CN104404051A - 鸡γ干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸡γ干扰素表达基因改造方法以及利用该方法改造得到的基因，上述方法及基因专门针对以大肠杆菌为宿主的表达系统。本发明的基因改造方法是在鸡γ干扰素天然表达基因的基础上将其中大肠杆菌的稀有密码子替换为非稀有密码子，从而提升了大肠杆菌对鸡γ干扰素及其衍生蛋白的表达效率。本发明所提供的基因，其表达的蛋白作为鸡γ干扰素蛋白衍生物具有鸡γ干扰素的活性且活性较天然鸡γ干扰素高，同时它以可溶蛋白的形式高效表达，表达后最高可占表达蛋白的50％以上，无需包涵体变复性等操作，通过一步纯化后纯度可达到95％；生产周期短，成本低；还具有很好的免疫调节活性和抗病毒活性，为该鸡γ干扰素的规模化生产奠定了良好的基础。

Description

鸡γ干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种鸡γ干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因。

背景技术

干扰素是一种低分子量的可溶性蛋白，目前一般将干扰素分为I、II、III型，其结构、受体和来源有所区别，活性侧重点也不同。干扰素功能主要有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤。而II型干扰素(IFN-γ)其免疫调节能力是I型干扰素的数百倍，又因其是机体自身携带不会出现排异反应，所以是理论上十分理想的免疫佐剂。

ChIFN-γ可增加单核细胞和巨噬细胞表面IgG Fc受体表达，从而参与免疫复合物的清除、吞噬作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒(Antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，ADCC)作用。ChIFN-γ能使抗原呈递细胞表达MHC-II类抗原的数量显著增加、增强抗原呈递细胞与T细胞的相互作用，增加辅助T细胞(T-helper cell，Th)的数量和增强迟发型超敏反应(Delayed type hypersensity，DTH)；能增强细胞毒T细胞和自然杀伤(Natural killer，NK)细胞杀伤靶细胞的能力；能诱导细胞表达IL-2受体，从而促进T细胞增殖，进一步扩大免疫应答。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡γ干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因，以解决现有技术中利用大肠杆菌表达鸡鸡γ干扰素产率较低的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是通过对鸡γ干扰素表达基因的改进从而提升其所表达的鸡γ干扰素蛋白向胞外分泌的作用。

本发明解决的又一技术问题是通过对鸡γ干扰素表达基因的改进从而便于其所表达的鸡γ干扰素蛋白后期纯化。

本发明解决的再一技术问题是通过提供利用上述改造基因表达鸡γ干扰素的方法，以提升表达效率。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种鸡γ干扰素表达基因改造方法，该方法在鸡γ干扰素天然表达基因的基础上以大肠杆菌非稀有密码子替换其中的大肠杆菌稀有密码子。

优选的，所述鸡γ干扰素表达基因所表达的蛋白质N端对应的核苷酸上连接有信号肽或利用表达载体上的信号肽。

优选的，所述鸡γ干扰素表达基因末端具有标签蛋白；在此基础上进一步优选的：所述标签蛋白可以是His标签、Arg标签、FLAG标签或GST标签的其中一种。

本发明还提供了一种利用上述方法改造得到的鸡γ干扰素表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

同时，本发明还提供了一种利用该基因表达鸡γ干扰素方法，包括以下步骤：将该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为0.1～1mmol/L，诱导温度为16～37℃，诱导表达时间为3～16小时。

优选的，所述表达载体是pBV220、pET系列载体或pQE系列载体的任一种；在此基础上更优的，所述表达载体是pET-28a(+)。

优选的，所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109。

本发明提供的方法及基因专门针对原核表达系统，尤其是以大肠杆菌为宿主的表达系统，因此本发明的基因改造方法是在鸡γ干扰素天然表达基因的基础上将其中大肠杆菌的稀有密码子替换为非稀有密码子，从而提升了大肠杆菌对鸡γ干扰素及其衍生蛋白的表达效率。在此基础上，本发明通过对鸡γ干扰素表达基因密码子的取代、添加或缺失实现了改造后基因所表达的蛋白具有鸡γ干扰素的生物活性。此外，本发明通过在鸡γ干扰素表达基因上增加信号肽基因从而使得所表达蛋白N端连接有信号肽，进而促进蛋白分泌到细胞周质或培养基中。此外，本发明通过在鸡γ干扰素表达基因上增设标签蛋白基因从而使得所表达的蛋白N端或C端连接有标签蛋白，进而便于后期分离纯化。

本发明提供的序列如SEQ ID NO2所示的基因与鸡γ干扰素天然表达基因的核苷酸数量均为438个，所表达的蛋白其氨基酸数量相同，但二者序列存在一定程度的差异。本发明SEQ ID NO2所示基因表达的蛋白作为鸡γ干扰素蛋白衍生物具有鸡γ干扰素的活性且活性较天然鸡γ干扰素高，同时它以可溶蛋白的形式高效表达，表达后最高可占表达蛋白的50％以上，无需包涵体变复性等操作，通过一步纯化后纯度可达到95％；生产周期短，成本低；还具有很好的免疫调节活性和抗病毒活性，为该鸡γ干扰素的规模化生产奠定了良好的基础。

附图说明

图1是鸡γ干扰素天然表达基因(ChIFN-γ-N)与本发明SEQ ID NO2序列(ChIFN-γ-O)对比图；

图2是天然鸡γ干扰素氨基酸序列与本发明SEQ ID NO3序列对比图；

图3是琼脂糖凝胶电泳检测ChIFN-γ-O基因的PCR扩增结果，其中M为Marker，L1为PCR产物电泳结果，L2为阴性对照；

图4：SDS-PAGE检测诱导后与未经诱导的ChIFN-γ-O蛋白在大肠杆菌中的表达结果，其中M1为非预染蛋白Marker，M2为预染蛋白Marker；L1为未诱导的对照组，L2为诱导后菌体的全诱导产物，L3、L4依次为诱导后菌体破碎沉淀和上清；

图5：SDS-PAGE检测ChIFN-γ-O蛋白的阳离子交换层析纯化结果，其中M为非预染蛋白Marker，L1为纯化前的样品，L2为上样流穿液，L3为Tris-HCl洗涤，L4为0.2 M NaCl洗涤，L5为0.5M NaCl洗脱产物(即ChIFN-γ-O蛋白)，L6为0.2 M NaCl洗涤；

图6：禽流感疫苗和(或)ChIFN-γ-O蛋白免疫后，HI抗体效价检测结果；

图7：新城疫疫苗和(或)ChIFN-γ-O蛋白免疫后，HI抗体效价检测结果；

图8：法氏囊灭活疫苗和(或)ChIFN-γ-O蛋白免疫后，HI抗体效价检测结果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

本实施例描述了本发明提供的天然的鸡γ干扰素(ChIFN-γ-N)基因与优化的鸡γ干扰素(ChIFN-γ-O)基因的获得方法。

根据GeneBank中FJ788637的mRNA序列，在去除信号肽序列后，即为本发明提供的天然的鸡γ干扰素(ChIFN-γ-N)基因的核苷酸序列(见SEQ ID NO1)。

通过大肠杆菌(E.coli)密码子分析软件的分析，并根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对天然的鸡γ干扰素(ChIFN-γ-N)基因进行了替换稀有密码子、调节GC含量等优化；天然的γ干扰素在C端含有两个半胱氨酸，本发明研究发现，这两个半胱氨酸对干扰素的生物活性并无影响。所以优化基因，使其突变成性质类似的丝氨酸。通过以上优化，即获得了优化后的鸡γ干扰素(ChIFN-γ-O)基因(见SEQ ID NO1)，使其能够在大肠杆菌中高效表达。

实施例2

本实施例描述了含ChIFN-γ-O基因的重组质粒与工程菌的构建。

一、ChIFN-γ-O基因的扩增

根据上述ChIFN-γ-O基因序列，利用Primer Premire软件设计引物，同时分别在引物的5’端引入Nco I酶切位点，3’端引入Hind III酶切位点：

上游引物(F1)：5’-CCATGGGTCATACCGCAAGCAGCCTG-3’(划线部分为Nco I酶切位点)；

下游引物(R1)：5’-AAGCTTTTAGCTATTGCTACGACGC-3’(划线部分为Hind III酶切位点)。

以合成的ChIFN-γ-O基因序列为模板，以F1和R1为引物进行PCR扩增，反应体系含模板1μg，上下游引物各1μM，总反应体系是50μL；反应条件为：94℃、5min；94℃、30sec，54℃、30sec，72℃、45sec，30个循环；72℃，10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图3所示。其中，M为Marker，L1为PCR产物的电泳结果，L2号为阴性对照，结果表明在450bp左右有清晰条带。

二、重组质粒及工程菌的构建

1.使用DNA回收试剂盒回收PCR产物。

2.用限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切已回收的PCR扩增产物，得到酶切产物；

3.用限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切表达载体pET-28a(+)，利用DNA回收试剂盒回收载体骨架；

4.将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，即得到连接产物；

5.将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定：1)菌落PCR使用引物为F1和R1，结果在450bp左右有清晰单一条带的菌落为阳性菌落；2)酶切鉴定所用的酶为限制性内切酶Nco I和Hind III，同时在450bp和5300bp左右有清晰单一条带的菌落为阳性菌落；3)将以上检定结果都为阳性的重组质粒交由华大基因进行DNA测序。测序正确的即为目的重组质粒，命名为ChIFN-γ-pET-28a。

6.将重组质粒ChIFN-γ-pET-28a转化大肠杆菌BL21(DE3)，后筛选单菌落，并进行酶切验证。结果为阳性的菌落，即为目的重组工程菌，命名为的宿主菌为BL21(DE3)-ChIFN-γ-pET-28a(+)。

实施例3

本实施例描述了重组工程菌BL21(DE3)-ChIFN-γ-pET-28a(+)的诱导表达，及其表达的重组鸡γ干扰素(ChIFN-γ-O)的纯化。

一、重组工程菌BL21(DE3)-ChIFN-γ-pET-28a(+)的诱导表达

1.将重组工程菌BL21(DE3)-ChIFN-γ-pET-28a(+)接种于100mL含氨苄抗性(Kan⁺)的液体LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床上震荡培养，至OD₆₀₀值为0.8时，添加诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，终浓度0.5mM)180rpm继续诱导培养，诱导时间为5小时；同时设对照组，除不加诱导物IPTG外，其他操作相同。

2.分别取诱导和未诱导的发酵培养液各取5mL，8000-10000rpm离心20min收集菌体。然后加入500μL Tris-HCl(PH 7.9)重悬菌体，超声破碎后，14000g离心10min，分别收集上清与沉淀(沉淀依然使用500μL Tris-HCl重悬)。

3.取以上4种样品各60μL，分别加入20μL 4×蛋白上样缓冲液(含DTT)，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样10μL进行SDS-PAGE电泳检测，电泳检测结果如图4所示，诱导后(L2-L4)在16kD左右处出现一条蛋白条带，与预期大小相符；ChIFN-γ-O蛋白的表达占全部菌体蛋白的50％左右，可溶性表达的ChIFN-γ-O蛋白占全部可溶蛋白的47％左右。

二、重组鸡γ干扰素(ChIFN-γ-O)的纯化

1.收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入1-5 mL Tris-HCl(PH 7.9)重悬，超声裂解菌体。

2.14000g、4℃离心10分钟，收集离心上清液。

3.使用蛋白监测仪监测，以50mM Tris-HCl(pH＝8.0)冲洗层析柱至平衡后，即可开始上样。用50mM Tris-HCl(pH＝8.0)将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为2mL/min。

4.使用50mM Tris-HCl(pH＝8.0)冲洗柱子，洗去杂蛋白，流速为4mL/min。

5.使用0.2M NaCl(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)洗涤杂蛋白，流速为4mL/min。

6.使用0.5M NaCl(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)洗脱目的蛋白，流速为4mL/min。收集洗脱峰。

7.使用1M NaCl(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)彻底洗净柱上蛋白。

8.纯化过程中每步需各取60μL的样品，分别加入20μL 4×蛋白上样缓冲液(含DTT)，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样10μL进行SDS-PAGE电泳检测，电泳检测结果如图5所示。结果显示，洗脱收集的ChIFN-γ-O蛋白，纯度能够达到95％以上(图5，L5)。

实施例4

本实施例描述了重组鸡γ干扰素(ChIFN-γ-O)蛋白的体内和体外测活，显示了其对鸡体的免疫功能调节，从而增强了多种禽类疫苗的免疫效果；同时也显示了一定的抗病毒活性。这些禽类疫苗包括禽流感病毒，新城疫病毒，法氏囊病毒。按方差分析法对数据进行统计学处理，显著水平为P<0.05。

一、重组蛋白的体外活性检测

根据《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》中猪白细胞干扰素的效价检验方法(细胞病变抑制法)进行生物学特性的体外活性检测，通过检测发现表达的目的蛋白具有生物活性。

二、重组蛋白的体内活性检测

1.与禽流感二价苗联合免疫

禽流感H5、H9二价油苗与重组干扰素联合免疫7日龄的SPF鸡。将SPF鸡分为4组，每组30只，具体免疫方法见表1，免疫方式为右胸皮下注射。

每组分别于免疫后第0、7、14、28、35、42日进行翅静脉采血，分离血清，检测血凝抑制效价，结果表明干扰素组可以较早产生抗体，且抗体水平明显高于疫苗组，维持时间也较长，具体结果见图6。

免疫后28天(35日龄)，通过点眼途径攻毒，每只0.5ml毒液，观察并记录鸡群的精神状态、饮食情况及死亡情况，并对病死鸡进行剖检并记录病理变化，于攻毒第3日、5日和7日，采集喉头和泄殖腔拭子样本，进行病毒分离。

表1禽流感免疫试验分组及免疫情况(AIV)

在感染H5型AIV后，空白组在第2日开始陆续发病，表现为精神沉郁，食欲废绝，腹泻和下痢，头部和脸部水肿，鸡冠和足部皮下出血等，在攻毒第6日全部死亡，且拭子检测全部带毒。疫苗组在感染后有部分鸡出现食欲不振，精神沉郁等，但在感染6日后逐渐好转，全部存活，拭子检测4/10带毒。佐剂组也在感染后发病，在攻毒第6日死亡6只，存活4只，拭子检测全部带毒。联合组虽然在感染初期也有部分鸡出现食欲不振等现象，但于3日后拭子检测未发现带毒，且全部存活，结果如表2所示。

表2禽流感疫苗免疫后攻毒的保护性试验结果

在感染H9型AIV后，空白组鸡出现精神沉郁、眼睛流泪、缩头闭眼，拉绿色粪便、肿头肿脸并伴有呼吸道症状等，待感染5日后全部死亡，拭子检测全部带毒。佐剂组拭子检测全部带毒，存活数为2只。联合组和疫苗组均全部存活，但是疫苗组拭子检测5只带毒，而联合组拭子检测均没有带毒，说明联合疫苗的免疫效力最强(表2)。进一步表明了ChIFN-γ-O可以提高禽流感H5、H9二价油苗的免疫效力，从而为鸡群提供更好的保护。

2.与新城疫疫苗联合免疫

新城疫油苗与重组干扰素联合免疫7日龄的SPF鸡。具体分组及其免疫方法见表3，免疫方式为颈部皮下注射。

表3新城疫免疫试验分组及免疫情况(ND)

每组分别于免疫后第0、7、14、28、35、42天进行翅静脉采血，分离血清，检测血凝抑制效价。结果表明加入ChIFN-γ-O可以刺激机体较早的产生针对NDV的抗体，降低疫苗免疫剂量也能与疫苗组产生接近的抗体水平，并且下降缓慢，具体结果见图7。

免疫后28天(35日龄)，通过点眼途径攻毒，每只0.5ml，观察并记录鸡群的精神状态、饮食情况及死亡情况，并对病死鸡进行剖检并记录病理变化，并于攻毒第3日、5日和7日，采集喉头和泄殖腔拭子样本，进行病毒分离。

在感染NDV后，空白组在第3日全部出现新城疫的症状，表现为精神沉郁，部分食欲废绝和下痢，第4日出现扭颈、震颤等神经症状，并且死亡4只，剩余鸡在攻毒第6日全部死亡，且拭子检测全部带毒。疫苗组在感染后有4鸡出现食欲不振，精神沉郁等，但在感染5日后有2只鸡逐渐好转，而另有2只鸡在感染6日后死亡，拭子检测5/10带毒。佐剂组也在感染后发病，在攻毒第6日死亡7只，存活3只，拭子检测全部带毒。低剂量组虽然降低了疫苗的用量，但是由于加入了ChIFN-γ-O，所以其攻毒保护情况与疫苗组接近。联合组在拭子检测没有发现带毒，且全部存活(表4)。

表4新城疫疫苗免疫后攻毒的保护性试验结果

3.与法氏囊疫苗联合免疫

法氏囊油苗与ChIFN-γ-O联合免疫14日龄的SPF鸡。具体分组及其免疫方法见表5，免疫方式为颈部皮下注射。

每组分别于免疫后第0、7、14、28、35、42、49天进行翅静脉采血，分离血清，ELISA检测抗体水平。通过分析可得，联合苗相对其他两种疫苗优势明显，在7天后即可确定为抗体阳性，并且到14天抗体迅速上升，并保持较高水平，至第七周仍然不下降；而低剂量组也比单纯使用疫苗组的效果要好，结果如图8所示。

表5法氏囊灭活苗免疫试验的分组及免疫情况(IBD)

*BID为法氏囊感染剂量

免疫后28天(35日龄)，通过点眼途径攻毒，每只0.5ml，观察并记录鸡群的精神状态、饮食情况及死亡情况，并对病死鸡进行剖检并记录病理变化，并于攻毒第3日、5日和7日，采集泄殖腔拭子样本，进行病毒分离。

在感染IBDV后，空白组于第3日出现临床症状，大部分鸡出现血便或灰绿色、白色粪便，且有3只鸡死亡，拭子检测带毒率为100％。低剂量组和疫苗组有少数鸡出现精神沉郁、活动减少等现象，但没有出现死鸡。联合组饮食和精神均正常，无异常反应，没有带毒现象，结果见表6。

表6法氏囊灭活苗免疫后攻毒的保护性试验结果

实施例5

一种利用鸡γ干扰素表达基因或鸡γ干扰素衍生蛋白表达基因表达鸡γ干扰素或鸡γ干扰素衍生蛋白方法，包括以下步骤：将该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为0.1mmol/L，诱导温度为16℃，诱导表达时间为3小时。

在以上技术方案的基础上，所述表达载体是pET-28a(+)，所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5α。

实施例6

一种利用鸡γ干扰素表达基因或鸡γ干扰素衍生蛋白表达基因表达鸡γ干扰素或鸡γ干扰素衍生蛋白方法，包括以下步骤：将该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为1mmol/L，诱导温度为24℃，诱导表达时间为16小时。

在以上技术方案的基础上，所述表达载体是pBV220，所述大肠杆菌是大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例7

一种利用鸡γ干扰素表达基因或鸡γ干扰素衍生蛋白表达基因表达鸡γ干扰素或鸡γ干扰素衍生蛋白方法，包括以下步骤：将该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为0.5mmol/L，诱导温度为37℃，诱导表达时间为5小时。

在以上技术方案的基础上，所述表达载体是pQE载体，所述大肠杆菌是大肠杆菌JM109。

实施例8

一种利用鸡γ干扰素表达基因或鸡γ干扰素衍生蛋白表达基因表达鸡γ干扰素或鸡γ干扰素衍生蛋白方法，包括以下步骤：将该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为0.3mmol/L，诱导温度为32℃，诱导表达时间为10小时。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种鸡γ干扰素表达基因改造方法，其特征在于：在鸡γ干扰素天然表达基因的基础上以大肠杆菌非稀有密码子替换其中的大肠杆菌稀有密码子。

2.根据权利要求1所述的一种鸡γ干扰素表达基因改造方法，其特征在于：所述鸡γ干扰素表达基因所表达的蛋白质N端对应的核苷酸上连接有信号肽或利用表达载体上的信号肽。

3.根据权利要求1所述的一种鸡γ干扰素表达基因改造方法，其特征在于：所述鸡γ干扰素表达基因末端具有标签蛋白。

4.根据权利要求4所述的一种鸡γ干扰素表达基因改造方法，其特征在于所述标签蛋白为His标签、Arg标签、FLAG标签或GST标签的其中一种。

5.一种利用权利要求1所述方法改造得到的鸡γ干扰素表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

6.一种利用权利要求5所述基因表达鸡γ干扰素方法，其特征在于包括以下步骤：将该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为0.1～1mmol/L，诱导温度为16～37℃，诱导表达时间为3～16小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述表达载体是pBV220、pET系列载体或pQE系列载体的任一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述表达载体是pET-28a(+)。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109。