BR112020019848A2

BR112020019848A2 - Terapia gênica para estresse oxidativo

Info

Publication number: BR112020019848A2
Application number: BR112020019848-0A
Authority: BR
Inventors: Ronald G. Crystal; Stephen M. Kaminsky; Christiana Salami
Original assignee: Cornell University
Priority date: 2018-04-03
Filing date: 2019-04-03
Publication date: 2021-01-05
Also published as: CN112236516A; EP3775177A1; AU2019249162A1; CA3095911A1; WO2019195387A1; IL277696A; US20210381002A1; KR20210005612A; JP2021520204A; WO2019195387A9

Abstract

terapia gênica para estresse oxidativo. a presente invenção refere-se a composições e métodos para terapia antioxidante.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERA- PIA GÊNICA PARA ESTRESSE OXIDATIVO". Referência Remissiva a Pedidos Relacionados

[0001] O presente pedido reivindica o benefício até a data de de- pósito do pedido Norte-Americano Nº 62/652.098, depositado em 3 de abril de 2018, cuja descrição é no presente documento incorporada por referência. Antecedentes

[0002] O estresse oxidativo, uma causa comum de dano tecidual com início ou aceleração concomitante da doença, é um fator de risco conhecido para aterosclerose, transtornos pulmonares crônicos, tal como doença pulmonar obstrutiva crônica e transtornos pulmonares fibróticos, câncer, diabetes, artrite reumatoide, perfusão pós-isquêmica lesão, infarto do miocárdio, doenças cardiovasculares, inflamação crô- nica, acidente vascular cerebral e choque séptico, envelhecimento e outras doenças degenerativas e neurológicas, tais como Alzheimer e Parkinson, e contribui para o processo de envelhecimento (Durackova, 2010; Mitscher et a/., 1996).

[0003] Os oxidantes derivam de fontes ambientais, incluindo polui- ção industrial, radiação cósmica e fumaça de cigarro ou da função ce- lular normal, tal como explosão respiratória de neutrófilos e monócitos, bem como enzimas de desintoxicação. O estresse oxidativo é mediado por radicais livres que incluem hidroxila e superóxido os quais, por sua vez, levam a espécies reativas, tal como peróxido de hidrogênio, de- nominadas juntas de espécies reativas de oxigênio (Reactive Oxygen Species, ROS). Estes oxidantes danificam lipídios, proteínas e DNA, os quais mediam várias das consequências patogênicas descritas acima e vários estudos demonstraram que os compostos antioxidantes podem ser protetores para aterosclerose, câncer, mutagênese e infla- mação (Mitscher et a/., 1996; Uttara et a/., 2009; Owen et al., 2000;

Sala et al., 2002).

[0004] Para proteção natural contra o estresse oxidativo, as prote- ínas antioxidantes catalase e superóxido dismutase catalisam a neu- tralização de peróxido de hidrogênio e superóxido, respectivamente (Mates et a/., 1999; Birben et al., 2012). Estas enzimas representam uma linha de defesa contra o estresse oxidativo iniciado pelo processo celular normal em indivíduos saudáveis, mas não têm a capacidade de lidar com a carga excessiva de oxidantes derivados de estados ambi- entais ou de hiperdoença em virtude da magnitude ou localização fisio- lógica. Por exemplo, a catalase é uma proteína intracelular tetramérica e, portanto, não é encontrada no soro nem nas superfícies mucosais, onde ela pode atuar como uma primeira linha de defesa para ROS exógenas (Goyal et al., 2010). A SOD tem três formas, SOD1, SOD2 e SOD3, as quais são definidas por suas localizações celulares, cito- plasma, mitocôndria e espaço extracelular ligado à heparina, respecti- vamente (Perry et al., 2010). Similar à catalase, as enzimas SOD não estão presentes no soro ou na superfície mucosal. A SOD3 é secreta- da, mas tem um domínio de ligação à heparina que se liga à superfície da célula e, portanto, não está disponível em níveis suficientes não ligados à superfície da célula para perfundir através da superfície epi- telial dos órgãos e atingir as superfícies mucosais (Perry et al., 2010). Sumário

[0005] É fornecida uma abordagem de terapia gênica que media a expressão de enzimas antioxidantes secretadas que conferem prote- ção contra o estresse oxidativo extracelular patogênico, incluindo nas superfícies mucosais. A expressão de longo prazo por vetores de vírus adenoassociados, retrovírus ou lentivírus, construídos com um cDNA que codifica uma catalase funcional monomérica secretada e uma su- peróxido dismutase extracelular modificada, constituem uma defesa de linha de frente para níveis exógenos ou inadequados de espécies rea-

tivas de oxigênio. Para resolver isto, as sequências de catalase e SOD3 foram modificadas para facilitar a secreção e difusão e, especi- ficamente, para que a SOD permaneça não ligada à superfície celular. O código genético para estas formas secretadas de catalase e SOD é incorporado, em uma modalidade, em um vetor de vírus adenoassoci- ado, de modo a fornecer níveis persistentes e consistentes destas en- zimas antioxidantes em uma região tratada, no soro e através do epité- lio e superfícies mucosais como uma barreira para agressões ambien- tais e patogênicas pelas espécies oxidantes peróxido de hidrogênio e superóxido. A estratégia para construir uma catalase monomérica se- cretada remove uma região relativamente não estruturada que media a aderência inter-molecular necessária para a formação do tetrâmero e a adição de uma sequência de sinalização de secreção. A SOD3 foi mo- dificada para substituir um loop que se acopla a monômeros para for- mar um tetrâmero maior com um segmento na sequência da SOD3 e a capacidade do domínio de ligação à heparina de aderir à matriz extra- celular foi eliminada. Tanto a catalase modificada quanto a SOD3 fo- ram liberadas no soro e mantiveram a função. Em uma modalidade, as duas enzimas antioxidantes podem ser administradas em vetores se- parados. Em uma modalidade, os vetores podem ser qualquer sorotipo do vetor de AAV. Em uma modalidade, o vetor pode ser um vetor de plasmídeo ou outro vetor viral, tal como um vetor de retrovírus, adeno- vírus ou lentivírus. Qualquer cassete de expressão pode ser usado e diferentes alterações nas sequências de proteínas para catalase e SOD3 podem ser feitas.

[0006] A administração do vetor pode resultar em proteção contra o insulto pelo estresse oxidativo derivado do meio ambiente, por exemplo, como um resultado de radiação ou exposição química, tal como em um ataque nuclear ou de gás (terrorismo), cigarro ou outro uso de tabaco, incluindo E-cigs ou vaporização, exposição à fumaça de charuto ou ROS endógenos inadequados provenientes de respos- tas inflamatórias. Em uma modalidade, o vetor pode ser usado em um método para prevenir, inibir ou tratar um ou mais transtornos incluindo, porém sem limitações, aterosclerose, câncer, diabetes, artrite reuma- toide, lesão de perfusão pós-isquêmica, infarto do miocárdio, doenças cardiovasculares, inflamação crônica, acidente vascular cerebral e choque séptico, envelhecimento e outras doenças degenerativas e neurológicas, tais como Alzheimer e Parkinson, e que contribuem para O processo de envelhecimento.

[0007] Em uma modalidade, é fornecido um vetor de terapia gêni- ca que compreende um cassete de expressão que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma catalase modificada que tem atividade de catalase, mas não forma tetrâmeros. Em uma modalidade, a catalase tem pelo menos 80 %, 82 %, 84 %, 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 % 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência de aminoácidos com uma de SEQ ID Nos. 1, 5-7 ou 12. Em uma modalidade, o vetor de terapia gênica compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma superóxido dismutase modificada que é secretada, mas não se liga a superfícies celulares e, opcionalmente, não forma tetrâmeros. Em uma modalidade, a superó- xido dismutase tem pelo menos 80 %, 82 %, 84 %, 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 % 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência de aminoácidos com uma de SEQ ID Nos. 2-4, 8 ou 10. Em uma mo- dalidade, é fornecido um vetor de terapia gênica que compreende um cassete de expressão que compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que codifica uma superóxido dismutase modificada que é se- cretada, mas não se liga a superfícies celulares. Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada é uma superóxido dismutase-3 modificada. Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada não se liga à heparina. Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada não forma tetrâmeros. Em uma modalidade, a catalase modificada tem uma eliminação no N-término no domínio do braço de encadeamento, eliminação a qual pode ser de 1 a 80 ou mais resíduos ou qualquer número inteiro entre 1 e 80, por exemplo, uma eliminação de 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 75 resíduos. Em uma modalidade, a catalase modifi- cada tem uma eliminação no N-término, por exemplo, uma eliminação de 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 resíduos. Em uma modalidade, a catalase modificada tem uma eliminação no N-término, por exemplo, uma eliminação de 15 ou 20 ou 20 a 25 resíduos. Em uma modalidade, a catalase modificada tem uma eliminação no domí- nio do loop envolvente, eliminação a qual pode ser 1, 2, 3,4, 5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 resí- duos. Em uma modalidade, a catalase modificada tem uma eliminação no domínio do loop envolvente, eliminação a qual pode ser de 15 a 20 ou 20 a 25 resíduos. Em uma modalidade, a catalase modificada tem uma eliminação no domínio do loop envolvente, eliminação a qual po- de ser a partir da posição 379, 380, 381, 382 383, 384 ou 385 até cer- ca da posição 398, 399, 400, 401, 402 ou 403, por exemplo, posição 381 a 400 na catalase (consulte Figura 2). Em uma modalidade, a ca- talase modificada tem uma eliminação no braço de encadeamento e nos domínios do loop envolvente. Em uma modalidade, a catalase modificada tem uma sequência secretora, por exemplo, uma sequên- cia secretora heteróloga.

[0008] Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada tem uma eliminação no domínio de ligação à heparina, eliminação a qual é nos resíduos do loop e pode ser de 1 a 15 ou 20 ou 25 ou mais resíduos ou qualquer número inteiro entre 1 e 15, por exemplo, uma eliminação de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23 ou 25 resíduos. Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada tem uma substituição de um ou mais resíduos de um domínio de volta ou loop, por exemplo, uma substituição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23, 25 ou mais resíduos. Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada tem uma substituição de um ou mais resíduos de um domínio de volta ou loop, por exemplo, uma substitui- ção de 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos por 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resí- duos. Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada tem uma substituição de resíduos de um domínio de volta ou loop, por exemplo, na posição 46, 47, 48, 49, 50, 51 52 ou 53 na posição 56, 57, 58, 59, 60, 61 ou 62 com resíduos na posição 66, 67, 68, 69, 70 ou 71 na posição 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 ou 79 ou posição 70, 71, 72,73, 74, ou 75 na posição 77, 78, 79, 80, 81, 82 ou 83 em superóxido dis- mutase (ver Figura 3). Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada tem uma eliminação e uma inserção de um ou mais resí- duos de um domínio de volta ou loop, por exemplo, uma eliminação de 1, 2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23, 25 ou mais resí- duos. Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada tem uma eliminação de um ou mais resíduos de um domínio de ligação à heparina, por exemplo, uma substituição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 23, 25 ou mais resíduos. Em uma modalidade, a superóxido dismutase modificada tem uma eliminação de um ou mais resíduos de um domínio de ligação à heparina, por exemplo, uma eli- minação de 10 a 30, por exemplo, 18, 19, 20, 21 ou 22 resíduos, ou uma eliminação de 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 resíduos. Em uma modali- dade, a superóxido dismutase modificada tem uma eliminação de um domínio de ligação à heparina, por exemplo, da posição 209, 210, 211, 212, 213, 214 ou 215 até a posição 235, 236, 237, 238, 239 ou 240 ou da posição 217, 218, 219, 220, 221, 222 ou 223 até a posição 235, 236, 237, 238, 239 ou 240 na superóxido dismutase.

[0009] Em uma modalidade, o vetor de terapia gênica é um vetor viral, por exemplo, um vetor de adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), retrovírus ou lentivírus. Em uma modalidade, o vetor de AAV é AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10. Em uma modalidade, um vetor compreende um cassete de expressão que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a catalase modificada e a superóxido dismutase modificada, cujas sequências de catalase e su- peróxido dismutase são separadas por uma sequência de substrato de protease. Em uma modalidade, a catalase modificada é N-terminal à superóxido dismutase modificada. Em uma modalidade, a catalase modificada é C-terminal à superóxido dismutase modificada. Em uma modalidade, um vetor compreende um cassete de expressão que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a cata- lase modificada e outro vetor compreende um cassete de expressão que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a superóxido dismutase modificada.

[0010] Também é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade do vetor. Em uma modalidade, o vetor está em um plasmídeo. Em uma modalidade, o vetor é um vetor viral, por exemplo, um vetor de adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), retrovírus ou lentivírus. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseu- dotipado. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseudotipado com a cápside de AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AA- Vhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 ou AAV7. Em uma modalidade, o genoma do vetor de AVV é AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10. Em uma modalidade, a quantidade do vetor tem cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10ºº cópias genômicas. Em uma modalidade, a quantidade do vetor tem cerca de 1 x 10º? a cerca de 1 x 10ºº cópias genômicas, cer- ca de 1 x 10! a cerca de 1 x 10º? cópias genômicas ou cerca de 1 x 10º? a cerca de 1 x 10º cópias genômicas. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende ainda um carreador farmaceuti-

camente aceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um vetor viral que codifica a catalase modificada e outro vetor viral que codifica a superóxido dismutase modificada.

[0011] Também é fornecido um método para prevenir, inibir ou tra- tar danos oxidativos em um mamífero que compreende: administrar ao mamífero uma quantidade eficaz do vetor ou da composição farma- cêutica. Em uma modalidade, o mamífero tem ou está em risco de ter aterosclerose, câncer, diabetes, artrite reumatoide, lesão de perfusão pós-isquêmica, infarto do miocárdio, doenças cardiovasculares, infla- mação crônica, acidente vascular cerebral, choque séptico ou outras doenças degenerativas e neurológicas, tais como mal de Alzheimer ou mal de Parkinson. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Em uma modalidade, é administrada uma quantidade de um vetor viral que codifica a catalase modificada e uma quantidade do vetor viral que codifica a superóxido dismutase modificada. Em uma modalidade, os vetores virais são administrados sequencialmente. Em uma modalida- de, os vetores virais são administrados simultaneamente. Em uma modalidade, um vetor viral que codifica a catalase modificada e a su- peróxido dismutase modificada é administrado. Em uma modalidade, o vetor de AAV é da cápside de AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AA- Vhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 ou AAV7. Em uma modalidade, o vetor de AAV é AAVrh.10, AAV8 ou AAV5. Em uma modalidade, o vetor de AAV é AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10. Uma dose do vetor viral pode ter cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10º cópias genômicas, cerca de 1 x 10"? a cerca de 1 x 10º5 cópias genômicas, cerca de 1 x 10" a cerca de 1 x 10º cópias genô- micas ou cerca de 1 x 10º a cerca 1 x 10ºº cópias genômicas. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseudotipado com a cápside de AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AA- Vhu.8, AAVhu.2 ou AAV7. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseudotipado com AAVrh.10, AAV8 ou AAV5. Em uma modalidade, o vetor de AAV é AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10.

[0012] É ainda fornecido um método para prevenir, inibir ou tratar DPOC, síndrome da dificuldade respiratória ou doença pulmonar in- tersticial fibrótica em um mamífero que compreende: administrar a um mamífero que precisa uma quantidade eficaz do vetor ou da composi- ção farmacêutica. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Em uma modalidade, é administrada uma quantidade de um vetor viral que codifica a catalase modificada e uma quantidade do vetor viral que codifica a superóxido dismutase modificada. Em uma modalidade, os vetores virais são administrados sequencialmente. Em uma modalida- de, os vetores virais são administrados simultaneamente. Em uma modalidade, um vetor viral que codifica a catalase modificada e a su- peróxido dismutase modificada é administrado. Em uma modalidade, o vetor de AAV é da cápside de AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AA- Vhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 ou AAV7. Em uma modalidade, o vetor de AAV é AAVrh.10, AAV8 ou AAV5. Em uma modalidade, o vetor de AAV é AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10. Uma dose do vetor viral pode ter cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10º cópias genômicas, cerca de 1 x 10”? a cerca de 1 x 10º cópias genômicas, cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10º cópias genô- micas ou cerca de 1 x 10º? a cerca 1 x 105 cópias genômicas. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseudotipado com a cápside de AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AA- Vhu.8, AAVhu.2 ou AAV7. Em uma modalidade, o vetor de AAV é pseudotipado com AAVrh.10, AAV8 ou AAV5. Em uma modalidade, o vetor de AAV é AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10.

Breve Descrição dos Desenhos

[0013] Figuras 1A-B. Carga de oxidante e defesas antioxidantes do pulmão. A) O pulmão está estressado com oxidantes inalados e, na

DPOC, com oxidantes extracelulares endógenos provenientes de célu- las inflamatórias ativadas. B) As células pulmonares têm 3 principais defesas antioxidantes enzimáticas: SOD (catalisa 07 em H2O>; cata- lase (H202 em H2O) e glutationa (GSH; H202 em H2O; GSH oxidada forma GSSG, a qual é reduzida por várias enzimas intracelulares). Ne- nhum destes sistemas enzimáticos fornecem defesas antioxidantes extracelulares adequadas.

[0014] Figuras 2A-B. Modificações da catalase para criar um mo- nômero extracelular funcional. A) Estrutura do monômero da catalase humana. B) Sequência de aminoácidos do monômero da catalase hu- mana (SEQ ID NO: 1). São mostradas as regiões onde foram feitas as modificações no N-término e no domínio do loop envolvente. Três es- tratégias foram usadas: hCatNT' (eliminação de 20 aminoácidos do N- término), hCatWL' (eliminação de 20 aminoácidos do domínio do loop envolvente) e hCat NTWL' (combinação das 2 eliminações). Para dire- cionar a secreção, um peptídeo sinalizador 5' foi adicionado; para de- tectar a proteína, uma etiqueta (tag) de hemaglutinina (HA) 3' foi adici- onada.

[0015] Figuras 3A-B. Modificações para gerar um monômero de SOD3 extracelular funcional. A) Estrutura do monômero de SOD3. B) Sequência de aminoácidos da SOD3 humana (SEQ ID NO: 8). São mostradas as regiões onde as modificações foram feitas com detalhes das modificações.

[0016] Figura 4. LEX 5, uma terapia gênica com base em antioxi- dante enzimático extracelular difusível; o vetor era 1 de 4 vetores de transferência gênica candidatos (LEX 5a, b, c e d). Todos os candida- tos têm o cassete de expressão idêntico, diferindo apenas quanto às sequências codificadoras da enzima antioxidante. Todos são empaco- tados na cápside de AAVrh.10 para gerar os 4 vetores candidatos.

[0017] Figuras 5A-C. Avaliação das construções de catalase mo-

dificadas. A) Secreção das construções de catalase modificadas. Wes- tern (gel de redução de SDS; etiqueta anti-HA) do sobrenadante de células 293T transfectadas com as 3 construções de catalase modifi- cadas. Linha 1 - simulação (mock); Linha 2 - construção hCatNT'; Li- nha 3 - nCATWL;; Linha 4 - NCATNTWL; e Linha 5 - controle de cata- lase. B) Análise da atividade da catalase dos sobrenadantes gerados pelas 3 construções. Todas as 3 são secretadas, mas apenas hCatWL" estava ativa. C) Análise dos sobrenadantes da construção hCatWD- em géis de Bis-Tris para demonstrar que a construção hCatND' é mo- nomérica.

[0018] Figuras 6A-B. Construção de SOD3 modificada. A) Secre- ção das construções de SOD3 modificadas. Western (etiqueta anti-HA) do sobrenadante de células 293T transfectadas com: Linha 1 — simu- lação (mock); Linha 2 - SOD3 marcada com HA não modificada; Linha 3 - SOD3hd". Apenas SOD3hd' está no sobrenadante. B) Western anti- HA de frações dos sobrenadantes de SOD3hd' passados em uma construção de coluna de dimensionamento Sephacryl para demonstrar que a construção SOD3hd': é monomérica. MW aproximados são cal- culados a partir das especificações da coluna.

[0019] Figuras 7A-F. Avaliação da função de LEX 5a e LEX 5b in vivo. AAVrh.10hCatWD- (LEX 5a) ou AAVrh.10hSOD3hd' (LEX 5b) fo- ram administrados por via intravenosa a camundongos Balb/c machos (dose total de 10** cópias genômicas). Duas semanas depois, amos- tras do fígado e pulmão foram coletadas para análise do DNA do vetor e o soro foi avaliado quanto à atividade de catalase e SOD. A-C) LEX 5a. A) DNA de vetor no fígado; B) DNA de vetor no pulmão; e C) Ativi- dade sérica de catalase. D-F) LEX 5b. D) DNA de vetor no fígado; E) DNA de vetor no pulmão; e F) Atividade sérica de SOD.

[0020] Figura 8. Estrutura da catalase. Cada monômero tem qua- tro domínios. No primeiro domínio, os resíduos do terminal amino in-

cluem aqueles para a troca de braço de encadeamento que mantém as unidades monoméricas juntas. O segundo domínio é o domínio heme. O terceiro domínio é o domínio do loop envolvente, onde os quatro monômeros se envolvem ao redor para formar um tetrâmero; pontes de sal e interações iônicas entre cadeias laterais de aminoáci- dos positiva e negativamente carregadas mantêm os quatro monôme- ros juntos. O quarto domínio inclui resíduos do terminal carboxila que desempenham um papel na orientação do substrato H2O2 de entrada para degradação catalítica.

[0021] Figura 9. Modificações genéticas para inibir a formação do tetrâmero de catalase. Para evitar a formação de monômero, os resí- duos de aminoácidos no braço de encadeamento do N-término e/ou domínios de loop envolvente são excluídos, mantendo o quadro de leitura e assegurando que as funções enzimáticas e de ligação a NADPH não sejam modificadas.

[0022] Figura 10. Sequências de catalase modificada.

[0023] Figura 11. Caracterização in vitro do tetrâmero de catalase. Apesar do sinal de secreção, a catalase de tipo selvagem permanece nas células (análise Western divide o tetrâmero em unidades monomé- ricas para análise).

[0024] Figura 12. Caracterização in vitro de construções de cata- lase modificada.

[0025] Figuras 13A-B. Caracterização in vitro de construções de catalase modificadas. A) Transferência de Western. B) Atividade de catalase no sobrenadante.

[0026] Figura 14. Avaliação de sobrenadantes de construções de catalase para separação de catalase monomérica e multimérica. As amostras foram avaliadas em gel de Bis-Tris, coradas e hibridizadas com anticorpo anti-catalase (ABCAM: ab88067); tamanhos de banda previstos, 60 kDa para monômero e 240 kDa para tetrâmero. Todas as

3 construções secretaram apenas a construção monomérica.

[0027] Figura 15. Avaliação in vitro de sobrenadantes quanto à atividade de catalase através de construções para catalase monoméri- ca e multimérica. As construções monoméricas expressam proteínas com atividade de catalase.

[0028] Figuras 16A-B. Avaliação in vivo da expressão de catalase humana por um AAVrh.10 que codifica uma catalase humana com um domínio de envolvimento modificado (hCatWL). A) Design experimen- tal. B) Número de cópias do vetor no fígado.

[0029] Figuras 17A-B. Curso de longo prazo da atividade de cata- lase in vivo mediada por um vírus adenoassociado de sorotipo rh.10 que codifica uma catalase humana com um domínio de loop envolven- te modificado (hCatWL'). A) Design de vetor. B) Design experimental.

[0030] Figura 18. Curso de longo prazo de atividade da catalase in vivo mediada por um vírus adenoassociado de sorotipo rh.10 que codi- fica o domínio de loop envolvente de catalase humana modificada (hCatWL'). Atividade da catalase no soro de camundongos machos C57bI/6J dos seguintes grupos de tratamento da semana 2 à semana

12. PBS (n = 4). AAVrh.10hCATWL (n = 5 até a semana 4, | camun- dongo foi sacrificado na semana 4 e, em seguida, outro camundongo foi sacrificado na semana 8). hCatWL' (exclusão de 20 AA do domínio de loop envolvente e etiqueta de HA).

[0031] Figuras 19A-B. Superóxido dismutase 3. A) Estrutura da proteína. B) Estrutura cristalográfica.

[0032] Figura 20. SOD3 modificada para aumentar a disponibili- dade extracelular. Para melhorar a difusão extracelular, os resíduos da "volta" no domínio de ligação à heparina são modificados.

[0033] Figura 21. Avaliação in vitro de NDSOD3hd-.

[0034] Figura 22. Análise de formas monoméricas e multiméricas de SOD3 no sobrenadante expresso por SOD3hd-". As frações de uma coluna de exclusão por tamanho foram passadas em gel de Bis-Tris. Ensaio de Western com anticorpo anti-HA; monômero com MW de 30 kDa é esperado em frações para as Linhas 2-5.

[0035] Figuras 23A-B. Quantificação de gONA de SOD3hd' no fígado e pulmão após administração IV. A) Quantificação de DNA no fígado. B) Quantificação de DNA no pulmão.

[0036] Figura 24. Atividade de SOD3 modificada no soro (Semana 2).

[0037] Figura 25. Proteção antioxidante in vitro mediada pela SOD3 modificada e catalase em células epiteliais das grandes vias aéreas expostas ao oxidante. Os dados mostram as propriedades an- tioxidantes da SOD3 modificada e da catalase de proteger as células epiteliais das grandes vias respiratórias humanas contra os oxidantes derivados de xantina oxidase e do extrato da fumaça do cigarro (Ciga- rette Smoke Extract, CSE).

[0038] Figuras 26A-B. Proteção antioxidante in vitro mediada pela SOD3 modificada e catalase em células epiteliais das grandes vias aéreas expostas ao oxidante. O ensaio de LDH mede a morte celular, e um menor nível de LDH indica proteção contra a morte celular indu- zida por oxidante. A SOD3 modificada forneceu proteção aprimorada contra o extrato da fumaça de cigarro e oxidantes derivados de xantina oxidase (redução da atividade de LDH por exposição ao CSE ou xanti- na oxidase). Tanto a SOD3 modificada quanto a catalase modificada fornecem melhor proteção contra a exposição à xantina oxidase com- parado com a SOD3 e catalase não modificada.

[0039] Figura 27. Esquema de duas construções. Descrição Detalhada

[0040] Na descrição a seguir, referência é feita aos desenhos ane- xos que formam uma parte deste documento e nos quais são mostra- das, a título de ilustração, modalidades específicas que podem ser praticadas. Estas modalidades são descritas em detalhes para permitir que aqueles versados na técnica pratiquem a invenção, e deve ser en- tendido que outras modalidades podem ser usadas e que alterações lógicas podem ser feitas sem se afastar do escopo da presente inven- ção. A descrição a seguir de modalidades exemplificativas, portanto, não deve ser tomada em um sentido limitado, e o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações em anexo.

[0041] O Resumo é fornecido de acordo com 37 C.F.R. 81.72 (b) para permitir ao leitor determinar rapidamente a natureza e a essência da descrição técnica. O Resumo é apresentado com o entendimento de que não será usado para interpretar ou limitar o escopo ou o signifi- cado das reivindicações. Definições

[0042] Um "vetor" se refere a uma macromolécula ou associação de macromoléculas que compreende ou se associa a um polinucleotí- deo e que pode ser usado para mediar a distribuição do polinucleotí- deo a uma célula, in vitro ou in vivo. Vetores ilustrativos incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores virais, lipossomas e outros veículos de distribuição gênica. O polinucleotídeo a ser distribuído, algumas vezes denominado como um "polinucleotídeo alvo" ou "transgene", pode compreender uma sequência codificadora de interesse em terapia gê- nica (tal como um gene que codifica uma proteína de interesse tera- pêutico), uma sequência codificadora de interesse no desenvolvimento de uma vacina (tal como um polinucleotídeo que expressa uma proteí- na, polipeptídeo ou peptídeo adequado para induzir uma resposta imune em um mamífero) e/ou um marcador selecionável ou detectá- vel).

[0043] "Transdução", "transfecção", "transformação" ou "transdu- ção", conforme usado no presente documento, são termos que se refe- rem a um processo para a introdução de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, levando à expressão do polinucleotídeo, por exemplo, o transgene na célula, e inclui o uso de vírus recombi- nante para introduzir o polinucleotídeo exógeno na célula hospedeira. A transdução, transfecção ou transformação de um polinucleotídeo em uma célula pode ser determinada por meio de métodos bem conheci- dos na técnica incluindo, porém sem limitações, expressão de proteína (incluindo níveis em estado estacionário), por exemplo, através de ELISA, citometria de fluxo e transferência de Western, medição de DNA e RNA através de ensaios de heterologização, por exemplo, transferências de Northern, transferências de Southern e ensaios de mobilidade de deslocamento de gel. Os métodos usados para a intro- dução do polinucleotídeo exógeno incluem técnicas bem conhecidas, tais como infecção ou transfecção viral, lipofecção, transformação e eletroporação, bem como outras técnicas de distribuição de genes não virais. O polinucleotídeo introduzido pode ser mantido de forma estável ou transitoriamente na célula hospedeira.

[0044] "Distribuição gênica" se refere à introdução de um polinu- cleotídeo exógeno em uma célula para transferência gênica e pode abranger direcionamento, ligação, absorção, transporte, localização, integração e expressão de replicon.

[0045] "Transferência gênica" se refere à introdução de um polinu- cleotídeo exógeno em uma célula que pode abranger direcionamento, ligação, absorção, transporte, localização e integração de replicon, po- rém, é distinto e não implica na subsequente expressão do gene.

[0046] "Expressão gênica" ou "expressão" se refere ao processo de transcrição, tradução e modificação pós-traducional do gene.

[0047] Um vírus ou partícula viral "infecciosa" é aquela que com- preende um componente polinucleotídico que é capaz de ser distribuí- do em uma célula para a qual a espécie viral é trófica. O termo não implica necessariamente em qualquer capacidade de replicação do vírus.

[0048] O termo "polinucleotídeo" se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, incluindo desoxirribonu- cleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Um polinu- cleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nu- cleotídeos metilados ou capeados, e análogos de nucleotídeos, e pode ser interrompido por componentes não nucleotídicos. Se presente, modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas an- tes ou após a montagem do polímero. O termo polinucleotídeo, con- forme usado no presente documento, se refere indistintamente a mo- léculas fita simples e dupla. A menos que especificado ou exigido de outra forma, qualquer modalidade descrita no presente documento que seja um polinucleotídeo abrange tanto a forma de fita dupla quanto ca- da uma das duas formas de fita simples complementares conhecidas ou previstas para formar a forma de fita dupla.

[0049] Um polinucleotídeo "isolado", por exemplo, plasmídeo, ví- rus, polipeptídeo ou outra substância, se refere a uma preparação da substância desprovida de pelo menos alguns dos outros componentes os quais também podem estar presentes onde a substância ou uma substância similar ocorre naturalmente ou é inicialmente preparada a partir da mesma. Assim, por exemplo, uma substância isolada pode ser preparada usando uma técnica de purificação para enriquecê-la a partir de uma mistura fonte. O ácido nucleico, peptídeo ou polipeptídeo isolado está presente em uma forma ou configuração diferente daque- la na qual ele é encontrado na natureza. Por exemplo, uma dada se- quência de DNA (por exemplo, um gene) é encontrada no cromosso- mo da célula hospedeira na proximidade de genes vizinhos; sequên- cias de RNA, tal como uma sequência de mRNA específica que codifi- ca uma proteína específica, são encontradas na célula como uma mis- tura com vários outros mMRNAs que codificam uma infinidade de prote-

ínas. A molécula de ácido nucleico isolada pode estar presente na forma fita simples ou fita dupla. Quando uma molécula de ácido nu- cleico isolada deve ser usada para expressar uma proteína, a molécu- la conterá, no mínimo, a fita senso ou codificadora (isto é, a molécula pode ser fita simples), mas pode conter as fitas senso e antissenso (isto é, a molécula pode ser fita dupla). O enriquecimento pode ser medido em uma base absoluta, tal como peso em volume de solução, ou pode ser medido em relação a uma segunda substância potencial- mente interferente presente na mistura de origem. Enriquecimento crescente das modalidades da presente invenção é previsto. Assim, por exemplo, pode haver um enriquecimento de 2 vezes, enriqueci- mento de 10 vezes, enriquecimento de 100 vezes ou um enriqueci- mento de 1000 vezes.

[0050] Uma "sequência reguladora de transcrição" se refere a uma região genômica que controla a transcrição de um gene ou sequência codificadora à qual ela está operacionalmente ligada. Sequências re- guladoras de transcrição de uso na presente invenção geralmente in- cluem pelo menos um promotor de transcrição e também podem incluir um ou mais intensificadores e/ou terminadores de transcrição.

[0051] "Operativamente ligado" se refere a um arranjo de dois ou mais componentes, em que os componentes assim descritos estão em uma relação que permite que funcionem de uma maneira coordenada. A título de ilustração, uma sequência reguladora de transcrição ou um promotor está operativamente ligado a uma sequência codificadora se o TRS ou promotor promover a transcrição da sequência codificadora. Um TRS operativamente ligado é geralmente unido em cis com a se- quência codificadora, mas não é necessariamente diretamente adja- cente a ela.

[0052] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipi- camente distinta da entidade com a qual ocorre a comparação. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por meio de técnicas de en- genharia genética em um tipo de célula diferente é um polinucleotídeo heterólogo (e, quando expresso, pode codificar um polipeptídeo hete- rólogo). Da mesma forma, um elemento regulador de transcrição, tal como um promotor que é removido de sua sequência codificadora na- tiva e operativamente ligado a uma sequência codificadora diferente, é um elemento regulador de transcrição heterólogo.

[0053] Um "terminador" se refere a uma sequência polinucleotídica que tende a diminuir ou evitar a transcrição de leitura (isto é, diminui ou impede que a transcrição originada em um lado do terminador con- tinue até o outro lado do terminador). O grau até o qual a transcrição é interrompida é, tipicamente, uma função da sequência de base e/ou do comprimento da sequência terminadora. Em particular, conforme é bem conhecido em vários sistemas biológicos moleculares, sequên- cias de DNA particulares, denominadas de modo geral como "sequên- cias de terminação de transcrição", são sequências específicas que tendem a interromper a transcrição de leitura pela RNA polimerase, presumivelmente ao fazer com que a molécula de RNA polimerase pa- re e/ou se desligue do DNA que está sendo transcrito. Um exemplo típico de tais terminadores específicos para sequência inclui sequên- cias de poliadenilação ("poliA"), por exemplo, poliA de SV40. Além ou em lugar de tais terminadores específicos para sequência, inserções de sequências de DNA relativamente longas entre um promotor e uma região codificadora também tendem a interromper a transcrição da re- gião codificadora, geralmente em proporção ao comprimento da se- quência interveniente. Este efeito presumivelmente surge porque sem- pre há alguma tendência para uma molécula de RNA polimerase se separar do DNA que está sendo transcrito, e aumentar o comprimento da sequência a ser transcrita antes de atingir a região codificadora ge- ralmente aumentaria a probabilidade de que o desligamento ocorresse antes que a transcrição da região codificadora seja concluída ou pos- sivelmente até mesmo iniciada. Terminadores podem, assim, impedir a transcrição apenas em uma direção (terminadores "unidirecionais") ou ambas as direções (terminadores "bidirecionais") e podem ser com- postos de sequências de término específicas para sequência ou termi- nadores não específicos para sequência ou ambos. Uma variedade de tais sequências terminadoras é conhecida na técnica; e usos ilustrati- vos de tais sequências no contexto da presente invenção são forneci- dos abaixo.

[0054] "Células hospedeiras", "linhagens de células", "culturas de células", "linhagem de células de empacotamento" e outros termos de- notam células eucariotas superiores, tais como células de mamíferos, incluindo células humanas, úteis na presente invenção, por exemplo, para produzir vírus recombinantes ou polipeptídeo de fusão recombi- nante. Estas células incluem a progênie da célula original que foi transduzida. Deve ser entendido que a progênie de uma única célula pode não ser necessariamente completamente idêntica (quanto à mor- fologia ou complemento genômico) à célula-mãe original.

[0055] "Recombinante", conforme aplicado a um polinucleotídeo, significa que o polinucleotídeo é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição e/ou ligação e outros procedimentos que resultam em uma construção que é distinta de um polinucleotídeo encontrado na natureza. Um vírus recombinante é uma partícula viral que compreende um polinucleotídeo recombinante. Os termos inclu- em, respectivamente, réplicas da construção polinucleotídica original e a progênie da construção viral original.

[0056] Um "elemento de controle" ou "sequência de controle" é uma sequência de nucleotídeos envolvida em uma interação de molé- culas que contribui para a regulação funcional de um polinucleotídeo, incluindo replicação, duplicação, transcrição, emenda (splicing), tradu-

ção ou degradação do polinucleotídeo. A regulação pode afetar a fre- quência, velocidade ou especificidade do processo e pode ser de natu- reza intensificadora ou inibidora. Elementos de controle conhecidos na técnica incluem, por exemplo, sequências reguladoras de transcrição, tais como promotores e intensificadores. Um promotor é uma região de DNA capaz, sob determinadas condições de ligação à RNA polimera- se, de iniciar a transcrição de uma região codificadora geralmente lo- calizada a jusante (na direção 3') do promotor. Promotores incluem promotores de AAV, por exemplo, promotores de AVV P5, P19, P40 e ITR, bem como promotores heterólogos.

[0057] Um "vetor de expressão" é um vetor que compreende uma região que codifica um produto gênico de interesse e é usado para efetuar a expressão do produto gênico em uma célula alvo pretendida. Um vetor de expressão também compreende elementos de controle operativamente ligados à região codificadora para facilitar a expressão da proteína no alvo. A combinação de elementos de controle e um ge- ne ou genes aos quais eles estão operativamente ligados para expres- são é, algumas vezes, denominada como um "cassete de expressão", um grande número dos quais são conhecidos e estão disponíveis na técnica ou podem ser facilmente construídos a partir de componentes que estão disponíveis na técnica.

[0058] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados indistintamente no presente documento para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado; por exemplo, forma- ção de ligação de dissulfeto, glicosilação, acetilação, fosfonilação, lipi- dação ou conjugação com um componente de marcação.

[0059] O termo "exógeno", quando usado em relação a uma prote- Ína, gene, ácido nucleico ou polinucleotídeo em uma célula ou orga- nismo, se refere a uma proteína, gene, ácido nucleico ou polinucleotí-

deo que foi introduzido na célula ou organismo por meios naturais. Um ácido nucleico exógeno pode ser de um organismo ou célula diferente, ou pode ser uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucleico que ocorre naturalmente dentro do organismo ou célula. A título de exem- plo não limitativo, um ácido nucleico exógeno está em uma localização cromossômica diferente daquela das células naturais ou é flanqueado por uma sequência de ácidos nucleicos diferente daquela encontrada na natureza, por exemplo, um cassete de expressão que liga um pro- motor de um gene a um quadro de leitura aberto para um produto gê- nico de um gene diferente.

[0060] "Transformado" ou "transgênico" é usado no presente do- cumento para incluir qualquer célula hospedeira ou linhagem de célu- las que foi alterada ou aumentada pela presença de pelo menos uma sequência de DNA recombinante. As células hospedeiras da presente invenção são, tipicamente, produzidas por meio de transfecção com uma sequência de DNA em um vetor de expressão de plasmídeo, tal como uma sequência de DNA linear isolada, ou infecção com um vetor viral recombinante.

[0061] O termo "homologia de sequência" significa a proporção de correspondências de bases entre duas sequências de ácidos nucleicos ou a proporção de correspondências de aminoácidos entre duas se- quências de aminoácidos. Quando a homologia de sequência é ex- pressa como uma porcentagem, por exemplo, 50 %, a porcentagem denota a proporção de correspondências ao longo do comprimento de uma sequência selecionada que é comparada com alguma outra se- quência. Lacunas (em qualquer uma das duas sequências) são permi- tidas para maximizar a correspondência; normalmente são usados comprimentos de lacuna de 15 bases ou menos, 6 bases ou menos, por exemplo, com 2 bases ou menos. Ao usar oligonucleotídeos como sondas ou tratamentos, a homologia de sequência entre o ácido nu-

cleico alvo e a sequência de oligonucleotídeos é, em geral, não menos de 17 correspondências de bases alvo dentre 20 possíveis correspon- dências de pares de bases de oligonucleotídeos (85 %); não menos de 9 correspondências dentre 10 possíveis correspondências de pares de bases (90 %) ou não menos de 19 correspondências dentre 20 possí- veis correspondências de pares de bases (95 %).

[0062] Duas sequências de aminoácidos são homólogas se houver uma identidade parcial ou completa entre suas sequências. Por exem- plo, 85 % de homologia significa que 85 % dos aminoácidos são idên- ticos quando as duas sequências estão alinhadas para correspondên- cia máxima. Lacunas (em qualquer uma das duas sequências que es- tão sendo comparadas) são permitidas para maximizar a correspon- dência; normalmente, comprimentos de lacuna de 5 ou menos ou 2 ou menos. Alternativamente, duas sequências de proteínas (ou sequên- cias polipeptídicas derivadas das mesmas de pelo menos 30 aminoá- cidos de comprimento) são homólogas, conforme este termo é usado no presente documento, se elas tiverem uma pontuação de alinhamen- to de mais de 5 (em unidades de desvio padrão) usando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade por lacu- na de 6 ou maior. As duas sequências ou partes das mesmas são ain- da homólogas se seus aminoácidos forem igual ou mais de 50 % idên- ticos quando alinhados de forma otimizada usando o programa ALIGN.

[0063] O termo "corresponde a" é usado no presente documento para significar que uma sequência polinucleotídica está estruturalmen- te relacionada a toda ou uma parte de uma sequência polinucleotídica de referência ou que uma sequência polipeptídica está estruturalmente relacionada a toda ou uma parte de uma sequência polipeptídica de referência, por exemplo, elas têm pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais, por exemplo, 99 % ou 100 % de identidade de sequência. Em contraste, o termo "complementar a" é usado no presente documento para significar que a sequência complementar é homóloga a toda ou uma parte de uma sequência polinucleotídica de referência. Para ilus- tração, a sequência de nucleotídeos "TATAC" corresponde a uma se- quência de referência "TATAC" e é complementar a uma sequência de referência "GTATA".

[0064] O termo "identidade de sequência" significa que duas se- quências de polinucleotídeos são idênticas (isto é, em uma base de nucleotídeo a nucleotídeo) ao longo da janela de comparação. O termo "porcentagem de identidade de sequência" significa que duas sequên- cias polinucleotídicas são idênticas (isto é, em uma base de nucleotí- deo a nucleotídeo) ao longo da janela de comparação. O termo "por- centagem de identidade de sequência" é calculado ao comparar duas sequências alinhadas de forma otimizada ao longo da janela de com- paração, determinar o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U ou |) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondidas, divi- dir o número de posições correspondidas pelo número total de posi- ções na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multipli- car o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. O termo "identidade substancial", conforme usado no pre- sente documento, denota uma característica de uma sequência poli- nucleotídica em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 85 por cento de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 90 a 95 por cento de identidade de sequência ou pelo menos 99 por cento de identidade de sequência comparado com uma sequência de referência ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de nucleotídeos, frequentemente ao longo de uma janela de pelo menos 20-50 nucleotídeos, em que a porcenta- gem de identidade de sequência é calculada ao comparar a sequência de referência com a sequência de polinucleotídeo que pode incluir eli-

minações ou adições que totalizam 20 por cento ou menos da sequên- cia de referência na janela de comparação.

[0065] Substituições "conservativas" de aminoácidos são, por exemplo, ácidos aspártico-glutâmico como aminoácidos polares; lisi- na/arginina/histidina como aminoácidos polares básicos; leucina/iso- leucina/metionina/valina/alanina/glicina/prolina como aminoácidos não polares ou hidrofóbicos; serina/treonina como aminoácidos hidrofílicos polares ou não carregados. A substituição conservativa de aminoáci- dos também inclui agrupamentos com base em cadeias laterais. Por exemplo, um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoáci- dos que tem cadeias laterais de hidroxila alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais que contêm amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histi- dina; e um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais que contêm enxofre é cisteína e metionina. Por exemplo, é razoável esperar que a substituição de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um asparta- to por um glutamato, uma treonina por uma serina ou uma substituição similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacio- nado não terá um grande efeito sobre as propriedades do polipeptídeo resultante. Se uma troca de aminoácido resulta em um polipeptídeo funcional pode ser facilmente determinado por meio do ensaio da ati- vidade específica do polipeptídeo. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades em comum da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, Iys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

[0066] A invenção também prevê polipeptídeos com substituições não conservativas. As substituições não conservativas envolvem a tro- ca de um membro de uma das classes descritas acima por outra. Composições e Métodos

[0067] Como um mecanismo para lidar com o estresse oxidativo, não há precedente para as modificações descritas no presente docu- mento para duas enzimas antioxidantes usadas individualmente ou em combinação em uma abordagem de transferência gênica. Em uma modalidade, modificações de proteína foram concebidas e preparadas construções genéticas para as formas monoméricas secretadas das enzimas catalase e superóxido dismutase 3. A incorporação do código genético para cada uma foi inserida no cassete de expressão, por exemplo, de um vetor viral, tal como um vetor viral adenoassociado, separadamente ou combinado como uma única sequência traduzida com um sítio de clivagem interveniente. A expressão mediada por ve- tor fornece uma catalase ou SOD, ou ambas, ao meio extracelular, com transferência para o soro e as superfícies mucosais como uma barreira de linha de frente ao estresse oxidativo. O uso destas aborda- gens de transferência gênica protege contra doenças e patologias me- diadas pela oxidação.

[0068] O uso de terapia gênica se baseia em um vetor de expres- são persistente, tal como um vetor virak adenoassociado (AAV) (mas poderia ser outro vetor viral, tal como um vetor retro- ou lentiviral). As estruturas de proteínas tridimensionais das enzimas catalase humana e SOD3 humana, as quais são potentes armas antioxidantes de prote- ção contra ROS, foram examinadas. Foi elaborada uma estratégia pa- ra modificar cada enzima com o objetivo de produção endógena medi- ada por vetor de construções monoméricas secretadas e funcionais que podem constituir uma linha de frente de defesa para perfundir através da superfície epitelial dos órgãos e atingir as superfícies mu-

cosais. Catalase

[0069] Em uma modalidade, há uma adição ao código genético, no N-término da proteína, de um peptídeo sinalizador de secreção (por exemplo, de imunoglobulina humana; consulte SEQ ID NO: 13) para fornecer instruções para a maquinaria de produção de proteína celular para direcionar a sequência traduzida a ser secretada a partir da célu- la. Em uma modalidade, o código genético foi modificado para remover as sequências que codificam um loop na sequência da proteína que forma a interface de ligação entre monômeros no tetrâmero. Em uma modalidade, o DNA que codifica os aminoácidos 381 a 400 foi elimina- do, de modo que as extremidades na estrutura da proteína tridimensi- onal permaneceram próximas uma da outra e, portanto, a cadeia de proteína aparada não é restringida pela remoção do loop intermediário para minimizar o impacto sobre a estrutura geral da proteína. SOD3

[0070] Em uma modalidade, o código genético para os resíduos de aminoácidos 50 a 59 foi removido e substituído por aquele dos amino- ácidos 74 a 80, outro loop flexível na estrutura da SOD3 escolhido pa- ra minimizar a imunidade que poderia ocorrer pela introdução de se- quências diferentes da SOD3 na estrutura. Em uma modalidade, há uma eliminação do código genético para a região que codifica o domí- nio de ligação da matriz extracelular/heparina (aminoácidos 220 a 240) para permitir que a proteína secretada se difunda livremente a partir da superfície celular. Uma vez que a SOD3 de tipo selvagem codifica uma sequência de sinal de secreção, nenhuma alteração foi feita no CONA que codifica o terminal amino.

[0071] Em uma modalidade, ambos os transgenes foram coloca- dos em um cassete de expressão atrás do promotor híbrido de cito- megalovírus de expressão constitutiva (CMV)/beta-actina de galinha e incorporados no vetor de sorotipo AAVrh.10. Uma sequência de cliva- gem de furina-2a interveniente fornece a capacidade para a sequência individual traduzida de produzir dois produtos polipeptídicos separa- dos, catalase monomérica secretada e SOD3 monomérica secretada (Fang et al., 2005).

[0072] Sequências de aminoácidos exemplificativas para a cata- lase são fornecidas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID Nos. 5-7 ou 12, e se- quências de SOD exemplificativas são fornecidas em SEQ ID Nos. 2- 4,8e10: SEQ ID NO:2 1 mlallcscll laagasdawt gedsaepnsd saewirdmya kvteiwgevm qgrrdddgalh 61 aacqvagpsat ldaagprvtg vvlfraglapr akldaffale gfptepnsss raihvhafgd 121 lsqggcestgp hynplavphp qghpgdfgnfa vrdgslwryr aglaaslagp hsivgravvv 181 hageddlgrg gngasvengn agrrlaccvv gvcegpglwer garehserkk rrreseckaa SEQ ID NO:3 1 mlallcscll laagasdawt gedsaepnsd saewirdmya kvteiwgevm qgrrdddgalh 61 aacqvagpsat ldaagprvtg vvlfraglapr akldaffale gfptepnsss raihvhafgd 121 lsqggcestgp hynplavphp qghpgdfgnfa vrdgslwryr aglaaslagp hsivgravvv 181 hageddlgrg gngasvengn agrrlaccvv gvcegpglwer garehserkk rrreseckaa SEQ ID NO:4 1 mlallcscll laagasdawt gedsaepnsd saewirdmya kvteiwgevm qrrdddgalh 61 aacqvapsat ldaaqgprvtg vvlfralapr akldaffale gfptepnsss raihvhgfgd 121 lsggcestgp hynplavphp ghpgdfgnfa vrdgslwryr aglaaslagp hsivgravvv 181 hageddlgrg gngasvengn agrrlaccvv gvegpglwer garehserkk rrreseckaa SEQ ID NO:6 1 madsrdpasd qmaghwkegra aqgkadvlttg agnpvgdkln vitvgprapl lvgdvvftde 61 mahfdrerip ervvhakgag afgyfevthd itkyskakvf enhigkktpia vrfstvages 121 gsadtvrdpr gfavkfyted gnwdlvgnnt piffirdpil fpsfihsqgkr npathlkdpd 181 mvwdfwslrp eslhavsflf sdrgipdghr hmngygshtf klvnangeav yckfhyktdq 241 giknlsveda arlsgedpdy girdlfnaia tgkypswtfy iqumtfíngae tfpfnpfdlt 301 kvwphkdypl ipvgklvlnr npvwnyfaeve giafdpsnmp pgieaspdkm lqggrlfaypd 361 thrhrlgpny lhipvncpyr arvanyardg pmemgdnggg apnyypnsfg apeggpsale 421 hsigysgevr rfntanddnv tqvrafyvnv lneegrkrlc eniaghlkda qifigkkavk 481 nftevhpdyg shigalldky naekpknaih tfvgsgshla arekanl SEQ ID NO:7 1 madsrdpasd qmaghwkegra aqgkadvlttg agnpvgdkln vitvgprapl lvagnvvftde 61 mahfdrerip ervvhakgag afgyfevthd itkyskakvf enhigkktpia vrfstvages 121 gsadtvrdpr gfavkfyted gnwdlvgnnt piffirdpil fpsfihsqgkr npathlkdpd 181 mvwdfwslrp eslhavsflf sdrgipdghr hmngygshtf klvnangeav yckfhyktgq

241 giknlsveda arlsgedpdy girdlfnaia tgkdpswtfy iqumtfngae tfpfnpfdlt 301 rvwphkdypl ipvgklvlnr npvnyfaeve giafdpsnmp pgieaspdkm lggrlfaypd 361 thrhrlgpny lhipvncpyr arvanygrdg pmemgdnggg apnyypnsfg apegapsale 421 hsigysgevr rfntanddnv tqvrafyvnv lneegrkrlc eniaghlkda qifiqgkkavk 481 nftevhpdyg shigalldky naekpknaih tfvrsgshlv arekanl

GCTGACAGCCGGGATCCCGCCAGCGACCAGATGCAGCACTGGAAGGAGCAGCGGGCCGCGCAGAAAGCTGATGTCC TGACCACTGGAGCTGGTAACCCAGTAGGAGACAAACTTAATGTTATTACAGTAGGGCCCCGTGGGCCCCTTCTTGT TCAGGATGTGGTTTTCACTGATGAAATGGCTCATTTTGACCGAGAGAGAATTCCTGAGAGAGTTGTGCATGCTAAA GGAGCAGGGGCCTTTGGCTACTTTGAGGTCACACATGACATTACCAAATACTCCAAGGCAAAGGTATTTGAGCATA TTGGAAAGAAGACTCCCATCGCAGTTCGGTTCTCCACTGTTGCTGGAGAATCGGGTTCAGCTGACACAGTTCGGGA CCCTCGTG GGTTTGCAGTGAAATTTTACACAGAAGATGGTAACTGGGATCTCGTTGGAAATAACACCCCCATTTTCTTCATCAG GGATCCCATATTGTTTCCATCTTTTATCCACAGCCAAAAGAGAAATCCTCAGACACATCTGAAGGATCCGGACATG GTCTGGGACTTCTGGAGCCTACGTCCTGAGTCTCTGCATCAGGTTTCTTTCTTGTTCAGTGATCGGGGGATTCCAG ATGGACATCGCCACATGAATGGATATGGATCACATACTTTCAAGCTGGTTAATGCAAATGGGGAGGCAGTTTATTG CAAATTCCATTATAAGACTGACCAGGGCATCAAAAACCTTTCTGTTGAAGATGCGGCGAGACTTTCCCAGGAAGAT CCTGACTATGGCATCCGGGATCTTTTTAACGCCATTGCCACAGGAAAGTACCCCTCCTGGACTTTTTACATCCAGG TCATGACATTTAATCAGGCAGAAACTTTTCCATTTAATCCATTCGATCTCACCAAGGTTTGGCCTCACAAGGACTA CCCTCTCATCCCAGTTGGTAAACTGGTCTTAAACCGGAATCCAGTTAATTACTTTGCTGAGGTTGAACAGATAGCC TTCGACCCAAGCAACATGCCACCTGGCATTGAGGCCAGTCCTGACAAAATGCTTCAGGGCCGCCTTTTTGCCTATC CTGACACTCACCGCCATCGCCTGGGACCCAATTATCTTCATATACCTGTGAACTGTCCCTACCGTGCTCCAAATTA CTACCCCAACAGCTTTGGTGCTCCGGAACAACAGCCTTCTGCCCTGGAGCACAGCATCCAATATTCTGGAGAAGTG CGGAGATTCAACACTGCCAATGATGATAACGTTACTCAGGTGCGGGCATTCTATGTGAACGTGCTGAATGAGGAAC AGAGGAAACGTCTGTGTGAGAACATTGCCGGCCACCTGAAGGATGCACAAATTTTCATCCAGAAGAAAGCGGTCAA

GAACTTCACTGAGGTCCACCCTGACTACGGGAGCCACATCCAGGCTCTTCTGGACAAGTACAATGCTGAGAAGCCT AAGAATGCGATTCACACCTTTGTGCAGTCCGGATCTCACTTGGCGGCAAGGGAGAAGGCAAATCTG (SEQ ID NO:9; hCatWL") codifica

APRAATMPRVRSCLLHSPRTHALADSRDPASDQOMQHWKEQRAAQKADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPRGPLLVOD VVFTDEMAHFDRERIPERVVHAKGAGAFGY FEVTHDITKYSKAKVFEHIGKKTPIAVRFSTVAGESGSADTVRDPR GFAVKFYTEDGNWDLVGNNTPIFFIRDPILFPSFIHSQKRNPOTHLKDPDMVWDFWSLRPESLHQOVSFLFSDRGIP DGHRHMNGYGSHTFKLVNANGEAVYCKFHYKTDQOGIKNLSVEDAARLSQEDPDYGIRDLENAIATGKYPSWTFYIQ VMTFNQAETFPFNPFDLTKVWPHKDY PLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQOGRLFAY PDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRAPNYYPNSFGAPEQQOPSALEHSIQYSGEVRRENTANDDNVTOVRAFYVNVLNEE

QORKRLCENIAGHLKDAQI FIQOKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVOSGSHLAAREKANLYPY DVPDYA (SEQ ID NO:12); ou uma que tem uma sequência sinalizadora de Ig atgccacgegteegetectgtettetecacagteceagaacacacgeacte

GCTGACAGCCGGGATCCCGCCAGCGACCAGATGCAGCACÇ TGGAAGGAGCAGCGGGCCGCGCAGAAAGCTGATGTCCT GACCACTGGAGCTGGTAACCCAGTAGGAGACAAACTTAA TGTTATTACAGTAGGGCCCCGTGGGCCCCTTCTTGTTCAG GATGTGGTTTTCACTGATGAAATGGCTCATTTTGACCGAG AGAGAATTCCTGAGAGAGTTGTGCATGCTAAAGGAGCAG GGGCCTTTGGCTACTTTGAGGTCACACATGACATTACCAA ATACTCCAAGGCAAAGGTATTTGAGCATATTGGAAAGAAG ACTCCCATCGCAGTTCGGTTCTCCACTGTTGCTGGAGAATC GGGTTCAGCTGACACAGTTCGGGACCCTCGTGEGTTTGCA GTGAAATTTTACACAGAAGATGGTAACTGGGATCTCGTTG GAAATAACACCCCCATTTTCTTCATCAGGGATCCCATATTG TTTCCATCTTTTATCCACAGCCAAAAGAGAAATCCTCAGAC ACATCTGAAGGATCCGGACATGGTCTGGGACTTCTGGAGC CTACGTCCTGAGTCTCTGCATCAGGTTTCTTTCTTGTTCAGT GATCGGGGGATTCCAGATGGACATCGCCACATGAATGGA TATGGATCACATACTTTCAAGCTGGTTAATGCAAATGGGG AGGCAGTTTATTGCAAATTCCATTATAAGACTGACCAGGG CATCAAAAACCTTTCTGTTGAAGATGCGGCGAGACTTTCC CAGGAAGATCCTGACTATGGCATCCGGGATCTTTTTAACG CCATTGCCACAGGAAAGTACCCCTCCTGGACTTTTTACATC CAGGTCATGACATTTAATCAGGCAGAAACTTTTCCATTTA ATCCATTCGATCTCACCAAGGTTTGGCCTCACAAGGACTA CCCTCTCATCCCAGTTGGTAAACTGGTCTTAAACCGGAAT CCAGTTAATTACTTTGCTGAGGTTGAACAGATAGCCTTCGA CCCAAGCAACATGCCACCTGGCATTGAGGCCAGTCCTGAC ARAATGCTTCAGGGCCGCCTTTTTGCCTATCCTGACACTCA CCGCCATCGCCTGGGACCCAATTATCTTCATATACCTGTGA ACTGTCCCTACCGTGCTCCAAATTACTACCCCAACAGCTTT GGTGCTCCGGAACAACAGCCTTCTGCCCTGGAGCACAGC ATCCAATATTCTGGAGAAGTGCGGAGATTCAACACTGCCA ATGATGATAACGTTACTCAGGTGCGGGCATTCTATGTGA ACGTGCTGAATGAGGAACAGAGGAAACGTCTGTGTGAG AACATTGCCGGCCACCTGAAGGATGCACAMATTTTCATCC AGAAGAAAGCGGTCAAGAACTTCACTGAGGTCCACCCTG ACTACGGGAGCCACATCCAGGCTCTTCTGGACAAGTACA

ATGCTGAGAAGCCTAAGAATGCGATTCACACCTTTGTGC AGTCCGGATCTCACTTGGCGGCAAGGGAGAAGGCAAATCTG (SEQ ID NO:13)

ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGECAGCCGETECCTCEGACECCTEGACEGECEAGGACTCEGCEG AGCCCAACTCTGACTCGGCEGAGTGGATCCGAGACATGTACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGETCGCCAC GCTGGACGCCGCGCAGCACGCCGCCTGCCAGETEGCAGCCGTCGGCCACGCTEGACECCGCECAGCCCCGEGTEACE GGCGTCETCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCEGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCGCCCTGGAGEGCTTCCCGACOG AGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTCGGGGACCTGAGCCAGEGCTGCGAGTCCACCGGECC CCACTACAACCCGCTEGCCETECCGCACCCGCAGCACCCGGGCEACTTCGGCAACTTCGCEGTCCGCGACEGCAGE CTCTGGAGGTACCGCECCEGCCTEGCCECCTCEGCTCECEGECCCGCACTCCATCGTEGECCEGECCETEGTCETCCE

ACGCTGGCGAGGACGACCTEGECCECEGCEGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAACGGGAACGCEGECCEGCEGCTEGC CTGCTGCGTGGTGGG C (SEQ ID NO:11; sequência de DNA hSOD3hd-) codifica

MLALLCSCLLLAAGASDAWTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYAKVTEINQEVATLDAAQHAACQVOPSATLDAAQPRVT

GVVLFROLAPRAKLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHOFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGS LWRYRAGLAASLAGPHSIVGRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENGNAGRRLACCVVG (SEQ ID NO:10)

[0073] As sequências dentro do escopo da invenção incluem aquelas que têm pelo menos 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência de ami- noácidos com uma de SEQ ID Nos. 1-8, 10 ou 12. As sequências de catalase, dentro do escopo da invenção, têm cerca de 2 %, 5 %, 10 %, 12 %, 15 % ou até 20 % menos resíduos do que uma sequência de catalase de comprimento total. As sequências de superóxido dismu- tase, dentro do escopo da invenção, têm cerca de 2 %, 5 %, 10 %, 12 %, 15 % ou até 20 % menos resíduos do que uma sequência de supe- róxido dismutase de comprimento total.

Vetores de Distribuição Gênica

[0074] Os vetores de distribuição gênica incluem, por exemplo, vetores virais, lipossomas e outros complexos que contêm lipídios, tais como lipoplexos (DNA e lipídios catiônicos), poliplexos, por exemplo, DNA em complexo com polímeros catiônicos, tais como polietileno gli- col, nanopartículas, por exemplo, nanopartículas magnéticas inorgâni- cas que se ligam ou são funcionalizados para se ligar ao DNA, tais como nanopartículas de Fe3O04 ou MnO», micropartículas, por exemplo, formadas a partir de reagentes de polilactídeo e poligalactídeo, nano- tubos, por exemplo, nanotubos de sílica e outros complexos macromo- leculares capazes de mediar a distribuição de um gene a uma célula hospedeira. Os vetores também podem compreender outros compo- nentes ou funcionalidades que modulam ainda mais a distribuição e/ou a expressão do gene ou que, de outra forma, conferem propriedades benéficas às células-alvo. Estes outros componentes incluem, por exemplo, componentes que influenciam a ligação ou direcionamento às células (incluindo componentes que mediam o tipo de célula ou li- gação específica para tecido); componentes que influenciam a absor- ção do vetor pela célula; componentes que influenciam a localização do gene transferido dentro da célula após absorção (tais como agentes que mediam a localização nuclear); e componentes que influenciam a expressão do gene. Tais componentes também podem incluir marca- dores, tais como marcadores detectáveis e/ou selecionáveis que po- dem ser usados para detectar ou selecionar células que absorveram e expressam o ácido nucleico distribuído pelo vetor. Uma grande varie- dade de tais vetores é conhecida na técnica e está disponível de modo geral.

[0075] Os vetores de distribuição gênica dentro do escopo da in- venção incluem, porém sem limitações, ácido nucleico isolado, por exemplo, vetores com base em plasmídeo que podem ser mantidos extracromossomicamente e vetores virais, por exemplo, adenovírus recombinante, retrovírus, lentivírus, herpesvírus, poxvírus, papiloma vírus ou vírus adenoassociado, incluindo vetores virais e não virais que estão presentes em lipossomas, por exemplo, lipossomas neutros ou catiônicos, tais como lipossomas de DOSPA/DOPE, DOGS/DOPE ou DMRIE/DOPE e/ou associados a outras moléculas, tais como comple- xos de DNA-anticorpo anti-DNA-lipídio catiônico (DOTMA/DOPE). Ve- tores de distribuição gênica virais exemplificativos são descritos abai- xo. Os vetores de distribuição gênica podem ser administrados através de qualquer via incluindo, porém sem limitações, administração intra- craniana, intratecal, intramuscular, bucal, retal, intravenosa ou intraco- ronariana e a transferência para as células pode ser aumentada usan- do eletroporação e/ou iontoforese e/ou um suporte, tal como matriz extracelular, ou hidrogéis, por exemplo, um adesivo de hidrogel. Em uma modalidade, um intensificador de permeação não é usado para aumentar a distribuição indireta ao CNS. Vetores Retrovirais

[0076] Os vetores retrovirais exibem várias características distin- tas, incluindo sua capacidade de se integrar de forma estável e precisa ao genoma do hospedeiro, permitindo expressão do transgene de lon-

go prazo. Estes vetores podem ser manipulados ex vivo para eliminar partículas de genes infecciosos de modo a minimizar o risco de infec- ção sistêmica e transmissão de paciente para paciente. Os vetores retrovirais pseudotipados podem alterar o tropismo da célula hospedei- ra. Lentivírus

[0077] Os lentivírus são derivados de uma família de retrovírus que inclui o vírus da imunodeficiência humana e o vírus da imunodefi- ciência felina. No entanto, ao contrário dos retrovírus que infectam apenas células em divisão, os lentivírus podem infectar células em di- visão e qie não estão em divisão. Por exemplo, vetores lentivirais com base no genoma do vírus da imunodeficiência humana são capazes de transdução eficiente de miócitos cardíacos in vivo. Embora os lentiví- rus tenham tropismos específicos, a pseudotipagem do envelope viral com o vírus da estomatite vesicular produz um vírus com uma varie- dade mais ampla (Schnepp et al., Meth. Mol. Med., 69: 427 (2002)). Vetores Adenovirais

[0078] Os vetores adenovirais podem ser tornados incompetentes para a replicação através da eliminação dos genes iniciais (EIA e E1B) responsáveis pela expressão do gene viral do genoma e são mantidos de forma estável nas células hospedeiras em uma forma ex- tracromossômica. Estes vetores têm a capacidade de transfectar célu- las em replicação e não replicação e, em particular, foi mostrado que estes vetores infectam miócitos cardíacos de forma eficiente in vivo, por exemplo, após injeção direta ou perfusão. Foi demonstrado que os vetores adenovirais resultam na expressão transitória de genes tera- pêuticos in vivo, com um pico em 7 dias e que dura aproximadamente 4 semanas. A duração da expressão do transgene pode ser aprimora- da em sistemas que usam promotores neurais específicos. Além disso, os vetores adenovirais podem ser produzidos em titulações muito al-

tas, permitindo a transferência eficiente de genes com pequenos vo- lumes de vírus. Vetores Virais Adenoassociados

[0079] Os vírus adenoassociados recombinantes (rAAV) são deri- vados de parvovírus não patogênicos, não evocam essencialmente nenhuma resposta imune celular e produzem expressão do transgene que dura meses na maioria dos sistemas. Além disso, assim como os adenovírus, os vetores de vírus adenoassociados também têm a ca- pacidade de infectar células em replicação e não replicação e acredita- se que não sejam patogênicos para seres humanos. Além disso, eles parecem promissores para a transferência sustentada do gene cardía- co (Hoshijima et a/,. Nat. Med., 8: 864 (2002); Lynch et al., Circ. Res., 80: 197 (1997)).

[0080] Vetores de AAV incluem, porém sem limitações, AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10. Vetores de DNA de Plasmídeo

[0081] O DNA de plasmídeo é frequentemente denominado como "DNA nu" para indicar a ausência de um sistema de empacotamento mais elaborado. Injeção direta de DNA de plasmídeo nas células do miocárdio in vivo foi realizada. Os vetores com base em plasmídeos são relativamente não imunogênicos e não patogênicos, com o poten- cial de se integrar de forma estável no genoma celular, resultando na expressão gênica de longo prazo em células pós-mitóticas in vivo. Por exemplo, a expressão de fatores de angiogênese secretados após in- jeção muscular de DNA de plasmídeo, apesar dos níveis relativamente baixos de expressão de transgene focal, demonstrou efeitos biológicos significativos em modelos animais e parece promissora clinicamente (Isner, Nature, 415: 234 (2002)). Além disso, o DNA de plasmídeo é rapidamente degradado na corrente sanguínea; portanto, a chance de expressão do transgene em sistemas de órgãos distantes é insignifi-

cante. O DNA de plasmídeo pode ser distribuído às células como parte de um complexo macromolecular, por exemplo, um lipossoma ou complexo de DNA-proteína, e a distribuição pode ser aumentada usando técnicas que incluem eletroporação. Composições Farmacêuticas

[0082] A invenção fornece uma composição que compreende, consiste essencialmente em ou consiste no(s) vetor(es) de transferên- cia gênica descrito(s) acima e um carreador farmaceuticamente acei- tável (por exemplo, fisiologicamente aceitável). Quando a composição consiste essencialmente no vetor de transferência gênica da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável, podem ser incluídos componentes adicionais que não afetam materialmente a composição (por exemplo, adjuvantes, tampões, estabilizantes, agentes anti- inflamatórios, solubilizantes, conservantes, etc.). Quando a composi- ção consiste no vetor de transferência gênica da invenção e no carre- ador farmaceuticamente aceitável, a composição não compreende quaisquer componentes adicionais. Qualquer carreador adequado po- de ser usado no contexto da invenção, e tais carreadores são bem co- nhecidos na técnica. A escolha do carreador será determinada, em parte, pelo local particular ao qual a composição pode ser administra- da e o método particular usado para administrar a composição. À composição pode ser opcionalmente estéril, com exceção do vetor de transferência gênica descrito no presente documento. A composição pode ser congelada ou liofilizada para armazenamento e reconstituída em um veículo estéril adequado antes do uso. As composições podem ser geradas de acordo com técnicas convencionais descritas, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21º Edição, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, PA (2001).

[0083] Formulações adequadas para a composição incluem solu- ções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, as quais podem conter antioxidantes, tampões e bacteriostáticos, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas as quais podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e con- servantes.

As formulações podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou múltiplas doses, tais como ampolas e fras- cos, e podem ser armazenadas em uma condição liofilizada (seca com congelamento) que requer apenas a adição do carreador líquido esté- ril, por exemplo, água, imediatamente antes de uso.

As soluções e suspensões extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo precedentemente descrito.

Em uma modalidade, o veículo é uma solução salina tamponada.

Em uma modalidade, o vetor de transferência gênica da invenção é administra- do em uma composição formulada para proteger o vetor de transfe- rência gênica contra danos antes da administração.

Por exemplo, a composição pode ser formulada para reduzir a perda do vetor de transferência gênica em dispositivos usados para preparar, armazenar ou administrar o vetor de transferência gênica, tais como vidraria, se- ringas ou agulhas.

A composição pode ser formulada para diminuir a sensibilidade à luz e/ou sensibilidade à temperatura do vetor de trans- ferência gênica.

Para esta finalidade, a composição pode compreender um veículo líquido farmaceuticamente aceitável tal como, por exemplo, aqueles descritos acima, e um agente estabilizante selecionado a par- tir do grupo que consiste em polissorbato 80, L-arginina, polivinilpirroli- dona, trealose e combinações dos mesmos.

O uso de tal composição prolongará a vida útil do vetor de transferência gênica, facilitará a ad- ministração e aumentará a eficiência do método da invenção.

Formu- lações para composições que contêm vetores de transferência gênica são ainda descritas, por exemplo, em Wright et a/., Curr.

Opin.

Drug Discov.

Develop., 6 (2): 174-178 (2003) e Wright et al., Molecular Therapy, 12: 171-178 (2005))

[0084] A composição também pode ser formulada para aumentar a eficiência de transdução. Além disso, aqueles versados na técnica re- conhecerão que o vetor de transferência gênica da invenção pode es- tar presente em uma composição com outros agentes terapêuticos ou biologicamente ativos. Por exemplo, fatores que controlam a inflama- ção, tais como ibuprofeno ou esteroides, podem fazer parte da compo- sição para reduzir o inchaço e a inflamação associados à administra- ção in vivo do vetor de transferência gênica. Estimulantes ou adjuvan- tes do sistema imune, por exemplo, interleucinas, lipopolissacarídeo e RNA fita dupla. Antibióticos, isto é, microbicidas e fungicidas, podem estar presentes para tratar a infecção existente e/ou reduzir o risco de futura infecção, tal como infecção associada a procedimentos de trans- ferência gênica.

[0085] As formas de depósito injetáveis são feitas ao formar matri- zes de microencapsulação dos compostos em questão em polímeros biodegradáveis, tais como polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da proporção de fármaco para polímero e da natureza do polímero usado em particular, a taxa de liberação de fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem (po- li)ortoésteres e (poli)anidridos. As formulações injetáveis de depósito também são preparadas ao reter o fármaco em lipossomas ou mi- croemulsões que são compatíveis com o tecido corporal.

[0086] Em determinadas modalidades, uma formulação da presen- te invenção compreende um polímero biocompatível selecionado a partir do grupo que consiste em poliamidas, policarbonatos, polialqui- lenos, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, polímeros de poli- vinila, poliglicolídeos, polissiloxanos, poliuretanos e copolímeros dos mesmos, celuloses, polipropileno, polietilenos, poliestireno, polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, polianidridos, (poli)ortoésteres, ácido (poli)butírico), ácido (poli) valérico), (poli)lactíedeo-co-caprolactona,

polissacarídeos, proteínas, ácidos poli-hialurônicos, policianoacrilatos e misturas, blendas ou copolímeros dos mesmos.

[0087] A composição pode ser administrada em ou com um dispo- sitivo que permite a liberação controlada ou sustentada, tal como uma esponja, malha biocompatível, reservatório mecânico ou implante me- cânico. Implantes (consulte, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº

5.443.505), dispositivos (consulte, por exemplo, Patente Norte- Americana Nº 4.863.457), tais como um dispositivo implantável, por exemplo, um reservatório mecânico ou um implante ou um dispositivo composto de uma composição polimérica, são particularmente úteis para administração do vetor de transferência gênica da invenção. À composição também pode ser administrada na forma de formulações de liberação sustentada (consulte, por exemplo, Patente Norte- Americana Nº 5.378.475) que compreendem, por exemplo, espuma de gel, ácido hialurônico, gelatina, sulfato de condroitina, um polifosfoés- ter, tal como tereftalato de bis-2-hidroxietila (BHET) e/ou um ácido poli- láctico-glicólico.

[0088] A dose do vetor de transferência gênica na composição administrada ao mamífero dependerá de uma série de fatores, incluin- do o tamanho (massa) do mamífero, a extensão de quaisquer efeitos colaterais, a via particular de administração e assim por diante. Em uma modalidade, o método da invenção compreende administrar uma "quantidade terapeuticamente eficaz" da composição que compreende o vetor de transferência gênica da invenção descrito no presente do- cumento. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo neces- sários, para atingir um resultado terapêutico desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores tais como a extensão da doença ou transtorno, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do vetor de transferência gênica de induzir a uma resposta desejada no indivíduo. A dose do vetor de transferência gênica na composição necessária para atingir um determinado efeito terapêutico é, tipicamente, administrada em unidades de cópias genômicas do ve- tor por célula (gc/célula) ou cópias genômicas do vetor/por quilograma de peso corporal (gc/kg). Aqueles versados na técnica podem deter- minar facilmente uma faixa de dose de vetor de transferência gênica apropriada para tratar um paciente que tem uma doença ou transtorno particular com base nestes e outros fatores que são bem conhecidos na técnica. A quantidade terapeuticamente eficaz pode estar entre 1 x 10º cópias genômicas a 1 x 10º? cópias genômicas.

[0089] Em uma modalidade, a composição é administrada uma vez ao mamífero. Acredita-se que uma única administração da compo- sição pode resultar em expressão persistente no mamífero com efeitos colaterais mínimos. No entanto, em determinados casos, pode ser apropriado administrar a composição várias vezes durante um período terapêutico para assegurar exposição suficiente das células à compo- sição. Por exemplo, a composição pode ser administrada ao mamífero duas ou mais vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 8, 9 ou 10 ou mais vezes) durante um período terapêutico.

[0090] A presente invenção fornece composições farmaceutica- mente aceitáveis que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de vetor de transferência gênica que compreende uma sequên- cia de ácidos nucleicos conforme descrito acima. Vias de Administração, Dosagens e Formas de Dosagem

[0091] A administração dos vetores de distribuição gênica de acordo com a presente invenção pode ser contínua ou intermitente dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor e de outros fatores conhecidos pelos médicos experientes. A administração do(s) vetor(es) de distribuição gênica pode ser essencialmente contí- nua ao longo de um período de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas. Tanto a administração local, por exemplo, intracraniana, intranasal ou intratecal, quanto a administra- ção sistêmica, por exemplo, usando vírus que cruzam a barreira hema- toencefálica, são consideradas. Qualquer via de administração pode ser usada, por exemplo, intravenosa, intranasal ou intrabrônquica, ad- ministração direta ao pulmão e intrapleural. Em uma modalidade, as composições podem ser distribuídas à pleura.

[0092] Uma ou mais formas de dosagem unitária adequadas que compreendem o(s) vetor(es) de distribuição gênica o(s) qual(is) po- de(m) ser opcionalmente formulado(s) para liberação sustentada, po- dem ser administradas através de uma variedade de vias, incluindo as vias intracraniana, intratecal ou intransal, ou outros meios para distri- buição ao SNC, ou oral ou parentericamente, incluindo através das vias retal, bucal, vaginal e sublingual, transdérmica, subcutânea, intra- venosa, intramuscular, intraperitoneal, intratorácica ou intrapulmonar. As formulações podem, quando apropriado, ser convenientemente apresentadas em formas de dosagem unitária distintas e podem ser preparadas por meio de qualquer um dos métodos bem conhecidos em farmácia. Tais métodos podem incluir a etapa de associar o vetor com carreadores líquidos, matrizes sólidas, carreadores semissólidos, carreadores sólidos finamente divididos ou combinações dos mesmos e, em seguida, se necessário, introduzir ou moldar o produto no siste- ma de distribuição desejado.

[0093] A quantidade de vetores de distribuição gênica administra- da para atingir um determinado resultado variará dependendo de vá- rios fatores incluindo, porém sem limitações, os genes e promotores escolhidos, a condição, parâmetros específicos do paciente, por exemplo, altura, peso e idade, e se prevenção ou tratamento deve ser alcançado.

[0094] Os vetores da invenção podem ser convenientemente for-

necidos na forma de formulações adequadas para administração, por exemplo, ao cérebro. Um formato de administração adequado pode ser melhor determinado por um médico para cada paciente individual- mente de acordo com procedimentos padrão. Carreadores farmaceuti- camente aceitáveis adequados e sua formulação são descritos em tra- tados de formulações padrão, por exemplo, Remington's Pharmaceuti- cals Sciences. Por "farmaceuticamente aceitável" entenda-se um car- reador, diluente, excipiente e/ou sal que é compatível com os outros ingredientes da formulação e não é prejudicial para seu receptor.

[0095] Os vetores da presente invenção podem ser formulados em solução em pH neutro, por exemplo, pH de cerca 6,5 a um pH de cer- ca de 8,5 ou um pH de cerca 7 a 8, com um excipiente para levar a solução para próximo da isotonicidade, por exemplo, manitol a 4,5 % ou cloreto de sódio a 0,9 %, pH tamponado com soluções tampão co- nhecidas na técnica, tais como fosfato de sódio, as quais são geral- mente considerados seguras, juntamente com um conservante aceito, tal como metacresol a 0,1 % a 0,75 % ou metacresol a 0,15 % a 0,4 %. A obtenção de uma isotonicidade desejada pode ser obtida usando cloreto de sódio ou outros agentes farmaceuticamente aceitáveis, tais como dextrose, ácido bórico, tartarato de sódio, propileno glicol, polióis (tais como manitol e sorbitol) ou outros solutos inorgânicos ou orgâni- cos. O cloreto de sódio é útil para tampões que contêm íons de sódio. Se desejado, as soluções das composições acima também podem ser preparadas para aumentar o prazo de validade e a estabilidade. As composições terapeuticamente úteis da invenção podem ser prepara- das ao misturar os ingredientes seguindo procedimentos geralmente aceitos. Por exemplo, os componentes selecionados podem ser mistu- rados para produzir uma mistura concentrada que pode, então, ser ajustada para a concentração e viscosidade finais mediante adição de água e/ou um tampão para controlar o pH ou um soluto adicional para controlar a tonicidade.

[0096] Os vetores podem ser fornecidos em uma forma de dosa- gem que contém uma quantidade eficaz de um vetor em uma ou em doses múltiplas. Para vetores virais, a dose eficaz pode estar na faixa de pelo menos cerca de 10” partículas virais, por exemplo, cerca de 10º partículas virais ou cerca de 10 partículas virais. O número de partículas virais adicionadas pode ser de até 10º. Por exemplo, quan- do um vetor de expressão viral é usado, cerca de 10º a cerca de 10% gc de vetor viral podem ser administrados como ácido nucleico ou co- mo um vírion empacotado. Em algumas modalidades, cerca de 10º a cerca de 10º cópias do vetor viral, por exemplo, por 0,5 a 10 mL, po- dem ser administradas como ácido nucleico ou como um vírion empa- cotado. Alternativamente, os ácidos nucleicos ou vetores podem ser administrados em dosagens de pelo menos cerca de 0,0001 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,25 mg/kg ou pelo menos cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,25 mg/kg de peso corporal, embora outras dosagens possam fornecer resultados benéficos. À quantidade administrada variará dependendo de vários fatores incluin- do, porém sem limitações, o ácido nucleico ou vetor escolhido para administração, a doença, o peso, a condição física, a saúde e/ou a idade do mamífero. Tais fatores podem ser prontamente determinados pelo médico usando modelos animais ou outros sistemas de teste que estão disponíveis na técnica. Conforme observado, a dose exata a ser administrada é determinada pelo médico que faz o atendimento, mas pode ser em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato. Para dis- tribuição de DNA de plasmídeo apenas, ou DNA de plasmídeo em um complexo com outras macromoléculas, a quantidade de DNA a ser administrada será uma quantidade que resulta em um efeito benéfico para o receptor. Por exemplo, a partir de 0,0001 a 1 mg ou mais, por exemplo, até 1 g, em doses individuais ou divididas, por exemplo, de 0,001 a 0,5 mg, ou 0,01 a 0,1 mg, de DNA podem ser administrados.

[0097] Por exemplo, quando um vetor de expressão viral é usado, cerca de 10º a cerca de 10º gc do vetor viral podem ser administrados como ácido nucleico ou como um vírion empacotado. Em algumas modalidades, cerca de 10º a cerca de 10** cópias do vetor viral, por exemplo, por 0,5 a 10 mL, podem ser administradas como ácido nu- cleico ou como um vírion empacotado. Alternativamente, os ácidos nu- cleicos ou vetores podem ser administrados em dosagens de pelo me- nos cerca de 0,0001 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,25 mg/kg ou pelo menos cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,25 mg/kg de peso corporal, embora outras dosagens possam forne- cer resultados benéficos.

[0098] Em uma modalidade, a administração pode ser através de injeção ou infusão intracraniana, intra-hepática, intratraqueal ou intra- brônquica usando um cateter ou agulha apropriada. Uma variedade de cateteres pode ser usada para conseguir a distribuição, conforme é conhecido na técnica. Por exemplo, uma variedade de cateteres de uso geral, bem como cateteres modificados, adequados para uso na presente invenção estão disponíveis a partir de fornecedores comerci- ais. Além disso, quando a distribuição é alcançada através de injeção diretamente em uma região específica do cérebro ou pulmão, uma sé- rie de abordagens podem ser usadas para introduzir um cateter nesta região, conforme é conhecido na técnica.

[0099] A título de ilustração, lipossomas e outros complexos de distribuição gênica que contêm lipídios podem ser usados para distri- buir um ou mais transgenes. Os princípios da preparação e uso de tais complexos para distribuição gênica foram descritos na técnica (consul- te, por exemplo, Ledley, (1995); Miller et a/., (1995); Chonn et al,

(1995); Schofield et a/., (1995); Brigham et a/., (1993)).

[00100] As formulações farmacêuticas que contêm os vetores de distribuição gênica podem ser preparadas por meio de procedimentos conhecidos na técnica usando ingredientes bem conhecidos e pronta- mente disponíveis. Por exemplo, o agente pode ser formulado com excipientes, diluentes ou carreadores comuns e moldado em compri- midos, cápsulas, suspensões, pós e assim por diante. Os vetores da invenção também podem ser formulados como elixires ou soluções adequadas para administração parentérica, por exemplo, através das vias intramuscular, subcutânea ou intravenosa.

[00101] As formulações farmacêuticas dos vetores também podem assumir a forma de uma solução aquosa ou anidra, por exemplo, uma formulação ou dispersão liofilizada ou, alternativamente, a forma de uma emulsão ou suspensão.

[00102] Em uma modalidade, os vetores podem ser formulados pa- ra administração, por exemplo, através de injeção, por exemplo, inje- ção em bolus ou infusão contínua por meio de um cateter, e podem ser apresentados na forma de dose unitária em ampolas, seringas pré- enchidas, recipientes de infusão de pequeno volume ou em recipientes de doses múltiplas com um conservante adicionado. Os ingredientes ativos podem assumir formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, os ingredientes ativos podem estar na forma de um pó obtido por meio de isolamento asséptico de sólido es- téril ou através de liofilização da solução para constituição com um ve- ículo adequado, por exemplo, água estéril, apirogênica, antes do uso.

[00103] Estas formulações podem conter veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis que são bem conhecidos no estado da técnica. É possível, por exemplo, preparar soluções usando um ou mais solventes orgânicos que são aceitáveis do ponto de vista fisioló- gico.

[00104] Para administração ao trato respiratório superior (nasal) ou inferior por inalação, o vetor é convenientemente distribuído a partir de um insuflador, nebulizador ou embalagem pressurizada ou outro meio conveniente de distribuição a partir de um spray aerossol. As embala- gens pressurizadas podem compreender um propelente adequado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroe- tano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um ae- rossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada ao fornecer uma válvula para distribuir uma quantidade medida.

[00105] —Alternativamente, para administração através de inalação ou insuflação, a composição pode assumir a forma de um pó seco, por exemplo, uma mistura de pó do agente terapêutico e uma base para pó adequada, tal como lactose ou amido. A composição em pó pode ser apresentada na forma de dosagem unitária, por exemplo, em cáp- sulas ou cartuchos ou, por exemplo, embalagens de gelatina ou blister a partir das quais o pó pode ser administrado com o auxílio de um ina- lador, insuflador ou um inalador dosimetrado.

[00106] Para administração intranasal, o vetor pode ser administra- do por meio de gotas nasais, um spray líquido, tal como por meio de um atomizador de garrafa plástica ou inalador dosimetrado. Atomiza- dores típicos são o Mistometer (Wintrop) e o Medihaler (Riker).

[00107] A distribuição local dos vetores também pode ser através de uma variedade de técnicas que administram o vetor no local da do- ença ou próximo da mesma, por exemplo, usando um cateter ou agu- Ilha. Exemplos de técnicas de distribuição local específicas ou direcio- nadas não se destinam a ser limitativas mas, para ilustrar as técnicas disponíveis, exemplos incluem cateteres de distribuição local, tal como um cateter de infusão ou permanente, por exemplo, um cateter de in-

fusão de agulha, shunts e stents ou outros dispositivos implantáveis, veículos específicos para o local, injeção direta ou aplicações diretas.

[00108] As formulações e composições descritas no presente do- cumento também podem conter outros ingredientes, tais como agentes antimicrobianos ou conservantes. Indivíduo

[00109] O indivíduo pode ser qualquer animal, incluindo animais humanos e não humanos. Animais não humanos incluem todos os ver- tebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como prima- tas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfí- bios e répteis, embora mamíferos sejam preferidos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas e cavalos. O indivíduo tam- bém pode ser gado, tal como vacas, porcos, ovelhas, aves domésticas e cavalos, ou animais de estimação, tais como cães e gatos.

[00110] Os indivíduos incluem indivíduos humanos que sofrem ou estão em risco de dano oxidativo. O indivíduo é geralmente diagnosti- cado com a condição da presente invenção por técnicos experientes, tal como um médico.

[00111] Os métodos descritos no presente documento podem ser usados para indivíduos de qualquer espécie, gênero, idade, população étnica ou genótipo. Consequentemente, o termo indivíduo inclui ho- mens e mulheres e inclui idosos, indivíduos em idade de transição de adulto para idoso, indivíduos em idade de transição de pré-adoles- cente para adolescente e adultos, incluindo adolescentes, crianças e bebês.

[00112] Exemplos de populações étnicas humanas incluem cauca- sianos, asiáticos, hispânicos, africanos, afro-americanos, nativos ame- ricanos, semitas e ilhéus do Pacífico. Os métodos podem ser mais apropriados para algumas populações étnicas, tais como caucasianos, especialmente populações do norte da Europa, bem como populações asiáticas.

[00113] O termo indivíduo também inclui indivíduos de qualquer ge- nótipo ou fenótipo, contanto que necessitem da invenção, conforme descrito acima. Além disso, o indivíduo pode ter o genótipo ou fenótipo para qualquer cor de cabelos, cor de olhos, cor da pele ou qualquer combinação dos mesmos.

[00114] O termo indivíduo inclui um indivíduo com qualquer altura corporal, peso corporal ou qualquer tamanho ou forma de órgão ou parte do corpo.

[00115] A invenção será descrita por meio dos exemplos não limita- tivos a seguir.

Exemplos

[00116] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a se- guir, os quais não devem ser interpretados como limitativos de qual- quer forma. O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo refe- rências da literatura, patentes emitidas, pedidos de patentes publica- dos conforme citado ao longo do presente pedido) é no presente do- cumento expressamente incorporado por referência.

[00117] Os experimentos com animais são projetados para assegu- rar um design experimental imparcial. Os animais experimentais serão distribuídos aleatoriamente em grupos, e os investigadores estarão às cegas ao avaliar o comportamento animal. Homens e mulheres serão usados para abordar possíveis diferenças de gênero na transdução, manifestação da doença ou resposta à terapia. O número de animais em cada coorte foi escolhido para produzir dados estatisticamente sig- nificativos.

Visão Geral

[00118] O foco da presente invenção é o desenvolvimento de tera- pia para proteger o pulmão com uma defesa antioxidante extracelular para tratar transtornos, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica

(DPOC), um transtorno crônico no qual oxidantes inalados a partir da fumaça do tabaco, poluição e gerados dentro do pulmão por células inflamatórias ativadas desempenham um papel importante na perpetu- ação da lesão ao epitélio pulmonar e endotélio fundamental para a pa- togênese da doença.

A estratégia é usar a tecnologia de terapia gêni- ca in vivo para fornecer um escudo de enzimas antioxidantes extrace- lulares persistente para o pulmão que inativará a superóxido dismu- tase (02) e H2O>, principais estresses oxidantes extracelulares no pul- mão.

A estratégia inclui o uso de genes para catalase e superóxido dismutase 3 (SOD3) que foram geneticamente modificados para se- cretar enzimas antioxidantes monoméricas funcionais que podem se difundir no meio extracelular, fornecendo ao pulmão um escudo antio- xidante extracelular eficaz.

A catalase é uma enzima intracelular te- tramérica que é muito grande (232 kDa) para se difundir se concebida para ser secretada.

Para usar a catalase como um antioxidante extra- celular eficaz, o gene da catalase foi modificado para evitar que o do- mínio do loop envolvente medie a formação do tetrâmero.

Com a adi- ção de um sinal secretor, o monômero da catalase humana (hCatWL) é secretado, capaz de funcionar para catalisar H2O>2 extracelular em H2O.

A superóxido dismutase 3 (SOD3) é secretada, mas é um grande tetrâmero (130 kDa) e tem um domínio de ligação à heparina que o liga às superfícies celulares.

Para modificar a SOD3 em um antioxi- dante extracelular pulmonar mais eficaz, um loop crítico para a forma- ção de tetrâmero foi modificado e o domínio de ligação à heparina re- movido (hSOD3hd), resultando em uma enzima antioxidante monomé- rica eficaz (30 kDa) que não se ligará às superfícies celulares.

Vetores de transferência gênica adenoassociados (AAV) são usados como ve- tores de transferência gênica exemplificativos para modificar geneti- camente o fígado para expressar e secretar os monômeros de cata- lase e/ou SOD3 modificada.

Quatro AAVrh.10 candidatos serão avali-

ados: AAVrh.10hCatWL' (que expressa o monômero da catalase); AAVrh.10hSOD3hd'— (monômero de SOD3); AAVrh.10hCatWL I/hSOD3hd': (ambos os monômeros); e AAVrh.10hSODhd/hCatWL' (o mesmo, mas com SOD3hd' na posição 5'). Em uma modalidade, um vetor de AAVrh.10 gera um escudo antioxidante extracelular persisten- te na superfície endotelial e epitelial do pulmão após administração.

[00119] Objetivo 1. Comparar in vitro os níveis de expressão de ca- talase e/ou SOD3 modificada funcional secretada, mediada pelo cas- sete de expressão dos 4 vetores antioxidantes AAVrh.10 (hCatWL, hSOD3hd', heatWL/hSOD3hd' e hSOD3hd/hCatWL').

[00120] Objetivo 2. Quantificar in vivo a capacidade dos 4 vetores antioxidantes AAVrh.10 de expressar a catalase e/ou SOD3 modifica- da funcional secretada, capaz de proteger o endotélio e o epitélio pul- monar contra o estresse por 07 e/ou H2O,». Exemplo 1

[00121] O foco da terapia gênica descrita no presente documento é, em uma modalidade, proteger o pulmão com uma defesa antioxidante extracelular para tratar a doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), um transtorno crônico no qual oxidantes inalados a partir da fumaça do tabaco, poluição e gerados dentro do pulmão por células inflamatórias ativadas desempenham um papel importante no início e perpetuação da lesão do epitélio e endotélio pulmonar fundamental para a patogê- nese da doença (Lin & Thomas, 2010; McGuinness et a/., 2017; Hub- bard & Crystal, 1986; MacNee, 2000; Shapiro & Ingenito, 2005; Yoshi- da et al., 2007; Elmasry et al., 2015). Muito do estresse oxidativo no pulmão é extracelular, sobrecarregando as defesas antioxidantes in- tracelulares das células epiteliais e endoteliais, resultando em dano celular, disfunção e eventual morte (Shaykhiev et a/l., 2014; Gao et al., 2015; Polverino et a/., 2018). A estratégia atual é usar tecnologia de terapia gênica in vivo para fornecer um escudo de enzimas antioxidan-

tes extracelular persistente para o pulmão que inativará a superóxido dismutase (07) e H2O>2, dois componentes principais do estresse oxi- dativo extracelular no pulmão.

[00122] As sequências codificadoras da catalase e da superóxido dismutase 3 (SOD3) foram geneticamente modificadas para serem se- cretadas em formas monoméricas funcionais que podem se difundir no meio extracelular, fornecendo ao pulmão uma proteção antioxidante extracelular eficaz. A catalase é uma grande enzima tetramérica (232 kDa) a qual, combinada com grupos heme e NADPH, é uma enzima intracelular altamente eficaz, mas muito grande para se difundir efeti- vamente no meio extracelular, mesmo se concebida para ser secreta- da (Reynolds et al., 1977; Rennard et a/., 1986; Goyal & Basak, 2010; Sepasi et al., 2018; Bell et al/., 1981). Para usar a catalase como um antioxidante extracelular eficaz, o gene da catalase foi modificado para evitar que o domínio do loop envolvente medie a formação de tetrâmero (Goyal & Basak, 2010; Ko et a/l, 2000; Safo et a/l., 2001). Com a adição de um sinal secretor, o monômero da catalase humana (hCatWL') é se- cretado, capaz de funcionar para catalisar H2O> extracelular em H2O.

[00123] Há3 genes de superóxido dismutase, SOD1, 2 e 3 (Fukai & Ushio-Fukai, 2011; Perry et al., 2010). A SOD1 funciona no citoplasma e a SOD2 nas mitocôndrias. A SOD3 é secretada, mas é um grande tetrâmero (130 kDa) e tem um domínio de ligação à heparina que a liga às superfícies celulares (Fukai & Ushio-Fukai, 2011; Antonyuk et al., 2009; Griess et al., 2017). Para modificar a SOD3 em um antioxi- dante extracelular pulmonar mais eficaz, um loop crítico para a forma- ção de tetrâmero foi modificado e o domínio de ligação à heparina re- movido (hSOD3hd), resultando em um antioxidante monomérico fun- cional secretado que não se ligará às superfícies celulares. Em uma modalidade, vetores de transferência gênica adenoassociados (AAV) são usados para modificar geneticamente o fígado para expressar e secretar os monômeros de catalase e/ou SOD3 modificada, cada um com uma massa molecular capaz de se difundir através do pulmão (Reynolds et al., 1977; Bell et a/., 1981): o resultado é uma proteção antioxidante extracelular para todo o pulmão. Em uma modalidade, a estratégia de terapia gênica usa sSAAVrh.10, um vetor de transferência gênica de vírus adenoassociados (AAV) de primatas não humanos que, quando administrado através da via intravenosa, transduz efeti- vamente hepatócitos para expressar o(s) gene(s) antioxidante(s). Qua- tro AAVrh.10 candidatos são avaliados: AAVrh.10hCatWL' (que ex- pressa o monômero da catalase); AAVrh.10hSOD3hd: (monômero de SOD3); AAVrh.10hCatWL/hSOD3hd" (ambos os monômeros); e AA- Vrh.10hSODhd/hCatWL' (o mesmo, mas com SOD3hd' na posição 5').

[00124] “Oxidantes são moléculas que aceitam prontamente elétrons de outras moléculas causando disfunção e eventual danos a célu- las/órgãos (Davies et a/., 2001; Devasagayam et a/l., 2002; O'Reilly et al., 2001; Janssen et a/l., 1993). Em circunstâncias normais, os antioxi- dantes protegem contra o estresse oxidativo (Pham-Huy et a/l., 2008; Irshad et a/l., 2002). Quando a carga oxidante supera as defesas antio- xidantes, o estresse oxidativo resultante desempenha um papel central na patogênese da disfunção orgânica (Casas et al., 2015; Pham-Huy et al., 2008; Irshad et a/l., 2002). Embora o pulmão seja altamente vul- nerável a oxidantes extracelulares inalados (fumaça de tabaco, polu- entes, xenobióticos, hiperóxia) e oxidantes endógenos (células infla- matórias ativadas), as defesas antioxidantes pulmonares são princi- palmente intracelulares (Rhaman et a/., 2006; Sies et al., 2017 ).

[00125] Na DPOC, o epitélio e o endotélio pulmonar estão sob es- tresse oxidativo adicional proveniente de células inflamatórias ativadas (macrófagos e neutrófilos alveolares) que geram oxidantes extracelula- res que superam as defesas oxidantes intracelulares (Figura 1A). As principais enzimas de defesa antioxidante do pulmão são a superóxido dismutase (SOD; catalisa 07 em H2O>2; 3 formas: SOD1 citoplasmática, SOD2 mitocondrial, SOD3 extracelular), catalase (catalisa H2O> em H2O, citoplasmática) e o sistema de glutationa que converte H2O02 em água (GSH é citoplasmático e extracelular; múltiplas enzimas cito- plasmáticas são necessárias para manter GSH reduzido; Figura 1B) (Rahman et al., 2006; Sies et a/., 2017). Embora as células pulmona- res tenham sensores de oxidação, tais como NRF2 e NF-«B/IkB, as células pulmonares humanas não são capazes de aumentar a regula- ção das principais enzimas antioxidantes catalase e SOD.

Isto foi dra- maticamente demonstrado em um estudo realizado pelo laboratório Crystal, no qual voluntários humanos normais sofreram broncoscopia para coletar amostras do epitélio das vias aéreas para quantificar os níveis de MRNA de catalase e SOD de linha de base e, em seguida, após exposição a 100 % de O> durante 12-18 horas (suficiente para induzir à traqueobronquite) e amostras do epitélio foram novamente coletadas (Erzurum et a/., 1985). Surpreendentemente, nem os níveis de mRNA de catalase nem de SOD foram positivamente regulados, isto é, o epitélio das vias aéreas humanas tem mecanismos limitados para regular positivamente seu escudo antioxidante, apesar do intenso estresse oxidativo extracelular.

Uma solução é fornecer um "revesti- mento de Teflon antioxidante" extracelular eficaz para proteger o pul- mão contra o estresse de oxidantes extracelulares.

Um vetor de trans- ferência gênica de vírus adenoassociado (AAV) é usado para expres- sar uma forma secretada de catalase apenas, SOD3 apenas ou cata- lase + SOD3 para gerar um escudo antioxidante eficaz.

O desafio é que a catalase é um grande tetrâmero intracelular e a SOD3 é um grande tetrâmero que se liga às superfícies celulares; em sua forma natural, nenhum dos dois pode fornecer defesa antioxidante extracelu- lar difusa eficaz.

A solução é modificar as sequências codificadoras da catalase e SOD3 para gerar monômeros funcionais que podem ser usados efetivamente como terapia gênica com base em antioxidantes, capazes de se difundir através do pulmão, protegendo o endotélio e epitélio vulneráveis aos oxidantes (Reynolds et al., 1977; Bell et al, 1981). Ao administrar, em uma modalidade, o vetor de AAV que codifi- ca monômeros de catalase e/ou SOD3 modificada através da via intra- venosa, os hepatócitos do fígado secretarão os monômeros antioxi- dantes funcionais no sangue, permitindo a proteção antioxidante do endotélio pulmonar (do lado do sangue) e de suficiente pesos molecu- lares baixos (50-60 kDa) para se difundir através do endotélio e jun- ções estreitas epiteliais para fornecer um escudo antioxidante eficaz aos tecidos intersticiais e o epitélio (para proteínas com peso molecu- lar de 50-60 kDa, os níveis de fluido de revestimento epitelial do pul- mão humano são 10 % do sangue).

[00126] Uma molécula de catalase pode converter milhões de mo- léculas de H202 em H2O a cada segundo (Goyal & Basak, 2010; Chance, 1947). A catalase é uma enzima intracelular composta por 4 monômeros (cada um 501 aminoácidos) + 4 grupos de ferro que con- têm 4 heme + 4 moléculas de NAPDH. A catalase é expressa em to- dos os órgãos. O desafio para uma estratégia de terapia gênica para aumentar a proteção antioxidante extracelular do pulmão é que a cata- lase é muito grande (232 kDa) para secretar e se difundir para fornecer um escudo antioxidante extracelular eficaz. A solução LEX é modificar geneticamente a sequência do gene da catalase de modo que ela não possa formar tetrâmeros e possa ser secretada como um monômero que funcionará como um antioxidante extracelular eficaz. Cada monô- mero de catalase tem resíduos amino-terminais importantes para a troca do braço de encadeamento que liga as unidades monoméricas juntas e um domínio de loop envolvente - os 4 monômeros se envol- vem para formar um tetrâmero, com pontes de sal e interações iônicas mantendo os 4 monômeros juntos. As modificações genéticas candi-

datas incluíram: (1) todas as construções tinham uma sequência de secreção N-terminal (de IgG1 humana); (2) a sequência da catalase foi modificada na região N-terminal para eliminar um domínio que estabiliza a estrutura do tetrâmero; e (3) o domínio do loop envolvente que forma a interface de ligação entre os monômeros foi eliminado (Figura 2).

[00127] A SOD converte 02 em H2O2. A SOD3 (sítio ativo de cobre + zinco) é um homotetrâmero secretado (cerca de 130 kDa) com um peptídeo sinalizador amino-terminal e um domínio de ligação à hepari- na C-terminal composto por um grupo de resíduos positivamente car- regados. Embora secretado, o domínio de ligação à heparina ancora a SOD3 à superfície celular e à matriz de proteoglicanos do sulfato de heparina e colágeno (Sandstom, 1993; Olsen et al., 2004) (uma pe- quena fração é clivada próximo do N-término para gerar tetrâmeros em circulação). Para maximizar a eficácia da SOD3 como um gene tera- pêutico no pulmão, uma modificação foi feita para substituir um loop envolvente monomérico que forma o tetrâmero, e um segmento do domínio de ligação à heparina foi eliminado para permitir que o monô- mero de SOD3 se difundisse livremente no tecido. Uma vez que a SOD3 tem um peptídeo sinalizador, este foi deixado intacto (Figura 3).

[00128] A DPOC é a terceira causa de morte mais comum nos Es- tados Unidos. Além do oxigênio, não há fármacos que diminuam a mortalidade associada à DPOC (Benton et a/., 2018; Woodruff et al., 2015). Os medicamentos usados na DPOC (broncodilatadores, corti- costeroides) ajudam os sintomas e os antibióticos de longo prazo re- duzem a frequência das exacerbações (Benton et a/l., 2018; Woodruff et al., 2015). Há dados extensos que sustentam o conceito de que o estresse proveniente de oxidantes extracelulares desempenha um pa- pel importante na patogênese da DPOC (Shaykiev et a/., 2014; Gao et al., 2015; Polverino et a/., 2010; Rahman, 2015). Há vários estudos clínicos para avaliar antioxidantes para a terapia de DPOC (revisado em Rahman, 2008; Rahman, 2012). Nenhum destes testes foi bem- sucedido. A estratégia LEX é uma nova abordagem que usa tecnologia de terapia gênica para aumentar os níveis de enzimas antioxidantes efi- cazes no meio extracelular para proteger as células epiteliais e endoteli- ais contra o estresse oxidativo. Se for bem-sucedido, no contexto da im- portância dos oxidantes na patogênese da DPOC, um estabelecimento com base na terapia gênica de uma triagem antioxidante extracelular deve ser altamente significativo como um produto terapêutico para es- te transtorno fatal comum (Foronjy et a/., 2008; Rahman et a/., 2006).

[00129] A Figura 4 mostra uma terapia gênica com base em antio- xidante enzimático difusível extracelular exemplificativa para tratar a DPOC. Com base nos estudos até o momento, o LEX 5 será composto de um cápside de sorotipo rh.10 de AAV, com 1 de 4 cassetes de ex- pressão candidatos (Figura 4). Os 4 vetores de transferência gênica candidatos são idênticos, exceto quanto ao cDNA que codifica a enzi- ma antioxidante. Cada um compreende um cassete de expressão com (5' para 3'): (1) repetição terminal invertida de AAV (ITR) do sorotipo 2 de AAV; (2) o intensificador/promotor de CAG-citomegalovírus, um do- ador de emenda (splicing), a sequência intrônica de B-actina de gali- nha, íntron direito e aceitador de emenda de B-globina de coelho; CAG é um promotor constitutivo altamente ativo, amplamente usado em aplicações de terapia gênica (Miyazaki et a/., 1989; Niwa et a/., 1991); (3) sequência codificadora do monômero de catalase (LEX 5a, hCatWbD-), o monômero de SOD3 (LEX 5b, hSOD3hd), as sequências codificadoras combinadas (5' para 3') de hCatWD' + hSOD3hd;, sepa- radas por uma sítio de furina 2A (LEX 5c) e as sequências codificado- ras combinadas (5' para 3') de hSOD3hd' + hCatWD-', separadas por um sítio de furina 2A (LEX 5d, idêntico ao LEX 5c, exceto quanto à or- dem, onde as sequências da catalase e da SOD3 são invertidas ); (4) marcador de hemaglutinina (para facilitar a detecção da proteína); (5)

poliA/sinal de término; e (6) 3AAV2ITR. Os cassetes de expressão se- rão todos empacotados na cápside do sorotipo AAVrh.10, um cápside de AAV de primata não humano que tem excelente transdução no fí- gado para expressar proteínas secretadas. Os 4 cassetes de expres- são candidatos serão avaliados in vitro quanto à função e os 4 vetores de AAV candidatos deverão ser comparados frente a frente em ca- mundongos, usando doses intravenosas equivalentes de cada vetor, avaliando o fígado e o pulmão quanto ao DNA de vetor e mRNA de catalase e/ou SOD3 humana e a quantidade e atividade de proteína monomérica catalase e atividade plasmática (para proteção endotelial pulmonar) e fluido de revestimento epitelial pulmonar (para proteção epitelial pulmonar). Usando critérios quantitativos detalhados em 3c, um dos vetores será escolhido dentre os 4 vetores candidatos.

[00130] Globalmente, a DPOC afeta 329 milhões (4,8 % da popula- ção mundial (Vos et a/., 2012)) e causa mais de 3 milhões de mortes em todo o mundo a cada ano. Nos EUA, a DPOC é a terceira causa de morte, causando cerca de 150.000 mortes por ano. O vetor pode re- querer apenas uma única infusão intravenosa para terapia ao longo da vida para este transtorno crônico e fatal. Em vez de usar terapia gêni- ca para expressar os genes nativos que codificam enzimas antioxidan- tes que aumentam principalmente o antioxidante intracelular (catalase) ou permanecem ligados às membranas celulares (SOD3), a presente estratégia é usar a terapia gênica para gerar um "escudo" antioxidante enzimático extracelular eficaz ao "fornecer proteção antioxidante ex- tracelular para todas as células pulmonares, incluindo o endotélio e epitélio altamente vulneráveis".

[00131] A solução para gerar uma defesa extracelular pulmonar efi- caz é modificar as sequências codificadoras da catalase e SOD3 hu- manas nativas para que possam gerar monômeros funcionais com um peso molecular de 50-60 kDa as quais, quando expressas por meio de transferência gênica mediada por AAV no fígado, permitem que os monômeros aumentem as defesas antioxidantes do sangue (prote- gendo o endotélio pulmonar) e se difundam pelo pulmão e aumentem as defesas antioxidantes do fluido de revestimento epitelial pulmonar (protegendo o epitélio). Em suma, as inovações incluem: (1) engenha- ria molecular dos genes da catalase e SOD3 humanas para direcionar estes antioxidantes altamente eficazes para criar um escudo antioxi- dante extracelular para o endotélio e epitélio pulmonar, evitando que o estresse oxidativo extracelular danifique as células pulmonares; e (2) usar, em uma modalidade, uma combinação dos genes da catalase e SOD3 geneticamente modificadas em um construção de transferência gênica, aproveitando a capacidade destes antioxidantes de remover eficazmente tanto 02 como e H2O>, deste modo, fornecendo um escu- do antioxidante extracelular eficaz contra um amplo espectro de oxi- dantes inalados, bem como oxidantes extracelulares gerados por célu- las inflamatórias ativadas. Os vetores separados de catalase e SOD podem ser administrados juntos.

[00132] Com base nos dados, 4 vetores candidatos foram identifi- cados, todos com base no sorotipo não humano AAV rh.10 (Figura 4): (1) LEX 5a - AAVrh.10hCatWD-" (monômero de catalase secretado); (2) LEX 5b - AAVrh.10hSOD3hd': (monômero de SOD3 secretado com o domínio de ligação à heparina eliminado); (3) LEX 5c - AAVrh. 10hCatWD/SOD3hd: (vetor único que expressa o monômero de cata- lase secretado e o monômero de SOD3 secretado); e (4) LEX 5d - AAVrh.10hSOD3hd/hCatWD- (idêntico ao LEX 5c, mas com a constru- ção de SOD3 após a construção de catalase). A abordagem experi- mental para identificar LEX 5 usa ensaios in vitro e in vivo.

[00133] As modificações na sequência codificadora da catalase humana levaram à identificação do cassete de expressão para LEX Ba, criando AAVrh.10hCatWD- (LEX 5a) e foi demonstrado que, quan-

do LEX 5a é administrado por via intravenosa a camundongos, o resul- tado é a atividade sérica da catalase humana funcional. Da mesma forma, modificações na sequência codificadora da SOD3 humana leva- ram à identificação do cassete de expressão LEX 5b em camundon- gos, resultando em atividade sérica de SOD funcional. Os vetores AA- Vrh.10hCatWD/hSOD3hd' e AAVrh.10hSOD3hd/hCatWD foram ge- rados e estão sendo testados in vitro e in vivo.

[00134] Três modificações da sequência da catalase humana foram avaliadas: hCatNT', hCatWL' e hCatNTWL. A avaliação do sobrena- dante da cultura após transfecção destes plasmídeos em células 293T em meio isento de soro foi demonstrada e todos os 3 foram secretados (Figura 5A). No entanto, das 3 construções, apenas a eliminação do domínio do loop envolvente (hCatWD-) reteve a atividade da catalase (Figura 5B). A análise no gel de Bis-Tris demonstrou que o hocAThd- foi secretado como um monômero (Figura 5C). Com base nestes dados, AAVrh.10hCatWD- (LEX 5a) foi criado. A administração intravenosa a camundongos levou à detecção de DNA de hCatWD- no fígado e pul- mão (típico para vetores de AAVrh.10) (Chiuchiolo et a/., 2013) e, mais importante, atividade de catalase humana facilmente detectável no so- ro, por exemplo, LEX 5a gera um monômero de catalase funcional se- cretado (Figura 7A-C).

[00135] Duas modificações foram feitas em uma única variante de SOD3 (hSOD3hd), incluindo uma eliminação dos resíduos 50-59 substituídos por uma cópia in frame do segmento dos resíduos 74-80, e uma eliminação dos resíduos 212-240, o domínio de ligação à hepari- na. A quantificação do sobrenadante da cultura após a transfecção deste plasmídeo em células 293T demonstrou que a variante hSOD3hd- foi facilmente detectada no sobrenadante (Figura 6A) e era um monômero (Figura 6B). Com base nestes dados, AAVrh.10hSOD3hd' (LEX 5b) foi gerado (Figura 4). A administração intravenosa a camundongos Balb/c levou à expressão do vetor de DNA no fígado e pulmão (fígado 50 ve- zes maior) e SOD no soro (Figura 7D-F). LEX 5c, LEX 5d. Com base nos dados funcionais in vitro e in vivo de LEX 5a e LEX 5b, LEX 5c e LEX 5d foram gerados para expressar os monômeros modificados de catalase e SOD3. Com base na expressão de 2 genes em 1 constru- ção de AAV (De et a/l., 2008; Wang et al., 2010; Watanabe et al., 2010; Mao et al., 2011; Rosenberg et a/., 2012; Hicks et a/., 2012; Xie et al., 2014; Hicks et a/., 2015; Pagovich et al., 2016; Liu et a/., 2016), tanto LEX 5a quanto LEX 5b usam um único promotor, com os 2 cDNA mo- dificados separados por um sítio de clivagem de furina 2A que controla a clivagem da proteína precursora resultante para gerar as 2 proteínas funcionais. Duas construções são testadas: LEX 5c, onde a sequência hCatWD- está após a sequência hSOD3hd”, e LEX 5d, onde as 2 se- quências codificadoras de cDNA estão invertidas. Ambas serão testa- das quanto à função in vitro e in vivo.

Design Experimental

[00136] Os estudos se focaram na comparação de LEX 5a, LEX 5b, LEX 5c e LEX 5d in vitro e in vivo. Os seguintes critérios são usados para classificar os candidatos para a mesma dose de vetor: (1) in vitro - níveis de antioxidante funcional secretado de estresse oxidativo por Oz, H2O>2; (2) in vivo - níveis persistentes de antioxidantes funcionais no soro e no fluido de revestimento epitelial pulmonar. Tabela |. Comparação in vitro dos 4 plasmídeos de expressão candidatos 1-5 para cada parâmetro Temo meadd SE de soro. Após 72 horas, o meio é coletado e avaliado. "Controle" - plasmídeo sem transgene. Todos os estudos são realizados em quadruplicata, com cada plasmí-

deo avaliado em quadruplicata. ? Os níveis de catalase e SOD3 humana são testados por ELISA; atividade de ca- talase através de ensaio colorimétrico (Thermo Fisher), atividade de SOD3 através de ensaio colorimétrico (Abeam); e desafios por H2O2 e Oz no endotélio microvas- cular pulmonar humano e o epitélio das vias aéreas humanas). ? Cada ensaio é classificado a partir de 1 (pior, sem efeito) a 5 (melhor, com média de 4 ensaios). As classificações são adicionadas a uma pontuação total de 6 (pior) ou até 30 (melhor).

[00137] Para comparar in vitro os níveis de expressão de catalase e/ou SOD3 modificada funcional e secretada mediada pelo cassete de expressão, foram usados os 4 vetores antioxidantes AAVrh.10 (hCatWL, hSOD3hd, hCatWL/hSOD3hd' e hSOD3hd/hCatWL). Os dados de- monstram que tanto hCatWD-' (cassete de expressão para LEX 5a) como hSOD3hd' (cassete de expressão para LEX 5b) geram monôme- ros e funcionam in vitro e in vivo para gerar catalase e SOD, respecti- vamente. A meta do objetivo 1 é realizar testes comparativos dos 4 cassetes de expressão através de transfecção de plasmídeos (hCatWD, hSsOD2hd', hcatWD/hSOD3hd: e hSOD3hd/hCatWD) em células 293T em meio isento de soro em função da dose. Após 72 ho- ras, o sobrenadante resultante é testado quanto: (1) aos níveis de ca- talase e SOD; (2) a atividade da catalase e SOD; e (3) a capacidade do sobrenadante de proteger o endotélio microvascular humano e o epitélio das vias aéreas humanas contra o estresse oxidativo (02 e H20>2). As avaliações in vitro dos 4 plasmídeos serão classificadas con- forme detalhado na Tabela |l. Tabela Il. Comparações in vivo dos 4 vetores candidatos po (semanas) Nível de catalase no soro LEXS: bp, | 10º 100 e ELF, atividade e inibi- a, ã : 2 1 * *|çãode desafio por H2O>2; 1-5 para cada & À e con 10º COPIAS | Nível de SOD no soro e 0,2,4,12 parâmetro role genômicas | EF, atividade e inibição de desafio por Oz ? Controle - idêntico aos outros vetores, mas sem transgene; n = 5 machos e = 5 fê- meas/grupo/ponto de tempo.

3 Similar à Tabela |, nota de rodapé ?, com soro ou fluido de revestimento epitelial puimo- nar (ELF) como uma função da quantidade é substituída pelos sobrenadantes.

* Avaliação no fígado, pulmão, soro e ELF em O, 2, 4 e 12 semanas.

* Conforme descrito em Estatísticas, a classificação total é uma combinação da avaliação in vitro e in vivo, com a classificação in vivo valendo 2 vezes a classificação in vitro.

[00138] Quantificação in vivo da capacidade dos 4 vetores antioxi- dantes AAVrh.10 de expressar a catalase e/ou SOD3 modificada fun- cional e secretada capaz de proteger o endotélio pulmonar e o epitélio contra o estresse por 02 e H2O>

[00139] O objetivo é comparar os vetores LEX 5a, b, c e d in vivo. À partir de experimentos precedentes com cassetes de expressão du- plos em vetores AAVrh.10 (De et a/l., 2008; Wang et a/., 2010; Wata- nabe et al., 2010; Mao et a/., 2011; Rosenberg et al., 2012; Hicks et al., 2012; Xie et al., 2014; Hicks et al., 2015; Pagovich et a/l., 2016; Liu et al., 2016), uma vez que LEX 5a e LEX 5b são funcionais, não há razão para que as construções LEX 5c e LEX 5d não sejam funcionais, em- bora possa haver diferenças na expressão relativa da catalase vs. SODS3 nos cassetes de expressão LEX 5c vs. LEX 5d. Para comparar os 4 vetores, as mesmas doses (10º, 10ºº e 10" cópias genômicas) de administração intravenosa são comparadas em camundongos Balb/c machos e fêmeas. Em O, 2 semanas, 1 mês e 3 meses, os seguintes parâmetros serão avaliados: (1) DNA de vetor no fígado e pulmão; (2) MRNA do cassete de expressão no fígado e pulmão; (3) níveis de ca- talase e SOD e atividade no soro e fluido de revestimento epitelial pulmonar (ELF); e (4) o soro dos camundongos tratados será testado quanto à proteção do endotélio microvascular humano contra o estres- se por 02 e H2O,> in vitro e o ELF testado quanto à proteção do epitélio das vias aéreas humanas contra o mesmo estresse oxidativo. O ponto de tempo de 3 meses será o último ponto de tempo com base nos da- dos extensos de que, se a expressão mediada por AAVrh.10 de prote- Ínas secretadas permanecer estável em 3 meses, ela permanecerá estável durante a vida do animal (Chiuchiolo et a/., 2013; De et al,

2008; De et a/l., 2006) A escolha de camundongos Balb/c se baseia no fato de que esta linhagem tolera a expressão de proteína humana in vivo sem gerar imunidade contra a proteína humana (Rosenberg et al.., 2012). Se houver qualquer problema de imunidade (observado pela perda de expressão), trocaremos para a linhagem de camundon- go C57BI/6, a qual também tolera genes de células humanas expres- sos por vetores AAV (De et a/., 2006). As avaliações in vivo são classi- ficadas conforme detalhado na Tabela Il. As classificações in vitro e in vivo são combinadas para obter uma classificação geral.

[00140] Os cassetes de expressão de plasmídeo são classificadas através de 6 ensaios de eficácia; os mesmos ensaios são usados no objetivo 2 para avaliar os níveis sérico e pulmonar de ELF.

Níveis de catalase

[00141] ELISA (Abcam).

Níveis de SOD3

[00142] ELISA (Biocompare).

Atividade de catalase

[00143] Ensaio colorimétrico (Thermo Fischer).

Atividade de SOD3

[00144] Ensaio colorimétrico (Abcam).

Desafio no Endotélio com Oz e H2O>z

[00145] As células endoteliais microvasculares humanas (Lonza) serão desafiadas com superóxido (quimicamente usando a reação de Fenton) ou H202. Em 24 e 48 horas, a morte celular (níveis de lactato desidrogenase no sobrenadante), resposta oxidativa (PCR quantitativa quanto aos níveis de MRNA dos genes de estresse oxidativo. Para proteção, as células serão pré-tratadas com sobrenadante de plasmí- deo, soro ou ELF.

Desafio no Epitélio com O2 e HzOz

[00146] Os ensaios são idênticos àqueles para o endotélio, mas com o epitélio das vias aéreas humanas substituído pelo endotélio. O epitélio humano será derivado ao longo de 28 dias a partir de células basais humanas normais em colágeno de tipo IV com culturas de inter- face ar-líquido. Produção de Vetores AAVrh.10

[00147] O vetor é produzido por meio de cotransfecção em células de rim embrionário humano 293T (HEK 293T; ATCC) do plasmídeo de expressão juntamente com um plasmídeo que porta o gene Rep AAV?2, o gene Cap AAVrh.10 para as proteínas VP1, 2 e 3 (que defi- nem o sorotipo do vetor rh.10 AAV produzido) e as funções auxiliares do RNA de adenovírus E2, E4 e VA (Collaco et a/., 1999; Hicks et al., 2016). O vetor é purificado através de um gradiente de iodixanol e cromatografia de permuta aniônica QHP. As titulações do genoma de vetor serão determinadas por meio de análise quantitativa de PCR em tempo real TaqMan (Mayginnes et a/., 2006). Modelos Animais

[00148] Os vetores são administrados por via intravenosa em cada uma das 3 doses (10º, 101º, 10!) na veia da cauda de camundongos Balb/c. Todos os estudos são feitos com n = 5 camundongos machos e 5 fêmeas em cada ponto de dados. O ELF pulmonar, obtido por meio de fibrobroncoscopia e lavagem, é uma mistura de solução salina usa- da para recuperar o ELF e o ELF real. O volume de ELF recuperado é quantificado usando o método da ureia (Rennard et a/., 1985) e o nível de catalase ou SOD3 expressa em uM por volume de ELF. O soro ob- tido através de coleta de sangue da veia da cauda e ELF do pulmão são avaliados em O (pré-terapia), 2, 4, 12 semanas. Quando de euta- násia, o fígado e o pulmão dos camundongos são coletados para aná- lise do genoma de vetor e expressão gênica e transferidos para um tubo cônico limpo de 15 ml, com 1 ml de RNAlater (Qiagen) por 100 mg de tecido para isolamento de DNA/MRNA e armazenado a 4'C du-

rante a noite. As amostras são homogeneizadas a 4 “C durante 10-20 minutos e 1 amostra é usada para cada análise de DNA e mRNA por PCR em tempo real usando um conjunto de sondas e iniciadores es- pecífico para o transgene.

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[00149] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes são incorporados no presente documento por referência. Embora no relató- rio descritivo precedente a presente invenção tenha sido descrita em relação a determinadas modalidades preferidas da mesma, e muitos detalhes tenham sido apresentados para fins de ilustração, será evi- dente para aqueles versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que alguns dos detalhes descritos no pre- sente documento podem ser consideravelmente variados sem se afas- tar dos princípios básicos da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor de terapia gênica, caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão que compreende uma sequên- cia de ácidos nucleicos que codifica uma catalase modificada que tem atividade de catalase, mas não forma tetrâmeros.

2. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma superóxido dismutase modificada que é secretada, mas não se liga às superfícies celulares.

3. Vetor de terapia gênica, caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão que compreende uma sequên- cia de ácidos nucleicos que codifica uma superóxido dismutase modifi- cada que é secretada, mas não se liga às superfícies celulares ou não forma tetrâmeros.

4. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a superóxido dismutase modifica- da é uma superóxido dismutase-3 modificada.

5. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a superóxido dismutase modifi- cada não se liga à heparina.

6. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma catalase modificada que tem ati- vidade de catalase, mas não forma tetrâmeros.

7. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 5, caracterizado pelo fato de que a cata- lase modificada tem uma eliminação no N-término no domínio do bra- ço de encadeamento, eliminação a qual pode ser de 1 a 80 ou qual- quer número inteiro entre 1 e 80.

8. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, 5 ou 7, caracterizado pelo fato de que a cata- lase modificada tem uma eliminação no domínio do loop envolvente, eliminação a qual pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 resíduos.

9. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, 5, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a catalase modificada tem uma eliminação no braço de encadeamento e nos domínios do loop envolvente.

10. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, 50u7 a 9, caracterizado pelo fato de que a catalase modificada tem uma sequência secretora.

11. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, caracterizado pelo fato de que a superóxido dismutase modificada tem uma eliminação no domínio de ligação à heparina, eliminação a qual pode ser de 1 a 15 ou 20 ou 25 ou mais resíduos.

12. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizado pelo fato de que a superóxido dismutase modificada tem uma substituição de um ou mais resíduos de uma volta ou domínio de loop.

13. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 12, caracterizado pelo fato de que a superóxido dismutase modificada tem uma eliminação e uma inserção de um ou mais resíduos de uma volta ou domínio de loop.

14. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é um vetor viral.

15. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é um vetor de adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), retrovírus ou lentivírus.

16. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é pseudotipado.

17. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é pseudotipado com a cápside de AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AAVhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 ou AAV7.

18. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é pseudotipado com AAVrh.10, AAV8 ou AAVS5.

19. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é AAV2, AAVS5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10.

20. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 19, caracterizado pelo fato de que o vetor com- preende um cassete de expressão que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a catalase modificada e a superóxido dismutase modificada, sequência de catalase e sequência de superó- xido dismutase as quais são separadas por um substrato de sequência de protease.

21. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a catalase modificada é N-terminal à superóxido dismutase modificada.

22. Vetor de terapia gênica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a catalase modificada é C-terminal à superóxido dismutase modificada.

23. Vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 19, caracterizado pelo fato de que um vetor compreende um cassete de expressão que compreende uma sequên- cia de ácidos nucleicos que codifica a catalase modificada e outro ve- tor compreende um cassete de expressão que compreende uma se-

quência de ácidos nucleicos que codifica a superóxido dismutase mo- dificada.

24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade do vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.

25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 24, caracterizada pelo fato de que o vetor é um plasmídeo

26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 24, caracterizada pelo fato de que o vetor é um vetor viral.

27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 26, caracterizada pelo fato de que o vetor é um vetor de adenoví- rus, vírus adenoassociado (AAV), retrovírus ou lentivírus.

28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 27, caracterizada pelo fato de que o vetor é um vetor de AAV.

29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 27, caracterizada pelo fato de que o vetor de AAV é pseudotipado.

30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 29, caracterizada pelo fato de que o vetor de AAV é pseudotipado com a cápside de AAVrh.10, AAV8, AAV9, AAV5, AAVhu.37, AA- Vhu.20, AAVhu.43, AAVhu.8, AAVhu.2 ou AAV7.

31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 28, caracterizada pelo fato de que o vetor de AAV é AAV2, AAV5B5, AAV7, AAV8, AAV9 ou AAVrh.10.

32. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 31, caracterizada pelo fato de que a quantidade do vetor é cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10º cópias ge- nômicas.

33. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 32, caracterizada pelo fato de que a quantidade do vetor é cerca de 1 x 10º? a cerca de 1 x 10*º cópias ge-

nômicas, cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10º? cópias genômicas ou cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10*º cópias genômicas.

34. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 33, caracterizada pelo fato de que com- preende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.

35. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 33, caracterizada pelo fato de que com- preende um vetor viral que codifica a catalase modificada e outro vetor viral que codifica a superóxido dismutase modificada.

36. Método para prevenir, inibir ou tratar dano oxidativo em um mamífero caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao mamífero uma quantidade eficaz do vetor, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 23 ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 35.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que o mamífero tem ou está em risco de ter ateroscle- rose, câncer, diabetes, artrite reumatoide, lesão de perfusão pós- isquêmica, infarto do miocárdio, doenças cardiovasculares, inflamação crônica, acidente vascular cerebral, choque séptico ou outras doenças degenerativas e neurológicas, tais como mal de Alzheimer ou mal de Parkinson.

38. Método para prevenir, inibir ou tratar DPOC, síndrome de dificuldade respiratória ou doença pulmonar intersticial fibrótica em um mamífero caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a um mamífero que precisa uma quantidade eficaz do vetor como defi- nido em qualquer uma das reivindicações | a 23 ou da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a

35.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 34, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser hu-

mano.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 39, caracterizado pelo fato de que uma quantidade de um vetor viral que codifica a catalase modificada e uma quantidade do ve- tor viral que codifica a superóxido dismutase modificada são adminis- tradas.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteriza- do pelo fato de que os vetores virais são administrados sequencial- mente.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteriza- do pelo fato de que os vetores virais são administrados simultanea- mente.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 39, caracterizado pelo fato de que um vetor viral que codifica a catalase modificada e a superóxido dismutase modificada é administrado.