製した。各蛋白質画分10μl に
対して胞子懸濁液を90μlを混合し、糸状菌の場合25
℃、細菌の場合30℃あるいは37℃で24〜48時間培養した
後、菌の生育を OD 595 nm の吸光度を測定することに
よって抗菌活性の検定を行った。 （1）供試菌 本発明の抗菌性タンパク質の抗菌活性は、糸状菌の代表
例として灰色かび病菌（B. cinerea (strain S1)）、リ
ンゴ斑点落葉病菌（A. alternata apple pathotype）、
トルコギキョウ立枯れ病菌（F. solani (Martius) Sacc
ardo）を用いて評価した。 （2）低イオン強度培地の作成 Terrasらの方法（ J. Biol. Chem. 267 : 15301-1530
9）に従い、次の組成及び濃度の培地を作成した。K₂HPO
₄ (2.5 mM), MgSO₄ (50 μM), CaCl₂ (50 μM),FeSO₄
(5 μM), CuSO₄ (0.1 μM), Na₂MoO₄ (2 μM), H₃BO₃
(0.5 μM), KI (0.1 μM), ZnSO₄ (0.5 μM), MnSO₄
(0.1 μM), Glucose (10 g/l), Asparagine(1 g/l), Me
thionine (20 mg/ml), Myo-inositol (2 mg/l), biotin
(0.2 mg/l), Thiamine-HCl (1 mg/l), Pyridoxine-HCl
(0.2 mg/l)

【００６５】3）抗菌性の評価 上記の精製方法によって強い抗菌性をもつ2画分を得
た。本画分をSDS-PAGE により解析したところ、いずれ
も8kDa、7kDaのタンパク質の複合体であった（図１）。
これらの画分の抗菌活性について灰色かび病菌、リンゴ
斑点落葉病菌、トルコギキョウ立枯れ病菌を用いて詳細
に解析したところ、いずれの画分もこれらの病原糸状菌
に対して抗菌性を有し（図２）、糸状菌の生育を50 %阻
害する濃度（IC₅₀）は上記の菌に対して5〜10μg/ml で
あった。

【００６６】［実施例２］リンドウの新規抗菌性タンパ
ク質のアミノ酸配列の決定 1）N末端アミノ酸配列の決定 精製抗菌性タンパク質（リンドウLTP）を常法によりSDS
-PAGE による分画後、PVDF膜にエレクトロブロッティン
グした。本ブロット体をタンパク質染色試薬であるポン
ソーS 0.1％を含む2％酢酸溶液にてタンパク質を検出
後、タンパク質のバンドをナイフで切り出した。N末端
アミノ酸配列に関しては、切り出したブロット体を直接
エドマン法によってアミノ酸配列を決定した（Takara
社；カスタムサービス）。

【００６７】［実施例３］遺伝子のクローニング 1）全RNAの調製 温室で栽培したリンドウの葉よりFast green RNA isola
tion Kit (Funakoshi社製)を用いて全RNAを抽出した。 2）一本鎖cDNA作製 上記1）によって得られた、全RNA（polyA mRNAを含む）
1μg を用いて RT-PCRキット（Takara社製）により一本
鎖cDNAの合成を行った。この反応に用いたプライマー
は、オリゴ(dT)20の5'側に既知の配列5' -AGTTTTCCCAGT
CACGAC-3'（配列5）を連結したものを用いた。PCRの反
応組成は以下の通りである。PCR反応組成： RNA 1μl（1μg） プライマー 1μl（50pmol） 10×PCR緩衝液 2μl 25 mM MgCl2 4μl RNAse inhibitor 0.5μl 10 mM dNTPミックス 2μl AMV 由来逆転写酵素 1μlDEPC処理水 8.5μl 全量 20μl 上記混合物を、42℃、50℃、55℃、60℃の各温度でそれ
ぞれ10分ずつインキュベートし、次いで99℃で5分間イ
ンキュベートして反応を停止した。

【００６８】3）プライマーの作製 新規抗菌性タンパク質1及び2（リンドウLTP1及びLTP2）
遺伝子の増幅に用いたプライマー（サワディーテクノロ
ジー社；カスタムサービス）は以下のとおりである。 リンドウLTP１ センスプライマー： 5' -ATA TTC ATA GTC ATC ATT CAC TTA CTC TTT-3'（配
列番号6） 5' -CCT ACT ACA AAC TAT TCA AAC AAT GGG TAA-3'（配
列番号7） アンチセンスプライマー： 5' -ACA ACA ACC ACT CAA ACG TGG AGC CAA ACA-3'（配
列番号8） 5' -TGT TGC AAC ACA TAC TAC TAC ATT TAT AAA-3'（配
列番号9） リンドウLTP2 センスプライマー： 5' -GCA AAA CAT ACA TTC GTT TTC TCC TAT AAA-3'（配
列番号10） 5' -CTC CTA TAA ATG GAA ACA ACT AGC TAA GCC-3'（配
列番号11） アンチセンスプライマー 5' -AAT TAC TCA CAA AAA AAC AAT TTT GAA GGA-3'（配
列番号12） 5' -AAG GAT AAA ATT GTT ATA AGT TAC AAC AAC-3'（配
列番号13）

【００６９】4）RT-PCRによる新規抗菌性タンパク質遺
伝子の増幅 合成された一本鎖cDNAを鋳型として、上記3）で記した
センスプライマーとアンチセンスプライマーでPCR反応
を行った。PCRの反応組成は以下の通りである。PCR反応組成： cDNA 溶液 1μl（1μg） 20μMセンスプライマー 2μl 20μMアンチセンスプライマー 2μl 10×PCR緩衝液 5μl 25 mM dNTPミックス 4μl ExTaq 1μlDEPC処理水 37.5μl 全量 50μl PCR 反応は、95℃で30秒間の熱変性、55℃で30秒間のア
ニーリング、72℃1分間の伸長反応を1サイクルとして、
30サイクル行った。このPCR反応物を1.6％アガロースゲ
ル電気泳動に供し、約800bpのDNA断片をゲルから切り出
した。本ゲル片より Quia Gel Extration Kit（キアゲ
ン社製）を用いてDNA断片を抽出した。

【００７０】次いで、このPCR産物をベクターpCR2.1
（インビトロゲン社製）にTAクローニングを行った。す
なわち、pCR2.1ベクターに重量比5〜10倍程度のPCR産物
を混合し、Ligation kit ver. 2（Takara社製）を用い
てライゲーションを行った。この組換えプラスミドを用
いて大腸菌（TOP10F'）を形質転換した。単一コロニー
をLB培地中で培養し、QUIA Miniprep Kit（キアゲン社
製）を用いてプラスミドを精製した。

【００７１】5）塩基配列の決定 得られたプラスミドを鋳型にM13RV及びT7プライマーを
用いて Big Dye Cyclesequence Kit（ABI）の方法に準
じてシークエンス反応を行い、ABI PRISM 377 DNA Sequ
ence System（ABI）を用いて塩基配列の決定を行った。
得られた塩基配列については解析ソフトDNASIS及びGENE
TIXを用いて解析し、検索ソフトBLASTによってホモロジ
ー検索を行った。それぞれ異なる塩基配列のcDNAが得ら
れ、GtLTP-1およびGtLTP-2とした。ホモロジー検索の結
果複数の植物で報告されているLTPと相同性を示した。
以上の結果より、これら2種の遺伝子をリンドウLTP（LT
P１及びLTP2）遺伝子と同定した。

【００７２】［実施例４］リンドウゲノムDNAのサザン
ブロット解析 1）ゲノムDNAの調製 リンドウ葉から CTAB 法（Focus 12 : 13-15(1990)）に
よってゲノムDNAを調製した。すなわち、5g のリンドウ
茎葉を液体窒素で凍結後、乳鉢、乳棒にて摩砕し、2×C
TAB溶液（2％Cetyl trimethyl ammonium bromide (CTA
B)、0.1M Tris-HCl, pH8.0、1.4M NaCl、1% PVP）10ml
を混合した。55℃で10分間インキュベート後、クロロホ
ルム/イソアミルアルコール（24：1）を5ml添加し、30
分間室温にて振とうした。3500rpm で遠心分離後、水層
部（上清）を回収し、1/10容量の10％CTAB溶液（10％CT
AB、0.7M NaCl）を加え、転倒混和後、等量の沈澱バッ
ファー（1％CTAB、5 mM Tris-HCl, pH8.0、10 mM EDT
A）を加えて、さらに30分間室温にて転倒混和した。700
0rpm で遠心分離後、沈澱部を5mlの1M NaCl-TE（1MNaC
l、10 mM Tris-HCl, pH8.0、1mM EDTA）により55℃で溶
解し、イソプロパノール5ml加えた。転倒混和後、3500r
pmで遠心分離し、沈澱部を5mlの70％エタノールでエタ
ノール沈澱を行い、沈澱部を乾燥後、500μlのTEに溶解
した。その後、RNAse（1μg/ml）処理を行い、混入した
RNAを除去後、フェノール/クロロホルム/イソアミルア
ルコール（25:24:1）により抽出し、エタノール沈澱を
行い、沈澱部を乾燥後、500μlのTEに溶解してゲノムDN
Aを得た。

【００７３】2）ハイブリダゼーション 上記で得られた、ゲノムDNAを制限酵素BamHI、EcoRIで
消化し、その分解産物を1%アガロースゲル電気泳動に供
した。泳動後、DNA断片をハイボンドN+メンブラン（ア
マシャム社製）にトランスファーし、そのメンブランを
高SDSハイブリダイゼーションバッファー（7%SDS、50%
ホルムアミド、5×SSC、2％ブロッキング試薬、50mMリ
ン酸ナトリウム,pH7.0、0.1％N-ラウリルサルコシン）
中に42℃で1時間以上プレハイブリダイゼーションを行
った。

【００７４】次いで、プローブとしてリンドウLTP1及び
LTP2遺伝子の全長cDNAをDIG（ジゴキシゲニン）発光検
出キット（ロシュ・ダイアグノステックス社製）を用い
てDIG標識した後、ハイブリダイゼーションを行った。
すなわち、ハイブリダイゼーションは標識プローブを含
む高SDSハイブリダイゼーションバッファー中、42℃で1
6時間浸積することによって行った。次いで、2×SSC、
0.1％SDS中50℃にて2回、0.1×SSC、0.1％SDS中68℃に
て2回、メンブランを洗浄した。その後、アルカリフォ
スファターゼ標識した抗DIG抗体（ロシュ・ダイアグノ
ステックス社製）で処理し、オートラジオグラムを取っ
てプローブとハイブリダイズしたバンドを調べた。その
結果、いずれの制限酵素でも3本以上のバンドが認めら
れた（図３）ことから、本遺伝子は遺伝子ファミリーを
形成しているものと考えられた。

【００７５】［実施例５］植物導入用の組換えベクター
の構築 １）植物導入用組換えベクター p35SLTP1、p35SLTP2の
構築 リンドウLTP１又はLTP2遺伝子を含むプラスミド10μｇ
を制限酵素SalIとBamHI10単位で消化した後、断片をア
ガロースゲル電気泳動により分画し、約700及び600bpの
バンドをアガロースゲルから切り出した。このゲルより
Quiaprep. gel extraction kit（キアゲン社製）を用い
て約700及び600bpのリンドウLTP1又はLTP2遺伝子を含む
DNA断片を得た。

【００７６】一方、CaMV35S（カリフラワーモザイクウ
イルス）プロモーターとNOS（ノパリン合成酵素）ター
ミネーターを含むプラスミドベクターの10μgのDNAをTE
バッファー中で10unitずつの制限酵素BamHIとSalIで消
化した後、断片をアガロースゲル電気泳動により分画
し、約4.5kbのバンドをアガロースゲルから切り出し
た。このゲルより Quiaprep. gel extraction kit（キ
アゲン社製）を用いて消化されたプラスミドを回収し
た。

【００７７】上記のようにして得られたリンドウLTP1及
びLTP2遺伝子を含むDNA断片とベクターDNA断片を各5μl
ずつを混合し、本DNA混合液と等量のライゲーション溶
液（DNA ligation kit (Takara社製)）を加えることに
より連結させた。この連結反応液の2μLを市販の大腸菌
コンピテントセルDH5α（TOYOBO社製）100μLと混合し
氷中で30分間、42℃で45秒間、さらに氷中に１分間放置
した。このようにして得た大腸菌の形質転換体を含む溶
液に、LB培地（１％ Bacto trypton, 0.5 % Bact yeast
extract, 0.5 % NaCl, 0.1% グルコース pH7.5）100mL
を加えて、37℃で1時間培養した後、スペクチノマイシ
ン50mg/Lを有するLB寒天培地にプレーティングした。翌
日、培地上に出現したコロニーのうち白色のコロニーの
中から１つを選抜し、スペクチノマイシン50mg/Lを含む
LB液体培地で37℃で約6〜12時間振盪培養した。この培
養液から Quiaprep. miniprep. kit（キアゲン社製）を
用いてプラスミドを調製し、各種制限酵素を用いて消化
した後、アガロースゲル電気泳動して解析を行うことに
より、CaMV35Sプロモーターの下流にリンドウLTP1及びL
TP2遺伝子が正常に連結されているプラスミドを選択
し、これを植物導入用組換えベクターp35SLTP1、p35SLT
P2（図４参照）とした。

【００７８】2）バイナリーベクターpEbisLTP1KB、pEbi
sLTP2KBの構築 バイナリープラスミドベクターpEBisKBの10μg及びプラ
スミドベクターp35SWPR-１ 10μｇのDNAをTEバッファー
中で 10unitずつの制限酵素 SSeIで消化した後、飽和フ
ェノール抽出を2回行うことにより制限酵素を除いた。
この抽出液に100分の１容の3M酢酸ナトリウム、2倍容の
エタノールを加え、-20℃に6時間放置した。この溶液を
1,500rpm、4℃で10分間遠心分離し、得られた沈澱を減
圧下で乾燥させ、10μLのTEに溶解し、DNA ligation ki
t （Takara社製）により連結させた。この連結反応液の
10μLを市販の大腸菌コンピテントセル DH5α（TOYOBO
社製）100μLと混合し氷中で30分間、42℃で45秒間、さ
らに氷中に１分間放置した。このようにして得た大腸菌
の形質転換体を含む溶液に、LB培地(１% Bacto trypto
n, 0.5% Bact yeast extract, 0.5% NaCl, 0.1% グルコ
ース pH 7.5) 100 mLを加えて、37℃で１時間培養した
後、スペクチノマイシン100mg/L、カナマイシン50mg/L
を含有するLB 寒天培地にプレーティングした。翌日、
培地上に出現したコロニーのうち白色のコロニーの中か
ら１つを選抜し、スペクチノマイシンとカナマイシンを
含むLB液体培地中、37℃で約6〜12時間振盪培養した。
この培養液から Quiaprep. miniprep. kit（キアゲン社
製）を用いてプラスミドを調製し、各種の制限酵素を用
いて消化した後、アガロースゲル電気泳動して解析を行
うことにより、リンドウLTP1及びLTP2遺伝子が正常に連
結されているプラスミドを選択し、これを植物導入用組
換えベクター pEbisLTP1KB,pEbisLTP2KB（図４参照）と
した。本ベクターによりアグロバクテリウムを公知の方
法でトランスフォームし、形質転換に用いた。

【００７９】［実施例６］タバコへのリンドウLTP遺伝
子の導入 1）タバコへのpEbisLTP1KB、pEbisLTP2KBの導入 （1）タバコ植物体の育成 タバコ（Nicotiana tabacum SR1）の完熟種子を１％次
亜塩素酸で消毒後、MS培地に置床し、発芽・伸長を誘発
する。MS培地は3%ショ糖と0.9% 寒天を含むムラシゲ・
スクーグ基本培地である。１-2ヶ月間培養後、アグロバ
クテリウムに感染可能な十分に展開した葉が得られた。 （2）バイナリーベクターpEbisLTP1KB、pEbisLTP2KBの
導入 十分展開したタバコの葉を外植片として約1cm四方に切
断し、適当な抗生物質を含むYEB培地で28℃、一晩培養
したpEBisGt3KBを有するアグロバクテリウム菌液にその
外植片を約1分間浸漬し、付着した余分な菌液を濾紙で
軽く拭い取りMS培地に移し、25℃弱光下で2日間共存培
養した。 （3）形質転換細胞の選抜及び植物体への再生 共存培養後の葉外植片を再分化培地に移し、１ヶ月後に
形成したカルス上に生じた不定芽を切り出し、発根培地
に置床し、発根を誘導した。再分化培地は1mg/L BAP、
0.1mg/L NAA、500mg/L カルベニシリン、5mg/L ビアラ
フォスを含むMS培地である。発根培地は500mg/Lカルベ
ニシリンと5mg/Lビアラフォスを含むMS培地である。選
抜薬剤としては、ビアラフォスの他にカナマイシン等を
用いることもできる。

【００８０】［実施例７］形質転換植物体の病害抵抗性
の評価 上記の方法で得られたリンドウLTP1遺伝子導入タバコ5
系統の再分化個体を、常法により、ノザンブロット解析
し、GtLTP1遺伝子の発現を確認後、灰色かび病菌に対す
る耐病性評価試験を行った。再分化したタバコの葉を切
り出し、灰色かび病菌(B. cinerea)をPDA培地で増殖さ
せた菌そうをコルクボーラー（直径5mm）で打ち抜き、
葉1枚あたり、2個の菌そうを接種し、湿度を保つため、
水を十分吸収させた濾紙上で25℃、4日間インキュベー
トした。

【００８１】コントロールの非形質転換体では菌の増殖
が進み葉全体が水浸状になり、激しい病徴が見られるの
に対し、5系統中3系統で病斑の広がりが抑えられていた
（図５Ａ）。灰色かび病菌接種4日後の病斑の広がりを
測定したところ、コントロールの非形質転換体に比較
し、それら3系統では約1/3以下に抑えられており、リン
ドウLTP1遺伝子導入タバコにおいては灰色かび病に対す
る抵抗性が付与されていた。

【００８２】

【発明の効果】本発明の抗菌性タンパク質及びその遺伝
子を用いれば、植物の病害抵抗性を向上させることがで
きる。また、本発明の抗菌性タンパク質は遺伝子組換え
技術により大量生産可能であり、抗菌剤として利用しう
る。

【００８３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Iwate Prefecture <120> New antimicrobial proteins from Gentiana triflora and genes thereo f <130> P01-0640 <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 603 <212> DNA <213> Gentiana triflora <400> 1 atattcatag tcatcattca cttactcttt cctactacaa actattcaaa caatgggtaa 60 gatcgccatt aaagttatct ccttggttgt gctgtccatg gtgttgcttg atcatgcaga 120 gggcttgact tgcggcgccg ttaccagcgc agtcgggcca tgtcttggct tcattaaggg 180 tgcacccatt gcacccggtt gctgccccgg agtcaaaagt ctagtcggct tggccaaaac 240 caccgccgat cgccgtgctg cttgcaactg tttgaagtcc attgccaatg ctgtcaagcc 300 cttcaatctt aaaaatgctc agaaccttcc tcatatctgt ggcactagtg ttccttaccc 360 tattgaccct accatcaact gcaacagtgt gaattgagca ttgagacgta cgtgtggctg 420 caaaagggtg tatggtctat ctacgagaca tatatttgaa taaataaatc agatttatta 480 aatgagcaat agagaaacat accattaaag cgtacctctg tttgccttta taaatgtagt 540 agtatgtgtt gcaacatgtt tggctccacg tttgagtggt tgttgtagaa aaaaaaaaaa 600 aaa 603 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Gentiana triflora <400> 2 Met Gly Lys Ile Ala Ile Lys Val Ile Ser Leu Val Val Leu Ser Met 1 5 10 15 Val Leu Leu Asp His Ala Glu Gly Leu Thr Cys Gly Ala Val Thr Ser 20 25 30 Ala Val Gly Pro Cys Leu Gly Phe Ile Lys Gly Ala Pro Ile Ala Pro 35 40 45 Gly Cys Cys Pro Gly Val Lys Ser Leu Val Gly Leu Ala Lys Thr Thr 50 55 60 Ala Asp Arg Arg Ala Ala Cys Asn Cys Leu Lys Ser Ile Ala Asn Ala 65 70 75 80 Val Lys Pro Phe Asn Leu Lys Asn Ala Gln Asn Leu Pro His Ile Cys 85 90 95 Gly Thr Ser Val Pro Tyr Pro Ile Asp Pro Thr Ile Asn Cys Asn Ser 100 105 110 Val Asn <210> 3 <211> 620 <212> DNA <213> Gentiana triflora <400> 3 gcaaaacata cattcgtttt ctcctataaa tggaaacaac tagctaagcc acttacagca 60 ctacctcaag tctcatttct tatctccaaa atgaggacat caagccttgc tgtttttgca 120 atgctactac tactcattct agccggagct aacctctcag ccgccgcagt atgcaacctg 180 ggtgcactgc agaggccatg tgctgcagtg cttgggcgcg gatctccgcc atccccgcaa 240 tgttgctttg cactcagaca acaattgcct tgctactgtg ggtatcttag gaaatacccc 300 agtttgcgga atcttattag cccttccact gccagaactg tttccagaat ttgcaggatt 360 ggtattccta gatgttaaag gactacttgc agttgaggaa ccctctaaat ccatgcatct 420 ttatgcatgg tctatgactt cattctgaag gggatatttt ataaacatta tatctatatg 480 tatggtgtaa tatattgagt gattttgcct ctgttgctaa gctcctgtcg aacttggctc 540 aataatcttt atctgcatac aagtttatgt aattttatag tgcaattgtc gttgttgtaa 600 cttataacaa ttttatcctt 620 <210> 4 <211> 95 <212> PRT <213> Gentiana triflora <400> 4 Met Arg Thr Ser Ser Leu Ala Val Phe Ala Met Leu Leu Leu Leu Ile 1 5 10 15 Leu Ala Gly Ala Asn Leu Ser Ala Ala Ala Val Cys Asn Leu Gly Ala 20 25 30 Leu Gln Arg Pro Cys Ala Ala Val Leu Gly Arg Gly Ser Pro Pro Ser 35 40 45 Pro Gln Cys Cys Phe Ala Leu Arg Gln Gln Leu Pro Cys Tyr Cys Gly 50 55 60 Tyr Leu Arg Lys Tyr Pro Ser Leu Arg Asn Leu Ile Ser Pro Ser Thr 65 70 75 80 Ala Arg Thr Val Ser Arg Ile Cys Arg Ile Gly Ile Pro Arg Cys 85 90 95 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 agttttccca gtcacgactt tttttttttt tttttttt 38 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 atattcatag tcatcattca cttactcttt 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 cctactacaa actattcaaa caatgggtaa 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 acaacaacca ctcaaacgtg gagccaaaca 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 tgttgcaaca catactacta catttataaa 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 gcaaaacata cattcgtttt ctcctataaa 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 ctcctataaa tggaaacaac tagctaagcc 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 12 aattactcac aaaaaaacaa ttttgaagga 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 13 aaggataaaa ttgttataag ttacaacaac 30

【００８４】

【配列表フリーテキスト】配列番号5−人工配列の説
明：合成ＤＮＡ 配列番号6−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号7−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号8−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号9−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号10−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号11−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号12−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号13−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、リンドウ抗菌性タンパク質（リンドウ
LTP1、LTP2）のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の
結果を示す写真である。

【図２】図２は、リンドウ抗菌性タンパク質（リンドウ
LTP1、LTP2）の各種微生物に対する作用を示すグラフで
ある。

【図３】図３は、リンドウLTP遺伝子1および2のサザン
ブロット解析結果を示す写真である。

【図４】図４は、植物形質転換体作出用ベクターの構築
を示す図である。

【図５】図５は、リンドウLTP遺伝子導入タバコの灰色
かび病抵抗性の評価を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ ４Ｈ０４５ (72)発明者 山村 三郎 岩手県北上市新穀町一丁目６番地27号 メ ルベイユ北上１−404号 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA17 CA19 CD03 CD07 CD10 4B024 AA07 AA08 BA80 CA04 DA01 DA05 EA04 FA02 GA11 HA03 4B064 AG01 CA11 CA19 CC24 DA11 4B065 AA11X AA88X AA88Y AB01 BA01 CA24 CA47 CA53 4H011 AA01 BB22 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA30 DA00 EA05 EA06 FA72 FA74

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（a）又は（b）の抗菌性タンパク
   質。 （a）配列番号2又は4で表されるアミノ酸配列からなる
   タンパク質。 （b）配列番号2又は4で表されるアミノ酸配列において1
   又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するタンパク
   質。
2. 【請求項２】 以下の（a）又は（b）の抗菌性タンパク
   質をコードする遺伝子。 （a）配列番号2又は4で表されるアミノ酸配列からなる
   タンパク質。 （b）配列番号2又は4で表されるアミノ酸配列において1
   又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するタンパク
   質。
3. 【請求項３】 以下の（c）又は（d）のDNAからなる遺
   伝子。 （c）配列番号1又は3で表される塩基配列からなるDNA。 （d）配列番号1又は3で表される塩基配列からなるDNAと
   ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ抗
   菌活性を有するタンパク質をコードするDNA。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を含有する
   組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項２又は３記載の遺伝子を導入して
   得られる形質転換体。
6. 【請求項６】 前記形質転換体が植物である、請求項５
   記載の形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項５又は６記載の形質転換体を培養
   し、得られる培養物から抗菌性タンパク質を採取する、
   抗菌性タンパク質の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項２又は３記載の遺伝子を導入する
   ことにより、病害抵抗性を付与された形質転換植物。
9. 【請求項９】 請求項１記載の抗菌性タンパク質を有効
   成分として含む抗菌剤。