ES2286038T3

ES2286038T3 - Lantibiotico.

Info

Publication number: ES2286038T3
Application number: ES00970338T
Authority: ES
Inventors: John Robert Tagg; Karen Patricia Dierksen; Mathew Upton
Original assignee: BLIS Technologies Ltd
Current assignee: BLIS Technologies Ltd
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2020-10-12
Also published as: DK1169340T3; DE60034879T2; RU2279481C2; US6773912B1; ATE362481T1; EP1169340B1; HK1039622B; AU7973700A; CA2363713C; WO2001027143A1; US20040232205A1; DE60034879D1; CA2363713A1; EP1169340A4; JP2003516123A; BR0014740A; NO20013905L; PL206441B1; HK1039622A1; JP3673497B2

Abstract

Proteína antibacteriana que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 3.

Description

Lantibiótico.

La presente invención se refiere a lantibióticos, organismos que producen tales lantibióticos, y a las utilizaciones tanto de los organismos como de los lantibióticos producidos a partir de los mismos.

Antecedentes

La infección bacteriana en seres humanos es un problema tanto de preocupación personal considerable como de importancia económica en el campo de la sanidad.

Las infecciones por estreptococos son particularmente frecuentes provocando dolencias que comprenden desde caries dental e infecciones de garganta menores hasta enfermedades graves tales como escarlatina, fiebre reumática y glomerulonefritis aguda.

Con el fin de reducir la incidencia de infecciones por estreptococos, se desea controlar o evitar el crecimiento de las bacterias causantes perjudiciales. Un enfoque hacia esto es proporcionar bacteriocinas y sustancias similares (incluyendo lantibióticos) activas contra los estreptococos y organismos que pueden producir tales sustancias, que son adecuadas para su utilización para controlar o evitar el crecimiento de bacterias estreptococos perjudi-
ciales.

Se conocen varias bacteriocinas. Se facilitan ejemplos de bacteriocinas derivadas de bacterias Gram positivas en Tagg et al., (1976). Bacteriol Rev. Vol. 40, págs. 722-756. Ejemplos adicionales de tales bacteriocinas son lacticina 481 de Lactobacillus lactis (Piard et al., (1992), Applied and Environmental Microbiology, Vol. 58, págs. 279-284), variacina de Micrococcus varians (documento US nº 5.981.261) y las bacteriocinas de Streptococcus thermophilus descritas en el documento EP 0643136.

En Kalmokoff et al., (1999), Applied and Environmental Microbiology, vol 65, nº 5, págs. 2128-2135 se describe el lantibiótico butirivibriocina OR79A.

Desde hace tiempo también se ha sabido que Streptococcus salivarius tiene una alta incidencia de producción de lantibiótico (Dempster RP et al. (1982) Arch Oral Biol 27:151). Un lantibiótico que se ha caracterizado a partir de S. salivarius es salivaricina A (Ross et al. (1993) Appl Envir Microbiol 59:2014). Sin embargo, aunque se demostró actividad inhibidora frente a varias especies de estreptococos, la actividad era bacteriostática en vez de bactericida. Por tanto, la salivaricina A y los organismos que la producen no proporcionan una respuesta completa para controlar las infecciones por estreptococos.

Los solicitantes han identificado ahora una proteína antibacteriana adicional de S. salivarius. Esta proteína, que los solicitantes han encontrado que presenta eficacia bactericida en vez de ser simplemente bacteriostática, es el enfoque principal de la presente invención.

Sumario de la invención

En un aspecto de la presente invención se proporciona una proteína antibacteriana que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 3.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una proteína antibacteriana que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de la SEC ID nº 3 en la inserción, deleción o sustitución de desde uno hasta tres aminoácidos.

En un aspecto adicional se proporciona una composición antibacteriana que incluye una proteína de la presente invención o un organismo que expresa una proteína de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una formulación terapéutica que comprende:

(i): una proteína de la presente invención; o

(ii): un organismo que expresa una proteína de la presente invención, en combinación con un diluyente, vehículo y/o excipiente.

Se proporciona, en otro aspecto de la presente invención, un polinucleótido que codifica para una proteína de la presente invención.

En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un organismo aislado, que incluye un polinucleótido que codifica para una proteína de la presente invención que expresa una proteína antibacteriana según la presente invención.

Se proporciona, en un aspecto adicional de la presente invención, un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de la SEC ID nº: 2.

Además, en otro aspecto de la presente invención se proporciona la cepa K12 de S. salivarius, depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, con el número de registro DSM 13084.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona la cepa K30 de S. salivarius depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, con el número de registro DSM 13085.

Se proporciona, en un aspecto adicional de la presente invención, una formulación terapéutica que incluye la cepa K12 de S. salivarius o la cepa K30 de S. salivarius según la presente invención.

Además, se proporciona en otro aspecto de la presente invención la utilización de una proteína según la presente invención en la preparación de una formulación terapéutica para al menos inhibir el crecimiento de bacterias estreptocócicas perjudiciales en las vías respiratorias superiores en la que la formulación terapéutica se formula para su administración oral.

En otro aspecto la presente invención proporciona una formulación terapéutica que contiene una proteína antibacteriana según la presente invención y una proteína antibacteriana salivaricina A2.

En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una formulación terapéutica que contiene por lo menos un organismo S. salivarius que expresa una proteína antibacteriana según la presente invención y por lo menos otro organismo S. salivarius que expresa una proteína antibacteriana salivaricina A2.

Por consiguiente, en un aspecto, puede decirse ampliamente que la presente invención está constituida por una proteína antibacteriana que puede aislarse de las cepas K12 y K30 de S. salivarius, que presenta una masa molecular de aproximadamente 2733 Da tal como se determina mediante espectrometría de masas por pulverización iónica, y la secuencia de aminoácidos N-terminal Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gln, o una variante de la misma o fragmento antibacteriano que presenta más del 80% de homología secuencia de aminoácidos con la proteína.

Los solicitantes han denominado la proteína de la invención "salivaricina B", facilitándose en la figura 2 las y secuencias de aminoácidos y nucleótidos completas, junto con las secuencias de una parte del péptido líder.

Convenientemente, la salivaricina B se obtiene mediante la expresión de una secuencia de ADN que codifica para la misma en una célula huésped o cultivando cepas productoras K12 o K30 de S. salivarius.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición antibacteriana que incluye una proteína tal como se definió anteriormente o un organismo que puede expresar una proteína tal como se definió anteriormente.

Todavía en un aspecto adicional, se proporciona una formulación terapéutica que comprende salivaricina B tal como se definió anteriormente o una variante de la misma o fragmento antibacteriano en combinación con un diluyente, vehículo y/o excipiente.

Aún en un aspecto adicional, se proporciona una formulación terapéutica que comprende un organismo que puede expresar salivaricina B tal como se definió anteriormente, o una variante de la misma o fragmento antibacteriano, en combinación con un diluyente, vehículo y/o excipiente.

Preferentemente, dicho microorganismo puede expresar salivaricina B sola o en combinación con un agente antibacteriano secundario.

Más preferentemente, dicho agente antibacteriano secundario es una BLIS; todavía más preferentemente salivaricina A2. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos completas para salivaricina A2 se facilitan en la figura 3, junto con las secuencias del péptido líder.

Convenientemente, dicho microorganismo se selecciona de entre las cepas K12 y K30 de S. salivarius.

En una todavía de realización particularmente preferida, las formulaciones terapéuticas están en forma de alimentos o bebidas, todavía más preferentemente en forma de alimentos o bebidas a base de productos lácteos.

Formas alternativas son medicamentos y productos de confitería.

Todavía en un aspecto adicional, la invención proporciona un organismo que expresa salivaricina B.

Preferentemente, dicho microorganismo se selecciona de las cepas de K12 y K30 S. salivarius.

\newpage

En la presente memoria se proporcionan procedimientos para tratar a un individuo para por lo menos inhibir el crecimiento de bacterias estreptocócicas perjudiciales en las vías respiratorias superiores comprendiendo la etapa que consiste en administrar una cantidad eficaz de salivaricina B por vía oral a dicho individuo.

Preferentemente, dicha salivaricina B se administra como parte de una composición terapéutica.

Convenientemente, en dicho procedimiento se provoca dicho efecto inhibidor colonizando al menos parte de las vías respiratorias superiores de un individuo con un organismo no patógeno viable que expresa salivaricina B.

Preferentemente, dicho organismo se administra como parte de un alimento o bebida.

Más preferentemente, dicho microorganismo es una cepa de S. salivarius seleccionada de las cepas K12 y K30.

Aún en una forma de realización adicional, dicho procedimiento incluye una etapa preliminar de tratar previamente a dicho individuo para al menos reducir la población bacteriana presente en las vías respiratorias superiores.

Preferentemente, dicho tratamiento previo comprende la etapa de administrar un antibiótico, preferentemente eritromicina, por vía oral a dicho individuo.

Aún en una forma de realización adicional, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un paciente frente a infecciones de las vías respiratorias superiores provocadas por organismos estreptocócicos comprendiendo las etapas siguientes:

(i): administrar por vía oral a dicho paciente una cantidad de un antibiótico eficaz para reducir el número de estreptococos presentes; y

(ii): administrar, al entorno despoblado de bacterias resultante, organismo(s) de S. salivarius que producen BLIS para repoblar dicho entorno.

Aunque la invención es amplia tal como se describió anteriormente, los expertos en la materia apreciarán que la invención no se limita a ello, sino que también incluye realizaciones de las que la siguiente descripción facilita ejemplos, junto con los aspectos completamente definidos en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

Descripción de los dibujos

Puede hacerse referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1 muestra las características estructurales de la salivaricina B;

la figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos y nucleótidos para la salivaricina B, incluyendo parte del péptido líder; y

la figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos y nucleótidos para la salivaricina A2, incluyendo la del péptido líder.

Descripción de la invención

Las BLIS (sustancias inhibidoras similares a bacteriocina) son proteínas o péptidos bacterianos liberados extracelularmente que en bajas concentraciones pueden destruir otras bacterias estrechamente relacionadas determinadas mediante un mecanismo frente al que la célula productora muestra un grado de inmunidad específico.

El término lantibiótico es un término derivado de antibióticos que contienen lantionina (Schnell et al. Nature 333:276, 1988). Los lantibióticos son una categoría de BLIS. Los lantibióticos se sintetizan ribosómicamente como prelantibióticos, que presentan una extensión N-terminal (péptido líder) que se elimina por escisión mediante una enzima de tratamiento durante la formación de la forma madura (forma biológicamente activa) de la molécula. Un rasgo característico es que éstos son polipéptidos policíclicos que contienen lantionina y/o \beta-metil-lantionina, que forman puentes tioéter dentro de la cadena peptídica. Se ha propuesto una clasificación de los lantibióticos actualmente notificados en dos tipos, A y B, por Jung en Angewandte Chemie 30:1051-1192, 1991.

Investigaciones previas por el solicitante localizaron varias cepas de Streptococcus salivarius productoras de BLIS con actividad frente a otros estreptococos. Se aisló la BLIS producida por una cepa, (cepa 20P3), se purificó parcialmente y se realizó una caracterización preliminar. Esta caracterización preliminar indicó que la BLIS producida era una proteína relativamente termoestable, de masa molecular en el intervalo de 3500 a 8000 Da. A la BLIS se le dio el nombre de SAL 20P3.

Investigaciones posteriores obtuvieron la secuencia de aminoácidos de SAL 20P3, junto con su masa molecular. Al lantibiótico identificado específicamente se le dio el nuevo nombre de salivaricina A (Ross et al., Appl. Envir. Microbiol 59:2014).

La BLIS de la presente invención es distinta de la salivaricina A. Esta distinción es tanto con respecto a su masa molecular (2733 Da comparado con 2316 Da para la salivaricina A) como con respecto a su secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la figura 2. Las salivaricinas A y B también son distintas con respecto a su actividad inhibidora. Específicamente, mientras que se ha encontrado que la salivaricina A es eficaz como agente bacteriostático frente a la mayoría de cepas de Streptococcus pyogenes, se ha determinado que la salivaricina B es bactericida. De manera más importante, todavía no se han detectado cepas de S. pyogenes que sean resistentes frente a la salivaricina B.

La salivaricina B se expresa por las cepas K12 y K30 de S. salivarius. Las cepas K12 y K30 de S. salivarius se depositaron en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 8 de octubre de 1999. A la cepa K12 se le ha asignado el número de registro DSM 13084, mientras que a la cepa K30 se le ha asignado el número de registro DSM 13085.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a la proteína antibacteriana, salivaricina B. También se proporcionan fragmentos o variantes de salivaricina B en los que éstos muestran equivalencia funcional.

Adicionalmente se apreciará que pueden introducirse modificaciones en la secuencia de aminoácidos nativa tanto de la proteína y como de los fragmentos activos de la misma mientras que todavía se conserva su actividad biológica por lo menos sustancialmente. Tales modificaciones en la secuencia de aminoácidos nativa para dar como resultado la inserción, sustitución o deleción de uno, dos o tres aminoácidos, están específicamente dentro del alcance de esta invención, siempre que las proteínas variantes presenten o incluyan una secuencia que sea homóloga en más del 80% con la secuencia de aminoácidos de la salivaricina B nativa.

Se entenderá, por supuesto, que es posible una variedad de sustituciones de aminoácidos mientras que todavía se consigue esto. En la bibliografía de patentes se describen sustituciones conservativas, tal como por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos nº 5.264.558 ó nº 5.487.983. Por tanto, se espera, por ejemplo, que se realizará posiblemente el intercambio entre aminoácidos neutros alifáticos no polares, glicina, alanina, prolina, valina e isoleucina. De la misma manera, podrán realizarse probablemente sustituciones entre los aminoácidos neutros alifáticos polares, serina, treonina, metionina, asparagina y glutamina. Probablemente podrán realizarse sustituciones entre los aminoácidos ácidos cargados, ácido aspártico y ácido glutámico, así como sustituciones entre los aminoácidos básicos cargados, lisina y arginina. También serán posibles probablemente sustituciones entre los aminoácidos aromáticos, incluyendo fenilalanina, histidina, triptófano y tirosina. Los expertos en la materia conocen bien estos tipos de sustituciones e intercambios. Otras sustituciones pueden ser bastante posibles. Por supuesto, también se espera que cuanto más supere el porcentaje de homología, es decir, similitud de secuencia, de una proteína variante con una proteína que se produce de manera natural, el umbral del 80%, mayor será la retención de la actividad.

La proteína y los fragmentos descritos en la presente memoria pueden prepararse de una variedad de maneras. Por ejemplo, mediante aislamiento a partir de una fuente natural (tal como las cepas K12 y/o K30 de S. salivarius), mediante síntesis utilizando cualquier técnica conocida adecuada (tal como se describe para la síntesis de nisina por Wakamiya et al., (1991) en "Nisin and Novel Lantibiotics" ed. G. Jung y H. G Shal, 189-203, Escom, Leiden o mediante síntesis en fase sólida tal como se describe por Merrifield (1964) J. Am. Chem. Assoc. 85, 2149-2154, o mediante síntesis en disolución homogénea tal como se describe por Houbenwycl (1987), Methods of Organic Chemistry, Vol I y II) o empleando técnicas de ADN recombinante tal como se describe por Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, Nueva York, USA.

Las variantes tanto de la proteína nativa como de sus fragmentos activos pueden producirse de manera similar mediante cualquiera de las técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse variantes mediante mutagénesis específica del sitio del ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos nativa tal como se describe por Adelman et al., DNA 2, 183 (1983).

Cuando se utiliza metodología recombinante para producir la BLIS, como primera etapa es necesario obtener el ADN que codifica para el producto deseado. Tal ADN comprende también un aspecto de esta invención.

La secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica para salivaricina B se muestra en la figura 2.

El ADN mencionado en la presente memoria puede codificar para la proteína nativa o un fragmento activo de la misma.

El ADN puede aislarse de, por ejemplo, cepas K12 y K30 de S. salivarius utilizando sondas y/o cebadores de amplificación basados en la secuencia de nucleótidos determinada de salivaricina B. El ADN identificado de este modo puede producirse como ADNc libre de intrones utilizando técnicas convencionales. El ADN puede producirse también en forma de oligonucleótidos sintéticos cuando el tamaño de los fragmentos activos lo permita, por ejemplo, utilizando el procedimiento de fosfotriéster de Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981. Todavía adicionalmente, el ADN puede producirse utilizando un sintetizador de ADN comercialmente disponible, tal como el sintetizador de ADN de Applied BioSystems.

Las variantes de la proteína y sus fragmentos que difieren de las secuencias de aminoácidos nativas en la inserción, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos, también se contemplan en la presente memoria. Cuando se desea una variante de este tipo, se altera de manera apropiada la secuencia de nucleótidos del ADN nativo. Esta alteración puede realizarse mediante síntesis electiva del ADN o mediante modificación del ADN nativo mediante, por ejemplo, mutagénesis por casete o específica del sitio.

Preferentemente, cuando las partes de ADNc o ADN genómico requieren modificaciones de secuencia, se emplea mutagénesis dirigida por cebadores específica del sitio. Esta técnica es ahora convencional en la materia.

Una vez obtenido, el ADN modificado se trata para ser adecuado para la inserción en el vector de expresión y/o clonación apropiado. Para este fin, se escinde, se adapta y vuelve a ligarse según sea necesario.

La escisión se realiza mediante el tratamiento con enzimas de restricción en un tampón adecuado. Puede utilizarse cualquiera del gran número de enzimas de restricción comercialmente disponibles de la manera especificada por el fabricante. Tras la escisión, se recupera el ácido nucleico mediante, por ejemplo, precipitación con etanol.

La adaptación del ADN escindido se realiza utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, si se requieren extremos romos, el ADN puede tratarse con ADN polimerasa 1 (Klenow), extraerse con fenol y cloroformo, y precipitarse mediante etanol.

El nuevo ligamiento puede realizarse proporcionando cantidades aproximadamente equimolares de los componentes deseados, adaptados de manera apropiada para un apareamiento correcto, y tratamiento con una ligasa apropiada (por ejemplo ADN ligasa de T_{4}).

La molécula de ADN obtenida de este modo se inserta en un vector de clonación en una posición que permite que se exprese el producto proteico para el que codifica.

Pueden construirse vectores de clonación adecuados según técnicas bien conocidas, o pueden seleccionarse del gran número de vectores de clonación disponibles en la materia. Mientras que este vector de clonación seleccionado puede variar según la célula huésped que se pretende utilizar para expresar el ADN que codifica para BLIS, los vectores de clonación útiles presentarán generalmente las siguientes características:

(i): la capacidad de autorreplicación;

(ii): presentación de un único objetivo para cualquier endonucleasa de restricción particular; y

(iii): de manera deseable, genes portadores para un marcador que puede seleccionarse fácilmente tal como resistencia frente a antibióticos.

Dos tipos principales de vectores de clonación que presentan las características mencionadas anteriormente son plásmidos y virus bacterianos (bacteriófagos o fagos). Ejemplos de vectores de clonación adecuados incluyen pUC18, Mp18, Mp19, pRB322, pMB9, ColE1, y pCR1 de E. coli; plásmidos de amplio espectro de huésped incluyendo RP4, ADN de fago, tales como lambda y M13 y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28.

Para la expresión del ADN que codifica para BLIS en el huésped, el vector de clonación también debe incorporar una secuencia de control de la expresión. Puede describirse una secuencia de control de la expresión típica con respecto a cinco elementos. En el orden en el que éstos aparecen en el gen, los elementos son tal como sigue:

(a): la región promotora;

(b): la región no traducida en el sentido de 5' (secuencia líder o señal);

(c): la secuencia que codifica para la proteína;

(d): la región no traducida en el sentido de 3'; y

(e): la región de terminación de la transcripción.

Se reconoce bien la función de cada uno de estos elementos.

Puede utilizarse cualquiera de un amplio intervalo de tales secuencias de control incluyendo, por ejemplo, las del gen de la lipoproteína, el gen de la \beta-galactosidasa, el gen del triptófano, el gen de la \beta-lactamasa, y fago lambda.

Como elemento (c), la secuencia de ADN que codifica para el lantibiótico se inserta en la secuencia de control del vector de clonación en la manera indicada anteriormente.

Entonces se selecciona un huésped apropiado en el que va a insertarse el vector de clonación. Huéspedes potencialmente útiles incluyen bacterias, levaduras, hongos, células vegetales, animales y de insectos. Generalmente se prefieren los huéspedes procariotas para la presente invención. Los huéspedes bacterianos que no provocan enfermedades son particularmente adecuados.

Los huéspedes bacterianos se seleccionan generalmente de entre las bacterias Gram positivas. Para su utilización en la presente invención se prefieren huéspedes Streptococcus.

Tal como se apreciará, en el sistema de huésped seleccionado, se utilizan vectores de plásmido que pueden contener sitios de replicación y secuencias de control derivadas de una especie compatible con el huésped.

El vector de clonación formado tal como anteriormente se utiliza para transformar el huésped seleccionado utilizando de nuevo técnicas bien conocidas en la materia, por ejemplo, el tratamiento con cloruro de calcio tal como se describe por Cohen, S.N. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 2110, 1972.

Tras la transformación del huésped seleccionado con el vector de clonación, puede producirse la proteína o fragmento codificado, posiblemente como una proteína de fusión, cultivando las células huésped. El fragmento o producto de proteína exógena se aísla entonces usando procedimientos rutinarios que incluyen precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna (por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, de filtración en gel, de afinidad, etc.) electroforesis, y por último, cristalización (véase en general "Enzyme Purification and Related Techniques". Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1971)). La purificación se realiza si es necesario usando técnicas convencionales.

Cuando se emplea metodología recombinante, el ADN mencionado en la presente memoria también puede codificar para una proteína de fusión que comprende la proteína o fragmento antibacteriano y una proteína de vector para ayudar en el aislamiento y la purificación. Generalmente, esta proteína de vector puede escindirse química o enzimáticamente de la proteína o fragmento antibacteriano según técnicas conocidas.

También podría tener aplicación una forma quimérica específica de proteína. Una secuencia de ADN que codifica para cada proteína completa, o una parte de la proteína, puede unirse, por ejemplo, a una secuencia que codifica para otra BLIS tal como la salivaricina A2, de modo que la expresión de la secuencia de ADN produce una proteína quimérica con un espectro expandido de actividad antibacteriana.

Una vez purificada la proteína, está disponible para su utilización. Tales utilizaciones incluyen como agentes antibacterianos generales (por ejemplo, como conservante en alimentos) así como terapéuticamente. En este contexto, se apreciará que "terapéuticamente" incluye tratamiento profiláctico.

Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a formulaciones terapéuticas adecuadas para su utilización en el tratamiento o la prevención de infecciones microbianas, particularmente infecciones por estreptococos. Las formulaciones son particularmente adecuadas para su utilización frente a S. pyogenes y S. sobrinus. Estas formulaciones terapéuticas comprenden salivaricina B o un fragmento o variante de la misma en combinación con un diluyente, vehículo o excipiente para las mismas, tal como se conoce en la materia. Ejemplos de formulaciones terapéuticas en las que puede emplearse salivaricina B incluyen medicamentos que pueden administrarse por vía oral tales como cápsulas, pastillas para chupar, jarabes, enjuagues bucales, gargarismos, pastas de dientes, y aerosoles bucales pero no se limitan a los mismos. Ejemplos adicionales incluyen formulaciones que pueden administrarse por vía tópica tales como cremas hidratantes y cosméticos para combatir el crecimiento bacteriano sobre la piel.

En un aspecto adicional se proporciona una formulación terapéutica que comprende un organismo viable que no provoca enfermedades que puede colonizar las vías respiratorias superiores o una parte de las mismas y expresar el lantibiótico de la invención, en combinación con un vehículo, diluyente y/o excipiente.

En una forma de realización el microorganismo es un microorganismo huésped transformado producido según la invención. Se prefiere, sin embargo, que el microorganismo sea uno que produce salivaricina B como producto nativo. Ejemplos de tales microorganismos son las cepas K12 y K30 de S. salivarius.

Se ha determinado que las cepas K12 y K30 de S. salivarius expresan no solamente salivaricina B sino también salivaricina A2. La salivaricina A2 está relacionada con, pero no es idéntica a, la salivaricina A. Las secuencias completas (polinucleótidos y aminoácidos) para la salivaricina A2 se muestran en la figura 3.

En esta forma de realización, se prefiere que las formulaciones terapéuticas de la invención estén en forma de un alimento, producto de confitería o bebida. Se prefiere particularmente que el producto alimenticio o bebida sea un alimento o bebida a base de productos lácteos, incluyendo, a modo de ejemplo, yogur, queso, leche, galletas de leche y leches aromatizadas. En el caso de un producto de confitería, la formulación terapéutica puede ser un chicle tal como un chicle tal como se describe en el documento WO 00/05972.

Una formulación particularmente preferida es en la que se incluyen cepas liofilizadas de S. salivarius que producen salivaricina B en formulaciones de leche en polvo en una manera similar a la notificada previamente para la preparación de leche en polvo con bifidus (Nagawa et al. (1988); J Dairy Sci 71:1777-1782).

A continuación se ilustrarán diversos aspectos de la invención en un modo no limitativo mediante referencia a la siguiente sección experimental.

Parte experimental Extracción de salivaricina

Se purificó la salivaricina B a partir de cultivos en césped de las cepas K12 y K30 de S. salivarius de prueba que se hicieron crecer durante 18 horas a 37ºC en una atmósfera al 5% de dióxido de carbono en aire en medio M17 complementado con agar Davis al 0,5%, sacarosa al 0,5%, plasma humano al 0,5% y carbonato de calcio al 0,1%. Se inocularon los cultivos en césped untando sobre la superficie del medio agar de un caldo de cultivo Todd Hewitt de 18 horas a 37ºC de la cepa productora. La extracción de la actividad de salivaricina B se consigue congelando las placas de agar a -70ºC y luego descongelando a temperatura ambiente para hundir el gel de agar, seguido de la centrifugación para clarificar el líquido extraído. El título de la actividad inhibidora en estos extractos de congelación/descongelación es generalmente de 2-4 UA/ml.

Titulación de la actividad de salivaricina

Se titula la actividad de salivaricina usando un ensayo en superficie de agar. Se someten a ensayo gotas (20 \mul) de diluciones de dos veces de solución salina de la muestra frente a Microoccus luteus T-18 sobre base de agar Columbia. La inversa de la dilución más alta para producir una zona de inhibición definida del crecimiento del césped del indicador es el título en unidades arbitrarias por ml (Ua/ml) de actividad de salivaricina.

Purificación de salivaricina B

Se aplicó un volumen de dos litros de extracto congelado/descongelado a una columna XAD-2 (diámetro 5,0 cm, volumen del lecho 150 ml; Serva) y se lavó con 7 volúmenes del lecho de metanol al 50% (v/v). Se eluyó la actividad de salivaricina con 5 volúmenes del lecho de metanol al 90% (v/v) (ajustado hasta pH 2 con CH1 11,6 M) y se concentró mediante evaporación a 50ºC a presión reducida. Se aplicaron alícuotas (1 ml) de este material a una columna de fase inversa C8 Brownlee (Aquapore RP 300; tamaño de poro, 7 \mum; 30 por 4,6 mm; Applied Biosystems, Inc.), equilibrada con ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA). El fraccionamiento de este material se consigue usando un sistema de cromatografía de líquidos rápida de proteínas (FPLC) de Pharmacia a una velocidad de flujo de un ml por minuto usando un gradiente de 10 minutos (acetonitrilo del 0 al 28% que contenía TFA al 0,085%) seguido de elución isocrática de 80 minutos (acetonitrilo al 28%). Durante esta elución isocrática, se consigue la separación de fases de la salivaricina A (comenzando la elución aproximadamente a los 40 minutos) y la salivaricina B (comenzando aproximadamente a los 60 minutos). Se sometió a prueba cada fracción de 1 ml para determinar la actividad inhibidora frente a M. luteus T18. Se combinaron por separado las fracciones activas en cada región correspondientes a salivaricina A y salivaricina B como preparaciones parcialmente purificadas de las bacteriocinas. Se liofilizó cada combinación y luego se disolvió en TFA 0,1%. Luego se cargaron alícuotas de cada una de estas preparaciones en una columna C_{18} de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de fase inversa C_{18} (Alltech Nucleosil C_{18}; 10 \mum; 250,0 x 4,6 mm) equilibrada con TFA al 0,1% y se fraccionó adicionalmente usando un sistema de HPLC de Waters/Millipore mediante la aplicación de los gradientes apropiados de acetonitrilo.

Se eluyó la salivaricina A2 como un pico homogéneo con acetonitrilo al 34-35% y salivaricina B con acetonitrilo al 38-40%. Se monitorizó la absorbancia a 214 mm y se recogieron manualmente las fracciones correspondientes a los diversos picos. Se detectó la actividad inhibidora mediante prueba de difusión puntual usando M. luteus T-18 como el indicador. Se combinaron las fracciones activas de cada serie, se liofilizaron y volvieron a disolverse en 1 ml de agua purificada Milli Q^{TM} que contenía TFA al 0,1%. Se combinaron las fracciones que contenían actividad inhibidora (salivaricina purificada) y se almacenaron a -20ºC.

La espectrometría de masas por pulverización iónica indicó que la masa molecular de salivaricina B era 2733 Da. El análisis de Edman de la salivaricina B purificada reveló la secuencia N-terminal Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gln.

Clonación de la salivaricina B

La secuencia de aminoácidos derivada mediante la purificación y secuenciación del péptido, permitió el diseño de sondas de ADN de oligonucleótidos degenerados basadas en la utilización del codón universal. La sonda específica utilizada (CF481) se basaba en la secuencia de aminoácidos: S W Q F L F T. La secuencia de nucleótidos correspondiente era TCNTGGCAATTTTTRTTTACT.

Se aisló el ADN cromosómico de la cepa Min 5 de Streptococcus salivarius mediante el procedimiento de Spanier y Cleary (1983). (Virology 130:514-522). Se realizó una digestión usando las enzimas de restricción tanto de EcoRI como de HindIII, y luego se separó el ADN cortado en un gel de agarosa al 1% que pasa a 40 V/cm durante 18 horas (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989). Se transfirió el ADN a una membrana de nilón mediante transferencia de tipo Southern siguiendo las instrucciones para su utilización de Hybond-N+ (Amersham Pharmacia). Se marcó la sonda CF481 con gamma P^{32} ATP usando la polinucleótido cinasa de T4. Se llevó a cabo la hibridación con la sonda CF481 en un tubo de hibridación a 38ºC durante 18 horas. Se lavó la membrana dos veces durante 5 minutos en 5 x SSC, SDS al 0,5%, y luego dos veces durante 20 minutos en 2 x SSC, SDS al 0,2%. Luego se expuso la membrana a película de rayos X a -70ºC durante 18 horas.

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Se cortó del gel la zona del gel que corresponde al sitio de hibridación de CF481 en la transferencia de tipo Southern y se extrajo el ADN usando un kit de extracción en gel de Qiagen QIAquick. Para el ligamiento, se mezcló 1 \mul del vector pUC 19 que se había cortado con las enzimas de restricción de EcoR1 y HindIII, con 15 \mul de los fragmentos de ADN de Min5 limpios, 2 \mul de tampón de ligamiento, y 1 \mul de ADN ligasa de T4 (Roche). La incubación se realizó durante 18 horas a 15ºC. Se utilizó la cepa DH10\beta\beta de E. coli para la transformación mediante electroporación con el pUC 19 ligado. Se hicieron crecer las células transformadas durante 1 hora en 1 ml de caldo Luria, y luego se cultivaron en placas sobre agar de caldo Luria con ampicilina añadida (100 \mul/ml) y X-gal 20 mg/ml. Tras una incubación durante la noche a 37ºC, se seleccionaron colonias blancas, se subcultivaron y se seleccionaron con la sonda CF481. Se llevó a cabo la selección lisando las colonias de E. coli en una disolución de SDS al 5%, glicerol al 10% a 65ºC durante 30 minutos. Luego se hicieron pasaron las colonias en un gen de agarosa, se realizó la transferencia de tipo Southern, y se hibridó la membrana con la sonda CF481 de la misma manera que se describió anteriormente. Entonces se hicieron crecer las colonias positivas en caldo Luria con ampicilina 100 \mul/ml durante 18 horas a 37ºC con agitación. Entonces se extrajo el plásmido pUC 19 usando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenció utilizando cebadores directos e inversos de pUC 19.

Los resultados se muestran en la figura 2.

Actividad antibacteriana de la salivaricina B

Parte 1

Las cepas de S. salivarius tales como 20P3 y 5 que producen salivaricina A (pero no salivaricina B) inhiben las 9 bacterias indicadoras patrón distintas del indicador 3. Este patrón de inhibición en forma de código se conoce como producción (P) tipo 677. Por el contrario, las cepas K12 y K30 que producen tanto salivaricina A2 como salivaricina B inhiben el crecimiento de los 9 indicadores patrón, actividad denominada P-tipo 777. La prueba de tipificación P implica en primer lugar hacer crecer la cepa de prueba sobre agar sangre como cultivo en líneas diametrales. Tras eliminar este crecimiento, se esteriliza la superficie de agar con vapor de cloroformo, se airea y se cultivan en líneas cruzadas las 9 bacterias indicadoras patrón (incluyendo 4 cepas de Streptococcus pyogenes) a lo largo de la línea del inóculo de la cepa de prueba original. Tras la incubación, se toma la interferencia con el crecimiento de los indicadores en la proximidad de la línea productora original como indicativo de actividad de bacteriocina. En el caso de las cepas 20P3 y 5 (productoras de salivaricina A) puede mostrarse que la actividad inhibidora es bacteriostática, es decir, pueden recuperarse células indicadoras viables en grandes número de la zona de inhibición tomando muestras con un hisopo y transfiriendo las células a un medio de agar reciente (que no contiene bacteriocina). Por el contrario, el efecto de las cepas P-tipo 777 (que se ha mostrado que también producen salivaricina B) es bactericida frente a los indicadores patrón, es decir, no pueden recuperarse células viables de la zona de inhibición en pruebas de antagonismo posteriores. Además, las pruebas que utilizan preparaciones purificadas de salivaricina A y salivaricina B (datos no mostrados) han confirmado que la acción frente a S. pyogenes de salivaricina A es bacteriostática, mientras que la de la salivaricina B es bactericida.

Parte 2

Se determinó la actividad inhibidora de las salivaricinas mediante la medición de la disminución con el tiempo del número de unidades formadoras de colonias (CFU) de una suspensión del estreptococo indicador sensible (cepa FF22 de Streptococcus pyogenes) tras mezclar las células con una preparación de salivaricina. Las células lavadas dos veces de un cultivo en caldo Todd Hewitt exponencial del estreptococo indicador volvieron a suspenderse en tampón fosfato 0,067 M (pH 6,5) hasta el volumen de cultivo original. Entonces se mezclaron partes de salivaricina parcialmente purificada (título 16 Ua/ml) o de tampón fosfato (control) con un volumen igual de suspensión de células lavadas y se continuó la incubación a 37ºC. Se determinaron los supervivientes a intervalos cultivando sobre placas diluciones de 10 veces (en caldo Todd Hewitt frío) de las mezclas de prueba y control sobre base de agar Columbia e incubando a 37ºC durante 24 h. Se expresaron los recuentos viables como el número total de CFU por ml.

Se encontró que las preparaciones de salivaricina B parcialmente purificada de título 16 eran letales para más del 99% de las CFU de los cultivos en caldos Todd Hewitt exponenciales de la cepa FF22 de S. pyogenes en 4 h a 37ºC. Por el contrario, la preparación parcialmente purificada de salivaricina A2 de título 16, cuando se sometió a prueba en las mismas condiciones, destruyó menos del 10% de las células de la cepa FF22. Se realizaron pruebas adicionales de los espectros inhibidores de preparaciones de salivaricina A2 y salivaricina B parcialmente purificadas utilizando el ensayo en superficie de agar descrito anteriormente. Se colocaron gotas (20 \mul) de una preparación de título 16 Ua/ml en cultivos en césped de las cepas de prueba que se habían inoculado recientemente untando la superficie de una placa de base de agar Columbia con una dilución 1/100 en solución salina de un cultivo en caldo Todd Hewitt de 18 h de esa cepa. Se consideró que la producción de una zona definida del crecimiento de la cepa de prueba inhibido durante la incubación de estas placas a 37ºC durante 18 h indicaba la sensibilidad de esa cepa frente a la salivaricina.

Los resultados se muestran en la tabla 1.

1

Aplicación industrial

Los resultados anteriores demuestran el efecto inhibidor y bactericida de la salivaricina B y los organismos que producen esta BLIS. Por tanto, la salivaricina B y/o los organismos que la producen pueden aplicarse en procedimientos de tratamiento de individuos frente a los efectos perjudiciales de infecciones por estreptococos en las vías respiratorias superiores, incluyendo la boca. Estos procedimientos incluyen procedimientos de tratamiento de estados tales como anginas estreptocócicas (provocadas principalmente por S. pyogenes) y caries dental (provocada en parte por S. sobrinus).

Las formulaciones que pueden administrarse por vía oral preferidas actualmente son mezclas de cepas de S. salivarius liofilizadas con leche en polvo desnatada o similares que se ha aromatizado para potenciar la palatabilidad.

Las indicaciones hasta la fecha son que tales formulaciones son eficaces cuando se reconstituyen mediante la adición de agua y se beben en de tres a cuatro veces durante el transcurso del día, de modo que se consume un total de 50 ml del producto aromatizado (que contiene aproximadamente 2 x 10^{7} células/ml de microorganismo(s) S. salivarius liofilizado(s)).

Cuando se seleccionan cepas de S. salivarius liofilizadas de K12 y K30, se añade la ventaja de que la salivaricina B se expresa junto con la salivaricina A2. La expresión conjunta de estas dos BLIS vuelve a la formulación particularmente bactericida con respecto a S. pyogenes y S. sobrinus, así como con respecto a otras varias bacterias.

<110> University of Otago

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BLIS Technologies Limited

\hfill

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<120> Lantibiótico

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<130> 26504 MRB

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<140>

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<141>

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<150> NZ 500261

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<151> 12-10-1999

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<160> 5

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<170> PatentIn Ver. 2,1

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<210> 1

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Streptococcus salivarius

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<400> 1

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\hskip1.5cm

2

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<210> 2

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<211> 111

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<212> ADN

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<213> Streptococcus salivarius

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<220>

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<221> CDS

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<222> (37)..(111)

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Streptococcus salivarius

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<400> 3

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4

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<210> 4

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<211> 153

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<212> ADN

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<213> Streptococcus salivarius

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<220>

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<221> CDS

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<222> (88)..(153)

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<400> 4

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5

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<210> 5

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Streptococcus salivarius

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<400> 5

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6

Claims

1. Proteína antibacteriana que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 3.

2. Proteína antibacteriana que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de la SEC ID nº 3 por la inserción, deleción o sustitución de desde uno hasta tres aminoácidos.

3. Proteína según la reivindicación 1 ó 2, que es bactericida.

4. Proteína según la reivindicación 3, que es bactericida con respecto a Streptococcus pyogenes.

5. Composición antibacteriana que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un organismo que expresa una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Formulación terapéutica que comprende:

(i): una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; o

(ii): un organismo que expresa una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

en combinación con un diluyente, vehículo y/o excipiente.

7. Formulación terapéutica según la reivindicación 6, que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en combinación con un diluyente, vehículo y/o excipiente.

8. Formulación terapéutica según la reivindicación 6, que comprende un organismo que expresa una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en combinación con un diluyente, vehículo y/o excipiente.

9. Formulación terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 que es un medicamento que puede administrarse por vía oral.

10. Medicamento según la reivindicación 9, que es un jarabe, enjuague bucal, gargarismo, pasta de dientes o aerosol bucal.

11. Medicamento según la reivindicación 9, que está en forma farmacéutica unitaria.

12. Medicamento según la reivindicación 10, que es una pastilla o cápsula que contiene una dosis unitaria de un organismo que expresa una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Formulación terapéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que dicha proteína u organismo está comprendido en un alimento o bebida.

14. Formulación según la reivindicación 13, en la que dicho alimento o bebida es un alimento o bebida a base de productos lácteos.

15. Formulación según la reivindicación 14, en la que dicha proteína u organismo está incluido en leche en polvo, galletas de leche, leche, yogur o queso.

16. Formulación según la reivindicación 14, en la que dicha proteína u organismo está incluido en una leche aromatizada.

17. Formulación terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que dicha proteína u organismo está incluido en un producto de confitería.

18. Formulación según la reivindicación 17, en la que dicho producto de confitería es una goma de mascar.

19. Formulación terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18, que comprende además uno o más agentes antibacterianos secundarios.

20. Formulación terapéutica según la reivindicación 19, en la que dicho(s) agente(s) antibacteriano(s) secunda-
rio(s) se selecciona(n) de sustancia(s) inhibidora(s) similar(es) a la bacteriocina (BLIS).

21. Formulación terapéutica según la reivindicación 18, que comprende además una o ambas de entre salivaricina A, un organismo que puede expresar salivaricina A, salivaricina A2 o un organismo que expresa salivaricina A2.

22. Polinucleótido que codifica para una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

23. Polinucleótido que comprende la secuencia codificante de la SEC ID nº: 2.

24. Organismo aislado, que incluye un polinucleótido según la reivindicación 22 ó 23, que expresa una proteína antibacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

25. Organismo según la reivindicación 24, en el que dicho polinucleótido es heterólogo.

26. Organismo según la reivindicación 24, que es un organismo S. salivarius.

27. Cepa K12 de S. salivarius depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, con el número de registro DSM 13084.

28. Cepa K30 de S. salivarius depositada en la Deutsche Sammlung von Milaoorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, con el número de registro DSM 13085.

29. Formulación terapéutica que comprende la cepa K12 de S. salivarius o la cepa K30 de S. salivarius según la reivindicación 27 ó 28.

30. Utilización de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la preparación de una formulación terapéutica para por lo menos inhibir el crecimiento de bacterias estreptocócicas perjudiciales en las vías respiratorias superiores en la que la formulación terapéutica se formula para su administración oral.

31. Utilización según la reivindicación 30, en la que dicha formulación terapéutica es una formulación terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 21 y 29.

32. Utilización según la reivindicación 30, en la que dicho efecto inhibidor se provoca colonizando por lo menos parte de las vías respiratorias superiores de un individuo con un organismo viable que expresa dicha proteína.

33. Utilización según la reivindicación 32, en la que dicho organismo forma parte de un medicamento, un alimento o bebida o un producto de confitería.

34. Utilización según la reivindicación 32 ó 33, en la que dicho organismo es una cepa de S. salivarius seleccionada de entre las cepas K12 y K30.

35. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, en la que dicho individuo se ha tratado previamente para por lo menos reducir la población bacteriana presente en las vías respiratorias superiores.

36. Utilización según la reivindicación 35, en la que dicho tratamiento previo comprende la etapa que consiste en administrar un antibiótico por vía oral a dicho individuo.

37. Formulación terapéutica que contiene una proteína antibacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y una proteína antibacteriana salivaricina A2.

38. Formulación terapéutica que contiene por lo menos un organismo S. salivarius que expresa una proteína antibacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y por lo menos otro organismo S. salivarius que expresa una proteína antibacteriana salivaricina A2.