CN103059124B - 一种重组猪干扰素γ及其编码基因和表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组猪干扰素γ及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法，属于生物基因工程领域。重组猪干扰素γ作为一种非特异性广谱抗病毒生物制剂在兽药领域具有广阔的药用前景，但是与大多基因工程兽药一样，猪干扰素γ也存在着产量不足、价格昂贵、质量参差不齐等问题。本发明采用大肠杆菌表达系统对密码子优化后的重组猪干扰素γ基因进行异源表达。此外，针对原核表达体系中的猪干扰素γ多以包涵体的形式表达的问题，本发明还提供了重组干扰素γ包涵体纯化和复性的方法，使得制得的重组干扰素γ具有较高活力，达到了产业化生产的标准。
Description
技术领域
本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪干扰素γ及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、γ三种。其中，γ干扰素(interferon，IFN-γ)具有免疫干扰素之称，由T细胞及NK细胞合成，其生物学效应包括抗病毒活性、抗肿瘤细胞增殖、诱导MHCI级抗原表达、诱导MHⅡ级抗原表达、激活使其杀伤肿瘤细胞以及杀灭胞内寄生虫。由此可见，干扰素γ不仅具有广谱抗病毒功能，还具有免疫调节的作用，对疾病的发生发展有着重要的影响。
我国是养猪大国，猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等多种猪病毒性传染病给养猪业带来了巨大的经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗，仍不能有效控制疾病流行。基因工程动物用药干扰素-γ可有效增强猪仔的免疫功能，提高机体对病毒的防御作用，并且具有无药物残留、无副作用等特点，深受临床兽医和养殖户的青睐。但是干扰素-γ的生物学效应具有高度的种属特异性，而天然的猪干扰素γ在机体内表达甚微，很难直接从体内大量提取供临床研究及应用。因此本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可以大量表达重组猪干扰素γ表达系统和表达方法。
原核表达系统是最早被采用进行研究的，也是目前掌握最为成熟的表达系统。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但是，原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：例如无法对表达时间及表达水平进行调控、外源蛋白的表达对宿主细胞毒性作用、产物纯化困难等；除此之外，由于原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，产物多以生物活性较低包涵体的形式产生。而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复兴的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白的自身性质。如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又易产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是：使大肠杆菌表达的猪干扰素γ包涵体复性为具有生物活性的细胞因子。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达重组猪干扰素γ以及其基因和表达、纯化、复性方法。
本发明提供了一种重组猪干扰素γ，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供了编码上述所述重组猪干扰素γ的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。
本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪干扰素γ的基因的载体，所述的载体优选为原核表达质粒，最优选为pET21b。
本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21（DE3）菌株。
本发明还提供了重组猪干扰素γ在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：
该方法的步骤为：
1.挑取一个含有上述所述重组猪干扰素γ的大肠杆菌菌落，接入50mL的LB培养液，在250mL摇瓶中于37℃培养过夜；
2.取5mL过夜培养物接入于500mL的LB培养液中，在2L摇瓶中于37℃震荡培养至对数中期（A600=1.0）；
3.在培养物中加入IPTG至0.5-1.5mmol/L，于37℃，诱导表达1-4h后，于4℃以5000rpm/min，离心处理15min收集含有重组猪干扰素γ的大肠杆菌菌体沉淀。
所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50-100μg/mL。
本发明还提供了重组猪干扰素γ的包涵体纯化方法，包括如下步骤：
1.将收集得到的上述含有诱导重组猪干扰素γ大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4℃高速离心处理；重复一次。
2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液Buffer A3-10ml，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。
3.每克（菌体湿重）菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。
4.破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4℃高速离心处理，弃上清。
5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4℃高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次。
6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30-60min。
7.充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ变性溶液。
该纯化方法优选步骤如下：
1.将收集得到的上述含有诱导重组猪干扰素γ大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃，以12000rpm/min的转速离心15min；重复一次。
2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。
3.每克（菌体湿重）菌体加入5μL浓度为100mmol/L的PMSF，5μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，冰上搅动20min。
4.用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。于4℃，以12000rpm/min的转速离心15min，弃上清。
5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，于4℃，以12000rpm/min的转速离心15min，沉淀包涵体，重复一次。
6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。
7.充分混匀后室温下以12000rpm/min的转速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ变性溶液。
本发明还提供了优化后的重组猪干扰素γ的包涵体复性方法，包括如下步骤：
取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的上述所述的重组猪干扰素γ变性溶液，测其浓度，然后用变性缓冲液Buffer C将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL，注入截留分子量10KDa的透析卡中，4℃透析复性，每隔6h换一次复性缓冲液Buffer D。复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液用0.45μm滤膜过滤，即得到低浓度的重组猪干扰素γ复性溶液。并可进一步用截留分子量10KDa的超滤管脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机低温真空干燥，即获得重组猪干扰素γ粉末。
本发明的上述所述表达、纯化、复性方法是经过发明人反复多次实验摸索和验证得到的用于大肠杆菌表达系统表达重组猪干扰素γ的最为有效的方法，该方法的表达量高，且表达得到包涵体复性后活性更高。尤其是本发明的经优化过的重组猪干扰素γ的基因序列，更适于大肠杆菌表达系统的表达，所表达的重组猪干扰素γ远高于猪干扰素γ天然基因序列在大肠杆菌表达系统的表达量。
本发明还提供了重组猪干扰素γ在制备治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征、猪流感以及猪蓝耳病疾病的药物中的用途。在猪仔疾病治疗过程中，干扰素-γ可以非特异性的发挥广泛的抗病毒效应，提高机体免疫应答和增强对病毒的防御能力。同时，干扰素-γ也可与其他疫苗联合使用，减轻疫苗的不良反应，增强整体抗病毒、细菌、寄生虫的效力。
附图说明
图1表示重组猪干扰素γ密码子优化前后核苷酸序列比较
其中，偶数行（即“原始序列”对应的行）为猪干扰素γ天然基因核苷酸序列，即密码子优化前的序列；奇数行（即“优化序列”对应的行）为本发明的重组猪干扰素γ的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。
图2-a、图2-b为重组猪干扰素γ密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数。
其中，图2-a表示猪干扰素γ天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.65；图2-b表示优化后的本发明的重组猪干扰素γ密码子在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.82。
图3-a、图3-b为猪干扰素γ密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图。
其中，图3-a表示猪干扰素γ天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：猪干扰素γ天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为10%；图3-b表示优化后的本发明的重组猪干扰素γ密码子在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的重组猪干扰素γ密码子序列的低利用率密码子出现百分比为0。
图4-a、图4-b为重组猪干扰素γ密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量分布区域图。
其中，图4-a表示猪干扰素γ天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：38.47%；图4-b表示优化后的本发明的重组猪干扰素γ密码子在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：45.76%。
图5-a、图5-b为重组猪干扰素γ密码子优化前后mRNA的二级结构预测图。
图5-a猪干扰素γ天然基因mRNA的二级结构预测图，图5-b为密码子优化后的本发明的重组猪干扰素γmRNA的二级结构预测图。
图6为重组猪干扰素γ表达质粒构建过程图。
图7为重组猪干扰素γ基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
其中，泳道1为NdeI和XhoI酶切pET21b载体；泳道2为500bp DNA Ladder；泳道3为两端含有NdeI和XhoI酶切位点的重组猪干扰素γ基因PCR产物。
图8-a、图8-b为重组猪干扰素γ的SDS-PAGE凝胶电泳图及相应的免疫印迹图。
图8-a为重组猪干扰素γSDS-PAGE凝胶电泳图。
其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为未加入IPTG诱导的重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道3为加入IPTG诱导的重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液。
图8-b为重组猪干扰素γ免疫印迹图。
其中，泳道1（10-230KDa）宽范围的预染的蛋白上样Marker，泳道2为未加入IPTG诱导的重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液：泳道3为加入IPTG诱导的重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液。
图9重组猪干扰素γ高效表达诱导条件优化的SDS-PAGE凝胶电泳图。
其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为0.5mmol/L IPTG诱导1h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道3为0.5mmol/L IPTG诱导2h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道4为0.5mmol/L IPTG诱导3h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道5为0.5mmol/L IPTG诱导4h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道6为1mmol/L IPTG诱导1h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道7为1mmol/L IPTG诱导2h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道8为1mmol/L IPTG诱导3h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道9为1mmol/L IPTG诱导4h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道10为1.5mmol/L IPTG诱导1h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道11为1.5mmol/L IPTG诱导2h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道12为1.5mmol/L IPTG诱导3h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液；泳道13为1.5mmol/L IPTG诱导4h的含重组猪干扰素γ大肠杆菌裂解液。
图10为复性后的重组猪干扰素γ包涵体SDS-PAGE电泳图
其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为用Buffer B第一次清洗后重组猪干扰素γ包涵体沉淀；泳道3为Buffer B第二次清洗后重组猪干扰素γ包涵体沉淀；泳道4为稀释法复性后的重组猪干扰素γ；泳道5为透析法复性后的重组猪干扰素γ
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1重组猪干扰素γ基因优化设计
1.密码子优化
遗传密码子有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上，常用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母和果蝇中对含最佳密码子的基因的表达效率明显高于含低利用率的密码子的基因的表达效率。因此，在异源表达系统中，密码子的偏爱性很大程度上影响了重组蛋白的表达。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用稀有的密码子进行基因合成，这种基因的重新设计叫密码子优化。优化过程充分考虑到蛋白表达不同阶段可能遇到的多种复杂因素，如：密码子适应性、mRNA结构以及转录和翻译过程中不同的顺式元件。因此，本发明对猪干扰素γ的基因设计不仅包括密码子优化，还包括mRNA结构修正、翻译起始位点的优化等。
2.密码子偏爱性优化
密码子偏爱性在原核基因表达中已经被证实是一个很重要的影响因素，它引起了同一密码子在不同生物体之间，蛋白的表达水平之间以及同一操纵子的不同部位间利用率的改变。引起这种偏爱性差异的主要原因是不同细胞内可用的tRNAs量的差异。因此优化翻译系统最佳的方法就是保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡。在大肠杆菌中表达哺乳动物基因是不可预测和具有挑战的，如在大肠杆菌中，AGG和AGA所对应的tRNA分子就很少，这种差异很明显会影响基因的表达。
3.将低利用率的密码子替换成宿主常用密码子
通常基因中包含的密码子在特定宿主中的利用率越低，该种蛋白的表达量也就越少，甚至当这种密码子存在与蛋白簇间或者N末端的时候表达量会更少。在不改变氨基酸序列的前提下将低利用率的密码子替换为宿主常用密码子能提高功能蛋白的表达水平。
任何来源的密码子如果在宿主生物体内的利用率低于5%到10%时,就会出现表达抑制，当这些低利用率密码子临近或相连时，对蛋白表达的影响更大。成簇的低利用率的密码子抑制了核糖体的运动，这是基因不能以合适水平表达的一个明显机制。核糖体翻译由九个密码子组成的信使（含几个低利用率密码子或全部为低利用率密码子）时的运动速度要比翻译不含低利用率密码子的同样长的信使的速度慢。即使低利用率密码子簇位于3’端，信使最后也会被核糖体“拥挤”而损害，核糖体又回到5’端。3’端低利用率密码子簇的抑制效应可以和全部信使都由低利用率密码子组成的抑制效应一样大。如果低利用率密码子簇位于5’端，其效应是起始核糖体数目的全面减少，导致蛋白合成中信使的低效率。去除低利用率的密码子或者容易被误读为终止信号的密码子能够防止低表达或者不表达。
4.表达载体和转录启动子
虽然密码子偏爱在基因表达中起着重要的作用，但表达载体和转录启动子的选择同样重要，N端核苷酸序列的蛋白表达对于低利用率密码子和接近起始位点的密码子AUG非常敏感。翻译与mRNA的稳定性间也存在着相互的影响，虽然降低翻译效率会使mRNA由于缺少了核糖体的保护而更容易被endo-RNAses分解，但目前还没有它们之间影响的完整解释。
其他因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列。稳定mRNA二级结构和接近5'端的分子也对基因表达有重要的影响。利用翻译时目的基因上游的开放式阅读框能够成功提高难度基因的表达效率。
发明人根据GenBank已公开的猪干扰素γ（Sus scrofa interferon,gamma）的cDNA序列(GenBank登录号：NM_213948.1)，对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组猪干扰素γ基因，如SEQ ID No：1所示。
下面是对重组猪干扰素γ进行密码子优化，优化前后各参数对比如下：
1.密码子适应指数(Codon Adaptation Index,CAI)
由图2-a可知，密码子没有优化前，猪干扰素γ天然基因在大肠杆菌中密码子适应指数（CAI）为0.65。由图2-b可知，通过密码子优化后，使得本发明的重组猪干扰素γ基因在大肠杆菌中CAI指数为0.82。通常CAI=1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高重组猪干扰素γ基因在大肠杆菌中的表达水平。
2.最优密码子使用频率（Frequency of Optimal Codons，FOP）
由图3-a可知，基于大肠杆菌表达载体，密码子没有优化前，猪干扰素γ天然基因序列的低利用率密码子出现百分比为10%。这条未进行优化的基因含有串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，本发明的重组猪干扰素γ基因在大肠杆菌系统中出现低利用率密码子的频率为0。
3.GC碱基含量（GC curve）
GC含量理想分布区域为30%-70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的猪干扰素γ基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示猪干扰素γ天然基因中在优化前GC碱基平均含量为38.47%，由图4-b中显示出优化后的序列消除了GC含量在30%-70%区域外所有碱基，最终得到优化后重组猪干扰素γ的GC碱基平均含量为45.76%。
3.优化前后顺式作用元件情况如下：
| 顺式作用元件 | 优化后 | 优化前 |
| E.coli_RBS(AGGAGG) | 0 | 0 |
| PolyT(TTTTTT) | 0 | 1 |
| PolyA(AAAAAAA) | 0 | 1 |
| Ch位点(GCTGGTGG) | 0 | 0 |
| T7Cis(ATCTGTT) | 0 | 3 |
4.优化前后回文以及重复序列情况如下：
5mRNA的二级结构预测图
在DNA转录成mRNA后，由于mRNA是单链线性分子，通过自身回折使得互补的碱基对相遇，通过氢键结合而成的发卡结构(Hairpin)。5’发卡结构可以在翻译起始阶段起调控作用。但是如果发卡结构很长，解链所需的能量很高，就有可能影响到翻译。所以需要表达的序列应该尽量避免长而且能量高的发卡结构。通过密码子优化后，由图5-a、图5-b猪干扰素γ密码子优化前后mRNA的二级结构预测图可知，优化后的5’发卡结构和解链所需的能量更适于目的蛋白的表达。
实施例2：重组猪干扰素γ基因的表达质粒构建
将优化后的重组猪干扰素γ全基因（如SEQ ID No：1所示）合成的片段，构建到pUC57质粒（由南京金斯瑞科技有限公司提供）中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-prIFNγ质粒。以pUC57-prIFNγ质粒为模板，上、下游引物分别引入NdeI和XhoI酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
上游引物：
P1:GGGAATTCCATATGCAGGCCCCGTTCTTCAAGG
下游引物：
P2:CCGCTCGAGTCATTTCGATGCGCGTTGGCC
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase（购自Theromo-Fisher scientific），2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5s、55℃20s、72℃30s，25个循环后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小（504bp）一致。（如图7所示）
将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）纯化。纯化后，用NdeI和XhoI（购自New England Biolabs公司）双酶切，用T4连接酶（购自New EnglandBiolabs公司）连接到pET21b质粒（购自Merck公司）中，转化到DH5α感受态细胞（购自北京天根生化科技有限公司）中，在含有100μg/mL的氨苄青霉素（购自Amresco公司）的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到重组猪干扰素γ一种形式的表达质粒，记为pET21b-prIFNγ。
实施例3重组猪干扰素γ在大肠杆菌中的表达和鉴定
具体步骤如下：
1．将实施例2中测序比对正确的pET21b-prIFNγ质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态菌株（购自北京天根生化科技有限公司）中，37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。
2．第二天挑1-4个含有pET21b-prIFNγ质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃培养过夜。
3．取50μL过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃振荡培养。
4．接种后每隔1h测菌液OD600值，待OD600=1.0时，用1mmol/L的IPTG（购自Amresco公司）进行诱导表达。同时以未加入IPTG的大肠杆菌培养液做阴性对照。
5．4h后收集菌液，高速离心（转速：12000rpm/min）3min，用预冷的PBS清洗沉淀，加入5XSDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min，室温高速离心（转速：12000rpm/min）1min，取上清。未加入IPTG的大肠杆菌培养液也按此步骤处理。
6．各取10μL步骤5所得的未加入IPTG和加入IPTG诱导的培养物样品，12%SDS-PAGE凝胶电泳分析。
7．8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。
8．考马斯亮蓝染色和免疫印迹，观察表达产物条带，见图8-a和图8-b。
实施例4重组猪干扰素γ高效表达诱导条件优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、培养温度、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制，生长过度或过速都会加重大肠杆菌形成重组猪干扰素γ包涵体。运用三因素四水平，建立IPTG浓度和诱导时间正交表，通过SDS-PAGE凝胶电泳分析诱导重组猪干扰素γ表达量。
具体步骤如下：
1．将实施例2中测序比对正确的pET21b-prIFNγ质粒转化到BL21（DE3）感受态菌株（购自北京天根生化科技有限公司）中，37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。
2．第二天挑对照菌和1-4个含有pET21b-prIFNγ质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃培养过夜。
3．取50μL过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃振荡培养。
4．接种后测菌液OD600值，待OD600=1.0时，按照表1分别加入0.5，1.0，1.5m mol/L IPTG浓度和时间进行诱导表达。同时以未加入IPTG的大肠杆菌培养液做阴性对照。
表1表达IPTG浓度和时间条件
5．1，2，3，4h后依次收集重组猪干扰素γ菌液，高速离心（转速：12000rpm/min）3min，用预冷的PBS清洗沉淀，得含有诱导重组猪干扰素γ的大肠杆菌沉淀，加入5XSDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min，室温高速离心（转速：12000rpm/min）1min，取上清。未加入IPTG的大肠杆菌培养液也按此步骤处理。
6．各取10μL步骤5处理的未加入IPTG和加入不同浓度IPTG，不同诱导时间条件下表达的重组猪干扰素γ样品，10%SDS-PAGE凝胶电泳分析。
7．8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。
8．考马斯亮蓝染色，观察重组猪干扰素γ表达产物条带。见图9。
凝胶成像系统薄层扫描分析表达重组猪干扰素γ含量鉴定重组猪干扰素γ的表达。最终确定适合本实施的诱导条件为1m mol/L IPTG，诱导时间为4h。
实施例5重组猪干扰素γ包涵体纯化及复性
1．将实施例4步骤5中经预冷的PBS清洗沉淀得到的含有诱导重组猪干扰素γ的大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm/min，离心15min；重复一次。
2．吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。
3．每克（菌体湿重）菌体加入5μL100mmol/L PMSF，5μL100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min。
4．用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm/min，离心15min。
5．沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃，12000rpm/min，离心15min，沉淀包涵体，重复一次。
6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。
7.充分混匀后室温12000rpm/min，离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ变性溶液。
8.分别采用稀释复性法及透析复性法对步骤7中的重组猪干扰素γ变性溶液进行复性。
A．稀释复性：取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪干扰素γ变性溶液，用Quick StartBradford1x Dye Reagent（美国bio-rad公司）测其浓度，然后用复性缓冲液BufferD将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL，4℃复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液过0.45μm滤膜（Merck Millipore公司），即得到低浓度的重组猪干扰素γ复性溶液。用截留分子量10KDa的超滤管（MerckMillipore公司）脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）低温真空干燥，即获得重组猪干扰素-γ粉末。
B．透析复性：取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪干扰素γ变性溶液，用Quick StartBradford1x Dye Reagent（美国bio-rad公司）测其浓度，然后用变性缓冲液Buffer C将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL，注入截留分子量10KDa的透析卡中（Thermo Scientific Pierce公司），4℃透析复性，每隔6h换一次复性缓冲液Buffer D。复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液过0.45μm滤膜（Merck Millipore公司），即得到低浓度的重组猪干扰素γ复性溶液。用截留分子量10KDa的超滤管（Merck Millipore公司）脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）低温真空干燥，即获得重组猪干扰素γ粉末。
各缓冲液按下表配制：
表2各缓冲液配制
9.分别以步骤5中洗涤缓冲液Buffer B两次洗涤产物和两种复性方法所得的产物进行SDS-PAGE电泳分析。（如图10所示）在目的范围可见明显条带。
实施例6重组猪干扰素γ生物学活性测定
猪水泡性口炎病毒（VSV，其TCID50为5×107/100μL，广东省农科院兽医研究所提供）可感染猪肾细胞（PK-15，广东省农科院兽医研究所提供），本发明利用猪干扰素γ的抗病毒机制检测在猪肾细胞在猪干扰素γ存在条件下对猪水泡性口炎病毒的防御作用，通过检测PK-15细胞的病变情况得到猪干扰素γ对PK-15细胞的保护效应曲线，从而测定重组猪干扰素γ生物学活性。
1.生物活性初筛实验
阳性对照品溶液制备：取猪干扰素阳性对照品(猪基因工程重组细胞因子:IFN-LLS-2，购自香港曼普动物营养品有限公司。测定其效价为5×104U/mL)，按说明书复溶后，用含有6%胎牛血清的MEM细胞培养液(Gibico产品)按10倍一级逐级稀释。
重组猪干扰素γ样品溶液制备：称取复性后重组猪干扰素γ样品2.4mg，用500μL细胞培养液溶解后，用细胞培养液做10倍一级逐级稀释，分别得4.8mg/mL、4.8×10-1mg/mL、4.8×10-2mg/mL、4.8×10-3mg/mL、4.8×10-4mg/mL、4.8×10-5mg/mL重组干扰素γ溶液。
在96孔板上每孔加入不同浓度的重组猪干扰素γ，再加入50μL新鲜传代的PK-15细胞悬液（细胞浓度约为1.8×106-2.2×106个/mL），总体系100μL，37℃、5％CO2条件下孵育约24小时，PK-15细胞贴壁生长至单层。弃去细胞培养液上清，每孔加入100μL含100个TCID50的VSV病毒的2%胎牛血清的MEM培养液。同时设立阴性对照病毒组（只加PK-15细胞和相同剂量的病毒，不加重组猪干扰素γ）和空白细胞对照组（只加PK-15细胞和细胞培养液，不加重组猪干扰素γ和病毒）。37℃、5％CO2条件下培养24h，待病毒对照孔的细胞病变90％－100％时观察结果。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位（记为“U”）。
实验结果显示，阴性对照病毒组中的细胞均发生明显病变，空白细胞对照组中细胞生长正常。与阳性对照相比，当重组猪干扰素γ的浓度在4.8×10-3mg/mL-4.8×10-5mg/mL时，开始产生消除VSV病毒对PK-15细胞正常生长的影响的现象。
2．生物活性复筛实验
根据初筛结果，对阳性对照及重组猪干扰素γ实验浓度调整：
阳性对照品溶液制备：取猪干扰素阳性对照品，按说明书复溶后，用细胞培养液稀释成每1ml约含1000IU，按4倍一级逐级稀释。
重组猪干扰素γ样品溶液制备：根据实施例5复性样品活性初步检测结果，分别将透析复性法和稀释复性法所得的重组猪干扰素γ用细胞培养液稀释至4.8×10-3mg/mL，然后按4倍一级逐级稀释，得1.2×10-3mg/mL、3×10-4mg/mL、7.5×10-5mg/mL、1.88×10-5mg/mL、4.7×10-6mg/mL、1.12×10-6mg/mL、2.8×10-7mg/mL、7×10-8mg/mL重组猪干扰素γ溶液。
在96孔板上每孔加入不同浓度的重组猪干扰素γ，再加入50μL新鲜传代的PK-15细胞悬液（细胞浓度约为1.8×106-2.2×106个/mL），总体系100μL，37℃、5％CO2条件下孵育约24小时，PK-15细胞贴壁生长至单层。弃去细胞培养液上清，每孔加入100μL含100个TCID50的VSV病毒的2%胎牛血清的MEM培养液。同时设立阴性对照病毒组（只加PK-15细胞和相同剂量的病毒，不加重组猪干扰素γ）和空白细胞对照组（只加PK-15细胞和细胞培养液，不加重组猪干扰素γ和病毒）。37℃、5％CO2条件下培养24h，待病毒对照孔的细胞病变90％－100％时观察结果。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位（记为“U”）。
实验结果表明，阴性对照病毒组中的细胞均发生明显病变，空白细胞对照组中细胞生长正常。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位（记为“U”），通过显微镜观察阳性对照存在条件下PK-15细胞生长未受VSV病毒影响的细胞数，确定阳性对照干扰素的效价为3.2×104U/mL。同理，显微镜观察在不同复性法所得的重组猪干扰素γ存在条件下PK-15细胞生长未受VSV病毒影响的细胞数，计算得重组猪干扰素γ透析复性样品的效价为4.1×104U/mL、重组猪干扰素γ稀释复性样品的效价为2.0×104U/mL。由此可见，透析复性法和稀释复性法均可作为重组猪干扰素γ包涵体的复性工艺，但是采用透析复性法所得的重组猪干扰素γ的活性较高。除此之外，与阳性对照相比，本发明重组猪干扰素γ具有明显的抗病毒活性，且制备工艺简单，在猪仔疾病预防和治疗应用方面展现出广阔的应用前景，使工业化生产基因工程重组猪干扰素γ的可能得以实现。
Claims (8)
1.一种重组猪干扰素γ的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种载体，所述载体具有如权利要求1的基因。
3.如权利要求2所述的载体，所述载体为pET21b。
4.一种大肠杆菌，所述大肠杆菌具有如权利要求3的载体。
5.如权利要求4所述的大肠杆菌，所述大肠杆菌为BL21（DE3）菌株。
6.一种重组猪干扰素γ的表达方法，包括如下步骤：
（1）挑取一个含有权利要求4或5中所述的大肠杆菌菌落，接入含抗生素的LB培养液，培养过夜；
（2）取过夜培养物转接入于含抗生素的新鲜LB培养液中，震荡培养至对数中期A600=1.0；
（3）在培养物中加入浓度为0.5-1.5m mol/L的IPTG，37℃，诱导表达1-4小时后，离心处理收集含有重组猪干扰素γ的大肠杆菌菌体沉淀。
7.一种重组猪干扰素γ的纯化和复性方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）将权利要求6中所述的含有重组猪干扰素γ的大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃，以12000rpm/min离心15min，重复一次；
（2）吸去上清，每克菌体按湿重计加入3-10mL裂解缓冲液BufferA，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起；
（3）每克菌体按湿重计加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，冰上搅动20min；
（4）破碎菌体细胞，4℃，12000rpm/min离心，弃上清；
（5）包涵体沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃，12000rpm/min离心15min，弃上清，包涵体沉淀重复本步骤一次；
（6）包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温搅拌30-60min；
（7）充分混匀后室温条件下12000rpm/min离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ变性溶液；
（8）用变性缓冲液Buffer C将重组猪干扰素γ变性溶液的浓度稀释至0.2mg/mL，4℃透析复性24小时，期间每6小时更换一次缓冲液Buffer D，重组猪干扰素γ复性溶液经滤膜过滤后，即得到重组猪干扰素γ复性溶液。
8.如权利要求7所述的纯化和复性方法，其特征在于，所述重组猪干扰素γ复性溶液可进一步用截留分子量10KDa的超滤浓缩、脱盐至最小体积，低温真空干燥，即获得重组猪干扰素γ粉末。
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