JP7207780B2 - 治療方法 - Google Patents

Description

出願データ
本願は、2014年10月21日に出願された米国特許仮出願第62/066,808号、発明の名称「A method of treatment」に関連し、かつその優先権を主張する。本仮出願の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。

分野
本開示は、ヒトおよび動物における、背側かつ末端の指節骨を覆う角状の外皮および動物における関連する脳の突出部、ならびにヒトおよび動物の表面上のケラチンを含む物質の真菌感染の制御に関する。これらの外皮および関連する突出部ならびにケラチンを含む物質の真菌感染の制御に有用な作用物質、天然製剤、合成製剤、および抽出物もまた、本開示に包含される。1つの態様において、本開示は、爪の真菌感染、特にヒトにおける爪真菌症の治療を教示する。

関連技術の説明
本明細書において著者によって言及された刊行物の文献の詳細は本明細書の最後にアルファベット順に集められている。

本明細書におけるいかなる先行技術に対する言及も、この先行技術があらゆる国における通常の一般常識の一部であることを認めるものでも、何らかの形で示唆するものでもなく、またそのように解釈されるべきではない。

侵襲を含む真菌感染は、ヒトおよび動物において重大な健康問題を引き起こすおそれがある。

化学的殺真菌剤は人間医学および獣医学において成功しているが、真菌感染を制御するための化学剤の継続使用に対する環境上および規制上の様々な懸念がある。これらの作用物質の使用の増加はまた、真菌種における耐性の出現に対する選択圧ももたらしている。真菌病原体によるヒトおよび動物における感染を制御する代替の方法を開発する必要性が明確に存在する。

特に問題となる状態は、皮膚糸状菌爪真菌症および爪白癬としても知られる、爪真菌症である(Rapini et al. (2007) Dermatology:全2巻, St. Louis: Mosby（非特許文献1）)。これは、ヒトおよび動物における爪および背側かつ末端の指節骨を覆う他の角状の外皮の真菌感染である。具体的には、それは、爪母、爪床または爪甲を含む爪単位の任意の構成要素を含む足指爪または手指爪の感染である。ヒトにおけるこの疾患は珍しくないが、感染した真菌は爪の中および下に入り込むことから、治療することは困難となる可能性がある。命には関わらないが、爪真菌症は、痛み、不快感、損なわれた外観を引き起こし、身体的ダメージと心理的ダメージの両方をもたらす可能性がある。爪真菌症の作用は広範にわたるものであり、生活の質に重大な影響を与える。

爪真菌症を引き起こす主な病原体は、皮膚糸状菌であるトリコフィトン・ルブルム(Tricophyton rubrum)およびトリコフィトン・メンタグロフィテス(Trichophyton mentagrophytes)であり、症例の90％をトリコフィトン・ルブルム(T. rubrum)が占める(Sotiriou et al. (2010) Acta Derm-Venereol 9(2):216-217（非特許文献2）)。

爪真菌症の治療は臨床亜型、罹患した爪の数、および爪病変の重症度によって決まる。経口薬物は最も有効であるが、それらの使用を妨げるいくつかの要因が存在する。多くの経口抗真菌医薬への全身暴露に関連する肝毒性を含む副作用は、経口医薬を魅力のないものにする。さらに、老人は、大きな爪真菌症罹患層であり、併用薬の頻繁な使用による望ましくない薬物-薬物相互作用は経口医薬を使用できなくしてしまう。このことは、爪真菌症を治療する局所療法の開発の重要性を強調する。多くの治療は、局所用または経口用いずれかの抗真菌製剤を伴う(Westerberg et al. (2013) American Family Physician 88(11):762-770（非特許文献3）)。経口医薬には、テルビナフィン、イトラコナゾールおよびフルコナゾールが含まれる(上記Westerberg et al. (2013)（非特許文献3）)。これらの治療は、14～38％の症例において感染を治癒するに過ぎず、肝臓障害の高い危険性を伴う。局所用医薬には、シクロピロックス、クロトリマゾール、アモロルフィン、エフィナコナゾール、タバボロール、およびブテナフィンが含まれる。これらの治療は、5から17％の治癒率を有し、少なくとも48週間毎日適用しなければならない。これらの低治癒率は、爪を通る活性成分の浸透が非常に悪いこと、ならびに真菌細胞の殺傷よりもむしろ真菌増殖のみを阻害し、真菌の保有体の存続または爪の再感染を可能にする静真菌性作用機序の結果である。加えて、長期の治療計画により、多くの患者が服薬を遵守しない。これらの治療のいずれも完全には有効ではなく、症状は何年もの間続く可能性がある。

感染の部位に到達する局所的爪真菌症治療のためには、抗真菌剤は爪に浸透できなければならない。複数のモデル抗糸状菌薬によるヒト爪甲の浸透およびウシ蹄由来のケラチン膜の浸透の研究によって、分子量が増加するにつれ、爪浸透性は低下することが示された(Mertin and Lippold (1997) J Pharm Pharmacol 49:866-872（非特許文献4）; Kobayashi et al (2004) Eur J Pharm Sci 21:471-477（非特許文献5）)。試験したモデル薬物のいずれも1000未満の分子量を有した。これらの研究は、MW＞5000を有する分子は爪に浸透することができないことを示唆する。

別の問題となる状態は、髪、および髪と毛包との境界面を含む他のケラチンを含む物質の真菌感染である。この状態は、頭部白癬または頭皮白癬として知られていることが多い。治療は、グリセオフルビン、テルビナフィン、およびイトラコナゾールを含む経口医薬の形態をとりうる。局所治療には、ケトコナゾール、シクロピロックス、ピロクトン、およびジンクピリチオンなどの抗真菌剤を含有するシャンプーが含まれる。頭皮および皮膚の真菌感染はまた、脂漏性皮膚炎および頭部秕糠疹などの状態につながる、皮膚の刺激および剥離を引き起こす可能性がある。抗真菌剤を含有するシャンプーを用いて、真菌感染により引き起こされる頭部秕糠疹を治療することができる。

植物ディフェンシンは、4から5個のジスルフィド結合を有する小さな(45～54アミノ酸)塩基性タンパク質である(Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):214-8222（非特許文献6）)。これらは、共通のジスルフィド結合パターンおよび共通の構造折り畳みを有し、3個のジスルフィド結合によって3本鎖の逆平行βシートがαヘリックスに繋ぎ止められて、システイン安定化αβモチーフを形成する。4番目のジスルフィド結合もまたN末端とC末端を接続して、極めて安定な構造をもたらす。植物ディフェンシンは、抗細菌活性、タンパク質合成阻害、α-アミラーゼおよびプロテアーゼの阻害、花発達および花粉感知における役割、ならびに抗真菌活性を含む、多くの生物機能を有しうる(Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2):191-194（非特許文献7）; Bloch and Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104（非特許文献8）; van der Weerden et al (2013) Fungal Biol Rev 26:121-131（非特許文献9）)。

ディフェンシンの構造は、システイン残基間の領域と定義される7本の「ループ」からなる。ループ1は、1番目のβ鎖(1A)、ならびに最初の2つのインバリアントシステイン残基間にあるαヘリックスにこのβ鎖を連結させる可動性領域の大部分(1B)を含む。ループ2、ループ3、およびループ4の最初の部分(4A)はαヘリックスを構成し、残りのループ(4B～7)はβ鎖2およびβ鎖3、ならびにこれらを連結する可動性領域(βヘアピン領域)を構成する(van der Weerden et al. (2013) Cell Mol Life Sci 70 (19): 3545-3570（非特許文献10）)。植物ディフェンシンのループ5は、抗真菌活性に必須であること、およびこれらのタンパク質の作用機序の重要な決定因子であることが知られている(Sagaram et al., (2011) PLoS One 6.4: e18550（非特許文献11）)。

植物ディフェンシンは概して、8個の完全に保存されたシステイン残基を共有する。これらの残基は、その存在、位置および連結性がディフェンシン間で保存されていることから、通常「インバリアントシステイン残基」と呼ばれる。植物ディフェンシンは、配列類似性に基づいて、異なるグループに分類することができる。各グループ内では、配列相同性は比較的高いが、グループ間アミノ酸類似性は低い(van der Weerden et al. (2013) Fungal Biol Rev 26:121-131（非特許文献9）)。異なるグループに属する植物ディフェンシンは概して、異なる生物活性、または同じ生物活性について異なる作用機序を有する。例えば、ラディッシュペプチドRsAFP2のグループに属する植物ディフェンシンは、細胞壁中のスフィンゴ脂質に結合することによって真菌増殖を阻害する(Thevissen et al. (2012) Mol Microbiol 84(1):166-180（非特許文献12）)。これに対して、ニコチアナ(Nicotiana)ディフェンシンNaD1のグループに属する植物ディフェンシンは、真菌細胞に侵入し、活性酸素種(ROS)の産生を誘発し、細胞溶解をもたらすことによって真菌増殖を阻害する(Hayes et al. (2013) Antimicrob Agents Ch 57(8)3667-3675（非特許文献13）)。

植物ディフェンシンには2つの主なクラスが存在する。クラスIディフェンシンは、小胞体(ER)シグナル配列とその後に続く成熟ディフェンシンドメインからなる。クラスIIディフェンシンは、約33アミノ酸のC末端プロドメインまたはプロペプチド(CTPP)を有するより大きな前駆体として産生される。今までに特定されたクラスIIディフェンシンの大部分はナス科植物種において発見されている。

本発明以前には安全かつ有効な治療が利用できなかった、ヒトおよび動物における真菌感染、特にヒトにおける爪真菌症をより効果的に管理するプロトコールを開発する必要がある。一部のディフェンシンは抗真菌特性を有するものの、それらの活性は異なる真菌病原体間で大きく異なり、かつ示された活性の大部分は植物真菌病原体に対するものである。加えて、それらのサイズ(MW＞5000Da)は、それらの爪内への透過性を制限するように思われる。

Rapini et al. (2007) Dermatology:全2巻, St. Louis: Mosby Sotiriou et al. (2010) Acta Derm-Venereol 9(2):216-217 Westerberg et al. (2013) American Family Physician 88(11):762-770 Mertin and Lippold (1997) J Pharm Pharmacol 49:866-872 Kobayashi et al (2004) Eur J Pharm Sci 21:471-477 Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):214-8222 Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2):191-194 Bloch and Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104 van der Weerden et al (2013) Fungal Biol Rev 26:121-131 van der Weerden et al. (2013) Cell Mol Life Sci 70 (19): 3545-3570 Sagaram et al., (2011) PLoS One 6.4: e18550 Thevissen et al. (2012) Mol Microbiol 84(1):166-180 Hayes et al. (2013) Antimicrob Agents Ch 57(8)3667-3675

概要
アミノ酸配列は配列識別子番号(SEQ ID NO)によって表される。SEQ ID NOは、配列識別子<400>1(SEQ ID NO:1)、<400>2(SEQ ID NO:2)などに数値的に対応する。配列識別子をまとめたものを表1に示す。配列表は、添付の特許請求の範囲の後に示す。

本開示は、一部のディフェンシンは、そのサイズにもかかわらず、爪に効果的に透過し、真菌感染を治療することができるという驚くべき決定に一部基づいている。加えて、一部の植物ディフェンシンは、植物真菌病原体を標的とするように進化しているにもかかわらず、哺乳類細胞に対するオフターゲット活性を有さずに、トリコフィトン・ルブルム(Trichophyton rubrum)などの爪真菌症を引き起こす真菌病原体に対して強力な活性を有する。さらに驚くことに、一部の植物ディフェンシンは、接触によって真菌細胞を殺傷することができる殺真菌性の作用機序を有する。したがって、本開示は、対象における、背側かつ末端の指節骨を覆う角状の外皮もしくは関連する脳の突出部、または対象上のケラチンを含む物質の中またはその上にある真菌病原体による感染を阻害するための方法であって、外皮もしくは突出部またはケラチン含む物質を、SEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を有する植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体の有効量と接触させる工程を含む、方法を教示する。1つの態様において、ディフェンシンは、HXL008(SEQ ID NO:1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、およびHXL036(SEQ ID NO:3)からなる群より選択される。本明細書において企図される他のディフェンシンは、HXL001(SEQ ID NO:4)、HXL002(SEQ ID NO:5)、HXL003(SEQ ID NO:6)、HXL004(SEQ ID NO:7)、HXL005(SEQ ID NO:8)、HXL009(SEQ ID NO:9)、HXL012(SEQ ID NO:10)、HXL013(SEQ ID NO:11)、HXL015(SEQ ID NO:12)、HXL032(SEQ ID NO:13)、HXL033(SEQ ID NO:14)、HXL034(SEQ ID NO:15)、NsD1(SEQ ID NO:16)、NsD2(SEQ ID NO:17)、NaD1(SEQ ID NO:18)、NoD173(SEQ ID NO:19)、DmAMP1(SEQ ID NO:20)、HXP4(SEQ ID NO:21)；HXP34(SEQ ID NO:22)、HXP35(SEQ ID NO:23)、およびN末端アラニン残基の付加を有する上記のいずれか(それぞれSEQ ID NO:25～47)、および最適アライメント後にSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも約80％アミノ酸配列類似性を有する植物ディフェンシンからなる群より選択される。ディフェンシンは概して、真菌増殖を根絶するかあるいはそうでなければそれを制御するのに十分な時間および条件下で、角状外皮またはケラチンを含む物質に局所的に適用することによって接触させる。外皮には、手指および足指の爪、ならびにかぎ爪、蹄、および角が含まれる。1つの態様において、本開示は、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体の有効量を対象に投与する工程を含み、該植物ディフェンシンまたは変異体がSEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を有する、対象における爪真菌症または関連する状態の治療のための方法を可能にする。1つの態様において、ディフェンシンは、SEQ ID NO:1～3、またはSEQ ID NO:4～47のいずれか1つ、またはSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも約80％の類似性を有するディフェンシンからなる群より選択される。特定の態様において、ディフェンシンは、HXL008(SEQ ID NO:1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、もしくはHXL036(SEQ ID NO:3)、またはN末端アラニン残基を含むディフェンシン(それぞれSEQ ID NO:25～27)を含むその機能的な天然のもしくは合成の変異体のいずれか1つである。

別の態様において、ケラチンを含む物質は髪または毛皮である。この態様において、本開示は、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体の有効量を対象に投与する工程を含み、選択された該植物ディフェンシンまたは変異体がSEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を有する、対象における髪または毛皮の真菌感染の治療のための方法を可能にする。1つの態様において、ディフェンシンは、SEQ ID NO:1～3、またはSEQ ID NO:4～47のいずれか1つ、またはSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも約80％の類似性を有するディフェンシンからなる群より選択される。特定の態様において、ディフェンシンは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、もしくはSEQ ID NO:3、またはN末端アラニン残基を含むディフェンシン(それぞれSEQ ID NO:25～27)を含むその機能的な天然のもしくは合成の変異体から選択される。別の態様において、ケラチンを含む物質は皮膚である。この態様において、本開示は、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体の有効量を対象に投与する工程を含み、選択された該植物ディフェンシンまたは変異体がSEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を有する、対象における皮膚の真菌感染の治療のための方法を可能にする。1つの態様において、ディフェンシンは、SEQ ID NO:1～3、またはSEQ ID NO:4～47のいずれか1つ、またはSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも約80％の類似性を有するディフェンシンからなる群より選択される。特定の態様において、ディフェンシンは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、もしくはSEQ ID NO:3、またはN末端アラニン残基を含むディフェンシン(それぞれSEQ ID NO:25～27)を含むその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体によって定義される。

治療プロトコールでの使用のために企図されるディフェンシンを表2に列記し、同様に、最適アライメント後に表2に列記したディフェンシンのいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンも列記する。簡潔にするために、以下、「SEQ ID NO:1～47」への言及には、SEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンが含まれる。1つの態様において、ディフェンシンは、浸透性ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体である。合成変異体の例には、クラスIディフェンシンに由来するループ1Bがナス科クラスIIディフェンシン由来のループ1Bを置換している変異体が含まれる。これらはHXP4、HXP34、およびHXP35である。他の変異体または誘導体には、そのN末端にアラニン残基を含む(すなわち、SEQ ID NO:25～47)、表2に列記したディフェンシン、または表2に列記したディフェンシンに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンが含まれる。ディフェンシンのN末端におけるアラニンの付加は、STE13プロテアーゼ部位の必要なしにピキア・パストリス(Pichia pastoris)発現系においてペプチドを組換え産生できるようにする。STE13部位は正常には、KEX2によるα-接合因子分泌シグナルの効果的なプロセシングを可能にする。しかしながら、高発現負荷下では、STE13プロテアーゼ切断は、非効率になりペプチドのN末端にGlu-Alaリピートを残すことにつながる可能性がある。これらのリピートによって与えられる追加の負電荷は、植物ディフェンシンの活性に対して有害なものとなりうる。STE13プロテアーゼ部位は、アラニンで置換され、不完全なプロセシングを防ぐことができる(Cabral et al., (2003) Protein Expres Purif 31(1):115-122)。N末端アラニンの存在はまた、赤血球細胞を溶解するディフェンシンの能力を低減させることができる(WO 2011/16074)。

1つの態様において、表2に列記したディフェンシン(SEQ ID NO:1～47)は、ペプチドの安定性を増強するように改変される。さらなる態様において、これは、アスパラギンおよびグルタミンなど脱アミドを受けやすいアミノ酸、またはアスパラギン酸など異性化を受けやすいアミノ酸を、修飾を受けにくいアミノ酸に置換することによって達成される。特定の態様において、ディフェンシンHXL008、HXL035、またはHXL036は、18、36または42位で改変される。

1つの態様において、表2に列記したディフェンシン(SEQ ID NO:1～47)は、ペプチドの正電荷を増加させるように改変される。正電荷は、植物ディフェンシンを含む抗微生物ペプチドの活性にとって重要であることが公知である(Sagaram et al., (2011) PLoS One 6.4: e18550)。1つの態様において、正電荷の増加は、グルタミン酸またはアスパラギン酸などの負の電荷を帯びた残基を中性アミノ酸に置換することによって達成される。1つの態様において、中性アミノ酸はアラニンまたはグリシンである。別の態様において、正電荷の増加は、中性アミノ酸をリジンまたはアルギニンなどの正の電荷を帯びた残基に置換することによって達成される。

保存アミノ酸の変更も本明細書において企図される。

1つの態様において、治療には、ディフェンシンではないペプチド、プロテイナーゼ阻害剤、別のディフェンシン、またはタンパク質性のもしくは非タンパク質性の(すなわち、化学的)殺真菌剤と組み合わせたディフェンシンが含まれる。

真菌病原体は、対象における手指もしくは足指の爪、かぎ爪、蹄、または角における爪真菌症または関連する状態の一因となる病原体である。

「爪」への言及には、ヒトおよび動物における背側かつ末端の指節骨を覆う任意の角状の外皮、および動物における関連する脳の突出部(すなわち、角)が含まれる。「爪真菌症関連状態」は、ヒト、非ヒト霊長類、もしくは動物の爪の周囲の表皮における感染、または動物におけるかぎ爪、蹄、もしくは角状突出部の中または上における感染である。関連状態の例は白癬である。

真菌性病原体には、皮膚糸状菌、酵母、および皮膚糸状菌ではない糸状菌が含まれる。皮膚糸状菌は、トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・インタージギターレ(Trichophyton interdigitale)、トリコフィトン・ビオラセウム(Trichophyton violaceum)、トリコフィトン・トンスランス(Trichophyton tonsurans)、およびトリコフィトン・ソウダネンセ(Trichophyton soudanense)を含むトリコフィトン種(Trichophyton species)、ミクロスポルム・フルブム(Microsporum fulvum)、エピデルモフィトン・フロッコーズム(Epidermophyton floccosum)、およびミクロスポルム・ギプセウム(Microsporum gypseum)を包含する。酵母は、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)およびカンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)を含むカンジダ種(Candida species)を包含する。

1つの態様において、ディフェンシンは感染領域に局所的に適用され、爪または角状構造を透過し、感染の部位に蓄積する。驚くべきことに、限定されるわけではないがHXL008(SEQ ID NO:1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、およびHXL036(SEQ ID NO:3)などの一部のディフェンシンが、爪を通る透過の程度が高く、かつ皮膚糸状菌病原体および皮膚糸状菌ではない糸状菌の強力な殺真菌性阻害剤であり、よって、爪真菌症などの状態の治療において非常に有効なものになることが確かめられる。1つの態様において、ディフェンシンは、哺乳類細胞または細菌細胞に対するオフターゲット活性を有さない。哺乳類細胞に対する活性は、皮膚刺激性および他の副作用の可能性を増大させる。細菌細胞に対する活性は、その領域における天然の有益なミクロフローラを崩壊させるおそれがある。天然のミクロフローラが真菌感染を妨げる際に重要な役割を果たすことは周知である(Reid et al., (2011) Nature Reviews Microbiology 9: 27-38)。

本明細書ではさらに、SEQ ID NO:1～47から選択された植物ディフェンシンを含む植物抽出物または酵母抽出物(例えば、ディフェンシンを産生するように遺伝的に改変されたピキアの抽出物)を含む製剤または抽出物を教示する。製剤または抽出物は、別の活性剤、または少なくとも1つの製剤または抽出物が本明細書で定義されたディフェンシンを含む製剤または抽出物の組み合わせをさらに含んでもよく、それらは使用前に混合されるか、またはいずれかの順で順次用いられる。植物ディフェンシン、または本明細書に定義されているのと同じものを含む抽出物は、例えば、ハーブ製剤、ならびに浸漬液を含む天然の身体用または爪用の洗浄剤およびシャンプーの形態などで用いられてもよい。ディフェンシンは概して、標的部位(例えば、爪または皮膚または髪または毛皮の繊維)内への透過を可能にするように製剤化される。

本明細書において、対象における背側かつ末端の指節骨を覆う角状外皮または関連する脳の突出部の真菌感染の治療または予防のための医薬の製造における、SEQ ID NO:1～47によって定義される植物ディフェンシンの使用が可能になる。本明細書ではまた、対象における背側かつ末端の指節骨を覆う角状外皮または関連する脳の突出部の真菌感染の治療または予防において使用するためのSEQ ID NO:1～47によって定義される植物ディフェンシンも教示される。本明細書において、対象上のケラチンを含む物質の真菌感染を治療または予防するための医薬の製造における、SEQ ID NO:1～47によって定義される植物ディフェンシンの使用が可能になる。本明細書ではまた、SEQ ID NO:1～47によって定義される植物ディフェンシンも教示される。特定の態様において、ディフェンシンは、コンセンサス配列SEQ ID NO:24またはその機能的な天然のもしくは合成の変異体によって定義される。例には、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3によって定義されるディフェンシン、ならびにN末端アラニン残基を含む該ディフェンシン(それぞれSEQ ID NO:25～27)が含まれる。

1つの態様において、真菌感染は、爪真菌症または関連する状態を引き起こす。

概して、治療される対象は、手指の爪または足指の爪の爪真菌症または関連する状態を有するヒトである。しかしながら、本発明はまた、例えば非ヒト霊長類、家畜動物、および角のある動物などにおける、動物の手指および足指の爪、かぎ爪、ならびに該当する場合は角を治療することにも関する。

さらに、本明細書において、微生物を含む組成物の製造における使用のための、本明細書で定義されたディフェンシンを発現するように操作された単離された微生物が企図される。微生物の例はピキアである。そのような組成物は、ヒトおよび動物の治療において有用である。あるいは、ディフェンシンは、植物抽出物または微生物抽出物を含む細胞抽出物として提供される。

本明細書では、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を含み、該植物ディフェンシンまたは変異体がSEQ ID NO:1～47からなるリストから選択される、区画に分かれた形態での真菌感染を治療するためのキットも教示される。最適な態様において、別の区画が第2の活性剤を含み、および任意でさらなる区画中に別々にまたは既存の区画中に一緒に薬学的にまたは獣医学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む。1つの態様において、ディフェンシンは、SEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列によって定義される。例には、HXL008(SEQ ID NO:1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、およびHXL036(SEQ ID NO:3)が含まれる。

1つの態様において、本明細書における使用のために企図されるディフェンシンは、N末端アラニン残基を含んでも含まなくてもよい。これは特に、N末端アラニン残基を含む一部の組換えディフェンシンに当てはまる。本明細書において「ディフェンシン」の定義には、N末端アラニンを有するSEQ ID NO:1～23、すなわち、SEQ ID NO:25～47のいずれも包含される。コンセンサスアミノ酸配列、SEQ ID NO:24は、任意の末端アラニン残基を有する。
[本発明1001]
対象上の、背側もしくは末端の指節骨を覆う角状の外皮または関連する脳の突出部またはケラチンを含む物質またはケラチンを含む物質のための毛包に対する真菌病原体の感染を阻害するための方法であって、感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、外皮または突出部またはケラチンを含む物質を、外皮もしくは突出部もしくはケラチンを含む物質を透過するSEQ ID NO:1～47から選択される植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体または最適アライメント後にSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンまたはN末端アラニン残基を有するSEQ ID NO:1～23から選択されるディフェンシン(SEQ ID NO:25～47)または外皮もしくは突出部もしくはケラチンを含む物質を透過するように製剤化されたディフェンシンの有効量と接触させる工程を含む、方法。
[本発明1002]
外皮が、足指もしくは手指の爪、かぎ爪、または蹄であり、関連する脳の突出部が角である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
感染が、爪真菌症または関連する状態に関連する、本発明1002の方法。
[本発明1004]
関連する状態が、爪、かぎ爪、蹄、または角の周囲の表皮組織の白癬または感染である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
ケラチンを含む物質が、髪、毛皮、または皮膚である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
ディフェンシンが、SEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
ディフェンシンが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
ディフェンシンが、SEQ ID NO:4～23およびSEQ ID NO:25～47からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
ディフェンシン変異体が、ナス科クラスIIディフェンシン由来の対応するループ1Bを置換するクラスIディフェンシン由来のループ1Bを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
ディフェンシン変異体が、HXP4、HXP34、およびHXP35からなるリストから選択される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
ディフェンシンが、抗真菌剤との相乗的組み合わせで用いられる、本発明1001の方法。
[本発明1012]
抗真菌剤が、約0.4～約12 kDのペプチドまたはプロテイナーゼ阻害剤である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
抗真菌剤が、テルビナフィン、イトラコナゾール(intraconazole)、フルコナゾール、シクロピロックス、クロトリマゾール、アモロルフィン、およびブテナフィンから選択される化学的殺真菌剤である、本発明1011の方法。
[本発明1014]
真菌病原体が、皮膚糸状菌、カンジダ種、および非皮膚糸状菌から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
皮膚糸状菌が、トリコフィトン・ルブルム(Trichophyton rubrum)、トリコフィトン・インタージギターレ(Trichophyton interdigitale)、トリコフィトン・ビオラセウム(Trichophyton violaceum)、トリコフィトン・トンスランス(Trichophyton tonsurans)、トリコフィトン・ソウダネンセ(Trichophyton soudanense)、トリコフィトン・メンタグロフィテス(Trichophyton mentagrophytes)を含むトリコフィトン属の種(Trichophyton species)、ミクロスポルム・フルブム(Microsporum fulvum)、エピデルモフィトン・フロッコーズム(Epidermophyton floccosum)、またはミクロスポルム・ギプセウム(Microsporum gypseum)である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
非皮膚糸状菌が、ネオスキタリジウム属(Neoscytalidium)、スコプラリオプシス属(Scopulariopsis)、アクレモニウム属(Acremonium)、およびスキタリジウム属(Scytalidium)の種である、本発明1014の方法。
[本発明1017]
非皮膚糸状菌が、ネオスキタリジウム属およびスコプラリオプシス属の種を含む、本発明1014の方法。
[本発明1018]
感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下でのSEQ ID NO:1～47から選択される植物ディフェンシン、またはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体、または最適アライメント後にSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシン、またはN末端アラニン残基を有するSEQ ID NO:1～23(SEQ ID NO:25～47)から選択されるディフェンシン、ならびに1つまたは複数の薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤を含む、爪真菌症または関連する状態を治療するのに使用するための、局所用製剤または細胞もしくは植物抽出物。
[本発明1019]
関連する状態が白癬である、本発明1018の製剤または細胞もしくは植物抽出物。
[本発明1020]
感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下でのSEQ ID NO:1～47から選択される植物ディフェンシン、またはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体、または最適アライメント後にSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシン、またはN末端アラニン残基を有するSEQ ID NO:1～23(SEQ ID NO:25～47)から選択されるディフェンシン、ならびに1つまたは複数の薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤を含む、ケラチンを含む物質の感染を治療するのに使用するための、局所用製剤または細胞もしくは植物抽出物。
[本発明1021]
ケラチンを含む物質が、髪、毛皮、または皮膚である、本発明1020の製剤または細胞もしくは植物抽出物。
[本発明1022]
製剤が、身体用もしくは髪用の洗浄剤もしくは塗布剤、スプレー、滴剤、クリーム、またはローションアプリケータである、本発明1018～1021のいずれかの製剤または細胞もしくは植物抽出物。
[本発明1023]
ディフェンシンがコンセンサスアミノ酸配列SEQ ID NO:24によって定義される、本発明1018または1020の製剤または細胞もしくは植物抽出物。
[本発明1024]
ディフェンシンが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される、本発明1023の製剤または細胞もしくは植物抽出物。
[本発明1025]
ヒトまたは動物対象における爪真菌症または関連する状態の治療または予防のための医薬の製造における、本発明1018～1024のいずれかの製剤または細胞もしくは植物抽出物の使用。
[本発明1026]
ヒトまたは動物対象上のケラチンを含む物質の治療または予防のための医薬の製造における、本発明1018～1024のいずれかの製剤または細胞もしくは植物抽出物の使用。
[本発明1027]
ケラチンを含む物質が髪、毛皮、または皮膚である、本発明1026の使用。
[本発明1028]
爪、かぎ爪、蹄、または角上の真菌病原体の感染を阻害するための方法であって、感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、爪、かぎ爪、蹄、または角を、爪、かぎ爪、蹄、または角を透過するSEQ ID NO:1～47から選択される植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体または最適アライメント後にSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンまたはN末端アラニン残基を有するSEQ ID NO:1～23(SEQ ID NO:25～47)から選択されるディフェンシンまたは爪、かぎ爪、蹄、もしくは角を透過するように製剤化されたディフェンシンの有効量と接触させる工程を含む、方法。
[本発明1029]
症状が爪真菌症または関連する状態に関連する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
関連する状態が、爪、かぎ爪、蹄、または角の周囲にある表皮における白癬または感染である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
ケラチンを含む物質に感染する真菌病原体の感染を阻害するための方法であって、感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、該物質を、ケラチンを透過するSEQ ID NO:1～47から選択される植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体または最適アライメント後にSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンまたはN末端アラニン残基を有するSEQ ID NO:1～23(SEQ ID NO:25～47)から選択されるディフェンシンまたはケラチンを透過するように製剤化されたディフェンシンの有効量と接触させる工程を含む、方法。
[本発明1032]
ケラチンを含む物質が、髪、毛皮、または皮膚である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
ディフェンシンがコンセンサスアミノ酸配列SEQ ID NO:24によって定義される、本発明1028または1031の方法。
[本発明1034]
ディフェンシンが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される、本発明1033の方法。

（表１）配列識別子の概要

HXLタンパク質のアミノ酸配列は、米国特許第6,911,577号および関連する特許ファミリーの各出願に記載されている。

（表２）植物ディフェンシンの例

本明細書に包含されるさまざまなディフェンシンのアミノ酸のアライメントを表したものである。 本明細書に包含されるさまざまなディフェンシンのアミノ酸のアライメントを表したものである。 本明細書に包含されるさまざまなディフェンシンのアミノ酸のアライメントを表したものである。 本明細書に包含されるさまざまなディフェンシンのアミノ酸のアライメントを表したものである。 本明細書に包含されるさまざまなディフェンシンのアミノ酸のアライメントを表したものである。 図2(a)～(d)は、トリコフィトン・ルブルムの4種の臨床分離株の増殖に対する植物ディフェンシンNaD1(破線)およびHXL008(実線)のインビトロでの効果を示すグラフを表したものである。真菌増殖を、増殖培地の播種の72時間後に達成される595 nm(A595)での吸光度の増加によって測定し、タンパク質濃度(μg/mL、横軸)に対して、非タンパク質対照に対する増殖のパーセンテージ(縦軸)としてプロットする。 図2(a)～(d)は、トリコフィトン・ルブルムの4種の臨床分離株の増殖に対する植物ディフェンシンNaD1(破線)およびHXL008(実線)のインビトロでの効果を示すグラフを表したものである。真菌増殖を、増殖培地の播種の72時間後に達成される595 nm(A595)での吸光度の増加によって測定し、タンパク質濃度(μg/mL、横軸)に対して、非タンパク質対照に対する増殖のパーセンテージ(縦軸)としてプロットする。 図2(a)～(d)は、トリコフィトン・ルブルムの4種の臨床分離株の増殖に対する植物ディフェンシンNaD1(破線)およびHXL008(実線)のインビトロでの効果を示すグラフを表したものである。真菌増殖を、増殖培地の播種の72時間後に達成される595 nm(A595)での吸光度の増加によって測定し、タンパク質濃度(μg/mL、横軸)に対して、非タンパク質対照に対する増殖のパーセンテージ(縦軸)としてプロットする。 図2(a)～(d)は、トリコフィトン・ルブルムの4種の臨床分離株の増殖に対する植物ディフェンシンNaD1(破線)およびHXL008(実線)のインビトロでの効果を示すグラフを表したものである。真菌増殖を、増殖培地の播種の72時間後に達成される595 nm(A595)での吸光度の増加によって測定し、タンパク質濃度(μg/mL、横軸)に対して、非タンパク質対照に対する増殖のパーセンテージ(縦軸)としてプロットする。 (a)から(e)は、100 μM HXL008による72時間の処理後に寒天プレート上に増殖したトリコフィトン・ルブルムの生存コロニーの写真により表したものである。パネル(a)から(d)はそれぞれ、臨床分離株14-01、14-02、14-03および13-04を表したものである。生存コロニーに黒の長方形で印をつける。パネル(e)は、HXL008で処理していないトリコフィトン・ルブルムの増殖を表示する。 (a)から(c)は、HXL008を毎日投与した後のトリコフィトン・ルブルムの生存コロニーの表示である。図4aは、0 μg/mL(左パネル)、10 μg/mL(中央パネル)または50 μg/mL(右パネル)のHXL008で毎日処理した後に1/2サブローデキストロース寒天培地(SDA)上に生存するコロニーの写真である。プレートは、24 h(上パネル)、14 d(中央パネル)または25 d(下パネル)にわたって処理した培養からのものである。図4bは、HXL008(50 μg/mL/日)で毎日処理した後に100 μLの培養中に生存するコロニーの数のグラフを表したものである。図4cは、HXL008の非存在下(左)または10 μg/mL(中央)もしくは50 μg/mL(右)のHXL008存在下での培養の写真である。 爪の下でレセプター溶液として機能する湿った綿棒による爪アダプターシステムを用いる、HXL008(黒三角、黒色の実線)、NaD1(黒星印、黒色の実線)、HXL004(ドット柄の円、黒色の破線)、HXL012(灰色四角、灰色の破線)、タバボロール(黒ダイヤ、黒色の破線)、シクロピロックス(ドット柄の四角、黒色の実線)、およびエフィナコナゾール(灰色円、灰色の実線)による爪の透過を表したものである。 さまざまな濃度の植物ディフェンシンNaD1(◆ 点線)、HXL004(● 破線)およびHXL008(▲ 破線)の存在下での大腸菌(Escherichia coli)の増殖の表示である。ヒト抗微生物ペプチドLL37(■ 点線)を対照として用いた。 rNaD1、HXP4、HXL001、HXL002、HXL004、HXL005、HXL008、HXL009、HXL012、およびHXL013(10 μM)によるヒトU937細胞の浸透性を表したものである。浸透性を、蛍光色素ヨウ化プロピジウム(PI)の取り込みをモニターすることによって測定した。 水対照に対して測定したHXL008、HXL004、およびNaD1により誘発される赤血球細胞の溶解を表したものである。 水(黒色棒)、50 mMクエン酸緩衝液pH 4.0(縞柄の棒)、および50 mMクエン酸緩衝液 pH 4.0、20％ v/vエタノール、0.5mM EDTA(灰色棒)の異なる製剤中のHXL008による経時的な爪透過の表示である。 (a)から(c)は、精製したHXL008＋alaのSDS-PAGE、RP-HPLCおよび質量分析を表したものである。(a)は、精製したHXL008＋alaのSDS-PAGEゲルである。レーン1、2および14は分子量マーカー(SeeBlue(登録商標) Plus 2)である。レーン3および4はHXL008＋alaスタンダード(5 μg)である。レーン5から12は、プールされたサイズ排除画分からの試料である。(b)はプールされた溶出液のRP-HPLCトレースである。約7.1分で単一ピークを観察する。(c)は4 kDaから20 kDaのMALDI-TOF質量分析トレースである。 HXL008、HXL035およびHXL036のアミノ酸アライメント、ならびに該アライメントによって生じるコンセンサス配列を表したものである。同一のアミノ酸を黒色で強調し、保存アミノ酸を灰色で強調する。

詳細な説明
本明細書全体を通じて、文脈によって他に必要とされない限り、単語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変化形は、規定された要素もしくは整数もしくは方法の工程、または要素もしくは整数もしくは方法の工程の集まりを含むことを意味するが、任意の要素もしくは整数もしくは方法の工程、または要素もしくは整数もしくは方法の工程の集まりを排除することを意味しないことが理解されるだろう。

本明細書において用いられる単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」には、特に文脈によって他に明確に規定されていない限り、複数の局面が含まれる。よって、例えば、「1つのディフェンシン」への言及には1種類のディフェンシンならびに2種類以上のディフェンシンが含まれ；「1つの作用物質」への言及には1種類の作用物質ならびに2種類以上の作用物質が含まれ；「その開示」への言及にはその開示によって教示される1つの局面および複数の局面が含まれる。本明細書において教示されるおよび実施可能となる局面は「発明」という用語によって包含される。全てのそのような局面は本発明の広がりの範囲内で実施可能である。全ての変異体および誘導体またはさまざまな局面は本発明の「形態」という用語に包含される。

「ディフェンシン」への言及は、抗真菌活性を保持する以下の植物ディフェンシンの1つを意味する：
(i)SEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を有するディフェンシン；
(ii)HXL008(SEQ ID NO:1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、およびHXL036(SEQ ID NO:3)からなる群より選択されるディフェンシン；
(iii)HXL001(SEQ ID NO:4)、HXL002(SEQ ID NO:5)、HXP35(SEQ ID NO:3)、HXL003(SEQ ID NO:6)、HXL004(SEQ ID NO:7)、HXL005(SEQ ID NO:8)、HXL009(SEQ ID NO:9)、HXL012(SEQ ID NO:10)、HXL013(SEQ ID NO:11)、HXL015(SEQ ID NO:12)、HXL032(SEQ ID NO:13)、HXL033(SEQ ID NO:14)、HXL034(SEQ ID NO:15)、NsD1(SEQ ID NO:16)、NsD2(SEQ ID NO:17)、NaD1(SEQ ID NO:18)、NoD173(SEQ ID NO:19)、DmAMP1(SEQ ID NO:20)、HXP4(SEQ ID NO:21)、HXP34(SEQ ID NO:22)、およびHXP35(SEQ ID NO:23)からなる群より選択されるディフェンシン；
(iv)SEQ ID NO:1～47のいずれか1つの機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体；
(v)最適アライメント後にSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシン；
(vi)N末端アラニン残基を含むSEQ ID NO:1～47のいずれか1つ(すなわち、SEQ ID NO:25～47)；および/または
(vii) SEQ ID NO:1～3のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するかまたは最適アライメント後のディフェンシン。便宜上、これらのディフェンシンは、SEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列の範囲内に包含される。

1つの態様において、ディフェンシンは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3、またはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体によって定義され、最適アライメント後にSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、またはSEQ ID NO:3のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性のアミノ酸配列を有する抗真菌活性を備えるポリペプチドを含む。

第2のディフェンシンが第1のディフェンシンとの組み合わせで用いられる場合、第2のディフェンシンは任意のディフェンシンであってよい。

本明細書において、ヒトおよび動物対象における特定の解剖学的部位での侵襲を含む真菌感染の管理を容易にするために用いられるプロトコールが記載される。プロトコールは、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を使用して、ヒトおよび動物における背側または末端の指節骨を覆う角状の外皮、および角のある動物における関連する脳の突出部の上またはその中での真菌病原体の増殖を阻害するあるいはそうでなければ制御することを含む。1つの態様において、外皮は手指もしくは足指の爪、かぎ爪、または蹄であり、脳の突出部は角である。1つの態様において、真菌感染は爪真菌症を引き起こす。1つの態様において、ディフェンシンは、トリコフィトン・ルブルムに対して強力な殺真菌性活性を有し、かつ哺乳類細胞または細菌細胞に対しては活性を有さないかまたは医学的に許容可能な最小の活性を有する。1つの態様において、ディフェンシンは、SEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を有するディフェンシンなど優れた爪の透過性を有する。例には、HXL008 (SEQ ID NO:1)、HXL035 (SEQ ID NO:2)およびHXL036 (SEQ ID NO:3)、またはN末端アラニン残基を有するこれらのディフェンシン(それぞれSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27)が含まれる。最適な態様において、ディフェンシンは、別の抗真菌剤との相乗的組み合わせで用いられる。後者の剤には、ディフェンシンではないペプチド、プロテイナーゼ阻害剤、別のディフェンシン、および抗真菌特性を有するタンパク質性または非タンパク質性(化学的)の作用物質が含まれる。プロトコールはまた、皮膚、髪、および毛皮ケラチンを含む物質、ならびに髪および毛皮の毛包などの真菌感染を治療することにも及ぶ。

本明細書において、対象上の、背側かつ末端の指節骨を覆う角状の外皮または関連する脳の突出部の上またはその中にある真菌病原体による感染を阻害するための方法であって、該外皮を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体の有効量と接触させる工程を含む、方法が可能になる。1つの態様において、外皮は爪、かぎ爪、または蹄である。したがって、本明細書には、手指の爪もしくは足指の爪の上またはその中、または動物のかぎ爪もしくは蹄の上にある真菌病原体の増殖を阻害するための方法であって、爪またはかぎ爪または蹄を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体の有効量と接触させる工程を含む、方法が教示される。概して、接触は、真菌病原体の増殖を阻害するのに十分な時間および条件下である。

本明細書において、対象上のケラチンを含む物質の上またはその中の真菌病原体による感染を阻害するための方法であって、該物質を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体の有効量と接触させる工程を含む、方法が教示される。1つの態様において、ケラチンを含む物質は髪または毛皮である。したがって、本明細書において、髪もしくは毛皮または髪もしくは毛皮の毛包の上またはその中の真菌病原体の増殖を阻害するための方法であって、髪もしくは毛皮または髪もしくは毛皮の毛包を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の変異体もしくは誘導体の有効量と接触させる工程を含む、方法が教示される。概して、接触は、真菌病原体の増殖を阻害するのに十分な時間および条件下である。

1つの態様において、ケラチンを含む物質は皮膚である。したがって、本明細書において、皮膚を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の変異体もしくは誘導体の有効量と接触させる工程を含む、皮膚の上またはその中の真菌病原体の増殖を阻害するための方法が教示される。概して、接触は、真菌病原体の増殖を阻害するのに十分な時間および条件下である。

「真菌阻害」には、対照と比較した真菌増殖の減少(または生存能の喪失)によって測定される、殺真菌性活性および静真菌性活性の両方が含まれる。真菌増殖は、真菌に応じて当技術分野において公知の多様な方法によって測定することができる。糸状菌の増殖を測定する通常用いられる方法は、例えば、適切な増殖培地中に胞子を発芽させる工程、測定可能な増殖を達成するのに十分な時間インキュベートする工程、および指定のインキュベーション時間後に培養の吸光度の増加を測定する工程を伴う。吸光度は増殖の増加にともない上昇する。典型的には、真菌増殖は病理発生にとって必須である。したがって、病原体増殖の阻害は、真菌疾患からの防御にとって適した指標、すなわち、より優れた阻害、より有効な防御をもたらす。さらに、殺真菌性活性または静真菌性活性の有効性は、爪、かぎ爪、蹄もしくは角または髪もしくは毛皮または髪もしくは毛皮の毛包の目視検査によって決定することができる。

爪真菌症の治療の成功について明確な定義は存在しない。菌類学的治癒は多くの場合、KOHおよび培養試験の両方での陰性の結果として定義される(Elewski et al. (2012) Fungal diseases In: Bolognia, Jorizzo, Schaffer eds, Dermatology 3rd ed. Philadelphia, PA; Elsevier Saunders; chapter 77)。

治療プロトコールには、危険性がある対象を感染から予防すること(すなわち、防止)が含まれる。「危険性がある」対象は熱帯性気候における対象であってもよい。したがって、本文脈における「感染を防止する」は、ヒトまたは動物宿主が、ディフェンシンに暴露されていない宿主と比較したときに、真菌感染またはそれに関連する疾患症状を避ける、または真菌感染またはそれに関連する疾患症状の頻度の減少または最小化または低下を示すように、ディフェンシンによって治療されることを意味し、宿主-真菌相互作用の自然に生じる結果である。すなわち、真菌病原体感染が疾患および/または関連する疾患症状(すなわち、爪真菌症)を引き起こすのを防止するかまたは低減させる。感染および/または症状は、本明細書で教示したプロトコールによるそのような治療を受けていない宿主と比較して、少なくとも約10％、20％、30％、40％、50、60％、70％もしくは80％またはそれ以上まで減少する。パーセント減少は、宿主および真菌病原体に適切な任意の簡便な手段によって決定することができる。

したがって、ディフェンシンの作用は、阻害性活性のなかでも特に真菌病原体の増殖、複製、感染および/または維持を阻害すること、および/または真菌感染または侵襲の症状の回復を誘導することである。

1つの態様において、真菌感染は爪真菌症または関連状態をもたらすか、またはそれらに関連する。

したがって、本明細書において、爪真菌症の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、対象上の感染部位を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体と接触させる工程を含む、爪真菌症または関連する状態の治療または予防のための方法が可能になる。

「爪真菌症」への言及には、遠位爪甲下爪真菌症、表在性白色爪真菌症、近位爪甲下爪真菌症および、カンジダ爪真菌症が含まれる。「爪真菌症に関連する状態」への言及には、爪、かぎ爪、蹄、または角の周囲の表皮組織の白癬および感染が含まれる。

1つの態様において、真菌感染は頭部白癬、頭部秕糠疹、または脂漏性皮膚炎である。

したがって、本明細書において、真菌感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、対象上の物質を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体と接触させる工程を含む、対象における頭部白癬、頭部秕糠疹、脂漏性皮膚炎、または関連する状態の治療または予防のための方法が可能になる。

1つの態様において、真菌感染はケラチンを含む物質の真菌感染である。

したがって、本明細書において、対象におけるケラチンを含む物質の真菌感染の治療および予防のための方法であって、真菌感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、対象上の該物質を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体と接触させる工程を含む、方法が可能になる。

後者の態様に関して、ケラチンを含む物質は皮膚、髪、または毛皮を含むか、または髪または毛皮の毛包である。

したがって、本明細書において、真菌感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、対象上の髪もしくは毛皮または髪もしくは毛皮の毛包を、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体と接触させる工程を含む、ヒト上の髪もしくは毛皮または髪もしくは毛皮の毛包の真菌感染の治療または予防のための方法が教示される。

「接触させる」には、ヒトまたは動物対象への局所投与または局所適用後のディフェンシンへの真菌病原体の暴露が含まれる。接触は、精製した植物ディフェンシンもしくはそれを含む製剤、またはディフェンシンを天然に含むかもしくはディフェンシンを産生するように操作されている植物抽出物を用いてもよい。製剤には、ネイルポリッシュまたは爪洗浄剤などのハーブ製剤および抽出物が含まれる。抽出物は、植物、または酵母(例えば、ピキア)などの微生物から得られてもよい。したがって、ディフェンシンはヒトまたは動物対象上の表面領域に局所的に適用される。「接触する」への言及には、対象にまたは対象上の感染部位に投与する工程が含まれる。

1つの態様において、ディフェンシンは、局所製剤、爪、かぎ爪、蹄もしくは角用製剤、または身体用もしくは髪用洗浄溶液に製剤化される。ディフェンシンを含む微生物抽出物または細胞抽出物を適用してもよい。一例としては、ピキア由来抽出物である。局所用製剤には、水性溶液、液体製剤、溶液、浸漬液、トニック、洗浄剤、スプレー、塗布剤、粉末剤、分散剤、噴霧製剤、クリーム、軟膏、リップスティック、ゲル、スラッジ、ペースト、パッチ、および含浸包帯等が含まれる。本明細書において、ディフェンシンを含む植物抽出物には、ディフェンシンを含む植物抽出物を含むことも企図される。概して、ディフェンシンは、標的部位(例えば、爪、かぎ爪、蹄、角、または髪もしくは毛皮の粒子)内への透過を可能にするように製剤化される。1つの態様において、ディフェンシンはその透過性に基づいて選択される。

本明細書において、ヒトまたは動物対象上の、背側または末端の指節骨を覆う角状外皮または関連する脳の突出部の中またはその上の真菌病原体による感染を阻害するのに使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を含む製剤が可能になる。

本明細書においてさらに、ヒトまたは動物対象上の爪、かぎ爪、蹄、または角の上の真菌病原体による感染を阻害するのに使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を含む製剤が可能になる。

本明細書においてさらに、ヒト対象における爪真菌症に関連する真菌病原体による感染を阻害するのに使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を含む製剤が可能になる。

本明細書において、ヒトまたは動物対象上のケラチンを含む物質の真菌病原体による感染を阻害するのに使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を含む製剤が可能になる。

本明細書においてさらに、ヒトまたは動物対象上の髪もしくは毛皮または髪もしくは毛皮の毛包の真菌病原体による感染を阻害するのに使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を含む製剤が可能になる。

本明細書において、ヒトまたは動物対象上の頭部白癬、頭部秕糠疹、または脂漏性皮膚炎に関連する真菌病原体による感染を阻害するのに使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を含む製剤が可能になる。

1つの態様において、本明細書において、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を含む区画を含むかまたは区画に分かれた形態での治療用キットが教示される。第2のまたはさらなる区画は、他の抗真菌剤を含む他の作用物質または賦形剤を含んでもよい。各区画の内容物は、使用前に混合されてもよくまたは任意の順番で順次用いられてもよい。他の抗真菌剤には、ディフェンシンではないペプチド、プロテイナーゼ阻害剤、別のディフェンシン、またはタンパク質性もしくは化学的(非タンパク質性)抗真菌剤が含まれる。植物ディフェンシンとの組み合わせで用いられうる他の抗真菌剤の例には、グリセオフルビン、テルビナフィン 、アモロルフィン 、シクロピロックス、エフィナコナゾール、タバボロール、およびトリアゾールが含まれる。

「植物ディフェンシン」への言及は、表2に関連して本明細書で定義したものを意味する。表2のディフェンシンはまた、その爪、かぎ爪、蹄、または角の浸透性に基づいて選択されうる。表2のディフェンシンはまた、トリコフィトン・ルブルムに対するその強力な殺真菌性活性、および哺乳類細胞および細菌細胞に対する活性の欠如または医学的に許容可能な最小限の活性に基づき選択されうる。本明細書で定義されるディフェンシンには、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3のいずれか1つまたはSEQ ID NO:4～47のいずれか1つを含む、SEQ ID NO:24に対して少なくとも約80％の類似性を有するディフェンシンが含まれる。80％の類似性は、最適アライメント後に、必要であれば、適切なスペースを用いてアライメントを最適化した後に決定される。「少なくとも80％」または「少なくとも約80％」には、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100％が含まれる。本発明の実施に有用なディフェンシンは、爪の中を容易に透過するディフェンシンである。具体的な例としては、HXL008(SEQ ID NO:1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、およびHXL036(SEQ ID NO:3)、ならびにN末端アラニン残基を有するその変異体(それぞれSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26およびSEQ ID NO:27)が含まれる。

したがって、本明細書において、背側または末端の指節骨を覆う角状の外皮または関連する脳の突出部または対象上のケラチンを含む物質またはケラチンを含む物質のための毛包上の真菌病原体の感染を阻害するための方法であって、感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、該外皮または関連する脳の突出部またはケラチンを含む物質を、SEQ ID NO:1～47から選択される植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体または最適アライメント後にSEQ ID NO:1～47のいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンまたはN末端アラニン残基を有するSEQ ID NO:25～47から選択されるディフェンシンの有効量と接触させる工程を含む、方法が教示される。

本明細書において、背側または末端の指節骨を覆う角状の外皮または関連する脳の突出部または対象上のケラチンを含む物質またはケラチンを含む物質のための毛包上の真菌病原体の感染を阻害するための方法であって、感染の症状を回復させるのに十分な時間かつ条件下で、該外皮または突出部またはケラチンを含む物質を、SEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を有するディフェンシン、またはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体、または任意でN末端アラニン残基を有するSEQ ID NO:24に対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンの有効量と接触させる工程を含む方法も可能となる。

本明細書においてさらに、爪真菌症を治療するためのHXL008(SEQ ID NO:1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、またはHXL036(SEQ ID NO:3)の使用が教示される。また、爪真菌症を治療するためのSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、またはSEQ ID NO:27により定義されたディフェンシンの使用も教示される。

本明細書で用いられる「類似性」という用語には、アミノ酸レベルでの比較配列間の正確な同一性が含まれる。アミノ酸レベルで非同一性がある場合、「類似性」には、非同一であるが、構造レベル、機能レベル、生化学レベル、および/またはコンホメーションレベルにおいて互いに関連するアミノ酸が含まれる。1つの態様において、類似性ではなく同一性のレベルでアミノ酸配列比較が行われる。

2つ以上のポリヌクレオチド間の配列関係性を説明するために用いられる用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列類似性」、「配列同一性」、「パーセント配列類似性」、「パーセント配列同一性」、「実質的に類似する」および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、長さが少なくとも12アミノ酸残基だが、しばしば、15～18アミノ酸残基、多くの場合、少なくとも25以上のアミノ酸残基、例えば、30アミノ酸残基である。2つのポリペプチドはそれぞれ、(1)2つのポリペプチド間で類似する配列(すなわち、完全なアミノ酸配列の一部のみ)、および(2)2つのポリペプチド間で異なる配列を含むことがあるので、2つ(またはそれより多い)ポリペプチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性のある局所領域を特定および比較する「比較ウィンドウ」にわたって2つのポリペプチドの配列を比較するとによって行われる。「比較ウィンドウ」は、参照配列と比較される、典型的には12個の連続した残基の概念上のセグメントを指す。比較ウィンドウは、2つの配列を最適にアラインメントするために、(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して約20％以下の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。比較ウィンドウをアラインメントするための配列の最適アラインメントは、アルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USAの中にあるGAP、BESTFIT、FASTA、Clustal W2、およびTFASTA)をコンピュータにより実行することによって、または検査、および選択された様々な方法のいずれかによって作成された最良のアラインメント(すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高いパーセント相同性をもたらす)によって実行してもよい。例えば、Altschul et al.(1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402に開示されるように、プログラムのBLASTファミリーも参照してもよい。配列分析の詳細な考察は、Ausubel et al. In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. 1994-1998のユニット19.3において見ることができる。他のアライメントソフトウエアには、BWA(Li and Durbin (2010) Bioinformatics 26: 589-595)およびBowtie(Langmead et al (2009) Genome Biol 10:R25 and BLAT (Kent (2002) Genome Res 12:656-664)が含まれる。

本明細書で用いられる「配列類似性」および「配列同一性」という用語は、配列が、比較ウィンドウにわたってアミノ酸単位で同一であるか、または機能的もしくは構造的に類似である程度を指す。よって、「配列同一性のパーセント」は、例えば、比較ウィンドウにわたって2つの最適にアライメントされた配列を比較し、両配列において同一のアミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMet)が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、結果に100を掛けて配列同一性のパーセントを得ることによって計算される。本発明の目的に関して、「配列同一性」は、ソフトウエアに付属する参考マニュアルにおいて用いられるような標準的なデフォルトを用いて、任意の適切な方法またはコンピュータアルゴリズムによって計算された「マッチパーセント」を意味すると理解されるだろう。同様のコメントは配列類似性に関しても当てはまる。

本明細書で用いられる一部のディフェンシンは本明細書において、その供給源に応じて、「天然の」ディフェンシン、「改変」ディフェンシン、「変異体」ディフェンシン、「突然変異」ディフェンシン、「合成誘導体もしくは変異体」、または「化学的」ディフェンシンと称されてもよい。本発明の実施に関して、そのようなディフェンシンは抗真菌活性を保持する。

1つの態様において、ディフェンシンはクラスIIナス科ディフェンシンである。1つの態様において、ディフェンシンは、ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖(β鎖1)とαヘリックスとの間にあるループ領域において改変される。1つの態様において、ループ領域は、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側にある6個のアミノ酸またはその等価物を含む。この領域は「ループ1B」と定義される。クラスIIナス科ディフェンシンは、成熟ドメインの比較的保存されたC末端部分によって他のディフェンシンと区別される。

本明細書において、抗病原体活性を有する変異体ディフェンシンを生じるようにN末端部分のβ鎖1とαへリックスとの間のループ領域が1個または複数個のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されている、改変クラスIIナス科ディフェンシン骨格を含む人工的に作り出されたディフェンシンの使用が含まれる。1つの態様において、ループ領域は、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側にある6個のアミノ酸残基によって定義されるループ1Bである。本明細書において、任意のディフェンシン中のその等価な領域が企図される。1つの態様において、人工的に作り出されたディフェンシンは、改変クラスIIディフェンシンを含む。本プロトコールは、その天然のアミノ酸配列を含むNaD1の使用には及ばない。

適したディフェンシンの例としては、表1に列記したディフェンシンが含まれる。これらは、HXP4(SEQ ID NO:21)、HXP34(SEQ ID NO:22)、およびHXP35(SEQ ID NO:23)などの合成ディフェンシン変異体を含む。本明細書には、N末端アラニン残基を有する最後の3つのディフェンシン(すなわち、それぞれSEQ ID NO:45～47)も包含される。有用なディフェンシンは、HXL008(SEQ ID NO: 1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、およびHXL036(SEQ ID NO:3)、またはSEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、およびSEQ ID NO:27を含むその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体である。

本明細書において、爪、かぎ爪、蹄、または角を、本明細書の表1に提示するリストから選択される植物ディフェンシンまたはその誘導体もしくは変異体の有効量と接触させる工程を含む、爪、かぎ爪、蹄、または角の上またはその中の真菌病原体による感染を阻害するための方法が教示される。概して、ディフェンシンは、感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で適用される。1つの態様において、症状は、爪真菌症または関連状態に関連する。

本明細書において、爪、かぎ爪、蹄、または角を、本明細書の表2に提示するリストから選択される植物ディフェンシンまたはその誘導体もしくは変異体の有効量と接触させる工程を含む、爪、かぎ爪、蹄、または角の上またはその中の真菌病原体による感染を阻害するための方法が教示される。ディフェンシンは、0.1％から10％w/vの濃度で、1日1回、1日2回、2日に1回、1週に1回、2週に1回、または1ヶ月に1回の頻度で、4週間、2週間、1週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月または最大で12ヶ月にわたって適用されうる。1つの態様において、症状は、爪真菌症または関連状態に関連する。

本明細書において、皮膚、髪もしくは毛皮、または髪もしくは毛皮の毛包を、本明細書の表1に提示するリストから選択される植物ディフェンシンまたはその誘導体もしくは変異体の有効量と接触させる工程を含む、皮膚、髪、または毛皮の上またはその中の真菌病原体による感染を阻害するための方法が教示される。ディフェンシンは、感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で適用される。1つの態様において、症状は、真菌感染に関連する。

本明細書において、皮膚、髪もしくは毛皮、または髪もしくは毛皮の毛包を、本明細書の表1に提示するリストから選択される植物ディフェンシンまたはその誘導体もしくは変異体の有効量と接触させる工程を含む、皮膚、髪、または毛皮の上またはその中の真菌病原体による感染を阻害するための方法が教示される。ディフェンシンは、0.1％から10％w/vの濃度で、1日1回、1日2回、2日に1回、1週に1回、2週に1回、または1ヶ月に1回の頻度で、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月または最大で12ヶ月にわたって適用されうる。1つの態様において、症状は真菌感染に関連する。

最適な態様において、ディフェンシンまたはその誘導体もしくは変異体は、抗真菌剤などの別の作用物質との組み合わせで用いられる。ディフェンシンおよびペプチドが相乗作用的に作用することが提案される。他の作用物質の例としては、ディフェンシンではない抗微生物ペプチド、プロテイナーゼ阻害剤、別のディフェンシン、またはタンパク質性のもしくは非タンパク質性の化学的殺真菌剤が含まれる。

本ディフェンシンとの組み合わせで使用するための化学的抗真菌剤には、テルビナフィン、イトラコナゾール(intraconazole)、フルコナゾール、シクロピロックス、クロトリマゾール、アモロルフィン、ブテナフィン、タバボロール、エフィナコナゾール、AN2718、およびNP213が含まれる。

相乗作用への言及は、所与のディフェンシンまたは他の作用物質単独での阻害作用が、それぞれ単独での使用と比較して両方を一緒に用いるときにより優れていることを意味する。Greco et al. (1995) Pharmacol Rev. 47:331-385は、2種類の作用物質の組み合わせでの使用が、各作用物質を単独でアッセイしたときの相加的作用と比較してより優れた活性を有するということに基づいて相乗作用の範疇を定義する。したがって、本明細書で採用される定義には、一緒に作用する2種類の作用物質の組み合わせ作用が、単独で作用する個々の作用物質の合計よりも優れているという条件の、全てのそのような状態が含まれる。さらに、一緒に作用する作用物質の組み合わせ作用が単独で作用する個々の構成要素の合計よりも優れている（濃度を含むがこれに限定されるわけではない）一連の条件が存在する場合に、作用物質の組み合わせは、該用語が本明細書で意図されるように相乗作用を有すると見なされる。Richer (1987) Pestic Sci 19:309-315は、相乗作用の証明を確立するための数学的アプローチを説明する。このアプローチは、2種類の阻害剤、XおよびYの組み合わせでの存在下で観察された阻害のレベル(Io)を、それらの組み合わせ作用を測定するのに用いられたものと同じ各濃度でそれぞれ作用する各XまたはYから生じる予想相加作用(Ee)と比較するためのLimpelの式を用いる。相加パーセント阻害、Eeは、X＋Y－XY/100として計算され、式中、XおよびYはパーセント阻害として表される。Io＞Eeの場合、相乗作用が存在する。

相乗作用は、相乗作用のスケールとして表されてもよい。1つの態様において、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14など最大で14までの値は有意な相乗作用ではないことを表し；15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29など15から最大で29の値は相乗作用が低いことを表し；30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59 、または60など30から60の値は相乗作用が中程度であることを表し；60を上回る値は相乗作用の程度が高いことを表す。「60を上回る」には、61、70、80、90、および100ならびにそれらの間の任意の値を含む、61から100が含まれる。

本方法は、背側または末端の指節骨を覆う角状の外皮もしくは関連する脳の突出部の、または皮膚、髪、もしくは毛皮などケラチンを含む物質の真菌病原体による感染または侵襲を有する対象の治療または予防において有用である。「対象」という用語には、任意の年齢のヒトまたは動物、例えば、家畜(例えば、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、ラクダ、ラマ、アルパカ)もしくは家禽(例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、キジ、クジャク)、愛玩動物(例えば、イヌまたはネコ)、実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはハムスター)、または捕獲した野生動物(例えば、野生のヤギ)が含まれる。「ヒト」または「動物」は、足指の爪、手指の爪、かぎ爪、蹄、角、皮膚、髪、または毛皮などその一部を含む。

「真菌」への言及には、皮膚糸状菌、酵母、および皮膚糸状菌ではない糸状菌(非皮膚糸状菌)が含まれる。皮膚糸状菌には、トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・インタージギターレ、トリコフィトン・ビオラセウム、トリコフィトン・トンスランス、トリコフィトン・ソウダネンセ、およびトリコフィトン・メンタグロフィテスを含むトリコフィトン種、ミクロスポルム・フルブム、エピデルモフィトン・フロッコーズム、ならびにミクロスポルム・ギプセウムが含まれる。酵母には、カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・グラブラタを含むカンジダ種が包含される。真菌は、足白癬などの白癬、頭部秕糠疹、または皮膚炎を引き起こす可能性がある。

本明細書において教示される別の局面は、爪真菌症または関連する状態を治療または予防するのに使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体を、1つまたは複数の薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と一緒に含む組成物である。最適な態様において、植物ディフェンシンは、ディフェンシンおよび別の抗真菌剤との組み合わせで用いられる。1つの態様において、組成物は、スプレー、ミスト、マイクロ粒子、ナノ粒子、水性溶液、浸漬液、洗浄剤、トニック、分散剤、噴霧製剤、リップスティック、スラッジ、粉末、クリーム、軟膏、ゲル、パッチ、含浸包帯、液体、製剤、塗布剤、または組成物の局所形態を含む他の適した分配媒体の形態をとる。ディフェンシンは、爪、かぎ爪、蹄、もしくは角、または髪もしくは毛皮の粒子の透過を容易にするために特に製剤化されうる。

爪、かぎ爪、蹄、もしくは角、または髪もしくは毛皮の真菌感染に有用な適用には、溶液、塗布剤、クリーム、粉末、滴剤、軟膏、シャンプー、および浸漬液が含まれる。

本明細書に記載のディフェンシンおよび任意で別の抗菌剤を含む組成物には、概して、担体、賦形剤、希釈剤、保存剤、安定剤、および/または固体もしくは液体の添加剤が含まれる。ディフェンシンを含む植物抽出物が用いられてもよい。製剤には、身体用洗浄剤またはシャンプーまたは浸漬液が含まれる。

組成物は、意図された投与方法に応じて多種多様な形態をとりうる。概して、ヒトまたは動物対象には局所用組成物が用いられるが、これに限定されない。組成物を調製する際に、通常の媒体、例えば、水、有機酸、例えばクエン酸または酢酸等、グリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、およびポリエチレングリコール等、油、アルコール、例えばエタノール、メタノール、またはイソプロパノール等、保存剤、ならびに/または着色剤等が利用されてもよい。組成物は、例えば、懸濁剤、エリキシル剤、および溶液などの液体調製物の形態をとりうる。担体、例えば、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、増粒剤、潤滑剤、結合剤、および崩壊剤等もまた用いられてもよい。組成物はまた、塗布剤、粉末、分散剤、軟膏、クリーム、または洗浄剤の形態をとってもよい。

組成物には、1つまたは複数の許容可能な賦形剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、シクロメチコン、ヒドロキシプロピルセルロール、カルボキシメチルセルロール、ヒドロキシプロピルキトサン、ポリビニルピロリドン、酢酸エチル、アジピン酸ジイソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、および乳酸ミリスチルが含まれてもよい。

ディフェンシンは、概して感染の症状を回復させるのに十分な時間および条件下で、感染部位に直接投与される。これには、爪真菌症または関連する状態の症状の回復が含まれる。

1つの態様において、ディフェンシンは、0.1％から10％w/vの濃度で、1日1回、1日2回、2日に1回、1週に1回、2週に1回、または1ヶ月に1回の頻度で、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月または最大で12ヶ月にわたって、感染部位に直接投与される。

エアロゾルまたはスプレーによって投与されるとき、組成物は、薬学的製剤の分野において周知の技法にしたがって調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを向上させる吸収促進剤、フルオロカーボン、および/または当技術分野において公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を利用する、食塩水での溶液として調製されてもよい。

ディフェンシンの有効投薬量は、単独で用いられるかまたは特定の組み合わせで用いられるか、投与の様式、治療される真菌病原体、および真菌病原体侵襲の重症度に応じて変化してもよい。よって、ディフェンシンを利用する投薬計画は、対象のタイプ、種、年齢、体重、性別、および医学的素因；治療される状態の重症度；投与の様式；ならびに利用されるその特定のディフェンシンを含むさまざまな要因にしたがって選択される。通常の知識を有する医師、臨床家、または獣医は、真菌病原体侵襲の進行を妨げる、それに対抗する、またはそれを阻止するのに必要とされるディフェンシンの有効量を容易に決定および処方することができる。本明細書において、徐放製剤も企図される。1つの態様において、組成物は、感染部位内へのディフェンシンの侵入を容易にするための透過剤を含む。

1つの態様において、組成物は、爪を横断する浸透を増大させる分子を含有する。爪浸透を増大させる分子には、無機塩類、メルカプタン、グリシン、システイン、尿素、ペルオキシド、酸、例えばリン酸もしくはチオグリコール酸等、アルカリ、例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウム等、還元剤(チオール、亜硫酸塩)、ジメチルスルホキシド、ポリグリコール、グリセリン、C_2-5アルコール、C_2-8ポリオール、C_6-24脂肪酸トリグリセリド、C_6-24脂肪アルコール、C_6-24アルキル硫酸塩、C_6-24脂肪酸；非イオン界面活性剤、またはそれらの混合物が含まれる(Murthy et al. (2009) J Pharm Sci 98(11):4264-4271; Nair et al. (2009) J Pharm Pharmacol 61(4):413-417; Malhotra and Zatz (2002) J Pharm Sci 91(2):312-323; Khengar et al. (2007) Pharm Res 24(12):2207-2212; Murdan (2008) Expert Opin Drug Deliv 5(11):1267-1282; Reeves米国特許第6,391,879号; Willers et al.欧州特許第2664327号)。

別の局面は、背側もしくは末端の指節骨を覆う角状の外皮もしくは関連する脳の突出部、またはケラチンを含む物質である部位において植物ディフェンシンを含む組成物の抗真菌病原体有効量を対象に適用する工程を含む、真菌病原体に感染したまたは侵襲されたヒト対象などの哺乳動物を含む動物を治療または予防するためのプロトコールまたは方法を提供する。

さらに別の局面は、植物ディフェンシンおよび任意で別の抗真菌剤を含む組成物の抗真菌病原体有効量を爪、かぎ爪、蹄、角、または髪もしくは毛皮の粒子、または髪もしくは毛皮の毛包に適用する工程を含む、皮膚、髪または毛皮の爪真菌症または真菌感染を治療または予防するためのプロトコールまたは方法を提供する。後者には、ディフェンシンではない抗微生物ペプチド、プロテイナーゼ阻害剤、別のディフェンシン、およびタンパク質性のまたは非タンパク質性の化学的な抗真菌剤が含まれる。

「適用する」という用語には、接触させることおよび暴露することならびにある部位に投与することが含まれる。1つの態様において、適用には、爪、かぎ爪、蹄、または角を透過する作用、または髪もしくは毛皮の粒子または髪もしくは毛皮の毛包を透過する作用が含まれる。

ディフェンシンは、角状の外皮および関連する脳の突出部、例えば爪、かぎ爪、蹄、および角等、またはケラチンを含む物質、例えば皮膚、髪、もしくは毛皮等の真菌性疾患または感染と戦うのに有用である。1つの態様において、本明細書は、爪真菌症または関連する状態の治療または予防のためのプロトコールを教示する。1つの態様において、本明細書は、頭部白癬、頭部秕糠疹、および脂漏性皮膚炎、または関連する状態の治療または予防のためのプロトコールを教示する。プロトコールはヒトおよび家畜への適用を有する。

本ディフェンシンは、例えばペプチドまたはタンパク質合成機を用いる、1個または複数個のアミノ酸残基の標準的な段階的付加を用いてそのアミノ酸配列に基づき製造されうる。あるいは、ディフェンシンは組換え手段によって作られる。組換えディフェンシンには、そのN末端に追加のアラニン残基が含まれてもよい。したがって、本明細書において企図されるディフェンシンは、N末端アラニン残基を含有してもよい。

本明細書において、別の局面は、植物ディフェンシンを組換え的に産生するための方法を教示する。1つの態様において、植物ディフェンシンは微生物発現系を用いて産生される。さらなる態様において、発現系は、ピキア・パストリスなどの酵母に基づく発現系である。好ましい態様において、植物ディフェンシンは、細胞の外側のタンパク質を標的とする分泌シグナルとの誘導タンパク質として発現される。分泌シグナルはその後、酵素的に除去され、発現培地内に成熟植物ディフェンシンを放出する。植物ディフェンシンはその後、イオン交換クロマトグラフィにより精製される。好ましい態様において、植物ディフェンシンは、SP-Sepharoseなどのレジンを用いる陽イオン交換クロマトグラフィによって精製される。植物ディフェンシンはその後、Superdex 30などの小さなタンパク質に適した媒体を用いるサイズ排除クロマトグラフィによってさらに精製される。

加えて、ディフェンシンを化学的修飾に供して、ディフェンシンを化学的類似体にしてもよい。そのようなディフェンシン類似体は、組織に接触した点で安定性の増加または半減期の延長を示しうる。

本明細書において企図される類似体には、限定されるわけではないが、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の合成時の非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体の導入、および架橋剤の使用、ならびにディフェンシン分子に対して構造制約を課す他の方法が含まれる。この用語はまた、ディフェンシンの修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などを排除しない。例えば、1個または複数個のアミノ酸の類似体 (例えば、非天然アミノ酸を含む) を含むディフェンシン、または置換された結合を有するディフェンシンが、この定義の範囲内に含まれる。そのような類似体は、安定性および/または透過性が増強されている可能性がある。

本発明により企図される側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応その後のNaBH4による還元による還元的アルキル化；メチルアセトイミド酸によるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸塩によるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化：無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；およびピリドキサル-5-リン酸その後のNaBH4のよる還元によるリジンのピリドキシル化などの、アミノ基の修飾が含まれる。

アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールなどの試薬による複素環の縮合生成物の形成によって修飾される可能性がある。

カルボキシル基は、O-アシルイソ尿素形成、その後の、例えば対応するアミドとの続いての誘導体化によるカルボジイミド活性化によって修飾される可能性がある。

スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸に対する過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応；4-クロロ水銀安息香酸、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、および他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成；アルカリpHでのシアン酸塩によるカルバモイル化などの方法によって修飾される可能性がある。

トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルフェニルによるインドール環のアルキル化によって修飾される可能性がある。これに対してチロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって変更され、3-ニトロチロシン誘導体を形成する可能性がある。

ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるN-カルボエトキシル化によって達成されうる。

ペプチド合成時の非天然アミノ酸および誘導体の取り込みの例としては、限定されるわけではないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン、および/またはアミノ酸のD体の使用が含まれる。二官能性架橋剤、例えば、n＝1からn＝6の(CH2)nスペーサー基を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびヘテロ二官能性試薬は通常、N-ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分、およびマレイミドまたはジチオ部分(SH)またはカルボジイミド(COOH)などの別の基特異的反応性部分を含有する。加えて、ペプチドは、例えば、CαおよびNα-メチルアミノ酸の導入、アミノ酸のCα原子とCβ原子間への二重結合の導入、およびN末端とC末端との間、2つの側鎖の間、または側鎖とN末端もしくはC末端の間にアミド結合形成するなど共有結合を導入することによる環状ペプチドまたは類似体の形成によって、構造的に制約を受けうる。

模倣体は、ディフェンシン類似体の別の有用なグループである。この用語は、ディフェンシンに一部化学的類似性を有しかつその抗真菌活性を模倣する物質を指すことを意図する。ペプチド模倣体は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子であってもよい(Johnson et al., Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York, 1993)。ペプチド模倣体の使用の背後にある根本的な理論的根拠は、タンパク質のペプチド骨格は主として、活性作用を容易にするようにアミノ酸側鎖を指向させるために存在するというものである。

さらなる別の局面は、ヒト上の感染した可能性がある領域に植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体および任意で別の抗真菌剤を局所的に適用する工程を含む、ヒト爪上の真菌感染または侵襲を減少させるまたは制御するための方法を提供する。1つの態様において、医薬は、溶液、粉末、スプレー、噴霧器、ナノ粒子、ゲル、ペースト、含浸包帯、塗布剤、エアロゾル、浸漬液、または他の液体の形態をとる。抗真菌性製剤はまた、徐放組成物であってもよい。

さらなる別の局面は、ヒト上の感染した可能性がある領域に植物ディフェンシンまたはその機能的な天然のもしくは合成の誘導体もしくは変異体および任意で別の抗真菌剤を局所的に適用する工程を含む、ヒト髪上の真菌感染または侵襲を減少させるまたは制御するための方法を提供する。1つの態様において、医薬は、溶液、粉末、スプレー、噴霧器、ナノ粒子、ゲル、ペースト、含浸包帯、塗布剤、エアロゾル、浸漬液、または他の液体の形態をとる。抗真菌性製剤はまた、徐放組成物であってもよい。

本明細書で用いられる「を含む(comprising)」は、「を含む(including)」、「を含有する」、または「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的(inclusive)またはオープンエンドであり、記載されなかった追加の要素または方法工程を排除しない。本明細書で用いられる「からなる」は、クレーム構成要素において特定されていない任意の要素、工程、または成分を排除する。本明細書で用いられる「から本質的になる」は、クレームの基本的なかつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を排除しない。「を含む(comprising)」という用語の本明細書における任意の記載は、特に、組成物の構成成分の説明またはデバイスの要素の説明において、記載された構成成分または要素から本質的になる組成物および方法ならびにそれらからなる組成物および方法を包含すると理解される。本明細書において適切に例示的に説明された本開示は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素、限定がなくても実施されうる。

マーカッシュグループまたは他のグループ分けが本明細書において用いられるとき、グループの全ての個々のメンバーならびにグループの可能性のある全ての組み合わせおよび部分的組み合わせが、個別に本開示に含まれることが意図される。

範囲が本明細書において記載されたとき、記述された範囲内の全ての部分範囲、および記述された範囲内の全ての整数値は、それぞれの部分範囲および整数値が記載されたように意図されることが意図される。

次に、本明細書において開示されかつ可能となる局面を以下の非限定的な例において説明する。

方法
ピキア・パストリスからのディフェンシンの精製
pPINK-ディフェンシン ピキア・パストリス(P. pastoris)PichiaPink(商標)strain 1のシングルコロニーを、250 mLフラスコ中の25 mLのBMG培地(Invitrogen Pichia Expression Manualに記載)に播種し、30℃振盪インキュベーター(140 rpm)内で2～3日間にわたってインキュベートする。培養物を、1 Lバッフル付きフラスコ中の200 mLのBMGに播種し、30℃振盪インキュベーター(140 rpm)内に一晩置く。細胞を遠心分離(1,500×g、10分、4℃)により収集し、5 Lバッフル付きフラスコ中の1 LのBMM培地内に再懸濁し、28℃振盪インキュベーター内で3日間(NaD1では2日間)インキュベートする。培養物をt＝24時間および48時間で誘導する。発現培地を遠心分離(6000 rpm、20分、4℃)により細胞から分離する。100 mMリン酸カリウム緩衝液pH 6.0で予め平衡化したSP Sepharoseカラム(1 cm×1 cm、Amersham Biosciences)にアプライする前に、培地をpH 3.0に調整する。次いで、カラムを100 mLの100 mMリン酸カリウム緩衝液pH 6.0で洗浄する(HXL004については洗浄×2)。結合タンパク質を、500 mM NaClを含有する10×10 mLの100 mMリン酸カリウム緩衝液で溶出する。ドットブロットを行い、最も高い濃度の溶出タンパク質を有する画分を特定し、その画分を濃縮カラムを用いて1 mLに濃縮し、滅菌ミリQ超純水を用いて5×洗浄する。ピキア発現ディフェンシンのタンパク質濃度を、タンパク質標準物質としてウシ血清アルブミン(BSA)を用いるビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ(Pierce Chemical Co.)を用いて決定する。

本明細書における使用のために企図されるディフェンシンは表1および2に列記され、最適アライメント後に列記したディフェンシンのいずれか1つに対して少なくとも80％の類似性を有するディフェンシンを含む。

図1(a)から(e)は、アミノ酸配列間の類似性を示すアライメントを提供する(定義については表1を参照されたい)。図11は、HXL008(SEQ ID NO:1)、HXL035(SEQ ID NO:2)、およびHXL036(SEQ ID NO:3)についてのアミン酸配列のアライメントを提供する。このアライメントを用いて、SEQ ID NO:24に示すコンセンサスアミノ酸配列を作成する。これらの配列のいずれも、任意のN末端アラニン残基を含有してもよい。

実施例1
植物ディフェンシンの存在下でのトリコフィトン・ルブルムおよびミクロスポルム・フルブムの増殖の阻害
植物ディフェンシンには、ナス科クラスIIディフェンシン(NaD1)およびクラスIディフェンシン(HXL001、HXL002、HXL004、HXL005、HXL008、HXL009、HXL012、HXL013、HXL015、NaD2)が含まれる。配列識別子については表1および2を参照されたい。

トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・インタージギターレ(T. interdigitale)、ミクロスポルム・フルブム、およびカンジダ・アルビカンス(C. albicans)( the National Mycology Reference Centre, South Australia Pathology at the Women’s and Children's Hospital, Adelaide, Australiaから入手)の増殖に対する植物ディフェンシンの阻害作用を、本質的にBroekaert et al. (1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-59に記載されたように測定する。

トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・インタージギターレ、およびミクロスポルム・フルブム(M. fulvum)の胞子を、1/2強度サブローデキストロース寒天培地(SDA)上で増殖する胞子形成真菌から単離する。胞子は、1/2強度ポテトデキストロースブロス(PDB)の添加によってプレートから取り出された。カンジダ・アルビカンス細胞を酵母ペプトンブロス(YPD)中で16時間増殖させる。胞子および細胞濃縮物を、血球計数器を用いて測定する。

抗真菌アッセイを、本質的に本明細書に記載されているように96ウェルマイクロタイタープレート中で実行する。ウェルに、20 μLの濾過滅菌した(0.22 μmシリンジフィルター、Millipore)ディフェンシン(それぞれ最終濃度に対して10×ストック)または水、および1/2強度PDB中の80 μLの5×10⁴胞子/mL(トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・インタージギターレ、ミクロスポルム・フルブム)または5,000細胞/mL(カンジダ・アルビカンス)を添加する。プレートを30℃でインキュベートする。真菌増殖を、マイクロタイタープレートリーダー(SpectraMax Pro M2; Molecular Devices)を用いて595 nm(A595)での吸光度を測定することによってアッセイする。いずれかの試験ディフェンシンの非存在下での真菌の吸光度(OD)が0.2のODに到達するまで増殖を進行させる。各試験は二度繰り返して行われる。

72時間のインキュベーション後、100 g/mL HXL008と一緒にインキュベートしたトリコフィトン・ルブルムの臨床分離株を含有するウェルからの培地を、新鮮なサブローデキストロース寒天培地の上に蒔いた。プレートを30℃で5日間インキュベートし、コロニーを成長させた後に写真を撮影した。

阻害アッセイの結果を表3に示す。HXL005、HXL008、およびHXL035は、真菌病原体の範囲にわたる最も有効な植物ディフェンシンである。HXL001およびHXL009は、試験した濃度でいかなる活性も示さなかった。HXL002およびNaD2は、ミクロスポルム・フルブムおよびカンジダ・アルビカンスのきわめて弱い阻害剤である。HXL004、HXL012、HXL013、およびHXL015は、病原体の範囲にわたって中間の活性を示す。

HXL008(実線)およびNaD1(破線)によるトリコフィトン・ルブルムの臨床分離株の阻害の結果を図2(a)から2(d)に示す。両ペプチドとも、低濃度で真菌増殖を阻害し、4つの臨床分離株に対するIC50は20 μg/mLを下回った。その一方で、全てのケースにおいて、HXL008はNaD1より低い濃度で増殖を阻害した。

トリコフィトン・ルブルムの臨床分離株に対する細胞生存アッセイの結果を図3(a)から3(e)に示す。植物ディフェンシンと一緒にインキュベートしなかった細胞を播種したプレートは、ほぼ完全に増殖で覆われた。これに対し、HXL008の存在下で72時間インキュベートした細胞を播種したプレートは、1～3コロニーしか有さず、ほぼ全ての細胞が死滅したことを示した。

（表３）

実施例2
HXL008の存在下で28日間にわたるトリコフィトン・ルブルムの増殖の阻害
トリコフィトン・ルブルム(the National Mycology Reference Centre, South Australia Pathology at the Women’s and Children's Hospital, Adelaide, Australiaから入手)の増殖に対するHXL008の阻害作用を28日間にわたってモニターした。

トリコフィトン・ルブルムの胞子を、1/2強度サブローデキストロース寒天培地上で増殖する胞子形成真菌から単離する。胞子は、1/2強度ポテトデキストロースブロス(PDB)の添加によってプレートから取り出される。胞子および細胞濃縮物を、血球計数器を用いて測定する。

胞子を、0、10、または50 μg/mL HXL008を含有する1/2 PBD(2 mL)中に5×10⁴胞子/mLの濃度に希釈した。培養物を振盪せずに30Cでインキュベートする。24時間後、100 μLの各培養物を抽出し、1/2 SDAプレートの上に蒔く。次いで、0、20、または100 μgいずれかのHXL008を含有する追加の100 uLの1/2 PDBを添加する。次いで、SDAプレートを30Cで5日間インキュベートする。このプロセスを24時間毎に28日間繰り返す。15日後に、HXL008を含有しない培養物は、ピペットで採取できないほど濃くなり、もはやアッセイでは使われない。

阻害アッセイの結果を図4に提示する。10 μg/mLまたは50 μg/mLのいずれかで処理した培養物は、アッセイ期間にわたってトリコフィトン・ルブルムの視認可能ないかなる増殖も示さなかった。24時間以内では、HXL008の非存在下で1/2 SDAの上に蒔いた時には視認可能であることから、HXL008は50 μg/mLで80％を上回るトリコフィトン・ルブルム細胞を死滅させていた。その後19日間にわたって、生存コロニーの数は減少し続けた。処理の20日後に、プレートは0個または1個だけコロニーを有し、99.5％を上回る細胞が死んだことを示した。

実施例3
植物ディフェンシンによるヒト爪の透過
NaD1によるヒト爪の透過を、Hui et al. (2002) J Pharm Sci 91(1):189-195の方法にしたがって測定した。ヒトの足指の爪をScienceCare(USA)から入手し、リン酸緩衝食塩水(詳述、PBS)で洗浄した後に、PBSで浸漬しているキムワイプ上に3時間置き、爪を再水和した。次いで、爪を、0.5×0.5 cmの投与区域を有するプラスチックの爪アダプター(Permagear, USA)内に配置し、75マイクロリットルのPBSで湿らせた綿棒をレセプター槽内に爪の下側と接触させ配置した。

タンパク質(10～30 μLの5～10 mg/mL溶液)を24時間毎に4日間、爪の上部に適用した。爪の下側に接触させた綿棒を24時間後およびその後24時間毎に取り除いた。爪を通過したタンパク質を、500 μLの0.1％ v/vトリフルオロ酢酸で2回洗浄することによって綿棒から回収した。回収したタンパク質をRP-HPLCを用いて定量した。

爪透過アッセイの結果を表4および図5に提示する。爪の表面に毎日適用した場合、植物ディフェンシン、HXL008、NaD1、およびHXL004は、現行の局所的爪真菌症療法の活性成分(タバボロール、エフィナコナゾール、およびシクロピロックス)より早くかつより効果的に爪を透過することができた。NaD1またはHXL004より多くのHXL008が爪を通り抜けるのを検出した。植物ディフェンシンHXL012は爪を透過しなかった。

（表４）

実施例4
植物ディフェンシンの存在下での大腸菌の増殖の阻害
大腸菌シングルコロニーを5 mlのLuria-Bertani培地に播種し、37℃で一晩増殖させた。次の日、培養物の吸光度を測定し、大腸菌をMueller-Hinton Broth中で0.01の600 nmでの吸光度(OD₆₀₀)に希釈した。希釈した大腸菌を、10 μM、5 μM、2.5 μM、1.25 μM、0.625 μM、0.3125 μM、または0.1625 μMの濃度のディフェンシンと共に96ウェルプレートに添加した。プレートをOD₅₉₅で読み取り、0時間のデータ点を得た。プレートを37℃で18時間インキュベートした後に、再びOD₅₉₅で読み取り、大腸菌増殖の量を評価した。

大腸菌の阻害の結果を図7に示す。HXL004は、LL37対照と同様に、濃度依存的に大腸菌の増殖を阻害した。NaD1およびHXL008は試験した濃度では大腸菌の増殖を阻害しなかった。

実施例5
植物ディフェンシンの存在下での哺乳類細胞の生存
ヒト単球性リンパ腫(U937)細胞をRPMI-1640培地中で培養する。全ての培養培地に5～10％v/vウシ胎児血清、100 U/mlのペニシリン、および100 μg/mlのストレプトマイシンを補充する。細胞株を、5％v/v CO₂を含有する加湿された雰囲気中で37℃にて培養する。接着性の細胞株を、0.25％v/vトリプシンおよび0.5 μM EDTAを含有する混合物を添加することによって、フラスコから剥離させる。

フローサイトメトリーに基づくヨウ化プロピジウム(PI)取り込みアッセイを行い、植物ディフェンシンのU937細胞に浸透する能力を分析する(Poon et al, 2014本質的に記載される)。簡単に説明すると、細胞を0.1％v/v BSA/RPMI-1640中で1×10⁶細胞/mlに懸濁し、植物ディフェンシン(10 μM)と共に37℃にて30分間インキュベートする。試料を、1 μg/ml PIの最終濃度を含有するPBSに添加し、氷上に置く。次いで、試料を、BD FACSCanto II Flow CytometerおよびBD FACSDivaソフトウエアv6.1.1を用いて直ちに分析する。結果として生じるフローサイトメトリーデータを、FlowJoソフトウエアv8.8.6を用いて分析する。細胞を前方散乱および側方散乱に基づき適切にゲートし、細胞浸透性をPI陽性染色により定義する。

PI取り込みアッセイの結果を図7に示す。植物ディフェンシンNaD1およびHXL005は、試験した条件下で哺乳類細胞に対して毒性を有する。NaD1は細胞の33％に浸透し、HXL005はほぼ25％に浸透した。植物ディフェンシンHXP4、HXL004、およびHXL013は、哺乳類細胞に対する毒性は低く、細胞の13％(HXP4またはHXL004)または5％(HXL013)のみに浸透した。これに対して、HXL001、HXL002、HXL008、HXL009、およびHXL012は、試験した条件下で哺乳類細胞に対する有意な毒性は有さず、細胞の2％未満に浸透した。

実施例6
植物ディフェンシンの存在下でのヒト赤血球細胞の溶解
ヒト赤血球細胞(RBC)を全血から収集し、1×PBSで洗浄し、1000×gで10分間ペレット化した。RBCを、植物ディフェンシンによる処理用に10倍に希釈し(100 μM)、5％v/v CO2/95％v/v大気の加湿した雰囲気下で一晩インキュベートした。インキュベーションの24時間後に、細胞を1×PBSで100倍に希釈した上清と共に10分間2000 rpmで遠心分離した。次いで、RBC溶解の指標となるヘモグロビンの放出を、412 nmでの吸光度の測定により決定した。結果を水で処理したRBC(100％溶解に指定)に対して正規化した。

赤血球細胞溶解アッセイの結果を図8に示す。植物ディフェンシンNaD1およびHXL004は100 μMでそれぞれ1.47パーセントおよび1.09パーセントのRBCを溶解し、HXL008は0.42パーセントのみを溶解した。エラーバーは標準偏差を表す。

実施例7
HXL008によるヒト爪の透過に対する製剤成分の作用
HXL008を、水、50 mMクエン酸緩衝液pH 4.0、または20％v/vエタノールおよび0.5 mM EDTAを含有する50 mMクエン酸緩衝液pH 4.0のいずれかで10 mg/mLの濃度に溶解した。各製剤中のHXL008によるヒト爪の透過を、上記Hui et al. (2002)の方法にしたがって測定した。ヒト足指爪をScienceCare(USA)から入手し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した後に、PBSで浸漬しているキムワイプ上に3時間置き、爪を再水和した。次いで、爪を、0.5×0.5 cmの投与区域を有するプラスチックの爪アダプター(Permagear, USA)内に配置し、75マイクロリットルのPBSで湿らせた綿棒をレセプター槽内に爪の下側と接触させ配置した。

製剤中のタンパク質(10 μLの10 mg/mL溶液)を24時間毎に2または3日間、爪の上部に適用した。爪の下側に接触させた綿棒を24時間後およびその後24時間毎に取り除いた。爪を通過したタンパク質を、500 μLの0.1％ v/vトリフルオロ酢酸で2回洗浄することによって綿棒から回収した。回収したタンパク質をRP-HPLCを用いて定量した。

透過アッセイの結果を表6および図9に提示する。爪の表面に毎日適用した場合、HXL008による爪の透過は、エタノールおよびEDTAの有無にかかわらず50 mMクエン酸緩衝液pH4.0の存在下で増強された。

（表６）3種類の異なる製剤中のHXL008による爪の透過

実施例8
ピキア・パストリスを用いる植物ディフェンシンの組換え発現
植物ディフェンシンHXL008、HXL008＋ala、HXL004、およびNaD1を、方法で説明したようにピキア・パストリスにおいて発現させた。

ピキア・パストリスにおける組換え発現からのさまざまな植物ディフェンシンの収量を表7に示す。HXL008＋alaが7.5 mg/Lの収量で最も高発現したタンパク質であった。

（表７）タンパク質発現および精製後のディフェンシンの収量

実施例9
HXL008＋alaの大規模発現および精製
HXL008＋alaのオープンリーディングフレーム(ORF)をピキア発現ベクターpPIC9内にクローニングする。このORFを、α-因子分泌シグナルを有するフレーム中かつKEX2切断部位の直ぐ下流に挿入する。次いで、プラスミドを、制限酵素SalIを用いてHIS4選択カセット内で直線化し、エレクトロコンピテントGS115ピキア・パストリス細胞内に形質転換する。陽性コロニーを、ヒスチジンを欠く培地を用いて選択する。陽性コロニーを5 mLのYPDに播種し、振盪インキュベーター内で30℃にて25時間インキュベートする。培養中の細胞を20％グリセロールと一緒に混合し、急速凍結し、－80℃で保存する。

グリセロールストックからの細胞をYPDプレートの上に線条接種し、30℃にて48時間増殖させる。次いで、プレートを4℃にて最大で2週間保存する。

YPDプレートからの細胞(pPIC9-ディフェンシン, GS115)を2.5 Lフラスコ中の500 mLのBMG培地(the Invitrogen Pichia Expression Manualで説明)に播種し、培養物を28℃振盪インキュベーター(120 rpm)内で2日間インキュベートする。48時間後に、培養物を30 L B Braun Fermenter中の20 LのFermentation Basal Salts Mediaに播種する。温度を発酵期間にわたって28℃に維持する。pHの任意の低下に反応する25％v/vアンモニア水の添加によって、pHを発酵期間にわたり5.0に維持する。攪拌(最小で500 rpm)を増大させるまたは流速もしくは酸素を増加させることによって、溶存酸素(DO)を発酵期間中30％に維持する。

細胞密度が250～300 g/Lに到達するまで、20 L培養物に3.6 mL/分の速度で滅菌した100％v/vグリセロールを供給した。この時点で、グリセロール供給を停止し、DOのスパイクから明らかなように、全てのグリセロールが消費されるまで培養を進行させる。次いで、培養に、12 mL/L微量金属を含有する滅菌した100％v/vメタノールを供給する。供給速度を8時間にわたって0.2から2.18 mL/分に加速させる。次いで、2.18 mL/分の供給速度をさらに48時間続ける。

発現培地を回収し、遠心分離(6000 rpm、20分、4℃)によって細胞から分離する。培地を、0.22 μm膜を通す濾過によって不純物除去する。培地を50 mM酢酸緩衝液pH 5.3で5倍に希釈する。次いで、希釈した培地を、50 mM酢酸緩衝液pH 5.3で予め平衡化したSP-Sepharoseカラム(高速)にアプライする。次いで、カラムを20カラム量の50 mM酢酸緩衝液pH 5.3で洗浄する。結合したHXL008を、1 M NaClを含有する0～100％v/v 50 mM酢酸緩衝液pH 5.3の直線勾配を用いて溶出する。タンパク質を含有する画分(280 nmでの吸光度により特定される)をプールし、200 mLに濃縮した後に、サイズ排除クロマトグラフィに供する。タンパク質を1800 mL Superdex 30カラム(5 cm×92 cm XK50/100カラム)の上にロードし、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、150 mM NaCl、pH 7.2を用いて15 mL/分で溶出する。空隙容量で溶出するタンパク質を廃棄し、HXL008＋alaを含有する画分を、質量分析を用いて特定する。HXL008を含有する画分をプールし、次いで、滅菌したミリQ水内で脱塩し、3000 MWCOスピンカラムを用いて濃縮する。

結果として生じるペプチド溶液をSDS-PAGE、RP-HPLC、および質量分析によって分析した。最終収量を、BCAアッセイを用いてペプチド濃度を測定することによって決定した。合計で1.436 gのHXL008＋alaが生成され、かつ99％を上回る純度に精製される。

精製の結果を図10に示す。図10Aは精製したHXL008＋alaのSDS-PAGEゲルである。レーン1、2および14は分子量マーカーである(SeeBlue[登録商標]Plus 2)。レーン3および4はHXL008＋alaスタンダード(5 μg)である。レーン5から12はプールしたサイズ排除画分からの試料である。図10Bはプールした溶出液のRP-HPLCトレースである。HXL008＋alaと予想される保持時間と一致する約7.1分に単一ピークが観察される。図XCは4 kDaから20 kDaのMALDI-TOF質量分析のトレースである。観察された質量(5477 Da)は、4つ全てのジスルフィド結合が形成されているHXL008＋alaの予想質量に相当する。

当業者であれば、本明細書に記載の開示は、具体的に説明された変形および変更以外の変形および変更が可能であることを理解するであろう。本開示は、全てのこのような変形および変更を企図することが理解されるはずである。本開示はまた、本明細書において言及された、または示された工程、特徴、組成物、および化合物の全てを個々にまたは集合的に可能にし、これらの工程または特徴または組成物または化合物の任意の2つ以上からなる任意の組み合わせおよび全ての組み合わせを可能にする。

文献

Claims (8)

1. SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、およびSEQ ID NO:27からなる群より選択される植物ディフェンシンを含む、局所用製剤。
2. 洗浄剤、塗布剤、スプレー、クリーム、またはローションである、請求項1記載の局所用製剤。
3. 局所用製剤中の植物ディフェンシンの濃度が、約0.1重量/体積％～約10重量/体積％である、請求項1または2記載の局所用製剤。
4. 尿素、還元剤、ペルオキシド、リン酸、チオグリコール酸、水酸化カリウム、および水酸化ナトリウムからなる群より選択される透過剤を含まない、請求項1～3のいずれか一項記載の局所用製剤。
5. 尿素を含まない、請求項4記載の局所用製剤。
6. アルコール、エチレンジアミン四酢酸、グリコール、シクロメチコン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルキトサン、ポリビニルピロリドン、アジピン酸ジイソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、および乳酸ミリスチルからなる群より選択される追加の賦形剤をさらに含む、請求項1～5のいずれか一項記載の局所用製剤。
7. 追加の賦形剤が、アルコール、グリコール、およびエチレンジアミン四酢酸からなる群より選択される、請求項6記載の局所用製剤。
8. 追加の賦形剤がアルコールである、請求項7記載の局所用製剤。

Images