CN111298098B - 卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用。本发明提供了卡泊芬净或其药学上可接受的盐或以卡泊芬净或其药学上可接受的盐为主要成分的物质在如下中的应用：抑制冠状病毒；治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病；改善由于冠状病毒感染所致症状。醋酸卡泊芬净能够与2019新型冠状病毒的nsp12蛋白结合、对2019新型冠状病毒的RNA聚合酶活性具有抑制作用，细胞实验显示出对2019新型冠状病毒的抑制作用。本发明对于COVID‑19的防治具有重要意义。

Description

卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用。

背景技术

冠状病毒是一类带有囊膜的不分节段的正义RNA病毒，能够感染多种哺乳动物和鸟类等宿主，其中包括SARS-CoV和MERS-CoV都被报道以蝙蝠作为其天然宿主。此前已知6种冠状病毒可以感染人，包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。

2020年2月11日，世界卫生组织正式命名此次疾病为“Coronavirus Disease2019”，缩写为“COVID-19”，即“2019冠状病毒疾病”。人感染2019新型冠状病毒后，可出现发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，严重时可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。截至2020年2月21日，我国境内发现确诊病例超过75000人，死亡病例超过2200人。此外，部分核酸检测阳性患者无明显的不适，为无症状感染者，这给疫情的防控带来了的挑战。目前尚且没有针对新型冠状病毒有效的疫苗和特异性的药物，因此迫切需要研发抗冠状病毒药物。

醋酸卡泊芬净(Cancidas)，FDA已批准药物。卡泊芬净的结构式如式Ⅰ所示(分子式为C₅₂H₈₈N₁₀O₁₅，分子量为1093.31，CAS号为162808-62-0)，目前适用于成人患者和儿童患者(三个月及三个月以上)：经验性治疗中性粒细胞减少、伴发热病人的可疑真菌感染治疗对其它治疗无效或不能耐受的侵袭性曲霉菌病。

发明内容

本发明的目的是提供卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用。

第一方面，本发明要求保护(a)卡泊芬净或(b)其药学上可接受的盐或(c)以卡泊芬净或其药学上可接受的盐为主要成分的物质在如下任一中的应用：

(A1)制备抑制冠状病毒的产品，或抑制冠状病毒；

(A2)制备能够治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品，或治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病；

(A3)制备能够改善由于冠状病毒感染所致症状的产品，或改善由于冠状病毒感染所致症状。

第二方面，本发明要求保护(a)卡泊芬净或(b)其药学上可接受的盐或(c)以卡泊芬净或其药学上可接受的盐为主要成分的物质在如下任一中的应用：

(B1)制备能够与冠状病毒nsp12蛋白结合的产品，或与冠状病毒nsp12蛋白结合；

(B2)制备能够抑制冠状病毒的RNA聚合酶活性的产品，或抑制冠状病毒的RNA聚合酶活性；

(B3)制备能够在细胞水平抑制冠状病毒的产品，或在细胞水平抑制冠状病毒。

在前文两方面中，所述冠状病毒可为能够感染人的冠状病毒。

进一步地，所述冠状病毒可为2019新型冠状病毒(即引起COVID-19的冠状病毒)。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒具体为2019新型冠状病毒毒株，所述2019新型冠状病毒毒株的基因组为GISAID:EPI_ISL_406798。

在前文第一方面中，由于所述冠状病毒感染所致疾病为COVID-19。

在前文第一方面中，所述由于冠状病毒感染所致症状为发热、咳嗽、气促和/或呼吸困难。

对于COVID-19而言，有部分核酸检测阳性患者无明显不适的无症状感染者。

在本发明的具体实施方式中，前文两方面中所述卡泊芬净的药学上可接受的盐具体为醋酸卡泊芬净。当然也可以为醋酸卡泊芬净外卡泊芬净的药学上可接受的其他盐。

在本发明的具体实施方式中，前文第二方面中所述冠状病毒nsp12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第2-926位所示，或者与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第2-926位具有95％以上同一性的序列。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒的RNA聚合酶活性具体体现为所述冠状病毒的RNA聚合酶的引物延伸活性。

在前文两方面中，所述产品具体可为药品。

第三方面，本发明要求保护一种产品。

本发明所要求保护的产品，其主要成分为卡泊芬净或其药学上可接受的盐；所述产品具有如下任一用途：

(A1)抑制冠状病毒；

(A2)治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病；

(A3)改善由于冠状病毒感染所致症状；

(B1)与冠状病毒nsp12蛋白结合；

(B2)抑制冠状病毒的RNA聚合酶活性；

(B3)在细胞水平抑制冠状病毒。

其中，所述冠状病毒可为能够感染人的冠状病毒。

进一步地，所述冠状病毒可为2019新型冠状病毒(即引起COVID-19的冠状病毒)。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒具体为2019新型冠状病毒毒株，所述2019新型冠状病毒毒株的基因组为GISAID:EPI_ISL_406798。

相应的，由于所述冠状病毒感染所致疾病为COVID-19。

其中，所述由于冠状病毒感染所致症状为发热、咳嗽、气促和/或呼吸困难。

对于COVID-19而言，有部分核酸检测阳性患者无明显不适的无症状感染者。

在本发明的具体实施方式中，所述卡泊芬净的药学上可接受的盐具体为醋酸卡泊芬净。当然也可以为醋酸卡泊芬净外卡泊芬净的药学上可接受的其他盐。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒nsp12蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.1的第2-926位所示，或者与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第2-926位具有95％以上同一性的序列。

在本发明的具体实施方式中，所述冠状病毒的RNA聚合酶活性具体体现为所述冠状病毒的RNA聚合酶的引物延伸活性。

其中，所述产品具体可为药品。

卡泊芬净的结构式如式I所示。

实验证明，醋酸卡泊芬净能够与2019新型冠状病毒的nsp12蛋白结合、对2019新型冠状病毒的RNA聚合酶活性具有抑制作用，细胞实验显示出对2019新型冠状病毒的抑制作用。本发明对于COVID-19的防治具有重要意义。

附图说明

图1为纯化后的2019新型冠状病毒的nsp12蛋白。

图2为醋酸卡泊芬净与2019新型冠状病毒nsp12蛋白的结合情况。

图3为纯化后的nsp7L8蛋白。

图4为醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒RNA聚合酶引物延伸活性的抑制作用。

图5为细胞水平评价醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒的抑制作用。

图6为醋酸卡泊芬净对Vero细胞的毒性作用

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

醋酸卡泊芬净：上海陶素生化科技有限公司产品，编号为T1799。

实施例1、醋酸卡泊芬净与2019新型冠状病毒nsp12蛋白的结合

1、将2019新型冠状病毒的nsp12(nsp12氨基酸序列来自于GISAID:EPI_ISL_406798)，N端添加起始密码子，C端添加凝血酶酶切位点，6×His标签纯化标签序列以及2×Strep标签序列(完整蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，第2-926位为nsp12氨基酸序列)，序列经昆虫细胞密码子优化(优化物种：insect)由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成并连接至pFastBac 1载体(Invitrogen^TM 10360014)。优化后的基因序列如SEQ ID No.2所示。蛋白的表达纯化方法参照文献(Kirchdoerfer,R.N.,Ward,A.B.Structure of theSARS-CoV nsp12 polymerase bound to nsp7 and nsp8co-factors.Nat Commun 10,2342(2019).https://doi.org/10.1038/s41467-019-10280-3)。纯化后的nsp12蛋白见图1，结果显示，分子量大小与预期相符，纯化后的nsp12蛋白纯度较高。通过10mM pH4.0醋酸钠溶液溶解至100μg/ml，使用Biacore 8K(GE/通用电气)机器通过氨基偶联方法固定于CM5芯片(GE/通用电气，Series S Sensor Chip CM5)。

2、将醋酸卡泊芬净用去离子水溶解至10mM母液，分装冻存于-20℃。将醋酸卡泊芬净母液用PBST溶液(PBS缓冲液含0.05‰的吐温20，体积百分含量)2倍梯度逐级稀释为不同浓度(25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、0.78μM)的待测溶液，每个浓度体积为100μl，同时设置0μM醋酸卡泊芬净作为阴性对照组。利用Biacore 8K(GE/通用电气)采用Single-cycle kinetics方法，设置结合60s，解离300s，按照预制程序显示样品位置，将样品加入96孔板，检测不同浓度醋酸卡泊芬净与nsp12蛋白的结合。结果如图2所示，醋酸卡泊芬净能够与nsp12蛋白结合，利用Biacore 8K(GE/通用电气)内置程序Single-cycle kinetics亲和力分析方法算得亲和力为50.7μM。

实施例2、醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒RNA聚合酶的引物延伸活性的抑制作用

1、将2019新型冠状病毒的nsp7和nsp8(nsp7和nsp8氨基酸序列来自于GISAID:EPI_ISL_406798)，nsp7和nsp8的氨基酸序列通过6×His linker连接在一起，并且在nsp7氨基酸序列N端添加起始密码子。含有nsp7和nsp8的完整蛋白序列如SEQ ID No.3所示，该蛋白命名为nsp7L8)。序列经密码子优化(优化物种：大肠杆菌)后连接pET21a载体。优化后的nsp7L8蛋白的基因序列如SEQ ID No.4所示。蛋白的表达纯化方法参照文献LorenzoSubissi,Clara C.Posthuma,Axelle Collet,Jessika C.Zevenhoven-Dobbe,AlexanderE.Gorbalenya,Etienne Decroly,Eric J.Snijder,Bruno Canard,Isabelle Imbert,Onesevere acute respiratory syndrome coronavirus protein complex integratesprocessive RNApolymerase and exonuclease activities,Proceedings of theNational Academy of Sciences Sep 2014,111(37)E3900-E3909；DOI:10.1073/pnas.1323705111。纯化后的nsp7L8蛋白见图3，结果显示，分子量大小与预期相符，纯化后的nsp7L8蛋白纯度较高。

2、利用DEPC水(碧云天，R0022)配制引物延伸活性测定所需反应缓冲液：10mMTris(pH8.0),10mM KCl,2mM MgCl₂,1mM DTT。

3、用DEPC水(碧云天，R0022)分别将模板RNA(由上海朗晶生物科技有限公司合成，5’-CUAUCCCCAUGUGAUUUUAAUAGCUUCUUAGGAGAAUGAC-3’)与5’带FAM标签的引物RNA(由上海朗晶生物科技有限公司合成，5’-GUCAUUCUCCUAAGAAGCUA-3’)溶解至100μM。

4、取等量的模板RNA与5’带FAM标签的引物RNA于PCR管(AXYGEN，YC-HC01010)中混合。将PCR管置于PCR仪(BIO-GENER)中70℃反应10min。反应结束后立即将PCR管置于冰上，即为退火的RNA。

5、用步骤2中的反应缓冲液分别将醋酸卡泊芬净母液稀释至浓度为1mM，800μM，500μM，250μM，125μM，62.5μM和31.2μM。

6、将浓度为100mM的ATP，GTP，CTP与UTP(TAKARA，货号分别为4041，4042，4043，4044)按照1:1:1:1混合，获得NTP mix。

7、在1.5mL EP管(AXYGEN，MCT-150-C)中加入2.2μl nsp12蛋白(浓度为1mg/mL)与1μl药物(步骤5配制)混合，添加步骤2的反应缓冲液补充至总体积为10μl，室温孵育10min。然后添加nsp7L8蛋白(0.64μl，浓度为1mg/mL)，退火的RNA(0.4μl，步骤4制备)，NTP mix(0.4μl，步骤6制备)，最后用步骤2的反应缓冲液补充至总体积20μl。其中nsp12蛋白终浓度为1μM，nsp7L8蛋白的终浓度为1μM，退火的RNA终浓度为1μM，NTP的终浓度为500μM，药物的终浓度分别为1.56μM，3.12μM，6.25μM，12.5μM，25μM，40μM，50μM。并分别设置不添加药物，不添加药物与nsp12蛋白的两个对照组。

7、将加有反应体系的EP管置于30℃金属浴(MIULAB)中反应60min。向反应结束后的体系中加入等体积的甲酰胺上样缓冲液(coolaber，SL2224-5mL)。100℃煮样5min后12000rpm离心10min。通过20％丙烯酰胺凝胶电泳和化学发光荧光成像系统(vilerfusion)观察反应结果。

结果如图4所示，醋酸卡泊芬净在浓度为40μM和50μM时，均能够百分之百抑制2019新型冠状病毒聚合酶引物延伸活性，醋酸卡泊芬净在浓度为25μM时，能够部分抑制2019新型冠状病毒聚合酶引物延伸活性。

实施例3、细胞水平评价醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒的抑制作用

1、使用DMEM稀释2019新型冠状病毒(毒株基因组为GISAID:EPI_ISL_406798(参见GISAID数据库)，来自于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所)，使病毒剂量为100TCID₅₀/100μl。

2、用DMEM(Gibco)培养基中加入2％血清(Gibco)和双抗(青霉素和链霉素)配制成维持液。用维持液将醋酸卡泊芬净母液(10mM)5倍梯度稀释为不同浓度(100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM)，每个浓度设置4个复孔，每个孔每个浓度体积为200μl。同时设置0μM醋酸卡泊芬净(即200μl维持液)作为阴性对照组。

3、将状态良好的Vero细胞(ATCC,CCL-81)，0.25％胰蛋白酶消化，DMEM(Gibco)中加入10％FBS(Gibco)配制成培养液，用培养液稀释细胞，制备密度为1×10⁵个/ml的细胞悬液，以每孔100μl均匀接种在96孔板中，37℃，5％CO₂培养箱环境中孵育过夜。待其长至90％-100％密度时，弃掉培养上清，PBS清洗2遍。

4、将步骤1配制的病毒液加至步骤3的96孔板细胞中，置于37℃，5％CO₂培养箱孵育2h，吸弃感染液，将步骤2配制的不同浓度梯度的药物加至孔内，置于37℃，5％CO₂培养箱孵育24h。

5、取步骤4的96孔板，吸取培养上清100μl/孔，至天龙生物科技有限公司的全自动核酸提取仪的配套提取板中，按照试剂盒说明书进行核酸提取。取核酸5μl进行RT-PCR体系配制(TaKaRa)以及qRT-PCR实验(靶标为ORF1ab，Roche 480)。

6、用Graphpad处理数据，计算出醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒的EC₅₀(半数效应浓度，即药效实验中能抑制50％病毒最大效应时的受试物浓度)。结果如图5所示，醋酸卡泊芬净对2019新型冠状病毒的EC₅₀＝8.07μM，细胞水平上对2019新型冠状病毒具有抑制作用。

实施例4、醋酸卡泊芬净对Vero细胞的毒性作用

1、状态良好的Vero细胞(ATCC,CCL-81)，0.25％胰蛋白酶消化，DMEM(Gibco)中加入10％FBS(Gibco)配制成培养液，用培养液稀释细胞，制备密度为1×10⁵个/ml的细胞悬液，以每孔100μl均匀接种在96孔板中，37℃，5％CO₂培养箱环境中孵育过夜。

2、醋酸卡泊芬净母液用含双抗(青霉素和链霉素)的DMEM(Gibco)培养液10倍梯度稀释为不同终浓度(100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.0001μM、0.00001μM)的待测溶液。实验分为空白对照组和各梯度浓度给药组。弃除96孔板中的细胞培养液，以每孔100μl加入待测药物和空白对照DMEM培养液，每个浓度设置3个复孔。置于37℃，5％CO₂培养箱孵育24h。

3、将CCK8试剂以每孔10μl加入到待检测细胞培养板中，继续孵育1-4h后，酶标仪以OD₄₅₀读取待测样品的吸光度值，并计算细胞活性。

结果如图6，显示醋酸卡泊芬净溶液在100μM浓度下对Vero细胞没有细胞毒性。

<110> 中国科学院微生物研究所；中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 卡泊芬净在制备抑制冠状病毒的产品中的应用

<130> GNCLN200577

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 969

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Phe Lys Arg Val Cys Gly Val Ser Ala Ala Arg Leu Thr Pro Cys

1 5 10 15

Gly Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Val Tyr Arg Ala Phe Asp Ile Tyr

20 25 30

Asn Asp Lys Val Ala Gly Phe Ala Lys Phe Leu Lys Thr Asn Cys Cys

35 40 45

Arg Phe Gln Glu Lys Asp Glu Asp Asp Asn Leu Ile Asp Ser Tyr Phe

50 55 60

Val Val Lys Arg His Thr Phe Ser Asn Tyr Gln His Glu Glu Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Asn Leu Leu Lys Asp Cys Pro Ala Val Ala Lys His Asp Phe Phe

85 90 95

Lys Phe Arg Ile Asp Gly Asp Met Val Pro His Ile Ser Arg Gln Arg

100 105 110

Leu Thr Lys Tyr Thr Met Ala Asp Leu Val Tyr Ala Leu Arg His Phe

115 120 125

Asp Glu Gly Asn Cys Asp Thr Leu Lys Glu Ile Leu Val Thr Tyr Asn

130 135 140

Cys Cys Asp Asp Asp Tyr Phe Asn Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Phe Val

145 150 155 160

Glu Asn Pro Asp Ile Leu Arg Val Tyr Ala Asn Leu Gly Glu Arg Val

165 170 175

Arg Gln Ala Leu Leu Lys Thr Val Gln Phe Cys Asp Ala Met Arg Asn

180 185 190

Ala Gly Ile Val Gly Val Leu Thr Leu Asp Asn Gln Asp Leu Asn Gly

195 200 205

Asn Trp Tyr Asp Phe Gly Asp Phe Ile Gln Thr Thr Pro Gly Ser Gly

210 215 220

Val Pro Val Val Asp Ser Tyr Tyr Ser Leu Leu Met Pro Ile Leu Thr

225 230 235 240

Leu Thr Arg Ala Leu Thr Ala Glu Ser His Val Asp Thr Asp Leu Thr

245 250 255

Lys Pro Tyr Ile Lys Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Asp Phe Thr Glu Glu

260 265 270

Arg Leu Lys Leu Phe Asp Arg Tyr Phe Lys Tyr Trp Asp Gln Thr Tyr

275 280 285

His Pro Asn Cys Val Asn Cys Leu Asp Asp Arg Cys Ile Leu His Cys

290 295 300

Ala Asn Phe Asn Val Leu Phe Ser Thr Val Phe Pro Pro Thr Ser Phe

305 310 315 320

Gly Pro Leu Val Arg Lys Ile Phe Val Asp Gly Val Pro Phe Val Val

325 330 335

Ser Thr Gly Tyr His Phe Arg Glu Leu Gly Val Val His Asn Gln Asp

340 345 350

Val Asn Leu His Ser Ser Arg Leu Ser Phe Lys Glu Leu Leu Val Tyr

355 360 365

Ala Ala Asp Pro Ala Met His Ala Ala Ser Gly Asn Leu Leu Leu Asp

370 375 380

Lys Arg Thr Thr Cys Phe Ser Val Ala Ala Leu Thr Asn Asn Val Ala

385 390 395 400

Phe Gln Thr Val Lys Pro Gly Asn Phe Asn Lys Asp Phe Tyr Asp Phe

405 410 415

Ala Val Ser Lys Gly Phe Phe Lys Glu Gly Ser Ser Val Glu Leu Lys

420 425 430

His Phe Phe Phe Ala Gln Asp Gly Asn Ala Ala Ile Ser Asp Tyr Asp

435 440 445

Tyr Tyr Arg Tyr Asn Leu Pro Thr Met Cys Asp Ile Arg Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Val Val Glu Val Val Asp Lys Tyr Phe Asp Cys Tyr Asp Gly Gly

465 470 475 480

Cys Ile Asn Ala Asn Gln Val Ile Val Asn Asn Leu Asp Lys Ser Ala

485 490 495

Gly Phe Pro Phe Asn Lys Trp Gly Lys Ala Arg Leu Tyr Tyr Asp Ser

500 505 510

Met Ser Tyr Glu Asp Gln Asp Ala Leu Phe Ala Tyr Thr Lys Arg Asn

515 520 525

Val Ile Pro Thr Ile Thr Gln Met Asn Leu Lys Tyr Ala Ile Ser Ala

530 535 540

Lys Asn Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly Val Ser Ile Cys Ser Thr Met

545 550 555 560

Thr Asn Arg Gln Phe His Gln Lys Leu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Thr

565 570 575

Arg Gly Ala Thr Val Val Ile Gly Thr Ser Lys Phe Tyr Gly Gly Trp

580 585 590

His Asn Met Leu Lys Thr Val Tyr Ser Asp Val Glu Asn Pro His Leu

595 600 605

Met Gly Trp Asp Tyr Pro Lys Cys Asp Arg Ala Met Pro Asn Met Leu

610 615 620

Arg Ile Met Ala Ser Leu Val Leu Ala Arg Lys His Thr Thr Cys Cys

625 630 635 640

Ser Leu Ser His Arg Phe Tyr Arg Leu Ala Asn Glu Cys Ala Gln Val

645 650 655

Leu Ser Glu Met Val Met Cys Gly Gly Ser Leu Tyr Val Lys Pro Gly

660 665 670

Gly Thr Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr Ala Tyr Ala Asn Ser Val Phe

675 680 685

Asn Ile Cys Gln Ala Val Thr Ala Asn Val Asn Ala Leu Leu Ser Thr

690 695 700

Asp Gly Asn Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Val Arg Asn Leu Gln His Arg

705 710 715 720

Leu Tyr Glu Cys Leu Tyr Arg Asn Arg Asp Val Asp Thr Asp Phe Val

725 730 735

Asn Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Arg Lys His Phe Ser Met Met Ile Leu

740 745 750

Ser Asp Asp Ala Val Val Cys Phe Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Gln Gly

755 760 765

Leu Val Ala Ser Ile Lys Asn Phe Lys Ser Val Leu Tyr Tyr Gln Asn

770 775 780

Asn Val Phe Met Ser Glu Ala Lys Cys Trp Thr Glu Thr Asp Leu Thr

785 790 795 800

Lys Gly Pro His Glu Phe Cys Ser Gln His Thr Met Leu Val Lys Gln

805 810 815

Gly Asp Asp Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Pro Ser Arg Ile Leu

820 825 830

Gly Ala Gly Cys Phe Val Asp Asp Ile Val Lys Thr Asp Gly Thr Leu

835 840 845

Met Ile Glu Arg Phe Val Ser Leu Ala Ile Asp Ala Tyr Pro Leu Thr

850 855 860

Lys His Pro Asn Gln Glu Tyr Ala Asp Val Phe His Leu Tyr Leu Gln

865 870 875 880

Tyr Ile Arg Lys Leu His Asp Glu Leu Thr Gly His Met Leu Asp Met

885 890 895

Tyr Ser Val Met Leu Thr Asn Asp Asn Thr Ser Arg Tyr Trp Glu Pro

900 905 910

Glu Phe Tyr Glu Ala Met Tyr Thr Pro His Thr Val Leu Gln Leu Val

915 920 925

Pro Arg Gly Ser His His His His His His Gly Trp Ser His Pro Gln

930 935 940

Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp

945 950 955 960

Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ser

965

<210> 2

<211> 2910

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgtttaaac gagtctgcgg agtgagcgcc gctcgattga caccctgcgg aacaggaaca 60

tcgacagatg tggtgtatcg cgccttcgat atctacaacg ataaggtggc cggctttgct 120

aagttcctga agaccaattg ttgccgcttc caggagaagg acgaagacga taacctgatc 180

gacagctact tcgtggtgaa gcgtcatacc ttcagcaact accagcacga agagaccatc 240

tacaacctgt tgaaagattg tccagccgtg gctaagcacg acttcttcaa gttccgcatc 300

gacggagata tggtgccaca tattagccgt cagcgtctga caaagtacac aatggccgat 360

ctggtgtacg ctttgcgtca ttttgacgag ggaaattgcg ataccctgaa ggagatcctg 420

gtgacctaca attgttgcga cgacgactac ttcaacaaga aggattggta cgacttcgtg 480

gagaacccag atatcctgcg agtgtacgcc aatttgggag aacgagtgcg tcaagctctg 540

ttgaagaccg tgcaattttg cgacgctatg cgtaacgccg gaattgtggg agtgttgaca 600

ttggacaacc aggacctgaa cggcaattgg tacgatttcg gcgatttcat ccagaccaca 660

ccaggaagcg gagtgccagt ggtggatagt tattacagcc tgctgatgcc aattctgacc 720

ttgacacgag ctttgacagc cgaaagtcac gtggataccg atctgaccaa gccctacatc 780

aagtgggatc tgctgaagta cgacttcacc gaagaacgcc tgaagctgtt tgatcgctac 840

ttcaagtatt gggaccagac ctaccacccc aattgcgtga attgcctgga cgatcgttgc 900

atcttgcatt gcgccaactt caacgtgctg ttcagtaccg tgtttccacc aaccagcttc 960

ggaccattgg tgcgtaagat ctttgtggac ggagtgccat ttgtggtgag tacaggatac 1020

cactttcgcg aattgggcgt ggtgcataat caggatgtga atctgcatag cagtcgcctg 1080

agtttcaagg aattgctggt gtacgccgcc gatccagcta tgcacgccgc ttccggaaat 1140

ttgctgctgg ataagcgcac aacttgcttt agcgtggccg ctttgaccaa taacgtggct 1200

tttcagacag tgaagccagg caacttcaac aaggatttct acgatttcgc cgtgagcaag 1260

ggattcttta aggagggaag cagcgtggaa ctgaagcact tcttcttcgc ccaagacgga 1320

aacgccgcta ttagcgatta cgattactac cgctacaacc tgccaactat gtgcgatatc 1380

cgccaattgc tgtttgtggt ggaggtcgtc gataagtact tcgattgcta cgacggaggt 1440

tgcatcaacg ctaaccaggt gatcgtgaac aacctggata agagcgccgg attccccttt 1500

aataagtggg gaaaggcccg attgtactac gatagcatga gttacgagga tcaagacgcc 1560

ttgtttgcct acaccaagcg taacgtgatt cccacaatca cccagatgaa cctgaagtac 1620

gccattagtg ccaagaatcg cgctcgtaca gtggccggag tgagtatttg tagtaccatg 1680

accaaccgcc agttccatca gaagctgttg aagagcattg ccgctacacg aggagctaca 1740

gtggtgattg gaaccagcaa gttctacgga ggttggcaca acatgctgaa gacagtgtac 1800

agcgacgtgg agaatccaca tctgatgggt tgggattacc ccaagtgcga tcgagctatg 1860

ccaaacatgc tgcgcattat ggccagtttg gtgttggctc gcaagcatac cacttgttgc 1920

agtctgagcc atcgctttta tcgcctggct aatgagtgcg ctcaagtgtt gagcgaaatg 1980

gtgatgtgcg gaggcagcct gtacgtgaaa ccaggaggaa caagcagcgg agacgctaca 2040

acagcttacg ccaacagcgt gttcaacatt tgccaagccg tgacagctaa cgtgaacgct 2100

ttgctgagta ccgacggaaa taagatcgcc gataagtacg tgcgcaatct gcaacatcgt 2160

ctgtacgagt gcctgtatcg taatcgagac gtggataccg acttcgtgaa cgagttctac 2220

gcttacctgc gcaagcactt cagcatgatg atcttgagcg acgacgccgt cgtctgtttt 2280

aacagtacct acgctagtca aggtttggtg gcttcgatca agaacttcaa gagcgtgctg 2340

tactaccaga acaacgtgtt catgagcgaa gccaagtgct ggacagaaac cgatctgacc 2400

aagggaccac acgaattttg ctcccagcat acaatgctgg tgaagcaggg agacgattac 2460

gtgtacctgc catacccaga tccaagtcgc attttgggag ccggttgttt tgtggatgat 2520

atcgtgaaga ccgacggaac actgatgatc gaacgtttcg tgagtctggc cattgacgct 2580

tatccactga ccaagcatcc caatcaagag tacgccgatg tgtttcacct gtacttgcag 2640

tacattcgca agctgcacga cgaattgaca ggacacatgc tggacatgta ctccgtgatg 2700

ctgaccaacg ataacaccag tcgctattgg gagccagagt tctacgaggc tatgtacacc 2760

ccacacacag tgttgcaatt ggtgccacga ggaagtcacc atcatcatca tcacggttgg 2820

agccatccac agttcgaaaa aggaggagga agcggaggag gaagcggagg aagcgcttgg 2880

agtcatccac agttcgagaa gggaagttag 2910

<210> 3

<211> 288

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Ser Lys Met Ser Asp Val Lys Cys Thr Ser Val Val Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Leu Gln Gln Leu Arg Val Glu Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln

20 25 30

Cys Val Gln Leu His Asn Asp Ile Leu Leu Ala Lys Asp Thr Thr Glu

35 40 45

Ala Phe Glu Lys Met Val Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Ser Met Gln

50 55 60

Gly Ala Val Asp Ile Asn Lys Leu Cys Glu Glu Met Leu Asp Asn Arg

65 70 75 80

Ala Thr Leu Gln His His His His His His Ala Ile Ala Ser Glu Phe

85 90 95

Ser Ser Leu Pro Ser Tyr Ala Ala Phe Ala Thr Ala Gln Glu Ala Tyr

100 105 110

Glu Gln Ala Val Ala Asn Gly Asp Ser Glu Val Val Leu Lys Lys Leu

115 120 125

Lys Lys Ser Leu Asn Val Ala Lys Ser Glu Phe Asp Arg Asp Ala Ala

130 135 140

Met Gln Arg Lys Leu Glu Lys Met Ala Asp Gln Ala Met Thr Gln Met

145 150 155 160

Tyr Lys Gln Ala Arg Ser Glu Asp Lys Arg Ala Lys Val Thr Ser Ala

165 170 175

Met Gln Thr Met Leu Phe Thr Met Leu Arg Lys Leu Asp Asn Asp Ala

180 185 190

Leu Asn Asn Ile Ile Asn Asn Ala Arg Asp Gly Cys Val Pro Leu Asn

195 200 205

Ile Ile Pro Leu Thr Thr Ala Ala Lys Leu Met Val Val Ile Pro Asp

210 215 220

Tyr Asn Thr Tyr Lys Asn Thr Cys Asp Gly Thr Thr Phe Thr Tyr Ala

225 230 235 240

Ser Ala Leu Trp Glu Ile Gln Gln Val Val Asp Ala Asp Ser Lys Ile

245 250 255

Val Gln Leu Ser Glu Ile Ser Met Asp Asn Ser Pro Asn Leu Ala Trp

260 265 270

Pro Leu Ile Val Thr Ala Leu Arg Ala Asn Ser Ala Val Lys Leu Gln

275 280 285

<210> 4

<211> 867

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgtccaaaa tgtccgacgt aaaatgcacc agcgttgttc tgctgagcgt tctgcaacaa 60

ctgcgcgttg aatcttcctc caaactgtgg gcacagtgcg ttcaactgca caacgatatc 120

ctgctggcga aagataccac cgaggctttc gaaaaaatgg tcagcctgct gtctgttctg 180

ctgagtatgc aaggcgcagt cgatatcaac aaactgtgcg aagaaatgct ggataatcgc 240

gcaaccctgc aacatcatca tcatcatcac gcgattgcga gcgaatttag cagtctgccg 300

agttacgcag catttgcaac cgcacaggaa gcatacgaac aggcagttgc aaacggcgat 360

agcgaagttg tcctgaaaaa actgaaaaaa tccctgaacg tcgcgaaatc tgaatttgat 420

cgcgacgcag caatgcagcg taaactggag aaaatggccg accaggctat gacccaaatg 480

tacaaacagg cgcgtagcga agataaacgc gcaaaagtca cctctgccat gcaaaccatg 540

ctgttcacca tgctgcgtaa actggacaac gacgcgctga acaacatcat taataacgcg 600

cgcgacggtt gcgttccgct gaatattatt ccgctgacca ccgctgccaa actgatggtt 660

gttattccgg actacaacac ctacaaaaac acctgcgacg gtaccacctt tacctacgct 720

tctgcactgt gggaaattca gcaggttgtg gatgcggata gcaaaatcgt ccagctgtcc 780

gagatcagca tggataatag cccgaatctg gcttggccgc tgattgttac cgcactgcgc 840

gctaattctg cagttaaact gcaataa 867

Claims (6)

1.卡泊芬净或其药学上可接受的盐在如下任一中的应用：

(A1)制备抑制冠状病毒的产品；

(A2)制备能够治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品；

(A3)制备能够改善由于冠状病毒感染所致症状的产品；

所述冠状病毒为2019新型冠状病毒；由于所述冠状病毒感染所致疾病为COVID-19。

2.卡泊芬净或其药学上可接受的盐在如下任一中的应用：

(B1)制备能够与冠状病毒nsp12蛋白结合的产品；

(B2)制备能够抑制冠状病毒的RNA聚合酶活性的产品；

(B3)制备能够在细胞水平抑制冠状病毒的产品；

所述冠状病毒为2019新型冠状病毒。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由于冠状病毒感染所致症状为发热、咳嗽、气促和/或呼吸困难。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述卡泊芬净的药学上可接受的盐为醋酸卡泊芬净。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒nsp12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第2-926位所示。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为药品。

Images