KR102061324B1

KR102061324B1 - 세포투과성 MxA 재조합 단백질

Info

Publication number: KR102061324B1
Application number: KR1020180005938A
Authority: KR
Inventors: 이흥규; 정희은
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2019-12-31
Also published as: KR20190087760A

Abstract

본 발명은 세포투과성이 증가된 MxA 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 MxA 재조합 단백질은 세포투과성이 증가되어 직접 숙주 세포 내에서 다양한 종류의 바이러스에 대한 방어 효과를 나타내므로, 이를 이용하여 다양한 바이러스에 대한 효과적인 항바이러스 제제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

세포투과성 MxA 재조합 단백질{CELL PERMEABLE MX-A RECOMBINANT PROTEIN}

본 발명은 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 효과를 가지는 세포투과성을 증가시킨 MxA 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

1962년, 린데만(Lindenmann)에 의해 A2G 계통의 마우스가 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 감염에 저항성을 갖고 있다는 것이 밝혀진 이후, 저항성의 원인을 밝히기 위하여 다양한 후속 연구들이 이루어졌고 이를 통하여, 타입 I 인터페론에 의해 생성이 유도되는 GTPases(Dynamin-like large guanosine triphosphatases)의 한 종류인 Mx(믹소바이러스 저항성, Myxovirus(influenza virus) resistance) 단백질들이 다양한 RNA 바이러스의 감염에 대한 항바이러스 기작을 촉진시키는데 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다(Genome Res 12, 2002, 527-530).

Mx GTPase의 종류는 종에 따라 다양한데, 그 중 MxA 단백질은 광범위한 바이러스에 대한 인터페론 유발 항바이러스 반응의 핵심 매개체이다. MxA 발현은 타입 제 1 형, 및 제 3 형 인터페론에 의해 엄격히 조절되고, 바이러스 또는 다른 자극에 의해서는 직접 유도되지 않는다. MxA는 큰 GTPase의 다이나민 수퍼 패밀리와 많은 특성을 공유하며, 다이나민과 마찬가지로 고순도의 올리고머로 자가 응집(self-assembly)되고, 고리와 같은 구조를 형성하여 바이러스의 vRNP 주위를 둘러싸서 그 기능을 방해한다(J Interferon Cytokine Res. 2011, Jan;31(1):79-87).

이러한 MxA 단백질은 다양한 바이러스의 감염에 대한 선천성 면역 반응에 관여하여 바이러스의 활성화를 저해하고 바이러스의 증식을 억제하여 항바이러스 제제로 사용될 수 있을 것이 기대되었으나, MxA 단백질의 자가 응집되는 특성 때문에, 세포내로 원활히 이동하지 못하고 자가 응집한 상태로 존재한다. 따라서 항바이러스 제제로 상용화되지 못하고 있는 실정이다.

따라서 본 발명은 세포내 이동성을 증가시킨 세포투과성 MxA 재조합 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 세포투과성 MxA 재조합 단백질은 세포막에 존재하는 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)을 통하여 세포내로 효율적으로 이동되고, 자연형 MxA 단백보다 항바이러스 효과가 우수하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

본 발명은 MxA 단백질을 효과적인 항바이러스 제제로 사용하기 위하여 안출된 것으로, 세포투과성 MxA 재조합 단백질 및 이의 용도를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에 서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서에 있어서, 믹소바이러스 저항성 A(Myxovirus resistance A, MxA) 단백질이란 커다란 GTPase의 다이나민 수퍼 패밀리(dynamin superfamily)에 속하는 항바이러스성 단백질로 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)와 버냐바이러스(bunyaviruses)를 포함한 많은 다른 바이러스에 대해 내재적 항바이러스 활성을 나타내며, 그 발현은 I 형(α/β)이나 III 형(λ) 인터페론에 의해 엄격히 제어된다. 믹소바이러스 저항성 A 단백질은 662개의 아미노산으로 구성되고(서열번호 1), 전체 75.520 Da 크기이며, 고도로 정돈된 올리고머를 자체 조립하여 링과 같은 구조를 형성할 수 있다.

믹소바이러스 저항성 A 단백질은 N 말단으로부터 G도메인(G domain, 또는 GTPase binding domain, 서열번호 2), 미들도메인(Middle domain, 서열번호 3), 및 GED(GTPase effect domain, 서열번호 4)으로 구분되고, 미들도메인과 GED는 α1N, α1C, α2, α3, α4, α6, 및 α1N과 α1C 사이의 L1, α1C와 α2 사이의 L2, α3와 α4 사이의 L3, α3와 α4 사이의 L4 영역으로 구분된다. 특히 GED에 해당하는 L4 및 α4 영역은 믹소바이러스 저항성 A 단백질의 항바이러스 활성 효과를 조절하는 부분으로, 항바이러스 활성에 매우 중요한 것으로 알려져 있다(Corinna Patzina 등, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 289, NO. 9, pp. 6020-6027). 상기 믹소바이러스 저항성 A 단백질의 구조적 모식도를 도 1에 나타내었다.

본 명세서에 있어서, 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이란 3 내지 30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 단백질, 펩타이드, DNA 등 다양한 물질과 결합하여 특별한 수용체 없이도 물질들을 세포 내부로 이동시킬 수 있는 펩타이드를 말한다. 바람직하게는 하기 표 1에 기재한 서열, 즉, 아르기닌(Arginine)이 5 내지 10개가 결합된 서열, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, Pep-2 등일 수 있으나, MxA 단백질과 결합하여 세포막을 통과하여 MxA 단백질을 세포 내부로 전달할 수 있는 도메인이라면 제한이 없다.

정의	서열
아르기닌(Arginine)이 5 내지 10개가 결합	RRRRR 내지 RRRRRRRRRR
전사 트랜스 활성자(TAT)	YGRKKRRORRR
ANTP	RQIKIWFQNRRMKWKK
Vp22	DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
MTS	AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP
Pep-1	KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
Pep-2	KETWFETWFTEWSQPKKKRKV

본 명세서에 있어서, 항바이러스란 동물, 식물, 세균, 방사균 등 살아있는 세포에 기생하며 세포 내에서만 증식할 수 있는 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료 작용을 의미하며, 상기 바이러스는 MxA 단백질에 의하여 증식이 억제되는 바이러스라면 제한이 없으나, 바람직하게는 오르토믹소바이러스(orthomyxoviridae)과 인플루엔자 바이러스(influenza virus)속에 속하는 바이러스를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 2, 및 서열번호 4의 1번째 내지 44번째 아미노산을 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 제공하고, 상기 단편 단백질은 서열번호 3을 추가로 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 제공하며, 상기 단편 단백질은 서열번호 4의 45번째 아미노산 내지 59번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 제공하며, 상기 단편 단백질은 N 말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이 결합된 것인 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 5개 내지 10개의 아르기닌(Arginine)이 결합된 것, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, 및 Pep-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)인 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 제공한다.

본 발명의 발명자들이 MxA 단백질의 다양한 크기의 단편단백질을 제조하고 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 효능 증진 효과를 확인한 결과, MxA 단백질의 G 도메인, 미들 도메인, 및 GED의 1번째 아미노산을 포함하는 경우, 내지 G 도메인, 미들 도메인, 및 GED의 1번째-43번째 아미노산을 포함하는 경우에는 MxA 전체 단백질과 비교하여 항바이러스 활성이 저하되는 것으로 나타났다. 그러나 MxA 단백질의 G 도메인, 미들 도메인, 및 GED의 1번째-44번째 아미노산을 포함하는 경우, 내지 G 도메인, 미들 도메인, 및 GED의 1번째-58번째 아미노산을 포함하는 경우에는 MxA 전체 단백질과 비교하여 증가된 항바이러스 활성을 나타내었다. 그리고, MxA 단백질의 G 도메인, 미들 도메인, 및 GED의 1번째-59번째 아미노산을 포함하는 경우, 내지 G 도메인, 미들 도메인, 및 GED의 1번째-129번째 아미노산을 포함하는 경우에는 MxA 전체 단백질과 비교하여 다시 항바이러스 활성을 저하되는 것으로 나타났다.

본 발명의 다른 구체예에서, 서열번호 2, 및 서열번호 4의 1번째 내지 44번째 아미노산을 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 제공하고, 상기 재조합 유전자는 서열번호 3을 추가로 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 제공하며, 상기 재조합 유전자는 서열번호 4의 45번째 아미노산 내지 59번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 2, 및 서열번호 4의 1번째 내지 44번째 아미노산을 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3을 추가로 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 추가로 포함하는 것인 재조합 벡터를 제공하며, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 45번째 아미노산 내지 59번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 추가로 포함하는 것인 재조합 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 대장균 과발현 벡터인 재조합 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 pET28a 벡터인 재조합 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 히스티딘-표지(Histidine-tag) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 2, 및 서열번호 4의 1번째 내지 44번째 아미노산을 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 인간을 제외한 형질전환체를 제공하고, 상기 형질전환체는 미생물인 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 2, 및 서열번호 4의 1번째 내지 44번째 아미노산을 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 제공하고, 상기 단편 단백질은 서열번호 3을 추가로 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질인 약학조성물을 제공하며, 상기 단편 단백질은 서열번호 4의 45번째 아미노산 내지 59번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질인 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 인플루엔자 바이러스 속의 감염을 예방 또는 치료하기 위한 것인 항바이러스용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(Elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 세포투과성 MxA 재조합 단백질은 세포내로 효율적으로 이동되고, 항바이러스 효과가 우수하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, MxA 단백질의 구조적 모식도를 나타낸 도이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른, MxA 단백질 전체 서열과 비교한 재조합 MxA 단백질의 설계 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 재조합 MxA 단백질의 세포 내 도입을 효과를 in vitro에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 재조합 MxA 단백질의 인플루엔자 바이러스에 대한 방어효능 증진 효과를 in vivo에서 확인한 것으로, 재조합 MxA 단백질을 투여한 마우스에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 생존률 및 체중 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 자가 응집하는 특성을 가진 재조합 MxA 단백질과 자가응집성이 저하된 재조합 MxA 단백질의 항 인플루엔자 방어능 차이를 비교한 것으로, 재조합 MxA 단백질을 투여한 마우스의 생존률 및 체중 변화를 확인하고 마우스 기관지 세척액 내에 존재하는 바이러스의 역가를 플라크 어세이로 측정한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재조합 MxA 발현 벡터 제작

본 발명자들은 사람 유래 믹소바이러스 저항성 A (Myxovirus resistance A, MxA) 단백질의 전체 서열의 일측에 단백질 전달 도메인 (Protein transduction domain) 서열이 결합되고, MxA 단백질의 591번 아미노산까지만 발현되어 자가 응집을 일으키지 않는 세포 투과성 MxA 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하였다.

보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 MxA 유전자 서열의 5’ 말단 부위에 HIV 유래 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD) TAT 서열(표 1 참조)이 추가되도록 하였다. 또한 MxA 단백질의 올리고머 형성에 관여하는 것으로 알려져 있는 C 말단 부위의 GTPase effector domain(GED)의 일부를 손실시키고자, MxA 단백질의 591번 아미노산을 코딩하는 부위까지만 발현(서열번호 5)하도록 프라이머를 디자인하였다. 양측에 제한 효소 (Nhe I 및 Not I) 절단 부위를 첨가하기 위하여 프라이머를 하기 표 2와 같이 제작하여 PCR 수행하였다.

프라이머 방향	프라이머 서열
정방향(5' primer)	CTAGCTAGCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGAGGAGAAGAGTTGTTTCCGAAGTGGACATC
역방향(3' primer)	ATAAGAATGCGGCCGCTTACTTGCTGGCCTCCTGGTGATA

PCR 수행 후, 증폭된 서열을 벡터에 삽입할 수 있도록 제한 효소 및 DNA 접합효소를 사용하였다. 구체적으로 본 발명자들은 대장균 과발현 벡터인 pET28a를 사용하였다. pET28a 벡터는 자체적으로 다중 제한효소 작용부위(multicloning site)에 His 태그(tag)를 포함하고 있어, 단백질 추출을 용이하도록 하는 His 태그가 재조합 단백질에 결합되도록 만들 수 있다. Nhe I 및 Not I 제한효소를 사용하여 PCR 산물 및 벡터를 처리하고 T4 DNA 접합효소 (ligase) 를 사용하여 PCR 산물을 벡터에 삽입하였으며, 최종적으로 이 벡터에서 도1과 같은 구조의 재조합 단백질이 발현되도록 만들었다. 이와 같은 과정을 거쳐 만들어진 재조합 MxA 단백질은 TAT-MxA₅₉₁로 명명하며, 이를 발현하는 벡터는 pET28a-His-TAT-MxA₅₉₁ 발현 벡터라고 명명하였다. 상기 MxA 단백질 전체 서열과 비교한 TAT-MxA₅₉₁의 설계 모식도를 도 2에 나타내었다.

대조군으로서는 단백질 전달 도메인 서열을 MxA 단백질에 결합시켰으나, 자가 응집은 저해되지 않은 재조합 TAT-MxA 단백질을 발현하도록 벡터를 제작하였으며, 이는 pET28a-His-TAT-MxA 발현 벡터로 명명하고 여기서 생성되는 단백질은 TAT-MxA라 명명하였다.

실시예 2: 대장균 내에서 pET28a -His-TAT- MxA591의 발현

실시예1에서 제작한 pET28a-His-TAT-MxA₅₉₁ 벡터를 이용하여 대장균 BL21 (DE3) (Enzynomics)을 형질전환시킨 후, 카나마이신이 포함된 LB 고체 배지에서 12시간동안 섭씨 37도씨 조건 하에 배양하였다. 이 때 형성된 단일 콜로니를 카나마이신이 포함된 LB 액체 배지에 접종하고 섭씨 37도씨에서 3시간 배양 한 후 배양액을 섭씨 18도씨로 냉각시킨 다음, 발현유도물질인 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)를 0.125 mM 농도가 되도록 첨가하고 18시간 더 배양하여 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD) 서열이 추가된 TAT-MxA₅₉₁ 재조합 단백질을 발현시켰다.

상기 배양액을 고속원심분리하여 침전된 균체를 세포 용해 완충액 (lysis buffer) 에 부유시키고 초음파 발생기를 이용하여 용해시켰다. 이 때 사용된 용해 완충액에는 HEPES, MgCl₂, NaCl, 이미다졸, DNAse 및 β-mercaptoethanol이 포함되었으며 단백질의 분해를 방지하기 위해 프로테이즈 저해제인 PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride) 가 첨가되었다. 용해시킨 균체를 다시 고속원심분리하고 상층액을 Ni-NTA 아가로즈 레진 컬럼에 가하여 단백질을 레진에 흡착시켰다. 이후 과량의 이미다졸이 포함되어 있는 용출 완충용액을 가하여 레진에 흡착된 재조합 단백질을 분리, 추출하며 단백질 용액 내에 포함된 이미다졸은 투석을 통해 제거하였다. 투석을 거친 재조합 단백질은 4 - 20 % SDS-PAGE 젤을 통해 확인하였다.

실시예 3: 재조합 TAT- MxA의 세포 내 도입 확인

재조합 MxA 단백질이 세포 내로 도입되는지 확인하기 위해, 개 유래 표피 세포인 MDCK 세포주에 100 μg/ml 농도로 재조합 MxA 단백질을 처리한 후 37도씨에서 3시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 씻어낸 뒤 메탄올을 이용해 세포를 고정하고, MxA에 특이적으로 결합하는 항체를 사용해 세포 내에 도입된 MxA 단백질을 형광 현미경으로 확인하였다. 그 결과 동량의 MxA 단백질은 세포 내로 거의 도입되지 못하였으나 TAT-MxA 및 TAT-MxA₅₉₁ 단백질은 세포 내로 충분히 도입되는 것이 관찰되었다. 또한 세포질 내에서 올리고머(oligomer)를 형성하는 TAT-MxA 단백질에 비하여, TAT-MxA₅₉₁는 세포질 내에 다방면으로 퍼진 형태를 이루며 존재함을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다.

실시예 4: 재조합 TAT- MxA591 단백질의 인플루엔자 바이러스에 대한 방어효능 증진 효과 확인

세포투과성이 확인된 재조합 TAT-MxA₅₉₁ 단백질이 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어능을 높인다는 것을 확인하고, 이를 다시 마우스를 이용해 생체 내에서도 마찬가지의 효과를 일으키는가에 대하여 검증하였다. 구체적으로는 마우스 당 10 μg의 재조합 MxA 단백질을 비강 내에 투여하고 6시간 후 25 PFU의 인플루엔자 바이러스 PR8을 비강 내로 감염시킨 다음 마우스의 생존율을 측정하였다. 이 때 단백질이 포함되지 않은 투석 용액을 비강 내로 투여하고 24시간 후 비강에 25 PFU의 인플루엔자 바이러스 PR8을 감염시킨 마우스를 생존율 평가의 대조군으로 이용하였다. 생존율 측정 시 실험 종료의 기준으로, 마우스의 체중이 바이러스 감염을 실시한 날에 비하여 25% 이상 감소하였을 경우 마우스를 희생시켜 결과를 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 실험 결과 TAT-MxA₅₉₁을 비강으로 투여한 실험군이 대조군에 비하여 높은 생존율을 보여(P value < 0.05), 재조합 단백질 TAT-MxA₅₉₁이 생체 내에서도 마찬가지로 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어능을 높임을 확인하였다.

한편, 자가 응집을 일으키는 TAT-MxA 단백질과 비교하여 TAT-MxA₅₉₁의 생체 내 항 인플루엔자 방어능 증진 효과를 관찰한 결과, TAT-MxA₅₉₁을 투여한 실험군의 체중 감소가 더 적고 회복이 더 빠른 것을 확인하였다. 또한 감염 후 5일째에 기관지 세척액 내에 존재하는 바이러스의 역가를 플라크 어세이(plaque assay) 방법을 이용하여 측정한 결과, TAT-MxA₅₉₁를 투여한 실험군에서 인플루엔자 바이러스의 역가가 더 낮게 측정되어 자가 응집을 일으키지 않도록 구조를 변형시킨 TAT-MxA₅₉₁의 항 인플루엔자 방어능 증진 효과가 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 실시예 1 내지 4의 결과로부터, MxA 단백질의 GED 말단(C 터미널) 일부를 제거하여도 MxA 전체 단백질에 비하여 항바이러스 활성이 유지되거나, 오히려 더 증가하는 것을 알 수 있었다. 이는 제거된 GED 말단(C 터미널) 일부가 MxA 단백질의 자가 응집을 저해하여, 바이러스와의 결합을 촉진시키기 때문인 것으로 해석된다. 또한 생체 내에서도 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어능이 향상되어 생존율을 증가시키고, 체중 감소를 완화하며, 기관지 내 항바이러스 효과가 있는 것을 확인하였다. 이는 GED 말단(C 터미널) 일부를 제거한 MxA 단편 단백질이 효과적인 항바이러스 제제로서 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> CELL PERMEABLE MX-A RECOMBINANT PROTEIN <130> DPB173916 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Val Ser Glu Val Asp Ile Ala Lys Ala Asp Pro Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ser His Pro Leu Leu Leu Asn Gly Asp Ala Thr Val Ala Gln Lys Asn 20 25 30 Pro Gly Ser Val Ala Glu Asn Asn Leu Cys Ser Gln Tyr Glu Glu Lys 35 40 45 Val Arg Pro Cys Ile Asp Leu Ile Asp Ser Leu Arg Ala Leu Gly Val 50 55 60 Glu Gln Asp Leu Ala Leu Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Asp Gln Ser 65 70 75 80 Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Gly Val Ala Leu Pro 85 90 95 Arg Gly Ser Gly Ile Val Thr Arg Cys Pro Leu Val Leu Lys Leu Lys 100 105 110 Lys Leu Val Asn Glu Asp Lys Trp Arg Gly Lys Val Ser Tyr Gln Asp 115 120 125 Tyr Glu Ile Glu Ile Ser Asp Ala Ser Glu Val Glu Lys Glu Ile Asn 130 135 140 Lys Ala Gln Asn Ala Ile Ala Gly Glu Gly Met Gly Ile Ser His Glu 145 150 155 160 Leu Ile Thr Leu Glu Ile Ser Ser Arg Asp Val Pro Asp Leu Thr Leu 165 170 175 Ile Asp Leu Pro Gly Ile Thr Arg Val Ala Val Gly Asn Gln Pro Ala 180 185 190 Asp Ile Gly Tyr Lys Ile Lys Thr Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Gln Arg 195 200 205 Gln Glu Thr Ile Ser Leu Val Val Val Pro Ser Asn Val Asp Ile Ala 210 215 220 Thr Thr Glu Ala Leu Ser Met Ala Gln Glu Val Asp Pro Glu Gly Asp 225 230 235 240 Arg Thr Ile Gly Ile Leu Thr Lys Pro Asp Leu Val Asp Lys Gly Thr 245 250 255 Glu Asp Lys Val Val Asp Val Val Arg Asn Leu Val Phe His Leu Lys 260 265 270 Lys Gly Tyr Met Ile Val Lys Cys Arg Gly Gln Gln Glu Ile Gln Asp 275 280 285 Gln Leu Ser Leu Ser Glu Ala Leu Gln Arg Glu Lys Ile Phe Phe Glu 290 295 300 Asn His Pro Tyr Phe Arg Asp Leu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Thr Val 305 310 315 320 Pro Cys Leu Ala Glu Lys Leu Thr Ser Glu Leu Ile Thr His Ile Cys 325 330 335 Lys Ser Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Lys Glu Thr His Gln Arg 340 345 350 Ile Thr Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Gly Val Asp Ile Pro Glu Asp Glu 355 360 365 Asn Glu Lys Met Phe Phe Leu Ile Asp Lys Ile Asn Ala Phe Asn Gln 370 375 380 Asp Ile Thr Ala Leu Met Gln Gly Glu Glu Thr Val Gly Glu Glu Asp 385 390 395 400 Ile Arg Leu Phe Thr Arg Leu Arg His Glu Phe His Lys Trp Ser Thr 405 410 415 Ile Ile Glu Asn Asn Phe Gln Glu Gly His Lys Ile Leu Ser Arg Lys 420 425 430 Ile Gln Lys Phe Glu Asn Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Pro Gly Phe 435 440 445 Val Asn Tyr Arg Thr Phe Glu Thr Ile Val Lys Gln Gln Ile Lys Ala 450 455 460 Leu Glu Glu Pro Ala Val Asp Met Leu His Thr Val Thr Asp Met Val 465 470 475 480 Arg Leu Ala Phe Thr Asp Val Ser Ile Lys Asn Phe Glu Glu Phe Phe 485 490 495 Asn Leu His Arg Thr Ala Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu 500 505 510 Gln Glu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ile Arg Leu His Phe Gln Met Glu 515 520 525 Gln Ile Val Tyr Cys Gln Asp Gln Val Tyr Arg Gly Ala Leu Gln Lys 530 535 540 Val Arg Glu Lys Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys Ser Trp Asp 545 550 555 560 Phe Gly Ala Phe Gln Ser Ser Ser Ala Thr Asp Ser Ser Met Glu Glu 565 570 575 Ile Phe Gln His Leu Met Ala Tyr His Gln Glu Ala Ser 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Thr Asp Val Ser Ile Lys Asn Phe Glu Glu Phe Phe 485 490 495 Asn Leu His Arg Thr Ala Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu 500 505 510 Gln Glu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ile Arg Leu His Phe Gln Met Glu 515 520 525 Gln Ile Val Tyr Cys Gln Asp Gln Val Tyr Arg Gly Ala Leu Gln Lys 530 535 540 Val Arg Glu Lys Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys Ser Trp Asp 545 550 555 560 Phe Gly Ala Phe Gln Ser Ser Ser Ala Thr Asp Ser Ser Met Glu Glu 565 570 575 Ile Phe Gln His Leu Met Ala Tyr His Gln Glu Ala Ser Lys Arg 580 585 590

Claims

서열번호 5의 아미노산의 서열로 이루어지는 믹소 바이러스 저항성 A 단편 단백질의 N 말단에, 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)으로서, YGRKKRRORRR의 아미노산 서열로 이루어지는 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)가 연결되어 형성된, TAT-믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질.
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서열번호 5의 아미노산의 서열로 이루어지는 믹소 바이러스 저항성 A 단편 단백질의 N 말단에, 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)으로서, YGRKKRRORRR의 아미노산 서열로 이루어지는 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)가 연결되어 형성된, TAT-믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
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제 10항에 있어서,
상기 벡터는 대장균 과발현 벡터인, 재조합 벡터.
제 13 항에 있어서,
상기 벡터는 pET28a 벡터인, 재조합 벡터.
제 10항에 있어서,
상기 벡터는 히스티딘-표지(Histidine-tag) 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
서열번호 5의 아미노산의 서열로 이루어지는 믹소 바이러스 저항성 A 단편 단백질의 N 말단에, 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)으로서, YGRKKRRORRR의 아미노산 서열로 이루어지는 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)가 연결되어 형성된, TAT-믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
제 16항에 있어서,
상기 형질전환체는 미생물인, 형질전환체.
서열번호 5의 아미노산의 서열로 이루어지는 믹소 바이러스 저항성 A 단편 단백질의 N 말단에, 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)으로서, YGRKKRRORRR의 아미노산 서열로 이루어지는 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)가 연결되어 형성된, TAT-믹소바이러스 저항성 A 단편 단백질을 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 바이러스 속의 감염증을 예방 또는 치료하기 위한 약학조성물.
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