KR20210005612A - 산화성 스트레스에 대한 유전자 요법 - Google Patents

Abstract

항산화제 요법을 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

산화성 스트레스에 대한 유전자 요법

관련 출원에 대한 상호 참고

본 출원은 2018년 4월 3일에 출원된 미국 출원 번호 62/652,098의 출원일에 대한 이익을 주장하며, 그의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.

질환의 개시 또는 가속화를 수반하며 조직 손상의 일반적인 원인인 산화성 스트레스는 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐 장애, 예컨대 만성 폐쇄성 폐 질환 및 섬유성 폐 장애, 암, 당뇨병, 류마티스 관절염, 허혈후 관류 손상, 심근 경색, 심혈관 질환, 만성 염증, 졸중 및 패혈성 쇼크, 노화 및 다른 변성 및 신경계 질환 예컨대 알츠하이머 및 파킨슨의 공지된 위험 인자이며, 노화 과정에 기여한다 (Durackova, 2010; Mitscher et al., 1996).

산화제는 산업 오염물, 우주 방사선 및 담배 연기를 비롯한 환경적 공급원으로부터, 또는 호중구 및 단핵구 뿐만 아니라 해독 효소로부터의 호흡성 격발과 같은 정상 세포 기능으로부터 유래된다. 산화성 스트레스는 히드록실 및 슈퍼옥시드를 포함하는 유리 라디칼에 의해 매개되고, 이는 반응성 산소 종 (ROS)으로도 지칭되는 반응성 종, 예컨대 과산화수소를 발생시킨다. 이들 산화제는 지질, 단백질 및 DNA를 손상시키고, 이는 상기 기재된 수많은 병원성 결과를 매개하고, 수많은 연구는 항산화제 화합물이 아테롬성 동맥경화증, 암, 돌연변이 유발 및 염증에 대해 보호성일 수 있음을 입증하였다 (Mitscher et al., 1996; Uttara et al., 2009; Owen et al., 2000; Sala et al., 2002).

산화성 스트레스에 대한 자연적인 보호를 위해, 항산화제 단백질인 카탈라제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 각각 과산화수소 및 슈퍼옥시드의 중화를 촉매한다 (Mates et al., 1999; Birben et al., 2012). 이들 효소는 건강한 개체에서 정상적인 세포 과정에 의해 개시되는 산화성 스트레스에 대한 방어선을 나타내지만, 크기 또는 생리적 국소화로 인해 환경적 또는 과다-질환 상태로부터 유래된 산화제의 과도한 부담을 다루는 능력이 없다. 예를 들어, 카탈라제는 사량체성 세포내 단백질이며, 따라서 혈청에서도 그리고 외인성 ROS에 대한 제1 방어선으로서 작용할 수 있는 점막 표면 상에서도 발견되지 않는다 (Goyal et al., 2010). SOD는 3가지 형태, SOD1, SOD2 및 SOD3을 가지며, 각각 그들의 세포 위치인 세포질, 미토콘드리아 및 세포외 공간에 한정된다 (Perry et al., 2010). 카탈라제와 유사하게, SOD 효소는 혈청 또는 점막 표면에 존재하지 않는다. SOD3은 분비되지만, 세포 표면에 부착하는 헤파린-결합 도메인을 갖고 있으며, 따라서 세포 표면에 결합하지 않기에 충분한 수준에서 기관의 상피 표면을 가로질러 관류하여 점막 표면에 도달할 수가 없다 (Perry et al., 2010).

점막 표면을 비롯하여 병원성 세포외 산화성 스트레스에 대한 보호를 제공하는 분비된 항산화제 효소의 발현을 매개하는 유전자 요법 접근법이 제공된다. 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의한 장기간 발현은 단량체성의 분비된 기능적 카탈라제 및 변형된 세포외 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 cDNA에 의해 구축되었으며, 이들 둘 다 외인성 또는 부적절한 수준의 반응성 산소 종에 대한 최전선 방어를 제공한다. 이를 다루기 위해, 카탈라제 및 SOD3 둘 다의 서열을, 분비 및 확산을 용이하게 하고, 특히 SOD의 경우 세포 표면에 부착되지 않은 채로 유지되도록 변형시켰다. 한 실시양태에서, 카탈라제 및 SOD의 이들 분비된 형태에 대한 유전자 암호를 아데노 연관 바이러스 벡터에 통합시켜서, 산화제 종인 과산화수소 및 슈퍼옥시드에 의한 환경적 및 병원성 공격에 대한 장벽으로서 처리된 영역에서, 혈청에서 및 상피 및 점막 표면을 가로질러 이들 항산화제 효소의 지속적이고 일정한 수준을 제공한다. 분비된 단량체성 카탈라제를 구축하기 위한 전략은, 사량체 형성을 위해 필요한 세포내 부착 및 분비 신호전달 서열의 부가를 매개하는, 비교적 구조화되지 않은 영역을 제거한다. 보다 큰 사량체를 형성하도록 단량체들을 SOD3 서열의 세그먼트와 결속시키는 루프를 대체하기 위해 SOD3을 변형시켰고, 헤파린 결합 도메인이 세포외 매트릭스에 부착하는 능력을 제거하였다. 변형된 카탈라제 및 SOD3 둘 다는 혈청으로 방출되어 기능을 유지하는 것으로 제시되었다. 한 실시양태에서, 상기 2가지 항산화제 효소는 별도의 벡터에 전달될 수 있다. 한 실시양태에서, 벡터는 AAV 벡터의 임의의 혈청형을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 벡터 또는 다른 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 임의의 발현 카세트를 사용할 수 있고, 카탈라제 및 SOD3에 대한 단백질 서열에 대해 상이한 변형이 이루어질 수 있다.

벡터의 투여는 예를 들어 방사선 또는 화학적 노출의 결과로서 환경적으로 유래된 산화성 스트레스 공격, 예컨대 핵 공격 또는 가스 (테러) 공격, 궐련 또는 다른 담배 사용, 예컨대 전자 담배 또는 베이핑, 또는 시가 연기 노출, 또는 염증 반응으로부터의 부적절한 내인성 ROS에 대한 보호를 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 벡터를 아테롬성 동맥경화증, 암, 당뇨병, 류마티스 관절염, 허혈후 관류 손상, 심근 경색, 심혈관 질환, 만성 염증, 졸중 및 패혈성 쇼크, 노화 및 다른 변성 및 신경계 질환 예컨대 알츠하이머 및 파킨슨을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 장애, 및 노화 과정에 대한 기여를 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하기 위한 방법에서 사용할 수 있다.

한 실시양태에서, 카탈라제 활성을 갖지만 사량체를 형성하지 않는 변형된 카탈라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 카탈라제는 서열식별번호(SEQ ID No): 1, 5-7 또는 12 중 하나와 적어도 80%, 82%, 84%, 85%, 87%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96% 98%, 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 분비되지만 세포 표면에 결합하지 않는 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 임의적으로 사량체를 형성하지 않는다. 한 실시양태에서, 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 서열식별번호: 2-4, 8 또는 10 중 하나와 적어도 80%, 82%, 84%, 85%, 87%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96% 98%, 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 분비되지만 세포 표면에 결합하지 않는 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제-3이다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 헤파린에 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 사량체를 형성하지 않는다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 스레딩 아암 도메인 내 N-말단에서 결실을 가지며, 상기 결실은 1 내지 80개 또는 그 초과의 잔기, 또는 1 내지 80개 사이의 임의의 정수의 것일 수 있으며, 예를 들어, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75개 잔기의 결실이다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 N-말단에서 결실을 가지며, 예를 들어, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 잔기의 결실이다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 N-말단에서 결실을 가지며, 상기 결실은, 예를 들어, 15개 또는 20개 또는 20 내지 25개 잔기의 결실이다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 랩핑 루프 도메인에서 결실을 가지며, 상기 결실은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 잔기일 수 있다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 랩핑 루프 도메인에서 결실을 가지며, 상기 결실은 15 내지 20개 또는 20 내지 25개 잔기일 수 있다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 랩핑 루프 도메인에서 결실을 가지며, 상기 결실은 카탈라제에서 위치 379, 380, 381, 382 383, 384 또는 385 내지 약 위치 398, 399, 400, 401, 402 또는 403, 예를 들어, 위치 381 내지 400일 수 있다 (도 2 참고). 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 스레딩 아암 및 랩핑 루프 도메인에서 결실을 갖는다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 분비 서열, 예를 들어, 이종성 분비 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 헤파린 결합 도메인에서 결실을 가지며, 상기 루프 잔기에서의 결실은 1 내지 15개 또는 20개 또는 25개 또는 그 초과의 잔기, 또는 1 내지 15개 사이의 임의의 정수의 것일 수 있고, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23 또는 25개 잔기의 결실일 수 있다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 턴 또는 루프 도메인의 1개 이상의 잔기의 대체, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23, 25개 또는 그 초과의 잔기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23, 25개 또는 그 초과의 잔기로의 대체를 갖는다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 턴 또는 루프 도메인의 1개 이상의 잔기의 대체, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 잔기의 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 잔기로의 대체를 갖는다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는, 예를 들어, 슈퍼옥시드 디스뮤타제에서의 위치 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53 내지 위치 56, 57, 58, 59, 60, 61 또는 62에서 턴 또는 루프 도메인의 잔기의 위치 66, 67, 68, 69, 70 또는 71 내지 위치 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 또는 79, 또는 위치 70, 71, 72, 73, 74 또는 75 내지 위치 77, 78, 79, 80, 81, 82 또는 83의 잔기로의 대체를 갖는다 (도 3 참고). 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 턴 또는 루프 도메인의 1개 이상의 잔기의 결실 및 삽입, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23, 25개 또는 그 초과의 잔기의 결실을 갖는다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 헤파린 결합 도메인의 1개 이상의 잔기의 결실, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23, 25개 또는 그 초과의 잔기의 대체를 갖는다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는 헤파린 결합 도메인의 1개 이상의 잔기의 결실, 예를 들어, 10 내지 30개, 예를 들어, 18, 19, 20, 21 또는 22개 잔기의 결실, 또는 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 잔기의 결실을 갖는다. 한 실시양태에서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제는, 예를 들어, 슈퍼옥시드 디스뮤타제에서의 위치 209, 210, 211, 212, 213, 214 또는 215 내지 위치 235, 236, 237, 238, 239 또는 240에서, 또는 위치 217, 218, 219, 220, 221, 222, 또는 223 내지 위치 235, 236, 237, 238, 239 또는 240에서 헤파린 결합 도메인의 결실을 갖는다.

한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10이다. 한 실시양태에서, 1개의 벡터는 변형된 카탈라제 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하며, 카탈라제 서열 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제 서열은 프로테아제 기질 서열에 의해 분리된다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제에 대해 N-말단에 있다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제는 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제에 대해 C-말단에 있다. 한 실시양태에서, 1개의 벡터는 변형된 카탈라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 또 다른 벡터는 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

벡터의 소정량을 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 상에 있다. 한 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 슈도타이핑된다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 또는 AAV7 캡시드에 의해 슈도타이핑된다. 한 실시양태에서, 벡터의 AAV 게놈은 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10이다. 한 실시양태에서, 벡터의 양은 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹⁶ 게놈 카피이다. 한 실시양태에서, 벡터의 양은 약 1 x 10¹² 내지 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피, 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹³ 게놈 카피, 또는 약 1 x 10¹³ 내지 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피이다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 변형된 카탈라제를 코딩하는 바이러스 벡터 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 또 다른 바이러스 벡터를 포함한다.

포유동물에게 벡터 또는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 산화성 손상을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는 방법이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 포유동물은 아테롬성 동맥경화증, 암, 당뇨병, 류마티스 관절염, 허혈후 관류 손상, 심근 경색, 심혈관 질환, 만성 염증, 졸중, 패혈성 쇼크, 또는 다른 변성 및 신경계 질환 예컨대 알츠하이머 질환 또는 파킨슨 질환을 갖고 있거나 또는 가질 위험이 있다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제를 코딩하는 바이러스 벡터의 소정량 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 바이러스 벡터의 소정량이 투여된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 순차적으로 투여된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 공동으로 투여된다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 바이러스 벡터가 투여된다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 또는 AAV7 캡시드이다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8 또는 AAV5이다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10이다. 바이러스 벡터의 용량은 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹⁶ 게놈 카피, 약 1 x 10¹² 내지 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피, 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹³ 게놈 카피, 또는 약 1 x 10¹³ 내지 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피일 수 있다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 또는 AAV7 캡시드에 의해 슈도타이핑된다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8 또는 AAV5에 의해 슈도타이핑된다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10이다.

COPD, 호흡 곤란 증후군 또는 섬유성 간질성 폐 질환의 예방, 억제 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 벡터 또는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 COPD, 호흡 곤란 증후군 또는 섬유성 간질성 폐 질환을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제를 코딩하는 바이러스 벡터의 소정량 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 바이러스 벡터의 소정량이 투여된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 순차적으로 투여된다. 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 공동으로 투여된다. 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 바이러스 벡터가 투여된다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 또는 AAV7 캡시드이다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8 또는 AAV5이다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10이다. 바이러스 벡터의 용량은 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹⁶ 게놈 카피, 약 1 x 10¹² 내지 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피, 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹³ 게놈 카피, 또는 약 1 x 10¹³ 내지 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피일 수 있다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 또는 AAV7 캡시드에 의해 슈도타이핑된다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.10, AAV8 또는 AAV5에 의해 슈도타이핑된다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10이다.

도 1A-B. 폐의 산화제 부담 및 항산화제 방어. A) 폐는 흡입된 산화제에 의해 및 COPD에서는 활성화된 염증 세포로부터의 내인성 세포외 산화제에 의해 스트레스를 받는다. B) 폐 세포는 3가지 주요 효소 항산화제 방어: SOD (O₂ ^·-에서 H₂O₂로 촉매함); 카탈라제 (H₂O₂에서 H₂O로) 및 글루타티온 (GSH; H₂O₂에서 H₂O로; 산화된 GSH는 GSSG를 형성하고, 이는 다중 세포내 효소에 의해 환원됨)를 갖는다. 이들 효소 시스템 중 어느 것도 적절한 세포외 항산화제 방어를 제공하지 못한다.
도 2A-B. 기능적 세포외 단량체를 생성하기 위한 카탈라제의 변형. A) 인간 카탈라제 단량체 구조. B) 인간 카탈라제 단량체 아미노산 서열 (서열식별번호: 1). N-말단 및 랩핑 루프 도메인에 대해 변형이 이루어진 영역이 도시된다. 3가지 전략이 이용되었다: hCatNT^- (N-말단으로부터 20개 아미노산 결실), hCatWL^- (랩핑 루프 도메인으로부터 20개 아미노산 결실) 및 hCat^-NT^-WL^- (2가지 결실의 조합). 분비를 지시하기 위해, 5' 신호 펩티드를 부가하고; 단백질을 검출하기 위해, 3' 헤마글루티닌 (HA) 태그를 부가하였다.
도 3A-B. 기능적 세포외 SOD3 단량체를 생성하기 위한 변형. A) SOD3 단량체 구조. B) 인간 SOD3 아미노산 서열 (서열식별번호: 8). 변형의 세부사항과 함께 변형이 이루어진 영역이 도시된다.
도 4. 유전자 요법-기반의 세포외 확산가능한 효소적 항산화제 벡터인 LEX 5는 4가지 후보 유전자 이동 벡터 (LEX 5a, b, c 및 d) 중 하나였다. 모든 후보는 동일한 발현 카세트를 갖고, 단지 항산화제 효소 코딩 서열에서만 차이가 있다. 모두 AAVrh.10 캡시드에 팩키징되어 4가지 후보 벡터를 생성한다.
도 5A-C. 변형된 카탈라제 구축물의 평가. A) 변형된 카탈라제 구축물의 분비. 3가지 변형된 카탈라제 구축물에 의해 형질감염된 293T 세포의 상청액의 웨스턴 (SDS 환원 겔; 항-HA 태그). 레인 1 - 모의; 레인 2 - hCatNT^- 구축물; 레인 3 - hCATWL^-; 레인 4 - hCATNT^-WL^-; 및 레인 5 - 카탈라제 대조군. B) 3가지 구축물에 의해 생성된 상청액의 카탈라제 활성의 분석. 3종 모두가 분비되지만, 단지 hCatWL^-가 활성이었다. C) hCatND^- 구축물이 단량체임을 입증하기 위해 비스 트리스(Bis Tris) 겔에서 hCatWD^- 구축물로부터의 상청액의 분석.
도 6A-B. 변형된 SOD3 구축물. A) 변형된 SOD3 구축물의 분비. 레인 1 - 모의; 레인 2 - 변형되지 않은 HA 태그 부착된 SOD3; 레인 3 - SOD3hd^-에 의해 형질감염된 293T 세포의 상청액의 웨스턴 (항-HA 태그). 단지 SOD3hd^-가 상청액 중에 있다. B) SOD3hd^- 구축물이 단량체임을 입증하기 위해, SOD3hd^- 상청액으로부터의 분획의 항-HA 웨스턴을 세파크릴 사이징 칼럼 구축물에 대해 작동시킨다. 대략적인 MW는 칼럼 사양으로부터 계산된다.
도 7A-F. 생체내 LEX 5a 및 LEX 5b의 기능의 평가. AAVrh.10hCatWD^- (LEX 5a) 또는 AAVrh.10hSOD3hd^- (LEX 5b)를 수컷 Balb/c 마우스 (10¹¹ 게놈 카피 총 용량)에게 정맥내로 투여하였다. 2주 후에, 간 및 폐를 벡터 DNA를 위해 샘플링하고, 혈청을 카탈라제 및 SOD 활성에 대해 평가하였다. A-C) LEX 5a. A) 간 벡터 DNA; B) 폐 벡터 DNA; 및 C) 혈청 카탈라제 활성. D-F) LEX 5b. D) 간 벡터 DNA; E) 폐 벡터 DNA; 및 F) 혈청 SOD 활성.
도 8. 카탈라제 구조. 각각의 단량체는 4개의 도메인을 갖는다. 첫번째 도메인에서, 아미노-말단 잔기는 단량체 단위들을 함께 결합시키는 인터록킹 아암 교환을 위한 것들을 포함한다. 두번째 도메인은 헴 도메인이다. 세번째 도메인은 랩핑 루프 도메인이며, 4개의 단량체가 서로의 주변을 둘러싸서 사량체를 형성하고; 염 가교, 및 양으로 및 음으로 하전된 아미노산 측쇄 사이의 이온 상호작용은 4개의 단량체를 함께 유지시킨다. 네번째 도메인은 촉매적 분해를 위해 유입되는 H₂O₂ 기질을 배향시키는 역할을 하는 카르복시-말단 잔기를 포함한다.
도 9. 카탈라제 사량체 형성을 억제하기 위한 유전자 변형. 단량체 형성을 방지하기 위해, 리딩 프레임은 유지하면서 N-말단 스레딩 아암 및/또는 랩핑 루프 도메인에 있는 아미노산 잔기를 결실시키고, 이는 NADPH 결합 및 효소 기능을 변형시키지 않는 것을 보장한다.
도 10. 변형된 카탈라제 서열.
도 11. 사량체 카탈라제의 시험관내 특징분석. 분비 신호에도 불구하고, 야생형 카탈라제가 세포에 남아있다 (웨스턴 분석은 분석을 위해 사량체를 단량체 단위로 분해함).
도 12. 변형된 카탈라제 구축물의 시험관내 특징분석.
도 13A-B. 변형된 카탈라제 구축물의 시험관내 특징분석. A) 웨스턴 블롯. B) 상청액 중에서 카탈라제 활성.
도 14. 단량체성 및 다량체성 카탈라제 분리를 위한 카탈라제 구축물의 상청액의 평가. 샘플을 비스-트리스 겔 상에서 평가하고, 블롯팅하고, 항-카탈라제 항체 (ABCAM: ab88067)로 프로빙하고; 단량체의 경우 60 kDa 및 사량체의 경우 240 kDa에서 밴드 크기를 예측하였다. 3가지 모든 구축물은 단지 단량체성 구축물만을 분비하였다.
도 15. 단량체성 및 다량체성 카탈라제에 대한 구축물에 의한 카탈라제 활성에 대해 상청액의 시험관내 평가. 단량체성 구축물은 카탈라제 활성을 갖는 단백질을 발현한다.
도 16A-B. 변형된 랩핑 도메인을 갖는 인간 카탈라제 (hCatWL^-)를 코딩하는 AAVrh.10에 의한 인간 카탈라제 발현의 생체내 평가. A) 실험 설계. B) 간에서 벡터 카피 수.
도 17A-B. 변형된 랩핑 루프 도메인을 갖는 인간 카탈라제 (hCatWL^-)를 코딩하는 아데노-연관 바이러스 혈청형 rh.10에 의해 매개되는 생체내 카탈라제 활성의 장기 시간 경과. A) 벡터 설계. B) 실험 설계.
도 18. 랩핑 루프 도메인 변형된 인간 카탈라제 (hCatWL^-)를 코딩하는 아데노-연관 바이러스 혈청형 rh.10에 의해 매개되는 생체내 카탈라제 활성의 장기 시간 경과. 2주 내지 12주째에 하기 처리 그룹으로부터의 수컷 C57bl/6J 마우스의 혈청에서 카탈라제 활성. PBS (n = 4). AAVrh.10hCATWL^- (4주째까지 n = 5, 1마리의 마우스를 4주째에 희생시킨 다음, 8주째에 또 다른 마우스를 희생시켰음). hCatWL^- (랩핑 루프 도메인으로부터 20 AA 결실 및 HA 태그).
도 19A-B. 슈퍼옥시드 디스뮤타제 3. A) 단백질 구조. B) 결정학적 구조.
도 20. 세포외 이용가능성을 증강시키기 위한 변형된 SOD3. 세포외 확산을 증강시기 위해, 헤파린-결합 도메인에서 "턴" 잔기를 변형시킨다.
도 21. hSOD3hd^-의 시험관내 평가.
도 22. SOD3hd^-에 의해 발현된 상청액 중 SOD3의 단량체 및 다량체 형태의 분석. 크기 배제 칼럼으로부터의 분획을 비스-트리스 겔 상에서 작동시켰다. 항-HA 항체에 의한 웨스턴 검정; 단량체 MW 30 kDa는 레인 2-5에 대한 분획에서 예상된다.
도 23A-B. IV 투여 이후 간 및 폐에서 SOD3hd^- gDNA 정량화. A) 간에서 DNA 정량화. B) 폐에서 DNA 정량화.
도 24. 혈청에서 변형된 SOD3 활성 (2주째).
도 25. 산화제 노출된 큰 기도 상피 세포의 변형된 SOD3 및 카탈라제에 의해 매개된 시험관내 항산화제 보호. 데이터는 크산틴 옥시다제 및 담배 연기 추출물 (CSE)로부터 유래된 산화제로부터 인간 큰 기도 상피 세포를 보호하기 위해 변형된 SOD3 및 카탈라제의 항산화제 성질을 제시한다.
도 26A-B. 산화제 노출된 큰 기도 상피 세포의 변형된 SOD3 및 카탈라제에 의해 매개된 시험관내 항산화제 보호. LDH 검정은 세포 사멸을 측정하고, 보다 낮은 LDH는 산화제-유도된 세포 사멸로부터의 보호를 나타낸다. 변형된 SOD3은 담배 연기 추출물 및 크산틴 옥시다제 유래된 산화제에 대해 증강된 보호를 제공한다 (CSE 또는 크산틴 옥시다제 노출로부터 감소된 LDH 활성). 변형된 SOD3 및 변형된 카탈라제 둘 다 변형되지 않은 SOD3 및 카탈라제와 비교하여 크산틴 옥시다제 노출에 대해 보다 양호한 보호를 제공한다.
도 27. 2가지 구축물의 개략도.

하기 설명에서는, 본 발명의 일부를 형성하고, 실시될 수 있는 구체적인 실시양태를 예시적으로 제시하는 첨부된 도면을 참고한다. 이들 실시양태는 관련 기술분야의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있게 상세하게 기재되며, 다른 실시양태가 이용될 수 있고 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 타당한 변화가 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 예시적인 실시양태의 하기 설명은 제한된 측면을 취하지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 정의된다.

요약서는 독자가 기술적 개시내용의 특성 및 요지를 신속하게 확인할 수 있도록 37 C.F.R. §1.72(b)를 준수하여 제공된다. 요약서는 청구항의 범위 또는 의미를 해석하거나 제한하는데 이용되지 않을 것이라는 이해에 따라 제출된다.

정의

"벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그와 회합하고, 세포로 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개하기 위해 사용될 수 있는 거대 분자 또는 거대 분자의 회합을 지칭한다. 예시적인 벡터에는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 및 다른 유전자 전달 비히클이 포함된다. 때때로 "표적 폴리뉴클레오티드" 또는 "트랜스진"으로 지칭되는 전달될 폴리뉴클레오티드는 유전자 요법에서 관심 코딩 서열 (예컨대, 관심 치료 단백질을 코딩하는 유전자), 백신 개발에서의 관심 코딩 서열 (예컨대, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는데 적합한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드), 및/또는 선택가능한 또는 검출가능한 마커를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 "형질도입", "형질감염", "형질전환" 또는 "형질도입하는"은 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시켜, 세포에서 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 트랜스진을 발현하는 과정을 지칭하는 용어이며, 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키기 위해 재조합 바이러스를 사용하는 것을 포함한다. 세포에서 폴리뉴클레오티드의 형질도입, 형질감염 또는 형질전환은 단백질 발현 (예컨대 정상 상태 수준), 예를 들어, ELISA, 유세포 분석 및 웨스턴 블롯, 이종화 검정에 의한 DNA 및 RNA의 측정, 예를 들어, 노던 블롯, 써던 블롯 및 겔 변화 이동성 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입을 위해 사용되는 방법에는 널리 공지된 기술, 예컨대 바이러스 감염 또는 형질감염, 리포펙션, 형질전환 및 전기천공, 뿐만 아니라 다른 비-바이러스 유전자 전달 기술이 포함된다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 안정하게 또는 일시적으로 유지될 수 있다.

"유전자 전달"은 유전자 이동을 위해 세포에 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 것을 지칭하며, 표적화, 결합, 흡수, 수송, 국지화, 레플리콘 통합 및 발현을 포괄할 수 있다.

"유전자 이동"은 표적화, 결합, 흡수, 수송, 국지화 및 레플리콘 통합을 포괄할 수 있는, 외인성 폴리뉴클레오티드의 세포로의 도입을 지칭하지만, 유전자의 후속적인 발현과는 구별되며 이를 의미하지는 않는다.

"유전자 발현" 또는 "발현"은 유전자 전사, 번역, 및 번역후 변형의 과정을 지칭한다.

"감염성" 바이러스 또는 바이러스 입자는 바이러스 종이 영양성인 세포에 전달할 수 있는 폴리뉴클레오티드 성분을 포함하는 것이다. 상기 용어가 반드시 바이러스의 임의의 복제 능력을 의미하는 것은 아니다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이를 갖는 뉴클레오티드의 중합체 형태, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 또는 캡핑된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조체에 대한 변형은 중합체의 조립 이전에 또는 이후에 부여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 상호교환적으로 이중- 및 단일-가닥 분자를 지칭한다. 달리 명시되거나 필요하지 않다면, 폴리뉴클레오티드에 대해 본원에 기재된 임의의 실시양태는 이중-가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 2개의 상보성 단일-가닥 형태 각각을 둘 다 포괄한다.

"단리된" 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 폴리펩티드 또는 다른 물질은, 물질 또는 유사한 물질이 천연 발생하거나 또는 처음에 제조되는 곳에 또한 존재할 수 있는 적어도 일부의 다른 성분이 없는 물질의 제제를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 물질은 공급원 혼합물로부터 농축시키기 위한 정제 기술을 이용함으로써 제조될 수 있다. 단리된 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드는 천연에서 발견되는 것과는 상이한 형태 또는 상태로 존재한다. 예를 들어, 주어진 DNA 서열 (예를 들어, 유전자)은 인접 유전자에 근접하여 숙주 세포 염색체에서 발견되고; RNA 서열, 예컨대 특이적인 단백질을 코딩하는 특이적인 mRNA 서열은 여러 단백질을 코딩하는 수많은 다른 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견된다. 단리된 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태로 존재할 수 있다. 단백질을 발현하기 위해 단리된 핵산 분자를 사용할 때, 분자는 센스 또는 코딩 가닥을 최소한으로 함유할 것이지만 (즉, 분자가 단일-가닥일 수 있음), 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 함유할 수 있다 (즉, 분자는 이중-가닥일 수 있음). 농축은 절대 기준으로, 예컨대 용액의 부피당 중량으로 측정될 수 있거나, 또는 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적인 간섭 물질과 관련하여 측정될 수 있다. 본 발명의 실시양태의 농축 증가가 구상된다. 따라서, 예를 들어, 2배 농축, 10배 농축, 100배 농축, 또는 1000배 농축이다.

"전사 조절 서열"은 작동가능하게 연결된 유전자 또는 코딩 서열의 전사를 제어하는 게놈 영역을 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 전사 조절 서열은 일반적으로 적어도 1개의 전사 프로모터를 포함하고, 전사의 1개 이상의 인핸서 및/또는 종결인자 또한 포함할 수 있다.

"작동가능하게 연결된"은 2종 이상의 성분의 배열을 지칭하며, 이렇게 기재된 성분들은 그들이 조정된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계를 갖는다. 예를 들어, TRS 또는 프로모터가 코딩 서열의 전사를 촉진시키는 경우, 전사 조절 서열 또는 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된 TRS는 일반적으로 코딩 서열과 시스로 연결되지만, 반드시 그에 직접적으로 인접하지는 않는다.

"이종성"은 비교되는 개체와 유전자형에 있어서 구별되는 개체로부터 유래되는 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자 조작 기술에 의해 상이한 세포 유형에 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드이다 (그리고, 발현될 때, 이종성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다). 유사하게, 그의 본래의 코딩 서열로부터 제거되고 상이한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소, 예컨대 프로모터는 이종성 전사 조절 요소이다.

"종결인자"는 리드-스루 전사를 감소시키거나 또는 방지하는 경향이 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다 (즉, 이는 종결인자의 한 쪽에서 유래하는 전사가 종결인자의 다른 쪽을 통해 계속되는 것을 감소시키거나 또는 방지함). 전사를 방해하는 정도는 전형적으로 종결인자 서열의 염기 서열 및/또는 길이의 함수이다. 특히, 수많은 분자 생물학 시스템에서 널리 공지된 바와 같이, 일반적으로 "전사 종결 서열"로 지칭되는 특정한 DNA 서열은 RNA 폴리머라제에 의해, 아마도 RNA 폴리머라제 분자가 DNA 전사를 중단시키고/거나 그로부터 분리되게 함으로써, 리드-스루 전사를 방해하는 경향이 있는 특정한 서열이다. 이러한 서열-특이적인 종결인자의 전형적인 예에는 폴리아데닐화 ("폴리A") 서열, 예를 들어, SV40 폴리A가 포함된다. 이러한 서열-특이적인 종결인자에 대해 추가로 또는 그를 대신하여, 프로모터와 코딩 영역 사이에 비교적 긴 DNA 서열의 삽입 또한 일반적으로 개재 서열의 길이에 비례하여 코딩 영역의 전사를 방해하는 경향이 있다. 이 효과는 아마도 항상 RNA 폴리머라제 분자가 전사될 DNA로부터 분리되는 경향이 다소 있기 때문에 발생하며, 코딩 영역에 도달하기 전에 횡단하는 서열의 길이가 증가하면 일반적으로 코딩 영역의 전사가 완료되기 전에 또는 가능하게는 심지어 개시되기 전에 분리가 발생할 가능성이 증가할 것이다. 따라서, 종결인자는 단지 한 방향으로만 ("단방향" 종결인자) 또는 두 방향 모두로 ("양방향" 종결인자) 전사를 방지할 수 있고, 서열-특이적인 종결 서열 또는 서열-비-특이적인 종결인자 또는 이들 둘 다로 구성될 수 있다. 이러한 다양한 종결인자 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 문맥 내에서 이러한 서열의 예시적인 사용이 하기에 제공된다.

"숙주 세포", "세포주", "세포 배양물", "팩키징 세포주" 및 다른 이러한 용어는, 예를 들어, 재조합 바이러스 또는 재조합 융합 폴리펩티드를 생산하기 위해 본 발명에서 유용한 보다 고급의 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포를 지칭한다. 이들 세포에는 전사된 원래 세포의 자손이 포함된다. 단일 세포의 자손이 원래의 모 세포와 반드시 (형태학적으로 또는 게놈 성분에 있어서) 완전히 동일할 필요가 없을 수 있음을 이해한다.

"재조합"은, 폴리뉴클레오티드에 적용될 때, 폴리뉴클레오티드가 천연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드와 구별되는 구축물을 생성하는 클로닝, 제한 및/또는 라이게이션 단계 및 다른 과정의 다양한 조합으로부터의 산물임을 의미한다. 재조합 바이러스는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자이다. 상기 용어들은 각각 원래의 폴리뉴클레오티드 구축물의 복제물 및 원래의 바이러스 구축물의 자손을 포함한다.

"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 폴리뉴클레오티드의 복제, 복사, 전사, 스플라이싱, 번역 또는 분해를 비롯하여 폴리뉴클레오티드의 기능적 조절에 기여하는 분자의 상호작용에 수반되는 뉴클레오티드 서열이다. 조절은 상기 과정의 빈도, 속도 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있고, 본질적으로 증강시키거나 또는 억제할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 조절 요소에는, 예를 들어, 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서가 포함된다. 프로모터는 특정한 조건 하에 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고, 보통 프로모터로부터 (3' 방향에서) 하류에 위치하는 코딩 영역의 전사를 개시할 수 있는 DNA 영역이다. 프로모터에는 AAV 프로모터, 예를 들어, P5, P19, P40 및 AAV ITR 프로모터, 뿐만 아니라 이종성 프로모터가 포함된다.

"발현 벡터"는 관심 유전자 산물을 코딩하는 영역을 포함하는 벡터이고, 의도된 표적 세포에서 유전자 산물을 발현하기 위해 사용된다. 발현 벡터는 또한 표적에서 단백질의 발현을 용이하게 하기 위해 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. 발현을 위해 작동가능하게 연결된 조절 요소 및 유전자 또는 유전자들의 조합물은 때때로 "발현 카세트"로 지칭되고, 이들 중 다수는 관련 기술분야에 공지되어 있고 이용가능하거나, 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 성분들로부터 용이하게 구축될 수 있다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 변형된, 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 아세틸화, 포스포닐화, 지질화, 또는 표지 성분과의 접합을 갖는 아미노산 중합체를 포괄한다.

용어 "외인성"은, 세포 또는 유기체에서 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 인공적인 또는 자연적인 수단에 의해 세포 또는 유기체에 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포로부터의 것일 수 있거나, 또는 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가의 카피일 수 있다. 비제한적인 예로서, 외인성 핵산은 천연 세포의 것과 상이한 염색체 영역에 있거나, 또는 천연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열, 예를 들어, 한 유전자로부터의 프로모터를 상이한 유전자로부터의 유전자 산물에 대한 오픈 리딩 프레임에 연결시키는 발현 카세트에 의해 달리 플랭킹된다.

"형질전환된" 또는 "트랜스제닉"은 적어도 하나의 재조합 DNA 서열의 존재에 의해 변경되었거나 또는 증대된 임의의 숙주 세포 또는 세포주를 포함시키기 위해 본원에서 사용된다. 본 발명의 숙주 세포는 전형적으로 단리된 선형 DNA 서열로서 플라스미드 발현 벡터에서 DNA 서열에 의한 형질감염에 의해, 또는 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염에 의해 생산된다.

용어 "서열 상동성"은 두 핵산 서열 사이의 염기 매칭 비율 또는 두 아미노산 서열 사이의 아미노산 매칭 비율을 의미한다. 서열 상동성이 백분율, 예를 들어, 50%로 표현되는 경우, 상기 백분율은 일부 다른 서열과 비교하여 선택된 서열의 길이에 걸친 매칭의 비율을 나타낸다. 매칭을 최대화하기 위해 (두 서열 중 하나에) 갭이 허용되며; 15개 염기 이하의 갭 길이가 일반적으로 이용되고, 6개 염기 이하, 예를 들어, 2개 염기 이하가 사용된다. 프로브 또는 처리로서 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 표적 핵산과 올리고뉴클레오티드 서열 사이의 서열 상동성은 일반적으로 20개의 가능한 올리고뉴클레오티드 염기쌍 매칭 중 17개 이상의 표적 염기 매칭 (85%); 10개의 가능한 염기쌍 매칭 중 9개 이상의 매칭 (90%), 또는 20개의 가능한 염기쌍 매칭 중 19개 이상의 매칭 (95%)이다.

두 아미노산 서열 사이에 부분적인 또는 완전한 동일성이 있는 경우, 이들의 서열은 상동성이다. 예를 들어, 85% 상동성은 두 서열을 최대 매칭을 위해 정렬시킬 때 아미노산의 85%가 동일하다는 것을 의미한다. 매칭을 최대화하기 위해 (매칭되는 두 서열 중 하나에) 갭이 허용되며; 갭 길이는 5개 이하 또는 2개 이하이다. 대안적으로, 두 단백질 서열 (또는 적어도 30개 아미노산 길이인 것들로부터 유래된 폴리펩티드 서열)은, 상기 용어가 본원에서 사용된 바와 같이, 돌연변이 데이터 매트릭스 및 6 이상의 갭 패널티를 갖는 프로그램 ALIGN을 사용하여 5 초과의 정렬 점수 (표준 편차 단위)를 갖는 경우에, 이들은 상동성이다. 두 서열 또는 그들의 일부분은 그들의 아미노산이 ALIGN 프로그램을 이용하여 최적으로 정렬될 때 50% 이상 동일하면 더욱 상동성이다.

용어 "에 상응한다"는 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열 모두 또는 그의 일부분과 구조적으로 관련이 있거나, 또는 폴리펩티드 서열이 기준 폴리펩티드 서열 모두 또는 그의 일부분과 구조적으로 관련이 있음을 의미하기 위해 본원에서 사용되며, 예를 들어, 이들은 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과, 예를 들어, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 반대로, 용어 "에 대해 상보적인"은 상보성 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열 모두 또는 그의 일부분과 상동성임을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 기준 서열 "TATAC"에 상응하고, 기준 서열 "GTATA"에 대해 상보적이다.

용어 "서열 동일성"은 두 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 범위에 걸쳐 동일하다는 (즉, 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 기준으로) 것을 의미한다. 용어 "서열 동일성 백분율"은 두 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 범위에 걸쳐 동일하다는 (즉, 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 기준으로) 것을 의미한다. 용어 "서열 동일성 백분율"은 비교 범위에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 핵산 염기 (예를 들어, A, T, C, G, U, 또는 I)가 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 수득하고, 매칭된 위치의 수를 비교 범위에서 위치의 총 수 (즉, 범위 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 수득함으로써 계산된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적인 동일성"은 폴리뉴클레오티드 서열의 특징을 나타내며, 폴리뉴클레오티드는 적어도 20개 뉴클레오티드 위치의 비교 범위에 걸쳐, 빈번하게는 적어도 20-50개 뉴클레오티드의 범위에 걸쳐 기준 서열과 비교할 때 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 90 내지 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 서열 동일성 백분율은 기준 서열을 비교 범위에 걸쳐 총 20% 이하인 결실 또는 부가를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열과 비교함으로써 계산된다.

"보존적" 아미노산 치환은, 예를 들어, 극성 산성 아미노산으로서 아스파르트산-글루탐산; 극성 염기성 아미노산으로서 리신/아르기닌/히스티딘; 비극성 또는 소수성 아미노산으로서 류신/이소류신/메티오닌/발린/알라닌/글리신/프롤린; 극성 또는 비하전 친수성 아미노산으로서 세린/트레오닌이다. 보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄를 기반으로 하는 그룹을 포함한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 및 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌울 세린으로의 대체, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체가 생성된 폴리펩티드의 성질에 대해 주요한 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 폴리펩티드를 생성하는지 여부는 폴리펩티드의 구체적인 활성을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 천연 발생 잔기는 공통 측쇄 성질을 기반으로 하여 그룹으로 나뉘어진다: (1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile; (2) 중성 친수성: cys, ser, thr; (3) 산성: asp, glu; (4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및 (6) 방향족; trp, tyr, phe.

본 발명은 또한 비-보존적 치환을 갖는 폴리펩티드를 구상한다. 비-보존적 치환은 상기 기재된 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 것으로 교환하는 것을 수반한다.

조성물 및 방법

산화성 스트레스를 다루는 메카니즘으로서, 유전자 이동 접근법에서 개별적으로 또는 조합되어 사용되는 2가지 항산화제 효소에 대하여 본원에 기재된 변형에 대한 전례는 없다. 한 실시양태에서, 카탈라제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제 3 효소의 분비된 단량체 형태를 위해 단백질 변형을 설계하고 유전자 구축물을 제조하였다. 각각에 대한 유전자 암호의 통합은, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 벡터의 발현 카세트에 별도로 또는 개재 절단 부위를 갖는 단일 번역된 서열과 조합되어 삽입되었다. 벡터-매개된 발현은 카탈라제 또는 SOD 또는 이들 둘 다를 세포외 환경에 제공하고, 산화성 스트레스에 대한 최전선 장벽으로서 혈청 및 점막 표면으로 이동시킨다. 이들 유전자 이동 접근법의 사용은 산화-매개된 병리 및 질환으로부터 보호한다.

유전자 요법의 사용은 지속적인 발현 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (그러나 또 다른 바이러스 벡터, 예컨대 레트로 또는 렌티 바이러스 벡터일 수 있음)를 기반으로 한다. ROS로부터의 보호를 위한 강력한 항산화제 무기인 인간 카탈라제 및 인간 SOD3 효소의 3차원 단백질 구조를 조사하였다. 최전선 방어를 제공하여 기관의 상피 표면을 가로질러 관류하고 점막 표면에 도달할 수 있는, 분비된 단량체성 기능적 구축물의 벡터-매개된 내인성 생산을 목적으로 하여, 각각의 효소를 변형시키는 전략을 고안하였다.

카탈라제. 한 실시양태에서, 분비 신호 펩티드 (예를 들어, 인간 이뮤노글로불린으로부터; 서열식별번호: 13 참고)의 단백질의 N 말단에서 유전자 암호의 부가는 번역된 서열이 세포로부터 분비되도록 지시하는 세포 단백질 생산 기구에 대한 지침을 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 암호는 사량체에서 단량체들 사이에 결합 계면을 형성하는 단백질 서열의 루프를 코딩하는 서열을 제거하도록 변형되었다. 한 실시양태에서, 아미노산 381 내지 400을 코딩하는 DNA는 3차원 단백질 구조에서 단부가 서로에 대해 가깝게 유지되는 방식으로 결실되었고, 따라서 전체 단백질 구조에 대한 영향을 최소화하도록 트리밍된 단백질 쇄가 개재 루프의 제거에 의해 제약을 받지 않는다.

SOD3. 한 실시양태에서, 아미노산 잔기 50 내지 59에 대한 유전자 암호가 제거되었고, 비-SOD3 서열을 구조에 도입시킴으로써 발생할 수 있는 면역을 최소화하기 위해 선택된 SOD3 구조에서의 또 다른 가요성 루프인 아미노산 74 내지 80에 대한 유전자 암호로 대체되었다. 한 실시양태에서, 세포외 매트릭스/헤파린 결합 도메인 (아미노산 220 내지 240)을 코딩하는 영역에 대한 유전자 암포로부터의 결실은 분비된 단백질이 세포 표면으로부터 자유롭게 확산할 수 있게 한다. 야생형 SOD3이 분비 신호 서열을 코딩하기 때문에, 아미노 말단을 코딩하는 cDNA에서는 변화가 이루어지지 않았다.

한 실시양태에서, 두 트랜스진 모두는 구성적으로 발현하는 시토메갈로바이러스 (CMV)/닭 베타-액틴 하이브리드 프로모터 뒤에서 발현 카세트에 넣었고, AAVrh.10 혈청형 벡터에 통합시켰다. 개재 푸린-2a 절단 서열은 단일 번역된 서열이 2개의 별도의 폴리펩티드 산물인 분비된 단량체 카탈라제 및 분비된 단량체 SOD3을 생산하는 능력을 제공한다 (Fang et al., 2005).

카탈라제에 대한 예시적인 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 5-7 또는 12에 제공되고, 예시적인 SOD 서열은 서열식별번호: 2-4, 8 및 10에 제공된다:

본 발명의 범위 내에 있는 서열에는 서열식별번호: 1-8, 10 또는 12 중 하나와 적어도 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것들이 포함된다. 본 발명의 범위 내에 있는 카탈라제 서열은 전장 카탈라제 서열에 비해 약 2%, 5%, 10%, 12%, 15% 또는 최대 20% 더 적은 잔기를 갖는다. 본 발명의 범위 내에 있는 슈퍼옥시드 디스뮤타제 서열은 전장 슈퍼옥시드 디스뮤타제 서열에 비해 약 2%, 5%, 10%, 12%, 15% 또는 최대 20% 더 적은 잔기를 갖는다.

유전자 전달 벡터

유전자 전달 벡터에는, 예를 들어, 바이러스 벡터, 리포솜 및 다른 지질-함유 복합체, 예컨대 리포플렉스 (DNA 및 양이온성 지질), 폴리플렉스, 예를 들어, 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 복합체화된 DNA, 나노입자, 예를 들어, DNA에 결합하거나 또는 결합하도록 기능화된 자성 무기 나노입자, 예컨대 Fe₃O₄ 또는 MnO₂ 나노입자, 미세입자, 예를 들어, 폴리락티드 폴리갈락티드 시약으로 형성된 것, 나노튜브, 예를 들어, 실리카 나노튜브, 및 숙주 세포로 유전자의 전달을 매개할 수 있는 다른 거대분자 복합체가 포함된다. 벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 또는 그렇지 않으면 표적화된 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분 또는 기능을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분에는, 예를 들어, 세포로의 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분 (예컨대, 세포-유형 또는 조직-특이적인 결합을 매개하는 성분); 세포에 의한 벡터의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수 후에 세포 내에서 이동된 유전자의 국소화에 영향을 미치는 성분 (예컨대, 핵 국소화를 매개하는 작용제); 및 유전자의 발현에 영향을 미치는 성분이 포함된다. 이러한 성분에는 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 검출하거나 선택하기 위해 사용될 수 있는 마커, 예컨대 검출가능한 및/또는 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 매우 다양한 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 일반적으로 이용가능하다.

본 발명의 범위 내에 있는 유전자 전달 벡터에는 단리된 핵산, 예를 들어, 염색체외에서 유지될 수 있는 플라스미드-기반 벡터, 및 바이러스 벡터, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스바이러스, 수두 바이러스, 유두종 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스, 예컨대 리포솜, 예를 들어, 중성 또는 양이온성 리포솜, 예컨대 DOSPA/DOPE, DOGS/DOPE 또는 DMRIE/DOPE 리포솜에 존재하고/거나 다른 분자, 예컨대 DNA-항-DNA 항체-양이온성 지질 (DOTMA/DOPE) 복합체와 회합된 바이러스 및 비-바이러스 벡터가 포함된다. 예시적인 바이러스 유전자 전달 벡터가 하기에 기재되어 있다. 유전자 전달 벡터는 두개내, 경막내, 근육내, 협측, 직장, 정맥내 또는 관상동맥내 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 경로를 통해 투여될 수 있고, 세포로의 이동은 전기천공 및/또는 이온영동, 및/또는 스캐폴딩, 예컨대 세포외 매트릭스 또는 히드로겔, 예를 들어, 히드로겔 패치를 사용하여 증강시킬 수 있다. 한 실시양태에서, CNS로의 간접적인 전달을 증강시키기 위해 투과 증강제는 사용되지 않는다.

레트로바이러스 벡터

레트로바이러스 벡터는 숙주 게놈으로 안정하고 정확하게 통합되어 장기간 트랜스진 발현을 제공하는 그들의 능력을 비롯하여 몇몇 구별되는 특징을 나타낸다. 이들 벡터는 전신 감염 및 환자간 전염의 위험을 최소화하도록 감염성 유전자 입자를 제거하기 위해 생체외에서 조작될 수 있다. 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터는 숙주 세포 향성을 변경시킬 수 있다.

렌티바이러스

렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 및 고양이 면역결핍 바이러스를 포함하는 레트로바이러스의 부류로부터 유래된다. 그러나, 단지 분열하는 세포를 감염시키는 레트로바이러스와는 달리, 렌티바이러스는 분열하는 및 분열하지 않는 세포 둘 다를 감염시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 게놈을 기반으로 하는 렌티바이러스 벡터는 생체내에서 심근 세포를 효율적으로 형질도입시킬 수 있다. 렌티바이러스가 특이적인 향성을 갖지만, 바이러스 외피를 수포성 구내염 바이러스로 슈도타이핑시키면 보다 넓은 범위를 갖는 바이러스가 수득된다 (Schnepp et al., Meth. Mol. Med., 69:427 (2002)).

아데노바이러스 벡터

아데노바이러스 벡터는 게놈으로부터 바이러스 유전자 발현을 담당하는 초기 (E1A 및 E1B) 유전자를 결실시킴으로써 복제-불능성이 될 수 있고, 염색체외 형태로 숙주 세포 내에서 안정하게 유지된다. 이들 벡터는 복제하는 및 복제하지 않는 세포 모두를 형질감염시키는 능력을 가지며, 특히, 이들 벡터는, 예를 들어, 주사 또는 주입 후에 생체내에서 심근 세포를 효율적으로 감염시키는 것으로 제시된 바 있다. 아데노바이러스 벡터는 생체내에서 치료 유전자의 일시적인 발현을 일으키고, 7일째에 피크이며, 대략 4주 지속되는 것으로 제시된 바 있다. 트랜스진 발현의 지속시간은 신경 특이적인 프로모터를 사용하는 시스템에서 개선될 수 있다. 또한, 아데노바이러스 벡터는 매우 높은 역가로 생산될 수 있으며, 이는 적은 부피의 바이러스로 효율적인 유전자 이동을 가능하게 한다.

아데노-연관 바이러스 벡터

재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)는 비병원성 파보바이러스로부터 유래되고, 본질적으로 세포 면역 반응을 유발하지 않으며, 대부분의 시스템에서 수개월 지속되는 트랜스진 발현을 생성한다. 더욱이, 아데노바이러스와 마찬가지로, 아데노-연관 바이러스 벡터는 또한 복제하는 및 복제하지 않는 세포를 감염시키는 능력을 가지며, 인간에 대해 비병원성인 것으로 믿어진다. 더욱이, 이들은 지속된 심장 유전자 이동에 대해 유망한 것으로 보인다 (Hoshijima et al., Nat. Med., 8:864 (2002); Lynch et al., Circ. Res., 80:197 (1997)).

AAV 벡터에는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10이 포함되나 이로 제한되지는 않는다.

플라스미드 DNA 벡터

플라스미드 DNA는 종종 더욱 정교한 팩키징 시스템의 부재를 나타내기 위해 "네이키드 DNA"로 지칭된다. 플라스미드 DNA를 생체내 심근 세포에 직접 주입하였다. 플라스미드-기반 벡터는 비교적 비면역원성 및 비병원성이며, 세포 게놈에 안정하게 통합되어 생체내에서 유사분열후 세포에서 장기간 유전자 발현을 일으키는 잠재성을 갖는다. 예를 들어, 플라스미드 DNA의 근육 주사 이후에 비교적 낮은 수준의 국소 트랜스진 발현에도 불구하고 분비된 혈관신생 인자의 발현은 동물 모델에서 유의한 생물학적 효과를 입증하였고, 임상적으로 유망한 것으로 보인다 (Isner, Nature, 415:234 (2002)). 추가로, 플라스미드 DNA는 혈류에서 신속하게 분해되므로, 멀리 있는 기관계에서 트랜스진 발현의 기회는 무시가능하다. 플라스미드 DNA는 거대분자 복합체, 예를 들어, 리포솜 또는 DNA-단백질 복합체의 일부로서 세포에 전달될 수 있고, 전달은 전기천공을 비롯한 기술을 이용하여 증강될 수 있다.

제약 조성물

본 발명은 상기 기재된 유전자 이동 벡터(들) 및 제약상 허용가능한 (예를 들어, 생리학적으로 허용가능한) 담체를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진 조성물을 제공한다. 조성물이 본질적으로 본 발명의 유전자 이동 벡터 및 제약상 허용가능한 담체로 이루어지는 경우, 조성물에 실질적인 영향을 미치지 않는 추가의 성분 (예를 들어, 아주반트, 완충제, 안정화제, 항염증제, 가용화제, 보존제 등)이 포함될 수 있다. 조성물이 본 발명의 유전자 이동 벡터 및 제약상 허용가능한 담체로 이루어지는 경우, 조성물은 임의의 추가의 성분을 포함하지 않는다. 본 발명의 문맥 내에서 임의의 적합한 담체가 사용될 수 있고, 이러한 담체는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 담체의 선택은 부분적으로 조성물이 투여될 수 있는 특정한 부위 및 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정한 방법에 의해 결정될 것이다. 본원에 기재된 유전자 이동 벡터를 제외하고 조성물은 임의적으로 멸균성일 수 있다. 조성물은 보관을 위해 냉동되거나 동결건조될 수 있고, 사용하기 전에 적합한 멸균성 담체 중에서 재구성될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)]에 기재된 통상적인 기술에 따라 생성될 수 있다.

조성물에 적합한 제형에는 수성 및 비-수성 용액, 항산화제, 완충제 및 세균발육저지제를 함유할 수 있는 등장성 멸균성 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균성 현탁액이 포함된다. 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 밀폐 용기, 예컨대 앰풀 및 바이알에 제공될 수 있고, 사용하기 직전에 멸균성 액체 담체, 예를 들어, 단지 물의 첨가를 필요로 하는 냉동-건조된 (동결건조된) 상태로 보관될 수 있다. 즉석 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균성 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 담체는 완충된 식염수 용액이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 유전자 이동 벡터는 투여하기 전에 유전자 이동 벡터를 손상으로부터 보호하도록 제형화된 조성물로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 유전자 이동 벡터를 제조하거나, 보관하거나 또는 투여하기 위해 사용되는 기기, 예컨대 유리, 시린지 또는 니들 상에서 유전자 이동 벡터의 손실을 감소시키도록 제형화될 수 있다. 조성물은 유전자 이동 벡터의 광 민감성 및/또는 온도 민감성을 감소시키도록 제형화될 수 있다. 이를 위해, 조성물은, 예를 들어, 상기 기재된 것과 같은 제약상 허용가능한 액체 담체, 및 폴리소르베이트 80, L-아르기닌, 폴리비닐피롤리돈, 트레할로스 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 안정화제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물의 사용은 유전자 이동 벡터의 보관 수명을 연장시키고, 투여를 용이하게 하고, 본 발명의 방법의 효율을 증가시킬 것이다. 유전자 이동 벡터-함유 조성물을 위한 제형은, 예를 들어, 문헌 [Wright et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 6(2): 174-178 (2003) and Wright et al., Molecular Therapy, 12: 171-178 (2005)]에 추가로 기재되어 있다.

조성물은 또한 형질도입 효율을 증강시키도록 제형화될 수 있다. 추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 유전자 이동 벡터가 다른 치료제 또는 생물학적 활성제와 함께 조성물에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 유전자 이동 벡터의 생체내 투여와 연관된 부종 및 염증을 감소시키기 위해 염증을 제어하는 인자, 예컨대 이부프로펜 또는 스테로이드가 조성물의 일부일 수 있다. 면역계 자극인자 또는 아주반트, 예를 들어, 인터류킨, 지질다당류, 및 이중-가닥 RNA. 기존 감염을 치료하기 위해 및/또는 추후의 감염, 예컨대 유전자 이동 절차와 연관된 감염의 위험을 감소시키기 위해 항생제, 즉, 항미생물제 및 항진균제가 존재할 수 있다.

주사가능한 데포 형태는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드 중에서 대상 화합물의 미세캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비, 및 사용되는 특정한 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예에는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 데포 주사가능한 제형은 또한 신체 조직과 상용성인 리포솜 또는 미세에멀젼 중에 약물을 포획시킴으로써 제조된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제형은 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 중합체, 폴리비닐 중합체, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄 및 이들의 공중합체, 셀룰로스, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 락트산 및 글리콜산의 중합체, 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 다당류, 단백질, 폴리히알루론산, 폴리시아노아크릴레이트, 및 이들의 블렌드, 혼합물 또는 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 생체적합성 중합체를 포함한다.

조성물은 제어된 또는 지속된 방출을 가능하게 하는 기기, 예컨대 스폰지, 생체적합성 메쉬워크, 기계적 저장소, 또는 기계적 임플란트 내에 또는 그 위에 투여될 수 있다. 임플란트 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,443,505 참고), 기기 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,863,457 참고), 예컨대 이식가능한 기기, 예를 들어, 기계적 저장소 또는 임플란트, 또는 중합체 조성물로 구성된 기기는 본 발명의 유전자 이동 벡터의 투여에 특히 유용하다. 조성물은 또한, 예를 들어, 겔 포움, 히알루론산, 젤라틴, 콘드로이틴 술페이트, 폴리포스포에스테르, 예컨대 비스-2-히드록시에틸-테레프탈레이트 (BHET) 및/또는 폴리락트산-글리콜산을 포함하는 지속-방출 제형의 형태 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,378,475 참고)로 투여될 수 있다.

포유동물에게 투여되는 조성물 중 유전자 이동 벡터의 용량은 포유동물의 크기 (질량), 임의의 부작용의 정도, 특정한 투여 경로 등을 비롯하여 수많은 인자에 따라 좌우될 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 본 발명의 유전자 이동 벡터를 포함하는 조성물의 "치료 유효량"을 투여하는 것을 포함한다. "치료 유효량"은 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안 원하는 치료 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 치료 유효량은 질환 또는 장애의 정도, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 유전자 이동 벡터가 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 특정한 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 조성물 중 유전자 이동 벡터의 용량은 전형적으로 벡터 게놈 카피/세포 (gc/세포) 또는 벡터 게놈 카피/kg 체중 (gc/kg)의 단위로 투여된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에 널리 공지된 이들 및 다른 인자에 기반하여 특정한 질환 또는 장애를 가진 환자를 치료하는데 적절한 유전자 이동 벡터 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다. 치료 유효량은 1 x 10¹⁰ 게놈 카피 내지 1 x 10¹³ 게놈 카피일 수 있다.

한 실시양태에서, 조성물은 포유동물에게 1회 투여된다. 조성물의 단일 투여가 최소한의 부작용으로 포유동물에서 지속적인 발현을 일으킬 수 있는 것으로 믿어진다. 그러나, 특정한 경우에, 조성물에 대한 세포의 충분한 노출을 보장하기 위해 치료 기간 동안에 조성물을 다중 투여하는 것이 적절할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 치료 기간 동안에 포유동물에게 2회 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 8, 9 또는 10회 또는 그 초과) 투여될 수 있다.

본 개시내용은 상기 기재된 핵산 서열을 포함하는 유전자 이동 벡터의 치료 유효량을 포함하는 제약상 허용가능한 조성물을 제공한다.

투여 경로, 투여량 및 투여량 형태

본 발명에 따른 유전자 전달 벡터의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 및 관련 기술자에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적이거나 또는 간헐적일 수 있다. 유전자 전달 벡터(들)의 투여는 미리 선택된 시간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는 일련의 간격을 둔 용량으로 이루어질 수 있다. 두개내, 비강내 또는 경막내와 같은 국소 투여, 및 예를 들어, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 바이러스를 사용하는 전신 투여 둘 다가 고려된다. 임의의 투여 경로, 예를 들어, 정맥내, 비강내 또는 기관지내, 폐로 직접 투여 및 흉막내가 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 흉막으로 전달될 수 있다.

임의적으로 지속되는 방출을 위해 제형화될 수 있는, 유전자 전달 벡터(들)을 함유하는 1개 이상의 적합한 단위 투여량 형태는 다양한 경로, 예컨대 두개내, 경막내, 또는 비강내, 또는 CNS로 전달하기 위한 다른 수단, 또는 경구, 또는 비경구, 예컨대 직장, 협측, 질 및 설하, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 흉곽내, 또는 폐내 경로로 투여될 수 있다. 제형은 적절한 경우 편리하게는 구별된 단위 투여량 형태로 제시될 수 있고, 약국에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 벡터를 액체 담체, 고체 매트릭스, 반고체 담체, 미분된 고체 담체 또는 이들의 조합물과 회합시킨 다음, 필요한 경우, 산물을 원하는 전달 시스템에 도입시키거나 또는 성형하는 단계를 포함할 수 있다.

특정한 결과를 달성하기 위해 투여되는 유전자 전달 벡터(들)의 양은 선택된 유전자 및 프로모터, 상태, 환자 특이적인 파라미터, 예를 들어, 키, 체중 및 연령, 및 예방 또는 치료가 달성되는지 여부를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 벡터는 편리하게는, 예를 들어, 뇌에 투여하기에 적합한 제형의 형태로 제공될 수 있다. 적합한 투여 포맷은 표준 절차에 따라 각각의 환자에 대해 개별적으로 의사에 의해 가장 잘 결정될 수 있다. 적합한 제약상 허용가능한 담체 및 그들의 제형은 표준 제형 논문, 예를 들어, [Remington's Pharmaceuticals Sciences]에 기재되어 있다. "제약상 허용가능한"이란, 제형의 다른 성분과 상용성이며 그의 수용자에게 해롭지 않은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 염을 의미한다.

본 발명의 벡터는 허용되는 보존제, 예컨대 메타크레졸 0.1% 내지 0.75%, 또는 0.15% 내지 0.4% 메타크레졸과 함께 용액이 대략 등장성이게 하는 하는 부형제, 예를 들어, 4.5% 만니톨 또는 0.9% 염화나트륨, 일반적으로 안전한 것으로 고려되는 pH 완충된 관련 기술분야에 공지된 완충제 용액, 예컨대 인산나트륨과 함께 중성 pH, 예를 들어, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5, 또는 약 pH 7 내지 8의 용액으로 제형화될 수 있다. 원하는 등장성을 수득하는 것은 염화나트륨 또는 다른 제약상 허용가능한 작용제, 예컨대 덱스트로즈, 붕산, 타르타르산나트륨, 프로필렌 글리콜, 폴리올 (예컨대 만니톨 및 소르비톨), 또는 다른 무기 또는 유기 용질을 이용하여 달성될 수 있다. 염화나트륨은 나트륨 이온을 함유하는 완충제의 경우에 유용하다. 원하는 경우, 상기 조성물의 용액은 또한 보관 수명 및 안정성을 증강시키도록 제조될 수 있다. 본 발명의 치료적으로 유용한 조성물은 일반적으로 허용되는 절차에 따라 성분들을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 선택된 성분들을 혼합하여 농축된 혼합물을 생성한 다음, pH를 제어하기 위한 물 및/또는 완충제 또는 장성을 제어하기 위한 추가의 용질을 첨가함으로써 최종 농도 및 점도로 조정할 수 있다.

벡터는 하나의 또는 다중 용량에서 효과적인 벡터의 양을 함유하는 투여량 형태로 제공될 수 있다. 바이러스 벡터의 경우, 효가적인 용량은 적어도 약 10⁷ 바이러스 입자, 예를 들어, 약 10⁹ 바이러스 입자, 또는 약 10¹¹ 바이러스 입자의 범위일 수 있다. 첨가된 바이러스 입자의 수는 10¹⁴ 이하일 수 있다. 예를 들어, 바이러스 발현 벡터가 사용되는 경우, 약 10⁸ 내지 약 10⁶⁰ gc의 바이러스 벡터가 핵산으로서 또는 팩키징된 비리온으로서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 0.5 내지 10 mL당 약 10⁹ 내지 약 10¹⁵ 카피의 바이러스 벡터가 핵산으로서 또는 팩키징된 비리온으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산 또는 벡터는 적어도 약 0.0001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 적어도 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 적어도 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.25mg/kg 또는 적어도 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.25 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있지만, 다른 투여량이 유익한 결과를 제공할 수도 있다. 투여되는 양은 투여를 위해 선택된 핵산 또는 벡터, 포유동물의 질환, 체중, 신체 상태, 건강 및/또는 연령을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자는 관련 기술분야에서 이용가능한 동물 모델 또는 다른 시험 시스템을 이용하여 임상의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 언급된 바와 같이, 투여되는 정확한 용량은 임상의에 의해 결정되지만, 1 mL 인산염 완충된 식염수 중에 있을 수 있다. 플라스미드 DNA 단독, 또는 다른 거대 분자와의 복합체인 플라스미드 DNA의 전달을 위해, 투여되는 DNA의 양은 수용자에게 유익한 효과를 나타내는 양일 것이다. 예를 들어, 개별적인 또는 나뉘어진 용량으로 0.0001 내지 1 mg 또는 그 초과, 예를 들어, 1 g 이하, 예를 들어, 0.001 내지 0.5 mg, 또는 0.01 내지 0.1 mg의 DNA가 투여될 수 있다.

예를 들어, 바이러스 발현 벡터가 사용되는 경우, 약 10⁸ 내지 약 10⁶⁰ gc의 바이러스 벡터가 핵산으로서 또는 팩키징된 비리온으로서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 0.5 내지 10 mL당 약 10⁹ 내지 약 10¹⁵ 카피의 바이러스 벡터가 핵산으로서 또는 팩키징된 비리온으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산 또는 벡터는 적어도 약 0.0001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 적어도 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 적어도 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.25 mg/kg 또는 적어도 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.25 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있지만, 다른 투여량이 유익한 결과를 제공할 수도 있다.

한 실시양태에서, 적절한 카테터 또는 니들을 사용하여 두개내, 간내, 기관내 또는 기관지내 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 다양한 카테터를 이용하여 전달을 달성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기에 적합한 다양한 일반 목적 카테터, 뿐만 아니라 변형된 카테터가 상업적인 공급자로부터 입수가능하다. 또한, 전달이 뇌 또는 폐의 특정한 영역으로 직접 주사에 의해 달성되는 경우, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 해당 영역에 카테터를 도입시키기 위해 수많은 접근법이 이용될 수 있다.

예를 들어, 리포솜 및 다른 지질-함유 유전자 전달 복합체를 사용하여 하나 이상의 트랜스진을 전달할 수 있다. 유전자 전달을 위해 이러한 복합체의 제조 및 사용에 관한 원리는 관련 기술분야에 기재되어 있다 (예를 들어, Ledley, (1995); Miller et al., (1995); Chonn et al., (1995); Schofield et al., (1995); Brigham et al., (1993) 참고).

유전자 전달 벡터를 함유하는 제약 제형은 널리 공지되고 용이하게 이용가능한 성분들을 사용하여 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 작용제는 일반적인 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제형화될 수 있고, 정제, 캡슐, 현탁액, 분말 등으로 형성될 수 있다. 본 발명의 벡터는 또한 비경구 투여, 예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내 경로에 의해 적절한 엘릭시르 또는 용액으로서 제형화될 수 있다.

벡터의 제약 제형은 또한 수성 또는 무수 용액, 예를 들어, 동결건조된 제형 또는 분산액의 형태, 또는 대안적으로 에멀젼 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있다.

한 실시양태에서, 벡터는, 예를 들어, 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 카테터를 통한 연속 주입에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있고, 보존제가 첨가된 앰풀, 미리 충전된 시린지, 소량 주입 용기 또는 다중-용량 용기의 단위 투여량 형태로 제시될 수 있다. 활성 성분은 유성 또는 수성 비히클 중에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 가질 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 멸균성 고체의 무균 단리에 의해 또는 용액으로부터 동결건조에 의해 수득되는 분말 형태일 수 있으며, 이는 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균성의 발열원-무함유 물에 의해 재구성된다.

이들 제형은 선행 기술에 널리 공지된 제약상 허용가능한 비히클 및 아주반트를 함유할 수 있다. 예를 들어, 생리학적 관점에서 허용가능한 1종 이상의 유기 용매(들)을 이용하여 용액을 제조할 수 있다.

흡입에 의해 상부 (비강) 또는 하부 기도에 투여하기 위해, 벡터는 편리하게는 취입기, 네불라이져 또는 가압식 팩, 또는 에어로졸 스프레이를 전달하는 다른 편리한 수단으로부터 전달된다. 가압식 팩은 적합한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 포함할 수 있다. 가압식 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계측된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.

대안적으로, 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위해, 조성물은 건조 분말, 예를 들어, 치료제의 분말 믹스, 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분의 형태를 취할 수 있다. 분말 조성물은, 예를 들어, 캡슐 또는 카트리지, 또는 예를 들어, 흡입기, 취입기 또는 정량 흡입기의 도움으로 분말이 투여될 수 있는 젤라틴 또는 블리스터 팩에서 단위 투여량 형태로 제시될 수 있다.

비강내 투여를 위해, 벡터를 비강 점적, 액체 스프레이, 예컨대 플라스틱 보틀 분무기 또는 정량 흡입기를 통해 투여할 수 있다. 전형적인 분무기는 미스토미터(Mistometer) (윈트롭(Wintrop)) 및 메디헤일러(Medihaler) (리커(Riker))이다.

벡터의 국소 전달 또한, 예를 들어, 카테터 또는 니들을 사용하여 질환 부위에 또는 그 근처에 벡터를 투여하는 다양한 기술에 의해 이루어질 수 있다. 부위-특이적인 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예는 제한하려는 의도는 아니지만, 이용가능한 기술을 기재한다. 그 예에는 국소 전달 카테터, 예컨대 주입 또는 유치 카테터, 예를 들어, 니들 주입 카테터, 션트 및 스텐트 또는 다른 이식가능한 기기, 부위 특이적인 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용이 포함된다.

본원에 기재된 제형 및 조성물은 또한 다른 성분, 예컨대 항미생물제 또는 보존제를 함유할 수 있다.

대상체

대상체는 임의의 동물, 예컨대 인간 및 비-인간 동물일 수 있다. 비-인간 동물에는 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류가 포함되지만, 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말이 바람직하다. 대상체는 또한 가축, 예컨대 소, 돼지, 양, 가금류 및 말, 또는 애완동물, 예컨대 개 및 고양이일 수 있다.

대상체에는 산화성 손상을 앓고 있거나 또는 그의 위험이 있는 인간 대상체가 포함된다. 대상체는 일반적으로 기술자, 예컨대 의사에 의해 본 발명의 상태를 갖는 것으로 진단된다.

본원에 기재된 방법은 임의의 종, 성별, 연령, 인종 집단, 또는 유전자형을 갖는 대상체에 대해 이용될 수 있다. 따라서, 용어 대상체에는 남성 및 여성이 포함되고, 노인, 노인-성인 전환 연령 대상체인 성인, 성인-성인전 전환 연령 대상체, 및 성인전, 예컨대 청소년, 어린이 및 유아가 포함된다.

인간 인종 집단의 예에는 백인, 아시아인, 히스패닉, 아프리카인, 아프리카계 미국인, 북미 원주민, 셈족 및 태평양 제도인이 포함된다. 상기 방법은 일부 인종 집단, 예컨대 백인, 특히 북유럽 집단, 뿐만 아니라 아시아 집단에 대해 더욱 적절할 수 있다.

용어 대상체에는 또한 상기 기재된 바와 같이 본 발명을 필요로 하는 한 임의의 유전자형 또는 표현형을 갖는 대상체가 포함된다. 또한, 대상체는 임의의 모발색, 눈색, 피부색 또는 이들의 임의의 조합에 대한 유전자형 또는 표현형을 가질 수 있다.

용어 대상체에는 임의의 신장, 체중, 또는 임의의 기관 또는 신체 부분 크기 또는 형태를 갖는 대상체가 포함된다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 기재될 것이다.

실시예

본 설명은 하기 실시예에 의해 추가로 기재되지만, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 인용된 모든 참고문헌의 내용 (본원에서 인용된 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원 포함)은 명시적으로 본원에 참고로 포함된다.

동물 실험은 편견이 없는 실험 설계를 보장하도록 설계된다. 실험 동물은 무작위로 그룹으로 배정되고, 연구자들은 동물 거동을 평가할 때 맹검일 것이다. 형질도입, 질환 발현 또는 요법 반응에서의 가능한 성별 차이를 다루기 위해 수컷 및 암컷을 이용할 것이다. 각각의 코호트에서 동물의 수는 통계적으로 유의한 데이터를 수득하도록 선택되었다.

개관

본 개시내용의 초점은 담배 연기, 오염물로부터 흡입되고, 활성화된 염증 세포에 의해 폐 내에서 생성된 산화제가 질환의 병인에 대해 근본적인 폐 상피 및 내피에 대한 손상을 지속시키는데 주요 역할을 하는 만성 장애인 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 비롯한 장애를 치료하기 위해 폐를 세포외 항산화제 방어에 의해 보호하는 요법을 개발하는 것이다. 상기 전략은 폐에 대한 주요 세포외 산화제 스트레스인 슈퍼옥시드 (O₂ ^·-) 및 H₂O₂를 불활성화시키는 폐에 대한 지속적인 세포외 항산화제 효소 쉴드를 제공하기 위해 생체내 유전자 요법 기술을 이용하는 것이다. 상기 전략은 세포외 환경에서 확산할 수 있는 기능적 단량체성 항산화제 효소를 분비하도록 유전자 변형된 카탈라제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제 3 (SOD3)에 대한 유전자의 사용을 포함하며, 이는 폐에 효과적인 세포외 항산화제 쉴드를 제공한다. 카탈라제는 분비되도록 설계되는 경우에 확산되기에는 너무 큰 (232 kDa) 사량체성 세포내 효소이다. 효과적인 세포외 항산화제로서 카탈라제를 사용하기 위해, 카탈라제 유전자는 랩핑 루프 도메인이 사량체 형성을 매개하는 것을 방지하도록 변형되었다. 분비 신호의 부가에 의해, 인간 카탈라제 단량체 (hCatWL^-)는 분비되어, 세포외 H₂O₂를 H₂O로 촉매하는 기능을 할 수 있다. 슈퍼옥시드 디스뮤타제 3 (SOD3)은 분비되지만, 큰 사량체 (130 kDa)이며, 그를 세포 표면에 부착시키는 헤파린-결합 도메인을 갖는다. SOD3을 더욱 효과적인 폐 세포외 항산화제로 변형시키기 위해, 사량체 형성에 결정적인 루프를 변형시켰고, 헤파린-결합 도메인을 제거하여 (hSOD3hd^-), 세포 표면에 결합하지 않는 효과적인 단량체 항산화제 효소 (30 kDa)를 생성하였다. 아데노-연관 (AAV) 유전자 이동 벡터는 간이 변형된 카탈라제 및/또는 SOD3 단량체를 분비하고 발현하도록 유전자 변형시키기 위한 예시적인 유전자 이동 벡터로서 사용된다. 4가지 AAVrh.10 후보를 평가할 것이다: AAVrh.10hCatWL^- (단지 카탈라제 단량체만을 발현함); AAVrh.10hSOD3hd^- (SOD3 단량체); AAVrh.10hCatWL^-/hSOD3hd^- (두 단량체 모두); 및 AAVrh.10hSODhd^-/hCatWL^- (동일하지만 5' 위치에 SOD3hd^-가 있음). 한 실시양태에서, AAVrh.10 벡터는 투여 후에 폐 내피 및 상피 표면의 지속적인 세포외 항산화제 쉴드를 생성한다.

목적 1. 4가지 AAVrh.10 항산화제 벡터 (hCatWL^-, hSOD3hd^-, hCatWL^-/hSOD3hd^- 및 hSOD3hd^-/hCatWL^-)의 발현 카세트에 의해 매개되는, 분비된 기능적 변형된 카탈라제 및/또는 SOD3의 시험관내 발현 수준을 비교하기 위해.

목적 2. 4가지 AAVrh.10 항산화제 벡터가 분비된 기능적 변형된 카탈라제 및/또는 SOD3을 발현하여, 폐 내피 및 상피를 O₂ ^·- 및/또는 H₂O₂ 스트레스로부터 보호할 수 있는 능력을 생체내에서 정량화하기 위해.

실시예 1

한 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 요법의 초점은 담배 연기, 오염물로부터 흡입되고, 활성화된 염증 세포에 의해 폐 내에서 생성된 산화제가 질환의 병인에 대해 근본적인 폐 상피 및 내피에 대한 손상을 개시하고 지속시키는데 주요 역할을 하는 만성 장애인 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 치료하기 위해 폐를 세포외 항산화제 방어에 의해 보호하는 것이다 (Lin & Thomas, 2010; McGuinness et al., 2017; Hubbard & Crystal, 1986; MacNee, 2000; Shapiro & Ingenito, 2005; Yoshida et al., 2007; Elmasry et al., 2015). 폐에 대한 대부분의 산화제 스트레스는 세포외에서 일어나고, 상피 및 내피 세포의 세포내 항산화제 방어를 압도하여, 세포 손상, 기능장애 및 궁극적인 사멸을 일으킨다 (Shaykhiev et al., 2014; Gao et al., 2015; Polverino et al., 2018). 현재의 전략은 폐에 대한 세포외 산화제 스트레스의 2가지 주요 성분인 슈퍼옥시드 (O₂ ^·-) 및 H₂O₂를 불활성화시키는 폐에 대한 지속적인 세포외 항산화제 효소 쉴드를 제공하기 위해 생체내 유전자 요법 기술을 이용하는 것이다.

카탈라제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제 3 (SOD3)에 대한 코딩 서열은 세포외 환경에서 확산될 수 있는 기능적 단량체 형태로 분비되도록 유전자 변형되었고, 이는 폐에 효과적인 세포외 항산화제 쉴드를 제공한다. 카탈라제는 헴 그룹과 조합된 큰 (232 kDa) 사량체 효소이고, NADPH는 고도로 효과적인 세포내 효소이지만, 심지어 분비되도록 설계되는 경우에도 세포외 환경에서 효과적으로 확산하기에는 너무 크다 (Reynolds et al., 1977; Rennard et al., 1986; Goyal & Basak, 2010; Sepasi et al., 2018; Bell et al., 1981). 효과적인 세포외 항산화제로서 카탈라제를 사용하기 위해, 카탈라제 유전자는 랩핑 루프 도메인이 사량체 형성을 매개하는 것을 방지하도록 변형시켰다 (Goyal & Basak, 2010; Ko et al.,. 2000; Safo et al., 2001). 분비 신호를 부가하여, 인간 카탈라제 단량체 (hCatWL^-)는 분비되어, 세포외 H₂O₂를 H₂O로 촉매하는 기능을 할 수 있다.

3가지 슈퍼옥시드 디스뮤타제 유전자, SOD1, 2 및 3이 있다 (Fukai & Ushio-Fukai, 2011; Perry et al., 2010). SOD1은 세포질에서 기능하고, SOD2는 미토콘드리아에서 기능한다. SOD3은 분비되지만, 큰 사량체 (130 kDa)이고, 그를 세포 표면에 부착시키는 헤파린-결합 도메인을 갖는다 (Fukai & Ushio-Fukai, 2011; Antonyuk et al., 2009; Griess et al., 2017). SOD3을 더욱 효과적인 폐 세포외 항산화제로 변형시키기 위해, 사량체 형성에 결정적인 루프를 변형시키고, 헤파린-결합 도메인을 제거하여 (hSOD3hd^-), 세포 표면에 결합하지 않는 기능적 분비된 단량체 항산화제를 생성하였다. 한 실시양태에서, 아데노-연관 (AAV) 유전자 이동 벡터를 사용하여 간이 변형된 카탈라제 및/또는 SOD3 단량체를 발현하고 분비하도록 유전자 변형시키고, 이들 각각은 폐를 가로질러 확산할 수 있는 분자 질량을 가지며 (Reynolds et al., 1977; Bell et al., 1981), 결과적으로 전체 폐에 대한 세포외 항산화제 보호를 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 요법 전략은 정맥내로 투여 시 항산화제 유전자(들)을 발현하도록 간세포를 효과적으로 형질도입시키는 비인간 영장류 아데노-연관 바이러스 (AAV) 유전자 이동 벡터인 sAAVrh.10을 사용한다. 4가지 AAVrh.10 후보를 평가한다: AAVrh.10hCatWL^- (카탈라제 단량체만을 발현함); AAVrh.10hSOD3hd^- (SOD3 단량체); AAVrh.10hCatWL^-/hSOD3hd^- (항산화제 단량체 둘 다); 및 AAVrh.10hSODhd^-/hCatWL^- (동일하지만 5' 위치에 SOD3hd^-가 있음).

산화제는 다른 분자로부터 전자를 용이하게 받아들여서, 기능장애 및 궁극적인 세포/기관 또는 손상을 일으키는 분자이다 (Davies et al., 2001; Devasagayam et al., 2002; O'Reilly et al., 2001; Janssen et al., 1993). 정상적인 환경 하에, 항산화제는 산화성 스트레스로부터 보호한다 (Pham-Huy et al., 2008; Irshad et al., 2002). 산화제 부담이 항산화제 방어보다 클 때, 생성된 산화제 스트레스는 기관 기능부전의 병인에서 중추적인 역할을 한다 (Casas et al., 2015; Pham-Huy et al., 2008; Irshad et al., 2002). 폐는 흡입된 세포외 산화제 (담배 연기, 오염물, 생체이물질, 산소과잉) 및 내인성 산화제 (활성화된 염증 세포)에 대해 매우 취약한 반면에, 폐의 항산화제 방어는 주로 세포내에 있다 (Rhaman et al., 2006; Sies et al., 2017).

COPD에서, 폐 상피 및 내피는 세포내 산화제 방어를 압도하는 세포외 산화제를 생성하는 활성화된 염증 세포 (폐포 대식세포 및 호중구)로부터의 추가의 산화제 스트레스 하에 있다 (도 1A). 주요 폐 항산화제 방어 효소는 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD; O₂ ^·-를 H₂O₂로 촉매함; 3가지 형태: SOD1 세포질, SOD2 미토콘드리아, SOD3 세포외), 카탈라제 (H₂O₂를 H₂O로 촉매함, 세포질)이고, 글루타티온 시스템은 H₂O₂를 물로 전환시킨다 (GSH는 세포질 및 세포외 둘 다에 있음; 다중 세포질 효소는 GSH를 환원된 채로 유지시키기 위해 필요함; 도 1B) (Rahman et al., 2006; Sies et al., 2017). 폐 세포가 산화제 센서, 예컨대 NRF2 및 NF-kB/IkB를 갖지만, 인간 폐 세포는 주요 항산화제 효소 카탈라제 및 SOD를 상향조절하지 못한다. 이는 크리스탈 래보러토리(Crystal laboratory)에 의해 수행된 연구에서 극적으로 입증되었으며, 여기서 정상인 인간 지원자를 기관지경으로 검사하여 기도 상피를 샘플링하여, 기준선 카탈라제 및 SOD mRNA 수준을 정량화한 다음, 12-18시간 동안 100% O₂에 노출시킨 후에 (기관기관지염을 유도하기에 충분함), 상피를 다시 샘플링하였다 (Erzurum et al., 1985). 현저하게도, 카탈라제 및 SOD mRNA 수준 모두 상향조절되지 않았고, 즉, 인간 기도 상피는 강한 세포외 산화제 스트레스에도 불구하고 그의 항산화제 쉴드를 상향조절하기 위한 메카니즘이 제한되었다. 한 해결책은 폐를 세포외 산화제의 스트레스로부터 보호하기 위해 효과적인 세포외 "항산화제 테플론 코팅"을 제공하는 것이다. 아데노-연관 바이러스 (AAV) 유전자 이동 벡터를 이용하여 카탈라제 단독, SOD3 단독 또는 카탈라제 + SOD3의 분비된 형태를 발현하여, 효과적인 항산화제 쉴드를 생성한다. 문제는 카탈라제가 큰 세포내 사량체이고, SOD3가 세포 표면에 결합하는 큰 사량체라는 것이며; 그들의 천연 형태에서는 어느 것도 효과적으로 확산하여 세포외 항산화제 방어를 제공하지 못한다. 해결책은 폐를 통해 확산할 수 있는 항산화제를 기반으로 하는 유전자 요법으로서 효과적으로 이용될 수 있는 기능적 단량체를 생성하도록 카탈라제 및 SOD3의 코딩 서열을 변형시켜, 산화제에 취약한 내피 및 상피를 보호하는 것이다 (Reynolds et al., 1977; Bell et al., 1981). 한 실시양태에서, 변형된 카탈라제 및/또는 SOD3 단량체를 코딩하는 AAV 벡터를 정맥내로 투여함으로써, 간의 간세포는 (혈액측으로부터) 폐 내피의 항산화제 보호를 가능하게 하고 내피 및 상피 치밀 이음부를 가로질러 확산하기에 충분히 낮은 분자량 (50-60 kDa)을 갖는 기능적-항산화제 단량체를 혈액으로 분비하여, 간질 조직 및 상피의 효과적인 항산화제 쉴드를 제공한다 (분자량 50-60 kDa의 단백질의 경우, 인간 폐 상피 내막액 수준이 혈액의 10%임).

한 카탈라제 분자는 매초 수백만 개의 H₂O₂ 분자를 H₂O로 전환시킬 수 있다 (Goyal & Basak, 2010; Chance, 1947). 카탈라제는 4개의 단량체 (각각 501개 아미노산) + 4개의 철-함유 4개의 헴 그룹 + 4개의 NAPDH 분자로 구성된 세포내 효소이다. 카탈라제는 모든 기관에서 발현된다. 폐 세포외 항산화제 보호를 강화하기 위한 유전자 요법 전략에 대한 문제는 카탈라제가 너무 커서 (232 kDa) 효과적인 세포외 항산화제 쉴드를 제공하도록 분비 및 확산될 수가 없다는 것이다. LEX 용액은 사량체를 형성할 수 없도록 카탈라제 유전자 서열을 유전자 변형시키기 위한 것이며, 효과적인 세포외 항산화제로서 기능하는 단량체로서 분비될 수 있다. 각각의 카탈라제 단량체는 단량체 단위를 함께 결합시키는 인터록킹 아암 교환에 중요한 아미노-말단 잔기, 및 랩핑 루프 도메인 (4개의 단량체를 함께 유지시키는 염 가교 및 이온 상호작용에 의해, 4개의 단량체가 서로의 주변을 둘러싸서 사량체를 형성함)을 갖는다. 후보 유전자 변형에는 다음이 포함되었다: (1) 모든 구축물은 (인간 IgG1로부터의) N-말단 분비 서열을 가졌고; (2) 카탈라제 서열은 사량체 구조를 안정화시키는 도메인을 결실시키기 위해 N-말단 영역에서 변형되었고; (3) 단량체들 사이에 결합 계면을 형성하는 랩핑 루프 도메인이 결실되었다 (도 2).

SOD는 O₂ ^·-를 H₂O₂로 전환시킨다. SOD3 (활성 부위 구리 + 아연)은 아미노-말단 신호 펩티드, 및 양으로 하전된 잔기의 클러스터로 구성된 헤파린-결합 도메인에 대해 C-말단을 갖는 분비된 동종사량체 (약 130 kDa)이다. 헤파린-결합 도메인은 분비되지만, SOD3을 세포 표면에 및 매트릭스 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 및 콜라겐에 고정시킨다 (Sandstom, 1993; Olsen et al., 2004) (작은 분획이 N-말단 근처에서 절단되어 순환하는 사량체를 생성함). 폐에서 유전자 치료제로서 SOD3 효과를 최대화하기 위해, 사량체를 형성하기 위해 단량체를 결속시키는 루프를 대체하도록 하는 변형이 이루어졌으며, 헤파린-결합 도메인의 세그먼트를 결실시켜 SOD3 단량체가 조직에서 자유롭게 확산할 수 있도록 하였다. SOD3이 신호 펩티드를 갖기 때문에, 이는 손상되지 않게 두었다 (도 3).

COPD는 미국에서 세번째로 가장 흔한 사망 원인이다. 산소 외에는 COPD-연관된 사망률을 감소시키는 약물이 없다 (Benton et al., 2018; Woodruff et al., 2015). COPD에서 사용되는 약물 (기관지 확장제, 코르티코스테로이드)은 증상을 도와주고, 장기 항생제는 악화 빈도를 감소시킨다 (Benton et al., 2018; Woodruff et al., 2015). 세포외 산화제의 스트레스가 COPD의 병인에서 주요 역할을 한다는 개념을 뒷받침하는 광범위한 데이터가 있다 (Shaykiev et al., 2014; Gao et al., 2015; Polverino et al., 2010; Rahman, 2015). COPD 요법에 대해 항산화제를 평가하기 위한 몇몇 임상 연구가 있었다 (Rahman, 2008; Rahman, 2012에서 검토됨). 이들 실험 중 어느 것도 성공적이지 않았다. LEX 전략은 세포외 환경에서 효과적인 항산화제 효소의 수준을 증가시켜 상피 및 내피 세포 둘 다를 산화제 스트레스로부터 보호하기 위한 유전자 요법 기술을 이용하는 새로운 접근법이다. 성공적인 경우, COPD의 병인에서 산화제의 중요성을 고려하여, 세포외 항산화제 스크린의 유전자 요법-기반 확립은 이러한 흔한 치명적인 장애에 대한 치료제로서 매우 유의하여야 한다 (Foronjy et al., 2008; Rahman et al., 2006).

도 4는 COPD를 치료하기 위한 예시적인 유전자 요법-기반의 세포외 확산가능한 효소적 항산화제를 제시한다. 지금까지의 연구를 기반으로 하여, LEX 5는 AAV 혈청형 rh.10 캡시드와 4가지 후보 발현 카세트 중 하나로 구성될 것이다 (도 4). 4가지 후보 유전자 이동 벡터는 항산화제 효소를 코딩하는 cDNA를 제외하고는 동일하다. 각각은 발현 카세트를 포함한다 (5'에서 3'으로): (1) AAV 혈청형 2로부터의 AAV 반전된 말단 반복부 (ITR); (2) CAG-시토메갈로바이러스 인핸서/프로모터, 스플라이스 공여자, 닭 β-액틴으로부터의 인트론 서열, 우측 방향 인트론 및 토끼 β-글로빈으로부터의 스플라이스 수용자; CAG는 유전자 요법 적용에서 널리 사용되는 고도로 활성인 구성적 프로모터임 (Miyazaki et al., 1989; Niwa et al., 1991); (3) 카탈라제 단량체 (LEX 5a, hCatWD^-), SOD3 단량체 (LEX 5b, hSOD3hd^-)의 코딩 서열, 푸린 2A 부위에 의해 분리된 hCatWD^- + hSOD3hd^-의 조합된 코딩 서열 (5'에서 3'으로) (LEX 5c), 및 푸린 2A 부위에 의해 분리된 hSOD3hd^- + hCatWD^-의 조합된 코딩 (5'에서 3'으로) (LEX 5d, 카탈라제 및 SOD3 서열의 순서가 바뀐 것을 제외하고는 LEX 5c와 동일함); (4) 헤마글루티닌 태그 (단백질의 결실을 용이하게 하기 위해); (5) 폴리A/정지 신호; 및 (6) 3' AAV2ITR. 발현 카세트는 모두 분비된 단백질을 발현하도록 간을 형질도입시키는데 우수한 비인간 영장류 AAV 캡시드인 AAVrh.10 혈청형 캡시드에 팩키징될 것이다. 4가지 후보 발현 카세트는 기능에 대해 시험관내에서 평가될 것이고, 4가지 후보 AAV 벡터를 각각의 벡터의 동등한 정맥내 용량을 이용하여 마우스에서 직접 비교하여, 벡터 DNA 및 인간 카탈라제 및/또는 SOD3 mRNA에 대해 간 및 폐를 평가하고, (폐 내피 보호에 대해) 혈장에서 및 (폐 상피 보호에 대해) 폐 상피 내막액에서 카탈라제 단량체 단백질 양 및 활성을 평가할 것이다. 3c에 상술된 정량적인 기준을 이용하여, 벡터 중 하나를 4가지 후보 벡터로부터 선택할 것이다.

전세계적으로, COPD는 3억2900만명 (세계 인구의 4.8% (Vos et al., 2012))에서 발병하고, 매년 전세계적으로 3백만건이 넘는 사망을 초래한다. 미국에서, COPD는 세번째 주요 사망 원인이며, 매년 150,000건의 사망을 초래하는 것으로 추정된다. 벡터는 이러한 만성의 치명적인 장애에 대한 평생 요법을 위해 단지 단일 정맥내 주입만을 필요로 할 수 있다. 주로 세포내 항산화제를 강화시키거나 (카탈라제) 또는 세포막에 부착되게 하는 (SOD3) 항산화제 효소를 코딩하는 본래의 유전자를 발현하도록 유전자 요법을 이용하기 보다는, 본 발명의 전략은 효과적인 세포외 효소적 항산화제 "쉴드"를 생성하도록 하는 유전자 요법을 이용하여, 매우 취약한 내피 및 상피를 비롯하여 모든 폐 세포에 대한 세포외 항산화제 보호를 제공하는 것이다.

효과적인 폐 세포외 방어를 생성하기 위한 해결책은, 본래의 인간 카탈라제 및 SOD3 코딩 서열이, 간으로 AAV-매개된 유전자 이동에 의해 발현될 때, 단량체가 혈액 항산화제 방어를 증강시키고 (폐 내피 보호), 폐를 가로질러 확산하여 폐 상피 내막액 항산화제 방어를 증강시키는 (상피 보호), 분자량 (50-60 kDa)의 기능적 단량체를 생성할 수 있도록 이들을 변형시키는 것이다. 요약하면, 혁신은 다음을 포함한다: (1) 이들 매우 효과적인 항산화제가 폐 내피 및 상피에 대한 세포외 항산화제 쉴드를 생성하여, 세포외 산화제 스트레스가 폐 세포를 손상시키는 것을 방지하는도록 지시하기 위해, 인간 카탈라제 및 SOD3 유전자에 대한 분자 공학; 및 (2) 한 실시양태에서 하나의 유전자 이동 구축물에서 유전자 변형된 카탈라제 및 SOD3 유전자의 조합물을 사용함으로써 이들 항산화제가 O₂ ^·- 및 H₂O₂ 둘 다를 효과적으로 제거하는 능력을 활용하여, 광범위한 흡입된 산화제, 뿐만 아니라 활성화된 염증 세포에 의해 생성된 세포외 산화제에 대한 효과적인 세포외 항산화제 쉴드를 제공함. 별도의 카탈라제 및 SOD 벡터를 함께 투여할 수 있다.

데이터를 기반으로 하여, 모두 AAV 비인간 혈청형 rh.10을 기반으로 하는 4가지 후보 벡터를 확인하였다 (도 4): (1) LEX 5a - AAVrh.10hCatWD^- (분비된 카탈라제 단량체); (2) LEX 5b - AAVrh.10hSOD3hd^- (결실된 헤파린-결합 도메인을 갖는 분비된 SOD3 단량체); (3) LEX 5c - AAVrh.10hCatWD^-/SOD3hd^- (분비된 카탈라제 단량체 및 분비된 SOD3 단량체 둘 다를 발현하는 단일 벡터); 및 (4) LEX 5d - AAVrh.10hSOD3hd^-/hCatWD^- (LEX 5c와 동일하지만, SOD3 구축물이 카탈라제 구축물 앞에 있음). LEX 5를 확인하기 위한 실험적 접근은 시험관내 및 생체내 검정을 이용한다.

인간 카탈라제 코딩 서열에 대한 변형에 의해, AAVrh.10hCatWD^- (LEX 5a)를 생성하는 LEX 5a에 대한 발현 카세트를 확인하였고, LEX 5a가 마우스에게 정맥내로 투여될 때, 결과적으로 혈청에서 기능적 인간 카탈라제 활성이 나타남을 입증하였다. 유사하게, 인간 SOD3 코딩 서열에 대한 변형에 의해, 마우스에서 LEX 5b에 대한 발현 카세트를 확인하여, 혈청에서 기능적 SOD 활성이 나타났다. AAVrh.10hCatWD^-/hSOD3hd^- 및 AAVrh.10hSOD3hd^-/hCatWD^- 벡터를 생성하였고, 시험관내 및 생체내에서 시험하고 있다.

인간 카탈라제 서열의 3가지 변형을 평가하였다: hCatNT^-, hCatWL^- 및 hCatNT-WL^-. 혈청 무함유 배지 중에서 이들 플라스미드를 293T 세포에 형질감염시킨 후에 배양물 상청액의 평가는 3가지 모두 분비되었음을 입증하였다 (도 5A). 그러나, 3가지 구축물 중에서, 단지 랩핑 루프 도메인 결실 (hCatWD^-)이 카탈라제 활성을 보유하였다 (도 5B). 비스-트리스 겔 분석은 hCAThd^-가 단량체로서 분비되었음을 입증하였다 (도 5C). 이 데이터를 기반으로 하여, AAVrh.10hCatWD^- (LEX 5a)를 생성하였다. 마우스로의 정맥내 투여는 간 및 폐에서 hCatWD^- DNA의 검출 (AAVrh.10 벡터에 대해 전형적임) (Chiuchiolo et al., 2013), 중요하게는 혈청에서 용이하게 검출가능한 인간 카탈라제 활성을 유도하였고, 예를 들어, LEX 5a는 분비된 기능적 카탈라제 단량체를 생성한다 (도 7A-C).

단일 SOD3 변이체 (hSOD3hd^-)에 대해 잔기 50-59를 결실시켜 74-80로부터의 잔기 세그먼트의 프레임내 카피로 대체하고, 헤파린-결합 도메인인 잔기 212-240을 결실시키는 2가지 변형이 이루어졌다. 이 플라스미드를 293T 세포에 형질감염시킨 후에 배양물 상청액의 정량화는, hSOD3hd^- 변이체가 상청액에서 용이하게 검출되었고 (도 6A), 단량체이었음을 (도 6B) 입증하였다. 이 데이터를 기반으로 하여, AAVrh.10hSOD3hd^- (LEX 5b)를 생성하였다 (도 4). Balb/c 마우스로의 정맥내 투여는 간 및 폐에서 벡터 DNA (간에서 50배 더 높음) 및 혈청에서 SOD 활성을 유도하였다 (도 7D-F). LEX 5c, LEX 5d. LEX 5a 및 LEX 5b의 시험관내 및 생체내 기능적 데이터를 기반으로 하여, 카탈라제 및 SOD3 변형된 단량체 둘 다를 발현하도록 LEX 5c 및 LEX 5d를 생성하였다. 1개의 AAV 구축물에서 2가지 유전자의 발현을 기반으로 하여 (De et al., 2008; Wang et al., 2010; Watanabe et al., 2010; Mao et al., 2011; Rosenberg et al., 2012; Hicks et al., 2012; Xie et al., 2014; Hicks et al., 2015; Pagovich et al., 2016; Liu et al., 2016), LEX 5a 및 LEX 5b 둘 다 단일 프로모터를 사용하며, 상기 2가지 변형된 cDNA는 2가지 기능 단백질을 생성하도록 생성된 전구체 단백질의 절단을 지시하는 푸린 2A 절단 부위에 의해 분리된다. 2가지 구축물을 시험하였다: hCatWD^- 서열이 hSOD3hd^- 서열 앞에 있는 LEX 5c, 및 2가지 cDNA 코딩 서열이 바뀐 LEX 5d. 둘 다 시험관내 및 생체내 기능에 대해 시험될 것이다.

실험 설계. 연구는 시험관내 및 생체내에서 LEX 5a, LEX 5b, LEX 5c 및 LEX 5d를 비교하는데 중점을 둔다. 하기 기준을 이용하여 동일한 벡터 용량에 대한 후보의 순위를 매긴다: (1) 시험관내 - O₂ ^·-, H₂O₂ 산화제 스트레스에 대한 분비된 기능적 항산화제의 수준; (2) 생체내 - 혈청 및 폐 상피 내막액에서 기능적 항산화제의 지속적인 수준.

4가지 AAVrh.10 항산화제 벡터 (hCatWL^-, hSOD3hd^-, hCatWL^-/hSOD3hd^- 및 hSOD3hd^-/hCatWL^-)의 발현 카세트에 의해 매개되는, 분비된 기능적 변형된 카탈라제 및/또는 SOD3의 시험관내 발현 수준을 비교하기 위해 사용되었다. 데이터는 hCatWD^- (LEX 5a에 대한 발현 카세트) 및 hSOD3hd^- (LEX 5b에 대한 발현 카세트) 둘 다 단량체를 생성하고, 둘 다 시험관내 및 생체내에서 각각 카탈라제 및 SOD를 생성하도록 기능함을 입증한다. 목적 1의 목표는 용량의 함수로서 혈청 무함유 배지에서 플라스미드 (hCatWD^-, hSOD2hd^-, hCatWD^-/hSOD3hd^- 및 hSOD3hd^-/hCatWD^-)를 293T 세포에 형질감염시킴으로서 4가지 발현 카세트의 비교 시험을 수행하기 위한 것이다. 72시간 후에, 생성된 상청액을 다음에 대해 시험한다: (1) 카탈라제 및 SOD 수준; (2) 카탈라제 및 SOD 활성; 및 (3) 상청액이 인간 미세혈관 내피 및 인간 기도 상피를 산화제 스트레스 (O₂ ^·- 및 H₂O₂)로부터 보호하는 능력. 4가지 플라스미드의 시험관내 평가는 표 II에 상세히 기재한 바와 같이 순위를 매길 것이다.

4가지 AAVrh.10 항산화제 벡터가 분비된 기능적 변형된 카탈라제 및/또는 SOD3을 발현하여 폐 내피 및 상피를 O ₂ ^·- 및 H ₂ O ₂ 스트레스로부터 보호할 수 있는 능력을 생체내에서 정량화하기 위해. 목표는 생체내에서 LEX 5a, b, c 및 d 벡터를 비교하는 것이다. AAVrh.10 벡터에서 이중 발현 카세트에 대한 이전의 경험으로부터 (De et al., 2008; Wang et al., 2010; Watanabe et al., 2010; Mao et al., 2011; Rosenberg et al., 2012; Hicks et al., 2012; Xie et al., 2014; Hicks et al., 2015; Pagovich et al., 2016; Liu et al., 2016), LEX 5a 및 LEX 5b가 기능적이기 때문에, LEX 5c 및 LEX 5d의 설계가 기능적이지 않을 이유가 없지만, LEX 5c 대 LEX 5d의 발현 카세트에서 카탈라제 대 SOD3의 상대적인 발현에서 차이가 있을 수 있다. 4가지 벡터를 비교하기 위해, 동일한 용량 (10⁹, 10¹⁰ 및 10¹¹ 게놈 카피)의 정맥내 투여를 Balb/c 수컷 및 암컷 마우스에서 비교한다. 0, 2주, 1개월 및 3개월째에, 하기 파라미터를 평가할 것이다: (1) 간 및 폐 벡터 DNA; (2) 간 및 폐 발현 카세트 mRNA; (3) 혈청 및 폐 상피 내막액 (ELF)에서 카탈라제 및 SOD 수준 및 활성; 및 (4) 처리된 마우스의 혈청은 시험관내에서 O₂ ^·- 및 H₂O₂ 스트레스에 대한 인간 미세혈관 내피의 보호에 대해 시험될 것이고, ELF는 동일한 산화제 스트레스에 대한 인간 기도 상피의 보호에 대해 시험될 것이다. 분비된 단백질의 AAVrh.10-매개된 발현이 3개월째에 안정하게 유지되는 경우에, 이들이 동물의 수명 동안에 안정하게 유지될 것이라는 광범위한 데이터를 기반으로 하여, 3개월 시점은 마지막 시점일 것이다 (Chiuchiolo et al., 2013; De et al., 2008; De et al., 2006) Balb/c 마우스의 선택은, 이 균주가 인간 단백질에 대한 면역을 생성하지 않고 생체내에서 인간 단백질 발현을 견디는 것인 발현을 기반으로 한다 (Rosenberg et al., 2012). 임의의 면역 문제 (발현의 손실로 나타남)가 있는 경우, 본 발명자들은 마우스 균주를 AAV 벡터에 의해 발현된 인간 세포 유전자를 또한 견디는 C57Bl/6으로 교체할 것이다 (De et al., 2006). 생체내 평가는 표 II에 상세히 기재한 바와 같이 순위를 매긴다. 시험관내 및 생체내 순위를 조합하여 전체 순위를 수득한다.

플라스미드 발현 카세트는 6가지 효능 검정에 의해 순위를 매기며; 동일한 검정을 목적 2에서 이용하여 혈청 및 폐 ELF를 평가하였다.

카탈라제 수준. ELISA (압캠).

SOD3 수준. ELISA (바이오컴페어(Biocompare)).

카탈라제 활성. 비색 검정 (써모 피셔).

SOD3 활성. 비색 검정 (압캠).

O ₂ ^·- 및 H ₂ O ₂ 에 의한 내피 챌린지. 인간 미세혈관 내피 세포 (론자(Lonza))는 슈퍼옥시드 (화학적으로 펜톤(Fenton) 반응을 이용함) 또는 H₂O₂에 의해 챌린지를 받을 것이다. 24 및 48시간째에, 세포 사멸 (상청액에서 락테이드 데히드로게나제 수준), 산화제 반응 (산화성 스트레스 유전자의 mRNA 수준에 대한 정량적인 PCR). 보호를 위해, 세포를 플라스미드 상청액, 혈청 또는 ELF로 전처리할 것이다.

O ₂ ^·- 및 H ₂ O ₂ 에 의한 상피 챌린지. 검정은 내피의 경우와 동일하지만, 내피를 인간 기도 상피로 대체한다. 인간 상피는 공기-액체 계면 배양에 의해 유형 IV 콜라겐 상에서 인간 정상 기저 세포로부터 28일에 걸처 유래될 것이다.

AAVrh.10 벡터 생산. 벡터는 AAV2 Rep 유전자, 단백질 VP1, 2 및 3에 대한 AAVrh.10 Cap 유전자 (생산된 rh.10 AAV 벡터의 혈청형을 정의함) 및 E2, E4 및 VA RNA의 아데노바이러스 헬퍼 기능을 보유하는 플라스미드와 함께 발현 플라스미드의 인간 배아 신장 293T 세포 (HEK 293T; ATCC)에 공동-형질감염시킴으로써 생산된다 (Collaco et al., 1999; Hicks et al., 2016). 벡터는 아이오딕사놀 구배 및 QHP 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 벡터 게놈 역가는 정량적인 탁맨(TaqMan) 실시간 PCR 분석에 의해 결정될 것이다 (Mayginnes et al., 2006)

동물 모델. 벡터는 각각 3가지 용량 (10⁹, 10¹⁰, 10¹¹)으로 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 투여된다. 모든 연구는 각각의 데이터 점에서 n=5 수컷 및 5 암컷 마우스를 이용하여 수행된다. 광섬유 기관지경 검사 및 세척액에 의해 수득된 폐 ELF는 ELF를 회수하기 위해 사용된 식염수 및 실제 ELF의 혼합물이다. 회수된 ELF의 부피는 우레아 방법 (Rennard et al., 1985) 및 μM/ELF 부피로 표현되는 카탈라제 또는 SOD3의 수준을 이용하여 정량화된다. 꼬리 정맥 출혈에 의한 혈청 및 폐 ELF를 0 (치료전), 2, 4, 12주째에 평가한다. 희생 시 벡터 게놈 및 유전자 발현의 분석을 위해 마우스로부터 간 및 폐를 수집하고, DNA/mRNA 단리를 위해 100 mg 조직당 1 ml의 RNAlater (퀴아젠(Qiagen))를 갖는, 표지된 깨끗한 15 ml 원뿔형 튜브로 옮기고, 밤새 4℃에서 보관한다. 샘플을 4℃에서 10-20 분 동안 균질화시키고, 1개의 샘플을 트랜스진에 대해 특이적인 프라이머 프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 각각의 DNA 및 mRNA 분석을 위해 사용한다.

모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 상기 명세서에서 본 발명이 그의 특정한 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었고, 여러 상세한 내용이 본 발명의 목적을 위해 기재되었지만, 본 발명이 추가의 실시양태에 적용가능하고, 본원에 기재된 특정한 상세한 내용은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고 상당히 달라질 수 있음이 자명할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Crystal, Ronald G. Kaminsky, Stephen M. Salami, Christiana Cornell Research Foundation, Inc. <120> GENE THERAPY FOR OXIDATIVE STRESS <130> 1676.131WO1 <140> PCT/US2019/025529 <141> 2019-04-03 <150> US 62/652,098 <151> 2018-04-03 <160> 13 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Asp Ser Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Gln His Trp Lys 1 5 10 15 Glu Gln Arg Ala Ala Gln Lys Ala Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly 20 25 30 Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Val Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly 35 40 45 Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe 50 55 60 Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Lys Tyr Ser Lys 85 90 95 Ala Lys Val Phe Glu His Ile Gly Lys Lys Thr Pro Ile Ala Val Arg 100 105 110 Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp 115 120 125 Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp 130 135 140 Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe 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aattcctgag agagttgtgc atgctaaagg agcaggggcc 240 tttggctact ttgaggtcac acatgacatt accaaatact ccaaggcaaa ggtatttgag 300 catattggaa agaagactcc catcgcagtt cggttctcca ctgttgctgg agaatcgggt 360 tcagctgaca cagttcggga ccctcgtggg tttgcagtga aattttacac agaagatggt 420 aactgggatc tcgttggaaa taacaccccc attttcttca tcagggatcc catattgttt 480 ccatctttta tccacagcca aaagagaaat cctcagacac atctgaagga tccggacatg 540 gtctgggact tctggagcct acgtcctgag tctctgcatc aggtttcttt cttgttcagt 600 gatcggggga ttccagatgg acatcgccac atgaatggat atggatcaca tactttcaag 660 ctggttaatg caaatgggga ggcagtttat tgcaaattcc attataagac tgaccagggc 720 atcaaaaacc tttctgttga agatgcggcg agactttccc aggaagatcc tgactatggc 780 atccgggatc tttttaacgc cattgccaca ggaaagtacc cctcctggac tttttacatc 840 caggtcatga catttaatca ggcagaaact tttccattta atccattcga tctcaccaag 900 gtttggcctc acaaggacta ccctctcatc ccagttggta aactggtctt aaaccggaat 960 ccagttaatt actttgctga ggttgaacag atagccttcg acccaagcaa catgccacct 1020 ggcattgagg ccagtcctga caaaatgctt cagggccgcc tttttgccta tcctgacact 1080 caccgccatc gcctgggacc caattatctt catatacctg tgaactgtcc ctaccgtgct 1140 ccaaattact accccaacag ctttggtgct ccggaacaac agccttctgc cctggagcac 1200 agcatccaat attctggaga agtgcggaga ttcaacactg ccaatgatga taacgttact 1260 caggtgcggg cattctatgt gaacgtgctg aatgaggaac agaggaaacg tctgtgtgag 1320 aacattgccg gccacctgaa ggatgcacaa attttcatcc agaagaaagc ggtcaagaac 1380 ttcactgagg tccaccctga ctacgggagc cacatccagg ctcttctgga caagtacaat 1440 gctgagaagc ctaagaatgc gattcacacc tttgtgcagt ccggatctca cttggcggca 1500 agggagaagg caaatctg 1518 <210> 10 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Leu Ala Leu Leu Cys Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Asp Ala Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala 20 25 30 Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu 35 40 45 Val Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln His Ala Ala Cys Gln Val Gln Pro 50 55 60 Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val Leu 65 70 75 80 Phe Arg Gln 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300 accgagccga acagctccag ccgcgccatc cacgtgcacc agttcgggga cctgagccag 360 ggctgcgagt ccaccgggcc ccactacaac ccgctggccg tgccgcaccc gcagcacccg 420 ggcgacttcg gcaacttcgc ggtccgcgac ggcagcctct ggaggtaccg cgccggcctg 480 gccgcctcgc tcgcgggccc gcactccatc gtgggccggg ccgtggtcgt ccacgctggc 540 gaggacgacc tgggccgcgg cggcaaccag gccagcgtgg agaacgggaa cgcgggccgg 600 cggctggcct gctgcgtggt gggc 624 <210> 12 <211> 538 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Pro Arg Ala Ala Thr Met Pro Arg Val Arg Ser Cys Leu Leu His 1 5 10 15 Ser Pro Arg Thr His Ala Leu Ala Asp Ser Arg Asp Pro Ala Ser Asp 20 25 30 Gln Met Gln His Trp Lys Glu Gln Arg Ala Ala Gln Lys Ala Asp Val 35 40 45 Leu Thr Thr Gly Ala Gly Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Val Ile 50 55 60 Thr Val Gly Pro Arg Gly Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr 65 70 75 80 Asp Glu Met Ala His Phe Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val 85 90 95 His Ala Lys Gly Ala Gly Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp 100 105 110 Ile Thr Lys Tyr Ser Lys Ala Lys Val Phe Glu His Ile Gly Lys Lys 115 120 125 Thr Pro Ile Ala Val Arg Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser 130 135 140 Ala Asp Thr Val Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr 145 150 155 160 Glu Asp Gly Asn Trp Asp Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe 165 170 175 Ile Arg Asp Pro Ile Leu Phe Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg 180 185 190 Asn Pro Gln Thr His Leu Lys Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp 195 200 205 Ser Leu Arg Pro Glu Ser Leu His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp 210 215 220 Arg Gly Ile Pro Asp Gly His Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His 225 230 235 240 Thr Phe Lys Leu Val Asn Ala Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe 245 250 255 His Tyr Lys Thr Asp Gln Gly Ile Lys Asn Leu Ser Val Glu Asp Ala 260 265 270 Ala Arg Leu Ser Gln Glu Asp Pro Asp Tyr Gly Ile Arg Asp Leu Phe 275 280 285 Asn Ala Ile Ala Thr Gly Lys Tyr Pro Ser Trp Thr Phe Tyr Ile Gln 290 295 300 Val Met Thr Phe Asn Gln Ala Glu Thr Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp 305 310 315 320 Leu Thr Lys Val Trp Pro His Lys Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly 325 330 335 Lys Leu Val Leu Asn Arg Asn Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu 340 345 350 Gln Ile Ala Phe Asp Pro Ser Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Ala Ser 355 360 365 Pro Asp Lys Met Leu Gln Gly Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His 370 375 380 Arg His Arg Leu Gly Pro Asn Tyr Leu His Ile Pro Val Asn Cys Pro 385 390 395 400 Tyr Arg Ala Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Gly Ala Pro Glu Gln 405 410 415 Gln Pro Ser Ala Leu Glu His Ser Ile Gln Tyr Ser Gly Glu Val Arg 420 425 430 Arg Phe Asn Thr Ala Asn Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Ala Phe 435 440 445 Tyr Val Asn Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn 450 455 460 Ile Ala Gly His Leu Lys Asp Ala Gln Ile Phe Ile Gln Lys Lys Ala 465 470 475 480 Val Lys Asn Phe Thr Glu Val His Pro Asp Tyr Gly Ser His Ile Gln 485 490 495 Ala Leu Leu Asp Lys Tyr Asn Ala Glu Lys Pro Lys Asn Ala Ile His 500 505 510 Thr Phe Val Gln Ser Gly Ser His Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ala Asn 515 520 525 Leu Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 530 535 <210> 13 <211> 1569 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atgccacgcg tccgctcctg tcttctccac agtcccagaa cacacgcact cgctgacagc 60 cgggatcccg ccagcgacca gatgcagcac tggaaggagc agcgggccgc gcagaaagct 120 gatgtcctga ccactggagc tggtaaccca gtaggagaca aacttaatgt tattacagta 180 gggccccgtg ggccccttct tgttcaggat gtggttttca ctgatgaaat ggctcatttt 240 gaccgagaga gaattcctga gagagttgtg catgctaaag gagcaggggc ctttggctac 300 tttgaggtca cacatgacat taccaaatac tccaaggcaa aggtatttga gcatattgga 360 aagaagactc ccatcgcagt tcggttctcc actgttgctg gagaatcggg ttcagctgac 420 acagttcggg accctcgtgg gtttgcagtg aaattttaca cagaagatgg taactgggat 480 ctcgttggaa ataacacccc cattttcttc atcagggatc ccatattgtt tccatctttt 540 atccacagcc aaaagagaaa tcctcagaca catctgaagg atccggacat ggtctgggac 600 ttctggagcc tacgtcctga gtctctgcat caggtttctt tcttgttcag tgatcggggg 660 attccagatg gacatcgcca catgaatgga tatggatcac atactttcaa gctggttaat 720 gcaaatgggg aggcagttta ttgcaaattc cattataaga ctgaccaggg catcaaaaac 780 ctttctgttg aagatgcggc gagactttcc caggaagatc ctgactatgg catccgggat 840 ctttttaacg ccattgccac aggaaagtac ccctcctgga ctttttacat ccaggtcatg 900 acatttaatc aggcagaaac ttttccattt aatccattcg atctcaccaa ggtttggcct 960 cacaaggact accctctcat cccagttggt aaactggtct taaaccggaa tccagttaat 1020 tactttgctg aggttgaaca gatagccttc gacccaagca acatgccacc tggcattgag 1080 gccagtcctg acaaaatgct tcagggccgc ctttttgcct atcctgacac tcaccgccat 1140 cgcctgggac ccaattatct tcatatacct gtgaactgtc cctaccgtgc tccaaattac 1200 taccccaaca gctttggtgc tccggaacaa cagccttctg ccctggagca cagcatccaa 1260 tattctggag aagtgcggag attcaacact gccaatgatg ataacgttac tcaggtgcgg 1320 gcattctatg tgaacgtgct gaatgaggaa cagaggaaac gtctgtgtga gaacattgcc 1380 ggccacctga aggatgcaca aattttcatc cagaagaaag cggtcaagaa cttcactgag 1440 gtccaccctg actacgggag ccacatccag gctcttctgg acaagtacaa tgctgagaag 1500 cctaagaatg cgattcacac ctttgtgcag tccggatctc acttggcggc aagggagaag 1560 gcaaatctg 1569

Claims (43)

1. 카탈라제 활성을 갖지만 사량체를 형성하지 않는 변형된 카탈라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터.
2. 제1항에 있어서, 분비되지만 세포 표면에 결합하지 않는 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 유전자 요법 벡터.
3. 분비되지만 세포 표면에 결합하지 않거나 또는 사량체를 형성하지 않는 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제가 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제-3인 유전자 요법 벡터.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제가 헤파린에 결합하지 않는 것인 유전자 요법 벡터.
6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 카탈라제 활성을 갖지만 사량체를 형성하지 않는 변형된 카탈라제를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 유전자 요법 벡터.
7. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 카탈라제가 스레딩 아암 도메인 내 N-말단에서 결실을 가지며, 상기 결실이 1 내지 80개, 또는 1 내지 80개 사이의 임의의 정수의 것일 수 있는 것인 유전자 요법 벡터.
8. 제1항, 제2항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 카탈라제가 랩핑 루프 도메인에서 결실을 가지며, 상기 결실이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 잔기일 수 있는 것인 유전자 요법 벡터.
9. 제1항, 제2항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 카탈라제가 스레딩 아암 및 랩핑 루프 도메인에서 결실을 갖는 것인 유전자 요법 벡터.
10. 제1항, 제2항, 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 카탈라제가 분비 서열을 갖는 것인 유전자 요법 벡터.
11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제가 헤파린 결합 도메인에서 결실을 가지며, 상기 결실이 1 내지 15개 또는 20개 또는 25개 또는 그 초과의 잔기의 것일 수 있는 것인 유전자 요법 벡터.
12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제가 턴 또는 루프 도메인의 1개 이상의 잔기의 대체를 갖는 것인 유전자 요법 벡터.
13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제가 턴 또는 루프 도메인의 1개 이상의 잔기의 결실 및 삽입을 갖는 것인 유전자 요법 벡터.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터인 유전자 요법 벡터.
15. 제14항에 있어서, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터인 유전자 요법 벡터.
16. 제15항에 있어서, AAV 벡터가 슈도타이핑된 것인 유전자 요법 벡터.
17. 제16항에 있어서, AAV 벡터가 AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 또는 AAV7 캡시드에 의해 슈도타이핑된 것인 유전자 요법 벡터.
18. 제16항에 있어서, AAV 벡터가 AAVrh.10, AAV8 또는 AAV5에 의해 슈도타이핑된 것인 유전자 요법 벡터.
19. 제15항에 있어서, AAV 벡터가 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10인 유전자 요법 벡터.
20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 1개의 벡터가 변형된 카탈라제 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하며, 카탈라제 서열 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제 서열이 프로테아제 기질 서열에 의해 분리되는 것인 유전자 요법 벡터.
21. 제20항에 있어서, 변형된 카탈라제가 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제에 대해 N-말단에 있는 것인 유전자 요법 벡터.
22. 제20항에 있어서, 변형된 카탈라제가 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제에 대해 C-말단에 있는 것인 유전자 요법 벡터.
23. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 1개의 벡터가 변형된 카탈라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 또 다른 벡터가 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 벡터의 소정량을 포함하는 제약 조성물.
25. 제24항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 제약 조성물.
26. 제24항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 제약 조성물.
27. 제26항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터인 제약 조성물.
28. 제27항에 있어서, 벡터가 AAV 벡터인 제약 조성물.
29. 제27항에 있어서, AAV 벡터가 슈도타이핑된 것인 제약 조성물.
30. 제29항에 있어서, AAV 벡터가 AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 또는 AAV7 캡시드에 의해 슈도타이핑된 것인 제약 조성물.
31. 제28항에 있어서, AAV 벡터가 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh.10인 제약 조성물.
32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터의 양이 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹⁶ 게놈 카피인 제약 조성물.
33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터의 양이 약 1 x 10¹² 내지 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피, 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹³ 게놈 카피, 또는 약 1 x 10¹³ 내지 약 1 x 10¹⁵ 게놈 카피인 제약 조성물.
34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
35. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 카탈라제를 코딩하는 바이러스 벡터 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 또 다른 바이러스 벡터를 포함하는 제약 조성물.
36. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 산화성 손상을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 포유동물이 아테롬성 동맥경화증, 암, 당뇨병, 류마티스 관절염, 허혈후 관류 손상, 심근 경색, 심혈관 질환, 만성 염증, 졸중, 패혈성 쇼크, 또는 다른 변성 및 신경계 질환 예컨대 알츠하이머 질환 또는 파킨슨 질환을 갖고 있거나 또는 가질 위험이 있는 것인 방법.
38. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 유효량을 COPD, 호흡 곤란 증후군 또는 섬유성 간질성 폐 질환의 예방, 억제 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 COPD, 호흡 곤란 증후군 또는 섬유성 간질성 폐 질환을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는 방법.
39. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 카탈라제를 코딩하는 바이러스 벡터의 소정량 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 바이러스 벡터의 소정량이 투여되는 것인 방법.
41. 제40항에 있어서, 바이러스 벡터가 순차적으로 투여되는 것인 방법.
42. 제40항에 있어서, 바이러스 벡터가 공동으로 투여되는 것인 방법.
43. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 카탈라제 및 변형된 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 코딩하는 바이러스 벡터가 투여되는 것인 방법.

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