CN1810954A - 一种利用大肠杆菌生产人α防御素1蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用大肠杆菌生产生物活性物质人α防御素1蛋白的方法及其适用的优化设计DNA序列和重组表达质粒。包括：使用由人α防御素1成熟肽编码序列优化设计后获得的序列SEQ ID NO：1，构建成原核表达载体质粒pET32a－mHNP1，将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，化学诱导表达人α－防御素1。本法可克服因α防御素1蛋白对宿主菌本身的毒害作用而引起的低表达甚至不表达，大量生产有活性的人α防御素1蛋白，满足有关结构、生化性质研究及抗体制备等方面的需要，也可应用于医药卫生领域。

Description

一种利用大肠杆菌生产人α防御素1蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种新的利用转基因工程菌生产人α防御素1的方法，即根据生物密码子使用偏好性原则对人α防御素1(Human neutrophil peptide，HNP1)成熟肽编码序列进行优化设计，构建能促进二硫键形成的Trx融合性原核表达载体，转化可降低毒性蛋白基低表达水平的大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS，组成高效大肠杆菌表达体系。本发明还提供了用于本发明构建的基因工程菌株的使用方法。

背景技术

防御素是普遍存在于高等生物体中的一种多肽抗生素，对病源微生物具有广谱的毒杀效应，是机体免疫防御系统的重要组成部分(Ganc T et al，Eur J Haematol，1990，44：1；张满朝，国外医学分子生物学分册，1994，68：70)。哺乳动物防御素主要来源于参与非特异性免疫的一些吞噬细胞，特别是嗜中性粒细胞(PMN)。其它细胞包括NK细胞、γδ细胞、B细胞和单核/巨噬细胞及某些上皮细胞也能产生此类物质。成熟防御素是分子量为3～4KD的非糖基多肽，一般由29～34个氨基酸组成，分子内的3个二硫键使防御素具有稳定的β-片层结构。防御素分子间通过疏水键和氢键的相互作用能形成二聚体。目前对防御素的抑菌机理尚无定论。普遍认为，防御素的细胞毒活性和抗微生物活性与其结构特点有关，带正电的防御素与带负电的细菌细胞膜相互吸引，二聚或多聚的防御素穿膜形成跨膜的离子通道，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量下降，最终使靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性(Lehrer RI et al，Annurev Immun，1993，11：105；Lehrer RI et al，J Clin Invest，1989，84：553)。由于这种特殊的作用机理，使防御素具备两个特点：一是抗性谱广，二是目的微生物难以对其产生抗性突变。因此，科学家们对防御素应用前景十分看好。

防御素在人体内广泛分布，包括α防御素β防御素两类。已发现的α防御素有6种之多，有关基因结构已经基本清楚(Sparkes RS et al，Genomic，1989，5：240)。早在1993年，日本科学家就报道防御素在离体情况下可抑制艾滋病毒的复制，但没有证明在体内防御素仍然有效(Nakashima H et al，AIDS，1993，7：1129)。1986年，科学家们观察到人体免疫细胞CD8分泌一些可抑制艾滋病毒复制的未知因子(Walker CMet al，Science，1986，234：1563)，但此后多年一直无法确定这些抑制因子的成分。直到2002年，张林琦等在正常人群和感染HIV 1的长期生存者来源CD8+T淋巴细胞刺激培养液中发现了一族有2个或3个峰的分子，分子量分别为3371.9Da、3442.5Da和3486.5Da。用单克隆抗体识别技术及直接蛋白序列分析技术，他们最终确定这些小分子是人α防御素1、2和3。这些小分子只能在正常对照和长期生存者中被检测到，在处于进展状态的HIV 1感染者的刺激培养液中没有发现这些α防御素。实验还证实人工合成α防御素1和2的混合物(1∶1)也对HIV 1病毒具有显著的抑制效应(Zhang et al，science，2002，298：995)。张林琦等的研究揭示了为什么少数感染艾滋病毒的人(约占感染者总数的1％-2％)可以自然存活多年不发病的秘密。著名华裔学者何大一博士认为防御素是一个非常有前途的治疗手段，对于艾滋病的治疗是一个非常有益的补充。

人α防御素1、2和3的发现和证实，使科学家在了解HIV/AIDS的发病机制方面迈出了一大步，为艾滋病的控制与治疗提供了新的思路与方向。但要将防御素真正应用于艾滋病治疗，尚有很多工作要做。从人体内提纯的天然防御素具有很强的抗病毒活性，但提取资源有限，成本昂贵。化学合成法虽可方便地对多肽进行修饰，但也存在成本过高的问题。现已获得两个商业化的产品α防御素1和α防御素2，但合成工艺复杂，且与天然提纯品相比纯度不够，包含了许多杂蛋白，抗艾滋病病毒活性较低，仅为提纯的天然防御素的1/10至1/20(Zhang et al，science，2002，298：995)。因此，通过基因和蛋白质工程技术来改善生产效率和产物活性，已成为防御素研究和应用的关键。

防御素在基因工程领域颇具诱惑力。这种诱惑力主要表现在两个方面：一是研究出高效的细菌或酵母表达系统，大量生产防御素，应用于医学领域；另一个方面是分离动物或昆虫的防御素基因，将之应用于植物抗病基因工程中(傅荣昭等，高技术通讯，1996，3：61)。因此，有关的研究非常引人注目。孙勇如等通过国家“九五”科技攻关项目的研究，分离出兔防御素基因(科学通报，1998，43：1519)，将兔α防御素基因导入小球藻，从转基因小球藻中获得了有活性的兔防御素NP 1，立了防御素基因小球藻生物反应器的模型系统，解决了藻类基因工程表达(专利申请号971123446，公开号CN1203278A；专利申请号71121893，公开号CN1203277A)，并构建兔防御素基因植物表达载体质粒(申请号95108877，公告号1126760)及在番茄中得到了表达(Zhang XH，Yi Chuan Xue Bao，2000，27：953)。但植物真核表达系统的较低表达效率对其工业化生产有一定障碍。

大肠杆菌基因工程是降低人防御素生产成本的一条有效途径。但如同其它多肽抗生素一样，防御素对大肠杆菌细胞的毒性以及表达产物的活性问题是限制其在原核表达系统表达成功的主要因素。为了克服对宿主细胞的毒性，人们采用融合表达或选择对多肽抗生素具有抗性的细菌株系进行原核表达。1993年，Piers等将HNP1、昆虫杀菌肽cecropin/melittin(CEME)杂合肽基因分别与4个不同的载体蛋白相融合，并在大肠杆菌中进行表达；对表达产物的产量、细胞定位、蛋白降解情况进行了较为系统的研究，但遗憾的是没得到具有抗菌活性的HNP1(Piers et al，gene，1993，134：7；孙超等，多肽抗生素研究进展，http：//www.21ray.com/6-tech/10.html)，所以生产防御素的高效表达体系还有待于进一步研究。

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用广泛的经典表达系统。自二十世纪七十年代中期Struhl等首次在大肠杆菌中实现了有功能的活性表达以来，以质粒、乳糖操纵子为基础建立的大肠杆菌表达体系不断得到发展和完善。与其他系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目标基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，因而成为分子生物学研究和生物技术产业化进程中的重要工具(李育阳等，基因表达技术，科学出版社，2001，1-13)。

要利用大肠杆菌系统高效生产异源蛋白质，必须采取正确的基因修饰策略。如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。遗传密码子有64种，但绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。最被频繁利用的称为最佳密码子(optimicalcodons)，那些不被经常利用的称为稀有或低利用率密码子(rare or low-usage codons)。实际上用作蛋白表达或生产的每种生物都表现出密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母和灵长类都有6～8个密码子很少被利用(Kane J F，Current Opinions Biotechnol，1995，6：494；Zhang S，Gene，1991，105：61)。在大肠杆菌、酵母中编码丰度高的蛋白质的基因都明显避免使用低利用率密码子。稀有密码子的tRNA丰度很低，可能在翻译中发生中止和移码突变；低利用率密码子往往抑制核糖体的运动，这些机制使含有稀有密码子的蛋白基因难以实现高效的异源表达。对基因序列进行适当突变以及在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因等方法都能改善这种状况，但最根本的方法还是在不改变表达蛋白的氨基酸序列的基础上，重新设计并人工合成适宜大肠杆菌高效表达基因序列。人血红蛋白在大肠杆菌系统的成功表达就是这种技术思路的范例。为了达到血红蛋白的好的表达水平，科学家们用大肠杆菌偏爱的密码子重新合成了α球蛋白的编码序列。

进行基因设计时除考虑编码区的密码子使用外，还应注意不同生物基因对终止密码子的偏爱性以及围绕终止密码子的序列框架对终止效率的影响。包括人在内的哺乳动物倾向于用TGA而大肠杆菌多偏爱TAA；对于TGA和TAA终止子而言，紧接着终止密码子的下游碱基对有效终止的影响力大小依次为G＞T＞A＞C。据报道，在大肠杆菌系统中，终止子终止效率可从TAAT的80％减低到TGAC的7％。

要获得异源蛋白质的成功表达，不仅要考虑该蛋白质的基因序列，还要明确其生物活性，根据这些特性设计正确的技术方案。一些动物蛋白质具有强烈的细胞毒性，它们在动物体内以特殊的机制避免对动物细胞本身的损伤。如人体内防御素是先合成前原蛋白，暂时封闭其细胞毒性。另外，成熟的防御素是在嗜天青颗粒中形成，并且很少向外分泌，即使向外分泌，也被胞间液稀释或与其它蛋白结合，从而不表现细胞毒活性。要用大肠杆菌表达系统来生产这些蛋白就相对比较困难。由于目标蛋白对宿主本身产生杀灭作用，往往造成表达体系表达量低甚至无表达。因此，抑制或克服目标蛋白对大肠杆菌本身毒性就成为首要面对的问题。

选择适宜的大肠杆菌表达系统、考虑目的蛋白质的形式和在细胞中的位置等是解决细胞毒性蛋白质表达的主要途径。完整的表达系统由表达载体和宿主菌两部分构成。目前比较成熟的大肠杆菌表达系统包括lac和tac表达系统、PL和PR表达系统、T7表达系统等。T7系统以Novagen公司的pET系列载体以及相应的宿主菌(BL21系列)为代表(Robert Mierdorf etal，Newsletter ofNovagen，1994，1：1)，这类表达系统所用的载体具有可诱导的T7启动子，系统表达量是目前大肠杆菌系统中最高的(可占细菌总蛋白的25％以上)，常用6～10个组氨酸形成融合蛋白，只增加几个氨基酸，对蛋白质结构影响较小。pET系列载体之一的pET32a带有硫氧化还原蛋白(Thioredoxin，Trx)标签，表达的Trx蛋白溶解度很高，具有很强的蛋白二硫键氧化还原酶活性，可催化新生肽链二硫键的形成，同时具有分子伴侣的作用，可辅助多种蛋白质底物的折叠和组装。与pET系列载体匹配的宿主菌包括BL21、BL21(DE3)、BL21TrxB、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE等。BL21应用最广，具有lon和ompT蛋白水解酶缺陷的优点，可提高表达蛋白的稳定性。BL21TrxB菌株在蛋白酶缺陷BL21基础上具有硫氧还蛋白还原酶突变(TrxB)，有利胞浆二硫键形成，增加正确折叠的蛋白组分。BL21(DE3)pLysS带有质粒pLysS，能编码T7溶酶。T7溶酶可降低T7启动子调控的目的基因的背景表达水平，但不干扰由IPTG诱导的表达水平，适宜毒性蛋白表达。PL和PR表达系统则是以温度敏感性PL和PR启动子为中心构建的表达系统，成本低廉，但是表达蛋白容易降解，表达量低，不适宜毒性蛋白表达。lac和tac表达系统以Amersham公司的pGEX系列载体为代表，在tac启动子、Lac操纵基因及SD序列下游相继是谷胱苷肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase Gene Fusion，GST)基因序列以及多克隆位点。克隆的外源基因与GST基因相连，表达产物GST融合蛋白。该系统具有可诱导高效表达、便于纯化的优点。由于GST基因序列存在可避免mRNA复杂二级结构的出现，增加转录物稳定性。GST属于多功能蛋白，有助于稳定重组蛋白的折叠，可在温和条件下除去，不易破坏目标蛋白的功能及其抗原性(The Recombinant Protein Book，Amersham，www.apbiotech.com)(Pickett C B，et al，Ann Rev Biochem，1989，58：743)。BL21系列菌株也适用于这类载体。

表达蛋白质特别是毒性蛋白时需要考虑目的蛋白质的形式和在细胞中的位置。目前的表达形式有两种，一是在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒，二是在细胞内表现为可溶性的蛋白质。可溶性蛋白可存在于细胞质中，还可借助于本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工运输体系，最终分泌到细胞周质空间，或分泌到培养液中。对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达是比较理想的方式。带有Trx或GST标签的载体选择了大肠杆菌偏爱的密码子，容易表达外源蛋白，并且纯化方便。

截止目前，在应用大肠杆菌系统生产真核来源的药用蛋白方面已取得了很大进展。据报道，国际上已批准的重组蛋白药物中有34种采用该系统生产，在我国已用该系统生产人生长素、胰岛素、人组织型纤维酶原激活剂、白介素等。国内在人α防御素的研究方面也已取得了一些进展。李景鹏等通过化学合成途径获得了人α防御素cDNA克隆(东北农业大学学报，1995，26：383)，刘水平等也克隆了人类防御素基因c DNA片段(湖南医科大学学报，2002，27：17)，但是，目前以大肠杆菌系统为工具进行人α防御素生产的技术尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用大肠杆菌表达系统生产人α防御素1蛋白的方法，包括用于该方法的适宜DNA序列，系统部件组合以及主要技术路线。

本发明提供了一种用大肠杆菌表达系统生产人α防御素1蛋白的方法，包括：

(1)设计并化学合成SEQ ID NO 1所示的序列；

(2)插入原核表达载体中，构建重组质粒pET32a-mHNP1；

(3)使用得到的重组质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)pLysS；

(4)异丙基硫代-β-D半乳糖糖苷诱导转化细菌表达异源蛋白。

为解决防御素基因的表达效率，对防御素基因进行了优化设计。本发明所述的SEQ ID NO 1序列是依据已公布的人α防御素cDNA序列及氨基酸组成(Zhang et al，science，2002，298：995)，经基因优化设计改造而来，可翻译出正确的人α防御素1氨基酸序列。

人α防御素1cDNA( NM 004084)先翻译成94aa的前原防御素(preprodefenis， NP 004075)，再裂解、加工最后变成成熟的30aa的防御素1(P59665)或29aa的防御素2( P59665)。人体内防御素的这种生成方式是机体克服其毒性的自然机制(Erika V et al，J Clin Invest，1996，97：1624)。

                表1 α防御素1成熟肽编码序列及其氨基酸序列

注：阴影部分字符标识人防御素成熟肽编码序列中的大肠杆菌稀有密码子。

对照目前公认的大肠杆菌稀有密码子表(Zhang et al，1991，Gene，105，61-72；Strategies Newsletter，2000，3(1)，p.31)，人α防御素1成熟肽编码序列(见表1)中先后密集排列有8个大肠杆菌基因中很少使用的密码子，比例高达27％左右。如此多的稀有密码子将可能对以大肠杆菌为工具的蛋白表达系统效率产生严重影响。因此，我们根据大肠杆菌喜好密码子进行同义密码子替换( http：//www.uky. edu/Pharmacy/ps/porter/CodonUsage/preferred codons.htm)，在不改变氨基酸序列的情况下，对防御素成熟肽编码序列进行大规模改造，将稀有密码子替换为使用频率高的同义密码子。除添加起始密码子ATG外，上述序列还使用了包括大肠杆菌常用终止密码子TAA在内的双终止子，并配置了有利终止的侧翼序列，TAAG的序列格式将最大限度地防止不良终止效应的发生，为高效表达系统奠定了基因结构基础。

本发明在基因修饰和反复筛选的基础上，选择带有T7启动子和硫氧化还原蛋白(Trx)标签序列的原核表达载体(pET32a，Novagen公司产品)，将优化了的基因序列插入pET32a载体Trx基因序列之后的BamHI和SalI位点之间，从而构建了高效融合性表达载体pET32a-mHNP1(图1)。这种构建方式综合了T7启动子的高效性以及Trx蛋白能促进蛋白二硫键形成和正确折叠的特点，在进一步提高表达效率的基础上，同时兼顾了表达产物的活性。表达的蛋白质经肠激酶切处理，可获得单纯的目的蛋白。

本方法将获得的重组表达质粒转化入适宜的大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)pLysS内，组成完整的大肠杆菌表达系统。BL21(DE3)pLysS菌株可降低T7启动子调控的目的基因的背景表达水平，但不干扰由IPTG诱导的表达水平，如此克服了因表达产物的宿主细胞毒性而致的低表达甚至不表达现象，为实现目的蛋白的高效有活性表达奠定了首要基础。

本方法建立的表达系统属于化学诱导表达系统。这些化学物质包括异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside，IPTG)、乳糖等。IPTG诱导效率高，可满足抗体制备、生化性质研究、结构研究等需要，而乳糖诱导法以其安全性适宜于制备用于医疗目的的重组人防御素。

本发明首次提供了用一种大肠杆菌DNA重组技术获得人α防御素1蛋白的方法，并提供了适宜该方法的高度优化的核苷酸序列。与目前应用的化学合成、人工提取人防御素以及藻类生产动物防御素的技术相比，具有如下的优点：

(1)核苷酸序列的优异性。与已人α-防御素1成熟肽编码序列相比，本申请要求保护的特定的碱基序列经过大幅度修饰(改变了近1/3的核苷酸序列，优化终止密码周边序列)，具有更好的转录和翻译效率，更适合基因工程系统表达。

(2)本申请中要求保护的重组表达体系，通过使用对大肠杆菌有较好抗性的宿主菌BL21(DE3)pLysS及以Trx融和方式表达目标蛋白，克服了因表达产物对宿主细胞毒性而致的低表达甚至不表达现象，成功实现了有活性表达，具有新颖性和创造性。

(3)本发明提供的方法可较好地弥补人工提取、化学合成生产人防御素方法的不足。产物容易加工提纯，开发周期短，生产效率高，可大规模制取。

(4)本法提供技术产品为人体活性多肽，应用于医学领域时比动物源性防御素毒安全，副作用可能性小，不易发生人体免疫应答反应及因此而导致的药效降低等现象。

本发明在国内首次解决了以大肠杆菌基因工程途径表达有活性人α防御素1的技术难关，通过融合蛋白的方式生产出了有活性的人防御素1，为α-防御素1的基因工程生产提供了新的途径，将在一定程度上解决人防御素1蛋白来源不足的现状。研究成果可满足生产人防御素结构、生化性质以及制备相应抗体等研究应用的需要，也使人防御素的药用开发和规模生产成为可能。新型药物的大规模生产，将为目前难以医治的疾病得以有效治疗，特别是对艾滋病的控制和治疗提供了新的思路和方法。

附图说明

图1：重组质粒pET32a-mHNP1图谱

图2：mHNP1片段合成示意图

F1、F2为正义链片段，F3、F4为反义链片段。正义链片段和反义链片段相互错位交搭。

图3：pUCm T-mHNP1阳性克隆PCR鉴定

1、2、4、5：阳性克隆，3：DNA marker

图4：pET32a载体图谱

图5：pET32a-mHNP1菌落质粒PCR鉴定

5：DNA marker，其余为菌落号。所有菌落质粒都为阳性

图6：15％SDS-PAGE凝胶鉴定菌体中融合蛋白表达

1，pET32a/BL21(DE3)PlysS空载非诱导对照；2，pET32a/BL21(DE3)PlysS空载诱导；3，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS非诱导对照6h；4，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS诱导6h；5，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS非诱导对照4h；6，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS诱导4h；7，蛋白标准；8，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS诱导2h；9，pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS非诱导对照2h；

图7：pET32a-mHNP1诱导表达时间光密度曲线

pET32a/HNP1-U：转基因菌pET32a-mHNP1/BL21(DE3)plysS非诱导样品

pET32a/HNP1-I：转基因菌pET32a-mHNP1/BL21(DE3)PlysS诱导样品

图8：mHNP1的杀菌活性

E coli BL21：大肠杆菌BL21；

Sta phylocococci aureus：金黄色葡萄球菌

具体实施方式

实施例1：α防御素1成熟肽编码序列的化学合成及其克隆

1、HNP1成熟肽编码序列优化设计与化学合成

从Genbank中查询得知HNP1mRNA序列( NM_004084)及其成熟肽氨基酸序列( P59665)，由此推出其成熟肽编码序列(90bp)。在序列序列分析的基础上，根据生物喜好密码子及其稀有密码子的差异性，对原序列进行优化设计。即剔除HNP1中稀有密码子，将它们替换为大肠杆菌喜好密码子。为达到良好的翻译终止效果，在优化编码序列末端添加了TGA和TAA两个终止密码子，利于目的蛋白在大肠杆菌表达。

修饰后序列见表2.

将重新设计的HNP1成熟肽编码序列(modified HNP1，以下简称mHNP1)两条互补链各分成2个片段，共4个片段(F1-F4)，互补片段之间相互交搭。交由上海生工生物技术公司，用亚磷酰胺法分别予以合成上述片段(见表3及图2)。检测纯化后分装，-20℃备用。

     表2 HNP1成熟肽原编码序列及重新设计修饰的序列

原编码序列	1   GCC TGC TAT TGC AGA ATA CCA GCG TGC ATT31  GCA GGA GAA CGT CGC TAT GGA ACC TGC ATC61  TAC CAG GGA AGA CTC TGG GCA TTC TGC TGC
		重新设计序列	1   GCC TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATT31  GCA GGC GAA CGT CGT TAT GGC ACC TGC ATC61  TAC CAG GGC CGT CTC TGG GCA TTC TGC TGC

表中斜体部分为替换了的密码子

                            表3 寡核苷酸片段的设计

正义链	F1(42bp)：5’GCC TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATTGCA GGC GAA CGT  3’F2(48b)： 5’CGT TAT GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG GCA TTC TGCTGC  3’
		反义链	F3(36b)： 3’ACG TAG ATG GTC CCG GCA GAG ACC CGT AAGACG ACG  5’F4(54b)： 3’CGG ACG ATA ACG GCA TAA GGT CGG AACG TAA CGT CCG CTT GCA GCAATA CCG TGG    5’

合成上述片段后，先对F2、F4两片段进行5’端磷酸化。即取F2片段和F4各200pm，T₄多核苷酸激酶40u(大连宝生物工程公司)，10mmol/L ATP 5ul，10ul 10倍缓冲液[500mM Tris-HCI(PH 8.0)，100mMMgCI₂，50mM DTT]，加水补足100ul体积，37℃反应2小时，80℃10min后渐冷至室温，用酚液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)抽提，100％乙醇沉淀以及70％乙醇，溶于20ul TE中。

对F2和F4片段5’端磷酸化处理后，进行4片段连接反应。将合成的4个片段(F1～F4)各200pm，用100ul 10倍T₄连接酶缓冲液[660mM Tris-HCI(PH 7.6)，66mM MgCI₂，100mM DTT，1mM ATP]溶解在一小管中，其中F2和F4己磷酸化，80℃2min后渐冷至室温，加入40ul T₄ DNA连接酶(大连宝生物工程公司)，12℃反应24h，酚液和乙醇抽提处理。将所得样品加入1.0％琼脂糖点样孔内，同时加入DNA marker(DL2000，北京天为时代科技有限公司)，60-80V电泳，紫外透射仪下检测，切下目的条带凝胶，用北京赛百盛基因技术有限公司生产的Ultrapure^TM PCR产物纯化试剂盒回收。最后溶解于20ulTE中。

2、合成mHNP1的克隆

(1)载体及菌种：

pUCmT克隆载体购自上海生工公司。大肠杆菌DH 5α为本实验室保存。

(2)工具酶、marker及试剂盒：

Taq DNA Polymerase、X-gal、IPTG、dNTP购自北京鼎国生物技术有限责任公司。DNA markerDL2000，来自北京天为时代科技有限公司。BamHI、SalI等限制性内切酶、T₄ DNA Ligase购自大连宝生物工程公司，Ultrapure^TM PCR产物纯化试剂盒由北京赛百盛生物工程公司提供，PCR引物(如下)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(3)引物合成：

按照合成mHNP1序列，利用Oligo6.0软件设计如下一对引物(P1和P4)：

P1  5’GCG  GGA TCC ATG GCC TGC TAT TGC CGT ATT C    3’

              BamH I

P4  5’CGC  GTC GAC TTA TCA GCA GCA GAA TGC CCA G    3’

          Sal I

下划线部分为酶切位点，斜体为起始密码子或终止密码子。

(4)PCR扩增反应：

以化学合成后连接的mHNP1为模板，用P1、P4引物对进行扩增。PCR在Flexigene(Techne(Cambridge)Ltd生产)PCR仪上进行，50ul反应体系：Taq酶1.0ul(2u/ul)，dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，各10mM，PH7.5)4.0ul，10倍反应缓冲液[200mM Tris-HCI(PH 9.0)，500mM KCI，20mM MgCI₂，1％Triton X-100]5.0ul，P1和P4引物各2.0ul，上述模板DNA 2.0ul(约含1ng DNA)，剩余体积用灭菌双蒸水补足。

反应条件为：95℃预变性1min，然后94℃变性30s，55℃30S，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min补齐末端。

(5)电泳检测PCR结果，并回收扩增片段，连接到T载体上：

反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，约为110bp，用回收试剂盒纯化回收上述PCR产物，与pUCm T载体进行连接。10ul连接反应体系组成为：T4 DNA连接酶1ul，上述回收PCR产物5ul(0.2pmol)，pUCm T载体(50ng/ul)1ul，10倍T₄连接酶缓冲液([660mM Tris-HCI(PH 7.6)，66mM MgCI₂，100mM DTT，1mMATP]1ul，PEG40001ul，灭菌水1ul。16℃，过夜连接。

(6)转化，筛选：

按照《分子克隆》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)。科学出版社，2002，p96)中的方法制备DH5α感受态细胞，按常规热激法转化大肠杆菌DH5α。将连接液8ul加入放置在冰浴上刚融化的DH5α感受态细胞200ul中，冰浴30min，然后在42℃恒温水浴中精确热激90s，立即取出，冰浴2min，加入不含任何抗生素的LB培养液800ul，37℃温浴45min使细菌复苏并表达抗生素抗性基因。最后将转化菌液涂在含X-gal和IPTG的氨苄琼脂平板上。培养过夜，次日进行蓝白斑初步筛选。

阳性菌落筛选程序是：从转化平皿中挑取白斑多个(20个)，另选少量蓝斑(3个)做对照，接种于含3ml含氨苄的LB培养液过夜。次日提取质粒，以蓝斑质粒为对照在白斑质粒中挑选电泳条带大小适合的滞后者，再进行PCR扩增检测(见图3)、BamH I和Sal I双酶切检测，均得到预计的约100bp的DNA片段。最后，挑选一个上述各步鉴定正确的菌落送上海申友公司测序。

序列分析结果表明，克隆中有预期的mHNP1编码序列及终止密码子侧翼序列(含SEQ ID NO：1)：

1    GCG  GGA TCC ATG GCC TGC TAT TGC CGT ATT

31   CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA CGT CGT TAT

61   GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG

91   GCA TTC TGC TGC TGA TAA  GTC GAC GCG

将获得的克隆命名为pUCm T-mHNP1质粒，做甘油菌-70℃保存。

实施例2：mHNP1 T7型表达载体的构建、诱导表达及活性鉴定

1、mHNP1 T7型表达载体的构建

(1)菌种与质粒：

大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为本实验室保存。pET32a质粒(Novagen公司，见图4)系东南大学医学院曾宪坤博士惠赠。

(2)工具酶及试剂：

限制性内切酶、T₄连接酶、Taq DNA聚合酶分别购自大连宝生物工程公司、上海生工公司、北京鼎国生物技术有限责任公司。

(3)引物的设计与合成：

PCR引物依本发明优化设计mHNP1成熟肽编码序列设计，均由大连宝生物公司合成。引物序列如下：

P1    5’GCG  GGA TCC ATG GCC TGC TAT TGC CGT ATT C    3’

                BamH I

P4    5′CGC  GTC GAC TTA TCA GCA GCA GAA TGC CCA G    3’

                Sal I

下划线部分为酶切位点，斜体为起始密码子或终止密码子。

(4)T7型原核表达载体的构建

采用PCR亚克隆法构建pET32a-mHNP1。

A.PCR扩增目的片段，并回收：以重组质粒pUCm-mHNP1为模板，由P1、P4引物经Termocycler PCR仪(Biometra公司产品)扩增出约0.1k b的mHNP1 DNA。反应体系为50ul，其中Taq酶1.0ul(2u/ul)，dNTPs(各10mM)4.0ul，10倍PCR反应缓冲液[200mM Tris-HCI(PH 9.0)，500mM KCI，20mM MgCI₂，1％Triton X-100]5.0ul，双端引物(P1和P4)各2.0ul。模板DNA 2.0ul(约含1ng DNA)，用灭菌双蒸水补足体积。反应条件为：95℃预变性1min，然后94℃变性30s，55℃ 30S，72℃延伸1min，共30个循环，最后延伸10min补齐末端。PCR反应后1.5％琼脂糖电泳检测，为110bp。用回收试剂盒纯化回收100ul上述PCR产物，溶解于20ul灭菌水中。

B.目的DNA片段与载体的连接：将上述纯化的PCR产物和pET32a载体分别以Bam HI和Sal I双酶切，并用Ultrapure^TM PCR产物纯化试剂盒进行纯化。将酶切纯化的目的基因和pET32a按体积比5∶1进行连接。反应体系为10ul，即加入目的DNA 5ul，pET32a 1ul，T4 DNA连接酶1ul，连接缓冲液1ul，16℃，连接过夜。得到的连接产物命名为pET32a-mHNP1。

C.重组子的提取及鉴定：将连接产物(pET32a-mHNP1)转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)PlysS。取8ul连接产物加入200ul感受态菌中，0℃冰水浴30min，42℃水浴90s，冰水浴2min，加入800ul LB培养液，37℃振荡培养1h后涂布于含氨苄的LB板上。用PCR鉴定克隆，电泳结果显示利用P1、P4引物扩增出与预期大小(约0.1Kb)的片段(图5).将鉴定的阳性克隆抽提质粒，并进行Bam HI和Sal I双酶切鉴定。最后，进行测序分析。用DNAMAN分析证实克隆序列与设计序列SEQ IDNO：1完全一致。重组质粒pET32a-mHNP1构建组成见图1。

2、pET32a-mHNP1在E.Coli BL21(DE3)PlysS中的表达

将鉴定正确的pET32a-mHNP1原核表达质粒转化感受态细胞后，挑取新鲜的单菌落在含氨苄的LB培养基中振荡培养过夜，次日取过夜培养物，按1％体积接种到新的LB培养基中，剧烈振荡培养3h左右至OD₆₀₀≈0.6。向培养菌中加入IPTG，使其终浓度达到1mmol/L，30℃振荡培养，分别在诱导后2h、4h、6h取小样检测蛋白表达，最后离心收集菌体。

用SDS-PAGE检测菌体中的融合蛋白表达(图6)。转化pET32a-mHNP1重组质粒的BL21(DE3)PlysS菌经IPTG诱导表达，表达菌处理后进行PAGE检测。蛋白标准(Protein molecular weight marker #SM0431，MBI fermentas产品)购自上海生工生物公司。结果表明，含有pET32a-mHNP1重组质粒的BL21(DE3)PlysS菌经IPTG诱导，菌体裂解物增加了一条约22kDa的蛋白电泳条带，和预计的蛋白质分子量相符(Trx-His标签分子量约为18.4KDa，HNP1成熟肽约3.5KDa)，说明表达出了含目的多肽的融合蛋白。另外，在诱导后2h左右，目的蛋白表达已经达到相当高的水平。约在诱导后4h，目的蛋白表达量达到最大值。经亚细胞定位方法(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)。科学出版社，2002，1244)确定大部分目的蛋白在胞质中以可溶性蛋白方式存在，提示目的蛋白可能具有良好的生物学活性及容易提纯等特点。

诱导过程中细菌生长曲线见图7。取含有pET32a-mHNP1质粒的BL21(DE3)pLysS转化菌接种LB，37℃振摇培养到OD600≈0.6，将pET32a-mHNP1菌一分为二，一半加IPTG诱导，一半不加做未诱导对菌照。30℃振摇培养，分别于0h、1h、2h、4h取3ml菌液测其OD₆₀₀值并记录数据。从图7可见，加IPTG 1h后，诱导菌光密度就开始轻微下降，表明表达的融合蛋白已经开始对宿主菌本身产生影响。在2h和4h后诱导组和对照组生长有了显著差异。上述结果显示表达的融和蛋白保持了一定的抑菌活性。

3、纯化重组人α防御素1(mHNP1)的抗菌实验

以常见革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Sta phylococcus aureus)、革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))为实验对象进行抗菌试验。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎甚至败血症、脓毒症等，因而是药物抗菌实验的良好材料。

(1)重组人α防御素的提取和纯化

I、制备细胞抽提物

将带有质粒pET32a-mHNP1的大肠杆菌BL21(DE3)PLysS菌株接种于含Amp的LB培养基37℃活化过夜。次日按1％扩大培养至OD₆₀₀＝0.8时加IPTG至终浓度为1.0mmol/L，继续振荡培养4小时(30℃)。于4℃5000g离心15min收获细菌。通过15％SDS-PAGE电泳检测以及亚细胞定位方法(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)。科学出版社，2002，1244)确定大部分目的蛋白在胞质中以可溶性蛋白方式存在。

制备细菌抽提物的方法参照《分子克隆》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译。科学出版社，2002，p1247)。将每100ml培养菌液离心收获的菌体沉淀重悬浮在4ml结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠，500mmol/LNaCI，PH7.8)中，加溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min。混合物于4℃摇床上孵育10min。加入TritonX-100、DNase和Rnase，终浓度分别为1％、5ug/ml和5ug/ml，再于4℃振动孵育10min。4℃3000g离心30min，去除不溶性细胞碎片。上清(细胞裂解物)转移到一新管中。上清液用0.45um滤膜过滤后进行亲和层析。

II、镍琼脂糖凝胶亲和层析

用镍琼脂糖凝胶FF柱(北京卓冠群科技有限公司产品)在AKTA Prime层析仪(Amershan biosciences产品)上进行亲和层析，提取融合蛋白。

缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19ml，0.5M Na₂HPO₄ 81ml，NaCl 29.3g，加适量水溶解后定容到1000ml。

缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19ml，0.5M Na₂HPO₄ 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g，加适量水溶解后定容到1000ml。

缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：

咪唑浓度	缓冲液1量(ml)	缓冲液2量(ml)
			10mM	98	2
20mM	96	4
			50mM	90	10
100mM	80	20
			200mM	60	40

300mM	40	60
			400mM	20	80

基本步骤如下：

A、镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20m，柱床体积为10ml。

B、用缓冲液1平衡2-5个床体积，流速为2ml/min。

C、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流1ml/min。

4、用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2ml/min。

5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度。

6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20％的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min。

III、融合蛋白的裂解以及进一步处理

在用BCA法测定融合蛋白的含量后，用肠激酶(Novagen产品)将目的蛋白从融合蛋白切下(20℃，16小时)。最后，再次进行亲和层析把Trx-His标签和肠激酶去除，而得到纯的目标蛋白。有关操作按照产品说明书进行。纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定，冻干，命名为mHNP并于-80℃保存。

(2)抗菌实验

A、菌种及材料

大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))

金黄色葡萄球菌(Sta phylococcus aureus)

mHNP1溶液配制：纯化mHNP1用0.01％乙酸稀释成不同浓度

琼脂糖：Sigma产品

B、抗菌实验基本步骤

琼脂糖弥散抗菌实验参考刘文超等(第四军医大学学报。1997，18(6)：525)、Lehrer等(J Immunnolmethod.1991，137：167)以及钟德钰等(华西口腔医学杂志。1998，16(1)：26)等所述的方法进行。取对数生长期的细菌3×10⁶CFU，加入16ml 42℃灭菌琼脂糖培养基中(含营养肉汤粉4.8mg，低电渗琼脂糖160mg，0.02％Tween 20，以1mmol/L pH7.4PBS配制)，混匀后倒入直径14.5cm的培养皿中，用打孔器在胶上打直径3mm的孔，每孔加入5μl防御素，浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml。在37℃温箱中温育3h，再铺以16ml 42℃灭菌琼脂培养基，于37℃温箱中继续温育18h，以考马斯亮蓝染色(考马斯亮蓝R250 2mg，甲醇27ml，甲醛15ml，水63ml)24h。观测以加样孔为中心的抑菌环的大小。

C、结果

mHNP1的抗菌活性如图8所示，在50μg/ml时mHNP1对大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))和金黄色葡萄球菌(Sta phylococcus aureus)在琼脂糖弥散抗菌检测系统中均显示出显著杀菌活性，并随着浓度增加而活性增强；但不同菌株对防御素的敏感性有差异。

SEQ ID NO 1的信息

序列特征：

序列描述：SEQ ID NO 1：

1   ATGGCCTGCT ATTGCCGTAT TCCAGCCTGC

31  ATTGCAGGCG AACGTCGTTA TGGCACCTGC

61  ATCTACCAGG GCCGTCTCTG GGCATTCTGC

91  TGC TGATAAG

下划线为起始密码子或双终止密码子及侧翼序列

Claims (7)

1.一种利用大肠杆菌生产人α防御素1蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)使用SEQ ID NO 1所示的序列片段

1   ATGGCCTGCT  ATTGCCGTAT  TCCAGCCTGC

31  ATTGCAGGCG  AACGTCGTTA  TGGCACCTGC

61  ATCTACCAGG  GCCGTCTCTG  GGCATTCTGC

91  TGC TGATAAG

下划线为起始密码子或双终止密码子及侧翼序列

(2)将上述基因序列插入T7型Trx融合表达载体中，获得重组质粒pET32a-mHNP1。

(3)将pET32a-mHNP1导入匹配大肠杆菌中组成完整表达体系；

(4)用异丙基硫代-β-D半乳糖糖苷诱导上述体系在菌体内表达人HNP1成熟蛋白。

2.权利要求1所述的方法，其中SEQ ID NO：1是人HNP1成熟肽优化编码序列。

3.权利要求1所述的方法，其中T7型Trx融合表达载体是pET32a。

4.权利要求1所述的方法，其中大肠杆菌是BL21(DE3)pLysS菌株。

5.一种多核苷酸，包含如SEQ ID NO：1所示的序列。

6.包含权利要求1的多核苷酸的表达载体。

7.包含权利要求7的表达载体的宿主细胞。

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