JP2024519094A - 予めテンプレート化された即時区画におけるゲノム発現摂動 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＲＮＡ誘導型ゲノム改変を経験した細胞を、予めテンプレート化された即時区画（ＰＩＰ）へとほぼ即時に分離するための方法、およびそのＰＩＰを使用して、そのガイドＲＮＡと、そのゲノム改変から生じた遺伝子発現レベル変化とを関連付けるための方法を提供する。本発明は、遺伝子発現配列決定ならびにがん検出の複雑性およびコストを大きく減少させる、シングルセル遺伝子発現解析のための方法を提供する。有利なことに、各細胞は、その細胞を改変したＲＮＡガイドのコピーを含む。

Description

（技術分野）
本発明は、一般的には、ゲノム発現捕捉および配列決定の分野に関連する。
（背景）
がんは、世界で２番目に多い死亡原因であり、毎年ほぼ１千万人の死亡の原因である。がんは、細胞がどのように成長して分裂するかを制御する、ＤＮＡ中に保存された遺伝情報の遺伝的変異または後天的変異によって引き起こされる、遺伝性疾患である。がんと関連付けられている種々の種類の多数のＤＮＡ変異が存在するが、一般的には、個別のがん患者の遺伝子変異プロファイルは異なる。さらに、ＤＮＡに保存された遺伝情報は、細胞で発現される前に、まずメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されなければならない。ＤＮＡ中の遺伝情報が実際にｍＲＮＡへと発現される程度もまた、各個人に独特である。つまり、患者が、がんと関連付けられたＤＮＡ変異を有すると同定され得る場合でさえ、その患者ががん表現型を実際に発現し得るか否かおよびその程度は、未知のままである。
ＲＮＡのシングルセルシーケンシングは、細胞が調製された複合混合物に由来する細胞におけるがんと関連する遺伝子の実際の発現レベルを科学者に提供することによって、患者におけるがん細胞発現の検出に革命を起こした。単一細胞群を分離することおよびそのＲＮＡ発現のための一般的な方法は、単一細胞群を一度に１個ずつ分離するために、フローサイトメトリーおよび液滴マイクロ流体力学を使用する。しかし、これらの方法は、高価でありかつ使用するのが難しい、複雑な装置を必要とする。さらに、各細胞は個別に処理されなければならないので、このような方法は、速度が制限され、がん細胞を周囲の細胞から分離するためには長い期間（しばしば、数日）を必要とする。この制限は、サンプルに対するがん細胞の割合が最小限である早期がん検出において、特に問題である。さらに、このような方法は、特に臨床医が使用するのは困難であるので、そのような装置を取り扱うことが可能な施設にサンプルを送付しなければならず、がん診断に至るために必要な時間および費用をさらに増大させる。このことは、がん遺伝子発現の早期検出が、がん患者の大多数にとっては費用負担できず利用不能であることをもたらしている。
（要旨）
本発明は、遺伝子発現配列決定ならびにがん検出の複雑性およびコストを大きく減少させる、シングルセル遺伝子発現解析のための方法を提供する。本発明は、ＲＮＡ誘導型ゲノム改変を経験した細胞を、予めテンプレート化された即時区画（ｐｒｅ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｉｎｓｔａｎｔ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）（ＰＩＰ）へとほぼ即時に分離するための方法、およびそのＰＩＰを使用して、そのガイドＲＮＡと、そのゲノム改変から生じた遺伝子発現レベル変化とを関連付けるための方法を提供する。
有利なことに、各細胞は、その細胞を改変したＲＮＡガイドのコピーを含む。例えば、各細胞は、そのＲＮＡガイドのコピーを発現し続け得る。結果として、その細胞により発現されるｍＲＮＡとそのＲＮＡガイドとの両方が、その区画に独特な配列でバーコード化され得る。その後、各ＲＮＡガイドは、そのＲＮＡガイドによって引き起こされたゲノム改変の結果としてその細胞によって実際に発現されたｍＲＮＡ転写物と、関連付けられ得る。遺伝子改変細胞を同時に区画化することによって、本発明は、細胞における何千個または何十万個もの遺伝子改変の評価を、数週間以内ではなく数日間以内で可能である。さらに、本発明の方法は、マイクロ流体細胞分離技術によって必要とされる複雑で高価な機器を必要とせずに実施され、早期がん検出における遺伝子発現の分析およびプロファイリングのコストを劇的に減少させる。
本発明は、遺伝子発現プロファイリングのための方法を記載し、この方法は、複数の細胞とテンプレート粒子とを合わせる工程を含む。それらの細胞はＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼにより遺伝子改変されており、それらの細胞は、捕捉配列をさらに発現するそのＲＮＡガイドのコピーを含む。そのＲＮＡガイドのコピーは、そのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと一緒になってその細胞を遺伝子改変した、同じガイドのコピーである。それらのテンプレート粒子のうちの一つだけとそれらの細胞のうちの一つだけとを封入する複数の均一区画がほぼ即時に生成されて、予めテンプレート化された即時区画（ｐｒｅ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｉｎｓｔａｎｔ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）（ＰＩＰ）を形成する。核酸分子が、各ＰＩＰにおいてそれらの細胞から放出され、それらの核酸分子は、捕捉配列を含むＲＮＡガイドおよびＲＮＡ転写物を少なくとも含む。有利なことに、それらの細胞とテンプレート粒子とを合わせる工程と、複数の均一区画を形成する工程とは、同じ容器（例えばチューブ、例えば、遠心管）において実施され得る。さらに、それらの細胞は、そのＲＮＡガイドをそのガイドによる遺伝子改変後も発現し続け得る。
いったんＲＮＡが細胞から放出されると、そのＲＮＡは、そのＲＮＡのｃＤＮＡ相補体へと逆転写され得る。ｃＤＮＡは一般的にはＲＮＡよりも安定であり、配列決定のためにより容易に利用可能で処理されるので、このことは有利である。さらに、ｃＤＮＡへの逆転写反応は、独特な分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）およびＰＩＰに独特なバーコードを各核酸分子にさらに付加するために有用である。
一般に、逆転写は、ＲＮＡのポリアデニル化（ポリＡ）テールにハイブリダイズするオリゴｄＴ逆転写プライマーによって実施される。したがって、そのｍＲＮＡ転写物は、オリゴｄＴ逆転写プライマーを使用することにより逆転写され得る。しかし、オリゴｄＴ逆転写プライマーは、非ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写することにおいて、一般的にはより制限される。
ＲＮＡガイドの非ポリアデニル化コピーが、ＲＮＡ誘導型プラットフォームのために一般的には必要とされる。その理由は、ＲＮＡのポリＡテールがそのＲＮＡ誘導型プラットフォームの機能に干渉するからである。
有利なことに、本発明において、非ポリアデニル化ＲＮＡガイドは捕捉配列を含み得、その非ポリアデニル化ＲＮＡガイドを逆転写する工程は、逆転写用捕捉プライマーをその非ポリアデニル化ＲＮＡガイドの捕捉配列にハイブリダイズさせることを含み得る。さらに有利なことに、そのＲＮＡガイドの捕捉配列は、そのガイドの遺伝子編集機能に最小限にしか干渉しない領域に位置し得る。例えば、そのＲＮＡガイドは、変更された場合にそのガイドＲＮＡの活性に最小限にしか影響を与えない定常領域（例えば、ステムループ２または３’末端領域）を含み得る。そのステムループ２または３’領域に捕捉配列を含むＲＮＡガイドは、そのｃＤＮＡを配列決定するために３’配列ライブラリーが望ましいものであり得る場合に、有用である。
その非ポリアデニル化ＲＮＡガイド自体はまた、独特な分子識別子を含み得る。独特な分子識別子をそのＲＮＡガイドに含むことの利点は、その独特な分子識別子を含まない逆転写用捕捉プライマーがバーコード化されていないものであり得ることである。その後、そのｍＲＮＡ転写物を逆転写する工程は、例えば、オリゴｄＴ逆転写プライマーを使用して、そのｃＤＮＡを形成し、独特な分子識別子およびＰＩＰに独特なバーコードをそのｃＤＮＡに付加することを含み得る。対照的に、独特な分子識別子を有するＲＮＡガイドを逆転写する工程は、そのＰＩＰに独特なバーコードのみを付加してその独特な分子識別子は付加しない、逆転写用捕捉プライマーを含み得る。独特な分子識別子を含むＲＮＡガイドおよび非バーコード化逆転写プライマーは、そのＲＮＡガイドの５’末端に対する捕捉配列を含み得る。独特な分子識別子を含むＲＮＡガイドは、そのｃＤＮＡを配列決定するために５’配列ライブラリーが望ましいものである場合に、有用である。
本発明はまた、遺伝子発現プロファイリングのための方法を記載し、この方法は、複数の細胞とテンプレート粒子とを合わせる工程を含む。それらの細胞はＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼにより遺伝子改変されており、それらの細胞は、そのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと一緒になってその細胞のゲノムを改変した、そのＲＮＡガイドの非ポリアデニル化コピーを含む。有利なことに、その細胞はまた、そのガイドＲＮＡと関連するガイドバーコードを含む、ポリアデニル化ＲＮＡ分子を含む。それらのテンプレート粒子のうちの一つだけとそれらの細胞のうちの一つだけとを封入する複数の均一区画がほぼ即時に生成されて、予めテンプレート化された即時区画（ｐｒｅ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｉｎｓｔａｎｔ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）（ＰＩＰ）を形成する。核酸分子が、各ＰＩＰにおいてそれらの細胞から放出され、それらの核酸分子は、そのガイドバーコードを含むポリアデニル化ＲＮＡ分子およびＲＮＡ転写物を少なくとも含む。そのガイドバーコードを含むＲＮＡ分子およびＲＮＡ転写物の両方がポリアデニル化されているので、ＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズするポリＴ逆転写プライマーは、それらのＲＮＡ分子を逆転写するために使用され得る。
ｃＤＮＡを逆転写することの利点は、ｃＤＮＡが一般的にはＲＮＡよりも安定であり、配列決定のためにより容易に利用可能で処理されることである。この逆転写工程の後に、そのｃＤＮＡ分子は、例えば、重合反応によって増幅されて、アンプリコンを形成し得る。そのｃＤＮＡまたはアンプリコンはまた、配列決定されて、各ＲＮＡガイドと関連する配列読取り（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ）および各ＲＮＡ転写物と関連する配列読取り（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ）を生成し得る。例えば、その各ＲＮＡガイドと関連する配列読取りは、そのＲＮＡガイドを逆転写するために捕捉配列が使用される場合に、非ポリアデニル化ＲＮＡガイドに由来するｃＤＮＡを配列決定することに由来し得る。その各ＲＮＡガイドと関連する配列読取りは、そのＲＮＡガイドと関連するガイドバーコードを含むＲＮＡ分子に由来するｃＤＮＡを配列決定することに由来する配列読取りであり得る。
いったん配列決定されると、各ＲＮＡガイド配列読取りは、ＰＩＰに独特な同じバーコードを有する各ＲＮＡ転写物配列読取りと関連付けられ得る。その後、ＲＮＡ転写物の発現のあらゆる変化が、そのＲＮＡガイドと関連付けられ得る。結果として、そのＲＮＡガイドによってもたらされたそのゲノムに対する変化が、生じる遺伝子発現の実際の変化について評価され得る。結果として、本発明の方法は、遺伝子型変化から生じる表現型変化を評価することの複雑性およびコストを大きく減少させる遺伝子解析を提供する。
さらに、各ＲＮＡ分子は独特な分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ＵＭＩ）を含むので、発現される異なるＲＮＡ転写物の数が評価され得るだけなく、各ｍＲＮＡ転写物の量もまた評価され得る。この理由は、ＵＭＩが、それがタグ付けされた核酸分子と一緒になって各核酸分子を独特またはほぼ独特にする、一種のバーコードであるからである。これは例えば、逆転写によって、以前は同一であったどの２つの核酸分子も、そのＵＭＩと一緒になって同じ配列を有する可能性がないように、ＵＭＩを各核酸分子に付加することによって達成される。適切な数のＵＭＩを選択することによって、サンプル中のどの核酸分子も、そのＵＭＩと一緒になると、独特またはほぼ独特である。例えば、がんと関連する同一の１００コピーのｍＲＮＡ転写物が発現される場合、そのＵＭＩと一緒になった各コピーは独特にされる。数回の増幅の後では、今や独特な各コピーが複数回差次的に増幅され得、その結果、何千コピーものそのｍＲＮＡ転写物が配列決定のために利用可能である。いったん配列決定されると、完全に独特な配列のみをマッピングまたは（例えば、読取りを分類（ｃｏｌｌａｐｓｅ）することにより）計数することによって、発現された１００個のｍＲＮＡ転写物の元々の数が、識別され得る。
本発明の局面において、複数の細胞が、疾患（例えば、がん）と関連する別々の遺伝子改変に各々が関連する複数のガイドＲＮＡによって、改変され得る。各ガイドＲＮＡがその遺伝子改変と関連し、各ガイドＲＮＡはまたその改変から生じるＰＩＰ中の遺伝子転写物にも関連するので、各改変は、その遺伝子改変から生じる表現型変化について分析され得る。
任意のＲＮＡ誘導型プラットフォーム（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）を使用するＲＮＡ誘導型プラットフォーム）が、本発明で用いると有用であり得る。
本発明は、予めテンプレート化された即時区画（ｐｒｅ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｉｎｓｔａｎｔ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）（ＰＩＰ）へと一つずつではなくほぼ即時に細胞を区画化することに基づく。
本発明の方法は単一細胞群を同時に分離し得、それは、第一の流体においてテンプレート粒子群と単一細胞群とを合わせること、第二の流体をその第一の流体に添加すること、およびそれらの流体を撹拌して、それらのテンプレート粒子のうちの一つだけとそれらの単一細胞群のうちの一つだけとを含む複数の予めテンプレート化された即時区画（ｐｒｅ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｉｎｓｔａｎｔ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）を同時に生成することによる。同時にとほぼ即時にとは互換可能に使用され、それらは、数秒間以内、数分間以内、または数時間以内を含む。同時にまたはほぼ即時には、マイクロ流体装置によって想定される連続的は含まない。
その第一の流体とその第二の流体とは非混和性であり得る。例えば、その第一の流体は水相流体を含み得、かつ／またはその第二の流体は油を含み得る。その第一の流体は、例えば、緩衝液、塩、溶解酵素（例えば、プロテイナーゼｋ）および／または他の溶解試薬（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ＩＧＥＰＡＬ、もしくはそれらの組合せ）、核酸合成試薬（例えば、核酸増幅試薬もしくは逆転写ミックス）、あるいはそれらの組合せから選択される試薬を含み得る。その第二の流体は、フッ化炭素油、シリコーンオイル、もしくは炭化水素油、またはそれらの組合せを含み得る。流体を撹拌することは、ボルテックス処理すること、振盪すること、手で弾くこと（ｆｌｉｃｋ）、かき混ぜること（ｓｔｉｒ）、ピペット操作すること、または溶液を混合するための公知のあらゆる方法を含み得る。
各ＰＩＰにおいて核酸分子を細胞から放出させる工程は、そのＰＩＰ内に含まれる単一細胞群の各々を溶解することを含み得る。核酸分子またはタンパク質を単一細胞群から放出させることは、そのＰＩＰ内の単一細胞群の溶解を含み得る。溶解は、熱、浸透圧、溶解試薬（例えば、ＤＴＴ、βメルカプトエタノール）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）、酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）、またはそれらの組合せなどの、刺激によって誘導され得る。
テンプレート粒子は、ＰＩＰを形成するために有用であり得る、あらゆる既知の粒子を含み得る。そのテンプレート粒子は、ヒドロゲル（例えば、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、アクリレート、アクリルアミド／ビスアクリルアミドコポリマーマトリックス、アジド修飾ＰＥＧ、ポリリジン、ポリエチレンイミン、およびそれらの組合せを含む、ヒドロゲル）であり得る。特定の場合、テンプレート粒子は、その単一細胞群に対する増加した親和性を提供する形状であり得る。例えば、そのテンプレート粒子はほぼ球状の形状であり得るが、その形状は、単一細胞を含むＰＩＰをテンプレート合成する確率をそのテンプレート粒子の形状が増加させるように、単一細胞との会合を促進する特徴（例えば、平坦な表面、クレーター状のもの、溝、突出、および他の凹凸）をその球状の形状に含み得る。
本発明のシングルセル解析のためのチューブは、細胞が分離される必要があるサンプルの体積に基づき、かつ／または分離されるべき細胞の数に基づいて、選択され得る。例えば、そのチューブは、コニカル遠心管（例えば、商標名ＦＡＬＣＯＮでＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによっては販売されているもの）などの単一の大きなチューブ、例えば、体積が４０ｍＬ未満のチューブであり得る。そのチューブはまた、ウェル（例えば、標準的な９６サンプルウェルキット）であり得る。そのチューブはまた、遠心管，微量遠心管、またはＰＣＲチューブ（例えば、商標名ＥＰＰＥＮＤＯＲＦでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙによって販売されているもの）であり得る。そのようなチューブは、例えば、０．１ｍＬと６ｍＬとの間であり得る。
テンプレート粒子群のうちの一つだけと細胞群のうちの一つだけとを封入する複数の均一区画をチューブにおいてほぼ即時に生成する工程はまた、それらのテンプレート粒子のうちの一つだけを封入し細胞は封入しない複数の区画を生成することを含み得る。例えば、１００，０００個のテンプレート粒子が第一の流体において１０，０００個の単一細胞群と合わされる場合、区画を生成することは、単一のテンプレート粒子を封入するが細胞は封入しない、約９０，０００個の区画を生じ得ると予測される。さらに、よりまれな場合、２個のテンプレート粒子が単一の区画によって封入され得、または２個の細胞が単一の区画に封入され得る。
図１は、本発明の方法の局面を示す。 図２は、本発明の方法の局面を示す。 図３は、逆転写後のｃＤＮＡ画分のグラフを示す。
（詳細な説明）
本発明は、ＲＮＡ誘導型ゲノム改変を経験した細胞を、予めテンプレート化された即時区画（ｐｒｅ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｉｎｓｔａｎｔ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）（ＰＩＰ）へとほぼ即時に分離するための方法、およびそのＰＩＰを使用して、そのガイドＲＮＡと、そのゲノム改変から生じた遺伝子発現レベル変化とを関連付けるための方法を提供する。
本発明は、ＲＮＡガイドを逆転写して、ＵＭＩおよびＰＩＰに独特なバーコードでタグ付けされているＲＮＡガイドから、ｃＤＮＡ分子を生成するための方法を提供する。そのＰＩＰに由来し、したがって単一細胞に由来するｍＲＮＡ転写物もまた、ＵＭＩおよびＰＩＰに独特なバーコードでタグ付けされている。その後、そのｃＤＮＡは増幅されてアンプリコンを生成し得、例えば配列決定によって分析され得る。ＲＮＡガイドによって改変された細胞を分析するための方法は、Ｄｉｘｉｔ、２０１６、Ｃｅｌｌ、１６８７：１８５３～１８６６、およびＲｅｐｌｏｇｌｅ、２０２０、Ｎａｔｕｒｅ、３８：９５４～９６１に記載されており、これらの各々の全体が参照によって本明細書に援用される。
図１は本発明の方法を一般的に示す。方法（１０１）は、ＲＮＡ誘導型編集プラットフォームによって改変された、ＲＮＡガイドを発現する細胞を取得する工程（１０５）を含む。それらの細胞は、チューブにおいてテンプレート粒子と混合（１０９）され区画化（１１３）されて、それらの細胞（１０５）のうちの１つと１つのテンプレート粒子とを封入する複数の区画を生成する。そのＲＮＡガイドのＲＮＡ識別子が、ポリアデニル化ｍＲＮＡ転写物の逆転写（１１７）と並列してｃＤＮＡへと逆転写される（１２１）。
図２は本発明の詳細な方法を示す。方法（２０１）は、細胞とテンプレートとを、捕捉配列を含むＲＮＡガイドの逆転写用捕捉プライマーおよびｍＲＮＡ転写物の逆転写用プライマー（例えば、オリゴｄＴ）と、捕捉プライマー対オリゴｄＴの比が１：２０で一緒に封入する工程（２０５）を含む。逆転写が開始されて、ＲＮＡガイドに由来するｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡが生成され、全ゲノム増幅によって増幅され（２０９）、細胞の区画化（２０５）、逆転写および増幅が１日で生じる。その後、２日目に、そのｃＤＮＡが例えば遠心分離によって精製され（２１３）、上清中の最も小さいフラグメントはＲＮＡガイドから生成されたｃＤＮＡを示し（２１７）、その沈殿物は、ＲＮＡ転写物から生成されたｃＤＮＡを含む（２２１）。３日目中に、ＲＮＡガイドに由来するｃＤＮＡ（２２５）とＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡとが、並列して富化される（２２９）。ＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡは、配列決定ライブラリー調製のために調製され（２３７）、ＲＮＡガイドに由来するｃＤＮＡは、そのライブラリー調製されたｍＲＮＡとともに１：２０の比で再プールされ（２３３）、そのｃＤＮＡは配列決定される（２４１）。
（遺伝子発現プロファイリングおよび遺伝性疾患）
遺伝子発現プロファイリングは、遺伝子の実際の発現の測定である。遺伝子発現プロファイリングは、発現されるｍＲＮＡの同定、および対応する遺伝子の活性を測定するための細胞中のそのｍＲＮＡの測定を含む。ゲノムを配列決定することは、その細胞がもしかすると行い得ることに関する情報を提供するが、その発現プロファイルは、その細胞がある時点で実際に行っていることに関する情報を提供する。
いつでも、ほぼ各々の細胞が、その細胞が保有する遺伝子の一部だけからｍＲＮＡを生成する。ｍＲＮＡを生成するために遺伝子が使用される場合、その遺伝子は一般的に「オン」の状態であり、そうでなければ「オフ」の状態であると考えられる。例えば、細胞は、ある遺伝子において「オン」のスイッチを生じると考えられるＲＮＡガイド、ある遺伝子において「オフ」のスイッチを生じると考えられるＲＮＡガイド、およびその遺伝子において何の変化を生じないと考えられるＲＮＡガイドによって、改変され得る。その遺伝子発現プロファイルは、それらのガイドＲＮＡによって生じたＤＮＡ中の変化がその細胞におけるｍＲＮＡ発現の表現型変化を実際に生じることに関する情報を提供する。遺伝子発現プロファイリングはまた、ＲＮＡガイドの編集能力に関する情報も提供し得る。例えば、同じ「オン」のスイッチを標的とする複数のＲＮＡガイドが並列して分析された場合、その種々の遺伝子発現変化レベルが、そのガイドの活性を分析するために使用され得る。
遺伝子発現プロファイリングは、種々の疾患状態を有する遺伝性疾患（例えば、がん、神経変性疾患、精神神経疾患、代謝障害、および心血管障害）を分析するために有用である。代謝障害としては、２型糖尿病および肥満が挙げられ得る。心血管障害としては、アテローム性動脈硬化症および高血圧が挙げられ得る。神経障害としては、アルツハイマー病またはパーキンソン病が挙げられ得る。がんとしては、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、乳がん、前立腺がん、黒色腫、卵巣がん、肉腫、口腔癌、または肝細胞癌が挙げられ得る。
さらに、遺伝子発現プロファイリングは、治療介入（例えば、低分子医薬品）の作用機構を同定するために有用であり得る。
（ＲＮＡ誘導型遺伝子編集）
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド遺伝子（例えば、ゲノムＤＮＡ）内のホスホジエステル結合を切断する酵素である。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを比較的に非特異的に切断し得るか、または非常に特定のヌクレオチド配列で切断し得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ上のある位置を標的とするためにＲＮＡガイドを使用する、エンドヌクレアーゼである。このようにして、本明細書において互換可能に使用されるＲＮＡガイドまたはガイドＲＮＡは、標的配列特異性をＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに付与する。
Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９）は、ＤＮＡウイルスに対する特定の細菌の免疫学的防御において役割を果たすＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、二重ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼである遺伝子編集ツールである。Ｃａｓ９は一般的には、ＲＮＡガイド上の２０塩基対スペーサー領域と相補的な部位を調べることによって、ＤＮＡを調べる。そのＤＮＡがガイドＲＮＡと相補的である場合、Ｃａｓ９はそのＤＮＡを切断する。有利なことに、Ｃａｓ９は、そのガイドＲＮＡと相補的な、ほぼどの配列も切断し得る。Ｃａｓ９は、二重ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ エンドヌクレアーゼであると考えられる。その理由は、ネイティブＣａｓ９は、会合する２種のＲＮＡであるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とから構成される、ガイドＲＮＡを必要とするからである。Ｃａｓ９標的化は、そのｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを合わせて単一のＲＮＡ分子にするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用することによって、しばしば簡単にされる。
本発明の方法で用いると有用なＲＮＡガイドは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡスペーサー、およびｓｇＲＮＡを含み得る。
代表的には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的化特異性は、そのＲＮＡガイドの５’末端にある２０塩基対配列によって決定される。望ましい標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフの前に存在しなければならない。そのプロトスペーサー隣接モチーフは、改変の標的とされるＤＮＡ領域の代表的には３～４ヌクレオチド下流にある、代表的には２～６塩基対長の短いＤＮＡ配列である。そのＲＮＡガイドと標的との塩基対形成後に、Ｃａｓ９は、そのプロトスペーサー隣接モチーフの約３塩基対上流で二本鎖切断を媒介する。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、その二本鎖修復経路に依存して、遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックインを導入し得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはまた、レポーター遺伝子をノックアウトすることによって遺伝子または遺伝子転写物の発現をアップレギュレートし得、あるいは遺伝子のプロモーターをノックアウトすることによってその遺伝子または遺伝子転写物の発現をダウンレギュレートし得る。
（バーコードおよび独特な分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ））
各ＰＩＰに特異的なバーコードは、群内の他のバーコードから識別可能な任意のヌクレオチド群またはオリゴヌクレオチド配列群であり得る。テンプレート粒子と単一細胞とを封入するＰＩＰは、その単一細胞から放出された各核酸分子に、そのバーコード群に由来する同じバーコードを提供する。各ＰＩＰにより提供されるバーコードは、そのＰＩＰに独特であり、そのバーコードは、他のどのＰＩＰによって核酸分子に提供されるバーコードからも識別可能である。いったん配列決定されると、そのバーコード配列を使用することによって、その核酸分子はそのＰＩＰへと遡られ得、それにより、各単一細胞へと遡られ得る。バーコードは、そのバーコードを他のバーコードから識別するために十分である適切な任意の長さであり得る。例えば、バーコードは、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、またはそれ以上を有し得る。
各ＰＩＰに独特なバーコードは、無作為に予め規定され得、縮重し得、かつ／または選択され得る。バーコードは、核酸分子にそのバーコードを「タグ付け」することによって、その核酸分子に付加され得る。タグ付けは、バーコード付加のための任意の既知方法（例えば、各核酸分子の末端のうちの１つまたは複数へのバーコードの直接連結）を使用して実施され得る。核酸分子は、例えば、そのバーコードの直接連結または平滑末端連結を可能にするために末端修復され得る、バーコードはまた、例えば、捕捉プローブまたは捕捉プライマーを使用して、第一鎖合成または第二鎖合成を通じて核酸分子に付加され得る。
独特な分子識別子はある種のバーコードであり、このバーコードは、サンプル中の核酸分子に提供されて、そのバーコードと一緒になった各核酸分子を独特またはほぼ独特にし得る。これは、例えば、以前は同一であったどの２つの核酸分子も、そのＵＭＩと一緒になって同じ配列を有する可能性がないように、１個または複数個のＵＭＩを各核酸分子に（例えば連結によって）付加することによって、達成される。適切な数のＵＭＩを選択することによって、サンプル中のどの核酸分子も、そのＵＭＩと一緒になると、独特またはほぼ独特である。それを行うための戦略の一つは、核酸分子サンプルに、そのサンプル中の出発核酸分子の数よりも過剰な数のＵＭＩを提供することである。それを行うことによって、各出発核酸分子は異なるＵＭＩを備え、それにより、そのＵＭＩと一緒になった各分子は独特になる。しかし、提供されるＵＭＩの数は、元のサンプル中の同一の核酸分子の数と同程度に少ないものであり得る。例えば、サンプル中の６個以下の核酸分子が同一である可能性がある場合、出発核酸分子の数に関わらず、６個程度の少ない異なるＵＭＩが提供され得る。
ＵＭＩはまた、それらが増幅中に生成される誤り（例えば、増幅バイアスまたは増幅中の不正確な塩基対形成）を訂正するために有用であり得るという点で、有利である。例えば、ＵＭＩを使用する場合、そのＵＭＩまたはＵＭＩ群と一緒になったサンプル中のどの核酸分子も独特またはほぼ独特であるので、増幅および配列決定の後で，同一の配列を有する分子は同じ出発核酸分子を参照すると考えられ得、それによって増幅バイアスを減少させ得る。ＵＭＩを使用する誤り訂正のための方法は、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、２０１６、「Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ＲＮＡ」、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎに記載されており、その内容は参照により本明細書に援用される。
（テンプレート粒子）
本開示のテンプレート粒子は、当該分野において公知の任意の方法を使用して調製され得る。一般に、そのテンプレート粒子は、ヒドロゲル物質、例えば、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、アクリレート、アクリルアミド／ビスアクリルアミドコポリマーマトリックス、およびそれらの組合せを合わせることによって、調製される。テンプレート粒子の形成後に、それらのテンプレート粒子は、細胞を捕捉し独特にタグ付けするために望ましい直径へとサイズ決定される。例えば、そのテンプレート粒子のサイズ決定は、非混和性油相中へのマイクロ流体並行流によって行われ得る。
テンプレート粒子はサイズが変化し得る。変動は限定され得、例えば、そのテンプレート粒子の直径または最大寸法は、そのテンプレート粒子のうちの少なくとも５０％以上、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上が、直径または最大寸法を１０倍未満、例えば、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満、１．４倍未満、１．３倍未満、１．２倍未満、１．１倍未満、１．０５倍未満、または１．０１倍未満変化させるようであり得る。
有利なことに、本開示のテンプレート粒子の吸収性は、シングルセル解析のために本開示の方法でそれらのテンプレート粒子を使用する前に、一般的にはその体積を収縮することを意図して、脱水状態でそれらを保管することによって増加され得る。有利なことに、テンプレート粒子を収縮することは、細胞を捕捉するためおよび放出された核酸分子の（例えば、各ＰＩＰに独特なバーコードによる）バーコード化のためのそのテンプレート粒子の形状およびサイズの制御を可能にする。例えば、そのテンプレート粒子の脱水は、収縮を促進ための高浸透圧緩衝液（すなわち、ポリエチレングリコール）中にそのテンプレート粒子を保管することによって、達成され得る。あるいは、そのテンプレート粒子は、エタノール脱水され得る。収縮は、外部刺激（例えば、熱）の適用によって生じ得る。例えば、そのテンプレート粒子は、剪断し、その後、熱を適用し、そのテンプレート粒子のサイズ収縮を引き起こすことによって、流体中に封入され得る。乾燥アプローチの他の一部の例としては、加熱、減圧下での乾燥、凍結乾燥、および超臨界乾燥が挙げられるが、それらに限定はされない。その乾燥したテンプレート粒子もまた、流体と合わせられ得るが、その形状および構造を独立した（しばしば球状の）ゲル粒子として依然として維持する。その乾燥したテンプレート粒子は適切な流体と組み合わせられ得、その流体の一部がそのテンプレート粒子によって吸収されることを引き起こし得る。そのテンプレート粒子の多孔度もまた変化し得、適切な流体と組み合わせられた場合に複数の細胞のうちの少なくとも１個がそのテンプレート粒子の吸収されることを可能にし得る。そのテンプレート粒子において望ましい吸収が実際されることを可能にする都合の良い任意の流体が、本発明の方法のために有用であり得る。
テンプレート粒子は、有利には、小さくほぼ球状の粒子である。テンプレート粒子は、多孔性であっても、無孔性であってもよい。テンプレート粒子はまた、追加の成分および／もしくは試薬（例えば、ＰＩＰ中に放出可能であり得る追加の成分および／もしくは試薬）を有利に含み得る、微小区画または内部区画を含み得る。
テンプレート粒子としては、ポリマー、例えば、ヒドロゲルが挙げられ得る。テンプレート粒子は一般的には、直径または最大寸法が約０．１μｍ～約１０００μｍの範囲である。テンプレート粒子は、約１．０μｍ～１０００μｍ（両端を含む）（例えば、１．０μｍ～７５０μｍ、１．０μｍ～５００μｍ、１．０μｍ～２５０μｍ、１．０μｍ～２００μｍ、１．０μｍ～１５０μｍ、１．０μｍ～１００μｍ、１．０μｍ～１０μｍ、または１．０μｍ～５μｍ（両端を含む））の直径もしくは最大寸法を有し得る。テンプレート粒子は、約１０μｍ～約２００μｍ、例えば、約１０μｍ～約１５０μｍ、約１０μｍ～約１２５μｍ、または約１０μｍ～約１００μｍの直径もしくは最大寸法を有し得る。
本発明により分析される細胞としては、例えば、患者のサンプル（体液の組織）から取得された生細胞が挙げられ得る。そのサンプルとしては、患者から得られた、穿刺吸引物、生検、または体液が挙げられ得る。そのサンプルから分離されると、その細胞は、例えば、適切な溶液で単一細胞懸濁物を生成することによって、処理され得る。そのような溶液は、一般的には、緩衝化塩溶液、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ（ハンクス緩衝塩溶液）などであり、特定の場合にはウシ胎児血清または他の天然に存在する因子を補充されており、低濃度（一般的には５ｍＭ～２５ｍＭ）の受容可能な緩衝液と組み合わせられている。都合の良い緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。その分離された細胞は、通常は収集チューブの底に血清のクッションを備えている、その細胞の生存性を維持する適切な任意の培地中に収集され得る。種々の培地が市販されており、その細胞の性質にしたがって有用であり得、それらの培地としては、ｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ＤＰＢＳ、ＲＰＭＩ、ＩＭＤＭ（イスコフ培地）などが挙げられ、ウシ胎児血清がしばしば補充される。好ましくは、その細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。
そのテンプレート粒子の組成および性質は、実行されるシングルセル解析に依存して変化し得る。例えば、そのテンプレート粒子は、ミクロンスケールのマトリックスの球であるミクロゲル粒子であり得る。そのミクロゲルは、水に可溶性である親水性ポリマー（アルギン酸塩またはアガロースが挙げられる）から構成される。ミクロゲルはまた、親油性ミクロゲルから構成され得る。
テンプレート粒子はまた、ヒドロゲル（例えば、天然由来物質に由来するヒドロゲル、合成由来物質由来のヒドロゲル、およびそれらの組合せ）であり得る。ヒドロゲルの例としては、コラーゲン、ヒアルロナン、キトサン、フィブリン、ゼラチン、アルギン酸塩、アガロース、コンドロイチン硫酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アクリルアミド／ビスアクリルアミドコポリマーマトリックス、ポリアクリルアミド／ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、およびポリ無水物、ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）が挙げられるが、それらに限定はされない。
テンプレート粒子は、さらに有利には、そのテンプレート粒子に正の表面電荷または増加した正の表面電荷を提供する、物質を含み得る。そのような物質は、ポリリジンもしくはポリエチレンイミン、またはそれらの組合せであり得るが、それらに限定はされない。これは、そのテンプレート粒子と、例えば、大部分が負に荷電した膜を一般的に有する細胞との間で、会合の機会を増加し得る。
テンプレート粒子－細胞間の会合の機会を増加すること目的とする他の戦略としては、特定のテンプレート粒子形状の生成が挙げられる。例えば、そのテンプレート粒子は、ほぼ球状の形状を有し得るが、その形状は、平坦な表面、クレーター状のもの、溝、突出、および他の凹凸などの特徴をその球状の形状に含み得る。
上記の戦略および方法のうちのいずれか１つまたはそれらの組合せは、本開示のテンプレート粒子およびそのシングルセル解析のための方法の実施において、有用であり得る。テンプレート粒子の生成のための方法、およびテンプレート粒子ベースの封入のための方法は、国際特許公開公報ＷＯ２０１９／１３９６５０に記載された。この国際特許公開公報は参照により本明細書に援用される。
１個のテンプレート粒子と１個の単一細胞とを含む区画を生成する機会を増加するために、そのテンプレート粒子と細胞とは、テンプレート粒子の方が細胞よりも多く存在する比で合わせられ得る。例えば、上記の混合物において合わせられるテンプレート粒子と細胞との比は、それぞれ５：１～１，０００：１の範囲にあり得る。そのテンプレート粒子と細胞とはまた、それぞれ１０：１、１００：１、または１０００：１の比で合わせられ得る。
単分散エマルションを生成するために、テンプレート粒子と細胞とを含む第一の混合物を、その第一の混合物と非混和性である第二の流体と合わせることによって提供される第二の混合物を剪断する工程。適切な任意の方法が、その第二の混合物に十分な剪断力を適用し得る。例えば、その第二の混合物は、その第二の混合物をピペットチップに流すことによって、剪断され得る。他の方法としては、ホモジナイザー（例えば、ボルテックス処理機）によってその第二の混合物を振盪すること、またはビーズビーター（ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ）でその第二の混合物を振盪することが挙げられるが、それらに限定はされない。ボルテックス処理は、例えば、３０秒間、または３０秒間～５分間の範囲で、実施され得る。十分な剪断力の適用は、その第二の混合物を破壊して、複数のテンプレート粒子のうちの１個を封入する区画にする。
テンプレート粒子ベースの区画を生成することは、２つの液相を剪断することを含み得る。例えば、その混合物は水相であり得、例えば、緩衝液、塩、溶解酵素（例えば、プロテイナーゼｋ）および／または他の溶解試薬（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ＩＧＥＰＡＬ、ｂｍ １３５、もしくはそれらの組合せ）、核酸合成試薬（例えば、核酸増幅試薬）、あるいはそれらの組合せから選択される試薬を含み得る。その流体は連続相であり得、フッ化炭素油、シリコーンオイル、もしくは炭化水素油、またはそれらの組合せなどの非混和性油であり得る。その流体は、界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレートおよび／またはオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、還元剤（例えば、ＤＴＴ、βメルカプトエタノール、またはそれらの組合せ）などの試薬を有利に含み得る。
本明細書に記載される方法を実施する際に、その区画（例えば、シングルエマルション区画および多重エマルション区画）の組成および性質は、変化し得る。有利なことに、界面活性剤は、それらの区画を安定化するために有用であり得る。本明細書に記載されるＰＩＰは、エマルションとして、例えば、非混和相キャリア流体（例えば、フッ化炭素油、シリコーンオイル、もしくは炭化水素油）中に分散した水相流体、またはその逆として、調製され得る。したがって、区画は、界面活性剤で安定化されたエマルション、例えば、界面活性剤で安定化されたシングルエマルションまたは界面活性剤で安定化された二重エマルションを含み得る。望ましい反応がその区画において実施されることを可能にする都合の良い任意の界面活性剤が、有用であり得る。他の局面において、ＰＩＰは、界面活性剤によって安定化されない。
本発明において有用なテンプレート粒子は、細胞捕捉部分をさらに含み得る。その細胞捕捉部分は、特定の細胞、例えば、特定の型の細胞を捕捉するように作用する。その捕捉部分は、ビオチン末端を備えるアクリレート末端化炭化水素リンカーを含み得る。その捕捉部分は、標的特異的捕捉エレメント（例えば、アプタマーおよび／または抗体）に付着され得る。捕捉部分およびその方法の例は、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３４２６に開示されている。
（逆転写、増幅、および配列決定）
本発明の方法は、目的のゲノム領域（例えば癌遺伝子）においてＲＮＡガイドによって改変された単一細胞群に由来する遺伝子転写物の分析および配列決定に一般的には関連する。単一細胞群により放出される核酸分子に由来する生成物のＰＣＲ増幅は、予め選択された遺伝子変異（例えば、がんと関連する変異）についての細胞の遺伝子発現プロファイルを決定するために有用であり得る。例えば、目的の遺伝子または変異の同定は、その核酸分子が放出された細胞が、そのＲＮＡガイドから生じるゲノム改変の結果としてがんと関連する遺伝子転写物を発現しているという情報を提供し得る。各核酸分子は、その核酸分子が放出されたＰＩＰと単一細胞とに独特なバーコードでタグ付けされているので、どの遺伝子転写物もそのＰＩＰおよび単一細胞へと遡られ得、それにより、ＲＮＡガイドおよびそのＲＮＡガイドにより引き起こされた遺伝子型改変の同定を可能にし得る。
ＲＮＡ配列決定またはｍＲＮＡ配列決定のために、配列決定はまず、バーコード化されたＲＮＡから、例えば逆転写によってｃＤＮＡライブラリーを調製し、そのｃＤＮＡを配列決定する工程を含み得る。ｃＤＮＡ配列決定は、その単一細胞内の遺伝子発現の定量化を有利に可能にし得、その単一細胞の特徴を同定して、例えば、診断を行うため、予後判定を行うため、または薬物の有効性を決定するために、有用であり得る。ＲＮＡからのｃＤＮＡ分子の逆転写は、そのＰＩＰ内でか、またはバーコード化されたＲＮＡ分子が各ＰＩＰから放出された後でかの両方で、実施され得る。
逆転写は、限定はされないが、ｄＮＴＰ（ヌクレオチドｄＡＴＰとヌクレオチドｄＣＴＰとヌクレオチドｄＧＴＰとヌクレオチドｄＴＴＰとの混合物）と、必要に応じて緩衝液、界面活性剤、または溶媒と、ポリメラーゼまたは逆転写酵素などの適切な酵素とを使用して、実施され得る。使用されるポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼであり得、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって提供される）、またはＱ５ポリメラーゼから選択され得る。核酸増幅試薬は市販されており、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡから購入され得る。本開示の標的化ライブラリー調製方法において使用される逆転写酵素は、例えば、ｍａｘｉｍａ逆転写酵素であり得る。一部の実施形態において、その逆転写反応の一般的なパラメータは、２５℃にて約１５分間のインキュベーション、その後、５２℃にて約９０分間のインキュベーションを含む。
逆転写は、遊離３’ポリＴ領域を有するオリゴによって実施され得る。そのｃＤＮＡ捕捉オリゴの３’部分は、遺伝子特異的配列または遺伝子特異的オリゴマー（例えば、捕捉配列を含むＲＮＡガイドを逆転写するための捕捉プライマー）を含み得る。そのオリゴマーは、ランダムオリゴマーまたは「準無作為（ｎｏｔ－ｓｏ－ｒａｎｄｏｍ）」（ＮＳＲ）オリゴマー（ＮＳＲＯ）（例えば、ランダムヘキサマーもしくはＮＳＲヘキサマー）であり得る。そのオリゴは、増幅工程またはＮＧＳ配列決定アダプターの配列において使用されるＰＣＲプライマーと同族であるプライマー結合配列などの、１個もしくは複数個のハンドル（ｈａｎｄｌｅ）を含み得る。その逆転写プライマーはテンプレートスイッチングオリゴ（ＴＳＯ）を含み得、そのテンプレートスイッチングオリゴ（ＴＳＯ）は、逆転写中に付加されるポリＣセグメントにハイブリダイズしてそのポリＣセグメントを捕捉する、ポリＧ配列を含み得る。
非ポリアデニル化ＲＮＡの逆転写は、捕捉配列と、捕捉プライマーまたは捕捉プローブとの使用を含み得る。プライマー配列は、結合部位（例えば、細胞から放出されたいずれかの核酸分子に相補的配列が存在する場合にその相補的配列にハイブリダイズして反応開始部位を提供すると予期される、プライマー配列）を含み得る。そのプライマー配列はまた、「ユニバーサル」プライマー配列（すなわち、特定の核酸フラグメントセットに非常に一般的なヌクレオチド配列に相補的な配列）であり得る。プライマー配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって提供される、Ｐ５プライマーおよびＰ７プライマーであり得る。そのプライマー配列はまた、捕捉プローブが固体支持体（例えば、テンプレート粒子）に結合することを可能にし得る。
逆転写はまた、ＰＩＰに独特なバーコード、もしくはＵＭＩ、またはそれらの両方を、ｃＤＮＡに付加するために有用であり得る。このプロセスは、逆転写プライマーをプローブにハイブリダイズさせること、およびその後、逆転写反応を行うことを含み得る。核酸の相補体は、整列された場合に完全である必要はなく、安定な二重鎖はミスマッチ塩基対または不適合（ｕｎｍａｔｃｈｅｄ）塩基を含み得る。核酸技術の当業者は、多数の変数（例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチド中のシトシン塩基およびグアニン塩基の濃度パーセント、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の頻度が挙げられる）を経験的に考慮して、二重鎖の安定性を決定し得る。
核酸分子は、有利には、配列決定前に増幅され得る。増幅は、熱サイクリングを使用して反応物質を加熱と冷却との反復サイクルに曝露し、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による）種々の温度依存性反応を可能にすることによって、核酸コピーを生成するための方法を含み得る。当該分野で公知の適切な任意のＰＣＲ方法が、本明細書に記載される方法と組み合わせて使用され得る。ＰＣＲ反応の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、定量ＰＣＲ、またはタッチダウンＰＣＲが挙げられる。特に、核酸分子の増幅されたコピー各々は、その核酸分子が放出されたＰＩＰと細胞とを同定するためのＰＩＰに独特なバーコードと、ＵＭＩとを含む。増幅のための方法としては、全ゲノム増幅が挙げられ得る。
核酸分子を配列決定することは、当該分野で公知の方法によって実施され得る。例えば、一般に、Ｑｕａｉｌら、２０１２、Ａ ｔａｌｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：３４１を参照のこと。核酸分子配列決定技術は、標識ターミネーターまたは標識プライマーと、スラブ中もしくはキャピラリー中でのゲル分離とを使用する古典的ジデオキシ配列決定反応（サンガー法）、または好ましくは次世代シーケンシング法を含む。例えば、配列決定は、参照により各々が援用される、米国特許出願公開第２０１１／０００９２７８号、米国特許出願公開第２００７／０１１４３６２号、米国特許出願公開第２００６／００２４６８１号、米国特許出願公開第２００６／０２９２６１１号、米国特許第７，９６０，１２０号、米国特許第７，８３５，８７１号、米国特許第７，２３２，６５６号、米国特許第７，５９８，０３５号、米国特許第６，３０６，５９７号、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，８２８，１００号、米国特許第６，８３３，２４６号、および米国特許第６，９１１，３４５号に記載される技術にしたがって実施され得る。
配列決定データを処理するための従来の経路は、次世代シーケンシングプラットフォームから配列決定された読取りを含むＦＡＳＴＱフォーマットファイルを生成する工程、これらの読取りを注釈付き参照ゲノムと整列する工程、および遺伝子発現を定量化する工程を含む。これらの工程は、既知のコンピュータアルゴリズムを使用して慣用的に実施され、これが本発明の工程を実行するために使用され得ると当業者は認識する。例えば、参照により援用される、Ｋｕｋｕｒｂａ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ、２０１５（１１）：９５１～９６９を参照のこと。
（ＰＩＰを生成するためのチューブ）
上記のとおり、チューブは、細胞が分離される必要があるサンプルの体積に基づき、かつ／または分離されるべき細胞の数に基づいて、選択され得る。例えば、そのチューブは、コニカル遠心管（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによっては販売されているＦａｌｃｏｎ（登録商標））などの単一の大きなチューブ、例えば、体積が４０ｍＬ未満のチューブであり得る。そのようなチューブは、分析されるべき細胞の数が１００，０００個の細胞と１００万個の細胞との間、または１００万個よりも多くの細胞である場合に、有利であり得る。この方法は、不均一な細胞型の標的化範囲について細胞を分析し、複雑な組織において（例えば、混合細胞集団におけるがん検出において）経路を探索する場合に、有用である。
そのチューブはまた、ウェル（例えば、標準的な９６サンプルウェルキット）であり得る。そのウェルは、各々がチューブを使用した複数のウェルを備えた、マイクロプレートの部分であり得る。そのマイクロプレートは、望まれるとおりの任意の数のウェル（６個～１５３６個のウェル）を含み得る。有利なことに、そのマイクロプレートは、９６個のウェルを含み得る。ウェルは、分析されるべき細胞の数が約１００個の細胞である場合に、有利であり得る。この方法は、種々の条件下で不均一な細胞をディーププロファイリング（ｄｅｅｐ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（例えば、腫瘍部位における早期がん検出）する場合に、有用である。
そのチューブはまた、遠心管、微量遠心管、またはＰＣＲチューブ（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙによって販売されているもの）であり得る。そのようなチューブは、例えば、０．１ｍＬと６ｍＬとの間であり得、分析されるべき細胞の数が約１０，０００個の細胞である場合に、有利である。この方法は、（例えば、混合細胞集団における早期がん検出において）不均一な細胞集団をディーププロファイリング（ｄｅｅｐ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）する場合に、有用である。
上記のとおり、細胞がＰＩＰ中に同時に封入されるので、本発明の方法は、任意の数の細胞の分析のために容易に規模調整される。例えば、チューブは、少なくとも１００万個の細胞，少なくとも２百万個の細胞、少なくとも１千万個、少なくとも１億個よりも多くの細胞、または２億個以上の細胞を分析するために選択され得る。さらに、細胞が同時に封入されるので、任意のチューブおよび任意の数の細胞について、配列決定のための調製が１日以内に完了し得、３時間以内に完了し得る。さらに、各チューブ内でのサンプルの調製は、約５分間または約２分間程度の短時間で完了し得る。
プライマーおよび／または試薬は、チューブにおけるＰＩＰの形成後に、そのＰＩＰに添加され得る。プライマーおよび／または試薬は、１工程で、または１つよりも多くの工程で、添加され得る。例えば、プライマーは、２つ以上の工程、３つ以上の工程、４つ以上の工程、または５つ以上の工程で添加され得る。プライマーが１つの工程で添加されるかまたは１つよりも多くの工程で添加されるかには関わりなく、それらのプライマーは、溶解剤の添加後か、溶解剤の添加前か、または溶解剤の添加と同時に、添加され得る。溶解剤の添加の前または後に添加される場合は、ＰＣＲプライマーは、溶解剤の添加とは別の工程で添加され得る。
（参照による援用）
特許、特許出願、特許公開公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文献の参照および引用が、本開示の全体を通じて行われた。そのような文献はすべて、実質的にその全体が参照によって本明細書により本明細書中に援用される。
（等価物）
本明細書において示され記載されているものに加えて、本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態が、本明細書において引用された科学文献および特許文献の参照を含む本明細書の全内容から当業者には明らかになる。本明細書における主題は、その種々の実施形態およびその等価物において本発明の実施に適合され得る重要な情報、例示および指針を含む。
（実施例）
（実施例１）
ＲＮＡ誘導型発現系により改変されてそのＲＮＡガイドのポリアデニル化コピーを発現する細胞を、テンプレート粒子と混合し、非ポリアデニル化ＲＮＡガイドの捕捉用プライマーおよびポリアデニル化ＲＮＡの逆転写用プライマーと一緒にほぼ即時に封入する。非ポリアデニル化ＲＮＡガイドは、そのガイド内に組み込まれた捕捉配列：５’－ＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＡＡＧＴＣＡＴＡＡＧＧＣＧＴＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＣＡＣＴＣ－３’を含む。ＲＮＡガイド用の捕捉プライマーとポリＴ逆転写プライマーとを、捕捉プライマー対ポリＴの比が１：２０の比で合わせ、それらをまた、ＰＩＰ形成中にそのＰＩＰに封入する。その後、各ＰＩＰ中のＲＮＡを逆転写し、全ゲノム増幅により増幅する。
細胞の区画化、逆転写、および増幅が１日で生じる。その後、２日目中に、そのｃＤＮＡを、ビーズ精製（ｃｌｅａｎｕｐ）を使用して精製する。その上清中の最も小さいフラグメントは、ＲＮＡガイドから生成されたｃＤＮＡを示し、その沈殿物は、ＲＮＡ転写物から生成されたｃＤＮＡを含む。３日目中に、ＲＮＡガイドに由来するｃＤＮＡとＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡとを、並列して富化する。
図３は精製（ｃｌｅａｎｕｐ）後のＰＩＰに由来するｃＤＮＡ画分のグラフを示し、より小さいＲＮＡガイドと関連するｃＤＮＡが、下側のピークによってサンプル中に示されており、より大きいＲＮＡ転写物と関連するｃＤＮＡが、大きい側のピークとしてサンプル中に示されている。

Claims (20)

  1. 遺伝子発現プロファイリングのための方法であって、
    複数の細胞とテンプレート粒子とを合わせる工程であって、細胞はＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼにより遺伝子改変されており、該細胞は、捕捉配列をさらに含む該ＲＮＡガイドのコピーを含む、工程；
    該テンプレート粒子のうちの一つだけと該細胞のうちの一つだけとを封入する複数の均一区画をほぼ即時に生成して、予めテンプレート化された即時区画（ＰＩＰ）を形成する工程；および
    各ＰＩＰにおいて、少なくとも該ＲＮＡガイドおよびＲＮＡ転写物を含む、核酸分子を該細胞から放出させる工程
    を含む、方法。
  2. 前記ＲＮＡガイドがポリアデニル化されていない、請求項１に記載の方法。
  3. 前記非ポリアデニル化ＲＮＡガイドおよびＲＮＡ転写物を逆転写して、独特な分子識別子および前記ＰＩＰに独特なバーコードをさらに含む、前記ＲＮＡ分子のｃＤＮＡ相補体を形成する工程
    をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記非ポリアデニル化ＲＮＡガイドを逆転写する工程が、捕捉プライマーを該非ポリアデニル化ＲＮＡガイドの捕捉配列にハイブリダイズさせることを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記合わせる工程において、前記ＲＮＡガイドが独特な分子識別子をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記ＲＮＡ転写物を逆転写して、独特な分子識別子および前記ＰＩＰに独特なバーコードをさらに含む、各ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡ相補体を形成する工程；および
    前記ＲＮＡガイドを逆転写して、前記ＰＩＰに独特なバーコードをさらに含む、各非ポリアデニル化ＲＮＡガイドのｃＤＮＡ相補体を形成する工程
    をさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ｃＤＮＡ分子を配列決定して、各ＲＮＡガイドと関連する配列読取りおよび各ＲＮＡ転写物と関連する配列読取りを生成する工程
    をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  8. 各ＲＮＡガイド配列読取りと、ＰＩＰに独特な同じバーコードを有する各ＲＮＡ転写物配列読取りとを関連付ける工程
    をさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびＲＮＡガイドが、前記細胞におけるＲＮＡ転写物の発現を該ＲＮＡガイドの非存在下の細胞と比較して改変する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびＲＮＡガイドが、遺伝性疾患と関連する遺伝子型を反映するように前記細胞のＤＮＡを改変する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記遺伝性疾患ががんである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＲＮＡガイドが定常領域を含み、前記捕捉配列が該ＲＮＡガイドの定常領域に存在する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記定常領域が２ステムループ領域または３’末端領域から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記合わせる工程が、前記複数の細胞およびテンプレート粒子と、少なくとも前記捕捉プライマーを含む逆転写用プライマーとをさらに合わせることを含み、
    前記生成する工程が、該プライマーを各ＰＩＰに封入することを含む、
    請求項４に記載の方法。
  15. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
  16. 前記テンプレート粒子を合わせる工程が、第一の流体において該テンプレート粒子と前記複数の細胞とを合わせること、および第二の流体を該第一の流体に添加することを含み、
    前記複数の均一区画をほぼ即時に生成する工程が、該複数の流体を撹拌して、該テンプレート粒子のうちの一つだけと該単一細胞のうちの一つだけとを含むＰＩＰを生成することを含み；
    各ＰＩＰにおいて核酸分子を前記細胞から放出させる工程が、該ＰＩＰ内に含まれる該単一細胞の各々を溶解することを含む、
    請求項１に記載の方法。
  17. 前記第一の流体と前記第二の流体とが非混和性である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記細胞とテンプレート粒子とを合わせる工程および前記複数の均一区画をほぼ即時に生成する工程がチューブにおいて実施され、該チューブは遠心管、微量遠心管、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）チューブである、請求項１に記載の方法。
  19. 前記テンプレート粒子のうちの一つだけと前記細胞のうちの一つだけとを封入する複数の均一区画を前記チューブにおいてほぼ即時に生成する工程が、該テンプレート粒子のうちの一つだけを封入し細胞は封入しない複数の区画を生成することを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 遺伝子発現プロファイリングのための方法であって、
    複数の細胞とテンプレート粒子とを合わせる工程であって、細胞はＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼにより遺伝子改変されており、該細胞は、該ＲＮＡガイドの非ポリアデニル化コピーおよびポリアデニル化ＲＮＡガイドバーコードを含む、工程；
    該テンプレート粒子のうちの一つだけと該細胞のうちの一つだけとを封入する、複数の均一区画をほぼ即時に生成して、予めテンプレート化された即時区画（ＰＩＰ）を形成する工程；
    各ＰＩＰにおいて、少なくとも該ポリアデニル化ＲＮＡガイドバーコードおよびＲＮＡ転写物を含む、核酸分子を該細胞から放出させる工程；ならびに
    該ポリアデニル化ＲＮＡガイドバーコードおよびＲＮＡ転写物を逆転写して、独特な分子識別子および該ＰＩＰに独特なバーコードをさらに含む、該ＲＮＡ分子のｃＤＮＡ相補体を形成する工程
    を含む、方法。
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