JP2021520204A - 酸化ストレスに対する遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

抗オキシダント療法のための組成物および方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年4月3日に出願された米国出願第62/652,098号の出願日に対する恩典を主張し、該出願の開示は参照により本明細書に組み入れられる。

背景
疾患の付随的な開始または加速を伴う組織損傷の一般的な原因である酸化ストレスは、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患および線維性肺障害などの慢性肺障害、がん、糖尿病、関節リウマチ、虚血後灌流傷害、心筋梗塞、心臓血管疾患、慢性炎症、卒中および敗血症性ショック、加齢、ならびに、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの他の変性性および神経学的疾患に対する公知のリスク因子であり、加齢プロセスに寄与する（Durackova,2010;Mitscher et al.,1996）。

オキシダントは、産業汚染物質、宇宙放射線および煙草の煙を含む環境上の供給源または好中球および単球からの呼吸バーストなどの正常細胞機能の他に、解毒酵素にも由来する。酸化ストレスは、ヒドロキシルおよび超酸化物を含むフリーラジカルにより媒介され、次いでそれは、一緒に活性酸素種（ROS）と称される、過酸化水素などの反応性種に繋がる。これらのオキシダントは、脂質、タンパク質およびDNAを損傷し、それが上記の多数の病原性アウトカムを媒介し、多数の研究は、抗オキシダント化合物は、アテローム性動脈硬化症、がん、突然変異誘発および炎症に対して保護的であり得ることを実証している（Mitscher et al.,1996;Uttara et al.,2009;Owen et al.,2000;Sala et al.,2002）。

酸化ストレスに対する天然の保護のために、抗オキシダントタンパク質であるカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼは、それぞれ過酸化水素および超酸化物の中和を触媒する（Mates et al.,1999;Birben et al.,2012）。これらの酵素は、健常個体において正常細胞プロセスにより開始される酸化ストレスに対する一連の防御を示すが、規模または生理的局在性に起因する環境上のまたは過剰疾患状態に由来するオキシダントの過度の負荷に対処する能力を有しない。例えば、カタラーゼは四量体細胞内タンパク質であり、したがって、外因性ROSに対する防御の第一線として作用できる血清中にも粘膜表面上にも見出されない（Goyal et al.,2010）。SODは、3つの形態、SOD1、SOD2、およびSOD3を有し、これらは、その細胞位置、それぞれ、細胞質、ミトコンドリアおよびヘパリンに結合した細胞外空間により定義される（Perry et al.,2010）。カタラーゼに類似して、SOD酵素は、血清にも粘膜表面にも存在しない。SOD3は分泌されるが、細胞表面に接続するヘパリン結合ドメインを有するため、臓器の上皮表面を越えて灌流して粘膜表面に達するために細胞表面に未結合な状態では充分なレベルにおいて利用可能ではない（Perry et al.,2010）。

概要
粘膜表面におけるものを含む、病原性細胞外酸化ストレスからの保護を提供する分泌性抗オキシダント酵素の発現を媒介する遺伝子療法アプローチが提供される。共に外因性のまたは不適切なレベルの活性酸素種に対する最前線防御を提供する単量体分泌性機能的カタラーゼおよび改変型細胞外スーパーオキシドジスムターゼをコードするcDNAを用いて構築されたアデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによる長期発現。これに対処するために、カタラーゼおよびSOD3の両方の配列を、分泌および拡散を促進し、特にSODが細胞表面に接続しないままとなることを促進するよう改変した。これらの分泌型のカタラーゼおよびSODの遺伝暗号は、一態様では、アデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれ、それにより、治療される領域中、血清中、ならびに上皮および粘膜表面にわたり、オキシダント種である過酸化水素および超酸化物による環境上および病原性の攻撃に対する障壁として持続性のおよび一貫したレベルのこれらの抗オキシダント酵素が提供される。分泌性単量体カタラーゼを構築する戦略は、四量体形成のために必要とされる分子間接着および分泌シグナル伝達配列の付加を媒介する比較的構造化されていない領域を除去する。SOD3は、SOD3配列中のセグメントとのより大きい四量体を形成するように単量体を噛み合わせるループを置換するように改変され、かつヘパリン結合ドメインは、細胞外マトリックスに接着する能力を除去された。改変型カタラーゼおよびSOD3の両方は、血清に放出されて機能を維持することが示された。一態様では、2つの抗オキシダント酵素は、別々のベクター中で送達されてもよい。一態様では、ベクターは、任意の血清型のAAVベクターであってもよい。一態様では、ベクターは、プラスミドベクターまたは他のウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスもしくはレンチウイルスベクターであってもよい。任意の発現カセットが使用されてもよく、かつ、カタラーゼおよびSOD3のタンパク質配列に対する異なる変更が為されてもよい。

ベクターの投与は、環境由来の酸化ストレス傷害、例えば、核攻撃もしくはガス（テロ）攻撃などにおける放射線もしくは化学物質曝露、シガレット、もしくはE-シガレットもしくはベイピングを含む他のタバコ摂取、もしくはシガー煙曝露の結果としてのもの、または炎症応答からの不適切な内因性ROSからの保護を結果としてもたらしてもよい。一態様では、ベクターは、アテローム性動脈硬化症、がん、糖尿病、関節リウマチ、虚血後灌流傷害、心筋梗塞、心臓血管疾患、慢性炎症、卒中および敗血症性ショック、加齢ならびにアルツハイマー病およびパーキンソン病などの他の変性性および神経学的疾患が挙げられるがそれに限定されるわけではない1つまたは複数の障害を予防、阻害または治療する方法において使用されてもよく、加齢プロセスに寄与してもよい。

一態様では、カタラーゼ活性を有するが四量体を形成しない改変型カタラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含む遺伝子療法ベクターが提供される。一態様では、カタラーゼは、SEQ ID No.1、5〜7または12の1つに対して少なくとも80％、82％、84％、85％、87％、90％、92％、94％、95％、96％、98％、99％またはより高いアミノ酸配列同一性を有する。一態様では、遺伝子療法ベクターは、分泌されるが細胞表面に結合せず、かつ任意で四量体を形成しない、改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸配列をさらに含む。一態様では、スーパーオキシドジスムターゼは、SEQ ID No.2〜4、8または10の1つに対して少なくとも80％、82％、84％、85％、87％、90％、92％、94％、95％、96％、98％、99％またはより高いアミノ酸配列同一性を有する。一態様では、分泌されるが細胞表面に結合しない改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含む遺伝子療法ベクターが提供される。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは改変型スーパーオキシドジスムターゼ-3である。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼはヘパリンに結合しない。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは四量体を形成しない。一態様では、改変型カタラーゼは、スレッディングアームドメイン（threading arm domain）中のN末端に欠失を有し、該欠失は、1〜80もしくはより多くの残基または1〜80の任意の整数、例えば、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70もしくは75残基の欠失であってもよい。一態様では、改変型カタラーゼは、N末端中に欠失、例えば、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25残基の欠失を有する。一態様では、改変型カタラーゼは、N末端中に欠失、例えば、15または20または20〜25残基の欠失を有する。一態様では、改変型カタラーゼは、ラッピングループドメイン（wrapping loop domain）中に欠失を有し、該欠失は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25残基であってもよい。一態様では、改変型カタラーゼは、ラッピングループドメイン中に欠失を有し、該欠失は、15〜20または20〜25残基であってもよい。一態様では、改変型カタラーゼは、ラッピングループドメイン中に欠失を有し、該欠失は、カタラーゼ中の位置379、380、381、382、383、384または385から約位置398、399、400、401、402または403まで、例えば、位置381〜400からのものであってもよい（図2を参照）。一態様では、改変型カタラーゼは、スレッディングアームドメインおよびラッピングループドメイン中に欠失を有する。一態様では、改変型カタラーゼは、分泌配列、例えば、異種分泌配列を有する。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは、ヘパリン結合ドメイン中に欠失を有し、ループ残基中の該欠失は、1〜15もしくは20もしくは25もしくはより多くの残基または1〜15の任意の整数、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23もしくは25残基の欠失であってもよい。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは、ターンまたはループドメインの1つまたは複数の残基の置換、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23、25、またはより多くの残基による1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23、25、またはより多くの残基の置換を有する。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは、ターンまたはループドメインの1つまたは複数の残基の置換、例えば、4、5、6、7、8、9、または10残基による6、7、8、9、10、11、または12残基の置換を有する。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは、ターンまたはループドメイン、例えば、スーパーオキシドジスムターゼ中の位置46、47、48、49、50、51、52、もしくは53から位置56、57、58、59、60、61もしくは62までの残基の、位置66、67、68、69、70、もしくは71から位置72、73、74、75、76、77、78もしくは79まで、または位置70、71、72、73、74、もしくは75から位置77、78、79、80、81、82もしくは83までの残基による置換を有する（図3を参照）。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは、ターンまたはループドメインの1つまたは複数の残基の欠失および挿入、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23、25、またはより多くの残基の欠失を有する。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは、ヘパリン結合ドメインの1つまたは複数の残基の欠失、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23、25、またはより多くの残基の置換を有する。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは、ヘパリン結合ドメインの1つまたは複数の残基の欠失、例えば、10〜30、例えば、18、19、20、21もしくは22残基の欠失、または25、26、27、28、29もしくは30残基の欠失を有する。一態様では、改変型スーパーオキシドジスムターゼは、ヘパリン結合ドメイン、例えば、スーパーオキシドジスムターゼ中の位置209、210、211、212、213、214もしくは215から位置235、236、237、238、239、もしくは240まで、または位置217、218、219、220、221、222、もしくは223から位置235、236、237、238、239、もしくは240までの欠失を有する。

一態様では、遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである。一態様では、AAVベクターは、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10である。一態様では、1つのベクターは、改変型カタラーゼおよび改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含み、該カタラーゼ配列およびスーパーオキシドジスムターゼ配列はプロテアーゼ基質配列により分離されている。一態様では、改変型カタラーゼは、改変型スーパーオキシドジスムターゼに対してN末端側にある。一態様では、改変型カタラーゼは、改変型スーパーオキシドジスムターゼに対してC末端側にある。一態様では、1つのベクターは、改変型カタラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含み、かつ、別のベクターは、改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含む。

ある量のベクターを含む薬学的組成物もまた提供される。一態様では、ベクターはプラスミド上にある。一態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである。一態様では、AAVベクターはシュードタイプ化されている。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2、またはAAV7キャプシドによりシュードタイプ化されている。一態様では、ベクターのAAVゲノムは、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10である。一態様では、ベクターの量は約1×10¹¹〜約1×10¹⁶ゲノムコピーである。一態様では、ベクターの量は、約1×10¹²〜約1×10¹⁵ゲノムコピー、約1×10¹¹〜約1×10¹³ゲノムコピー、または約1×10¹³〜約1×10¹⁵ゲノムコピーである。一態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一態様では、薬学的組成物は、改変型カタラーゼをコードするウイルスベクターと改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする別のウイルスベクターとを含む。

哺乳動物において酸化的損傷を予防、阻害または治療する方法であって、哺乳動物に有効量のベクターまたは薬学的組成物を投与する工程を含む、方法もまた提供される。一態様では、哺乳動物は、アテローム性動脈硬化症、がん、糖尿病、関節リウマチ、虚血後灌流傷害、心筋梗塞、心臓血管疾患、慢性炎症、卒中、敗血症性ショック、またはアルツハイマー病もしくはパーキンソン病などの他の変性性および神経学的疾患を有するかまたは有するリスクがある。一態様では、哺乳動物はヒトである。一態様では、改変型カタラーゼをコードするある量のウイルスベクターと改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードするある量のウイルスベクターとが投与される。一態様では、ウイルスベクターは逐次的に投与される。一態様では、ウイルスベクターは同時に投与される。一態様では、改変型カタラーゼと改変型スーパーオキシドジスムターゼとをコードするウイルスベクターが投与される。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2、またはAAV7キャプシドである。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、またはAAV5である。一態様では、AAVベクターは、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10である。ウイルスベクターの用量は、約1×10¹¹〜約1×10¹⁶ゲノムコピー、約1×10¹²〜約1×10¹⁵ゲノムコピー、約1×10¹¹〜約1×10¹³ゲノムコピー、または約1×10¹³〜約1×10¹⁵ゲノムコピーであってもよい。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2、またはAAV7キャプシドによりシュードタイプ化されている。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、またはAAV5によりシュードタイプ化されている。一態様では、AAVベクターは、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10である。

哺乳動物においてCOPD、呼吸窮迫症候群または線維性間質性肺疾患を予防、阻害または治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に有効量のベクターまたは薬学的組成物を投与する工程を含む、方法がさらに提供される。一態様では、哺乳動物はヒトである。一態様では、改変型カタラーゼをコードするある量のウイルスベクターと改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードするある量のウイルスベクターとが投与される。一態様では、ウイルスベクターは逐次的に投与される。一態様では、ウイルスベクターは同時に投与される。一態様では、改変型カタラーゼと改変型スーパーオキシドジスムターゼとをコードするウイルスベクターが投与される。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2、またはAAV7キャプシドである。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、またはAAV5である。一態様では、AAVベクターは、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10である。ウイルスベクターの用量は、約1×10¹¹〜約1×10¹⁶ゲノムコピー、約1×10¹²〜約1×10¹⁵ゲノムコピー、約1×10¹¹〜約1×10¹³ゲノムコピー、または約1×10¹³〜約1×10¹⁵ゲノムコピーであってもよい。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2、またはAAV7キャプシドによりシュードタイプ化されている。一態様では、AAVベクターは、AAVrh.10、AAV8、またはAAV5によりシュードタイプ化されている。一態様では、AAVベクターは、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10である。

（図１）図1A〜B。肺のオキシダント負荷および抗オキシダント防御。A）肺は、吸入したオキシダント、COPDにおいては、活性化した炎症細胞からの内因性細胞外オキシダントによるストレスにさらされる。B）肺細胞は3つの主要な酵素抗オキシダント防御:SOD（

をH₂O₂へと触媒する）、カタラーゼ（H₂O₂をH₂Oへ）およびグルタチオン（GSH;H₂O₂をH₂Oへ;酸化されたGSHは、複数の細胞内酵素により還元されるGSSGを形成する）を有する。これらの酵素系のいずれも充分な細胞外抗オキシダント防御を提供しない。
（図２Ａ）図2A〜B。機能的な細胞外単量体を作製するためのカタラーゼの改変。A）ヒトカタラーゼ単量体の構造。B）ヒトカタラーゼ単量体アミノ酸配列（SEQ ID NO:1）。N末端およびラッピングループドメインへの改変が為された領域を示す。3つの戦略を使用した:hCatNT^-（N末端から20アミノ酸の欠失）、hCatWL^-（ラッピングループドメインから20アミノ酸の欠失）およびhCat^-NT^-WL^-（2つの欠失の組合せ）。分泌を指令するために5'シグナルペプチドを付加し、タンパク質を検出するために3'ヘマグルチニン（HA）タグを付加した。
（図２Ｂ）図2Aの説明を参照のこと。
（図３Ａ）図3A〜B。機能的な細胞外SOD3単量体を生成するための改変。A）SOD3単量体構造。B）ヒトSOD3アミノ酸配列（SEQ ID NO:8）。改変が為された領域を改変の詳細と共に示す。
（図３Ｂ）図3Aの説明を参照のこと。
（図４）図4。LEX 5（遺伝子療法ベースの、細胞外の、拡散可能な酵素抗オキシダント）ベクターは、4つの候補遺伝子移入ベクター（LEX 5a、LEX 5b、LEX 5cおよびLEX 5d）の1つであった。全ての候補は同一の発現カセットを有し、抗オキシダント酵素コーディング配列においてのみ異なる。全てをAAVrh.10キャプシドにパッケージングして4つの候補ベクターを生成する。
（図５）図5A〜C。改変型カタラーゼ構築物の評価。A）改変型カタラーゼ構築物の分泌。3つの改変型カタラーゼ構築物をトランスフェクトした293T細胞の上清のウエスタン（SDS還元ゲル;抗HAタグ）。レーン1-モック;レーン2-hCatNT^-構築物;レーン3-hCATWL^-;レーン4-hCATNT^-WL^-;およびレーン5-カタラーゼ対照。B）3つの構築物により生成された上清のカタラーゼ活性の分析。3つ全てが分泌されたが、hCatWL^-のみが活性であった。C）hCatND^-構築物が単量体であることを実証するためのビストリスゲル中のhCatWD^-構築物からの上清の分析。
（図６）図6A〜B。改変型SOD3構築物。A）改変型SOD3構築物の分泌。レーン1-モック;レーン2-未改変HAタグ付加SOD3;レーン3-SOD3hd^-をトランスフェクトした293T細胞の上清のウエスタン（抗HAタグ）。SOD3hd^-のみが上清中に存在する。B）SOD3hd^-構築物が単量体であることを実証するためのSephacrylサイジングカラム構築物に流したSOD3hd^-上清からの画分の抗HAウエスタン。おおよそのMWはカラム仕様から算出される。
（図７−１）図7A〜F。インビボでのLEX 5aおよびLEX 5bの機能の評価。AAVrh.10hCatWD^-（LEX 5a）またはAAVrh.10hSOD3hd^-（LEX 5b）を雄Balb/cマウスの静脈内に投与した（10¹¹ゲノムコピーの総用量）。2週後、肝臓および肺をベクターDNAのためにサンプリングし、血清をカタラーゼおよびSOD活性について評価した。A〜C）LEX 5a。A）肝臓のベクターDNA、B）肺のベクターDNA、およびC）血清のカタラーゼ活性。D〜F）LEX 5b。D）肝臓のベクターDNA;E）肺のベクターDNA;およびF）血清のSOD活性。
（図７−２）図7-1の説明を参照のこと。
（図８）図8。カタラーゼの構造。各単量体は4つのドメインを有する。第1のドメインにおいて、アミノ末端残基は、単量体単位を一緒に結合させる噛み合い式アームエクスチェンジ（interlocking arm exchange）用の残基を含む。第2のドメインはヘムドメインである。第3のドメインはラッピングループドメインであり、該ドメインでは、4つの単量体が互いに巻き付いて四量体を形成し、塩架橋および正荷電アミノ酸側鎖と負荷電アミノ酸側鎖との間のイオン相互作用が4つの単量体を一緒に保持する。第4のドメインは、触媒分解のために入ってくるH₂O₂基質の方向付けにおいて役割を果たすカルボキシ末端残基を含む。
（図９）図9。カタラーゼ四量体形成を阻害するための遺伝子改変。単量体形成を防止するために、リーディングフレームを維持しかつNADPH結合および酵素機能が改変されないことを確実にしながらN末端スレッディングアームおよび/またはラッピングループドメイン中のアミノ酸残基を欠失させる。
（図１０）図10。改変型カタラーゼ配列。
（図１１）図11。四量体カタラーゼのインビトロでの特徴付け。分泌シグナルにかかわらず、野生型カタラーゼは細胞中に留まる（ウエスタン分析は分析のために四量体を単量体単位に解体する）。
（図１２）図12。改変型カタラーゼ構築物のインビトロでの特徴付け。
（図１３）図13A〜B。改変型カタラーゼ構築物のインビトロでの特徴付け。A）ウエスタンブロット。B）上清中のカタラーゼ活性。
（図１４）図14。単量体および多量体カタラーゼの分離についてのカタラーゼ構築物の上清の評価。試料をビス-トリスゲル上でブロットし、抗カタラーゼ抗体（ABCAM:ab88067）を用いてプロービングして評価した。予測されるバンドサイズは単量体について60kDa、四量体について240kDa。3つ全ての構築物は単量体構築物のみを分泌した。
（図１５）図15。単量体および多量体カタラーゼ用の構築物によるカタラーゼ活性についての上清のインビトロ評価。単量体構築物はカタラーゼ活性を有するタンパク質を発現する。
（図１６）図16A〜B。改変型ラッピングドメイン（hCatWL^-）を有するヒトカタラーゼをコードするAAVrh.10によるヒトカタラーゼ発現のインビボ評価。A）実験の設計。B）肝臓中のベクターコピー数。
（図１７）図17A〜B。改変型ラッピングループドメイン（hCatWL^-）を有するヒトカタラーゼをコードするアデノ随伴ウイルス血清型rh.10により媒介されるインビボカタラーゼ活性の長期時間経過。A）ベクターの設計。B）実験の設計。
（図１８）図18。改変されたヒトカタラーゼラッピングループドメイン（hCatWL^-）をコードするアデノ随伴ウイルス血清型rh.10により媒介されるインビボカタラーゼ活性の長期時間経過。2週目から12週目までの以下の治療群からの雄C57bl/6Jマウスの血清中のカタラーゼ活性。PBS（n＝4）。AAVrh.10hCATWL^-（4週目までn＝5、1匹のマウスを4週目に屠殺し、次に別のマウスを8週目に屠殺した）。hCatWL^-（ラッピングループドメインからの20AAの欠失およびHAタグ）。
（図１９）図19A〜B。スーパーオキシドジスムターゼ3。A）タンパク質の構造。B）結晶学的構造。
（図２０）図20。細胞外利用可能性を増進するための改変型SOD3。細胞外拡散を増進するために、ヘパリン結合ドメイン中の「ターン」残基が改変される。
（図２１）図21。hSOD3hd^-のインビトロ評価。
（図２２）図22。SOD3hd^-により発現される上清中の単量体型および多量体型のSOD3の分析。サイズ排除カラムからの画分をビス-トリスゲルに流した。抗HA抗体を用いるウエスタンアッセイ。単量体MW 30kDaがレーン2〜5の画分において予期される。
（図２３）図23A〜B。IV投与後の肝臓および肺におけるSOD3hd^- gDNAの定量化。A）肝臓におけるDNA定量化。B）肺におけるDNA定量化。
（図２４）図24。血清中の改変型SOD3活性（2週目）。
（図２５）図25。オキシダント曝露大気道上皮細胞の改変型SOD3およびカタラーゼにより媒介されるインビトロ抗オキシダント保護。データは、キサンチンオキシダーゼおよび煙草の煙抽出物（CSE）に由来するオキシダントからヒト大気道上皮細胞を保護する改変型SOD3およびカタラーゼの抗オキシダント特性を示す。
（図２６）図26A〜B。オキシダント曝露大気道上皮細胞の改変型SOD3およびカタラーゼにより媒介されるインビトロ抗オキシダント保護。LDHアッセイは細胞死を測定し、より低いLDHはオキシダント誘導性細胞死からの保護を指し示す。改変型SOD3は、煙草の煙抽出物およびキサンチンオキシダーゼ由来のオキシダントからの増進した保護を提供した（CSEまたはキサンチンオキシダーゼ曝露からの低減されたLDH活性）。改変型SOD3および改変型カタラーゼの両方は、非改変型SOD3およびカタラーゼと比較してキサンチンオキシダーゼ曝露からのより良好な保護を提供する。
（図２７）図27。2つの構築物の図式。

詳細な説明
以下の記載において、本出願の部分を形成する添付の図面を参照し、該図面において、実施され得る特定の態様が実例として示される。これらの態様は、当業者が本発明を実施することを可能とするために詳細に記載されており、他の態様が利用されてもよいことおよび本発明の範囲から離れることなく論理的な変更が為され得ることが理解されるべきである。実施例の態様の以下の記載は、したがって、限定された意味において解釈されるべきではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義される。

要約書は、読者が技術開示の性質および概要を迅速に確認することを可能とするために37 C.F.R.§1.72（b）にしたがって提供される。要約書は、請求項の範囲または意味を解釈または限定するために使用されないという理解と共に提出される。

定義
「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むまたはポリヌクレオチドと会合する高分子または高分子の会合体であって、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用され得るものを指す。実例的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。「標的ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」と称されることがある送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子療法における関心対象のコーディング配列（例えば、治療的関心対象のタンパク質をコードする遺伝子）、ワクチン開発における関心対象のコーディング配列（例えば、哺乳動物において免疫応答を誘発するために好適なタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを発現するポリヌクレオチド）、および/または選択可能もしくは検出可能なマーカーを含んでもよい。

本明細書において使用される「形質導入」、「トランスフェクション」、「形質転換」または「導入する」は、細胞中でのポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子の発現に繋がる宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入のための方法を指す用語であり、組換えウイルスを使用して宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む。細胞におけるポリヌクレオチドの形質導入、トランスフェクションまたは形質転換は、当技術分野において周知の方法により決定されてもよく、該方法としては、例えば、ELISA、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットによる、タンパク質発現（定常状態レベルを含む）、異種化（heterologousization）アッセイ、例えば、ノーザンブロット、サザンブロットおよびゲルシフト移動度アッセイによるDNAおよびRNAの測定が挙げられるがそれに限定されるわけではない。外因性ポリヌクレオチドの導入のために使用される方法としては、ウイルス感染またはトランスフェクション、リポフェクション、形質転換およびエレクトロポレーションの他に、他の非ウイルス遺伝子送達技術などの周知の技術が挙げられる。導入されるポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定的または一過的に維持されてもよい。

「遺伝子送達」は、遺伝子療法のための細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指し、ターゲティング、結合、取込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含してもよい。

「遺伝子移入」は、ターゲティング、結合、取込み、輸送、局在化、およびレプリコン組込みを包含してもよいが、遺伝子のその後の発現とは別個でありかつ該発現を含意しない、細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。

「遺伝子発現」または「発現」は、遺伝子転写、翻訳、および翻訳後修飾のプロセスを指す。

「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、ポリヌクレオチド成分を含むウイルスまたはウイルス粒子であって、ウイルス種が栄養性である細胞に該ポリヌクレオチド成分を送達できるものである。該用語は、ウイルスの任意の複製能力を必ずしも含意しない。

「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはそのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化またはキャップ付加ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分により割り込まれていてもよい。ヌクレオチド構造への修飾が存在する場合、該修飾は、ポリマーの組立ての前または後に付与されてもよい。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書において使用される場合、二本鎖および一本鎖分子を交換可能に指す。他に指定または必要とされなければ、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の任意の態様は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが既知であるまたは予測される2つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。

「単離された」ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ウイルス、ポリペプチドまたは他の物質は、物質または類似の物質が天然に存在するまたは最初に調製される場合に共に存在し得る他の成分の少なくとも一部を欠いている物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、供給源混合物からそれを濃縮するための精製技術を使用することにより調製されてもよい。単離された核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、それが天然に見出される形態または状況とは異なる形態または状況において存在する。例えば、所与のDNA配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見出され、特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列などのRNA配列は、数多くのタンパク質をコードする多数の他のmRNAとの混合物として細胞中に見出される。単離された核酸分子は、一本鎖または二本鎖の形態において存在してもよい。単離された核酸分子がタンパク質を発現するために利用される場合、分子は最小でセンスまたはコーディング鎖を含有する（すなわち、分子は一本鎖であってもよい）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有してもよい（すなわち、分子は二本鎖であってもよい）。濃縮は、溶液の体積当たりの重量など、絶対基準において測定され得、または、それは、供給源混合物中に存在する第2の、潜在的に干渉性の物質と比べて測定され得る。本発明の態様の増加性の濃縮が想定される。したがって、例えば、2倍の濃縮、10倍の濃縮、100倍の濃縮、または1000倍の濃縮。

「転写調節配列」は、それが機能的に連結された遺伝子またはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域を指す。本発明において使用される転写調節配列は、概しては、少なくとも1つの転写プロモーターを含み、転写の1つまたは複数のエンハンサーおよび/またはターミネーターも含んでもよい。

「機能的に連結された」は、2つまたはより多くの成分の構成であって、そのように記載される成分が同調した方式において機能することを可能とする関係性にあるものを指す。実例として、転写調節配列またはプロモーターは、TRSまたはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合にコーディング配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたTRSは、概しては、コーディング配列とシスで連結しているが、それに必ずしも直接的に隣接しない。

「異種」は、それが比較される実体とは遺伝子型が別個である実体に由来することを意味する。例えば、異なる細胞種に遺伝子操作技術により導入されるポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである（かつ、発現される場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、その天然のコーディング配列から除去されており、かつ異なるコーディング配列に機能的に連結されたプロモーターなどの転写調節エレメントは異種転写調節エレメントである。

「ターミネーター」は、リードスルー転写を減少または予防する傾向があるポリヌクレオチド配列を指す（すなわち、それは、ターミネーターの片側を起源とする転写がターミネーターの他の側まで続くことを減少または予防する）。転写が破壊される程度は、典型的には、ターミネーター配列の塩基配列および/または長さの関数である。特に、多数の分子生物学的システムにおいて周知のように、一般に「転写終結配列」と称される特定のDNA配列は、恐らくは、RNAポリメラーゼ分子の停止および/または転写されているDNAからの脱離を引き起こすことにより、RNAポリメラーゼによるリードスルー転写を破壊する傾向がある特定の配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例としては、ポリアデニル化（「ポリA」）配列、例えば、SV40ポリAが挙げられる。そのような配列特異的ターミネーターに加えてまたはその代わりに、プロモーターとコーディング領域との間の比較的長いDNA配列の挿入もまた、概しては介在配列の長さに比例して、コーディング領域の転写を破壊する傾向がある。この効果は、RNAポリメラーゼ分子が転写されているDNAから脱離するある程度の傾向が常に存在するために生じると推定され、コーディング領域に達する前に通過される配列の長さを増加させることは、概しては、コーディング領域の転写が完了する前または場合によっては開始される前にさえ脱離が起こる可能性を増加させる。ターミネーターは、したがって、1方向のみから（「1方向性」ターミネーター）または両方向から（「2方向性」ターミネーター）の転写を予防してもよく、配列特異的終結配列または配列非特異的ターミネーターまたは両方を含んでもよい。様々なそのようなターミネーター配列は当技術分野において公知であり、本発明の文脈内のそのような配列の実例的な使用は以下において提供される。

「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」および他のそのような用語は、例えば、組換えウイルスまたは組換え融合ポリペプチドを製造するために本発明において有用な、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの高等真核細胞を表す。これらの細胞には、形質導入された元々の細胞の子孫が含まれる。単一細胞の子孫は元々の親細胞に必ずしも完全に同一（形態またはゲノム相補体において）でなくてもよいことが理解される。

「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および/またはライゲーション工程、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドとは別個の構築物を結果としてもたらす他の手順の様々な組合せの生成物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。該用語は、元々のポリヌクレオチド構築物の複製物および元々のウイルス構築物の子孫をそれぞれ含む。

「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複化、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含むポリヌクレオチドの機能的な調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響することがあり、増進性または阻害性であってもよい。当技術分野において公知の制御エレメントとしては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、ある特定の条件下においてRNAポリメラーゼに結合してプロモーターの下流（3'方向）に通常位置するコーディング領域の転写を開始させることができるDNA領域である。プロモーターとしては、AAVプロモーター、例えば、P5、P19、P40およびAAV ITRプロモーターの他に、異種プロモーターが挙げられる。

「発現ベクター」は、関心対象の遺伝子産物をコードし、意図する標的細胞における遺伝子産物の発現をもたらすために使用される領域を含むベクターである。発現ベクターはまた、標的中のタンパク質の発現を促進するためにコーディング領域に機能的に連結された制御エレメントを含む。制御エレメントとそれらが発現のために機能的に連結された1つまたは複数の遺伝子との組合せは「発現カセット」と称されることがあり、多数の発現カセットが当技術分野において公知かつ利用可能であり、または当技術分野において利用可能な成分から容易に構築され得る。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。該用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化、脂質化、または標識化成分との共役といった修飾が為されたアミノ酸ポリマーを包含する。

「外因性」という用語は、細胞または生物中のタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関して使用される場合、人工的なまたは天然の手段により細胞または生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指す。外因性核酸は異なる生物もしくは細胞からのものであってもよく、または、それは、生物もしくは細胞内に天然に存在する核酸の1つもしくは複数の追加のコピーであってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞のそれとは異なる染色体位置にあり、またはそれ以外に、天然に見出される異なる核酸配列、例えば、1つの遺伝子からのプロモーターを異なる遺伝子からの遺伝子産物のためのオープンリーディングフレームに連結する発現カセットにより隣接される。

「形質転換された」または「トランスジェニック」は、少なくとも1つの組換えDNA配列の存在により変更または強化された任意の宿主細胞または細胞株を含めるために本明細書において使用される。本発明の宿主細胞は、典型的には、単離された直鎖状DNA配列としての、プラスミド発現ベクター中のDNA配列のトランスフェクション、または組換えウイルスベクターを用いる感染により製造される。

「配列相同性」という用語は、2つの核酸配列の間の塩基マッチの割合または2つのアミノ酸配列の間のアミノ酸マッチの割合を意味する。配列相同性がパーセンテージ、例えば、50％として表される場合、パーセンテージは、何らかの他の配列に対して比較される選択される配列の長さにわたるマッチの割合を表す。（2つの配列のいずれかにおける）ギャップがマッチングを最大化するために許容され、15塩基またはそれ未満、6塩基またはそれ未満、例えば、2塩基またはそれ未満のギャップ長さが通常使用される。プローブまたは治療としてオリゴヌクレオチドを使用する場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は、概しては、20の可能なオリゴヌクレオチド塩基対マッチのうちの17以上の標的塩基マッチ（85％）、10の可能な塩基対マッチのうちの9以上のマッチ（90％）、または20の可能な塩基対マッチのうちの19以上のマッチ（95％）である。

2つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性がある場合に相同的である。例えば、85％の相同性は、2つの配列を最大マッチングのためにアライメントした場合に85％のアミノ酸が同一であることを意味する。（マッチングされている2つの配列のいずれかにおける）ギャップがマッチングの最大化において許容され、ギャップ長さは5もしくはそれ未満または2もしくはそれ未満である。代替的に、2つのタンパク質配列（またはそれらに由来する少なくとも30アミノ酸の長さのポリペプチド配列）は、この用語が本明細書において使用される場合、変異データマトリックスおよび6またはより大きいギャップペナルティを用いてプログラムALIGNを使用して（標準偏差単位において）5より大きいアライメントスコアを有する場合に相同的である。2つの配列またはその部分は、それらのアミノ酸がALIGNプログラムを使用して最適にアライメントされた場合に50％以上同一である場合、より相同的である。

「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体もしくは部分に構造的に関連すること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列の全体もしくは部分に構造的に関連することを意味するために本明細書において使用され、例えば、それらは、少なくとも80％、85％、90％、95％またはより高い、例えば、99％または100％の、配列同一性を有する。対比的に、「相補的」という用語は、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または部分に相同的であることを意味するために本明細書において使用される。実例のために、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に対応し、かつ参照配列「GTATA」に相補的である。

「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたり同一（すなわち、ヌクレオチド毎を基準にして）であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたり同一（すなわち、ヌクレオチド毎を基準にして）であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較のウィンドウにわたり2つの最適にアライメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、U、またはI）が両方の配列において起こる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、かつ結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。本明細書において使用される「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも20ヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたり、頻繁には少なくとも20〜50ヌクレオチドのウィンドウにわたり、参照配列と比較して少なくとも85パーセントの配列同一性、例えば少なくとも90〜95パーセントの配列同一性、または少なくとも99パーセントの配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセンテージが、比較のウィンドウにわたり参照配列の合計20パーセントまたはそれ未満である欠失または付加を含んでもよいポリヌクレオチド配列に対して参照配列を比較することにより算出される、ポリヌクレオチド配列の特徴を表す。

「保存的」アミノ酸置換は、例えば、極性酸性アミノ酸としてアスパラギン酸-グルタミン酸、極性塩基性アミノ酸としてリジン/アルギニン/ヒスチジン、非極性または疎水性アミノ酸としてロイシン/イソロイシン/メチオニン/バリン/アラニン/グリシン/プロリン、極性または非荷電性親水性アミノ酸としてセリン/スレオニンである。保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づくグループ分けを含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、スレオニンのセリンによる置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸による類似の置換は、結果として生じるポリペプチドの特性に対して大きな効果を有しないと予測することが合理的である。アミノ酸の変更が機能的なポリペプチドを結果としてもたらすかどうかは、ポリペプチドの比活性をアッセイすることにより容易に決定され得る。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分けられる:（1）疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;（2）中性親水性:cys、ser、thr;（3）酸性:asp、glu;（4）塩基性:asn、gln、his、lys、arg;（5）鎖配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;および（6）芳香族;trp、tyr、phe。

本発明はまた、非保存的置換を有するポリペプチドを想定する。非保存的置換は、上記のクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することを要する。

組成物および方法
酸化ストレスに対処する機構として、遺伝子移入アプローチにおいて個々にまたは組合せで使用される2つの抗オキシダント酵素への本明細書に記載の改変に対する先例はない。一態様では、タンパク質改変を設計し、分泌される単量体形態のカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ3酵素のための遺伝子構築物を調製した。それぞれのための遺伝暗号の組込みを、別々に、または介在する切断部位と共に単一の翻訳される配列として組み合わせて、例えばアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターの、発現カセットに挿入した。ベクター媒介性発現は、酸化ストレスに対する最前線の障壁として、血清および粘膜表面への移動と共に、細胞外環境に対してカタラーゼもしくはSODのいずれかまたは両方を提供する。これらの遺伝子移入アプローチの使用は、酸化媒介性の病理および疾患から保護する。

遺伝子療法の使用は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター（但し、レトロまたはレンチウイルスベクターなどの別のウイルスベクターであってもよい）などの持続性の発現ベクターに基づく。ROSからの保護のための強力な抗オキシダント武器であるヒトカタラーゼおよびヒトSOD3酵素の三次元タンパク質構造を調べた。臓器の上皮表面を越えて灌流して粘膜表面に達する最前線の防御を提供し得る、分泌される、単量体の、機能的な構築物のベクター媒介性の内因性産生を目的として各酵素を改変するための戦略を発明した。

カタラーゼ
一態様では、翻訳された配列が細胞から分泌されることを指令するように細胞タンパク質産生機構への指示を提供するための分泌シグナルペプチド（例えば、ヒト免疫グロブリンから;SEQ ID NO:13を参照）のタンパク質のN末端における遺伝暗号への付加。一態様では、遺伝暗号を改変して、四量体中の単量体の間で結合境界面を形成するタンパク質配列中のループをコードする配列を除去した。一態様では、アミノ酸381〜400をコードするDNAを欠失させ、それにより、三次元タンパク質構造中の末端が互いに近接したままとなり、したがって、切断されたタンパク質鎖が、介在するループの除去により拘束されずに全体的なタンパク質構造に対する影響力を最小化するようにした。

SOD3
一態様では、アミノ酸残基50〜59の遺伝暗号を除去し、構造への非SOD3配列の導入により起こる可能性がある免疫を最小化するために選択されたSOD3構造中の別の柔軟なループであるアミノ酸74〜80の遺伝暗号と置換した。一態様では、細胞外マトリックス/ヘパリン結合ドメイン（アミノ酸220〜240）をコードする領域の遺伝暗号からの欠失により、分泌されたタンパク質が細胞表面から自由に拡散することを可能とする。野生型SOD3は分泌シグナル配列をコードするので、アミノ末端をコードするcDNAに対する変更は行わなかった。

一態様では、両方の導入遺伝子を構成的発現性のサイトメガロウイルス（CMV）/ニワトリベータアクチンハイブリッドプロモーターの後ろに、発現カセット中に配置し、AAVrh.10血清型ベクターに組み込んだ。介在するフューリン-2a切断配列は、単一の翻訳された配列が2つの別々のポリペプチド生成物、分泌性単量体カタラーゼおよび分泌性単量体SOD3を生成する能力を提供する（Fang et al.,2005）。

カタラーゼの例示的なアミノ酸配列はSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:5〜7または12に提供され、例示的なSOD配列はSEQ ID NO:2〜4、8および10に提供される。

本発明の範囲内の配列は、SEQ ID NO:1〜8、10または12の1つに対して少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより高いアミノ酸配列同一性を有するものを含む。本発明の範囲内のカタラーゼ配列は、全長カタラーゼ配列より約2％、5％、10％、12％、15％または最大20％少ない残基を有する。本発明の範囲内のスーパーオキシドジスムターゼ配列は、全長スーパーオキシドジスムターゼ配列より約2％、5％、10％、12％、15％または最大20％少ない残基を有する。

遺伝子送達ベクター
遺伝子送達ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター、リポソームおよび他の脂質含有複合体、例えば、リポプレックス（DNAおよび陽イオン性脂質）、ポリプレックス、例えば、ポリエチレングリコールなどのカチオンポリマーと複合体化したDNA、ナノ粒子、例えば、Fe₃O₄またはMnO₂ナノ粒子などのDNAに結合するまたはDNAに結合するように機能化された磁性無機ナノ粒子、マイクロ粒子、例えば、ポリラクチドポリガラクチド（polygalactide）試薬から形成されたもの、ナノチューブ、例えば、シリカナノチューブ、ならびに宿主細胞への遺伝子の送達を媒介することができる他の高分子複合体が挙げられる。ベクターはまた、遺伝子送達および/もしくは遺伝子発現をさらにモジュレートする、または標的とされる細胞に有益な特性を他に提供する、他の成分または機能を含み得る。そのような他の成分としては、例えば、細胞への結合またはターゲティングに影響を及ぼす成分（細胞種または組織特異的な結合を媒介する成分を含む）、細胞によるベクターの取込みに影響を及ぼす成分、取込み後の細胞内の移入された遺伝子の局在性に影響を及ぼす成分（例えば、核局在性を媒介する剤）、および遺伝子の発現に影響を及ぼす成分が挙げられる。そのような成分はまた、ベクターにより送達された核酸を取り込んでそれを発現する細胞を検出または選択するために使用され得る検出可能および/または選択可能なマーカーなどのマーカーを含んでもよい。多様なそのようなベクターが当技術分野において公知であり、一般に利用可能である。

本発明の範囲内の遺伝子送達ベクターとしては、単離された核酸、例えば、染色体外に維持され得るプラスミドベースのベクター、ならびに、リポソーム中、例えば、中性もしくは陽イオン性リポソーム中、例えば、DOSPA/DOPE、DOGS/DOPEもしくはDMRIE/DOPEリポソーム中に存在する、かつ/またはDNA-抗DNA抗体-陽イオン性脂質（DOTMA/DOPE）複合体などの他の分子と会合したウイルスおよび非ウイルスベクターを含む、ウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パピローマウイルス、もしくはアデノ随伴ウイルスが挙げられるがそれに限定されるわけではない。例示的なウイルス遺伝子送達ベクターは以下に記載される。遺伝子送達ベクターは、任意の経路を介して投与されてもよく、該経路としては、頭蓋内、髄腔内、筋肉内、頬側、直腸、静脈内または冠内投与が挙げられるがそれに限定されるわけではなく、細胞への移入は、エレクトロポレーションおよび/もしくはイオントフォレーシス、ならびに/または細胞外マトリックスもしくはハイドロゲル、例えば、ハイドロゲルパッチなどのスキャフォールド形成を使用して増進されてもよい。一態様では、浸透性増進剤は、CNSへの間接的な送達を増進するために用いられない。

レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、宿主ゲノムに安定的かつ精密に組み込まれて長期導入遺伝子発現を提供する能力を含むいくつかの確固とした特徴を呈する。これらのベクターは、全身性感染および患者間伝染のリスクを最小化するために感染性遺伝子粒子を除去するようにエクスビボでマニピュレートされ得る。シュードタイプ化されたレトロウイルスベクターは宿主細胞のトロピズムを変化させ得る。

レンチウイルス
レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスおよびネコ免疫不全ウイルスを含むレトロウイルスのファミリーに由来する。しかしながら、分裂細胞にのみ感染するレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る。例えば、ヒト免疫不全ウイルスゲノムに基づくレンチウイルスベクターは、インビボでの心筋細胞の効率的な形質導入が可能である。レンチウイルスは特定のトロピズムを有するが、水胞性口内炎ウイルスを用いてウイルスエンベロープをシュードタイプ化することは、より広い範囲を有するウイルスをもたらす（Schnepp et al.,Meth.Mol.Med.,69:427（2002））。

アデノウイルスベクター
アデノウイルスベクターは、ゲノムからのウイルス遺伝子発現に関与する初期（E1AおよびE1B）遺伝子を欠失させることにより複製インコンピテントにされてもよく、染色体外形態で宿主細胞中に安定的に維持される。これらのベクターは、複製細胞および非複製細胞の両方にトランスフェクトする能力を有し、特に、これらのベクターは、例えば、方向注入または灌流後に、インビボで心筋細胞に効率的に感染することが示されている。アデノウイルスベクターは、7日時にピークとなり約4週続く、インビボでの治療遺伝子の一過性発現を結果としてもたらすことが示されている。導入遺伝子発現の継続期間は、神経特異的プロモーターを利用するシステムにおいて改善され得る。加えて、アデノウイルスベクターは、非常に高い力価において製造されて、小容量のウイルスを用いる効率的な遺伝子移入を可能とし得る。

アデノ随伴ウイルスベクター
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）は、非病原性パルボウイルスに由来し、細胞性免疫応答を本質的に喚起せず、かつほとんどの系において数か月続く導入遺伝子発現を生じさせる。さらに、アデノウイルスのように、アデノ随伴ウイルスベクターはまた、複製細胞および非複製細胞に感染する能力を有し、ヒトにとって非病原性であると考えられている。さらに、それらは、持続的な心臓遺伝子移入のために有望なようである（Hoshijima et al,.Nat.Med.,8:864（2002）;Lynch et al.,Circ.Res.,80:197（1997））。

AAVベクターとしては、AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10が挙げられるがそれに限定されるわけではない。

プラスミドDNAベクター
プラスミドDNAは、より手の込んだパッケージングシステムの非存在を指し示すために多くの場合に「ネイキッドDNA」と称される。インビボでの心筋細胞へのプラスミドDNAの直接注射が達成されている。プラスミドベースのベクターは、比較的非免疫原性かつ非病原性であり、細胞ゲノム中に安定的に組み込まれて、インビボで有糸分裂後細胞において長期の遺伝子発現を結果としてもたらす潜在能力を有する。例えば、プラスミドDNAの筋肉注射後の分泌性血管新生因子の発現は、比較的低いレベルの限局性導入遺伝子発現にもかかわらず、動物モデルにおいて顕著な生物学的効果を実証しており、臨床的に有望なようである（Isner,Nature,415:234（2002））。さらには、プラスミドDNAは血流中で急速に分解され、したがって、遠位の臓器系における導入遺伝子発現の可能性はごくわずかである。プラスミドDNAは、高分子複合体、例えば、リポソームまたはDNA-タンパク質複合体の部分として細胞に送達されてもよく、送達は、エレクトロポレーションを含む技術を使用して増進されてもよい。

薬学的組成物
本発明は、上記の遺伝子移入ベクターおよび薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体を含む、から本質的になる、またはからなる組成物を提供する。組成物が本発明の遺伝子移入ベクターおよび薬学的に許容される担体から本質的になる場合、組成物に実質的に影響しない追加の成分（例えば、佐剤、緩衝剤、安定化剤、抗炎症剤、可溶化剤、防腐剤など）が含まれ得る。組成物が本発明の遺伝子移入ベクターおよび薬学的に許容される担体からなる場合、組成物はいかなる追加の成分も含まない。任意の好適な担体を本発明の文脈内において使用することができ、そのような担体は当技術分野において周知である。担体の選択は、部分的には、組成物が投与され得る特定の部位および組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。組成物は、任意で、本明細書に記載の遺伝子移入ベクターを除いて、無菌であり得る。組成物は、貯蔵のために凍結または凍結乾燥および使用前に好適な無菌の担体中に再構成され得る。組成物は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Lippincott Williams＆Wilkins,Philadelphia,PA（2001）において記載される従来技術にしたがって生成され得る。

組成物のための好適な製剤としては、水性および非水性溶液、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤を含有し得る等張無菌溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単回用量または複数用量の密閉容器中で提供され得、使用の直前に無菌の液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態において貯蔵され得る。即席溶液および懸濁液が、以前に記載された種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。一態様では、担体は緩衝生理食塩水溶液である。一態様では、本発明の遺伝子移入ベクターは、投与前の損傷から遺伝子移入ベクターを保護するために製剤化された組成物中で投与される。例えば、組成物は、ガラス製品、シリンジ、または針などの遺伝子移入ベクターを調製、貯蔵、または投与するために使用されるデバイス上での遺伝子移入ベクターの損失を低減するために製剤化され得る。組成物は、遺伝子移入ベクターの光感受性および/または温度感受性を減少させるために製剤化され得る。この目的のために、組成物は、例えば、上記のものなどの薬学的に許容される液体担体、ならびにポリソルベート80、L-アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびその組合せからなる群より選択される安定化剤を含んでもよい。そのような組成物の使用は、遺伝子移入ベクターの貯蔵寿命を延長させ、投与を促進し、かつ本発明の方法の効率を増加させる。遺伝子移入ベクター含有組成物のための製剤は、例えば、Wright et al.,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.,6（2）:174-178（2003）およびWright et al.,Molecular Therapy,12:171-178（2005））にさらに記載されている。

組成物はまた、形質導入効率を増進するために製剤化され得る。加えて、本発明の遺伝子移入ベクターは、他の治療的または生物学的に活性の剤と共に組成物中に存在し得ることを当業者は理解する。例えば、イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子は、遺伝子移入ベクターのインビボ投与と関連付けられる腫脹および炎症を低減するために組成物の部分であり得る。免疫系刺激剤またはアジュバント、例えば、インターロイキン、リポ多糖、および二本鎖RNA。抗生物質、すなわち、殺菌剤および殺真菌剤は、既存の感染症を治療するためおよび/または遺伝子移入手順と関連付けられる感染症などの将来の感染症のリスクを低減するために存在し得る。

注射可能なデポー形態は、ポリラクチド-ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に対象化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。薬物対ポリマーの比、および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射可能な製剤はまた、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を捕捉させることにより調製される。

ある特定の態様では、本発明の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）（poly（butic acid））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド-コ-カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそのブレンド物、混合物、またはコポリマーからなる群より選択される生体適合性ポリマーを含む。

組成物は、スポンジ、生体適合性の網目構造、機械的なリザーバー、または機械的なインプラントなどの制御または持続放出を可能とするデバイス中または該デバイス上で投与され得る。インプラント（例えば、米国特許第5,443,505号を参照）、デバイス（例えば、米国特許第4,863,457号を参照）、例えば、埋込み可能なデバイス、例えば、機械的なリザーバーまたはインプラントまたはポリマー組成物を含むデバイスは、本発明の遺伝子移入ベクターの投与のために特に有用である。組成物はまた、例えば、ゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸塩、ポリホスホエステル、例えば、ビス-2-ヒドロキシエチル-テレフタレート（BHET）、および/またはポリ乳酸-グリコール酸を含む持続放出製剤の形態（例えば、米国特許第5,378,475号を参照）で投与され得る。

哺乳動物に投与される組成物中の遺伝子移入ベクターの用量は多数の要因に依存し、該要因としては、哺乳動物のサイズ（質量）、任意の副作用の程度、および特定の投与経路などが挙げられる。一態様では、本発明の方法は、本明細書に記載の本発明の遺伝子移入ベクターを含む「治療有効量」の組成物を投与する工程を含む。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な、投与量および時間的期間についての効果的な量を指す。治療有効量は、個体の疾患または障害の程度、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する遺伝子移入ベクターの能力などの要因にしたがって変化してもよい。特定の治療効果を達成するために必要とされる組成物中の遺伝子移入ベクターの用量は、典型的には、ベクターゲノムコピー/細胞（gc/細胞）またはベクターゲノムコピー/体重キログラム（gc/kg）の単位において投与される。当業者は、これらおよび当技術分野において周知の他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療するための適切な遺伝子移入ベクター用量範囲を容易に決定することができる。治療有効量は1×10¹⁰ゲノムコピー〜1×10¹³ゲノムコピーであってもよい。

一態様では、組成物は、哺乳動物に1回投与される。組成物の単回投与は、最小の副作用と共に哺乳動物において持続性の発現を結果としてもたらすことがあると考えられる。しかしながら、ある特定の場合には、組成物への細胞の充分な曝露を確実にするために治療的な期間中に組成物を複数回投与することが適切なことがある。例えば、組成物は、治療期間中に2回またはより多くの回数（例えば、2、3、4、5、6、6、8、9、または10回またはより多くの回数）哺乳動物に投与されてもよい。

本開示は、上記の核酸配列を含む治療有効量の遺伝子移入ベクターを含む、薬学的に許容される組成物を提供する。

投与の経路、投与量および投与形態
本発明による遺伝子送達ベクターの投与は、例えば、レシピエントの生理的条件、および当業者に公知の他の要因に依存して、連続的または間欠的なものであってもよい。遺伝子送達ベクターの投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であってもよく、または間隔を置いた一連の用量であってもよい。局所投与、例えば、頭蓋内、鼻腔内または髄腔内投与、および、例えば、血液脳関門を越えるウイルスを使用する全身投与の両方が想定される。例えば、静脈内、鼻腔内または気管支内、肺への直接投与および胸膜内といった、任意の投与経路を用いることができる。一態様では、組成物は、胸膜に送達されてもよい。

任意で持続放出用に製剤化されてもよい、遺伝子送達ベクターを含む1つまたは複数の好適な単位投与形態は、頭蓋内、髄腔内、または鼻腔内（intransal）、またはCNSに送達するための他の手段、または経口、または非経口、例えば、直腸、頬側、膣および舌下、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、もしくは肺内経路を含む様々な経路により投与され得る。製剤は、適切な場合、別々の単位投与形態で提供されることが好都合なことがあり、薬局に周知の任意の方法により調製されてもよい。そのような方法は、ベクターを液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微細に分割された固体担体またはその組合せと会合させる工程、および次に、必要な場合、製造物を所望の送達システムに導入または成形する工程を含んでもよい。

特定のアウトカムを達成するために投与される遺伝子送達ベクターの量は、様々な要因に依存して異なり、該要因としては、選択された遺伝子およびプロモーター、状態、患者特異的なパラメーター、例えば、身長、体重および年齢、ならびに予防または治療のいずれが達成されるべきかが挙げられるがそれに限定されるわけではない。

本発明のベクターは、例えば脳への、投与のために好適な製剤の形態で好都合に提供されてもよい。好適な投与フォーマットは、標準的な手順にしたがって、各患者について個々に医師により最良に決定され得る。好適な薬学的に許容される担体およびその製剤は、標準的な製剤の専門書、例えば、Remington's Pharmaceuticals Sciencesに記載されている。「薬学的に許容される」は、製剤の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに対して有害でない担体、希釈剤、賦形剤、および/または塩を意味する。

本発明のベクターは、中性pH、例えば、約pH6.5〜約pH8.5、または約pH7〜8で、溶液をおおよそ等張性とする賦形剤、例えば、4.5％のマンニトールまたは0.9％の塩化ナトリウムと共に、一般に安全であるとみなされるリン酸ナトリウムなどの当技術分野において公知の緩衝溶液を用いて緩衝化されたpHで、メタクレゾール0.1％〜0.75％、または0.15％〜0.4％のメタクレゾールなどの許容される防腐剤と共に、溶液中に製剤化されてもよい。所望の等張性を得ることは、塩化ナトリウムまたは他の薬学的に許容される剤、例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、ポリオール（例えば、マンニトールおよびソルビトール）、または他の無機もしくは有機溶質を使用して達成され得る。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液のために有用である。所望の場合、上記の組成物の溶液はまた、貯蔵寿命および安定性を増進するように調製され得る。本発明の治療的に有用な組成物は、一般に許容される手順にしたがって成分を混合することにより調製され得る。例えば、選択された成分を混合して濃縮混合物を製造することができ、それを次にpHを制御するための水および/もしくは緩衝剤または張度を制御するための追加の溶質の添加により最終濃度および粘度に調整することができる。

ベクターは、1つまたは複数の用量において効果的な量のベクターを含有する投与形態において提供され得る。ウイルスベクターについて、効果的な用量は、少なくとも約10⁷ウイルス粒子、例えば、約10⁹ウイルス粒子、または約10¹¹ウイルス粒子の範囲内であってもよい。添加されるウイルス粒子の数は、最大10¹⁴であってもよい。例えば、ウイルス発現ベクターが用いられる場合、約10⁸〜約10⁶⁰gcのウイルスベクターが核酸としてまたはパッケージングされたビリオンとして投与され得る。いくつかの態様では、例えば0.5〜10mL当たり、約10⁹〜約10¹⁵コピーのウイルスベクターが核酸としてまたはパッケージングされたビリオンとして投与され得る。代替的に、核酸またはベクターは、少なくとも約0.0001mg/kg〜約1mg/kg、少なくとも約0.001mg/kg〜約0.5mg/kg、少なくとも約0.01mg/kg〜約0.25mg/kgまたは少なくとも約0.01mg/kg〜約0.25mg/kg体重の投与量で投与され得るが、他の投与量が有益な結果を提供することもある。投与される量は、様々な要因に依存して異なり、該要因としては、投与のために選択された核酸またはベクター、疾患、哺乳動物の体重、身体条件、健康、および/または年齢が挙げられるがそれに限定されるわけではない。そのような要因は、当技術分野において利用可能な動物モデルまたは他の試験系を用いて臨床医により容易に決定され得る。記載のように、投与される正確な用量は担当医により決定されるが、1mLのリン酸緩衝生理食塩水中であってもよい。単独でのプラスミドDNA、または他の高分子との複合体中のプラスミドDNAの送達について、投与されるDNAの量は、レシピエントに対して有益な効果を結果としてもたらす量である。例えば、個々のまたは分割された用量において、0.0001〜1mgまたはより多く、例えば、最大1g、例えば、0.001〜0.5mg、または0.01〜0.1mgのDNAが投与され得る。

例えば、ウイルス発現ベクターが用いられる場合、約10⁸〜約10⁶⁰gcのウイルスベクターが核酸としてまたはパッケージングされたビリオンとして投与され得る。いくつかの態様では、例えば0.5〜10mL当たり、約10⁹〜約10¹⁵コピーのウイルスベクターが核酸としてまたはパッケージングされたビリオンとして投与され得る。代替的に、核酸またはベクターは、少なくとも約0.0001mg/kg〜約1mg/kg、少なくとも約0.001mg/kg〜約0.5mg/kg、少なくとも約0.01mg/kg〜約0.25mg/kgまたは少なくとも約0.01mg/kg〜約0.25mg/kg体重の投与量で投与され得るが、他の投与量が有益な結果を提供することもある。

一態様では、投与は、適切なカテーテルまたは針を使用する頭蓋内、肝内、気管内または気管支内注射または注入によるものであってもよい。当技術分野において公知のように、送達を達成するために様々なカテーテルが使用され得る。例えば、本発明において使用するために好適な、様々な一般目的のカテーテルの他に改良型カテーテルが商用供給業者から入手可能である。また、送達が脳または肺の特定の領域への直接的な注射により達成される場合、当技術分野において公知のように、カテーテルをその領域に導入するために多数のアプローチが使用され得る。

実例として、1つまたは複数の導入遺伝子を送達するためにリポソームおよび他の脂質含有遺伝子送達複合体が使用され得る。遺伝子送達用のそのような複合体の調製および使用の原則は当技術分野において記載されている（例えば、Ledley,（1995）;Miller et al.,（1995）;Chonn et al.,（1995）;Schofield et al.,（1995）;Brigham et al.,（1993）を参照）。

遺伝子送達ベクターを含有する薬学的製剤は、周知のおよび容易に利用可能な成分を使用して当技術分野において公知の手順により調製され得る。例えば、剤を一般的な賦形剤、希釈剤、または担体と共に製剤化し、錠剤、カプセル、懸濁液、および粉末などを形成させることができる。本発明のベクターはまた、例えば、筋肉内、皮下または静脈内経路による、非経口投与のために適切なエリキシルまたは溶液として製剤化され得る。

ベクターの薬学的製剤はまた、水性もしくは無水溶液、例えば、凍結乾燥製剤、もしくは分散体の形態、または代替的にエマルションもしくは懸濁液の形態をとることができる。

一態様では、ベクターは、例えば、注射による、例えば、ボーラス注射またはカテーテルを介する連続注入による投与のために製剤化されてもよく、アンプル、事前充填シリンジ、小体積注入容器中の単位用量形態または防腐剤を添加した複数用量容器中に提供されてもよい。活性成分は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤などの製剤化剤を含有してもよい。代替的に、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質非含有水を用いて構成するための、無菌固体の無菌単離または溶液からの凍結乾燥により得られる、粉末形態であってもよい。

これらの製剤は、先行技術において周知の薬学的に許容されるビヒクルおよび佐剤を含有し得る。例えば、生理学的見地から許容される1つまたは複数の有機溶媒を使用して溶液を調製することが可能である。

吸入による上（鼻）または下気道への投与のために、ベクターは、空気吸入器、ネブライザーまたは加圧パックまたはエアロゾルスプレーを送達する他の簡便な手段から好都合に送達される。加圧パックは、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを含んでもよい。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達するための弁を提供することにより決定されてもよい。

代替的に、吸入または吹送による投与のために、組成物は、乾燥粉末、例えば、治療剤とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末ミックスの形態をとってもよい。粉末組成物は、例えば、カプセルまたはカートリッジ中、または、例えば、粉末が吸入器、空気吸入器もしくは定量吸入器の補助により投与され得るゼラチンもしくはブリスターパック中の単位投与形態において提供されてもよい。

鼻腔内投与のために、ベクターは、点鼻薬、液体スプレー、例えば、プラスチックボトルアトマイザーまたは定量吸入器を介するものなどを介して投与されてもよい。典型的なアトマイザーは、Mistometer（Wintrop）およびMedihaler（Riker）である。

ベクターの局所送達はまた、例えば、カテーテルまたは針を使用して、疾患の部位またはその近くにベクターを投与する様々な技術により為され得る。部位特異的なまたは標的指向型の局所送達技術の例は、利用可能な技術の限定ではなく実例であることが意図される。例としては、局所送達カテーテル、例えば、注入または留置カテーテル、例えば、針注入カテーテル、シャントおよびステントもしくは他の埋込み可能なデバイス、部位特異的なキャリア、直接注射、または直接塗布が挙げられる。

本明細書に記載の製剤および組成物はまた、抗菌剤または防腐剤などの他の成分を含有してもよい。

対象
対象は、ヒトおよび非ヒト動物を含む任意の動物であってもよい。非ヒト動物としては、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が挙げられるが、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマなどの哺乳動物が好ましい。対象はまた、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽、およびウマなどの家畜類、またはイヌおよびネコなどの愛玩動物であってもよい。

対象としては、酸化的損傷を患うまたはそのリスクがあるヒト対象が挙げられる。対象は、概しては、医師などの技術を有する専門家により主題とする発明の状態を診断される。

本明細書に記載の方法は、任意の種、性別、年齢、民族集団、または遺伝子型の対象のために用いられ得る。したがって、対象という用語は男性および女性を含み、かつそれは、熟年、熟年から成人までの年齢の対象成人、成人から成人前までの年齢の対象、ならびに若者、子供、および乳児を含む未成年を含む。

ヒトの民族集団の例としては、コーカサス人、アジア人、ヒスパニック、アフリカ人、アフリカ系アメリカ人、ネイティブアメリカン、セム人、およびパシフィックアイランダーが挙げられる。方法は、一部の民族集団、例えば、コーカサス人、特に北欧集団の他に、アジア人集団のためにより適切なことがある。

対象という用語はまた、上記のように本発明を必要とする限り、任意の遺伝子型または表現型の対象を含む。加えて、対象は、任意の髪の色、目の色、皮膚の色またはその任意の組合せの遺伝子型または表現型を有し得る。

対象という用語は、任意の身長、体重、または任意の臓器もしくは身体部分のサイズもしくは形状の対象を含む。

本発明を以下の非限定的な例により説明する。

本発明の記載は以下の実施例によりさらに説明され、実施例はいかなる意味でも限定的なものと解されるべきではない。全ての参照される参考文献（本出願の全体を通じて参照されるような文献資料、発行特許、特許出願公開を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。

動物実験は、不偏の実験の設計を保証するように設計される。実験動物は無作為に群に割り当てられ、動物行動を評価する場合に研究者は盲検とされる。形質導入、疾患徴候、または療法応答において起こり得る性差に対処するために雄および雌が使用される。各コホート中の動物数は、統計的に有意なデータをもたらすように選択された。

概要
本開示の焦点は、細胞外抗オキシダント防御を用いて肺を保護して、タバコの煙、汚染物質から吸入された、および活性化した炎症細胞により肺内に生成されたオキシダントが、疾患の病理の基礎となる肺上皮および内皮への傷害の永続化において大きな役割を果たす慢性障害である慢性閉塞性肺疾患（COPD）を含む障害を治療するための療法の開発である。戦略は、肺への主要な細胞外オキシダントストレスである超酸化物

およびH₂O₂を不活性化する肺への持続性の細胞外抗オキシダント酵素シールドを提供するインビボ遺伝子療法技術を使用する。戦略は、細胞外環境中に拡散して、効果的な細胞外抗オキシダントシールドを肺に提供できる機能的な単量体抗オキシダント酵素を分泌するように遺伝子改変されたカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ3（SOD3）の遺伝子の使用を含む。カタラーゼは、分泌されるように設計された場合に拡散するには大きすぎる（232kDa）四量体の細胞内酵素である。効果的な細胞外抗オキシダントとしてカタラーゼを使用するために、カタラーゼ遺伝子を改変して、ラッピングループドメインが四量体形成を媒介するのを防止した。分泌シグナルの付加により、ヒトカタラーゼ単量体（hCatWL^-）は分泌され、細胞外H₂O₂がH₂Oになるのを触媒するように機能することができる。スーパーオキシドジスムターゼ3（SOD3）は分泌されるが、大きい四量体（130kDa）であり、それを細胞表面に接続させるヘパリン結合ドメインを有する。SOD3をより効果的な肺細胞外抗オキシダントに改変するために、四量体形成のために不可欠なループを改変し、ヘパリン結合ドメインを除去し（hSOD3hd^-）、細胞表面に結合しない効果的な単量体抗オキシダント酵素（30kDa）を結果として得た。改変型カタラーゼおよび/またはSOD3単量体を発現および分泌するように肝臓を遺伝学的に改変するための例示的な遺伝子移入ベクターとしてアデノ随伴（AAV）遺伝子移入ベクターを使用する。4つのAAVrh.10候補を評価する:AAVrh.10hCatWL^-（カタラーゼ単量体を発現する）、AAVrh.10hSOD3hd^-（SOD3単量体）、AAVrh.10hCatWL^-/hSOD3hd^-（両方の単量体）、およびAAVrh.10hSODhd^-/hCatWL^-（同じであるが5'位にSOD3hd^-を有する）。一態様では、AAVrh.10ベクターは、投与後に肺内皮および上皮表面の持続性の細胞外抗オキシダントシールドを生成する。

目的1
4つのAAVrh.10抗オキシダントベクター（hCatWL^-、hSOD3hd^-、hCatWL^-/hSOD3hd^-およびhSOD3hd^-/hCatWL^-）の発現カセットにより媒介される、分泌される機能的な改変型カタラーゼおよび/またはSOD3の発現のレベルをインビトロで比較すること。

目的2

および/またはH₂O₂ストレスから肺内皮および上皮を保護することができる分泌される機能的な改変型カタラーゼおよび/またはSOD3を発現する4つのAAVrh.10抗オキシダントベクターの能力をインビボで定量化すること。

実施例1
本明細書に開示される遺伝子療法の焦点は、一態様では、細胞外抗オキシダント防御を用いて肺を保護して、タバコの煙、汚染物質から吸入された、および活性化した炎症細胞により肺内に生成されたオキシダントが、疾患の病理の基礎となる肺上皮および内皮への傷害の開始および永続化において大きな役割を果たす慢性障害である慢性閉塞性肺疾患（COPD）を治療することである（Lin＆Thomas,2010;McGuinness et al.,2017;Hubbard＆Crystal,1986;MacNee,2000;Shapiro＆Ingenito,2005;Yoshida et al.,2007;Elmasry et al.,2015）。肺に対するオキシダントストレスの大部分は細胞外のものであり、上皮および内皮細胞の細胞内抗オキシダント防御を圧倒して、細胞損傷、機能障害および最終的に死を結果としてもたらす（Shaykhiev et al.,2014;Gao et al.,2015;Polverino et al.,2018）。現行の戦略は、肺に対する細胞外オキシダントストレスの2つの主成分である超酸化物

およびH₂O₂を不活性化する肺への持続性の細胞外抗オキシダント酵素シールドを提供するインビボ遺伝子療法技術を使用することである。

細胞外環境中で拡散して、効果的な細胞外抗オキシダントシールドを肺に提供できる機能的な単量体形態で分泌されるようにカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ3（SOD3）のコーディング配列を遺伝子改変した。カタラーゼは、ヘム基と組み合わされる大きい（232kDa）四量体酵素であり、NADPHは高度に効果的な細胞内酵素であるが、分泌されるように設計されたとしても細胞外環境中で効果的に拡散するには大きすぎる（Reynolds et al.,1977;Rennard et al.,1986;Goyal＆Basak,2010;Sepasi et al.,2018;Bell et al.,1981）。効果的な細胞外抗オキシダントとしてカタラーゼを使用するために、カタラーゼ遺伝子を改変して、ラッピングループドメインが四量体形成を媒介するのを防止した（Goyal＆Basak,2010;Ko et al,2000;Safo et al.,2001）。分泌シグナルの付加により、ヒトカタラーゼ単量体（hCatWL^-）は分泌され、細胞外H₂O₂がH₂Oになるのを触媒するように機能することができる。

3つのスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、SOD1、SOD2およびSOD3がある（Fukai＆Ushio-Fukai,2011;Perry et al.,2010）。SOD1は細胞質中で機能し、SOD2はミトコンドリア中で機能する。SOD3は分泌されるが、大きい四量体（130kDa）であり、それを細胞表面に接続させるヘパリン結合ドメインを有する（Fukai＆Ushio-Fukai,2011;Antonyuk et al.,2009;Griess et al.,2017）。SOD3をより効果的な肺細胞外抗オキシダントに改変するために、四量体形成のために不可欠なループを改変し、ヘパリン結合ドメインを除去し（hSOD3hd^-）、細胞表面に結合しない機能的な分泌される単量体抗オキシダントを結果として得た。一態様では、アデノ随伴（AAV）遺伝子移入ベクターを使用して、肺を越えて拡散することができる分子量をそれぞれ有する（Reynolds et al.,1977;Bell et al.,1981）改変型カタラーゼおよび/またはSOD3単量体を発現および分泌するように肝臓を遺伝学的に改変し、その結果は肺全体の細胞外抗オキシダント保護である。一態様では、遺伝子療法戦略は、静脈内に投与された場合に、効果的に肝細胞に形質導入して抗オキシダント遺伝子を発現させる非ヒト霊長動物アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子移入ベクターであるsAAVrh.10を使用する。4つのAAVrh.10候補を評価する:AAVrh.10hCatWL^-（カタラーゼ単量体のみを発現する）、AAVrh.10hSOD3hd^-（SOD3単量体）、AAVrh.10hCatWL^-/hSOD3hd^-（両方の抗オキシダント単量体）、およびAAVrh.10hSODhd^-/hCatWL^-（同じであるが5'位にSOD3hd^-を有する）。

オキシダントは、他の分子からの電子を容易に受容して機能障害および最終的な細胞/臓器または損傷を引き起こす分子である（Davies et al.,2001;Devasagayam et al.,2002;O'Reilly et al.,2001;Janssen et al.,1993）。正常な状況下において、抗オキシダントは酸化ストレスから保護する（Pham-Huy et al.,2008;Irshad et al.,2002）。オキシダント負荷が抗オキシダント防御を上回った場合、結果として生じるオキシダントストレスは、臓器機能障害の病理発生において中心的役割を果たす（Casas et al.,2015;Pham-Huy et al.,2008;Irshad et al.,2002）。肺は吸入した細胞外オキシダント（タバコの煙、汚染物質、生体異物、高酸素）および内因性オキシダント（活性化した炎症細胞）に高度に脆弱であるが、肺抗オキシダント防御は主に細胞内のものである（Rhaman et al.,2006;Sies et al.,2017）。

COPDにおいて、肺上皮および内皮は、細胞内オキシダント防御を圧倒する細胞外オキシダントを生成する活性化した炎症細胞（肺胞マクロファージおよび好中球）からの追加のオキシダントストレス下にある（図1A）。主要な肺抗オキシダント防御酵素は、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD;

がH₂O₂になるのを触媒する;3つの形態:SOD1細胞質、SOD2ミトコンドリア、SOD3細胞外）、カタラーゼ（H₂O₂がH₂Oになるのを触媒する、細胞質）であり、グルタチオン系はH₂O₂を水に変換する（GSHは細胞質および細胞外の両方にある;GSHを還元状態に保つために複数の細胞質酵素が必要とされる;図1B）（Rahman et al.,2006;Sies et al.,2017）。肺細胞はNRF2およびNF-kB/IkBなどのオキシダントセンサーを有するが、ヒト肺細胞は、主要な抗オキシダント酵素カタラーゼおよびSODを上方調節することができない。これは、正常ヒトボランティアを気管支鏡観察して気道上皮のサンプリングを行い、ベースラインカタラーゼおよびSOD mRNAレベルを定量化し、次に100％のO₂への12〜18時間（気管気管支炎を誘導するために充分）の曝露後に、上皮を再サンプリングしたCrystal研究室により実行された研究において劇的に実証された（Erzurum et al.,1985）。顕著なことに、カタラーゼおよびSODのいずれのmRNAレベルも上方調節されず、すなわち、ヒト気道上皮は、激しい細胞外オキシダントストレスにもかかわらずその抗オキシダントシールドを上方調節することに限られた機構を有する。1つの解決策は、細胞外オキシダントのストレスから肺を保護するために効果的な細胞外「抗オキシダントTeflonコート」を提供することである。分泌型のカタラーゼを単独で、SOD3を単独で、またはカタラーゼ＋SOD3を発現させて効果的な抗オキシダントシールドを生成するためにアデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子移入ベクターが使用される。課題は、カタラーゼは大きい細胞内四量体であり、SOD3は細胞表面に結合する大きい四量体であり、それらの天然の形態においては、いずれも効果的な拡散性細胞外抗オキシダント防御を提供できないことである。解決策は、カタラーゼおよびSOD3のコーディング配列を改変して、肺を通じて拡散してオキシダント脆弱性の内皮および上皮を保護することができる遺伝子療法ベースの抗オキシダントとして効果的に使用され得る機能的な単量体を生成することである（Reynolds et al.,1977;Bell et al.,1981）。一態様では、静脈内に改変型カタラーゼおよび/またはSOD3単量体をコードするAAVベクターを投与することにより、肝臓肝細胞は血液中に機能的な抗オキシダント単量体を分泌し、肺内皮（血液側から）の抗オキシダント保護を可能とし、内皮および上皮タイトジャンクションを越えて拡散するために充分に低分子量（50〜60kDa）であることにより、間質組織および上皮の効果的な抗オキシダントシールドを提供することを可能とする（分子量50〜60kDaのタンパク質について、ヒト肺上皮内壁液レベルは血液のそれの10％である。

1つのカタラーゼ分子は各秒に何百万ものH₂O₂分子をH₂Oに変換することができる（Goyal＆Basak,2010;Chance,1947）。カタラーゼは、4つの単量体（各501アミノ酸）＋4つの鉄含有の4つのヘム基＋4つのNAPDH分子を含む細胞内酵素である。カタラーゼは全ての臓器中で発現される。肺細胞外抗オキシダント保護を増強するための遺伝子療法戦略にとっての課題は、カタラーゼは、分泌および拡散して効果的な細胞外抗オキシダントシールドを提供するためには大きすぎる（232kDa）ことである。LEXの解決策は、カタラーゼ遺伝子配列を、それが四量体を形成できないように、および効果的な細胞外抗オキシダントとして機能する単量体として分泌され得るように遺伝学的に改変することである。各カタラーゼ単量体は、単量体単位を一緒に結合させる噛み合い式アームエクスチェンジのために重要なアミノ末端残基、および4つの単量体が互いに巻き付いて四量体を形成し、塩架橋およびイオン相互作用は4つの単量体を一緒に保持するラッピングループドメインを有する。候補遺伝子改変は以下を含んだ:（1）全ての構築物はN末端分泌配列（ヒトIgG1から）を有した、（2）カタラーゼ配列をN末端領域において改変して四量体構造を安定化させるドメインを欠失させた、（3）単量体間の結合境界面を形成するラッピングループドメインを欠失させた（図2）。

SODは

をH₂O₂に変換する。SOD3（活性部位の銅＋亜鉛）は、アミノ末端シグナルペプチドおよびC末端の正に荷電した残基のクラスターを含むヘパリン結合ドメインを有する分泌されるホモ四量体（約130kDa）である。分泌されるが、ヘパリン結合ドメインは、SOD3を細胞表面にならびにマトリックスヘパリン硫酸プロテオグリカンおよびコラーゲンにアンカーする（Sandstom,1993;Olsen et al.,2004）（小さい比率はN末端の近くで切断されて、循環性の四量体を生成する）。肺における遺伝子治療剤としてのSOD3の有効性を最大化するために、改変を行って、単量体を噛み合わせて四量体を形成させるループを置換し、またヘパリン結合ドメインのセグメントを欠失させてSOD3単量体が組織中で自由に拡散することを可能とした。SOD3はシグナルペプチドを有するので、それはインタクトなままとした（図3）。

COPDは米国において3番目に一般的な死因である。酸素以外に、COPD関連の死亡率を減少させる薬物はない（Benton et al.,2018;Woodruff et al.,2015）。COPDにおいて使用される薬物（気管支拡張剤、コルチコステロイド）は症状を助け、長期の抗生物質は増悪の頻度を低減する（Benton et al.,2018;Woodruff et al.,2015）。細胞外オキシダントのストレスはCOPDの病理発生において大きな役割を果たすという概念を支持する広範なデータがある（Shaykiev et al.,2014;Gao et al.,2015;Polverino et al.,2010;Rahman,2015）。COPD療法のために抗オキシダントを評価するいくつかの臨床研究が為されてきた（Rahman,2008;Rahman,2012において総説されている）。これらの試みのいずれも成功していない。LEX戦略は、細胞外環境中の効果的な抗オキシダント酵素のレベルを増大し、オキシダントストレスから上皮細胞および内皮細胞の両方を保護するために遺伝子療法技術を使用する新たなアプローチである。成功した場合、COPDの病理発生におけるオキシダントの重要性の文脈において、細胞外抗オキシダントスクリーニングの遺伝子療法ベースの確立は、この一般的な致死性障害に対する治療法として高度に意義を持つものとなるはずである（Foronjy et al.,2008;Rahman et al.,2006）。

図4は、COPDを治療するための、例示的な遺伝子療法ベースの、細胞外の、拡散可能な酵素抗オキシダントを示す。現在までの研究に基づいて、LEX 5は、4つの候補発現カセットの1つと共に、AAV血清型rh.10キャプシドを含む（図4）。4つの候補遺伝子移入ベクターは、抗オキシダント酵素をコードするcDNAを除いて同一である。それぞれは、（5'から3'へ）:（1）AAV血清型2からのAAV逆位末端反復（ITR）;（2）CAG-サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーター、スプライスドナー、ニワトリβ-アクチンからのイントロン配列、右手イントロンおよびウサギβ-グロビンからのスプライスアクセプター;CAGは遺伝子療法応用において広く使用される高度に活性の構成的プロモーターである（Miyazaki et al.,1989;Niwa et al.,1991）;（3）カタラーゼ単量体（LEX 5a、hCatWD^-）、SOD3単量体（LEX 5b、hSOD3hd^-）のコーディング配列、フューリン2A部位により分離されたhCatWD^-＋hSOD3hd^-の組み合わせたコーディング配列（5'から3'へ）（LEX 5c）、およびフューリン2A部位により分離されたhSOD3hd^-＋hCatWD^-の組み合わせたコーディング（5'から3'へ）（LEX 5d、カタラーゼおよびSOD3配列の順序が逆転している以外はLEX 5cと同一）;（4）ヘマグルチニンタグ（タンパク質の検出を促進するため）;（5）ポリA/停止シグナル;ならびに（6）3'AAV2ITRを有する発現カセットを含む。発現カセットを全て、分泌されるタンパク質を発現させるための肝臓への形質導入において優れた非ヒト霊長動物AAVキャプシドであるAAVrh.10血清型キャプシドにパッケージングする。4つの候補発現カセットを機能についてインビトロで評価し、同等の静脈内用量の各ベクターを使用して4つの候補AAVベクターをマウスにおいて突き合わせて比較し、ベクターDNAについて肝臓および肺を、ならびに血漿（肺内皮保護について）および肺上皮内壁液（肺上皮保護について）におけるヒトカタラーゼおよび/またはSOD3 mRNA、およびカタラーゼ単量体タンパク質の量および活性を評価する。3cにおいて詳述される定量的な基準を使用して、ベクターの1つを4つの候補ベクターから選択する。

世界的に、COPDは3億2900万人（世界人口の4.8％（Vos et al.,2012））に影響し、各年当たり世界中で300万を超える死を引き起こす。米国において、COPDは3番目の死因であり、1年当たり150,000人の死を引き起こすと推定される。ベクターは、この慢性の致死性障害に対する生涯にわたる療法のために単回の静脈内注入のみを必要とし得る。主に細胞内抗オキシダントを増強する（カタラーゼ）または細胞膜に接続したままである（SOD3）抗オキシダント酵素をコードする天然遺伝子を発現させるための遺伝子療法を使用するのではなく、本発明の戦略は、効果的な細胞外酵素抗オキシダント「シールド」を生成して、高度に脆弱な内皮および上皮を含む全ての肺細胞に細胞外抗オキシダント保護を提供するために遺伝子療法を使用する。

効果的な肺細胞外防御を生成するための解決策は、天然ヒトカタラーゼおよびSOD3コーディング配列を改変して、肝臓へのAAV媒介性の遺伝子移入により発現された場合に、単量体が血液抗オキシダント防御（肺内皮を保護する）を増進しかつ肺を越えて拡散して肺上皮内壁液抗オキシダント防御（上皮を保護する）を増進する分子量（50〜60kDa）の機能的な単量体を生成できるようにすることである。要約すると、本革新は以下を含む:（1）ヒトカタラーゼおよびSOD3遺伝子の分子操作により、これらの高度に効果的な抗オキシダントが肺内皮および上皮のための細胞外抗オキシダントシールドを生成して、肺細胞を損傷させる細胞外オキシダントストレスを防止するように指令すること、ならびに（2）一態様では、1つの遺伝子移入構築物中で遺伝子改変型カタラーゼおよびSOD3遺伝子の組合せを使用することにより、

およびH₂O₂の両方を効果的に除去し、それにより、広範な吸入されるオキシダントの他に、活性化した炎症細胞により生成される細胞外オキシダントに対する効果的な細胞外抗オキシダントシールドを提供するこれらの抗オキシダントの能力を利用すること。別々のカタラーゼベクターおよびSODベクターが一緒に投与されてもよい。

データに基づいて、全てAAV非ヒト血清型rh.10に基づく4つの候補ベクターを同定した（図4）:（1）LEX 5a-AAVrh.10hCatWD^-（分泌されるカタラーゼ単量体）、（2）LEX 5b-AAVrh.10hSOD3hd^-（ヘパリン結合ドメインを欠失した分泌されるSOD3単量体）、（3）LEX 5c-AAVrh.10hCatWD^-/SOD3hd^-（分泌されるカタラーゼ単量体および分泌されるSOD3単量体の両方を発現する単一のベクター）、ならびに（4）LEX 5d-AAVrh.10hSOD3hd^-/hCatWD^-（LEX 5cと同一であるが、カタラーゼ構築物がSOD3構築物に先行する）。LEX 5を同定するための実験アプローチはインビトロおよびインビボアッセイを使用する。

ヒトカタラーゼコーディング配列に対する改変は、AAVrh.10hCatWD^-（LEX 5a）を生成するLEX 5a用の発現カセットの同定に繋がり、またLEX 5aをマウスの静脈内に投与した場合、その結果は血清中の機能的なヒトカタラーゼ活性であることが実証された。同様に、ヒトSOD3コーディング配列に対する改変は、血清中の機能的なSOD活性を結果としてもたらすマウスへのLEX 5b用の発現カセットの同定に繋がった。AAVrh.10hCatWD^-/hSOD3hd^-およびAAVrh.10hSOD3hd^-/hCatWD^-ベクターを生成し、インビトロおよびインビボで試験する。

ヒトカタラーゼ配列の3つの改変を評価した:hCatNT^-、hCatWL^-およびhCatNT^-WL^-。無血清培地（mediate）中の293T細胞へのこれらのプラスミドのトランスフェクション後の培養上清の評価は、3つ全てが分泌されることを実証した（図5A）。しかしながら、3つの構築物のうち、ラッピングループドメイン欠失（hCatWD^-）のみがカタラーゼ活性を保持した（図5B）。ビス-トリスゲル分析は、hCAThd^-は単量体として分泌されることを実証した（図5C）。このデータに基づいて、AAVrh.10hCatWD^-（LEX 5a）を作製した。マウスへの静脈内投与は肝臓および肺中のhCatWD^-DNAの検出に繋がった（AAVrh.10ベクターについて典型的）（Chiuchiolo et al.,2013）。重要なことに、血清中の容易に検出可能なヒトカタラーゼ活性、例えば、LEX 5aは、分泌される機能的なカタラーゼ単量体を生成する（図7A〜C）。

2つの改変を単一のSOD3変異体（hSOD3hd^-）中で行い、これは74〜80の残基セグメントのインフレームコピーにより置換した残基50〜59の欠失、および残基212〜240のヘパリン結合ドメインの欠失を含んだ。293T細胞へのこのプラスミドのトランスフェクション後の培養上清の定量化は、hSOD3hd^-変異体は上清中で容易に検出され（図6A）、単量体である（図6B）ことを実証した。このデータに基づいて、AAVrh.10hSOD3hd^-（LEX 5b）を生成した（図4）。Balb/cマウスへの静脈内投与は、肝臓および肺（肝臓で50倍高い）中のベクターDNAならびに血清中のSOD活性に繋がった（図7D〜F）。LEX 5c、LEX 5d。LEX 5aおよびLEX 5bのインビトロおよびインビボでの機能データに基づいて、LEX 5cおよびLEX 5dを生成してカタラーゼおよびSOD3の両方の改変型単量体を発現させた。1つのAAV構築物中での2つの遺伝子の発現に基づいて（De et al.,2008;Wang et al.,2010;Watanabe et al.,2010;Mao et al.,2011;Rosenberg et al.,2012;Hicks et al.,2012;Xie et al.,2014;Hicks et al.,2015;Pagovich et al.,2016;Liu et al.,2016）、LEX 5aおよびLEX 5bの両方は単一のプロモーターを使用し、2つの改変型cDNAは、結果として生じる前駆体タンパク質の切断を指令して2つの機能性タンパク質を生成させるフューリン2A切断部位により分離されている。2つの構築物を試験する:hCatWD^-配列がhSOD3hd^-配列に先行するLEX 5c、および2つのcDNAコーディング配列がフリップしているLEX 5d。両方をインビトロおよびインビボでの機能について試験する。

実験の設計
研究は、インビトロおよびインビボでのLEX 5a、LEX 5b、LEX 5c、およびLEX 5dの比較を焦点とする。以下の基準を使用して同じベクター用量について候補をランク付けする:（1）インビトロ-

、H₂O₂オキシダントストレスに対して分泌される機能的な抗オキシダントのレベル、（2）インビボ-血清および肺上皮内壁液中の機能的な抗オキシダントの持続性のレベル。

（表Ｉ）4つの候補発現プラスミドのインビトロでの比較

¹プラスミド（4μg）をPEIを用いて無血清培地中の293T細胞にトランスフェクトする。72時間後、培地を収集し、評価する。「対照」-導入遺伝子なしのプラスミド。全ての研究を4連で実行し、各プラスミドを4連で評価する。²ヒトカタラーゼおよびSOD3のレベルをELISAにより試験する;比色アッセイ（Thermo Fisher）によりカタラーゼ活性、比色アッセイ（Abcam）によりSOD3活性;ならびにヒト肺微小血管内皮およびヒト気道上皮に対するH₂O₂および

負荷）。³各アッセイを1（最悪、効果なし）から5（最良、4回の試行を平均する）でランク付けする。ランク数を足して6（最悪）から30（最良）の総スコアとする。

4つのAAVrh.10抗オキシダントベクター（hCatWL^-、hSOD3hd^-、hCatWL^-/hSOD3hd^-およびhSOD3hd^-/hCatWL^-）の発現カセットにより媒介される、分泌される機能的な改変型カタラーゼおよび/またはSOD3のインビトロでの発現のレベルを比較すること。データは、hCatWD^-（LEX 5a用の発現カセット）およびhSOD3hd^-（LEX 5b用の発現カセット）の両方は単量体を生成すること、ならびに両方はインビトロおよびインビボでそれぞれカタラーゼおよびSODを生成するように機能することを実証する。目的1の目標は、用量の関数として無血清培地中の293T細胞にプラスミド（hCatWD^-、hSOD2hd^-、hCatWD^-/hSOD3hd^-およびhSOD3hd^-/hCatWD^-）をトランスフェクトすることにより4つの発現カセットの比較試験を実行することである。72時間後に、結果として得られた上清を、（1）カタラーゼおよびSODレベル、（2）カタラーゼおよびSOD活性、ならびに（3）オキシダントストレス

からヒト微小血管内皮およびヒト気道上皮を保護する上清の能力について試験する。4つのプラスミドのインビトロでの評価を表IIに詳述されるようにランク付けする。

（表ＩＩ）4つの候補ベクターのインビボでの比較

^{1 1}対照-他のベクターと同一であるが、導入遺伝子を有しない;n=5の雄およびn=5の雌/群/時点。²静脈内投与。³表I、脚注²と類似、量の関数としての血清または肺上皮内壁液（ELF）を上清の代わりとする。⁴0、2、4、および12週における肝臓、肺、血清およびELFの評価。⁴統計に記載されるように、総ランク数はインビトロでの評価とインビボでの評価の組合せであり、インビボでのランクはインビトロでのランクの2倍の価値とする。

およびH ₂ O ₂ ストレスから肺内皮および上皮を保護することができる分泌される機能的な改変型カタラーゼおよび/またはSOD3を発現する4つのAAVrh.10抗オキシダントベクターの能力をインビボで定量化すること。目標は、LEX 5a、LEX 5b、LEX 5cおよびLEX 5dベクターをインビボで比較することである。AAVrh.10ベクター中の二重発現カセットを用いた以前の経験から（De et al.,2008;Wang et al.,2010;Watanabe et al.,2010;Mao et al.,2011;Rosenberg et al.,2012;Hicks et al.,2012;Xie et al.,2014;Hicks et al.,2015;Pagovich et al.,2016;Liu et al.,2016）、LEX 5aおよびLEX 5bは機能的であるので、LEX 5cおよびLEX 5dの設計が機能的でない理由はないが、LEX 5c対LEX 5dの発現カセットにおけるカタラーゼ対SOD3の相対発現において差異がある可能性がある。4つのベクターを比較するために、同じ用量10⁹、10¹⁰、および10¹¹ゲノムコピー）の静脈内投与をBalb/c雄および雌マウスにおいて比較する。0、2週、1か月および3か月において、以下のパラメーターを評価する:（1）肝臓および肺のベクターDNA、（2）肝臓および肺の発現カセットmRNA、（3）血清および肺上皮内壁液（ELF）中のカタラーゼおよびSODのレベルおよび活性、ならびに（4）治療されたマウスの血清をインビトロで

およびH₂O₂のストレスに対するヒト微小血管内皮の保護について試験し、ELFを同じオキシダントストレスに対するヒト気道上皮の保護について試験する。分泌されるタンパク質のAAVrh.10媒介性発現が3か月時に安定なままであれば、それは動物の生涯にわたり安定なままであるという広範なデータに基づいて、3か月の時点を最後の時点とする（Chiuchiolo et al.,2013;De et al.,2008;De et al.,2006）。Balb/cマウスの選択は、この系統はヒトタンパク質に対して免疫を生成することなくインビボでヒトタンパク質発現を忍容するという表現に基づく（Rosenberg et al.,2012）。何らかの免疫上の問題（発現の喪失により観察される）がある場合、これもまたAAVベクターにより発現されるヒト細胞遺伝子を忍容するC57Bl/6にマウス系統を切り替える（De et al.,2006）。インビボでの評価を表IIに詳述されるようにランク付けする。インビトロおよびインビボでのランクを組み合わせて全体的なランクを得る。

プラスミド発現カセットを6つの有効性アッセイによりランク付けし、同じアッセイを目的2において使用して血清および肺ELFを評価する。

カタラーゼレベル
ELISA（Abcam）。

SOD3レベル
ELISA（Biocompare）。

カタラーゼ活性
比色アッセイ（Thermo Fischer）。

SOD3活性
比色（Colormetric）アッセイ（Abcam）。

およびH₂O₂を用いた内皮負荷
ヒト微小血管内皮細胞（Lonza）を超酸化物（フェントン反応を化学的に使用する）またはH₂O₂を用いて負荷する。24時間および48時間に、細胞死（上清中の乳酸デヒドロゲナーゼレベル）、オキシダント応答（酸化ストレス遺伝子のmRNAレベルについての定量PCR。保護のために、細胞をプラスミド上清、血清またはELFを用いて前処理する。

およびH₂O₂を用いた上皮負荷
アッセイは内皮のものと同一であるが、ヒト気道上皮が内皮に取って代わる。空気-液体界面培養を用いてIV型コラーゲン上のヒト正常基底細胞から28日にわたりヒト上皮を誘導する。

AAVrh.10ベクターの製造
AAV2 Rep遺伝子、タンパク質VP1、VP2およびVP3（製造されるrh.10 AAVベクターの血清型を定義する）のためのAAVrh.10 Cap遺伝子、ならびにE2、E4およびVA RNAのアデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミドと共に発現プラスミドのヒト胎児腎臓293T細胞（HEK 293T;ATCC）への共トランスフェクションによりベクターを製造する（Collaco et al.,1999;Hicks et al.,2016）。ベクターをイオジキサノール勾配およびQHP陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。ベクターゲノム力価を定量的TaqManリアルタイムPCR分析により決定する（Mayginnes et al.,2006）。

動物モデル
ベクターをBalb/cマウスの尾静脈に3つの各用量（10⁹、10¹⁰、10¹¹）で静脈内投与する。全ての研究は各データ点においてn＝5の雄および5の雌マウスを用いて行う。光ファイバー気管支鏡検査および洗浄により得られる肺ELFは、ELFを回収するために使用される生理食塩水と実際のELFとの混合物である。回収されたELFの体積を尿素法を使用して定量化し（Rennard et al.,1985）、カタラーゼまたはSOD3のレベルをELF体積当たりのμMで表す。尾静脈出血による血清および肺ELFを0週（療法前）、2週、4週、12週時に評価する。屠殺時に肝臓および肺をベクターゲノムおよび遺伝子発現の分析のためにマウスから収集し、DNA/mRNA単離用の組織100mg当たり1mlのRNAlater（Qiagen）を含む標識された清潔な15mlコニカルチューブに移し、4℃で終夜貯蔵する。試料を4℃で10〜20分間ホモジナイズし、1つの試料を、導入遺伝子に特異的なプライマープローブセットを使用するリアルタイムPCRによる各DNAおよびmRNA分析のために使用する。

参考文献

全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。以上の明細書において本発明をそのある特定の好ましい態様に関して記載し、多くの詳細を実例の目的のために示してきたが、本発明は追加の態様を受け入れること、および本明細書に記載のある特定の詳細を本発明の基本原理から離れることなく大幅に変更してもよいことは当業者に明らかであろう。

Claims (43)

1. カタラーゼ活性を有するが四量体を形成しない改変型カタラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含む、遺伝子療法ベクター。
2. 分泌されるが細胞表面に結合しない改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1記載の遺伝子療法ベクター。
3. 分泌されるが細胞表面に結合しないまたは四量体を形成しない改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含む、遺伝子療法ベクター。
4. 改変型スーパーオキシドジスムターゼが改変型スーパーオキシドジスムターゼ-3である、請求項2または3記載の遺伝子療法ベクター。
5. 改変型スーパーオキシドジスムターゼがヘパリンに結合しない、請求項2、3または4記載の遺伝子療法ベクター。
6. カタラーゼ活性を有するが四量体を形成しない改変型カタラーゼをコードする核酸配列をさらに含む、請求項3または4記載の遺伝子療法ベクター。
7. 改変型カタラーゼが、スレッディングアームドメイン中のN末端に欠失を有し、該欠失が、1〜80または1〜80の任意の整数の欠失であってもよい、請求項1〜2または5のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
8. 改変型カタラーゼが、ラッピングループドメイン中に欠失を有し、該欠失が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25残基であってもよい、請求項1〜2、5または7のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
9. 改変型カタラーゼが、スレッディングアームドメインおよびラッピングループドメイン中に欠失を有する、請求項1〜2、5、7または8のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
10. 改変型カタラーゼが分泌配列を有する、請求項1〜2、5または7〜9のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
11. 改変型スーパーオキシドジスムターゼが、ヘパリン結合ドメイン中に欠失を有し、該欠失が、1〜15または20または25またはより多くの残基の欠失であってもよい、請求項2〜10のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
12. 改変型スーパーオキシドジスムターゼが、ターンまたはループドメインの1つまたは複数の残基の置換を有する、請求項2〜11のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
13. 改変型スーパーオキシドジスムターゼが、ターンまたはループドメインの1つまたは複数の残基の欠失および挿入を有する、請求項2〜12のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
14. ウイルスベクターである、請求項1〜13のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
15. アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである、請求項14記載の遺伝子療法ベクター。
16. AAVベクターがシュードタイプ化されている、請求項15記載の遺伝子療法ベクター。
17. AAVベクターが、AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2、またはAAV7キャプシドによりシュードタイプ化されている、請求項16記載の遺伝子療法ベクター。
18. AAVベクターが、AAVrh.10、AAV8、またはAAV5によりシュードタイプ化されている、請求項16記載の遺伝子療法ベクター。
19. AAVベクターが、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10である、請求項15記載の遺伝子療法ベクター。
20. 1つのベクターが、改変型カタラーゼおよび改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含み、カタラーゼ配列およびスーパーオキシドジスムターゼ配列が、プロテアーゼ基質配列により分離されている、請求項2〜19のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
21. 改変型カタラーゼが、改変型スーパーオキシドジスムターゼに対してN末端にある、請求項20記載の遺伝子療法ベクター。
22. 改変型カタラーゼが、改変型スーパーオキシドジスムターゼに対してC末端にある、請求項20記載の遺伝子療法ベクター。
23. 1つのベクターが、改変型カタラーゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含み、かつ、別のベクターが、改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸配列を含む発現カセットを含む、請求項2〜19のいずれか一項記載の遺伝子療法ベクター。
24. ある量の請求項1〜23のいずれか一項記載のベクターを含む、薬学的組成物。
25. ベクターがプラスミドである、請求項24記載の薬学的組成物。
26. ベクターがウイルスベクターである、請求項24記載の薬学的組成物。
27. ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである、請求項26記載の薬学的組成物。
28. ベクターがAAVベクターである、請求項27記載の薬学的組成物。
29. AAVベクターがシュードタイプ化されている、請求項27記載の薬学的組成物。
30. AAVベクターが、AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2、またはAAV7キャプシドによりシュードタイプ化されている、請求項29記載の薬学的組成物。
31. AAVベクターが、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAVrh.10である、請求項28記載の薬学的組成物。
32. ベクターの量が約1×10¹¹〜約1×10¹⁶ゲノムコピーである、請求項26〜31のいずれか一項記載の薬学的組成物。
33. ベクターの量が、約1×10¹²〜約1×10¹⁵ゲノムコピー、約1×10¹¹〜約1×10¹³ゲノムコピー、または約1×10¹³〜約1×10¹⁵ゲノムコピーである、請求項26〜32のいずれか一項記載の薬学的組成物。
34. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項24〜33のいずれか一項記載の薬学的組成物。
35. 改変型カタラーゼをコードするウイルスベクターと改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードする別のウイルスベクターとを含む、請求項26〜33のいずれか一項記載の薬学的組成物。
36. 哺乳動物において酸化的損傷を予防、阻害または治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項1〜23のいずれか一項記載のベクターまたは請求項24〜35のいずれか一項記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
37. 哺乳動物が、アテローム性動脈硬化症、がん、糖尿病、関節リウマチ、虚血後灌流傷害、心筋梗塞、心臓血管疾患、慢性炎症、卒中、敗血症性ショック、またはアルツハイマー病もしくはパーキンソン病などの他の変性性および神経学的疾患を有するかまたは有するリスクがある、請求項36記載の方法。
38. 哺乳動物においてCOPD、呼吸窮迫症候群または線維性間質性肺疾患を予防、阻害または治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に有効量の請求項1〜23のいずれか一項記載のベクターまたは請求項24〜35のいずれか一項記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
39. 哺乳動物がヒトである、請求項32〜34のいずれか一項記載の方法。
40. 改変型カタラーゼをコードするある量のウイルスベクターと改変型スーパーオキシドジスムターゼをコードするある量のウイルスベクターとが投与される、請求項36〜39のいずれか一項記載の方法。
41. ウイルスベクターが逐次的に投与される、請求項40記載の方法。
42. ウイルスベクターが同時に投与される、請求項40記載の方法。
43. 改変型カタラーゼと改変型スーパーオキシドジスムターゼとをコードするウイルスベクターが投与される、請求項36〜39のいずれか一項記載の方法。

Images