MX2008007342A - Peptidos inductores de baceriocina - Google Patents

Abstract

Nuevos péptidos producidos mediante bacterias productoras de bacteriocina, estimulan la producción in vitro de bacteriocinas. Las bacterias productoras son cultivadas en presencia de una bacteria inductora novedosa un péptido que tiene una secuencia carboxi-terminal de VKGLT, a fin de obtener un incremento en la producción de bacteriocina.

Description

PÉPTIDOS INDUCTORES DE BACTERIOCINAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a péptidos novedosos que estimulan la producción de bacteriocinas a través de bacterias productoras en la presencia de una bacteria inductora, y a métodos para utilizar los péptidos para la producción de bacteriocina. Antecedentes de la Invención Las bacterias intestinales normales son importantes para la salud de cualquier animal huésped. El huésped deriva el beneficio a través de los procesos metabólicos digestivos transmitidos por las biotas bacterianas nativas. Desde la perspectiva de las bacterias intestinales, la competición y evolución consecuente proporciona nutrientes y espacios vivos e incrementa el potencial reproductor, habilita que ciertas especies y cepas ganen una ventaja de supervivencia. Durante la evolución bacteriana, ha ocurrido la producción de bacteriocina. Las bacteriocinas son antagónicas a otros organismos dentro de un nicho competitivo determinado, y por lo tanto proporcionan una ventaja ecológica. Estas bacteriocinas normalmente son polipéptidos de bajo peso molecular y se clasifican con base en diferencias en peso molecular (Klaenhammer, FEMS Microbiol. Rev., Volumen 12-39-85, 1993). Estos compuestos pueden digerirse fácilmente en sus aminoácidos componentes a través de enzimas de proteasa o huésped. Las bacteriocinas pueden representar un componente significativo de los beneficios derivados de la exclusión competitiva (Nurmi y Rantala, Nature, Londres, Volumen 241, 210-21 1, 1973). Nurmi y Rantala (1973, supra) describió originalmente las ventajas de la exclusión competitiva en el control de colonización de Salmonella entre pollos recientemente incubados, utilizando una flora bacteriana no definida derivada de las heces de aves adultas saludables. Este método es una alternativa atractiva para las prácticas de agricultura actuales que implican antibióticos sintéticos. Se describe una flora de exclusión competitiva derivada de mucosa (Stern y asociados, Patente Norteamericana No. 5,451,400, presentada en septiembre de 1995) como un cultivo anaeróbico derivado de desechos de los revestimientos de la mucosa intestinal en gallinas adultas saludables. Esta flora no definida proporcionó una excelente protección contra colonización de Salmonella en pollos, pero proporcionó un control únicamente inconsistente de la colonización de Campylobacter (Stern, Poult. Sci, Volumen 73, 402-407, 1994). La exclusión competitiva ocurre dentro del tracto intestinal de aves salvajes y contribuye a la ecología del intestino saludable. Los microorganismos producen una variedad de compuestos que muestran propiedades antibacterianas. Un grupo de estos compuestos, las bacteriocinas, consisten en proteínas bactericidas con un mecanismo de acción similar a los antibióticos de ionóforo. Las bacteriocinas con frecuencia son activas contar especies que están relacionadas cercanamente con el productor de la bacteriocina. Su surgimiento amplio en especies bacterianas aisladas de comunidades microbianas de complejo, tal como el tracto gastrointestinal, las superficie orales, u otras superficies epiteliales, sugieren que las bacteriocinas pueden tener un papel regulador en términos de dinámica de población dentro de ecosistemas bacterianos. Las bacteriocinas se definen como compuestos producidos mediante bacterias que tienen una porción de proteína biológicamente activa y una acción bacteriocina (Tagg y asociados, Bacteriological Reviews, Volumen 40, 722-256, 1976). Otras características pueden ser: (1) un espectro de inhibición de actividad estrecho, centrados alrededor de especies relacionadas en forma cercana; (2) adhesión a receptores celulares específicos; y (3) determinantes genéticos sostenidos en plásmidos en producción de bacteriocinas y de inmunidad de bacteriocina de célula huésped. Las sustancias antagónicas definidas en forma incompleta han sido denominadas "sustancias tipo bacteriocina". Algunas bacteriocinas efectivas contra bacteria Gram positiva, en contraste con bacteria Gram-negativa, tienen un espectro de actividad más amplio. Se ha sugerido que el término bacteriocina, cuando se utiliza para describir agentes inhibidores producidos mediante bacterias Gram positiva, deben cumplir con los criterios mínimos (1) siendo un péptido, y (2) teniendo la actividad bactericida (Tagg y asociados, supra). Con el objeto de hacer económicamente factible el uso comercial de las bacteriocinas, es necesario la optimización del rendimiento durante la producción (Chen y Hoover, Comprehensive Reviews in Food Science y Food Safety, Volumen 2, 82-100, 2003). Chen y Hoover manifiestan que para la producción de nisina, se descubrió que en el medio de crecimiento, los factores c|ave fueron el mantenimiento de un pH óptimo y el suplemento del medio con nutrientes específicos de cada cepa o cepas que producen la bacteriocina. Knutsen y asociados, (Journal of Bacteriology, Volumen 186 (10), 3078-3085, 2004) describen una bacteriocina que produce péptido (BIP) de 27 aminoácidos que genera la producción de bacteriocina en Streptococcus pneumoniae. Diep y asociados, (Molecular Biology, Volumen 47 (2), 483-494, 2003) describe que el número de bacterias Gram positiva han sido reportados para aplicar una denominada trayectoria de transducción de señal a base de feromona de péptido, para regular la producción de péptidos antimicrobianos, conocidos como bacteriocinas, de novedosas bacterias de ácido láctico. También describen un fenómeno de péptido PInA, que induce la producción de bacteriocina. Van Belkum y Stiles (Nat. Prod.

Rep., Volumen 17, 323-335, 2000) describe que algunas bacteriocinas requieren productos de genes reguladores para su producción. Manifiestan que estos genes codifican un péptido de inducción secretada y proteínas que son homologas a las cinasas de histidina y reguladores de respuesta. La referencia descrita además que algunas bacteriocinas clase II, son inducidas por un péptido de inducción en tanto que otras, tales como carnobacteriocina B2 y sacacina P, son inducidas por un péptido de inducción o auto-inducidas por la bacteriocina sintetizada. Aunque se ha descubierto que varios péptidos inducen la producción de bacteriocinas en bacterias, permanece la necesidad en la técnica en la producción comercial de bacteriocinas utilizando péptidos que incrementan el rendimiento de la producción de bacteriocina in vitro. La presente invención proporciona péptidos que son diferentes a los péptidos de la técnica anterior y proporcionan métodos producir grandes cantidades de bacteriocinas para uso comercial. Breve Descripción de la Invención Por consiguiente es un objeto de la presente invención proporcionar péptidos que estimulen la producción de bacteriocinas in vitro. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar péptidos que estimulan la producción de bacteriocinas in vitro, y tienen una secuencia de terminal carboxi de VKGLT (SEQ ID NO 1). Otro objeto de la presente invención es proporcionar un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: MVTKSLVLAWVVALLACGM \Z GZ.7 (SEQ ID NO 3). Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos TNVTKS WWVLAGCNQVVASNCNCGN VKGLT (SEQ ID NO 5). Un objeto aún adicional de la presente invención, es proporcionar un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de WN KYKTNWVLSVC NTGCACAA VKGLT (SEQ ID NO 7). Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para incrementar la producción de bacteriocinas in vitro en donde el péptido tiene una secuencia de terminal carboxi de VKGLT (SEQ ID NO 1) se agrega a un cultivo de células que producen bacteriocina. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para incrementar la producción de bacteriocina OR-7 in vitro, en donde el péptido que tiene SEQ ID NO 3 se agrega a un cultivo de células Lactobacillus salivarius PVD-32 (NRRL B-30514). Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para incrementar la producción de bacteriocina 50-52 in vitro, en donde el péptido que tiene SEQ ID NO 5 se agrega a un cultivo de células Enterococcus faecium LWP 50-52 (NRRL B-30746). Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para incrementar la producción de bacteriocina 760 in vitro, en donde el péptido que tiene SEQ ID NO 7 se agrega a un cultivo de células Streptococcus cricetus LWP 760 (NRRL B-30745). Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para incrementar la producción de una bacteriocina a través de una línea celular productora, incluyendo además una línea celular inductora. Un objeto aún adicional de la presente invención es proporcionar un método para incrementar la producción de bacteriocina OR-7 a través de la línea celular productora Lactobacillus salivarius PVD-32, incluyendo además la línea celular inductora Lactobacillus crispatus LWP 252 (NRRL B-30884). Un objeto aún adicional de la presente invención es proporcionar un método para incrementar la producción de bacteriocina 50-52 a través de la línea celular productora Enterococcus faecium LWP 50-52 incluyendo además la línea celular inductora Lactobacillus acidophilus LWP 320 (NRRL B-30510). Un objeto aún adicional de la presente invención es proporcionar un método para incrementar la producción de bacteriocina 760 a través de la línea celular productora Streptococcus cricetus LWP 760 incluyendo además la línea celular inductora Lactobacillus acidophilus LWP 320. Los objetos y ventajas adicionales de la presente invención se podrán a preciar a partir de la descripción que se encuentra a continuación. DEPOSITO DE LOS MICROORGANISMOS Lactobacillus salivarius, designado NRRL B-30514 (Cepa PVD32) se depositó el 3 de agosto del 2001. Streptococcus cricetus, designado NRRL B-30745 (Cepa LWP 760), y Enterococcus faecium designado NRRL B-30746 (Cepa LWP-50-52) se depositaron el 03 de mayo del 2004; y Lactobacillus acidophilus, designado NRRL B-30510 (Cepa LWP 320) se depositó el 03 de agosto del 2001. Lactobacillus crispatus, designado NRRL B-30884 (Cepa LWP 252) se depositó el 04 de noviembre del 2005. Todas las cepas anteriores también han sido depositadas bajo las provisiones de Tratado de Budapest con la U. S. D. A. Agricultural Research Service Patent Culture Collection (National Center for Agricultural Utilization Research, 1815 N. University Street, Peoría, Illinois 61604). Breve Descripción de los Dibujos Las figuras 1A y 1B son fotografías que muestran la detección directa de péptido de señal y bacteriocinas OR-7 después de SDS-PAGE (A) e isoelectroenfoque (B). El gel fue revestido con Campylobacter jejuni para determinar que banda(s) corresponde a la actividad antimicrobiana, peso molecular y punto isoeléctrico. En la figura 1A, la Columna 1 -Rango de Marcadores de Masa Molecular LMW 2,100-12,500 (Amersham Pharmacia Biotech): 2,100; 5,780; 8,400; 12,500 Da. La banda en la Columna 2 que contiene la bacteriocina pura OR-7 corresponde a la actividad antimicrobiana, la zona de inhibición de crecimiento tuvo una masa de aproximadamente 5.5 kDa. La banda en la Columna 3 que contiene el péptido de señal pura de PVD-32 tuvo una masa de aproximadamente 2.5 kDa. En la figura 1B, la Columna 1 que contiene bacteriocina pura OR-7 corresponde a la actividad antimicrobiana; la zona de inhibición de crecimiento tuvo un pl de aproximadamente 8.4. La banda en la Columna 2 que contiene la forma de péptido de señal pura PVD-32 tuvo un pl de aproximadamente 7.9. La Columna 3 contuvo estándares pl (Protein Test Mixture, I Marker Proteins, Serva): 10.0, 9.2, 8.1, 6.9, 5.5, 4.3. Las figuras 2A y 2B son fotografías que muestran detección directa de péptido de señal y bacteriocina 50 a 52 después SDS-PAGE (A) e isoelectroenfoque (B). Los geles fueron revestidos con Campyiobacter jejuni para determinar que banda(s) corresponde a la actividad antimicrobiana, peso molecular, y punto isoeléctrico. En la figura 1A, la Columna 1 muestra el Rango de Marcadores de Masa Molecular LMW de aproximadamente 2,100-12, 500 (Amersham Pharmacia Biotech): 2,100; 5,780; 8,400; 12,500 Da. La banda en la Columna 2 que contiene bacteriocina pura 50-52 corresponde a la actividad antimicrobiana, la zona de inhibición de crecimiento tuvo una masa de aproximadamente 3.9 kDa. La banda en la Columna 3 que contiene péptido de señal pura para LWP-50-52 tuvo una masa de aproximadamente 3.1 kDa. En la figura 2B, la banda en la Columna 1 que contiene bacteriocina pura 50-52 corresponde a la actividad antimicrobiana; la zona de inhibición de crecimiento tuvo un pl de aproximadamente 8.4. La banda en la Columna 2 que contiene el péptido de señal puro de LWP-50-52 tuvo un pl de aproximadamente 8.1. La Columna 3 contuvo estándares pl (Protein Test Mixture, I Marker Proteins, Serva): 10.0, 8.1, 7.9, 6.4, 5.5, 4.3, 4.1, y 3.8. Las figuras 3A y 3B son fotografías que muestran la detección directa de péptido de señal y bacteriocina 760 después de SDS-PAGE(A) e isoelectroenfoque (B). Los geles son revestidos con Campylobacter jejuni para determinar que banda(s) corresponde a la actividad antimicrobiana, peso molecular, y punto isoeléctrico. En la figura 3A, la Columna 3 muestra un Rango de Marcadores de Masa Molecular LMW de aproximadamente 2,100-12,500 (Anriersham Pharmacia Biotech): 2,100; 5,780; 8,400; 12,500 Da. La banda en la Columna 1 que contiene bacteriocina pura 760 corresponde a la actividad antimicrobiana; la zona de inhibición de crecimiento tuvo una masa de aproximadamente 5.5 kDa. La banda en la Columna 3 que contiene la forma de péptido de señal pura LWP 760 tuvo una masa de aproximadamente 2.1 kDa. En la figura 3B, la banda en la Columna 1 que contiene bacteriocina pura 760 corresponde a la actividad antimicrobiana; la zona de inhibición de crecimiento tuvo un pl de aproximadamente 9.5. La banda en la Columna 2 que contiene un péptido de señal pura procedente de LWP-760 tuvo un pl de aproximadamente 8.9. La Columna 3 contuvo estándares (Protein Test Mixture, I Marker Proteins, Serva): 10.0, 8.1, 7.9, 6.4, 5.5, 4.3, 4.1, y 3.8. Descripción Detallada de la Invención La importancia de infecciones entéricas en humanos ha sido mejor reconocida y esta bien documentada la relación de la contaminación de aves de corral e infección humana. La capacidad de disminuir este riesgo a la salud mediante intervenciones en plantas de procesamiento de aves de corral también es bien conocida. Durante la producción y procesamiento en caldera, y las materias fecales que contienen patógenos se transfieren a la carne y persisten en las cocinas que procesan alimentos. Los metabolismos de organismos de competición pueden contribuir al control de patógenos tales como Campylobacter jejuni y Salmonella . Lactobacillus salivarius, designado NRRL B- 30514 (Cepa PVD32), Streptococcus cricetus, designado NRRL B-30745 (Cepa LWP- 760); y Enterococcus faecium, designado NRRL B-30746 (Cepa LWP-50-52) producen bacteriocinas novedosas las cuales son la material en cuestión de la Solicitud de Patente Norteamericana Pendiente No. /644,927, presentada el 21 de agosto del 2003 y la Solicitud de Patente Norteamericana Pendiente No. 10/426,688, presentada el 01 de mayo del 2003, las cuales ambas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Estas cepas también producen péptidos novedosos que estimulan las cepas a que produzcan mayores cantidades de bacteriocinas in vitro. La presente invención proporciona péptidos de señal novedoso y las cepas que producen los péptidos, cepas inductoras novedosas, secuencias de aminoácido, y métodos para utilizar los péptidos novedosos y las cepas inductoras. Lactobacillus salivarius, PVD-32, (NRRL B-30514) produce el péptido de señal SEQ ID NO 3. Es un aerobo con bacilos gram positivo y tiene la capacidad de crecer a una temperatura de aproximadamente 37°C. La cepa crece en nutrientes y de conteo en placa que produce bordes con forma irregular. Las colonias son de color blanca y tienen aproximadamente 3 mm de diámetro después del cultivo aerofílico durante aproximadamente 24 horas a una temperatura de aproximadamente 37°C. Enterococcus faecium, LWP 50-52 (NRRL B-30746) produce un péptido de señal SEQ ID NO 5. Es un aerobo facultativo con coco gram-positivo y tiene la capacidad de crecer a una temperatura de aproximadamente 37°C. La cepa crece en nutrientes o un agar de conteo de placa que produce bordes con forma irregular. Las colonias son de color gris y tienen aproximadamente 2 mm de diámetro después del cultivo micro-aerofílico a una temperatura de aproximadamente 37°C durante aproximadamente 24 horas. Streptococcus cricetus, LWP-760 (NRRL B-30745) produce el péptido de señal SEO. ID NO 7. Es un aerobo facultativo con cocos gram-positivo y tiene la capacidad de crecer a una temperatura de aproximadamente 37°C. La cepa crece en nutrientes o agar de conteo de placa que produce bordes con forma irregular. Las colonias son de color gris y tienen un diámetro de aproximadamente 1 mm después del cultivo micro-aerofílico durante aproximadamente 24 horas a una temperatura de aproximadamente 37°C. Lactobacillus acidophilus, LWP 320 (NRRL B-305 0), es una cepa inductora la cual es un aerobo facultativo con cocus gram-positivo y tiene la capacidad de crecer a una temperatura de aproximadamente 37°C. Las cepas crecen en nutrientes o un agar de conteo de placa que produce bordes con forma irregular. Las colonias son de color blanco y tienen aproximadamente 3 mm de diámetro después del cultivo microaerofílico durante aproximadamente 24 horas a una temperatura de aproximadamente 37°C. Lactobacillus crispatus, LWP 252 (NRRL B-30884), es una cepa inductora la cual es un aerobo con cocus gram-positivo y tiene la capacidad de crecer a una temperatura de aproximadamente 37°C. La cepa crece en nutrientes o un agar de conteo de placa que produce bordes con forma regular. Las colonias son de color gris y tienen aproximadamente 1 mm de diámetro después del cultivo aerofílico durante aproximadamente 24 horas a una temperatura de aproximadamente 37°C. Se aislaron y purificaron péptidos de señal de cepas que producen bacteriocinas. Las células de productores secretan principalmente en bacteriocinas Clase II a través del sistema de transportación ABC (Haverstein y asociados., Mol. Microbiol. , Volumen 16, 229-240, 1995; Gajic y asociados., J. Biol. Chem., Volumen 36, 34291-34298, 2003). La secreción de algunas bacteriocinas de esta clase tiene lugar debido a los péptidos de señal los cuales son activados mediante translocasa Sec localizada en las membranas citoplásmicas (Cintas y asociados., Appl. Environ. Microbiol., Volumen 63, 4321-4330, 1997; Doi y asociados., J. Biosci. Bioeng., Volumen 93, 434-436, 2002; Leer y asociados., Microbiology, Volumen 141, 1629-1635, 1995; Martínez y asociados., Microbiology, Volumen 145, 3155-3161, 1999; Tomita y asociados., J. Bacteriol., Volumen 178, 3585-3593, 1999; Worobo y asociados., J. Bacteriol., Volumen 177, 3143-3149, 1995; y Herranz y asociados., J. Appl. Environ. Microbiol., Volumen 71 (4), 1959-1963, 2005). Otra función de los péptidos de señal está asociada probablemente con el fenómeno bacteriano "detección de cuórum" (De Kievit y asociados., Infection and Immunity, Volumen 68(9), 4839-4849, 2000; Dunny y asociados., In: Microbial Signaling and Communication , England y asociados, (eds), University Press, Cambridge, United Kingdom, 117-138, 1999; Dunning and Leonard, Annu. Rev. Microbiol., Volumen 51, 527-564, 1997; y Kleerebezem y asociados, Mol. Microbiol., Volumen 24, 895-904, 1997). Un péptido de señal ya sea solo o en un complejo con metabolitos de una cepa de inducción, activan la cinasa de proteína de histidina en el productor, incrementando de esta forma la producción de bacteriocina. Para obtener una producción de péptido máxima, las células que producen péptidos de señal tales como PVD 32, LWP 50-52 y LWP 760, fueron cultivadas durante de aproximadamente 2 a 10 horas en un caldo M9 suplementado con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, triptofan, alanina y mezcla de los mismos. Una modalidad preferida de la presente invención incluye cantidades de aminoácido dentro del rango de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.1% para cada aminoácido incluido en la composición. Un medio de aproximadamente 10% de caldo de Brúcela da como resultado la producción de un péptido de señal a una concentración inferior.

El péptido de señal se aisla del sobrenadante de cultivo utilizando precipitación de sulfato de amonio seguido de (1) filtración de gel utilizando cromatografía de Alta Resolución Superosa 12; y (2) cromatografía de interacción hidrofóbica de Flujo Rápido Octil-Sefarosa. Los péptidos de señal de la presente invención se utilizan para incrementar la producción de bacteriocinas in vitro a través de células productoras cuando están en la presencia de una bacteria inductora. El péptido de señal puede ser agregado en cualquier momento durante el cultivo de la bacteria inductora y productora. Debido a la Descripción Detallada de la presente invención, un experto en la técnica podrá determinar fácilmente cuando agregar el péptido de señal para lograr altos niveles de producción de bacteriocina en comparación con la producción de bacteriocina en cultivos que contienen únicamente el péptido y productor o únicamente la bacteria productora e inductora. La actividad antagónica de las bacteriocinas producidas cuando utilizan el péptido de señal y una cepa inductora de bacteria contra C. jejuni y S. enteritidis, fue evaluada utilizando una Prueba de Mancha. Los pasos incluyeron tomar varias concentraciones de la preparación pura (µg/p\\) de la bacteriocina en aproximadamente 10 microlitros de volumen plaqueados en agar Camfilobacter o agar de Nutrientes suplementado con sangre (Agar MPA o Agar Meta Peptona) sembradas previamente con células de la bacteria objetivo. Las placas que contienen cultivos de C. jejuni se crecieron a una temperatura de aproximadamente 42°C, bajo condiciones microaeróbicas. Las placas que contienen S. enteritidis se crecieron a una temperatura de aproximadamente 37°C bajo condiciones aeróbicas. La actividad de la bacteriocina se expresó en unidades arbitrarias (AU) por mililitro de la preparación en la cual aparece una zona visible de inhibición del crecimiento del cultivo (Henderson y asociados., Archives of Biochemistry and Biophysics, Volumen 295, 5-12, 1992; incorporada a la presente invención como referencia). La actividad específica también puede expresarse como unidades arbitrarias por miligramo de bacteriocina pura. Los péptidos de señal de la presente invención incluyen cualquier péptido con una secuencia carboxi termina de VKGLT (SEQ ID NO 1) producida mediante una bacteria que secreta bacteriocina que incrementa la producción de bacteriocina cuando se agrega a un cultivo, incluyendo una bacteria productora o una bacteria productora y una bacteria inductora. Para propósitos de la presente invención, se define una bacteria inductora como cualquier bacteria, la cual cuando se cultiva con una bacteria que produce bacteriocina, bacteria productora junto con el péptido de señal del productor, incrementa la producción de bacteriocina con respecto a la de un cultivo que contiene únicamente la bacteria productora y su péptido de señal. Para propósitos de la presente invención, el término "péptido" significa un compuesto con al menos dos o más aminoácidos o análogos de aminoácido. Los aminoácidos o análogos de aminoácido pueden estar enlazados por enlaces de péptido. En otra modalidad, los aminoácidos pueden estar enlazados por otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Los péptidos pueden estar en cualquier configuración estructural incluyendo configuraciones lineales, ramificadas o cíclicas. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "aminoácidos" se refiere a cualesquiera aminoácidos naturales o sintéticos, incluyendo tanto los isómeros ópticos D ó L como análogos de aminoácidos. Los derivados de péptido y análogos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los que contienen como una secuencia de aminoácido primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácido del péptido, incluyendo secuencias alteradas en las cuales los residuos de aminoácido funcionalmente equivalentes son substituidos por residuos dentro de la secuencia que dan como resultado una substitución de aminoácido conservadora. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia pueden ser substituidos por otro aminoácido de una polaridad similar, la cual actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silente. Los substituyentes de un aminoácido dentro de la secuencia pueden ser seleccionados de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofan y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillo aromáticos son fenilalanina, triptofan y tirosina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados en forma positiva (básicos)' incluyen arginina, Usina e histidina. Los aminoácidos cargados en forma negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Dichas alteraciones no se espera que afecten en forma significativa el peso molecular aparente, tal como se determina mediante electroforesis de gel de poliacrilamida o un punto isoeléctrico. Las substituciones de aminoácido no conservadoras también pueden ser introducidas para substituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferida. Por ejemplo, se puede introducir Cys en un sitio potencial para puentes de disulfuro con otro Cys. Pro se puede introducir debido a su estructura particularmente plana. Los péptidos de la presente invención pueden ser químicamente sintetizados. Los péptidos sintéticos pueden ser preparados utilizando técnicas bien conocidas de fase sólida, fase líquida o técnicas de condensación de péptido, o cualquier combinación de las mismas, y pueden incluir aminoácidos naturales y/o sintéticos. Los aminoácidos utilizados para síntesis de péptido pueden ser una resina de aminoácido Boc(Na-t-butiloxicarbonilo) protegido con Na-amino) con los protocolos de desprotección, neutralización, acoplamiento y lavado estándar del procedimiento de fase sólida original de Merrifield (J. Am. Chem. Soc, Volumen 85, 2154, 1963), o el aminoácido 9-fluorenilmetoxicarbonilo protegido con N -amino labil-base (Fmoc) (Carpino and Han, J. Org. Chem., Volumen 37, 3403-3409, 1972). Además, el método de la presente invención se puede utilizar con otros grupos de protección-Na que son familiares para los expertos en la técnica. La síntesis de péptido de fase sólida se puede lograr mediante técnicas dentro de las habilidades de los expertos en la técnica (ver por ejemplo, las publicaciones de Stewart and Young, Solid Phase Synthesis, Segunda Edición, Pierce Chemical Company, Rockford, III., 1984; Fields and Noble, Int J. Pept. Protein Res., Volumen 35, 161-214, 1990), o utilizando sintetizadores automáticos. Los siguientes ejemplos están proyectados únicamente para ilustrar en forma adicional la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la misma, tal como se define a través de las reivindicaciones adjuntas. EJEMPLO 1 Se revistieron células de las cepas Enterococcus faecium LWP50-52, Streptococcus cricetus LWP-760 y Lactobacillus salivarius PVD-32 en frascos que contienen aproximadamente 300 mi del siguiente medio: caldo de Brúcela, caldo de Brúcela al 10% o M9 suplementado con aminoácidos tal como se indica a continuación en la Tabla 1. Los frascos se cultivaron agitando a una temperatura de aproximadamente 37°C durante aproximadamente 2, 4, 6 y 8 horas. La velocidad de rotación fue de aproximadamente 120 rpm. Las alícuotas del fluido de cultivo fueron centrifugadas en aproximadamente 6000 X g durante aproximadamente 15 minutos a una temperatura de aproximadamente -4°C. Los péptidos se aislaron mediante sedimentación de proteínas con aproximadamente 40% de una solución de (NH )2S04 a una temperatura de aproximadamente 4°C durante aproximadamente 24 horas, seguido de filtración de gel utilizando cromatografía de Alta Resolución Superosa- 2 con selección de fracciones de bajo peso molecular. Estas fracciones fueron aplicadas a una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica de Flujo Rápido Octil-Sefarosa 6 B y las proteínas fueron eluídas con aproximadamente 0.4-0.9 M K2HPO en un amortiguador 0.1 M Tris, gradiente pH 5.1. Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 1. Tal como se puede apreciar a partir de la Tabla 1, los péptidos aislados de los productores PVD 32, LWP 50-52 y LWP 760, fueron de bajo peso molecular y se acumulan principalmente en cultivos que contienen medios de inanición (M9 + aminoácidos indicados).

Tabla 1. Aislamiento y purificación de péptidos inductores de cepas PVD-32, LWP-50-52 y LWP-760.

El péptido de señal aislado para PVD-32, tenía actividad antagónica débil contra C. jejuni y S. enteritidis, tal como se determina en una prueba de mancha. Su actividad fue de aproximadamente 200 AU/ml y su peso molecular fue de aproximadamente 2.5 kDa, tal como se determina mediante electroforesis SDS-PAGE. El punto isoeléctrico (pl) fue de aproximadamente 7.9 (figuras 1A y 1B). El péptido de señal aislado para LWP50-52 no tuvo actividad antagónica contra C. jejuni y S. enteritidis , tal como se determina mediante una Prueba de Mancha. Su peso molecular fue de aproximadamente 3.1 kDa tal como se mide mediante SDS-PAGE y el punto isoeléctrico (pl) fue de aproximadamente 8.1 (figuras 2A y 2B). El péptido de señal aislado para LWP-760 no tuvo actividad antagónica hacia C. jejuni y S. enteritidis, tal como se determina mediante una Prueba de Mancha. Su peso molecular fue de aproximadamente 2.1 kDa tal como se determina mediante electrofóresis SDS-PAGE y el punto isoeléctrico fue de aproximadamente 8.9 (figuras 3A y 3B). EJEMPLO 2 Para determinar la eficacia del péptido de señal aislado de células PVD-32 en la producción de bacteriocina OR-7, se cultivaron células PVD-32 en frascos con aproximadamente 300 mi de aproximadamente 10% de Caldo de Brúcela. Se agregaron aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula PVD-32 que contiene aproximadamente 109 CFU/ml al caldo, aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula LWP 252 de cepa inductora que contiene aproximadamente 109 CFU/ml, y también se agregaron aproximadamente 0.10 mg/ml, 0.01 mg/ml ó 0.001 mg/ml de péptido de señal PVD 32. Una muestra de control no contuvo el péptido de señal. Algunas muestras contenían las diferentes concentraciones de péptido de señal y la cepa productora, sin cepa inductora. Dos muestras contenían 0.1 mg/ml de péptido de señal de LWP 760 ó 0.1 mg/ml de péptido de señal de LWP-50-52, ambas con las cepas ¡nductoras y productoras. Los frascos fueron cultivados a una temperatura de aproximadamente 37°C durante aproximadamente 14 horas utilizando una velocidad de agitación de aproximadamente 120 rpm. Los resultados se resumen más adelante en la Tabla 2. Al final de las 14 horas, el sobrenadante de los cultivos fue colocado en frascos de centrifugación de 500 mi con aproximadamente un mililitro de Flujo Rápido Sefarosa SP regenerado (v/v 500:1). Esto se incubó durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Posteriormente la suspensión se lavó con aproximadamente 100 mi de un amortiguador 0.2 M TRIS-HCI con pH aproximadamente 6.4. Las bacteriocinas fueron eluídas mediante centrifugación con aproximadamente 100 mi de aproximadamente 0.2 M K2HP04, pH de aproximadamente 5.8 en aproximadamente 7,000 X g durante aproximadamente 10 minutos. La actividad antagónica de las fracciones de bacteriocina contra C. jejuni y S. enteritidis fue evaluada utilizando una Prueba de Mancha tal como se describe anteriormente. El nivel de pureza de las fracciones de bacteriocina fue determinado mediante SDS-PAGE. Los puntos isoeléctricos de las fracciones fueron determinados mediante enfoque isoeléctrico. Las concentraciones de proteína para cada fracción de bacteriocina fueron determinadas en 215 nm utilizando un espectrofotómetro. Los resultados se presentan en la Tabla 2 que se encuentra más adelante. Tal como se aprecia en la Tabla 2, el cultivo de PVD-32 (Productor) con LWP-252 (inductor) en la presencia de aproximadamente 0.01 mg del péptido de señal purificado de PVD-32, incrementa el rendimiento de bacteriocina OR-7 hasta aproximadamente 214.5 mg a partir de un litro de fluido de cultivo. La adición de los péptidos señal aislados de las cepas LWP 50-52 y LWP 760, no incrementa el rendimiento de la bacteriocina OR-7 versus el control. Esto señala el hecho de que el péptido de señal es fuertemente específico hacia el productor. La síntesis de la bacteriocina incrementa cuando el péptido de señal, productor e inductor se introducen en forma simultánea en un fluido de cultivo. Para evaluar el efecto del péptido de señal en la producción de bacteriocina bajo cultivo escalado, se crecieron cepas de producción e inducción en un bioreactor aproximadamente con seis litros de cultivo. La proporción de concentraciones de cultivos y péptido de señal fue de 109 CFU/ml de PVD-32 (cepa productora), 109 CFU/ml LWP-252 (cepa inductora) y 0.01 mg/ml de péptido de señal purificado procedente de PVD-32. La bacteriocina OR-7 fue aislada después de aproximadamente 8, 10, 12 y 14 horas de cultivo. Ver Tabla 3. El esquema de purificación es tal como se describe anteriormente. Los experimentos se repitieron tres veces.

Tabla 2. Influencia de péptido de señal aislado de PVD-32 en producción de bacteriocina OR-7.

Tabla 3. Cultivo de cepa productora PVD-32 y cepa inductora LWP-252 en la presencia del Péptido de Señal PVD-32 bajo condiciones de escalado.

Control: V-61 bioreactor, 10% Caldo de Brúcela, PVD-32, LWP-252, en pH 6.9, 37°C, 150 r.p.m., cultivo 14 horas. Péptido de señal: reactor V-61.10% Caldo de Brúcela, PVD-32, LWP-252, Péptido de Señal PVD-32-0.2 mg, pH 6.9, 37°C, 150 r.p.m., 14 horas de cultivo El cultivo simultáneo PVD-32 (Cepa de Producción) y LWP-252 (Cepa de Inducción) en la presencia del péptido de señal específico aislado de PVD-32, permite la producción de aproximadamente 214 + 225 miligramos de bacteriocina OR-7 por litro de fluido de cultivo. EJEMPLO 3 Para Determinar la eficacia del péptido de señal aislado de LWP 50-52 en la producción de bacteriocina 50-52, se cultivó LWP 50-52 a una temperatura de 37°C, tal como se describió en el Ejemplo 2. Aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula LWP 50-52 que contiene aproximadamente 109 CFU/ml fue agregada al 10% de caldo de Brúcela, aproximadamente 109 CFU/ml de cepa inductora LWP-320 fue agregada al caldo, y también se agregaron aproximadamente 0.10 mg/ml, 0.01 mg/ml ó 0.001 mg/ml de péptido de señal LWP 50-52. Una muestra de control no tenía el péptido de señal. Algunas muestras contenían las diferentes concentraciones de péptido de señal y la cepa productora sin cepa ¡nductora. Dos muestras contenían ya sea 0.10 mg/ml de péptido de señal procedente de LWP 760, o 0.10 mg/ml de péptido de señal procedente de PVD-32 con las cepas tanto inductoras como productoras. Los frascos fueron cultivados a una temperatura de aproximadamente 37°C durante aproximadamente 14 horas utilizando una velocidad de agitación de aproximadamente 120 RPM. Los resultados se resumen más adelante en la Tabla 4. El aislamiento de bacteriocina 50-52 implicó dos pasos: (1) el aislamiento de bacteriocina del sobrenadante del fluido de cultivo y (2) el aislamiento de bacteriocina del precipitado de células de las cepas tanto de inducción como de producción. En el paso 1, los cultivos fueron recolectados y separados mediante centrifugación a aproximadamente 10,000 X g durante aproximadamente 15 minutos para precipitar las células. El sobrenadante fue aplicado a una columna de Flujo Rápido Octilo Sefarosa 4 para recuperar la bacteriocina utilizando un amortiguador de elución de aproximadamente 20 mM de amortiguador K2HP04, pH aproximadamente 7.0. El precipitado celular del paso 2 fue suspendido en un amortiguador de fosfato con aproximadamente 0.7% NaCI, pH aproximadamente 5.6 (amortiguador de elución) y la suspensión fue mezclada e incubada durante aproximadamente 20 minutos. Después de la incubación, la suspensión fue centrifugada en aproximadamente 10,000 X g durante aproximadamente 15 minutos. La bacteriocina fue aislada del sobrenadante utilizando cromatografía de intercambio de iones en Flujo Rápido Superosa SP utilizando un amortiguador de elución que contiene aproximadamente 10 mM Tris HCI y aproximadamente 125 mM NaCI, pH aproximadamente 7.5. Se evaluaron las actividades antagónicas de las fracciones de bacteriocina contra C. jejuni y S. enteritidis en una Prueba de Mancha. Se determinó el nivel de pureza de las bacteriocinas mediante SDS-PAGE. Los puntos isoeléctricos de las fracciones fueron determinadas utilizando isoelectroenfoque. Las concentraciones de proteína para todas fracciones de bacteriocina fueron determinadas en aproximadamente 215 nm utilizando un método espectrofotométrico. Tabla 4. Influencia de péptido de señal aislado de LWP 50-52 en producción de bacteriocina 50-52.

Tal como se aprecia a partir de la Tabla 4, el cultivo simultáneo de LWP 50-52 (Cepa Productora) y LWP 320 (Cepa Inductora) en la presencia de aproximadamente 0.01 mg/ml del péptido de señal de LWP 50-52 durante aproximadamente 8 horas incrementa el rendimiento de bacteriocina 50-52 hasta aproximadamente 353.1 mg a partir de 1 litro de fluido de cultivo. La adición de péptidos de señal aislados de PVD-32 y LWP 760 no incrementó el rendimiento de bacteriocina 50-52 versus el control. Deberá observarse que la síntesis de la bacteriocina incrementa en forma máxima si el péptido de señal es inducido en el fluido de cultivo aproximadamente 2 horas después del comienzo del cultivo con un tiempo de cultivo total de aproximadamente 12 horas. Para evaluar la influencia del péptido de señal en la producción de bacteriocina bajo cultivo escalado, las cepas de producción e inducción se crecieron en un bioreactor de V-6 litros que contiene aproximadamente 6 litros de medio. La proporción de concentraciones de cultivos y el péptido de señal se mantuvo como en la Tabla 5 para condiciones de 10% de Caldo de Brúcela, LWP 50-52, LWP 320, 0.01 mg/ml de péptido de señal LWP 50-52 agregado después de aproximadamente 2 horas de cultivo. El aislamiento de la bacteriocina, se llevó a cabo aproximadamente 8, 10, 12 y 14 horas de cultivo tal como se describe anteriormente. El control contuvo 10% de Caldo de Brúcela, LWP 50-52, LWP 320, en un pH de aproximadamente 6.9, a una temperatura de aproximadamente 37°C y aproximadamente 150 rpm. La bacteriocina 50-52 fue aislada después de aproximadamente 12 horas de cultivo. Para la segunda condición, las condiciones fueron las mismas excepto que se agregaron aproximadamente 0.22 mg del péptido de señal LWP 50-52 después de 2 horas de cultivo. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 5. Cada condición se repitió tres veces. Tabla 5. Cultivo de Cepa Productora LWP 50-52 v Cepa Inductora LWP-320 en la presencia de Péptido de Señal LWP 50-52.

El cultivo de LWP 50-52 con LWP-320 en la presencia del péptido de señal LWP 50-52 se introdujo a aproximadamente 2 horas después del comienzo del cultivo, los resultados en la producción de aproximadamente 360 mg/litro de bacteriocina 50-52, se obtuvieron después de aproximadamente 2 horas de cultivo.

EJEMPLO 4 Para determinar la eficacia del péptido de señal aislado de LWP-760 para la producción de bacteriocina 760, se cultivó LWP-760 a una temperatura de aproximadamente 37°C tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. Se agregaron aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula LWP-760 que contiene aproximadamente 109 CFU/ml, a aproximadamente 10% de caldo de Brúcela, y se agregaron aproximadamente 1 mi de una preparación de 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ó 0.001 mg/ml de péptido de señal LWP-760 ya sea en el momento del cultivo o aproximadamente a las 2, 4 ó 6 horas después del inicio del cultivo. Para otro grupo de variables, se agregaron aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula LWP-760 que contiene aproximadamente 109 CFU/ml aproximadamente a 10% de caldo de Brúcela, se agregaron al caldo aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula LWP-320 de cepa inductora que contiene aproximadamente 109 CFU/ml, y se agregaron aproximadamente 1 mi de una preparación de 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ó 0.001 mg/ml de péptido de señal LWP-760 ya sea al momento de cultivo o aproximadamente a las 2, 4 ó 6 horas después del inicio del cultivo. El siguiente grupo de condiciones incluyó aproximadamente 1 mi de una suspensión celular LWP-760 que contiene aproximadamente 109 CFU/ml que se agregó aproximadamente al 10% de caldo de Brúcela, aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula LWP-320 de cepa inductora que contiene aproximadamente 109 CFU/ml que se agregó al caldo y se agregaron al inicio del cultivo aproximadamente 1 mi de una preparación de aproximadamente 0.1 mg/ml de péptido de señal LWP-50-52 o péptido de señal PVD-32 purificado. El control tuvo aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula LWP-760 que contiene aproximadamente 109 CFU/ml, y aproximadamente 1 mi de una suspensión de célula LWP-320 de cepa inductora que contiene aproximadamente 109 CFU/ml en 10% de caldo de Brúcela. Se aisló la bacteriocina 760 utilizando centrifugación para separar la célula y el fluido de cultivo en aproximadamente 10,000 X g durante aproximadamente 15 minutos. El sobrenadante fue aplicado a una columna de Flujo Rápido Octilo Sefarosa 4 para recuperar la bacteriocina y se eluyó con aproximadamente 15 mM de amortiguador de elución K2HP0 en un pH de aproximadamente 6.3. Se suspendió el pelet celular en amortiguador de fosfato que contiene aproximadamente 0.7% NaCI, pH aproximadamente 5.6 (amortiguador de elución) y la suspensión se mezcló e incubó durante aproximadamente 20 minutos. Después del período de incubación, la suspensión se centrífugo en aproximadamente 10,000 X g durante aproximadamente 15 minutos. El sobrenadante se aplicó a una columna de Flujo Rápido Superosa SP para aislar la bacteriocina utilizando un amortiguador de elución que contiene aproximadamente 25 mM Tris HCI y aproximadamente 90 mM NaCI a un pH de aproximadamente 6.4. Las actividades antagónicas de las fracciones de bacteriocina contra C. jejuni y S. enteritidis fueron evaluadas en una Prueba de Mancha tal como se describió anteriormente. El nivel de pureza de bacteriocina 760 fue determinado mediante SDS-PAGE. El punto isoeléctrico fue determinado utilizando enfoque isoeléctrico. Las concentraciones de proteína fueron determinadas en aproximadamente 215 nm utilizando un método espectrofotométrico. Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 6. Tabla 6. Influencia de Péptido de Señal LWP-760 en la Producción de Bacteriocina 760.

Tal como se aprecia en la Tabla 6 anterior, el cultivo de la cepa inductora LWP 760 con la cepa inductora 320 y aproximadamente 0.01 mg del péptido de señal de LWP 760 en 4 horas de cultivo, incrementa el rendimiento de bacteriocina 760 hasta aproximadamente 693 mg a partir de un litro de fluido de cultivo. La introducción de los péptidos de señal de PVD 32 y LWP 50-52 no incrementó el rendimiento de la producción de bacteriocina 760 versus control. Para evaluar el efecto del péptido de señal en la producción bacteriocina bajo condiciones de escalado, se crecieron LWP 760 y LWP 320 en un bioreactor de V-6 litros con aproximadamente 6 litros de 10% de caldo de Brúcela. La proporción de concentraciones de cultivos y el péptido de señal se mantuvo para la condición que produjo 510 mg/litro de bacteriocina 760 en la Tabla 7 que se encuentra a continuación. La bacteriocina 760 se aisló aproximadamente 8, 10 12 y 14 horas después del cultivo. La producción máxima de bacteriocina ocurrió después de 12 horas de cultivo (Tabla 7 que se encuentra a continuación). Tabla 7. Cultivo de cepa productora LWP 760 y cepa inductora LWP 320 en la presencia de un Péptido de Señal LWP bajo condiciones de escalado.

Control: bioreactor V-61 , 10% Caldo de Brúcela, LWP 760, LWP 320, en pH 6.9, 37°C, 150 r.p.m., 12 horas de cultivo. Péptido de señal: reactor V-61, 10% Caldo de Brúcela, LWP 760, LWP 320, LWP 760 Péptido de Señal-0.22 mg, agregado después de dos horas de cultivo, pH 6.9, 37°C, 150 r.p.m., 12 horas de cultivo.

EJEMPLO 5 Las secuencias de aminoácido para los péptidos de señal fueron determinadas mediante degradación Edman utilizando un Secuenciador Automático 491 cLC (Applied Biosystems, La Jolla, Calif.) según las instrucciones del fabricante. La determinación de la masa molecular de cada péptido de señal se llevó a cabo mediante desorpcion láser ayudada con matriz y tiempo de ionización de espectrometría de masa de vuelo (MALDI-TOFMS) con un espectrómetro de masa de ionización de electrorocío (API IIITAGA 6000E, CJEX, Mumbai, India) según las instrucciones de los fabricantes. Los resultados se muestran en la Tabla 8 que se encuentra a continuación. Tabla 8. Secuencias de aminoácido de bacteriocinas OR-7, LWP 760 y sus péptidos de señal La descripción detallada anterior es únicamente con propósitos de ilustración. Los detalles son únicamente con dicho propósito y los expertos en la técnica podrán realizar variaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES 1. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácido carboxi terminal de SEQ ID NO 1. 2. Un péptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO
2. 2.
3. 3. Un péptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 5.
4. 4. Un péptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 7.
5. 5. Un método para incrementar la producción de una bacteriocina, en donde el método comprende: a. agregar una bacteria de producción de bacteriocina con una bacteria inductora a un sistema de cultivo, b. agregar un péptido que tiene una secuencia de aminoácido carboxi terminal de SEQ ID NO 1, y c. cultivar la bacteria con el péptido durante un tiempo para lograr la producción incrementada de la bacteriocina.
6. 6. Un método para estimular la producción de bacteriocina que tiene SEQ ID NO 2, caracterizado porque comprende: a. agregar la línea celular de producción de bacteriocina NRRL-B-30514 con la línea celular inductora NRRL 30884 a un sistema de cultivo, b. agregar un péptido que tiene SEQ ID NO 3, y c. cultivar la bacteria con el péptido durante un tiempo para lograr la producción incrementada de la bacteriocina.
7. 7. Un método para estimular la producción de una bacteriocina que tiene SEQ ID NO 4, caracterizado porque comprende: a. agregar una línea celular de producción de bacteriocina NRRL B-30746 y una línea celular inductora NRRL B-30510 30884 a un sistema de cultivo, b. agregar un péptido que tiene SEQ ID NO 5 al sistema, y c. cultivar la bacteria y el péptido durante un tiempo para lograr la producción incrementada de dicha bacteriocina.
8. 8. Un método para estimular la producción de bacteriocina que tiene SEQ ID NO 6, caracterizado porque comprende: d. agregar la línea celular de producción de bacteriocina NRRL B-30745 con la línea celular inductora NRRL B-30510 a un sistema de cultivo, e. agregar un péptido que tiene SEQ ID NO 7, y f. cultivar la bacteria con el péptido durante un tiempo para lograr la producción incrementada de la bacteriocina.
9. 9. Un método para estimular la producción de bacteriocina que tiene SEQ ID NO 2, caracterizado porque comprende: a. agregar la línea celular de producción de bacteriocina NRRL-B-30514 con la línea celular inductora NRRL 30884 a un sistema de cultivo, b. agregar un péptido que tiene una secuencia de aminoácido carboxi terminal de SEQ ID NO 1, y c. cultivar la bacteria con el péptido durante un tiempo para lograr la producción incrementada de la bacteriocina.
10. 10. Un método para estimular la producción de una bacteriocina que tiene SEQ ID NO 4, caracterizado porque comprende: g. agregar la línea celular de producción de bacteriocina NRRL B-30746 y la línea celular inductora NRRL B- 30510 a un sistema de cultivo, h. agregar un péptido que tiene una secuencia de aminoácido carboxi terminal de SEQ ID NO 1 al sistema, y i. cultivar la bacteria y péptido durante un tiempo para lograr la producción incrementada de la bacteriocina.
11. 11. Un método para estimular la producción de una bacteriocina que tiene SEQ ID NO 6, caracterizado porque comprende: j. agregar la línea celular de producción de bacteriocina NRRL B-30745 con la línea celular inductora NRRL B-30510 a un sistema de cultivo, k. agregar un péptido que tiene una secuencia de aminoácido carboxi terminal de SEQ ID NO 1, y I. cultivar la bacteria con el péptido durante un tiempo para lograr la producción incrementada de la bacteriocina.