KR20220007963A - 신규한 세포 내 단백질 전달 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 세포 내 단백질 전달 방법에 관한 것이다.
진핵생물의 세포는 인지질 이중층의 세포막으로 둘러싸여 있으며 이중층 내부의 소수성 때문에 세포 외부의 친수성 물질들이 세포막을 통과하여 세포 내로 이동하는 것은 거의 불가능하므로, 세포 내로 전달되어야 하는 질병 치료 목적의 약물 등의 전달이 제한된다.
따라서 본 발명은 본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 방법을 이용하면 타겟 물질의 고유 기능을 유지하면서도 세포질 내로 높은 효율로 도입이 가능하고, 타겟 물질을 핵으로 이동시키지 않고 세포질 내에 머무르게 하는 것이 가능하므로, 의학 및 바이오 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

신규한 세포 내 단백질 전달 방법{Novel intracellular protein delivery method}
본 발명은 신규한 세포 내 단백질 전달 방법에 관한 것이다.
병원체 감염은 체내 면역 반응의 활성화를 유도한다. 그 중에서도 바이러스 감염은 감염된 세포 내에서 인터페론 생성을 매개하게 되고, 인터페론은 다시 다른 세포의 인터페론 수용체에 결합하여 신호 전달계를 활성화, 여러 인터페론 자극 유전자(ISG, Interferon-stimulated gene)를 발현시키고 세포의 항바이러스 작용이 일어나게 한다.
Mx (Interferon-induced GTP-binding protein Mx)은 대부분의 척추동물에서 타입 I 인터페론에 의해 그 생성이 유도되는 ISG의 일종으로서 GTPases (dynamin-like large guanosine triphosphatases)에 속한다. Mx 단백질은 다양한 바이러스 감염에 대한 선천성 면역 반응에 관여하여 바이러스의 활성화를 저해하여 숙주의 생존을 돕고 질병으로부터 회복할 수 있도록 매개한다는 측면에서 항바이러스 제제로서의 가능성이 있다. 이 단백질은 세포질 내에서 바이러스의 증식을 억제하는 작용을 하므로, Mx 단백질의 항바이러스 제제로의 활용을 위해서는 세포 내로 단백질을 도입시키는 과정이 필수적이다.
진핵생물의 세포는 인지질 이중층의 세포막으로 둘러싸여 있으며 이중층 내부의 소수성 때문에 세포 외부의 친수성 물질들이 세포막을 통과하여 세포 내로 이동하는 것은 거의 불가능하다. 이러한 장벽을 극복하고 약물의 세포 내 전달을 위해 리포좀과 같은 약물 전달체들이 개발되었다. PTD (Protein transduction domain)은 세포막에서의 물질 이동 장애를 극복하고 세포 내로 물질을 이동시키기 위해 이용되고 있는 방법의 일종으로서, 약 10여개의 염기성 아미노산으로 구성된 펩타이드이다. PTD를 결합시키면 펩타이드, DNA 등의 물질들이 특별한 수용체 없이도 세포막을 통과하여 세포 내로 들어갈 수 있게 되는데, 이에 따라 한국 등록특허 제 10-1595152 호(TCTP-PTD를 포함하는 유전자 전달체)와 같이 PTD 서열을 유전자 전달을 위해 사용하는 기술이 개발되었다.
본 발명은 신규의 PTD 서열을 함유하는 PTD-MxA 융합 단백질을 개발하는 것을 목적으로 한다. 본 발명자들은 믹소바이러스 저항성 A(Myxovirus resistance A, MxA)을 연구하던 중, 마우스 유래 Mx1 단백질의 NLS(nuclear localization signal)에서 유래한 펩타이드 서열(REKKKFLKRR, cytoPTD로 명명)이 PTD로서의 기능을 할 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 상기 cytoPTD는 물질을 세포질로 전달시킨 후, 세포질 내에 머무르게 하는 효과가 우수하다. 또한 세포질 내로 전달시키고자 하는 물질의 양측에 cytoPTD를 연결하면, 일측에 cytoPTD를 연결한 경우에 비하여 전달 효율이 매우 높아진다. 따라서 본 발명은 의학 및 바이오 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 신규한 세포 내 단백질 전달 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에 서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에 있어서, 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain)이란 3 내지 30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 단백질, 펩타이드, DNA 등 다양한 물질과 결합하여 특별한 수용체 없이도 물질들을 세포 내부로 이동시킬 수 있는 펩타이드를 말한다. 바람직하게는 하기 표 1에 기재한 서열, 즉, Mx1 단백질의 NLS(nuclear localization signal)에서 유래한 펩타이드, 아르기닌(Arginine)이 5 내지 10개가 결합된 서열, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, Pep-2 등일 수 있으나, 세포 내로 이동시키고자 목적하는 타겟 단백질과 결합하여 세포막을 통과하고 세포간 이동을 촉진할 수 있는 도메인이라면 제한이 없다.
정의 서열
Mx1 단백질의 NLS(nuclear localization signal)에서 유래한 펩타이드 REKKKFLKRR
아르기닌(Arginine)이 5 내지 10개가 결합 RRRRR 내지 RRRRRRRRRR
전사 트랜스 활성자(TAT) YGRKKRRORRR
ANTP RQIKIWFQNRRMKWKK
Vp22 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
MTS AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP
Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
Pep-2 KETWFETWFTEWSQPKKKRKV
본 명세서에 있어서, 항바이러스란 동물, 식물, 세균, 방사균 등 살아있는 세포에 기생하며 세포 내에서만 증식할 수 있는 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료 작용을 의미하며, 상기 바이러스는 본 발명의 변성 MxA 단백질에 의하여 증식이 억제되는 바이러스라면 제한이 없으나, 바람직하게는 오르토믹소바이러스과(orthomyxoviridae) 인플루엔자 바이러스(influenza virus)를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 타겟물질이란 세포 외부로부터 세포 내부, 보다 구체적으로는 세포질 내로 전달시키고자 목표하는 물질을 의미한다. 상기 타겟물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 핵산, 단백질, 무기질, 유기질, 이온, 나노입자, 당, 또는 지질일 수 있으며, 본 발명에 있어서 핵산 또는 단백질인 것이 바람직하고, 단백질인 것이 더욱 바람직하다. 상기 타겟물질은 세로 내부로의 전이 효율을 증가시키기 위해 일측, 또는 양측 말단에 상기 단백질 전달 도메인이 결합될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 믹소바이러스 저항성 A(Myxovirus resistance A, MxA) 단백질이란 커다란 GTPase의 다이나민 수퍼 패밀리(dynamin superfamily)에 속하는 항바이러스성 단백질로 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)와 버냐바이러스(bunyaviruses)를 포함한 많은 다른 바이러스에 대해 내재적 항바이러스 활성을 나타내며, 그 발현은 I 형(α/β)이나 III 형(λ) 인터페론에 의해 엄격히 제어된다. 믹소바이러스 저항성 A 단백질은 662개의 아미노산으로 구성되고(서열번호 1), 전체 75.520 Da 크기이며, 고도로 정돈된 올리고머를 자체 조립하여 링과 같은 구조를 형성할 수 있다.
믹소바이러스 저항성 A 단백질은 N 말단으로부터 G도메인(G domain, 또는 GTPase binding domain), 미들도메인(Middle domain), 및 GED(GTPase effect domain)으로 구분되고, 미들도메인과 GED는 α1N, α1C, α2, α3, α4, α6, 및 α1N과 α1C 사이의 L1, α1C와 α2 사이의 L2, α3와 α4 사이의 L3, α3와 α4 사이의 L4 영역으로 구분된다. 특히 GED에 해당하는 L4 및 α4 영역은 믹소바이러스 저항성 A 단백질의 항바이러스 활성 효과를 조절하는 부분으로, 항바이러스 활성에 매우 중요하다(Corinna Patzina 등, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 289, NO. 9, pp. 6020-6027). 그러나 추가 연구를 통해 상기 MxA 단백질은 300mM 이상의 NaCl 이 포함된 고농도의 salt 조건에서는 수용액 속에 용해되어 존재하나 생리학적 수준(약 150mM)으로 salt 농도를 낮추면 자가응집되어 3MDa 이상의 거대한 올리고머를 형성하며 불용성의 침전을 이루는 것이 확인되었다(Georg Kochs등, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 277, NO. 16, pp. 14172-14176, 2002). 이렇듯 MxA 단백질은 자가 응집되는 특성 때문에 세포 내로 전이가 어려우므로, 세포 내에서 항바이러스 활성을 나타내는 데 제한을 받는다는 것이 알려졌다. 따라서 항바이러스 제제로 상용화되지 못하고 있는 실정이다.
본 명세서에 있어서, 약학조성물이란 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 것이며, 이에 관여하는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 유효성분을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 치료용 약학조성물을 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 목적하고자 하는 암 줄기세포의 치료를 위해 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법, 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다. 바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 약학조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 식품조성물이란 본 발명의 목적상, 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 개선하기 위한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 우유, 유산균 함유 유제품, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품조성물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로, 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 100%의 비율로 첨가할 수 있다. 여기서, 상기 식품조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 전분 등의 폴리사카라이드 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다. 그 외 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 100 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 일 구체예에서, 타겟 단백질의 5’말단, 및 3’말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이 결합된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질을 제공하고, 상기 재조합 단백질은 세포의 핵막과 세포질막 사이에 머무르는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 Mx1 단백질의 NLS(nuclear localization signal)에서 유래한 펩타이드, 5개 내지 10개의 아르기닌(Arginine)이 결합된 펩타이드, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, 및 Pep-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 재조합 단백질을 제공하며, 상기 Mx1 단백질의 NLS에서 유래한 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드인 것인 재조합 단백질을 제공하며, 상기 타겟 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 핵산에 의해 코딩되는 것인 재조합 단백질을 제공하며, 상기 재조합 단백질은 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드인 것인 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기의 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 대장균 과발현 벡터인 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 재조합 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 타겟 단백질을 코딩하는 유전자의 5’말단, 및 3’말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)을 결합시키는 단계;를 포함하는 재조합 유전자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 타겟 단백질을 코딩하는 유전자의 5’말단, 및 3’말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)을 결합시켜 재조합 유전자를 제조하는 단계; 및, (b) 상기 재조합 유전자를 인간을 제외한 개체에서 발현시키는 단계;를 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 타겟 단백질을 코딩하는 유전자의 5’말단, 및 3’말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)을 결합시켜 재조합 유전자를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 유전자를 인간을 제외한 개체에서 발현시켜 재조합 단백질을 생산하는 단계; 및, (c) 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 신규한 세포 내 단백질 전달 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포질 내로 타겟 물질의 도입 효율이 증가된 신규한 세포 내 단백질 전달 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면 타겟 물질의 고유 기능을 유지하면서도 세포질 내로 높은 효율로 도입이 가능하고, 타겟 물질을 핵으로 이동시키지 않고 세포질 내에 머무르게 하는 것이 가능하므로, 의학 및 바이오 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 신규한 재조합 MxA 단백질 cytoPTD-MxA-cytoPTD의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포 내로 MxA 단백질, MxA-cytoPTD 단백질, 또는 cytoPTD-MxA-cytoPTD 단백질을 도입한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, cytoPTD-MxA-cytoPTD 재조합 단백질의 항바이러스 효과를 검증한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재조합 cytoPTD-MxA-cytoPTD 발현 벡터 제작
본 발명자들은 신규 cytoPTD 서열(서열번호 1)이 세포질 내로 타겟 단백질을 도입시킬 수 있는가를 확인하고자, 사람 유래 MxA 전체 서열의 양측에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킨 재조합 단백질 및 그 발현 벡터를 제조하였다.
구체적으로는 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 유전자 서열(서열번호 2)을 사람 유래 MxA 유전자 서열(서열번호 3)의 5’말단, 및 3’말단에 추가하고, 양측에 제한효소(Nhe I 및 Not I) 절단 부위를 첨가하기 위하여 신규한 프라이머 서열인 서열번호 4 및 5를 전방 및 후방 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다.
PCR 수행 후, 증폭된 서열을 벡터에 삽입할 수 있도록 제한 효소 및 DNA 접합효소를 사용하였다. 구체적으로 본 발명자들은 대장균 과발현 벡터인 pET28a를 사용하였다. pET28a 벡터는 자체적으로 다중 제한효소 작용부위(multicloning site)에 His 태그(tag)를 포함하고 있어, 단백질 추출을 용이하도록 하는 His 태그가 재조합 단백질에 결합되도록 만들 수 있다. Nhe I 및 Not I 제한효소를 사용하여 PCR 산물 및 벡터를 처리하고 T4 DNA 접합효소(ligase)를 사용하여 PCR 산물을 벡터에 삽입하였다. 이와 같은 과정을 거쳐 만들어진 재조합 MxA 단백질(서열번호 6)은 cytoPTD-MxA-cytoPTD로 명명하고, 이의 모식도를 도 1에 나타내었다. 상기 본 발명의 cytoPTD-MxA-cytoPTD 단백질을 발현하는 벡터는 pET28a-cytoPTD-MxA-cytoPTD 발현 벡터라고 명명하였다.
실시예 2: 대장균 내에서 pET28a-cytoPTD-MxA-cytoPTD의 발현
실시예 1에서 제작한 pET28a-cytoPTD-MxA-cytoPTD 벡터로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시킨 후, 카나마이신이 포함된 LB 고체 배지에서 12시간 동안 37℃ 조건 하에 배양하였다. 이 때 형성된 단일 콜로니를 카나마이신이 포함된 LB 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 3시간 배양한 후 배양액을 18℃로 냉각시킨 다음, 발현유도물질인 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)를 0.125 mM 농도가 되도록 첨가하고 72시간 추가로 배양하여 cytoPTD-MxA-cytoPTD 재조합 단백질을 발현시켰다.
상기 배양액을 고속원심분리하여 침전된 균체를 세포 용해 완충액 (lysis buffer)에 부유시키고 초음파 발생기를 이용하여 용해시켰다. 이 때 사용된 용해 완충액에는 HEPES, MgCl2, NaCl, 이미다졸, DNAse, 및 β-mercaptoethanol이 포함되었으며, 단백질의 분해를 방지하기 위해 프로테이즈 저해제인 PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride)가 첨가되었다. 용해시킨 균체를 다시 고속원심분리하고 상층액을 Ni-NTA 아가로즈 레진 컬럼에 가하여 단백질을 레진에 흡착시켰다. 이후 과량의 이미다졸이 포함되어 있는 용출 완충용액을 가하여 레진에 흡착된 재조합 단백질을 분리, 추출하며 Pierce 사의 High-Capacity Endotoxin Removal Resin을 이용하여 재조합 단백질 용액 내의 endotoxin을 제거하였다. 이후 단백질 용액 내에 포함된 이미다졸은 DPBS 투석을 통해 제거하고 투석을 거친 재조합 단백질은 2 - 20 % SDS-PAGE 젤을 통해 확인하였다.
실시예 3: 재조합 cytoPTD-MxA-cytoPTD의 구조적 특성 및 세포 내 도입 확인
실시예 2에서 추출한 재조합 cytoPTD-MxA-cytoPTD 단백질의 구조적 특성 및 세포 내 도입을 확인하기 위하여, 개 유래 표피 세포인 MDCK 세포주에 50 μg/ml 농도로 MxA 단백질, MxA-cytoPTD 단백질, 또는 cytoPTD-MxA-cytoPTD 단백질을 처리한 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 씻어낸 뒤 4% paraformaldehyde를 이용해 세포를 고정하고, MxA에 특이적으로 결합하는 항체를 사용해 세포 내에 도입된 MxA 단백질을 형광 현미경으로 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 실험 결과, 동량의 MxA 단백질은 세포 내로 거의 도입되지 못하였다. MxA 단백질의 C 말단에 cytoPTD가 결합된 재조합 MxA-cytoPTD 단백질 역시 MxA 단백질보다는 나았으나, 세포 내 도입이 매우 미비한 수준이었다. 그러나 MxA 단백질의 N 및 C 말단 양측에 cytoPTD가 결합된cytoPTD-MxA-cytoPTD 단백질은 타겟 단백질이 세포 내로 충분히 도입되는 것이 관찰되어 타겟 단백질 양측에 cytoPTD를 결합하는 것이 매우 현저한 효과로 타겟을 세포 내로 도입시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 기존에 핵 위치 신호 서열 (nuclear localization signal)로서 기능하는 것으로 알려진 cytoPTD가 타겟 단백질과 결합된 재조합 단백질로 존재하는 경우에는 타겟을 핵으로 이동시키기 않고, 세포질에만 머무르게 하는 것을 확인하여 cytoPTD가 타겟 단백질의 세포질 내 도입 만을 매개함을 검증하였다.
실시예 4: 재조합 cytoPTD-MxA-cytoPTD 단백질의 인플루엔자 바이러스에 대한 방어효능 증진효과 확인
실시예 3에서 세포 내 도입된 재조합 cytoPTD-MxA-cytoPTD 단백질이 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 효능을 증진시키는가를 in vitro 및 레벨에서 검증하였다. 구체적으로는 MDCK 세포주에 0.01 MOI의 인플루엔자 바이러스 PR8(H1N1 아형)을 감염시킨 후 4시간 뒤에 cytoPTD-MxA-cytoPTD 재조합 단백질을 80 μg/ml의 농도로 처리하였다. 이후 감염 48시간 뒤 세포 내의 바이러스 RNA의 발현을 RT-qPCR 방법으로 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비하여 cytoPTD-MxA-cytoPTD 재조합 단백질을 처리할 경우 바이러스 RNA의 발현이 약 1/5 내지 1/10로 감소하는 것을 확인하여 cytoPTD-MxA-cytoPTD 재조합 단백질의 처리가 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였다. 이를 도 3에 나타내었다.
상기 실시예 1 내지 3의 결과로부터, 타겟 단백질의 양측에 cytoPTD를 결합하는 것이 세포내로의 타겟 물질 도입에 매우 효과적이며, 타겟 단백질 고유의 기능을 유지할 수 있음을 알 수 있었다. 이는 본 발명에서 제조한 cytoPTD-타겟 물질-cytoPTD의 구조가 세포 내로 타겟 단백질을 전달하는데 매우 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Novel intracellular protein delivery method <130> PDPB204100 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated sequence from Mx1 <400> 1 Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated sequence from Mx1 <400> 2 agagagaaga agaagttcct gaagaggcgg 30 <210> 3 <211> 1983 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gttgtttccg aagtggacat cgcaaaagct gatccagctg ctgcatccca ccctctatta 60 ctgaatggag atgctactgt ggcccagaaa aatccaggct cggtggctga gaacaacctg 120 tgcagccagt atgaggagaa ggtgcgcccc tgcatcgacc tcattgactc cctgcgggct 180 ctaggtgtgg agcaggacct ggccctgcca gccatcgccg tcatcgggga ccagagctcg 240 ggcaagagct ccgtgttgga ggcactgtca ggagttgccc ttcccagagg cagcgggatc 300 gtgaccagat gcccgctggt gctgaaactg aagaaacttg tgaacgaaga taagtggaga 360 ggcaaggtca gttaccagga ctacgagatt gagatttcgg atgcttcaga ggtagaaaag 420 gaaattaata 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<210> 5 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 ataagaatgc ggccgcttac cgcctcttca ggaacttctt cttctctcta ccggggaact 60 gggc 64 <210> 6 <211> 704 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cytoPTD-MxA-cytoPTD <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ser Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg 20 25 30 Arg Val Val Ser Glu Val Asp Ile Ala Lys Ala Asp Pro Ala Ala Ala 35 40 45 Ser His Pro Leu Leu Leu Asn Gly Asp Ala Thr Val Ala Gln Lys Asn 50 55 60 Pro Gly Ser Val Ala Glu Asn Asn Leu Cys Ser Gln Tyr Glu Glu Lys 65 70 75 80 Val Arg Pro Cys Ile Asp Leu Ile Asp Ser Leu Arg Ala Leu Gly Val 85 90 95 Glu Gln Asp Leu Ala Leu Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Asp Gln Ser 100 105 110 Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Gly Val Ala Leu Pro 115 120 125 Arg Gly Ser Gly Ile Val Thr Arg Cys Pro Leu Val Leu Lys Leu Lys 130 135 140 Lys Leu Val Asn Glu Asp Lys Trp Arg Gly Lys Val Ser Tyr Gln Asp 145 150 155 160 Tyr Glu Ile Glu Ile Ser Asp Ala Ser Glu Val Glu Lys Glu Ile Asn 165 170 175 Lys Ala Gln Asn Ala Ile Ala Gly Glu Gly Met Gly Ile Ser His Glu 180 185 190 Leu Ile Thr Leu Glu Ile Ser Ser Arg Asp Val Pro Asp Leu Thr Leu 195 200 205 Ile Asp Leu Pro Gly Ile Thr Arg Val Ala Val Gly Asn Gln Pro Ala 210 215 220 Asp Ile Gly Tyr Lys Ile Lys Thr Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Gln Arg 225 230 235 240 Gln Glu Thr Ile Ser Leu Val Val Val Pro Ser Asn Val Asp Ile Ala 245 250 255 Thr Thr Glu Ala Leu Ser Met Ala Gln Glu Val Asp Pro Glu Gly Asp 260 265 270 Arg Thr Ile Gly Ile Leu Thr Lys Pro Asp Leu Val Asp Lys Gly Thr 275 280 285 Glu Asp Lys Val Val Asp Val Val Arg Asn Leu Val Phe His Leu Lys 290 295 300 Lys Gly Tyr Met Ile Val Lys Cys Arg Gly Gln Gln Glu Ile Gln Asp 305 310 315 320 Gln Leu Ser Leu Ser Glu Ala Leu Gln Arg Glu Lys Ile Phe Phe Glu 325 330 335 Asn His Pro Tyr Phe Arg Asp Leu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Thr Val 340 345 350 Pro Cys Leu Ala Glu Lys Leu Thr Ser Glu Leu Ile Thr His Ile Cys 355 360 365 Lys Ser Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Lys Glu Thr His Gln Arg 370 375 380 Ile Thr Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Gly Val Asp Ile Pro Glu Asp Glu 385 390 395 400 Asn Glu Lys Met Phe Phe Leu Ile Asp Lys Ile Asn Ala Phe Asn Gln 405 410 415 Asp Ile Thr Ala Leu Met Gln Gly Glu Glu Thr Val Gly Glu Glu Asp 420 425 430 Ile Arg Leu Phe Thr Arg Leu Arg His Glu Phe His Lys Trp Ser Thr 435 440 445 Ile Ile Glu Asn Asn Phe Gln Glu Gly His Lys Ile Leu Ser Arg Lys 450 455 460 Ile Gln Lys Phe Glu Asn Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Pro Gly Phe 465 470 475 480 Val Asn Tyr Arg Thr Phe Glu Thr Ile Val Lys Gln Gln Ile Lys Ala 485 490 495 Leu Glu Glu Pro Ala Val Asp Met Leu His Thr Val Thr Asp Met Val 500 505 510 Arg Leu Ala Phe Thr Asp Val Ser Ile Lys Asn Phe Glu Glu Phe Phe 515 520 525 Asn Leu His Arg Thr Ala Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu 530 535 540 Gln Glu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ile Arg Leu His Phe Gln Met Glu 545 550 555 560 Gln Ile Val Tyr Cys Gln Asp Gln Val Tyr Arg Gly Ala Leu Gln Lys 565 570 575 Val Arg Glu Lys Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys Ser Trp Asp 580 585 590 Phe Gly Ala Phe Gln Ser Ser Ser Ala Thr Asp Ser Ser Met Glu Glu 595 600 605 Ile Phe Gln His Leu Met Ala Tyr His Gln Glu Ala Ser Lys Arg Ile 610 615 620 Ser Ser His Ile Pro Leu Ile Ile Gln Phe Phe Met Leu Gln Thr Tyr 625 630 635 640 Gly Gln Gln Leu Gln Lys Ala Met Leu Gln Leu Leu Gln Asp Lys Asp 645 650 655 Thr Tyr Ser Trp Leu Leu Lys Glu Arg Ser Asp Thr Ser Asp Lys Arg 660 665 670 Lys Phe Leu Lys Glu Arg Leu Ala Arg Leu Thr Gln Ala Arg Arg Arg 675 680 685 Leu Ala Gln Phe Pro Gly Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg 690 695 700

Claims (15)

  1. 타겟 단백질의 5’말단, 및 3’말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이 결합된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 세포의 핵막과 세포질막 사이에 머무르는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 전달 도메인은 Mx1 단백질의 NLS(nuclear localization signal)에서 유래한 펩타이드, 5개 내지 10개의 아르기닌(Arginine)이 결합된 펩타이드, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, 및 Pep-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인, 재조합 단백질.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 Mx1 단백질의 NLS에서 유래한 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드인 것인, 재조합 단백질.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 타겟 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 핵산에 의해 코딩되는 것인, 재조합 단백질.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드인 것인, 재조합 단백질.
  7. 제 1항의 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자.
  8. 제 6항의 재조합 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 벡터는 대장균 과발현 벡터인, 재조합 벡터.
  10. 제 8항의 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
  11. 제 1항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  12. 제 1항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품조성물.
  13. 타겟 단백질을 코딩하는 유전자의 5’말단, 및 3’말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)을 결합시키는 단계;를 포함하는, 재조합 유전자의 제조 방법.
  14. (a) 타겟 단백질을 코딩하는 유전자의 5’말단, 및 3’말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)을 결합시켜 재조합 유전자를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 재조합 유전자를 인간을 제외한 개체에서 발현시키는 단계;를 포함하는, 재조합 단백질의 제조 방법.
  15. (a) 타겟 단백질을 코딩하는 유전자의 5’말단, 및 3’말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)을 결합시켜 재조합 유전자를 제조하는 단계;
    (b) 상기 재조합 유전자를 인간을 제외한 개체에서 발현시켜 재조합 단백질을 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계;를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법.
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