CN103608027A - 用于生成致密tale-核酸酶的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于生成可有效地靶向并加工双链DNA的致密转录激活物样效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）的方法。更具体地，本发明涉及一种用于产生TALEN的方法，所述TALEN由与至少一个催化结构域融合的单一TALE DNA结合结构域组成，使得活性实体由单一多肽链构成用于单一和有效载体化，并且不需要二聚化以靶向特定的目标单一双链DNA靶标序列和加工所述DNA靶标序列附近的DNA。本发明还涉及用于实施所述方法的致密TALEN、载体、组合物和试剂盒。

Description

用于生成致密TALE-核酸酶的方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种用于生成可有效地靶向并且加工双链DNA的致密转录激活物样效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）的方法。更具体地，本发明涉及一种用于产生TALEN的方法，所述TALEN由与至少一个催化结构域融合的单一TALE DNA结合结构域组成，使得活性实体由用于简单和有效载体化（vectorization）的单一多肽链构成，并且不需要二聚化以靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列和加工所述DNA靶标序列附近的DNA。本发明还涉及用于实施所述方法的致密TALEN、载体、组合物和试剂盒。
背景技术
哺乳动物基因组时常遭受多种类型的损伤，其中认为双链断裂（double-strandbreak，DSB）是最危险的（Haber2000）。通过可取决于细胞环境的不同机制可发生DSB的修复。通过同源重组（HR）的修复能够在断裂处恢复原始序列。由于其对广泛序列同源性的严格依赖性，所以建议该机制主要在细胞周期中姐妹染色单体非常靠近的S和G2相期间起作用（Sonoda,Hochegger等2006）。单链退火（SSA）是可在同向重复之间修复DSB并由此促进缺失的另一种同源依赖性过程（Paques和Haber1999）。最后，DNA的非同源末端连接（NHEJ）是可在整个细胞周期中起作用并且不依赖于同源重组的主要途径（Moore和Haber1996;Haber2008）。NHEJ似乎包含至少两个不同组成部分：（i）主要在于DSB末端直接重新连接并且依赖于XRCC4、Lig4和Ku蛋白的途径；以及（ii）替代的NHEJ途径，其不依赖于XRCC4、Lig4和Ku蛋白，并且尤其容易出错，主要导致在微同源序列之间存在的接点缺失（Frank,Sekiguchi等.1998;Gao,Sun等.1998;Guirouilh-Barbat,Huck等.2004;Guirouilh-Barbat,Rass等.2007;Haber2008;McVey和Lee2008）。
超过25年前首次描述（Hinnen,Hicks等.1978;Orr-Weaver,Szostak等.1981;Orr-Weaver,Szostak等.1983;Rothstein1983）的同源基因靶向（homologous genetargeting，HGT）是合理基因组工程第一批方法之一并且保留到今日成为用于生成工程化的细胞或敲除小鼠的标准（Capecchi2001）。但是，固有的低效率阻止将其用作大多数细胞类型和生物体的常规方案。为了解决这些问题，提议了大量类别的合理方法以实现大于1%的靶向修饰。许多研究组集中于增强HGT的效力，其中两个主要的原则已变得明显：（i）所谓的“基质优化（matrix optimization）”方法，基本由修饰靶向载体结构组成以实现最大效力，以及；（ii）包括另外的效应物（一般是序列特异性内切核酸酶）以刺激HR的方法。基质优化的领域覆盖了宽范围的技术，并且取得了不同程度的成功（Russell和Hirata1998;Inoue,Dong等.2001;Hirata,Chamberlain等.2002;Taubes2002;Gruenert,Bruscia等.2003;Sangiuolo,Scaldaferri等.2008;Bedayat,Abdolmohamadi等.2010）。在另一方面中，通过核酸酶刺激HR已反复地证明是有效的（Paques和Duchateau2007;Carroll2008）。
对于由生物试剂诱导的DSB，例如，兆核酸酶、ZFN和TALEN（见下），其通过水解两个磷酸二酯键切割DNA，所述DNA可通过粘性末端的简单重新连接以无缝方式重新连接。或者，多种大小的有害插入或缺失（indel）可在断裂处发生，最终导致基因失活（Liang,Han等.1998;Lloyd,Plaisier等.2005;Doyon,McCammon等.2008;Perez,Wang等.2008;Santiago,Chan等.2008;Kim,Lee等.2009;Yang,Djukanovic等.2009）。不依赖于位点特异性或同源重组的该过程的性质产生了第三种基于内切核酸酶诱导的诱变的靶向方法。该方法以及相关应用可比基于同源重组的那些方法简单，原因是（a）所述方法不需要引入修复基质，和；（b）效力更加不依赖于细胞类型（与HR相反，NHEJ在整个细胞周期中可能起作用（Delacote和Lopez2008）。基于NEHJ的靶向诱变用于在永生化细胞系中引发单个基因或甚至多个基因失活（Cost,Freyvert等.2010;Liu,Chan等.2010）。此外，该方法为在其中经典的基于HR的基因敲除方法已证明是无效的，或者至少难以建立的生物体打开了新的前景（Doyon,McCammon等.2008;Geurts,Cost等.2009;Shukla,Doyon等.2009;Yang,Djukanovic等.2009;Gao,Smith等.2010;Mashimo,Takizawa等.2010;Menoret,Iscache等.2010）。
在过去的15年中，许多文献中已很好地报道了使用兆核酸酶以成功诱导基因靶向，其开始于涉及野生型I-SceI的简单实验，发展至涉及完全重组工程化的（re-engineered）酶的更精细的工作（Stoddard,Scharenberg等.2007;Galetto,Duchateau等.2009;Marcaida,Munoz等.2010;Arnould,Delenda等.2011）。兆核酸酶，也称为归巢内切核酸酶（homing endonuclease，HE），根据序列和结构基序可分为五个家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒和PD-(D/E)XK（Stoddard2005;Zhao,Bonocora等.2007）。结构数据对于每个家族的至少一个成员是可获得的。最深入研究的家族是LAGLIDADG蛋白质的家族，并且大量的生物化学、遗传和结构的工作确立了这些内切核酸酶可用作分子工具（Stoddard,Scharenberg等.2007;Arnould,Delenda等.2011）。成员蛋白质由采用类似αββαββα折叠的结构域构成，LAGLIDADG基序包含第一螺旋的末端区域，并且不仅有助于二重催化中心，而且还形成了核心亚基/亚基相互作用（Stoddard2005）。两个这样的α/β结构域装配形成功能蛋白质，并且每一个中的β链产生马鞍形DNA结合区。催化中心与直接与DNA相互作用的区域的空间分离允许特异性重组工程化的（Seligman,Chisholm等.2002;Sussman,Chadsey等.2004;Arnould,Chames等.2006;Doyon,Pattanayak等.2006;Rosen,Morrison等.2006;Smith,Grizot等.2006;Arnould,Perez等.2007）。此外，虽然迄今为止分析的所有已知的LAGLIDADG蛋白质都充当“切割酶（cleavase）”以切割靶标DNA的两条链，但是在生成切割仅一条链的“兆切口酶”方面最近已有了进展（Niu,Tenney等.2008;McConnell Smith,Takeuchi等.2009）。这样的酶可在原则上提供靶向诱导的HR的类似水平并且使NHEJ的频率最小化。
虽然大量的工程化的努力集中于LAGLIDADG HE，但是人们对其他两个家族GIY-YIG和HNH中的成员也特别感兴趣。生化和结构研究已表明，在两个家族中，成员蛋白质可采用具有不同功能结构域的二重折叠：（1）主要负责DNA切割的催化结构域，和；（2）提供靶标特异性的DNA结合结构域（Stoddard2005;Marcaida,Munoz等.2010）。开发了相关的GIY-YIG HE I-TevI和I-BmoI以证明对于这些酶的DNA结合区的可交换性（Liu,Derbyshire等.2006）。I-BasI HE的分析证明，虽然N端催化结构域属于HNH家族，但是C端DNA结合区类似于GIY-YIG家族的内切核酸酶中发现的内含子编码的内切核酸酶重复基序（IENR1）（Landthaler和Shub2003）。I-BasI的催化头与HNH HE I-HmuI、I-HmuII和I-TwoI的催化头具有序列相似性，所有的催化头作为链特异性切口酶起作用（Landthaler,Begley等.2002;Landthaler和Shub2003;Landthaler,Lau等.2004;Shen,Landthaler等.2004;Landthaler,Shen等.2006）。
鉴于蛋白质的上述家族包含序列特异性核酸酶，还在非特异性核酸酶，如大肠杆菌的大肠杆菌素（例如，ColE9和ColE7）、来自肺炎链球菌（S.pneumoniae）的EndA、来自鱼腥藻（Anabaena）的NucA和CAD中鉴定了HNH基序（Midon,Schafer等.2011）。除具有HNH基序之外，这些核酸酶中的一些包含标记性的DRGH基序并且与形成ββα-Me-指活性位点基序的核心元件具有结构同源性。HNH/DRGH基序中残基的突变研究证明了其在核酸切割活性中的作用（Ku,Liu等.2002;Doudeva,Huang等.2006;Eastberg,Eklund等.2007;Huang和Yuan2007）。此外，可有效地改变对于ColE7的DNA结合亲和力和序列偏好（Wang,Wright等.2009）。这样的详细研究表明了重组工程化的非特异性核酸酶用于靶向目的的可能性。
通过使基于锌指的DNA结合结构域与独立的催化结构域经由柔韧性接头融合产生的锌指核酸酶（ZFN）（Kim,Cha等.1996;Smith,Berg等.1999;Smith,Bibikova等.2000）代表常用于刺激基因靶向的另一种类型的工程化的核酸酶。原型ZFN基于IIS型限制酶FokI的催化结构域并且已成功地用于诱导基因修正、基因插入和基因缺失。基于锌指的DNA结合结构域由3个或4个单独锌指的串构成，每个锌指识别DNA三联体（Pabo,Peisach等.2001）。理论上，ZFN的主要优点之一在于它们容易使用具有已知识别模式的事先存在的锌指的组合装配来设计（Choo和Klug1994;Choo和Klug1994;Kim,Lee等.2009）。但是，高分辨结构的仔细检查表明在单元之间实际上有串话（cross-talk）（Elrod-Erickson,Rould等.1996），并且已使用多种方法通过选择环境依赖性方式的单独锌指来组装ZF蛋白质（Greisman和Pabo1997;Isalan和Choo2001;Maeder,Thibodeau-Beganny等.2008;Ramirez,Foley等.2008），以实现更好的成功率和更好质量的试剂。
最近，描述了使用FokI催化结构域的新一类嵌合核酸酶（Christian,Cermak等.2010;Li,Huang等.2011）。这些核酸酶的DNA结合结构域来源于转录激活物样效应物（TALE），其是用于由黄单胞菌属植物病原体的感染过程中的蛋白质家族。在这些DNA结合结构域中，序列特异性由基本上在两个位置不同的一系列33至35个氨基酸重复驱动（Boch,Scholze等.2009;Moscou和Bogdanove2009）。DNA靶标中的每个碱基对通过单个重复相接触，其特异性由重复的两个变体氨基酸产生（所谓的重复可变二钛，repeat variable dipeptide，RVD）。通过所设计的具有新特异性的TALE源蛋白质的模块装配，在某一程度上确定了这些DNA结合结构域的表观模块化（Boch,Scholze等.2009;Moscou和Bogdanove2009）。但是，如对于锌指蛋白质所观察到的（见上），仍然不能排除单独重复/碱基识别模式的某一水平的环境依赖性。此外，表明了天然TAL效应物可二聚化（Gurlebeck,Szurek等.2005），并且目前还不知道其如何影响“基于二聚化的”TALE源核酸酶。
基于FokI的TALE核酸酶（TALEN）的功能布置基本上是ZFN的功能布置，其锌指DNA结合结构域被替换为TALE结构域（Christian,Cermak等.2010;Li,Huang等.2011）。同样地，通过TALEN的DNA切割需要非特异性中心区两侧的两个DNA识别区。这种中心“间隔物”DNA区域对于促进通过二聚化FokI催化结构域的催化是必不可少的，并且已将大量的努力投入到了优化DNA结合位点之间的距离（Christian,Cermak等.2010;Miller,Tan等.2011）。间隔物的长度从14到30个碱基对变化，并且DNA切割的效率与间隔物长度和TALE支架构建（即，所使用的融合构建体的性质）相互依赖。仍然不知道重复区域中的不同（即，所使用的RVD类型和数目）是否对DNA“间隔物”需求有影响或是否对通过TALEN的DNA切割效率有影响。但是，在酵母、哺乳动物细胞和植物中的基于细胞的测定中，已表明TALE核酸酶具有不同程度的活性（Christian,Cermak等.2010;Li,Huang等.2011;Mahfouz,Li等.2011;Miller,Tan等.2011）。
本发明人开发了可工程化为特异性识别并有效地加工靶标DNA的新类型TALEN。这些新型“致密TALEN”（cTALEN）对于DNA加工活性不需要二聚化，从而减弱了对具有间插DNA“间隔物”的“双”靶标位点的需要。此外，本发明允许生产可增加单独的DNA修复途径（HR和NHEJ）的几种不同类型的酶。
发明内容
本发明涉及一种用于生成由单一多肽链构成的致密转录激活物样效应物核酸酶（TALEN）的方法，其不需要二聚化以靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列并且加工在所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA。本发明还涉及用于简单和有效载体化的功能性单一多肽融合蛋白的产生。在另一方面中，本发明涉及包含至少增强子结构域的致密TALEN，其中所述增强子结构域增强所述致密TALEN在目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA加工效率。本发明还涉及用于实施所述方法的致密TALEN、载体、组合物和试剂盒。本发明还涉及用于将根据本发明的所述致密TALEN用于从靶向DNA切割到靶向基因调节的多种应用的方法。根据本发明的方法可用于从产生转基因生物体到治疗遗传疾病的多个领域中。
附图说明
除以上特征之外，本发明还包括由以下描述以及附图显现出的另一些特征。通过参照以下附图以及以下的详细描述会更好地、更全面地理解本发明，以及容易地得到的其许多的伴随优点。
图1：内切核酸酶诱导的基因靶向方法。切割后，DNA修复机制可导致几种结果之一。（A）当双链断裂靶向在两条同向重复之间时，HR可导致一个重复与间插序列一起缺失。可通过引入包含与DNA断裂周围的内源性序列同源的序列的DNA修复基质实现基因插入（B）和修正（C）。可在断裂处或断裂远端修正突变，修正频率随着距离增加而降低。（D）易于出错的NHEJ对DNA末端的错修复可导致多种大小的插入或缺失，引起基因失活。
图2：由I-CreI和I-TevI识别的靶标DNA的序列。C1234（SEQ ID NO:3）表示由野生型I-CreI兆核酸酶识别和切割的部分对称的天然DNA序列。C1221（SEQID NO:2）表示来源于C1234（SEQ ID NO:3）、也由I-CreI（SEQ ID NO:1）识别和切割的人工回文DNA序列。核苷酸由靶标中心向外（-/+）进行编号。DNA切割发生在下划线序列的任一侧，以生成4-核苷酸3’悬垂末端。对于基于I-CreI的兆核酸酶，核苷酸在位置-2至+2中的性质可潜在地干扰蛋白质的切割活性。Tev（SEQ ID NO:105）表示由野生型I-TevI兆核酸酶识别和切割的非对称DNA序列。核苷酸编号相对于天然靶标序列的内含子插入位点。通过I-TevI的切割发生在下划线序列的任一侧上以生成2-核苷酸3’悬垂末端。
图3：由TALEN和致密TALEN构建体识别的靶标DNA的序列。工程化的致密TALEN cTN-Avr和cTN-Pth的靶标DNA分别基于天然发生的非对称序列AvrBs3（19bp）[在bT1-Avr（SEQ ID NO:136）和bT2-Avr（SEQ ID NO:137）基线蛋白质支架]和PthXo1（25bp）[在bT1-Pth（SEQ ID NO:138）和bT2-Pth（SEQID NO:139）基线蛋白质支架]。对于每个序列，核苷酸从锚定的T（位置-1）向外（-/+）进行编号。显示的序列通过蛋白质直接接触以提供靶标特异性。野生型重复可变二肽（RVD）对应于靶向每个序列的天然发生的效应物蛋白的重复中发现的二肽。密码（Cipher）RVD基于所列出的二肽/核苷酸对的子集。通过使用密码RVD编码直接读出基础DNA序列得到人工RVD（SEQ ID NO:245至249）。
图4：兆核酸酶融合构造的示意图。优化融合构建体以解决或克服不同的问题。（A）向活性兆核酸酶中添加两个催化结构域不仅可增强切割活性（例如，每个结合事件中有三次机会影响DNA切割），而且可促进由易于出错的NHEJ引起的序列改变，原因是对于每对切割事件小区段的DNA被切除了。（B）当特异性重组工程妨碍了维持兆核酸酶的切割活性时，所附加（attached）的催化结构域提供了必需的链切割功能。（C）和（D）分别表示当每个融合蛋白仅默认一个催化结构域（例如，作为N端或C端融合或者在单链分子的环境下）时，（A）和（B）的示例。在所有的情况下，预想的催化结构域可根据应用是切割酶（能够切割DNA的两条链）或切口酶（仅切割单一DNA链）。融合接点（N端与C端）和接头设计可根据应用而改变。融合蛋白的组分列于图例中。
图5：cTALEN构造的示意图。设计致密TALEN以减弱在靶向DNA切割事件时对多个独立蛋白质部分的需要。重要的是，对于目前经典的TALEN功能必不可少的必要的“间隔物”区和双重靶位点是不需要的。此外，由于催化结构域不需要特异性DNA接触，所以对于核心TALE DNA结合结构域周围的区域没有限制。（A）通过标准（切割酶结构域）或保守（切口酶结构域）修复途径促进HR的N端融合构建体。（B）具有如（A）中的性质的C端融合构建体。（C）向TALE两个末端附加两个催化结构域允许在NHEJ中的双切割增强。融合接点（N端与C端）和接头设计可根据应用而改变。融合蛋白的组分列于图例中。
图6：增强的cTALEN构造的示意图。可通过添加结构域以促进现有的或替代活性来增强致密TALEN。由于TALE DNA结合结构域的每个末端经历融合，所以催化结构域和增强子结构域的添加顺序（N端与C端）可根据应用而改变。（A）具有C端增强子结构域的标准cTALEN。（B）增强子结构域与cTALEN通过催化结构域的N端融合。这样的构造可用于帮助和/或锚定DNA附近的催化结构域以增加切割活性。（C）增强子结构域夹在催化结构域与TALE DNA结合结构域之间。增强子结构域可促进旁侧结构域（flanking domain）之间的信息传递（即，有助于催化和/或DNA结合），或者可用于克服在所有基于TALE的靶标的位置-1处需要的T核苷酸。（D）增强子结构域用于功能性替换天然TALE蛋白N-端区域。（E）增强子结构域用于功能性替换天然TALE蛋白C-端区域。融合接点（N端与C端）和接头设计可根据应用而改变。融合蛋白的组分列于图例中。
图7：反式cTALEN构造的示意图。致密TALEN可与辅助增强子结构域组合以促进交替的活性。辅助结构域提供对于cTALEN活性不是必需的另外的功能。（A）具有N端切口酶催化结构域的标准cTALEN通过单独添加辅助结构域变为“切割酶”。（B）在一些情况下，靶向辅助结构域特异性的需要是必要的。这样的构造可通过TALE融合实现并且可用于帮助和/或锚定DNA附近的辅助结构域以增加cTALEN的活性。（C）在cTALEN之前或之后提供靶向的辅助结构域以执行独立的任务。融合蛋白之间的信息传递是不必要的。融合接点（N端与C端）和接头设计可根据应用而改变。融合蛋白的组分列于图例中。
图8：DNA切割、在体内重新连接和另一些修复途径的示意图。在细胞中，通过肽的罕见切口的内切核酸酶进行的切割通常导致具有粘性末端的DNA双链断裂（DSB）。例如，来自LAGLIDADG家族的兆核酸酶，例如I-SceI和I-CreI，产生具有3’悬垂端的DSB。这些粘性末端可在体内通过NHEJ重新连接，导致无缝修复，以及导致恢复可切割靶标序列，进而可再次被相同的内切核酸酶加工。因此，可发生切割和重新连接事件的一系列无效循环。不精确的NHEJ或同源重组可改变或移除切割位点，导致循环退出；这也可适用于根据本发明的致密TALEN和增强致密TALEN（A）。两种其他方式也可停止所述过程：（i）作为修复DSB失败的结果可发生染色体丢失；（ii）核酸酶丢失（降解、稀释、细胞分裂等）。B至E：切割另外的磷酸二酯键的结果。添加单一切口酶活性（B）或添加影响相同链的两种切口酶活性（C）将导致单链缺口，并且抑制粘性末端，进而可影响事件谱。添加影响相反链的两种切口酶活性（D）或添加生成第二DSB的新切割酶活性将导致双链缺口；结果，不再可能发生完整的重新连接，并且可刺激一个或几个替代修复结果。目前的附图关于这些替代结果（不精确的NHEJ、同源重组等）的相对频率没有进行假设。实心三角形表示磷酸二酯键的水解。
图9：酵母中TALE-AvrBs3::TevI的活性（37℃）。阴性对照在于没有任何RVD的TALEN。n.d.指示没有可检测的活性，+指示在酵母测定中超过0.3的活性并且+++指示在酵母测定中超过0.7的活性（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006中）。
图10：哺乳动物细胞中TALE-AvrBs3::TevI的活性（CHO-K1中的染色体外测定）。pCLS8993（SEQ ID NO:194）由黑条表示并且pCLS8994（SEQ ID NO:195）由深灰色条表示。阴性对照（空载体）由白条表示并且阳性对照（I-SceI兆核酸酶）由浅灰色条表示。相对于阳性对照归一化数据。
图11：酵母中TALE-AvrBs3::NucA的活性（37℃）。阴性对照是缺少识别位点的靶标（neg.ctrl.:SEQ ID NO:228）。致密是仅具有一个识别位点的靶标（SEQID NO:224）。n.d.指示没有可检测的活性，+指示在37℃下在酵母测定中超过0.3的活性；++表示在37℃下在酵母测定中超过0.5的活性并且+++指示在37℃下在酵母测定中超过0.7的活性（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006中）。
图12：酵母中TALE-AvrBs3::ColE7的活性（37℃）。阴性对照是缺少识别位点的靶标（neg.ctrl.:SEQ ID NO:228）。致密是仅具有一个识别位点的靶标（SEQID NO:224）。n.d.指示没有可检测的活性，+指示在37℃下在酵母测定中超过0.3的活性；++表示在37℃下在酵母测定中超过0.5的活性并且+++指示在37℃下在酵母测定中超过0.7的活性（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006中）。
图13：TALE::CreI原型致密TALEN的示意图和细节。该类致密TALEN靶向由邻近兆核酸酶靶标位点的TALE DNA结合位点构成的二重识别序列。与由TALE部分识别的RVD和DNA序列的细节一起显示了工程化的TCRB02-A兆核酸酶位点。显示了T细胞受体B基因的区域，突出了基于TALE::CreI的致密TALEN杂交靶标位点的内源性布置。
图14：酵母中基于TALE::scTB2aD01的构建体的活性（30℃）。显示了多种杂交靶标的布置，开始（5’）是以大写字母表示的由TALE DNA结合结构域识别的区域，非特异性间隔区以小写字母表示，并且兆核酸酶靶标位点以下划线大写字母表示。阐明了在酵母中的活性用以选择代表性构建体。n.d.指示没有可检测的活性，+指示在30℃下在酵母测定中超过0.3的活性；++表示在30℃下在酵母测定中超过0.5的活性并且+++指示在30℃下在酵母测定中超过0.7的活性（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006中）。
图15：基于TALE::scTB2aD01的构建体的Western印迹。在HEK293细胞中表达构建体并且在转染48小时后制备总蛋白质提取物。使用多克隆抗I-CreI抗体检测蛋白质。
图16：CHOK1细胞中基于TALE::scTB2aD01的构建体的毒性。细胞毒性基于相对于标准对照（转染空质粒），在第1天和第6天中，活细胞中表达的GFP的可检测水平。
图17：HEK293细胞中基于TALE::scTB2aD01的构建体的NHEJ活性。基因组DNA的转染后基于PCR的分析用于评价在体内的活性。通过T7内切核酸酶切割错配DNA序列是在靶向基因座处由cTALEN或兆核酸酶的活性引起的NHEJ事件的指示。
图18：酵母中TevI::TALE-AvrBs3+/-TALE-RagT2-R::TevI的活性（37℃）。阴性对照是缺少识别位点的靶标（neg.ctrl.:SEQ ID NO:228）。n.d.指示没有可检测的活性，+指示在37℃下在酵母测定中超过0.3的活性；++表示在37℃下在酵母测定中超过0.5的活性并且+++指示在37℃下在酵母测定中超过0.7的活性（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006中）。
图19：酵母中TALE::SnaseSTAAU的活性（37℃）。阴性对照是缺少识别位点的靶标。致密是仅具有一个识别位点的靶标（SEQ ID NO:224）。n.d.指示在37℃下没有可检测的活性，+/-指示在37℃下在酵母测定中超过0.3的活性；+指示在37℃下在酵母测定中超过0.3的活性；++表示在37℃下在酵母测定中超过0.5的活性；+++指示在37℃下在酵母测定中超过0.75的活性（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006中）。
图20：酵母中具有多种多肽接头的TALE::ColE7的活性（37℃）。致密是仅具有一个识别位点的靶标（SEQ ID NO:224）。n.d.指示没有可检测的活性，+指示在37℃下在酵母测定中超过0.3的活性；++表示在37℃下在酵母测定中超过0.5的活性；+++指示在37℃下在酵母测定中超过0.75的活性（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006中）。
表6：具有不同间隔物长度的AvrBs3靶标的列表（SEQ ID NO:157至192）。
表7：具有不同间隔物长度的AvrBs3靶标的列表（SEQ ID NO:157至192），其包括仅具有一个识别位点（致密，SEQ ID NO:224）的靶标和在于没有任何识别位点的靶标的阴性对照靶标（neg.ctrl.,SEQ ID NO:228）。
表13：具有不同间隔物长度的杂交RagT2-R/AvrBs3靶标的列表（SEQ ID NO:315至350）。
具体实施方式
除非本文另有定义，否则使用的所有技术术语和科学术语与基因疗法、生物化学、遗传学和分子生物学领域的技术人员通常理解的意思相同。
与本文所述方法和材料类似或等同的所有方法和材料，以及本文所述的合适方法和材料可用于本发明的实施或测试。本文提到的所有公开、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在矛盾的情况下，本说明书（包括定义）占优势。此外，除非另有说明，否则所述材料、方法和实施例仅是说明性的并且不旨在限制。
除非另有说明，否则本发明的实践采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学领域技术中的常规技术，其在本领域技术范围内。文献中全面解释了这样的技术。参见，例如Current Protocols inMolecular Biology（Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley和son Inc，Library ofCongress，USA）；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版,（Sambrook等，2001，Cold Spring Harbor，New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press）；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait编，1984）；Mullis等.美国专利No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization（B.D.Harries&S.J.Higgins编.1984）；Transcription AndTranslation（B.D.Hames&S.J.Higgins编.1984）；Culture Of Animal Cells（R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987）；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press，1986）；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）；the series，MethodsIn ENZYMOLOGY（J.Abelson和M.Simon，总主编，Academic Press，Inc.，NewYork）、具体地第54和155卷（Wu等.编）和第185卷，"Gene Expression Technology"（D.Goeddel编）；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory）；Immunochemical Methods In CellandMolecular Biology（Mayer和Walker编，Academic Press，London，1987）；HandbookOf Experimental Immunology，Volumes I-IV（D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986）和Manipulating the Mouse Embryo,（Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)。
在第一方面中，本发明涉及一种生成由单一多肽链构成的致密转录激活物样效应物核酸酶（cTALEN）的方法，其不需要二聚化以靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，并加工所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA。
根据本发明的第一方面是生成致密转录激活物样效应物核酸酶（cTALEN）的方法，其包括步骤：
（i）将核心TALE支架工程化成（a）包含不同组的重复可变二肽区（RVD）以改变DNA结合特异性并且靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，（b）选择的催化结构域可附加到其上以影响DNA加工；
（ii）确定或工程化至少一个催化结构域，其中所述催化结构域在与来自（i）的所述工程化的核心TALE支架融合时能够加工所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA；
（iii）任选地确定或工程化肽接头以使来自（ii）的所述催化结构域与来自（i）的所述工程化的核心TALE支架融合；
从而得到由单一多肽链构成的致密TALEN实体，其不需要二聚化以靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，并加工所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA。换言之，根据本发明的致密TALEN是这样的活性实体单元：其自身能够通过一个DNA结合结构域仅靶向一个特定的目的单一双链DNA靶标序列并且加工所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA。
在另一个实施方案中，是用于靶向和加工双链DNA的方法，其包括：
（a）在双链DNA的一条链中选择一个目的DNA靶标序列；
（b）提供独特的致密TALEN单体，所述单体包含：
（i）一个核心TALE支架，其包含对所述目的DNA靶标序列具有DNA结合特异性的重复可变二肽区（RVD）；
（ii）至少一个催化结构域，其中所述催化结构域当与来自（i）的所述核心TELE支架的C端和/或N端融合时，能够加工距所述目的DNA靶标序列几个碱基对远的DNA；
（iii）任选的一个肽接头，在需要时，其使来自（ii）的所述催化结构域与来自（i）的所述核心TALE支架融合；
其中所述致密TALEN单体装配成结合并加工所述双链DNA而不需要二聚化；
（c）使所述双链DNA与所述独特的单体相接触使得在3’和/或5’方向上距所述一条链靶标序列几个碱基对远的双链被加工。
在另一个实施方案中，根据本发明的所述工程化的核心TALE支架包含另外的N端结构域，导致工程化的核心TALE支架顺序地包含N端结构域和不同组的重复可变二肽区（RVD）以改变DNA结合特异性并靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，选择的催化结构域可附加到其上以影响DNA加工。
在另一个实施方案中，根据本发明的所述工程化的核心TALE支架包含另外的C端结构域，导致工程化的核心TALE支架顺序地包含不同组的重复可变二肽区（RVD）和C端结构域，所述RVD改变DNA结合特异性并靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，选择的催化结构域可附加到其上以影响DNA加工。
在另一个实施方案中，根据本发明的所述工程化的核心TALE支架包含另外的N端结构域和C端结构域，导致工程化的核心TALE支架顺序地包含N端结构域、不同组的重复可变二肽区（RVD）和C端结构域，所述RVD改变DNA结合特异性并靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，选择的催化结构域可附加到其上以影响DNA加工。在另一个实施方案中，根据本发明的所述工程化的核心TALE支架包含选自ST1（SEQ ID NO:134）和ST2（SEQ ID NO:135）的蛋白质序列。在另一个实施方案中，所述工程化的TALE支架包含与选自SEQ ID NO:134和SEQID NO:135的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个实施方案中，根据本发明的所述工程化的核心TALE支架包含选自bT1-Avr（SEQ ID NO:136）、bT2-Avr（SEQ ID NO:137）、bT1-Pth（SEQ ID NO:138）和bT2-Pth（SEQ ID NO:139）的蛋白质序列。在另一个实施方案中，所述工程化的TALE支架包含与选自SEQ ID NO:136至SEQ ID NO:139的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在根据本发明方法的一个优选实施方案中，所述工程化的核心TALE支架的另外的N端和C端结构域来源于天然TALE。在一个更优选的实施方案中，所述工程化的核心TALE支架的另外的N端和C端结构域来源于诸如AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1c作为非限制性实例的天然TALE。在另一个更优选的实施方案中，所述另外的N端结构域和/或所述C端结构域是其所来源的天然TALE（诸如AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1c作为非限制性实例）各自的N端结构域和/或所述C端结构域的截短形式。在一个更优选的实施方案中，所述工程化的核心TALE支架的另外的N端和C端结构域选自ST1SEQ ID NO:134和ST2SEQID NO:135，如分别由基线蛋白质支架bT1-Avr（SEQ ID NO:136）或bT1-Pth（SEQID NO:138）和bT2-Avr（SEQ ID NO:137）或bT2-Pth（SEQ ID NO:139）所举例说明的。
在另一个实施方案中，所述核心支架的每个RVD由30至42个氨基酸，更优选由33或34个氨基酸构成，其中位于位置12和13处的两个关键氨基酸介导所述核酸靶标序列的一个核苷酸的识别；等同的两个关键氨基酸可位于除12和13之外的位置处，尤其是在高于33或34个氨基酸长的RVD中。优选地，与不同核苷酸识别有关的RVD是识别C的HD，识别T的NG，识别A的NI，识别G或A的NN，识别A、C、G或T的NS，识别T的HG，识别T的IG，识别G的NK，识别C的HA，识别C的ND，识别C的HI，识别G的HN，识别G的NA，识别G或A的SN和识别T的YG，识别A的TL，识别A或G的VT和识别A的SW。更优选地，与核苷酸C、T、A、G/A和G识别有关的RVD分别选自识别G的NN或NK，识别C的HD，识别T的NG和识别A的NI，识别A的TL，识别A或G的VT和识别A的SW。在另一个实施方案中，与核苷酸C识别有关的RVDS选自N*，并且与核苷酸T识别有关的RVDS选自N*和H*，其中*指在对应于RVD第二位置处缺少氨基酸残基的重复序列中的缺口。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可向其他氨基酸残基突变，以调控其对核苷酸A、T、C和G的特异性，并且特别地增强其特异性。其他氨基酸残基指二十种天然氨基酸残基或非天然氨基酸衍生物的任意一种。
在另一个实施方案中，本发明的所述核心支架包含8至30个RVD。更优选地，本发明的所述核心支架包含8至20个RVD，更优选地包含15个RVD。
在另一个实施方案中，所述核心支架在所述一组RVD的C端处包含由20个氨基酸构成的另外的单一截短RVD，即，另外的C端半RVD（half-RVD）。在这种情况下，本发明的所述核心支架包含8.5至30.5个RVD，“.5”指先前提到的半RVD（或端RVD，或半重复）。更优选地，本发明的所述核心支架包含8.5至20.5个RVD，更优选地包含15.5个RVD。在一个优选实施方案中，所述半RVD在允许所述半RVD对核苷酸A、C、G、T缺少特异性的核心支架环境中。在一个更优选的实施方案中，不存在所述半RVD。
在另一个实施方案中，本发明的所述核心支架包含不同来源的RVD。在一个优选实施方案中，所述核心支架包含来源于不同天然发生的TAL效应物的RVD。在另一个优选实施方案中，本发明核心支架的一些RVD的内部结构由来源于不同天然发生的TAL效应物的结构或序列构成。在另一个实施方案中，本发明的所述核心支架包含RVD样结构域。RVD样结构域具有不同于天然发生的RVD的序列，但是具有与本发明所述核心支架中相同的功能和/或总体结构。
在另一个实施方案中，所述工程化的核心TALE支架的所述另外的N端结构域是增强子结构域。在另一个实施方案中，所述增强子结构域选自作为非限制性实例的Puf RNA结合蛋白质或锚蛋白（Ankyrin）超家族。在另一个实施方案中，所述增强子结构域序列选自表1所列的作为非限制性实例的SEQ ID NO:4和SEQID NO:5的蛋白质结构域，其功能突变体、变体或衍生物。
在另一个实施方案中，所述工程化的核心TALE支架的所述另外的C端结构域是增强子结构域。在另一个实施方案中，所述增强子结构域选自作为非限制性实例的绿脓杆菌（Pseudomonas Aeuriginosa）家族的水解酶/转移酶、来自结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）连接酶D家族的聚合酶结构域、来自火球菌属（Pyrococcus）家族的起始因子elF2、翻译起始因子Aif2家族。在另一个实施方案中，所述增强子结构域序列选自表1所列的作为非限制性实例的SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:9的蛋白质结构域，其功能突变体、变体或衍生物。
表1：用于工程化的核心TALE支架的增强子结构域的列表
Figure BDA0000429500830000131
Figure BDA0000429500830000141
在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，催化结构域可与所述核心TALE支架的N端部分融合，所述催化结构域当根据本发明方法与所述工程化的核心TALE支架融合时能够加工目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA。在另一个优选实施方案中，所述催化结构域与所述核心TALE支架的C端部分融合。在另一个优选实施方案中，两个催化结构域与所述核心TALE支架的N端部分和所述核心TALE支架的C端部分均融合。在一个更优选的实施方案中，所述催化结构域具有选自以下的酶活性：核酸酶活性、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在另一个优选实施方案中，与本发明的核心TALE支架融合的催化结构域可以是转录激活物或阻遏物（即，转录调节物），或者与其他蛋白质如组蛋白相互作用或修饰其的蛋白质。本发明的所述致密TALEN的DNA加工活性的非限制性实例包括，例如，产生或修饰表观遗传（epigenetic）调节元件，在DNA中进行位点特异性插入、缺失或修复，控制基因表达和修饰染色质结构。
在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域具有内切核酸酶活性。在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域对根据本发明方法的所述双链DNA具有切割活性。在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域对根据本发明方法的所述双链DNA具有切口酶活性。在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域选自蛋白质MmeI、大肠杆菌素-E7（CEA7_ECOLX）、大肠杆菌素-E9、APFL、EndA、Endo I（END1_ECOLI）、人Endo G（NUCG_HUMAN）、牛Endo G（NUCG_BOVIN）、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAAU）、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAHY）、微球菌核酸酶（NUC_SHIFL）、内切核酸酶yncB、内切脱氧核糖核酸酶I（ENRN_BPT7）、Metnase、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I（R.BspD6I大亚基）、ss.BspD6I（R.BspD6I小亚基）、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCI亚基1、BbvCI亚基2、Bpu10Iα亚基、Bpu10Iβ亚基、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、人DNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）和VP16，如表2中列出的（SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:1、366&367），其功能突变体、变体或衍生物。在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，所述催化结构域是I-TevI（SEQ ID NO:20），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，催化结构域I-TevI（SEQ ID NO:20），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的N端结构域融合。在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:420至432的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个优选实施方案中，所述催化结构域是ColE7（SEQ ID NO:11），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，催化结构域ColE7（SEQ IDNO:11），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的N端结构域融合。在另一个优选实施方案中，催化结构域ColE7（SEQ ID NO:11），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的C端结构域融合。在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:435至438的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个优选实施方案中，所述催化结构域是NucA（SEQ ID NO:26），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，催化结构域NucA（SEQ IDNO:26），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的N端结构域融合。在另一个优选实施方案中，催化结构域NucA（SEQ ID NO:26），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的C端结构域融合。在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:433至434的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个优选实施方案中，所述催化结构域是I-CreI（SEQ ID NO:1），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，催化结构域I-CreI（SEQ IDNO:1），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的N端结构域融合。在另一个优选实施方案中，催化结构域I-CreI（SEQ ID NO:1），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的C端结构域融合。在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:439至441和SEQ ID NO:444至446的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个实施方案中，所述催化结构域是限制酶，例如，作为非限制性实例的表2列出的MmeI、R-HinPII、R.MspI、R.MvaI、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I、ss.BspD6I、R.PleI、MlyI和AlwI。在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域具有外切核酸酶活性。
在另一个更优选的实施方案中，选自以下的两个催化结构域的任意组合可分别与所述核心TALE支架的N端部分和C端部分两端融合：蛋白质MmeI、大肠杆菌素-E7（CEA7_ECOLX）、大肠杆菌素-E9、APFL、EndA、Endo I（END1_ECOLI）、人Endo G（NUCG_HUMAN）、牛Endo G（NUCG_BOVIN）、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAAU）、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAHY）、微球菌核酸酶（NUC_SHIFL）、内切核酸酶yncB、内切脱氧核糖核酸酶I（ENRN_BPT7）、Metnase、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I（R.BspD6I大亚基）、ss.BspD6I（R.BspD6I小亚基）、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCI亚基1、BbvCI亚基2、Bpu10Iα亚基、Bpu10Iβ亚基、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、人DNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）和VP16，如表2中列出的（SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:1、366&367），其功能突变体、变体或衍生物。例如，I-HmuI催化结构域可与所述核心TALE支架的N端部分融合，ColE7催化结构域可与所述核心TALE支架的C端部分融合。在另一个实例中，I-TevI催化结构域可与所述核心TALE支架的N端部分融合，ColE7催化结构域可与所述核心TALE支架的C端部分融合。在根据本发明方法的另一个实施方案中，所述独特的致密TALEN单体包含分别与所述核心TALE支架的C端部分和N端部分融合的两个催化结构域的组合，其选自：
（i）N端的Nuc A结构域（SEQ ID NO:26）和C端的Nuc A结构域（SEQ IDNO:26）；
（ii）N端的ColE7结构域（SEQ ID NO:11）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）；
（iii）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）；
（iv）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的NucA结构域（SEQ IDNO:26）；
（v）N端的ColE7结构域（SEQ ID NO:11）和C端的NucA结构域（SEQ IDNO:26）；
（vi）N端的NucA结构域（SEQ ID NO:26）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）。
在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:448和450的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含分别与所述核心TALE支架的C端部分和N端部分融合的两个催化结构域的组合，其选自：
（i）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的FokI结构域（SEQ ID NO:368）；
（ii）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）；
（iii）N端的scTrex2结构域（SEQ ID NO:451）和C端的FokI结构域（SEQID NO:368）。
在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:447至450和SEQ ID NO:452的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在本发明的范围中，可设想将所述催化结构域插入到根据本发明的工程化的核心TALE支架的两个部分之间，每个部分包含一组RVD。在这最后的情况下，对于工程化的核心TALE支架每一部分的RVD数目可相同或不同。换言之，可设想分裂本发明的所述核心TALE支架以将一个催化结构域插入到所得的所述工程化的核心TALE支架的两部分之间。在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:453至455的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
表2：用于致密TALEN或增强的致密TALEN的催化/增强子结构域的列表
Figure BDA0000429500830000171
Figure BDA0000429500830000191
Figure BDA0000429500830000201
Figure BDA0000429500830000211
Figure BDA0000429500830000221
Figure BDA0000429500830000241
Figure BDA0000429500830000251
Figure BDA0000429500830000261
Figure BDA0000429500830000271
Figure BDA0000429500830000281
Figure BDA0000429500830000291
Figure BDA0000429500830000301
Figure BDA0000429500830000311
Figure BDA0000429500830000321
Figure BDA0000429500830000331
Figure BDA0000429500830000341
Figure BDA0000429500830000351
在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，可使所述催化结构域与根据本发明方法的核心TALE支架连接的肽接头可选自：NFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1和1qu6A_1，如表3所列出的（SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:372至SEQ IDNO:415）。在一个更优选的实施方案中，可使所述催化结构域与根据本发明方法的核心TALE支架连接的肽接头可选自NFS1（SEQ ID NO:98）、NFS（SEQ ID NO:99）和CFS1（SEQ ID NO:100）。在本发明的范围中还包括了不需要肽接头使催化结构域与TALE支架融合以得到根据本发明的cTALEN的情况。
表3：可用于致密TALEN或增强的致密TALEN的肽接头的列表
Figure BDA0000429500830000352
Figure BDA0000429500830000361
Figure BDA0000429500830000371
根据其结构组成[核心TALE支架的类型、与酶活性有关的催化结构域的类型以及最后的接头的类型]，根据本发明的致密TALEN可包含不同水平的能够差异地加工DNA的独立酶活性，得到所述致密TALEN的总体DNA加工效率，所述不同酶活性的每一种具有其自己的加工效率。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的方法还包括步骤：
（i）工程化至少一个增强子结构域；
（ii）任选地确定或工程化一个肽接头以使所述增强子结构域与所述致密TALEN实体的一部分融合；
从而得到在目的单一双链DNA靶标序列附近处具有增强的DNA加工效率的致密TALEN实体，即，增强的致密TALEN。
换言之，根据本发明的方法，所述独特的致密TALEN单体还包含：
（i）至少一个增强子结构域；
（ii）任选的一个肽接头，其使所述增强子结构域与所述独特的致密TALEN单体活性实体融合。
在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域与所述致密TALEN实体的核心TALE支架部分的N端融合。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域与所述致密TALEN实体的核心TALE支架部分的C端融合。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域与所述致密TALEN实体的催化结构域部分融合。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域在核心TALE支架部分的N端与所述致密TALEN实体的催化部分之间融合。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域在核心TALE支架部分的C端与所述致密TALEN实体的催化部分之间融合。在本发明的范围中，可设想将所述催化结构域和/或增强子结构域插入到根据本发明的工程化的核心TALE支架的两部分之间，每部分包含一组RVD。在这最后的情况下，对于每种工程化的核心TALE支架的RVD数目可相同或不同。换言之，可设想分裂本发明的所述核心TALE支架以将一个催化结构域和/或一个增强子结构域插入到所得的所述工程化的核心TALE支架两部分之间。
在另一个优选实施方案中，所述增强子结构域是催化活性的或非催化活性的，为所述致密TALEN实体提供了功能和/或结构支持。在一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域由选自以下的蛋白质结构域组成：MmeI、大肠杆菌素-E7（CEA7_ECOLX）、大肠杆菌素-E9、APFL、EndA、Endo I（END1_ECOLI）、人Endo G（NUCG_HUMAN）、牛Endo G（NUCG_BOVIN）、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAAU）、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAHY）、微球菌核酸酶（NUC_SHIFL）、内切核酸酶yncB、内切脱氧核糖核酸酶I（ENRN_BPT7）、Metnase、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I（R.BspD6I大亚基）、ss.BspD6I（R.BspD6I小亚基）、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCI亚基1、BbvCI亚基2、Bpu10Iα亚基、Bpu10Iβ亚基、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、人DNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）和VP16，如表2中列出的（SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:1、366&367），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域由以上和表2中所列的蛋白质结构域的催化活性衍生物组成，为所述致密TALEN实体提供了功能和/或结构支持。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域由以上和表2中所列的蛋白质结构域的非催化活性衍生物组成，为所述致密TALEN实体提供了结构支持。在另一个优选实施方案中，所述增强子结构域选自I-TevI（SEQ ID NO:20）、ColE7（SEQ ID NO:11）和NucA（SEQ ID NO:26）。
在一个更优选的实施方案中，根据本发明方法的所述增强致密TALEN可包含第二增强子结构域。在该实施方案中，所述第二增强子结构域可与第一增强子结构域具有相同的特征。在一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域为增强的致密TALEN实体提供了结构支持。在另一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域为增强的致密TALEN实体提供了功能支持。在一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域为增强的致密TALEN实体提供了结构和功能支持。在一个更优选的实施方案中，所述增强的致密TALEN实体包含一个催化结构域和一个增强子结构域。在另一个更优选的实施方案中，所述增强的致密TALEN实体包含一个催化结构域和两个增强子结构域。在另一个更优选的实施方案中，所述增强的致密TALEN实体包含两个催化结构域和一个增强子结构域。在另一个更优选的实施方案中，所述增强的致密TALEN实体包含两个催化结构域和两个增强子结构域。
在一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域由来源于选自以下的蛋白质的蛋白质结构域组成：MmeI、大肠杆菌素-E7（CEA7_ECOLX）、大肠杆菌素-E9、APFL、EndA、Endo I（END1_ECOLI）、人Endo G（NUCG_HUMAN）、牛Endo G（NUCG_BOVIN）、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAAU）、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAHY）、微球菌核酸酶（NUC_SHIFL）、内切核酸酶yncB、内切脱氧核糖核酸酶I（ENRN_BPT7）、Metnase、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I（R.BspD6I大亚基）、ss.BspD6I（R.BspD6I小亚基）、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCI亚基1、BbvCI亚基2、Bpu10Iα亚基、Bpu10Iβ亚基、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、人DNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）和VP16，如表2中列出的（SEQ ID NO:10至SEQ IDNO:66和SEQ ID NO:1、366&367），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域由以上和表2中所列的蛋白质结构域的催化活性衍生物组成，为所述增强的致密TALEN实体提供了功能和/或结构支持。在另一个优选实施方案中，所述第二增强子结构域由以上和表2中所列的蛋白质结构域的非催化活性衍生物组成，为所述增强的致密TALEN实体提供了结构支持。
在另一个更优选的实施方案中，可设想以上所列的作为非限制性实例的催化结构域和/或增强子结构域的任意组合与所述核心TALE支架融合，为所述致密TALEN实体提供结构和/或功能支持。更优选地，能够设想选自以下的催化结构域的组合：TevI（SEQ ID NO:20）、ColE7（SEQ ID NO:11）和NucA（SEQ ID NO:26）。任选地，FokI（SEQ ID NO:368）可与根据表2列表的另一种催化结构域组合使用。可根据设想的用于使用本发明方法的应用来设想催化结构域和/或增强子结构域的这样的组合。
根据其结构组成[核心TALE支架的类型、与酶活性有关的催化结构域的类型、最后是接头的类型和增强子结构域的类型]，根据本发明的增强致密TALEN可呈现出能够差异性加工DNA的独立酶活性的不同水平，获得所述增强致密TALEN的总体DNA加工效率，所述不同酶活性的每一种具有其自己的DNA加工效率。
在一个优选实施方案中，根据本发明方法的致密TALEN实体的DNA加工效率可通过工程化至少一个增强子结构域和一个肽接头来增强，从而得到在目的单一双链DNA靶标序列附近具有增强DNA加工活性的致密TALEN实体，即，根据本发明的增强致密TALEN。
根据其结构组成，根据本发明的所述增强致密TALEN中增强的总体DNA加工效率可具有作为非限制性实例的选自以下的主要酶活性：核酸酶活性、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在一个更优选的实施方案中，根据本发明的所述增强致密TALEN中增强的总体DNA加工效率是作为非限制性实例的选自以下的不同酶活性的组合：核酸酶活性、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在一个更优选的实施方案中，根据本发明的所述增强致密TALEN中增强的总体DNA加工效率是作为非限制性实例的选自以下的不同酶活性之一：核酸酶活性、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在这种情况下，总体DNA加工效率等同于上述酶活性中的一种DNA加工活性。在另一个更优选的实施方案中，通过增强子增强的致密TALEN实体的所述DNA加工活性是切割酶活性或切口酶活性或切割酶活性和切口酶活性二者的组合。
根据本发明的致密TALEN实体的DNA加工效率的增强可以是由至少一个增强子结构域的结构支持的结果。在一个优选实施方案中，与初始致密TALEN实体对所述DNA靶标序列的结合相比，所述结构支持增强了根据本发明的致密TALEN实体对相同DNA靶标序列的结合，从而间接地协助催化结构域以得到具有增强DNA加工活性的致密TALEN实体。在另一个优选实施方案中，与初始致密TALEN实体对所述DNA靶标序列的结合相比，所述结构支持增强了致密TALEN实体对相同DNA靶标序列的现有催化活性。
在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述增强子增强了致密TALEN实体对所述DNA靶标序列的结合以及增强了催化结构域催化活性以得到具有增强DNA加工活性的致密TALEN实体。所有的这些非限制性实例导致在目的基因组基因座处对DNA靶标序列具有增强DNA加工效率的致密TALEN实体，即，根据本发明的增强致密TALEN。
与初始致密TALEN实体相比，根据本发明的致密TALEN实体的DNA加工效率的增强也可以是由至少一个增强子结构域的功能支持的结果。在一个优选实施方案中，所述功能支持可以是另外的磷酸二酯键水解的结果。在一个更优选的实施方案中，所述功能支持可以是由来源于核酸酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。在一个实施方案中，所述功能支持可以是由来源于内切核酸酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。在一个更优选的实施方案中，功能支持可以是由来源于切割酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。在另一个更优选的实施方案中，所述功能支持可以是由来源于切口酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。在一个更优选的实施方案中，所述功能支持可以是由来源于外切核酸酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。
在基因组工程化的实验中，罕见切口内切核酸酶的效率，例如，其在基因座处诱导期望事件（同源基因靶向、靶向诱变、序列移除或切除）的能力，取决于几个参数，包括核酸酶的特异性活性，可能的靶标的可接近性，以及导致期望事件（用于基因靶向的同源修复，用于靶向诱变的NHEJ途径）的修复事件的效率和后果。
肽罕见切口内切核酸酶的切割通常生成带有用于LAGLIDADG兆核酸酶的3’悬垂端的粘性末端（Chevalier和Stoddard2001）和用于锌指核酸酶的5’悬垂端的粘性末端（Smith,Bibikova等.2000）。由磷酸二酯键水解产生的这些末端可通过NHEJ以无缝方式（即，无痕重新连接）在体内重新连接。可切割靶标序列的修复允许通过相同内切核酸酶的新切割事件，并因此可发生切割和重新连接事件的一系列无效循环。间接证据表明，即使在酵母菌酿酒酵母中，这样的循环可在HO内切核酸酶的连续切割后发生（Lee,Paques等.1999）。在哺乳动物细胞中，几个实验已表明，由两个独立却靠近的I-SceI诱导DSB产生的相容性粘性末端的完美重新连接是有效过程（Guirouilh-Barbat,Huck等.2004;Guirouilh-Barbat,Rass等.2007;Bennardo,Cheng等.2008;Bennardo,Gunn等.2009）。Ku DNA修复蛋白质的不存在不显著地影响重新连接来自两个DSB的末端的NHEJ事件的总体频率；但是在CHO永生化细胞和小鼠ES细胞中，其非常大地增强不精确NHEJ对修复过程的贡献（Guirouilh-Barbat,Huck等.2004;Guirouilh-Barbat,Rass等.2007;Bennardo,Cheng等.2008）。而且，在小鼠ES细胞中，Ku的不存在刺激I-SceI诱导事件，例如不精确NHEJ（Bennardo,Cheng等.2008）、单链退火（(Bennardo,Cheng等.2008）和基因转化（Pierce,Hu等2001；Bennardo,Cheng等.2008）。用XRCC4修复蛋白质缺陷的细胞（Pierce,Hu等.2001;Guirouilh-Barbat,Rass等.2007;Bennardo,Gunn等.2009）（尽管XRCC4缺陷影响CHO细胞中NHEJ的总水平（Guirouilh-Barbat,Rass等.2007）)或DNA-PK缺陷的细胞（Pierce,Hu等.2001）获得类似的观察。相比之下，CtIP的敲除已显示出抑制“alt-NHEJ”（更易于导致不精确NHEJ的NHEJ的Ku和XRCC4独立形式）、单链退火和基因转化，并且不影响由I-SceI生成的两个相容性末端重新连接的总体水平（Bennardo,Cheng等.2008）。因此，不同DSB修复途径之间的竞争可影响由核酸酶诱导的DSB导致的谱图或修复事件。
此外，DSB切除对于某些DSB途径是重要的。显示导致生成大的单链区域（至少几百个核苷酸）的广泛DSB切除在酵母中启动单链退火（Sugawara和Haber1992）和链侵入、通过同源链启动DNA双链侵入的许多同源重组事件的ATP依赖性步骤（White和Haber1990;Sun,Treco等.1991）（对于机制的综述，参见（Paques和Haber1999））。在真核细胞中，DSB切除取决于一些蛋白质，包括BLM/Sgs1和DNA2、EXOI和MRN复合物（Mre11、Rad50、Nbs1/Xrs2）并且认为由不同途径导致。小范围切除过程中涉及MRN，而广泛切除中涉及两种冗长的途径，其在一方面取决于BLM和DNA2并且在另一方面取决于EXOI（Mimitou和Symington2008;Nimonkar,Genschel等.2011）。此外，包含损伤核苷酸的加工末端（由化学切割或大块加合物产生）需要CtIP/Sae2蛋白质以及RMN（Sartori,Lukas等.2007;Buis,Wu等.2008;Hartsuiker,Mizuno等.2009）。Trex2外切核酸酶的过表达显示强烈刺激与仅几个碱基对缺失有关的不完美NHEJ（Bennardo,Gunn等.2009），同时其抑制远距离序列之间多种类型的DNA修复事件（例如，单链退火、不同断裂末端之间的NHEJ、或涉及远程微同源的单一DSB的NHEJ修复）。在相同研究中，提议Trex2确实通过I-SceI以非持续方式切除3’悬垂端。因此，刺激途径的类型可进而取决于切除的类型（切除长度、单链与双链、5’链与3’链的切除）。
因此，致密TALEN的效率（例如，其产生期望事件如靶向诱变或同源基因靶向的能力）可通过增强或修饰其总体DNA加工效率（参见对完整定义“总体DNA加工效率”的定义）来增强，例如，所述致密TALEN不同的独立的酶活性的总体结果或总结果。
在一个优选实施方案中，与初始致密TALEN实体相比，增强根据本发明的致密TALEN实体的总体DNA加工效率可以是水解切割位点处另外的磷酸二酯键。
通过根据本发明的所述至少一个增强子在切割位点处进行另外的磷酸二酯键的所述水解可导致不同类型的DSB切除，在所述DSB切割位点处影响一条单一DNA链或两条DNA链，影响5’悬垂末端、3’悬垂末端或两个末端并且取决于所述切除的长度。因此，向致密TALEN实体的现有切割酶活性添加新切口酶或切割酶活性可在目的基因组基因座处增强根据本发明所得的增强致密TALEN的效率（图8B至8E）。作为非限制性实例，在相反链上添加两个切口酶活性（图8D）或添加生成第二DSB的新切割酶活性（图8E）可导致双链缺口。因此，不再可能发生完美的重新连接，并且可刺激一个或几个替代修复结果，例如，不精确NHEJ、同源重组或SSA。作为另一个非限制性实例，添加单一切口酶活性可导致单链缺口，并且抑制末端的粘结，还可通过刺激上述的一个或几个替代修复结果增强根据本发明的所得增强致密TALEN在目的基因组基因座处的效率。
在本发明的该方面中，致密TALEN的DNA加工效率增强指与第一致密TALEN对靶DNA序列的活性相比，增强致密TALEN对相同靶DNA序列的所述DNA加工效率的检测水平增加。所述第一致密TALEN可以是初始致密TALEN或已被工程化的致密TALEN或根据本发明的增强致密TALEN。可由初始致密TALEN或由初始增强致密TALEN设想几轮的增强。
在本发明方法的该方面中，致密TALEN实体（或增强致密TALEN）的DNA加工效率增强指与第一致密TALEN或初始致密TALEN对靶DNA序列或其附近的效率相比，针对相同目的靶DNA序列或所述目的DNA序列附近的所述DNA加工效率的检测水平增加。在该情况下，初始致密TALEN认作为是测量DNA加工效率的参照支架。所述增强致密TALEN是包含根据本发明该方面的增强子结构域的工程化的致密TALEN。所述增强致密TALEN也可被认作为是用于进一步增强所述DNA加工效率的参照支架。作为非限制性实例，所述DNA加工效率可由通过所述增强致密TALEN产生的切割诱导的重组导致。在该情况下，切割诱导的重组的所述水平可例如通过如国际PCT申请2004/067736所述的基于细胞的重组测定来确定。重要的是，细胞中效率的增强（靶向诱变或靶向重组的增强产生）可以但不一定与在某些体外测定中检测的切割活性的增强有关。例如，如图8所述的另外的磷酸二酯酶活性几乎不影响切割规律（profile），如通过体外切割和电泳凝胶上切割产物的分离检测到的。然而，如上所解释的，在图8的图例中，以该方式生成的DSB末端可更易于诱导可检测的基因组重排，例如靶向诱变（通过不精确NHEJ）或同源重组。与初始支架或初始致密TALEN相比，所述增强致密TALEN的切割诱导的重组的所述增强为至少5%的增强，更优选至少10%的增强，更优选至少15%的增强，更优选至少20%的增强，更优选至少25%的增强，更优选50%的增强，更优选大于50%的增强，导致与初始支架或初始致密TALEN相比，所述增强致密TALEN的DNA加工效率有至少5%的增强，更优选至少10%的增强，更优选至少15%的增强，更优选至少20%的增强，更优选至少25%的增强，更优选50%的增强，更优选大于50%的增强。
在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，可使所述增强子结构域与根据本发明方法的所述致密TALEN实体的一部分连接的肽接头可选自NFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1和1qu6A_1，如表3所列出（SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:372至SEQ ID NO:415）。在一个更优选的实施方案中，可使所述增强子结构域与根据本发明方法的所述致密TALEN实体的一部分连接的肽接头可选自NFS1（SEQ IDNO:98）、NFS2（SEQ ID NO:99）和CFS1（SEQ ID NO:100）。在本发明范围中还包括其中不需要使一个增强子结构域与所述致密TALEN实体一部分融合的肽接头以得到根据本发明的增强致密TALEN。
根据其结构组成[核心TALE支架的类型、与酶活性有关的催化结构域的类型、增强子的类型和最终的接头的类型]，根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN可包含能够差异性加工如上所述DNA的独立酶活性的不同水平。与初始致密TALEN或增强致密TALEN相比，通过向所述致密TALEN或所述增强致密TALEN添加新酶活性或者增强其构成酶活性的一种或几种的DNA加工效率，可增强一种致密TALEN或增强致密TALEN的总体DNA加工效率。
根据本发明，致密TALEN设计成减弱当靶向DNA加工事件时对多个独立蛋白质部分的需要。重要的是，对于当前的TALEN功能必不可少的“间隔物”区和双靶标位点的需要是不必要的。因为核心TALE支架的每个末端经历融合，所以催化结构域和增强结构域的添加顺序（N端与C端）可随应用而改变。此外，因为催化结构域不需要特定的DNA接触，所以对于围绕核心TALE支架的区域没有限制，如图5所述的非限制性实例：（A）促进由切割酶结构域或由切口酶结构域诱导的同源重组的N端融合构建体。（B）具有如（A）中的性质的C端融合构建体。（C）两个催化结构域附加至核心TALE支架的两末端，允许NHEJ中增强的双切割。融合连接（N端与C端）和接头设计可随应用改变。
根据本发明，致密TALEN可通过添加结构域以促进现有或替代活性来增强，如图6所述的非限制性实例：（A）具有增强子结构域与其核心TALE支架部分的C端融合的标准致密TALEN。（B）增强子结构域与致密TALEN通过其催化结构域部分的N端融合。这样的构造可用于帮助和/或锚定DNA附近的催化结构域部分以增加DNA加工活性。（C）增强子结构域夹在催化结构域部分与核心TALE支架部分之间。增强子结构域可促进旁侧结构域之间的信号传递（即，有助于催化和/或DNA结合）或者可用于克服在所有基于TALE靶标的位置-1处需要的T核苷酸。（D）增强子结构域用于功能性替换工程化的核心TALE支架N端区域。（E）增强子结构域用于功能性替换工程化的核心TALE支架C端区域。融合连接（N端与C端）和接头设计可随应用改变。
根据本发明，致密TALEN和增强致密TALEN中包含的催化结构域的性质依赖于应用。作为非限制性实例，切口酶结构域应允许比切割酶结构域更高的HR/NHEJ比，从而更适合于治疗应用（McConnell Smith,Takeuchi等.2009;Metzger,McConnell-Smith等.2011）。例如，切割酶结构域在一侧的偶联与切口酶结构域在另一侧的偶联可导致跨越致密TALEN结合区的DNA单链切除。延长单链悬垂端的靶向生成可用于靶向DNA修复机制的应用。对于靶向基因失活，则优选使用两个切割酶结构域。在另一个优选实施方案中，使用两个切口酶结构域可以是有利的。此外，本发明涉及用于生成可用于从靶向DNA切割至靶向基因调节的应用范围的几种不同类型致密TALEN的方法。
在另一个方面中，本发明涉及包含以下部分的致密TALEN：
（i）一个核心TALE支架，所述核心TALE支架包含不同组重复可变二肽区（RVD）以改变DNA结合特异性并且靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，选择的催化结构域可附加于所述支架连接以影响DNA加工；
（ii）至少一个催化结构域，其中所述催化结构域当与来自（i）的所述工程化的核心TALE支架融合时能够加工所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA；
（iii）任选的一个肽接头，所述肽接头在需要时使来自（ii）的所述催化结构域与来自（i）的所述工程化的核心TALE支架融合；
使得所述致密TALEN不需要二聚化以靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列并且加工所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA。换言之，根据本发明的致密TALEN是活性实体单元，其自身能够通过一个DNA结合结构域仅靶向一个特定的目的单一双链DNA靶标序列并且加工所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA。
本发明还涉及致密TALEN单体，其包含：
（i）一个核心TALE支架，所述核心TALE支架包含对特定的目的双链DNA靶标序列具有DNA结合特异性的重复可变二肽区（RVD）；
（ii）至少一个催化结构域，其中所述催化结构域当与来自（i）的所述核心TALE支架的C端或N端融合时能够加工距所述目的双链DNA靶标序列几个碱基对远的DNA；
（iii）任选的一个肽接头，所述肽接头在需要时使来自（ii）的所述催化结构域与来自（i）的所述工程化的核心TALE支架融合；
其中所述致密TALEN单体装配成结合所述靶标DNA序列并加工所述双链DNA而不需要二聚化。
在另一个实施方案中，根据本发明的致密TALEN的所述工程化的核心TALE支架包含另外的N端结构域，其导致工程化的核心TALE支架顺序地包含N端结构域和不同组的重复可变二肽区（RVD），所述RVD改变DNA结合特异性并靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，选择的催化结构域可附加于所述支架以影响DNA加工。
在另一个实施方案中，根据本发明的致密TALEN的所述工程化的核心TALE支架包含另外的C端结构域，导致工程化的核心TALE支架顺序地包含不同组的重复可变二肽区（RVD）和C端结构域，所述RVD改变DNA结合特异性并靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，选择的催化结构域可附加于所述支架以影响DNA加工。
在另一个实施方案中，根据本发明的致密TALEN的所述工程化的核心TALE支架包含另外的N端结构域和C端结构域，导致工程化的核心TALE支架顺序地包含N端结构域、不同组的重复可变二肽区（RVD）和C端结构域，所述RVD改变DNA结合特异性并靶向特定的目的单一双链DNA靶标序列，选择的催化结构域可附加于所述支架以影响DNA加工。
在另一个实施方案中，根据本发明的所述工程化的核心TALE支架包含选自ST1（SEQ ID NO:134）和ST2（SEQ ID NO:135）的蛋白质序列。在另一个实施方案中，所述工程化的核心TALE支架包含与选自SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。在另一个实施方案中，根据本发明的所述工程化的核心TALE支架包含选自bT1-Avr（SEQ ID NO:136）、bT2-Avr（SEQ ID NO:137）、bT1-Pth（SEQID NO:138）和bT2-Pth（SEQ ID NO:139）的蛋白质序列。在另一个实施方案中，所述工程化的核心TALE支架包含与选自SEQ ID NO:136至SEQ ID NO:139的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在一个优选实施方案中，工程化的核心TALE支架的所述另外的N端和C端结构域来源于天然TALE。在一个更优选的实施方案中，工程化的核心TALE支架的所述另外的N端和C端结构域来源于天然TALE，其选自作为非限制性实例的AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1c。在另一个更优选的实施方案中，所述另外的N端和/或所述C端结构域是其所来源的天然TALE（如作为非限制性实例的AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1c）各自N端和/或所述C端结构域的截短形式。在一个更优选的实施方案中，工程化的核心TALE支架的所述另外的N端和C端结构域序列选自如分别以基线蛋白质支架bT1-Avr（SEQ ID NO:136）或bT1-Pth（SEQ ID NO:138）和bT2-Avr（SEQ ID NO:137）或bT2-Pth（SEQ ID NO:139）举例说明的ST1SEQ ID NO:134和ST2SEQ ID NO:135。
在另一个实施方案中，所述核心支架的每个RVD由30至42个氨基酸，更优选33或34个氨基酸组成，其中位于位置12和13处的两个关键氨基酸介导所述核酸靶标序列中一个核苷酸的识别；特别地在高于33或34个氨基酸长的RVD中等同的两个关键氨基酸可位于除12和13之外的位置处。优选地，与不同核苷酸识别有关的RVD是识别C的HD，识别T的NG，识别A的NI，识别G或A的NN，识别A、C、G或T的NS，识别T的HG，识别T的IG，识别G的NK，识别C的HA，识别C的ND，识别C的HI，识别G的HN，识别G的NA，识别G或A的SN和识别T的YG，识别A的TL，识别A或G的VT和识别A的SW。更优选地，与核苷酸C、T、A、G/A和G识别有关的RVD分别选自识别G的NN或NK，识别C的HD，识别T的NG和识别A的NI，识别A的TL，识别A或G的VT和识别A的SW。在另一个实施方案中，与核苷酸C识别有关的RVDS选自N*，并且与核苷酸T识别有关的RVDS选自N*和H*，其中*指在对应于RVD第二位置处缺少氨基酸残基的重复序列中的缺口。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可向其他氨基酸残基突变，以调控其对核苷酸A、T、C和G的特异性，并且特别地增强其特异性。其他氨基酸残基指二十种天然氨基酸残基或非天然氨基酸衍生物的任意一种。
在另一个实施方案中，本发明的所述核心支架包含8至30个RVD。更优选地，本发明的所述核心支架包含8至20个RVD，更优选地包含15个RVD。
在另一个实施方案中，所述核心支架在所述一组RVD的C端处包含由20个氨基酸构成的另外的单一截短RVD，即，另外的C端半RVD。在这种情况下，本发明的所述核心支架包含8.5至30.5个RVD，“.5”指先前提到的半RVD（或端RVD，或半重复）。更优选地，本发明的所述核心支架包含8.5至20.5个RVD，更优选地包含15.5个RVD。在一个优选实施方案中，所述半RVD在允许所述半RVD对核苷酸A、C、G、T缺少特异性的核心支架环境中。在一个更优选的实施方案中，不存在所述半RVD。
在另一个实施方案中，本发明的所述核心支架包含不同来源的RVD。在一个优选实施方案中，所述核心支架包含来源于不同天然发生的TAL效应物的RVD。在另一个优选实施方案中，本发明核心支架的一些RVD的内部结构由来源于不同天然发生的TAL效应物的结构或序列构成。在另一个实施方案中，本发明的所述核心支架包含RVD样结构域。RVD样结构域具有不同于天然发生的RVD的序列，但是具有与本发明所述核心支架中相同的功能和/或总体结构。
在另一个实施方案中，根据本发明的所述致密TALEN的所述工程化的核心TALE支架的所述另外的N端结构域是增强子结构域。在另一个实施方案中，所述增强子结构域选自作为非限制性实例的Puf RNA结合蛋白质或锚蛋白超家族。在另一个实施方案中，所述增强子结构域序列选自表1所列的作为非限制性实例的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的蛋白质结构域，其功能突变体、变体或衍生物。在另一个实施方案中，所述工程化的核心TALE支架的所述另外的C端结构域是增强子结构域。在另一个实施方案中，所述增强子结构域选自作为非限制性实例的绿脓杆菌家族的水解酶/转移酶、来自结核分枝杆菌连接酶D家族的聚合酶结构域、来自火球菌属家族的起始因子elF2、翻译起始因子Aif2家族。在另一个实施方案中，所述增强子结构域序列选自表1所列的作为非限制性实例的SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:9的蛋白质结构域。
在另一个优选实施方案中，能够加工目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA的催化结构域当与根据本发明的所述工程化的核心TALE支架融合时与所述核心TALE支架的N端部分融合。在另一个优选实施方案中，所述催化结构域与所述核心TALE支架的C端部分融合。在另一个优选实施方案中，两个催化结构域与所述核心TALE支架的N端部分和所述核心TALE支架的C端部分均融合。在一个更优选的实施方案中，所述催化结构域具有选自以下的酶活性：核酸酶活性、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在另一个优选实施方案中，与本发明的核心TALE支架融合的催化结构域可以是转录激活物或阻遏物（即，转录调节物），或者与其他蛋白质如组蛋白相互作用或修饰其的蛋白质。本发明的所述致密TALEN的DNA加工活性的非限制性实例包括，例如，产生或修饰表观遗传调节元件，在DNA中进行位点特异性插入、缺失或修复，控制基因表达和修饰染色质结构。
在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域具有内切核酸酶活性。在另一个更优选的实施方案中，所述根据本发明的致密TALEN的催化结构域对根据本发明方法的所述双链DNA具有切割活性。在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域对根据本发明方法的所述双链DNA具有切口酶活性。在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域选自蛋白质MmeI、大肠杆菌素-E7（CEA7_ECOLX）、大肠杆菌素-E9、APFL、EndA、Endo I（END1_ECOLI）、人Endo G（NUCG_HUMAN）、牛Endo G（NUCG_BOVIN）、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAAU）、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAHY）、微球菌核酸酶（NUC_SHIFL）、内切核酸酶yncB、内切脱氧核糖核酸酶I（ENRN_BPT7）、Metnase、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I（R.BspD6I大亚基）、ss.BspD6I（R.BspD6I小亚基）、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCI亚基1、BbvCI亚基2、Bpu10Iα亚基、Bpu10Iβ亚基、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、人DNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）和VP16，如表2中列出的（SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:1、366&367），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，根据本发明的致密TALEN的所述催化结构域是I-TevI（SEQ ID NO:20），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，催化结构域I-TevI（SEQ ID NO:20），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明的致密TALEN的所述核心TALE支架的N端结构域融合。在另一个优选实施方案中，根据本发明的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:426至432的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个优选实施方案中，所述根据本发明的致密TALEN的催化结构域是ColE7（SEQ ID NO:11），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，催化结构域ColE7（SEQ ID NO:11），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的N端结构域融合。在另一个优选实施方案中，催化结构域ColE7（SEQ ID NO:11），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的C端结构域融合。在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:435至438的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个优选实施方案中，所述根据本发明的致密TALEN的催化结构域是NucA（SEQ ID NO:26），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，催化结构域NucA（SEQ ID NO:26），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的N端结构域融合。在另一个优选实施方案中，催化结构域NucA（SEQ ID NO:26），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的C端结构域融合。在另一个优选实施方案中，根据本发明方法的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:433至434的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个优选实施方案中，所述催化结构域是I-CreI（SEQ ID NO:1），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个优选实施方案中，催化结构域I-CreI（SEQ IDNO:1），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明方法的所述核心TALE支架的N端结构域融合。在另一个优选实施方案中，催化结构域I-CreI（SEQ ID NO:1），其功能突变体、变体或衍生物与根据本发明的所述核心TALE支架的C端结构域融合。在另一个优选实施方案中，根据本发明的所述致密TALEN包含与选自SEQID NO:439至441和SEQ ID NO:444至446的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个实施方案中，所述催化结构域是限制酶，例如，作为表2列出的非限制性实例的MmeI、R-HinPII、R.MspI、R.MvaI、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I、ss.BspD6I、R.PleI、MlyI和AlwI。在另一个更优选的实施方案中，所述催化结构域具有外切核酸酶活性。在另一个更优选的实施方案中，选自以下的两个催化结构域的任意组合可分别与所述核心TALE支架的N端部分和C端部分两端均融合：蛋白质MmeI、大肠杆菌素-E7（CEA7_ECOLX）、大肠杆菌素-E9、APFL、EndA、Endo I（END1_ECOLI）、人Endo G（NUCG_HUMAN）、牛Endo G（NUCG_BOVIN）、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAAU）、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAHY）、微球菌核酸酶（NUC_SHIFL）、内切核酸酶yncB、内切脱氧核糖核酸酶I（ENRN_BPT7）、Metnase、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I（R.BspD6I大亚基）、ss.BspD6I（R.BspD6I小亚基）、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCI亚基1、BbvCI亚基2、Bpu10Iα亚基、Bpu10Iβ亚基、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、人DNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）和VP16，如表2中列出的（SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:1、366&367），其功能突变体、变体或衍生物。例如，I-HmuI催化结构域可与所述核心TALE支架的N端部分融合，ColE7催化结构域可与所述核心TALE支架的C端部分融合。在另一个实例中，I-TevI催化结构域可与所述核心TALE支架的N端部分融合，ColE7催化结构域可与所述核心TALE支架的C端部分融合。
下表14给出可包含在根据本发明的致密TALEN单体内的催化结构域的组合的非限制性实例。任选地。FokI（SEQ ID NO:368）可与根据表2列表的另一种催化结构域组合使用。
表14：分别与根据本发明的致密TALEN核心支架的N和C端部分融合的催
化结构域组合的导致双切割TALENS的实例
Figure BDA0000429500830000501
在根据本发明的一个优选实施方案中，所述独特的致密TALEN单体包含分别与所述核心TALE支架的N端部分和C端部分融合的两个催化结构域的组合，其选自：
（i）N端的Nuc A结构域（SEQ ID NO:26）和C端的Nuc A结构域（SEQ IDNO:26）；
（ii）N端的ColE7结构域（SEQ ID NO:11）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）；
（iii）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）；
（iv）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的NucA结构域（SEQ IDNO:26）；
（v）N端的ColE7结构域（SEQ ID NO:11）和C端的NucA结构域（SEQ IDNO:26）；
（vi）N端的NucA结构域（SEQ ID NO:26）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的所述致密TALEN包含与选自SEQID NO:448和450的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的所述致密TALEN包含分别与所述核心TALE支架的C端部分和N端部分融合的两个催化结构域的组合，其选自：
（i）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的FokI结构域（SEQ ID NO:368）；
（ii）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）；
（iii）N端的scTrex2结构域（SEQ ID NO:451）和C端的FokI结构域（SEQID NO:368）。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的所述致密TALEN包含与选自SEQ IDNO:447至450和SEQ ID NO:452的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在本发明的范围中，可设想将所述催化结构域和/或所述增强子结构域插入到根据本发明的工程化的核心TALE支架的两个部分之间，每个部分包含一组RVD。在后一种情况下，对于工程化的核心TALE支架每一部分的RVD数目可相同或不同。换言之，可设想分裂本发明的所述核心TALE支架以将一个催化结构域和/或一个增强子结构域插入到所得的所述工程化的核心TALE支架的两部分之间。在另一个优选实施方案中，根据本发明的所述致密TALEN包含与选自SEQ ID NO:453至455的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
换言之，本发明的致密TALEN单体包含与选自SEQ ID NO:420至450和SEQID NO:452至455的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，可连接所述催化结构域与根据本发明方法的核心TALE支架的肽接头可选自：NFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1和1qu6A_1，如表3所列出的（SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:372至SEQ ID NO:415）。在一个更优选的实施方案中，可使所述催化结构域与根据本发明方法的核心TALE支架连接的肽接头可选自NFS1（SEQ ID NO:98）、NFS（SEQ ID NO:99）和CFS1（SEQ ID NO:100）。在本发明的范围中还包括了不需要肽接头使催化结构域与TALE支架融合以得到根据本发明的cTALEN的情况。
根据其结构组成[核心TALE支架的类型、与酶活性有关的催化结构域的类型以及最后的接头的类型]，根据本发明的致密TALEN可包含不同水平的独立酶活性，所述酶活性能够差异地加工DNA，导致对于所述致密TALEN的总体DNA加工效率，所述不同酶活性的每一种具有其自己的DNA加工效率。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的致密TALEN还包含：
（i）至少一个增强子结构域；
（ii）任选的一个肽接头，其使所述增强子结构域与所述致密TALEN活性实体的一部分融合；
从而得到在目的单一双链DNA靶标序列附近处具有增强的DNA加工效率的致密TALEN实体，即，增强的致密TALEN。
换言之，所述独特的致密TALEN单体还包含：
（i）至少一个增强子结构域；
（ii）任选的一个肽接头，其使所述增强子结构域与所述独特的致密TALEN单体活性实体融合。
在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域与所述致密TALEN实体的核心TALE支架部分的N端融合。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域与所述致密TALEN实体的核心TALE支架部分的C端融合。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域与所述致密TALEN实体的催化结构域部分融合。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域在核心TALEN支架的N端部分与所述致密TALEN实体的催化部分的之间融合。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域在核心TALEN支架的C端部分与所述致密TALEN实体的催化部分的之间融合。在本发明的范围中，可设想将所述催化结构域和/或增强子结构域插入到根据本发明的工程化的核心TALE支架的两部分之间，每部分包含一组RVD。在这后一种情况下，对于每种工程化的核心TALE支架的RVD数目可相同或不同。换言之，可设想分裂本发明的所述核心TALE支架以将一个催化结构域和/或一个增强子结构域插入到所得的所述工程化的核心TALE支架的两部分之间。
在另一个优选实施方案中，所述增强子结构域是催化活性的或非催化活性的，为所述致密TALEN实体提供了功能和/或结构支持。在一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域由选自以下的蛋白质结构域组成：蛋白质MmeI、大肠杆菌素-E7（CEA7_ECOLX）、大肠杆菌素-E9、APFL、EndA、Endo I（END1_ECOLI）、人Endo G（NUCG_HUMAN）、牛Endo G（NUCG_BOVIN）、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAAU）、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAHY）、微球菌核酸酶（NUC_SHIFL）、内切核酸酶yncB、内切脱氧核糖核酸酶I（ENRN_BPT7）、Metnase、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I（R.BspD6I大亚基）、ss.BspD6I（R.BspD6I小亚基）、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCI亚基1、BbvCI亚基2、Bpu10Iα亚基、Bpu10Iβ亚基、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、人DNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）和VP16，如表2中列出的（SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:1、366&367），其功能突变体、变体或衍生物。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域由以上和表2中所列的蛋白质结构域的催化活性衍生物组成，为所述致密TALEN实体提供了功能和/或结构支持。在另一个更优选的实施方案中，所述增强子结构域由以上和表2中所列的蛋白质结构域的非催化活性衍生物组成，为所述致密TALEN实体提供结构支持。在另一个优选实施方案中，所述增强子结构域选自I-TevI（SEQ ID NO:20）、ColE7（SEQ ID NO:11）和NucA（SEQ ID NO:26）。
在一个更优选的实施方案中，根据本发明的所述增强致密TALEN可包含第二增强子结构域。在该实施方案中，所述第二增强子结构域可与第一增强子结构域具有相同的特征。在一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域为增强的致密TALEN实体提供了结构支持。在另一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域为增强的致密TALEN实体提供了功能支持。在一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域为增强的致密TALEN实体提供了结构和功能支持。在一个更优选的实施方案中，所述增强的致密TALEN实体包含一个催化结构域和一个增强子结构域。在另一个更优选的实施方案中，所述增强的致密TALEN实体包含一个催化结构域和两个增强子结构域。在另一个更优选的实施方案中，所述增强的致密TALEN实体包含两个催化结构域和一个增强子结构域。在另一个更优选的实施方案中，所述增强的致密TALEN实体包含两个催化结构域和两个增强子结构域。
在一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域由来源于选自以下的蛋白质的蛋白质结构域组成：MmeI、大肠杆菌素-E7（CEA7_ECOLX）、大肠杆菌素-E9、APFL、EndA、Endo I（END1_ECOLI）、人Endo G（NUCG_HUMAN）、牛Endo G（NUCG_BOVIN）、R.HinP1I、I-BasI、I-BmoI、I-HmuI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、R.MspI、R.MvaI、NucA、NucM、Vvn、Vvn_CLS、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAAU）、葡萄球菌核酸酶（NUC_STAHY）、微球菌核酸酶（NUC_SHIFL）、内切核酸酶yncB、内切脱氧核糖核酸酶I（ENRN_BPT7）、Metnase、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I（R.BspD6I大亚基）、ss.BspD6I（R.BspD6I小亚基）、R.PleI、MlyI、AlwI、Mva1269I、BsrI、BsmI、Nb.BtsCI、Nt.BtsCI、R1.BtsI、R2.BtsI、BbvCI亚基1、BbvCI亚基2、Bpu10Iα亚基、Bpu10Iβ亚基、BmrI、BfiI、I-CreI、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、人DNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）和VP16，如表2中列出的（SEQ ID NO:10至SEQ IDNO:66和SEQ ID NO:1、366&367），这些蛋白质结构域的其功能突变体、变体或衍生物。在另一个更优选的实施方案中，所述第二增强子结构域由以上和表2中所列的蛋白质结构域的催化活性衍生物组成，为所述增强的致密TALEN实体提供了功能和/或结构支持。在另一个优选实施方案中，所述第二增强子结构域由以上和表2中所列的蛋白质结构域的非催化活性衍生物组成，为所述增强的致密TALEN实体提供了结构支持。
在另一个更优选的实施方案中，可设想以上所列的作为非限制性实例的催化结构域和/或增强子结构域的任意组合可与所述核心TALE支架融合，为所述致密TALEN实体提供结构和/或功能支持。更优选地，列于表14的催化结构域的组合。更优选地，可以设想选自以下的催化结构域的组合：TevI（SEQ ID NO:20）、ColE7（SEQ ID NO:11）和NucA（SEQ ID NO:26）。任选地，FokI（SEQ ID NO:368）可与根据表2列表的另一种催化结构域组合使用。关于用于使用本发明方法，可设想催化结构域和/或增强子结构域这样的组合。
根据其结构组成[核心TALE支架的类型、与酶活性有关的催化结构域的类型、接头的类型和增强子结构域的类型]，根据本发明的增强致密TALEN可呈现出差异性加工DNA的独立酶活性的不同水平，导致对于所述增强致密TALEN的总体DNA加工效率，所述不同酶活性的每一种具有其自己的DNA加工效率。
在该优选的实施方案中，根据本发明的致密TALEN实体的DNA加工效率可通过工程化至少一个增强子结构域和一个肽接头来增强，从而得到在目的单一双链DNA靶标序列附近具有增强DNA加工活性的致密TALEN实体，即，根据本发明的增强致密TALEN。
根据其结构组成，根据本发明的所述增强致密TALEN中增强的总体DNA加工效率可具有作为非限制性实例的选自以下的主要酶活性：核酸酶活性、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在一个更优选的实施方案中，根据本发明的所述增强致密TALEN中增强的总体DNA加工效率是作为非限制性实例的选自以下的不同酶活性的组合：核酸酶活性、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在一个更优选的实施方案中，根据本发明的所述增强致密TALEN中增强的总体DNA加工效率是作为非限制性实例的选自以下的其不同酶活性之一：核酸酶活性、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在这种情况下，总体DNA加工效率等同于上述酶活性中的一种DNA加工活性。在另一个更优选的实施方案中，通过增强子增强的致密TALEN实体的所述DNA加工活性是切割酶活性或切口酶活性或切割酶活性和切口酶活性二者的组合。
根据本发明的致密TALEN实体的DNA加工效率的增强可以是由至少一个增强子结构域提供的结构支持的结果。在一个优选实施方案中，与初始致密TALEN实体对所述DNA靶标序列的结合相比，所述结构支持增强了根据本发明的致密TALEN实体对相同DNA靶标序列的结合，从而间接地协助催化结构域以得到具有增强DNA加工活性的致密TALEN实体。在另一个优选实施方案中，与初始致密TALEN实体对所述DNA靶标序列的结合相比，所述结构支持增强了致密TALEN实体对相同DNA靶标序列的现有催化活性。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的所述增强子增强了致密TALEN实体对所述DNA靶标序列的结合以及催化结构域催化活性二者以得到具有增强DNA加工活性的致密TALEN实体。所有的这些非限制性实例导致在目的基因组基因座处对DNA靶标序列具有增强DNA加工效率的致密TALEN实体，即，根据本发明的增强致密TALEN。
与初始致密TALEN实体相比，根据本发明的致密TALEN实体的DNA加工效率的增强也可以是由至少一个增强子结构域提供的功能支持的结果。在一个优选实施方案中，所述功能支持可以是另外的磷酸二酯键水解的结果。在一个更优选的实施方案中，所述功能支持可以是由来源于核酸酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。在一个更优选的实施方案中，所述功能支持可以是由来源于内切核酸酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。在一个更优选的实施方案中，所述功能支持可以是由来源于切割酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。在另一个更优选的实施方案中，所述功能支持可以是由来源于切口酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。在一个更优选的实施方案中，所述功能支持可以是由来源于外切核酸酶的蛋白质结构域对另外的磷酸二酯键的水解。
在基因组工程化的实验中，罕见切口内切核酸酶的效率，例如，其在基因座处诱导期望事件（同源基因靶向、靶向诱变、序列移除或切除）的能力，取决于几个参数，包括核酸酶的特异性活性，可能的靶标的可接近性，以及导致期望事件（用于基因靶向的同源修复，用于靶向诱变的NHEJ途径）的修复事件的效率和后果。
肽罕见切口内切核酸酶的切割通常生成用于LAGLIDADG兆核酸酶的3’悬垂端的粘性末端（Chevalier和Stoddard2001）和用于锌指核酸酶的5’悬垂端的粘性末端（Smith,Bibikova等.2000）。由磷酸二酯键水解产生的这些末端可通过NHEJ以无缝方式（即，无痕重新连接）在体内重新连接。可切割靶标序列的修复允许通过相同内切核酸酶的新切割事件，并因此可发生切割和重新连接事件的一系列无效循环。间接证据表明，即使在酵母菌酿酒酵母中，这样的循环可在HO内切核酸酶的连续切割后发生（Lee,Paques等.1999）。在哺乳动物细胞中，几个实验已表明，由两个独立却靠近的I-SceI诱导DSB产生的相容性粘性末端的完美重新连接是有效过程（Guirouilh-Barbat,Huck等.2004;Guirouilh-Barbat,Rass等.2007;Bennardo,Cheng等.2008;Bennardo,Gunn等.2009）。Ku DNA修复蛋白质的不存在不显著地影响使来自两个DSB末端重新连接的NHEJ事件的总体频率；但是，在CHO永生化细胞和小鼠ES细胞中，其非常大地增强不精确NHEJ对修复过程的贡献（Guirouilh-Barbat,Huck等.2004;Guirouilh-Barbat,Rass等.2007;Bennardo,Cheng等.2008）。而且，在小鼠ES细胞中，Ku的不存在刺激I-SceI诱导事件，例如不精确NHEJ（Bennardo,Cheng等.2008）、单链退火（(Bennardo,Cheng等.2008）和基因转化（Pierce,Hu等；Bennardo,Cheng等.2008）。在XRCC4修复蛋白质缺陷的细胞（Pierce,Hu等.2001;Guirouilh-Barbat,Rass等.2007;Bennardo,Gunn等.2009）（但是XRCC4缺陷影响CHO细胞中NHEJ的总水平（Guirouilh-Barbat,Rass等.2007）或DNA-PK缺陷的细胞（Pierce,Hu等.2001）中获得类似的观察到。相反地，CtIP的敲除已显示出抑制“alt-NHEJ”（更易于导致不精确NHEJ的NHEJ的Ku和XRCC4独立形式）、单链退火和基因转化，并且不影响由I-SceI生成的两个相容性末端重新连接的总体水平（Bennardo,Cheng等.2008）。因此，不同DSB修复途径之间的竞争可影响由核酸酶诱导DSB导致的谱图或修复事件。
此外，DSB切除对于某些DSB途径是重要的。导致生成大的单链区域（至少几百个核苷酸）的广泛DSB切除在酵母中显示启动单链退火（Sugawara和Haber1992）、链侵入、通过同源链启动DNA双链侵入的许多同源重组事件的ATP依赖性步骤（White和Haber1990;Sun,Treco等.1991）（对于机制的综述，参见（Paques和Haber1999））。在真核细胞中，DSB切除取决于一些蛋白质，包括BLM/Sgs1和DNA2、EXOI和MRN复合物（Mre11、Rad50、Nbs1/Xrs2）并且认为由不同途径导致。小范围切除过程中涉及MRN，而广泛切除中涉及两种冗长的途径，其在一方面取决于BLM和DNA2并且在另一方面取决于EXOI（Mimitou和Symington2008;Nimonkar,Genschel等.2011）。此外，参与损伤核苷酸的加工末端（由化学切割或大块加合物产生）需要CtIP/Sae2蛋白质以及RMN（Sartori,Lukas等.2007;Buis,Wu等.2008;Hartsuiker,Mizuno等.2009）。Trex2外切核酸酶的过度表达显示强烈刺激与仅几个碱基对缺失有关的不完美NHEJ（Bennardo,Gunn等.2009），同时其抑制远距离序列之间多种类型的DNA修复事件（例如，单链退火、来自不同断裂的末端之间的NHEJ、或涉及远程微同源的单一DSB的NHEJ修复）。在相同研究中，提议Trex2确实通过I-SceI以非进行方式切除3’悬垂端。因此，刺激途径的类型可进而取决于切除的类型（切除长度、单链与双链、5’链与3’链的切除）。
因此，致密TALEN的效率，例如，其产生期望事件如靶向诱变或同源基因靶向的能力（参见完整定义“致密TALEN的效率”的定义），可通过增强或修饰其总体DNA加工效率来增强（参见完整定义“总体DNA加工效率”的定义），例如，所述致密TALEN不同的独立的酶活性的总体结果或总结果。
在一个优选实施方案中，与初始致密TALEN实体相比，增强根据本发明的致密TALEN实体的总体DNA加工效率可以是水解切割位点处另外的磷酸二酯键。
通过根据本发明的所述至少一个增强子在切割位点处进行另外的磷酸二酯键的所述水解可导致不同类型的DSB切除，在所述DSB切割位点处影响一条单DNA链或两条DNA链，影响5’悬垂末端、3’悬垂末端或两个末端并且取决于所述切除的长度。因此，向致密TALEN实体的现有切割酶活性添加新切口酶或切割酶活性可在目的基因组基因座处增强根据本发明的所得增强致密TALEN的效率（图8B至8E）。作为非限制性实例，在相反链上添加两个切口酶活性（图8D）或添加生成第二DSB的新切割酶活性（图8E）可导致双链缺口。因此，不再可能发生完美的重新连接，并且可刺激一个或几个替代修复结果，例如，不精确NHEJ、同源重组或SSA。作为另一个非限制性实例，添加单一切口酶活性可导致单链缺口，并且抑制末端的粘结，还可通过刺激上述的一个或几个替代修复结果增强根据本发明所得的增强致密TALEN在目的基因组基因座处的效率。
在本发明的该方面中，致密TALEN的DNA加工效率增强指与第一致密TALEN对靶DNA序列的活性相比，致密TALEN对相同靶标DNA序列的所述DNA加工效率的检测水平增加。所述第一致密TALEN可以是初始致密TALEN或已被工程化的致密TALEN或根据本发明的增强致密TALEN。可由初始致密TALEN或由初始增强致密TALEN设想几轮的增强。
在本发明的该方面中，致密TALEN实体（或增强致密TALEN）的DNA加工效率增强指与第一致密TALEN或初始致密TALEN对靶标DNA序列或靶标DNA序列附近的效率相比，针对相同目的靶标DNA序列或所述目的DNA序列附近的所述DNA加工效率的检测水平增加。在该情况下，初始致密TALEN认为是测量DNA加工效率的参照支架。所述增强致密TALEN是包含根据本发明该方面的增强子结构域的工程化的致密TALEN。所述增强致密TALEN也可被认为是用于进一步增强所述DNA加工效率的参照支架。作为非限制性实例，所述DNA加工效率可由通过所述增强致密TALEN产生的切割诱导的重组导致。在该情况下，切割诱导的重组的所述水平可例如通过如国际PCT申请2004/067736所述的基于细胞的重组测定来确定。重要的是，细胞中效率的增强（靶向诱变或靶向重组的增强产生）可以但不一定与在某些体外测定中可检测到的切割活性的增强有关。例如，如图8所述的另外的磷酸二酯酶活性几乎不影响切割规律，如通过体外切割和电泳凝胶上切割产物的分离检测到的。然而，如上所解释的，在图8的图例中，以该方式生成的DSB末端可更易于诱导可检测的基因组重排，例如靶向诱变（通过不精确NHEJ）或同源重组。与初始支架或初始致密TALEN相比，所述增强致密TALEN的切割诱导的重组的所述增强为至少5%的增强，更优选至少10%的增强，更优选至少15%的增强，更优选至少20%的增强，更优选至少25%的增强，更优选50%的增强，更优选大于50%的增强，导致与初始支架或初始致密TALEN相比，所述增强致密TALEN的DNA加工效率有至少5%的增强，更优选至少10%的增强，更优选至少15%的增强，更优选至少20%的增强，更优选至少25%的增强，更优选50%的增强，更优选大于50%的增强。
在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，可使所述增强子结构域与根据本发明方法的所述致密TALEN实体的一部分连接的肽接头可选自NFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1和1qu6A_1，如表3所列出（SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:372至SEQ ID NO:415）。在一个更优选的实施方案中，可使所述增强子结构域与根据本发明方法的所述致密TALEN实体的一部分连接的肽接头可选自NFS1（SEQ IDNO:98）、NFS2（SEQ ID NO:99）和CFS1（SEQ ID NO:100）。在本发明范围中还包括其中不需要使一个增强子结构域与所述致密TALEN实体一部分融合的肽接头以得到根据本发明的增强致密TALEN。
根据其结构组成[核心TALE支架的类型、与酶活性有关的催化结构域的类型、增强子的类型和最终的接头的类型]，根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN可包含能够差异性加工如上所述DNA的独立酶活性的不同水平。与初始致密TALEN或增强致密TALEN相比，通过向所述致密TALEN或所述增强致密TALEN添加新酶活性或者增强其构成酶活性的一种或几种的DNA加工效率，可增强一种致密TALEN或增强致密TALEN的总体DNA加工效率。
根据本发明，致密TALEN设计成减弱当靶向DNA加工事件时对多个独立蛋白质部分的需要。重要的是，对于当前的TALEN功能必不可少的“间隔物”区和双靶标位点的需要是不必要的，因为根据本发明的致密TALEN包含仅含有一个DNA结合结构域的核心TALE支架，所述的DNA结合结构域靶向特异的目标单一双链DNA靶标序列，并加工所述目标单一双链DNA靶标序列附近的DNA。因为核心TALE支架的每个末端经历融合，所以催化结构域和增强结构域的添加顺序（N端与C端）可随应用改变。此外，因为催化结构域不需要特定的DNA接触，所以对于围绕核心TALE支架的区域没有限制，如图5所述的非限制性实例：（A）促进由切割酶结构域或由切口酶结构域诱导的同源重组的N端融合构建体。（B）具有如（A）中的性质的C端融合构建体。（C）两个催化结构域附加至核心TALE支架的两末端，允许NHEJ中增强的双切割。融合连接（N端与C端）和接头设计可随应用改变。
根据本发明，可通过添加结构域以促进现有或替代活性来增强致密TALEN，如图6所述的非限制性实例：（A）具有增强子结构域与其核心TALE支架部分的C端融合的标准致密TALEN。（B）增强子结构域与致密TALEN通过其催化结构域部分的N端融合。这样的构造可用于帮助和/或锚定DNA附近的催化结构域部分以增加DNA加工活性。（C）增强子结构域夹在催化结构域部分与核心TALE支架部分之间。增强子结构域可促进旁侧结构域之间的信号传递（即，有助于催化和/或DNA结合）或者可用于克服在所有基于TALE靶标的位置-1处需要的T核苷酸。（D）增强子结构域用于功能性替换工程化的核心TALE支架N端区域。（E）增强子结构域用于功能性替换工程化的核心TALE支架C端区域。融合连接（N端与C端）和接头设计可随应用改变。
根据本发明，致密TALEN和增强致密TALEN中包含的催化结构域的性质依赖于应用。作为非限制性实例，切口酶结构域应允许比切割酶结构域更高的HR/NHEJ比，从而更适合于治疗应用（McConnell Smith,Takeuchi等.2009;Metzger,McConnell-Smith等.2011）。例如，切割酶结构域在一侧的偶联与切口酶结构域在另一侧的偶联可导致跨越致密TALEN结合区的DNA单链切除。延长单链悬垂端的靶向生成可用于靶向DNA修复机制的应用。对于靶向基因失活，则优选使用两个切割酶结构域。在另一个优选实施方案中，使用两个切口酶结构域可以是有利的。此外，本发明涉及用于生成可用于从靶向DNA切割至靶向基因调节的应用范围的几种不同类型致密TALEN的方法。
本发明还涉及将根据本发明的所述致密TALEN用于范围从靶向DNA切割到靶向基因调节的多种应用的方法。在一个优选实施方案中，本发明涉及用于在根据本发明的靶向DNA靶标序列的致密TALEN中促进双链断裂时，增加靶向HR（和NHEJ）的方法。在另一个更优选的实施方案中，添加根据本发明的至少两个催化活性切割酶增强子结构域允许通过引起遗传信息丧失和通过NHEJ防止靶向目的基因组基因座的任何无痕重新连接增加双链断裂诱导的诱变。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及用于在根据本发明的靶向DNA靶标序列的致密TALEN中促进单链断裂活性时增加具有较少NHEJ（以更保守的形式）的靶向HR的方法。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及用于在一个切割酶增强子结构域和一个切口酶增强子结构域均分别与根据本发明的核心TALE支架的N端和C端两端融合时，增加跨越致密TALEN结合区的DNA单链的切除的方法。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及用于治疗由基因中特定单一双链DNA靶标序列中的突变造成的遗传疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的致密TALEN的变体。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及用于将转基因插入到细胞、组织或非人动物或植物的基因组基因座的特定单一双链DNA靶标序列中的方法，其中本发明的至少一个致密TALEN瞬时引入到或未引入到所述细胞、组织、非人动物或植物中。
在另一个实施方案中，本发明涉及当在细胞中表达时调控所述致密TALEN的活性的方法，其中所述方法包括将调控所述致密TALEN活性的辅助结构域引入到所述细胞中的步骤。在一个优选实施方案中，本发明涉及允许在细胞中表达时暂时控制致密TALEN活性的方法，其通过一旦所述致密TALEN实现其活性（DNA切割、DNA切口形成或其他DNA加工活性）后就将调控所述致密TALEN活性的辅助结构域引入所述细胞中。在一个优选实施方案中，本发明涉及抑制在细胞中表达时的致密TALEN活性的方法，其中所述方法包括将抑制所述致密TALEN活性的辅助结构域引入到所述细胞中的步骤。在一个更优选的实施方案中，所述致密TALEN的催化结构域是NucA（SEQ ID NO:26），并且所述辅助结构域是NuiA（SEQ ID NO:229）及其功能突变体、变体或衍生物。在另一个更优选的实施方案中，所述致密TALEN的催化结构域是ColE7（SEQ ID NO:11），并且所述辅助结构域是Im7（SEQ ID NO:230）及其功能突变体、变体或衍生物。
本发明的范围中还包括编码根据本发明的致密TALEN、双致密TALEN或增强致密TALEN的重组多核苷酸。本发明的范围中还包括包含编码根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN的重组多核苷酸的载体。
本发明的范围中还包括包含编码根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN的载体和/或重组多核苷酸的宿主细胞。
本发明的范围中还包括包含编码根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN的载体和/或重组多核苷酸的非人转基因植物。
本发明的范围中还包括包含编码根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN的载体和/或重组多核苷酸的转基因植物。
本发明还涉及用于实施根据本发明的方法的试剂盒。更优选地，本发明的范围中包括包含根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN的试剂盒和将所述试剂盒用于增强目的单一双链DNA靶标序列的DNA加工效率的说明书。
为了治疗目的，本发明的致密TALEN和可药用赋形剂以治疗有效量施用。如果施用量是生理学显著的，则认为这样的组合以“治疗有效量”施用。如果药剂的存在导致受体生理机能可检测的变化，则所述药剂是生理学显著的。在本文上下文中，如果药剂的存在导致靶向疾病的一种或更多种症状严重程度降低以及导致损伤或异常的基因组修正，则认为药剂是生理学显著的。可通过多种方法（例如，注射、直接摄入、炮弹轰击（projectile bombardment）、脂质体、电穿孔）将包含编码致密TALEN的靶向DNA和/或核酸的载体引入到细胞中。施用表达载体可使致密TALEN稳定或瞬时地表达在细胞中。在真核细胞中表达的技术是本领域技术人员所公知的（参见Current Protocols in Human Genetics:第12章“Vectors ForGene Therapy”&帝13章“Delivery Systems for Gene Therapy”）。
在本发明的另一个方面中，本发明的致密TALEN是基本非免疫原性的，即，产生很少或不产生不利的免疫应答。根据本发明可使用用于减弱或消除这类有害免疫反应的多种方法。在一个优选实施方案中，致密TALEN基本不含N-甲酰基甲硫氨酸。避免不需要的免疫反应的另一种方法是使致密TALEN与聚乙二醇（“PEG”）或聚丙二醇（“PPG”）（优选平均分子量（MW）为500至20,000道尔顿）缀合。与PEG或PPG缀合，例如如Davis等（US4,179,337）所述的，可提供具有抗病毒活性的非免疫原性的、生理学活性的、水溶性致密TALEN缀合物。Saifer等（US5,006,333）中描述了还使用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物的类似方法。
在本发明的另一方面中是包含载体和根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN的组合物。更优选地，是包含根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN和现有技术水平已知的药学活性载体的药物组合物。
在本发明的范围中并且对于上面提到的所有应用，可设想使用多于一个的致密TALEN（即，一个致密TALEN活性实体）或多于一个的增强致密TALEN（即，一个增强致密TALEN活性实体）用于根据本发明的DNA加工。在一个优选实施方案中，可使用两个不同的致密TALEN或两个增强致密TALEN。在该实施方案中，作为非限制性实例，所述两个不同的致密TALEN可包含相同或不同的核心TALE支架；所述两个不同的致密TALEN可包含相同组或不同组的重复可变二肽；所述两个不同的致密TLAEN可包含相同或不同的催化结构域。当两个相同的致密TLAEN活性实体用于根据本发明的DNA加工时，它们可被认为是致密TALEN活性实体的同二聚体对。当两个不同的致密TALEN活性实体用于根据本发明的DNA加工时，它们可被认为是致密TALEN活性实体的异二聚体对。作为非限制性实例，当使用根据本发明的两个致密TALEN时，致密TALEN之一可调控另一个的活性，导致例如与仅通过一个致密TALEN实现的相同DNA加工事件相比，增强的DNA加工事件；在该非限制性实例中，Trans-TALEN调控并增强初始致密TALEN的催化活性。
在另一个优选实施方案中，可使用三个致密TALEN或三个增强致密TALEN。在另一个优选实施方案中，多于三个的致密TALEN或三个增强致密TALEN可用于根据本发明的DNA加工。在另一个优选实施方案中，致密TALEN和增强致密TALEN的组合可用于根据本发明的DNA加工。作为非限制性实例，可使用一个致密TALEN和一个增强致密TALEN。作为另一个非限制性实例，可使用一个致密TALEN和一个双切割致密TALEN。在另一个优选实施方案中，可使用致密TALEN、增强致密TALEN和双切割致密TALEN的组合，所述致密TALEN包含相同或不同的催化结构域，相同或不同的核心TLAE支架。当不得不使用几个致密TALEN时，待使用组合的每个致密TALEN的DNA靶标序列可位于相同或不同的内源性目的基因组DNA基因座上。所述DNA靶标序列可位于1000碱基对（bps）的近似距离处。更优选地，所述DNA靶标序列可位于500bps或200bps、或100bps、或50bps、或20bps、19bps、18bps、17bps、16bps、15bps、14bps、13bps、12bps、11bps、10bps、9bps、8bps、7bps、6bps、5bps、4bps、3bps、2bps、1bp的近似距离处。位于上述距离处的所述DNA靶标序列是参照用于根据本发明的DNA加工的靶标DNA序列的“附近”DNA序列。
在另一个优选实施方案中，可使用两个致密TALEN活性实体作为实现在根据本发明的DNA靶标序列附近的两种不同DNA加工活性的一种方法。作为非限制性实例，可使用靶向所述DNA序列或在所述靶向DNA序列附近的DNA序列并且每一个均包含切口酶源催化结构域的两个致密TALEN；与使用靶向所述DNA序列并且包含或不包含切割酶源催化结构域的一个致密TALEN相比，在该情况下，这种使用两个致密TALEN活性实体可代表在所述DNA靶标序列附近实现双链断裂的替代方法。作为另一个非限制性实例，可使用包含切割酶源结构域的一个致密TALEN和包含外切核酸酶源结构域的一个致密TALEN分别产生双链断裂和产生切口，从而在包含所述DNA靶标序列的目的基因组基因座处实现不精确NHEJ事件。在这种情况下，即使形成该致密TALEN异二聚体对的每个致密TALEN自身是有活性的，但是这些活性实体中的每一个都需要依赖于彼此以实现需要的结果DNA加工活性。的确，在这种特殊情况下，需要的结果活性是通过外切核酸酶活性产生切口，所述外切核酸酶活性可靠仅来自于通过其他致密TALEN的切割酶结构域实现的双链断裂。在本发明的范围中，还设想其中两个相同致密TALEN活性实体（致密TALEN的同二聚体对）彼此依赖以实现需要的结果DNA加工活性的情况。
定义
–多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母码定名，其中，例如，Q意指Gln或谷氨酰胺残基，R意指Arg或精氨酸残基，D意指Asp或天冬氨酸残基。
–氨基酸替换意指将一个氨基酸残基置换为另一个氨基酸，例如，将肽序列中的精氨酸残基置换为谷氨酰胺残基是氨基酸替换。
–增强/增加/提高的DNA加工活性指，与第一致密TALEN或增强致密TALEN针对靶DNA序列的活性相比，给定的致密TALEN或增强致密TALEN相关DNA加工活性针对靶DNA序列或DNA靶标序列的检测活性通过第二致密TALEN或增强致密TALEN的增加。第二致密TALEN或增强致密TALEN可以是第一致密TALEN的变体，并且与第一致密TALEN或增强致密TALEN相比可包含一个或更多个替换氨基酸。第二致密TALEN或增强致密TALEN可以是第一致密TALEN的变体，并且与所述第一致密TALEN或增强致密TALEN相比可包含一个或更多个催化结构域和/或增强子结构域。该定义更广泛地适用于其他内切核酸酶和罕见切口内切核酸酶。
–DNA加工活性指所述致密TALEN或增强致密TALEN的特殊/给定酶活性或者更广泛地指限定罕见切口内切核酸酶的酶活性。所述DNA加工活性可指切割活性（切割酶活性或切口酶活性），更广泛地指核酸酶活性，但是也指作为非限制性实例的聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。在本定义的范围中，特殊酶活性的所述给定DNA加工活性也可描述为所述特殊酶活性的DNA加工效率。根据该定义的用于增强致密TALEN或增强致密TALEN DNA加工活性的方法包括在本发明中。
–对于根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN，总体DNA加工效率描述了所述致密TALEN或增强致密TALEN可包含的不同独立的酶活性的总体结果或总作用。根据这些不同独立的酶活性，致密TALEN或增强致密TALEN呈现出加工目的基因组基因座中靶标序列附近的DNA的总体能力，即，总体DNA加工效率。与第一给定致密TALEN或增强致密TALEN相比，所述总体DNA加工效率可限定或归类为第二给定致密TALEN或增强致密TALEN。根据所述致密TALEN或增强致密TALEN结构组成[核心TALE支架的类型，与酶活性有关的催化结构域的类型，最后的接头的类型和增强子结构域的类型]，所述总体DNA加工效率可指仅一种酶活性、两种酶活性、三种酶活性、四种酶活性或多于四种的酶活性。所述总体DNA加工效率可指单个酶活性的总和。所述总体DNA加工效率可指给定致密TALEN或增强致密TALEN中所含不同酶活性的协同作用或组合作用。根据本发明的致密TALEN的DNA加工效率的增强可反映出协同作用、增强的组合作用，产生了增强致密TALEN，所述增强致密TALEN的特征在于，总体DNA加工效率大于单独的初始致密TALEN各自的DNA加工效率的总和，或者大于相同初始致密TALEN中所含的单独的酶活性各自的DNA加工效率的总和。
–根据本发明的罕见切口内切核酸酶的效率是所述罕见切口内切核酸酶产生期望事件的性质。该期望事件可以是例如同源基因靶向、靶向诱变、或序列移除或切除。期望事件的效率取决于几个参数，包括核酸酶的特异性活性和导致期望事件的修复途径（同源修复用于基因靶向的效力，NHEJ途径用于靶向右边的效力和结果）。罕见切口内切核酸酶用于基因座的效率旨在意指其在该基因座处产生期望事件的能力。罕见切口内切核酸酶用于靶标的效率旨在意指其作为切割该靶向之结果产生期望事件的能力。
–核苷酸如下定名：单字母码用于给核苷酸的碱基定名：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶并且g是鸟嘌呤。对于兼并核苷酸，r表示g或a（嘌呤核苷酸），k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c（嘧啶核苷酸），d表示g、a或t，v表示g、a或c，b表示g、t或c，h表示a、t或c，并且n表示g、a、t或c。
–“兆核酸酶”指具有大于12bp的双链DNA靶标序列的罕见切口内切核酸酶亚型。所述兆核酸酶是二聚体酶，其中每个结构域是在单一多肽上包含两个结构域的单体或单体酶。
–“兆核酸酶结构域”指这样的区域：其与兆核酸酶的DNA靶标的一半相互作用，并且能够与相同兆核酸酶的另一个结构域结合，与DNA靶标的另一半相互作用以形成能够切割所述DNA靶标的功能性兆核酸酶。
–“内切核酸酶变体”、“罕见切口内切核酸酶变体”、“嵌合罕见切口内切核酸酶变体”或“兆核酸酶变体”或“致密TALEN变体”或“增强致密TALEN变体”或“双切割致密TALEN变体”或“变体”指通过将亲本内切核酸酶、罕见切口内切核酸酶、嵌合罕见切口内切核酸酶、兆核酸酶或致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN的氨基酸序列中的至少一个残基替换为至少另一个氨基酸的内切核酸酶、罕见切口内切核酸酶、嵌合罕见切口内切核酸酶、兆核酸酶、或致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN。“变体”命名也适用于例如与起始致密TALEN实体相比包含至少一个补充蛋白质结构域（催化结构域或增强子结构域）的增强致密TALEN。本发明的范围中还包括变体和包含在这些变体中的蛋白质结构域，所述变体表示与根据本发明的致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN或蛋白质结构域和多肽的序列在核苷酸或多肽水平上具有高百分比同一性或高百分比同源性的序列。高百分比同一性或高百分比同源性指60%，更优选70%，更优选75%，更优选80%，更优选85%，更优选90%，更优选95，更优选97%，更优选99%或在60%与99%之间所含的任何整数。
–“肽接头”或“肽间隔物”旨在意指这样的肽序列：其允许融合蛋白质中不同单体连接并且采用对于所述融合蛋白质活性的正确构象，并且不改变单体中任一种对其靶标的特异性。肽接头可以为不同大小，作为非限制性指示范围的3个氨基酸酯50个氨基酸。肽接头也可被结构化或非结构化。
–“与......有关”，特别是在表达“与所选择细胞类型或生物体有关的一种细胞类型”中，指与所述所选择细胞类型或所述所选择生物体共有特征的细胞类型或生物体。与所选择细胞类型或生物体有关的该细胞类型或生物体可来源于或不来源于所述所选择细胞类型或生物体。
–“子结构域”指与LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域中归巢内切核酸酶DNA靶标半位点的不同部分相互作用的区域。
–“靶向DNA构建体/最小修复基质/修复基质”旨在意指包含与原位DNA靶标的区域5’和3’同源的第一和第二部分的DNA构建体。DNA构建体还包含定位在第一和第二部分之间的第三部分，所述第三部分与对应的原位DNA序列包含一些同源性，或者替代地与原位DNA靶标的区域5’和3’没有同源性。在切割DNA靶标之后，在包含在目的基因座中所含靶向基因的基因组与修复基质之间刺激同源重组事件，其中包含DNA靶标的基因组序列被替换为修复基质的第三部分以及修复基质第一和第二部分的可变部分。
–“功能性变体”指蛋白质的催化活性变体，这样的变体与其亲本蛋白质相比可具有另外的性质。作为非限制性实例，兆核酸酶的功能性变体可能够切割DNA靶标序列，优选地所述靶标是亲本兆核酸酶不切割的新靶标。该定义也适用于致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN或构成根据本发明的这种TALEN的蛋白质结构域。本定义的范围中还包括这些分子中所含的功能性变体、多肽和蛋白质结构域，其表示与根据本发明的致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN或蛋白质结构域和多肽的序列在核苷酸或多肽水平上具有高百分比同一性或高百分比同源性的序列。高百分比同一性或高百分比同源性指60%，更优选70%，更优选75%，更优选80%，更优选85%，更优选90%，更优选95，更优选97%，更优选99%或在60%与99%之间所含的任何整数。
–“来源于”或“衍生物”旨在意指例如由亲本兆核酸酶产生的兆核酸酶变体，因此兆核酸酶变体的肽序列与亲本兆核酸酶的肽序列有关（一级序列水平），但是来源于其（突变）。在该定义中很难过，突变包括几个氨基酸残基的缺失或插入；作为非限制性实例，I-CreI兆核酸酶的截短变体认为是来源于I-CreI兆核酸酶的支架。该定义也适用于致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN或构成根据本发明的这种TALEN的蛋白质结构域。本定义的范围中还包括根据本发明的致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN或蛋白质结构域的衍生物和多肽的衍生物，其表示与根据本发明的致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN或蛋白质结构域和多肽的序列在核苷酸或多肽水平上具有高百分比同一性或高百分比同源性的序列。高百分比同一性或高百分比同源性指60%，更优选70%，更优选75%，更优选80%，更优选85%，更优选90%，更优选95，更优选97%，更优选99%或在60%与99%之间所含的任何整数。
–“I-CreI”指具有pdb登录代码1g9y的序列的野生型I-CreI，对应于序列列表中的序列SEQ ID NO:1。在本专利申请中，所述的I-CreI变体可在野生型I-CreI序列（SEQ ID NO:1）的第一甲硫氨酸之后包含另外的丙氨酸。这些变体还可在野生型I-CreI序列的最后的脯氨酸之后包含两个另外的丙氨酸残基和一个天冬氨酸残基，如SEQ ID NO:106所示。这些另外的残基不影响酶的性质，并且为了避免混淆，这些另外的残基不影响本文所提及的I-CreI或变体中残基的编号，因为这些标记仅指如存在于变体中的野生型I-CreI酶（SEQ ID NO:1）的残基，所以例如I-CreI的残基2事实上是在第一甲硫氨酸之后包含另外的丙氨酸的变体的残基3。
–具有新特异性的致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN指具有不同于其各自的亲本致密TALEN、增强致密TALEN、双切割致密TALEN的切割靶标类型的切割靶标类型的这些蛋白质的变体。意义相同并且无差别使用的术语“新特异性”、“修饰特异性”、“新切割特异性”、“新底物特异性”指变体对DNA靶标序列的核苷酸的特异性。
–“I-CreI位点”指被I-CreI切割的22至24bp的双链DNA序列。I-CreI位点包括野生型非回文I-CreI回归位点和衍生的回文序列，例如序列5’-t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12（SEQ ID NO:2），也称为C1221或C1221靶标。
–“结构域”或“核心结构域”指“LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域”，它是LAGLIDADG家族中归巢内切核酸酶的特征性αββαββα折叠，对应于约一百个氨基酸残基的序列。所述结构域包含以反平行β片折叠的四个β链（β1β2β3β4），其与DNA靶标的一般相互作用。该结构域能够与另一个LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域缔合，与DNA靶标的另一半相互作用以形成能够切割所述DNA靶标的功能性内切核酸酶。例如，在二聚体归巢内切核酸酶I-CreI（163个氨基酸）的情况下，LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域对应于残基6至94。
–“β发夹”指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域的反平行β片的两条连续的β链（β1β2或β3β4），其通过环或回转连接。
–“单链兆核酸酶”、“单链嵌合兆核酸酶”、“单链兆核酸酶衍生物”、“单链嵌合兆核酸酶衍生物”或“单链衍生物”指包含通过肽间隔物连接的两个LAGLIDADG归巢内切核酸酶结构域或核心结构域的兆核酸酶。单链兆核酸酶能够切割包含每个亲本兆核酸酶靶标序列的不同一半的嵌合DNA靶标序列。
–“DNA靶标”、“DNA靶标序列”、“靶DNA序列”、“靶标序列”、“靶位点”、“靶标”、“位点”、“目的位点”、“识别位点”、“多核苷酸识别位点”、“识别序列”、“归巢识别位点”、“归巢位点”、“切割位点”指被识别并且可被LAGLIDADG归巢内切核酸酶（例如I-CreI、或变体、或来源于I-CreI的单链嵌合兆核酸酶）切割的双链的回文、部分回文（假回文）或非回文多核苷酸序列。当在基因组序列中被识别并且已知对应于给定内切核酸酶、罕见切口内切核酸酶、嵌合罕见切口内切核酸酶或兆核酸酶的DNA靶标序列时，所述DNA靶标序列可有资格被内切核酸酶、罕见切口内切核酸酶、嵌合罕见切口内切核酸酶或兆核酸酶“切割”。这些术语指特定的DNA位置，优选值基因组位置，但是也指可独立存在为遗传材料主体的遗传材料的一部分，例如作为非限制性实例的质粒、游离体、病毒、转座子，或者在细胞器中例如是线粒体或叶绿体，在此处可通过内切核酸酶、切口罕见内切核酸酶、嵌合罕见切口内切核酸酶或兆核酸酶诱导双链断裂（切割）。对于罕见切口内切核酸酶的LAGLIDADG亚家族，DNA靶标通过双链多核苷酸一条链的5’至3’序列限定，如以上对于C1221（SEQ ID NO:2）所述的。DNA靶标切割可发生在位置+2和-2的核苷酸处，分别对应于正义和反义链。除非另有说明，否则I-CreI源变体切割DNA靶标可发生的位置对应于DNA靶标正义链上的切割位点。在致密TALEN（嵌合罕见切口内切核酸酶的子类）的特殊情况下，以下表达“DNA靶标”、“DNA靶标序列”、“靶DNA序列”、“靶标序列”、“靶位点”、“靶标”、“位点”、“目的位点”、“识别位点”、“多核苷酸识别位点”和“识别序列”可适用于限定具有以下特质的其特定的DNA靶标序列：由根据本发明的致密TALEN识别的所述特定DNA靶标序列是或不是由致密TALEN加工和/或切割的DNA靶标序列。根据本发明的致密TALEN、增强致密TALEN或双切割致密TALEN可加工和/或切割所述特定DNA靶标序列中的DNA。致密TALEN、增强致密TALEN或双切割致密TALEN也可加工和/或切割所述特定DNA靶标序列外侧的DNA。
–“所述特定DNA靶标序列附近的DNA”或“附近的DNA”指位于所述特定DNA靶标序列中或外侧的DNA序列。其还指在所述特定DNA靶标序列位置处与致密TALEN或增强致密TALEN绑定的DNA序列或位于在5’或3’距离所述特定DNA靶标序列1至100个碱基对（bp）、1至50个碱基对（bp）或1至25个碱基对（bp）远的DNA。
当几个致密TALEN必须用于特殊的基因组工程化的应用时，对于待使用组合中每个致密TALEN的DNA靶标序列可位于相同或不同的内源性目的基因组DNA基因组上。所述DNA靶标序列可位于1至1000个碱基对（bp），更优选1至500个bp，更优选1至100个bp，更优选1至100个bp，更优选1至50个bp，更优选1至25个bp，更优选1至10个bp的近似距离处。在另一个实施方案中，对于待使用组合中每个致密TALEN的DNA靶标序列可位于相同或不同的DNA链上。位于上述距离处的所述DNA靶标序列是参照用于根据本发明之DNA加工的靶DNA序列的“附近”DNA序列。
–“单一双链DNA靶标序列”指致密TALEN或增强致密TALEN或双切割致密TALEN结合位点。致密TALEN或增强致密TALEN或双切割致密TALEN的识别DNA结合位点的长度范围可以是12至100个碱基对（bp），通常长度大于12bp。
–“DNA靶半位点”、“半切割位点”或“半位点”指被LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域绑定的DNA靶标的一部分。
-术语“内切核酸酶”指能够催化水解（切割）DNA或RNA分子（优选DNA分子）中核酸之间的键的野生型或变体酶。当通常的多核苷酸识别的长度大于12个碱基对（bp），更优选为14至45bp时，内切核酸酶可归类为罕见切口内切核酸酶。罕见切口内切核酸酶通过在限定基因座处诱导DNA双链断裂（DSB）使HR显著增加（Rouet,Smih等.1994;Rouet,Smih等.1994;Choulika,Perrin等.1995;Pingoud和Silva2007）。罕见切口内切核酸酶可例如是归巢内切核酸酶（Paques和Duchateau2007）、由工程化锌指结构域与限制酶的催化结构域（例如FokI）融合产生的嵌合锌指核酸酶（ZFN）（Porteus和Carroll2005）或化学内切核酸酶（Eisenschmidt,Lanio等.2005;Arimondo,Thomas等.2006;Simon,Cannata等.2008）。在化学内切核酸酶中，化学或肽切割物与核酸的聚合物缀合或与识别特定靶标序列的另一个DNA缀合，从而使切割活性靶向特定序列。化学内切核酸酶也包括合成核酸酶，如已知结合特定DNA序列的邻二氮杂菲、DNA切割分子和三链形成寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotide，TFO）的缀合物（Kalish和Glazer2005）。这样的化学内切核酸酶包括在根据本发明的数据“内切核酸酶”内。
罕见切口内切核酸酶也可以是例如TALEN—使用来源于转录激活物样效应物（TALE）的FokI催化结构域和DNA结合结构域的新一类嵌合核酸酶，TALE是黄单胞菌属的植物病原体感染过程中使用的蛋白质家族（Boch,Scholze等.2009;Boch,Scholze等.2009;Moscou和Bogdanove2009;Moscou和Bogdanove2009;Christian,Cermak等.2010;Christian,Cermak等.2010;Li,Huang等.2010;Li,Huang等.2011）。基于FokI的TALE核酸酶（TALEN）的功能布置基本上在于ZFN，并且锌指DNA结合结构域被替换为TALE结构域。同样地，通过TALEN的DNA切割在非特定中心区旁侧需要两个DNA识别区。本发明中包括的罕见切口内切核酸酶也可来源于TALEN。本发明的作者开发了新类型TALEN，其可工程化成有效的特异性识别并加工靶DNA。这些新型“致密TALEN”（cTALEN）不需要用于DNA加工活性的二聚化，从而减少了对具有间插DNA“间隔物”的“双”靶位点的需要；这些致密TALEN可看做是根据本发明的罕见切口内切核酸酶或嵌合罕见切口内切核酸酶的一个子类。
罕见切口内切核酸酶可以是归巢内切核酸酶，也称为兆核酸酶。这样的归巢内切核酸酶在本领域是公知的（Stoddard2005）。归巢内切核酸酶识别DNA靶标序列并生产单链断裂或双链断裂。归巢内切核酸酶是高度特异性的，识别长度范围为12至45个碱基对（bp），通常长度范围为14至40bp的DNA靶位点。根据本发明的归巢内切核酸酶可例如相当于LAGLIDADG内切核酸酶、HNH内切核酸酶或GIY-YIG内切核酸酶。
在野生状态下，兆核酸酶基本上由归巢内切核酸酶代表。归巢内切核酸酶（HE）是天然兆核酸酶的广泛家族，包括数百种蛋白质家族（Chevalier和Stoddard2001）。这些蛋白质由通过称为“归巢”的过程增殖的可移动遗传元件编码：内切核酸酶切割不存在可移动元件的同源等位基因，从而刺激同源重组事件，将可移动DNA复制到受体基因座。考虑到其关于效力和特异性的例外的切割性质，它们可代表驱动新的高特异性内切核酸酶的理想支架。
HE属于四个主要家族。在催化中心所涉及的保守肽基序之后命名的LAGLIDADG家族是最广泛并且表征最好的组。现在存在七个结构。然而，来自该家族的大多数蛋白质是单体的并且示出两个LAGLIDADG基序，一些具有仅一个基序，并因此发生二聚化以切割回文或假回文靶标序列。
虽然LAGLIDADG肽是家族成员中仅有的保守区，但是这些蛋白质共有非常类似的构造。催化核心旁侧是两个DNA结合结构域，对于同二聚体具有完美双重对称（例如I-CreI（Chevalier,Monnat等.2001）、I-MsoI（Chevalier,Turmel等.2003）和I-CeuI（Spiegel,Chevalier等.2006）），以及对于单体具有假对称（例如I-SceI（Moure,Gimble等.2003）、I-DmoI（Silva,Dalgaard等.1999）或I-AniI（Bolduc,Spiegel等.2003））。两种单体和两个结构域（对于单体蛋白质）均促成围绕二价阳离子组织的催化核心。仅在催化核心之上，两个LAGLIDADG肽也在二聚化界面中发挥必不可少的作用。DNA结合取决于位于DNA深沟中的两个典型马鞍形αββαββα折叠。在例如内含肽，如PI-PfuI（Ichiyanagi,Ishino等.2000）和PI-SceI（Moure,Gimble等.2002）中可发现另一些结构域，其蛋白质剪接结构域也包括在DNA结合中。
通过将N端I-DmoI结构域与I-CreI单体融合来制备功能性嵌合兆核酸酶（Chevalier,Kortemme等.2002;Epinat,Arnould等.2003）；国际PCT申请WO03/078619（Cellectis）和WO2004/031346（Fred Hutchinson Cancer Research Center,Stoddard等）已证明了LAGLIDADG蛋白质的可塑性。
不同研究组也使用了半理性方法（semi-rational approach）以局部改变I-CreI的特异性（Seligman,Stephens等.1997;Sussman,Chadsey等.2004）；国际PCT申请WO2006/097784、WO2006/097853、WO2007/060495和WO2007/049156（Cellectis）；（Arnould,Chames等.2006;Rosen,Morrison等.2006;Smith,Grizot等.2006）、I-SceI（Doyon,Pattanayak等.2006）、PI-SceI（Gimble,Moure等.2003）和I-MsoI（Ashworth,Havranek等.2006）。
此外，具有局部改变特异性的数百种I-CreI衍生物通过组合半理性方法与高通量筛选来工程化：
-使I-CreI的残基Q44、R68和R70或Q44、R68、D75和I77诱变并且通过筛选鉴定在DNA靶标位置±3至5处（5NNN DNA靶标）具有改变特异性的变体集合（国际PCT申请WO2006/097784和WO2006/097853（Cellectis）；（Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006）。
-使I-CreI的残基K28、N30和Q38或N30、Y33和Q38或K28、Y33、Q38和S40诱变并且通过筛选鉴定在DNA靶标（10NNN DNA靶标）位置±8至10处具有改变特异性的变体集合（Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006）；国际PCT申请WO2006/097784和WO2006/097853（Cellectis））。
将两个不同变体组合并装配到能够切割嵌合靶标的功能性异二聚体内切核酸酶中，所述嵌合靶标由每个变体DNA靶标序列的两个不同半族融合产生（（Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006）；国际PCT申请WO2006/097854和WO2007/034262）。
此外，I-CreI的残基28至40和44至77示出形成两部分可分离的功能性子结构域，能够结合归巢内切核酸酶靶半位点的不同部分（Smith,Grizot等.2006）；国际PCT申请WO2007/049095和WO2007/057781（Cellectis））。
相同单体中I-CreI的两个子结构域的突变组合允许设计能够切割回文组合DNA靶标序列的新型嵌合分子（同二聚体），所述回文组合DNA靶标序列包含被每个子结构域绑定的位置±3至5和±8至10处的核苷酸（（Smith,Grizot等.2006）；国际PCT申请WO2007/049095和WO2007/057781（Cellectis））。
国际PCT申请WO2004/067736；（Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006）中描述了用于在哺乳动物或酵母细胞中基于切割诱导型重组产生兆核酸酶变体和测定的方法，其用于筛选具有改变特异性的变体。这些测定导致了可通过标准方法监测的功能性LacZ报道基因。
前两步骤的组合允许更大的组合方法，包括四个不同子结构域。不同子结构域可分开修饰并且组合起来以得到全部重新设计的具有所选择特异性的兆核酸酶变体（异二聚体或单链分子。在第一步中，将成对新型兆核酸酶组合到切割来源于想要切割的靶标的回文靶标的新分子（“半兆核酸酶”）中。然后，这种“半兆核酸酶”的组合可导致切割目的靶标的异二聚体物类。以下Cellectis国际专利申请中描述了将四组突变装配到切割模型靶标序列或来自不同基因的序列的异二聚体内切核酸酶：XPC基因（WO2007/093918）、RAG基因（WO2008/010093）、HPRT基因（WO2008/059382）、β2微球蛋白基因（WO2008/102274）、Rosa26基因（WO2008/152523）、人血红蛋白β基因（WO2009/13622)和人白细胞介素-2受体γ链基因（WO2009019614）。
这些变体可用于切割真正的染色体序列并且为包括基因治疗的多个领域的新视野铺平了道路。
这些内切核酸酶的实例包括I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-TliI、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BsuI、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-MgoI、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-MtuI、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-MsoI。
归巢内切核酸酶可以是LAGLIDADG内切核酸酶，例如I-SceI、I-CreI、I-CeuI、I-MsoI和I-DmoI。
所述LAGLIDADG内切核酸酶可以是I-SceI，包含两个LAGLIDADG基序并且作为单体起作用的家族成员，其分子质量约为其他家族成员（如包含仅一个LAGLIDADG基序并且作为同源二聚体起作用的I-CreI）质量的两倍。
本申请中提到的内切核酸酶包括野生型（天然发生的）内切核酸酶和变体内切核酸酶。根据本发明的内切核酸酶可以是“变体”内切核酸酶，即自然中不天然存在并且通过遗传工程或通过随机诱变得到的内切核酸酶，即，工程化的内切核酸酶。这种变体内切核酸酶可例如通过将野生型的天然发生的内切核酸酶氨基酸序列中的至少一个残基替换为不同氨基酸来得到。所述替换可例如通过定点诱变和/或随机诱变引入。在本发明的范围中，这样的变体内切核酸酶依然是功能性的，即，它们保留识别（结合功能）和任选地特异性切割靶标序列以启动基因靶向过程的能力。
根据本发明的变体内切核酸酶切割不同于对应的野生型内切核酸酶靶标序列的靶标序列。用于得到具有新特异性的这种变体内切核酸酶的方法是本领域公知的。
内切核酸酶变体可以是同二聚体（包含两个相同单体的兆核酸酶）或异二聚体（包含两个不同单体的兆核酸酶）。应理解，本发明的范围还包括内切核酸酶变体本身，包括作为非限制性实例的异二聚体（WO2006097854）、专性异二聚体（WO2008093249）和单链兆核酸酶（WO03078619和WO2009095793），其能够切割多核苷酸序列中或基因组中的一个目的靶标。本发明还包括由不同来源的两个单体构成的杂合体变体本身（WO03078619）。
具有新特异性的内切核酸酶可用于根据本发明的方法中用于基因靶向，从而在预定位置处将目的转基因整合到基因组中。
–“亲本兆核酸酶”旨在意指野生型兆核酸酶或具有相同性质的这种野生型兆核酸酶的变体，或与相同的兆核酸酶野生型版本相比具有一些改变特征的兆核酸酶。该表达也可变换为内切核酸酶、罕见切口内切核酸酶、嵌合罕见切口内切核酸酶、TALEN或致密TALEN及衍生物。
-“递送载体”指可用于本发明以使本发明所需的药剂/化学品和分子（蛋白质或核酸）与细胞接触（即“接触”）或递送到细胞内侧或亚细胞隔室的任何递送载体。其包括但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学载剂、聚合物载剂、脂质体、复合物（polyplex）、树枝状大分子、微泡（超声造影剂）、纳米颗粒、乳剂或其他释放的转移载体。这些递送载体允许递送分子、化学品、大分子（基因、蛋白质）或其他载体（例如质粒或由Diatos开发的肽）。在这些情况下，递送载体是分子载体。“递送载体”还指进行转染的递送方法。
–术语“载体”指能够将另一种核酸运输至与其已连接的核酸分子。本发明中的“载体”包括但不限于，病毒载体、质粒、RNA载体或者线状或环状DNA或RNA分子，其可由染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸和合成核酸组成。优选的载体是能够自生复制（游离型载体）和/或表达与其连接的核酸（表达载体）的那些。大量的合适载体是本领域技术人员已知的并且是可商购的。
病毒载体包括逆转录病毒；腺病毒；细小病毒（例如，腺相关病毒）；冠状病毒；负链RNA病毒，例如正粘病毒（例如，流感病毒）、棒状病毒（例如，狂犬病性和水疱性口炎病毒）、副粘病毒（例如，麻疹和仙台病毒）；正链RNA病毒，例如小核糖核酸病毒和甲病毒；以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒（例如，1型和2型单纯性疱疹病毒、艾普斯登－巴尔病毒（Epstein-Barr virus）、巨细胞病毒）和痘病毒（例如，牛痘、禽痘和金丝雀痘）。另一些病毒包括例如诺沃克病毒、囊膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：鸡白血病-肉瘤，哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒，HTLV-BLV组，慢病毒、泡沫病毒（Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and theirreplication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,等.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。
“慢病毒载体”意指对于基因递送非常有前景的基于HIV的慢病毒载体，原因是其相对大的包装能力，减少的免疫原性及其高效率的稳定转导大范围不同细胞类型的能力。慢病毒载体通常通过将三个（包装、包膜和转移）或更多个质粒瞬时转染到生产细胞中来产生。与HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体的相互作用进入靶细胞。进入后，病毒RNA经历由病毒逆转录酶复合物介导的逆转录。逆转录的产物是双链线性病毒DNA，这是病毒整合到感染细胞DNA中的底物。
-“整合慢病毒载体（或LV）”意指作为非限制性实例的能够整合靶细胞基因组的这样的载体。
–相反地，“非整合慢病毒载体（或NILV）”意指不通过病毒整合酶作用整合靶细胞基因组的有效基因递送载体。
优选载体的一种类型是游离体，即，能够进行染色体外复制的核酸。优选载体是能够自生复制和/或表达其与之连接的核酸的那些。能够定向表达其与之有效连接的基因的载体在本文中称为“表达载体”。根据本发明的载体包括但不限于，YAC（酵母人工染色体）、BAC（细菌人工染色体）、杆状病毒载体、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒载体、质粒、RNA载体或者线状或环状DNA或RNA分子，其可由染色体DNA、非染色体DNA、半合成DNA或合成DNA组成。一般来说，用于重组DNA技术的表达载体经常为“质粒”的形式，所述质粒一般指环状双链DNA环，其载体形式不与染色体绑定。大量合适的载体是本领域技术人员已知的。载体可包含可选择标志物，例如：新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯性疱疹病毒胸苷激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和用于真核细胞培养的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶；用于啤酒酵母的TRP1；大肠杆菌中的四环素、利福平或氨苄青霉素抗性。优选地，所述载体是表达载体，其中编码目的多肽的序列在释放转录和翻译控制元件的控制下以允许产生或合成所述多肽。因而，所述多核苷酸包含于表达盒中。更特别地，所述载体包含复制起点、与所述编码多核苷酸有效连接的启动子、核糖体结合位点、RNA剪接位点（当使用基因组DNA时）、聚腺苷酸化位点和转录终止位点。其还可包含增强子或沉默元件。启动子的选择取决于其中表达多肽的细胞。合适的启动子包括组织特异性和/或诱导型启动子。诱导型启动子的实例是：由增加水平的重金属诱导的真核生物金属硫蛋白启动子、响应于异丙基-β-D-硫代半乳-呋喃糖苷（IPTG）诱导的原核生物lacZ启动子和由增加温度诱导的真核生物热休克启动子。组织特异性启动子的实例是骨骼肌肌酸激酶、前列腺特异性抗原（PSA）、α-抗胰蛋白酶、人表面活性物质（SP）A和B蛋白、β-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。
–诱导型启动子可由病原体或应力，更优选地由应力（如冷、热、UV光、或高离子浓度）诱导（回顾Potenza C等.2004,In vitro Cell Dev Biol40:1-22）。诱导型启动子可由化学品诱导（Moore,Samalova等.2006）；（Padidam2003）；（Wang,Zhou等.2003）；（Zuo和Chua2000）。
递送载体和载体可与任何细胞透化技术相结合或组合，例如声致穿孔或电穿孔或这些技术的衍生技术。
–细胞指任何原核或真核的活细胞，来源于这些生物体以体外培养的细胞系，动物或植物来源的原代细胞。
–“原代细胞”指直接由活组织（即活检材料）中提取并且在体外建立生长的细胞，其经历了很少的群体倍增并因此与连续肿瘤发生细胞系或人工永生化细胞系相比，更代表其来源的组织的主要功能性组分和特征。因此，这些细胞代表它们所涉及的体内状态的更有价值的模型。
在本发明的范围中，“真核细胞”指真菌、植物或动物细胞，或来源于以下所列生物体并建立体外培养物的细胞系。更优选地，真菌是属曲霉菌属、青霉菌属、支顶孢属、木霉属、金孢属、被孢霉属、克鲁维酵母菌属或毕赤酵母属；更优选地，真菌是种黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、黄青梅、桔青霉、产黄头孢霉、里氏木霉、高山被孢霉、Chrysosporium lucknowense（无对应中译文）、乳酸克鲁维酵母、Pichia pastoris（无对应中译文）或Pichia ciferrii（无对应中译文）。
更优选地，植物是属拟南芥属、烟草属、茄属、莴苣属、芸薹属、稻属、天门冬属、豌豆属、苜蓿属、玉蜀黍属、大麦属、黑麦属、小麦属、辣椒属、黄瓜属、南瓜属、西瓜属、柑橘属、高粱属的植物；更优选地，植物是种泰国拟南芥、烟草、番茄、马铃薯、茄子、Solanum esculentum（无对应中译文）、莴苣、欧洲油菜、甘蓝、芜菁、光稃稻、水稻、石刁柏、豌豆、紫花苜蓿、玉蜀黍、大麦、黑麦、小麦、硬粒小麦、栽培辣椒（Capsicum sativus）、西葫芦、西瓜、香瓜、来檬、柚子、佛手柑、柑橘的植物。
更优选地，动物细胞是人属、鼠属、小鼠属、猪属、牛属、鱼属、犬属、猫属、马属、斑鳟属、大马哈鱼属、鸡属、火鸡属、果蝇属、隐杆线虫属的细胞；更优选地，动物细胞是种智人、褐家鼠、小家鼠、野猪、家牛、斑马鱼、狼、家猫、家马、安大略鲑、虹鳟、原鸡、吐绶鸡、黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫的动物细胞。
在本发明中，细胞可以是植物细胞、哺乳动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞或来源于这些生物体用于体外培养的细胞系或直接由活组织提取并建立用于体外培养的原代细胞。作为非限制性实例，细胞可以是得自于以上所列植物生物体的原生质体。作为非限制性实例，细胞系可选自CHO-K1细胞、HEK293细胞、Caco2细胞、U2-OS细胞、NIH3T3细胞、NSO细胞、SP2细胞、CHO-S细胞、DG44细胞、K-562细胞,U-937细胞、MRC5细胞、IMR90细胞、Jurkat细胞、HepG2细胞、HeLa细胞、HT-1080细胞、HCT-116细胞、Hu-h7细胞、Huvec细胞、Molt4细胞。
所有的这些细胞系可通过本发明方法进行修饰以提供生产、表达、定量、检测、研究目的基因或目的蛋白质的细胞系模型；这些模型也可用于在研究和生产及多个领域（例如，作为非限制性实例的化学、生物燃料、治疗学和农学领域）中筛选目的生物活性分子。使用遗传工程化的T细胞的过继性免疫疗法是治疗恶性肿瘤和感染疾病的有前景的方法。最通用的方法依赖于通过适当T细胞受体（TCR）或嵌合抗原受体（CAR）随机整合的基因转移。使用罕见切口内切核酸酶的靶向方法是将基因转移到T细胞中并产生遗传工程化的T细胞的有效且安全的替代方法。
–“同源”指与另一种序列具有足够同一性以导致序列之间同源重组，更特别地具有至少95%同一性，优选97%同一性并且更优选99%同一性的序列。
–“同一性”指两条核酸分子或多肽之间的序列同一性。同一性可通过对可为了比较目的而对准的每条序列中位置进行比较进行来确定。当比较序列中的位置被相同碱基占据时，那么分子在所述位置处具有同一性。核酸或氨基酸序列之间相似性或同一性的程度是核酸分子序列共用位置处相同或匹配核苷酸的数目的函数。多种比对算法和/或程序可用于计算两条序列之间的同一性，包括FASTA或可作为GCG序列分析包的一部分利用的BLAST（University of Wisconsin,Madison,Wis.），并且可与例如缺省设置一起使用。
–“突变”指多核苷酸（cDNA、基因）或多肽序列中一个或更多个核苷酸/氨基酸的替换、缺失、插入。所述突变可影响基因或其调节序列的编码序列。其还可影响基因组序列的结构或所编码mRNA的结构/稳定性。
–在本发明的范围中，表达“双链断裂诱导的诱变”（DSB诱导的诱变）指在内切核酸酶诱导的DSB之后接着NHEJ事件的诱变事件，导致内切核酸酶切割位点处的插入/缺失。
–“基因”意指遗传的基本单元，由沿染色体以线性方式排列的DNA区段，其编码特定的蛋白质或蛋白质片段组成。基因通常包含启动子、5’非翻译区、一个或更多个编码序列（外显子）、任选的内含子、3’非翻译区。基因还可包含终止子、增强子和/或沉默子。
–本文使用的术语“转基因”指编码多肽的序列。优选地，由转基因编码的多肽在该转基因被插入的细胞、组织或个体中不表达、或虽然表达却没有生物活性。最优选地，转基因编码用于治疗个体的治疗性多肽。
–术语“目的基因”或“GOI”指编码已知或假定基因产物的任何核苷酸序列。
–本文使用的术语“基因座”是染色体上DNA序列的（例如，基因的）特定物理位置。术语“基因座”通常指染色体上内切核酸酶靶标序列的特定物理位置。包含由根据本发明的内切核酸酶识别和切割的靶标序列的这种基因座称为“根据本发明的基因座”。另外，表达“目的基因组基因座”用于限定基因组中的核酸序列，所述核酸序列可以是根据本发明的双链断裂的假定靶标。应理解，所考虑的本发明的目的基因组基因座可不仅限定细胞的遗传物质主体中（即，染色体中）存在的核酸序列，而且还限定可独立存在于所述遗传物质主体（例如，质粒、游离体、病毒、转座子）或存在与细胞器（例如，作为非限制性实例的线粒体或叶绿体）中的遗传物质的一部分。
–表达“遗传信息丢失”理解为消除或添加至少一个给定DNA片段（至少一个核苷酸）或序列，限定本发明的内切核酸酶、嵌合罕见切口内切核酸酶、致密TALEN或增强致密TALEN的识别位点的序列或本发明的内切核酸酶、嵌合罕见切口内切核酸酶、致密TALEN或增强致密TALEN的至少两个加工位点之间的间插序列，并导致目的基因组基因座中所述内切核酸酶切割位点、嵌合罕见切口内切核酸酶切割位点、致密TALEN或增强致密TALEN是识别DNA结合位点周围的原始序列改变。这种遗传信息丢失可以是，作为非限制性实例的，致密TALEN或增强致密TALEN的两个内切核酸酶切割位点之间或两个加工位点之间的间插序列的消除。作为另一个非限制性实例，这种遗传信息丢失也可以是跨越根据本发明的致密TALEN或增强致密TALEN的结合区的DNA单链的切除。
–“无痕重新连接”指完美的重新连接事件，在产生双链断裂事件之后通过NHEJ过程没有DNA断裂末端的遗传信息丢失（没有插入/缺失事件）。
–“不精确NHEJ”指通过DSB生成的核酸末端的具有核苷酸插入或缺失的重新连接。不精确NHEJ是结果而不是修复途径，并且可由不同NHEJ途径（作为非限制性实例的Ku依赖性或Ku非依赖性途径）产生。
–“融合蛋白”指本领域公知的过程的结果，其在于使最初编码独立蛋白质或其一部分的两种或更多种基因连接，所述“融合基因”的翻译产生具有来源于原始蛋白质中每一种的功能性质的单一多肽。
–“嵌合罕见切口内切核酸酶”意指包含罕见切口内切核酸酶的任何融合蛋白。所述罕见切口内切核酸酶可以是所述嵌合罕见切口内切核酸酶的N端部分；相反地，所述罕见切口内切核酸酶可以是所述嵌合罕见切口内切核酸酶的C端部分。包含两个催化结构域的根据本发明的“嵌合罕见切口内切核酸酶”可描述为“双功能”或“双功能兆核酸酶”。包含多于两个催化结构域的根据本发明的“嵌合罕见切口内切核酸酶”可描述为“多功能”或“多功能兆核酸酶”。作为非限制性实例，根据本发明的嵌合罕见切口内切核酸酶可以是切口罕见内切核酸酶与一个催化结构域之间的融合蛋白；根据本发明的嵌合罕见切口内切核酸酶也可以是罕见切口内切核酸酶与两个催化结构域之间的融合蛋白。如上所提到的，根据本发明之嵌合罕见切口内切核酸酶的罕见切口内切核酸酶部分可以是包含两个相同单体、两个不同单体的兆核酸酶或单链兆核酸酶。根据本发明的嵌合罕见切口内切核酸酶的罕见切口内切核酸酶部分也可以是无活性罕见切口内切核酸酶的DNA结合结构域。在另一些非限制性实例中，根据本发明的嵌合罕见切口内切核酸酶可来源于TALE核酸酶（TALEN），即，来源于转录激活物样效应物（TALE）的DNA结合结构域与一个或两个催化结构域之间的融合物。在另一些非限制性实例中，根据本发明的嵌合罕见切口内切核酸酶的子类可以是“致密TALE核酸酶”（cTALEN），即，包含至少一个重复可变二肽区的工程化的核心TALE支架与至少一个催化结构域之间的融合物；构成致密TALEN活性实体的所述融合蛋白不需要用于DNA加工活性的二聚化。所述催化结构域可以是作为非限制性实例的表2所列的内切核酸酶；所述催化结构域可以是切口常见（frequent-cutting）内切核酸酶，例如选自表2所列的作为非限制性限制酶实例的MmeI、R-HinPII、R.MspI、R.MvaI、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I、ss.BspD6I、R.PleI、MlyI和AlwI的限制酶。
-“增强子结构域”或“增强子”意指为蛋白质支架（致密TALEN，作为非限制性实例）提供功能和/或结构支持，从而使得相对于初始致密TALEN的DNA加工效率，所得融合蛋白的总体DNA加工效率增强，即，增强致密TALEN。具体的结构域是增强子结构域，其提供初始支架效率中至少5%的增强，更优选10%，更优选15%，更优选20%，更优选25%，更优选50%，更优选大于55%。这样的增强子结构域的非限制性实例在表1和2中给出。“辅助增强子结构域”或“辅助增强子”或“辅助结构域”意指与致密TALEN或增强致密TALEN反式起作用的蛋白质结构域，从而提供对于所述基础致密TALEN活性或所述增强致密TALEN活性不必需的另外的功能。当使用这样的辅助增强子时，致密TALEN或增强致密TALEN转化为“反式TALEN”，分别是反式致密TALEN和反式增强致密TALEN。
-“催化结构域”指包含所述酶活性位点的蛋白质结构域或酶的模块，活性位点指发生底物催化的所述酶的一部分。酶，以及其催化结构域根据其催化的反应分类和命名。酶学委员会编号（EC编号）是基于其催化的化学反应对酶的数值分类方案（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/）。在本发明的范围中，任何催化结构域可以与工程化的核心TALE支架融合以生成具有由至少一个催化结构域活性提供的DNA加工效率的致密TALEN活性实体。所述催化结构域可提供作为非限制性实例的核酸酶活性（内切核酸酶或外切核酸酶活性、切割酶或切口酶）、聚合酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、甲基化酶活性、拓扑异构酶活性、整合酶活性、转座酶活性或连接酶活性。这样的催化结构域的非限制性实例在表1和2中给出。在本发明的一个优选实施方案中，所述催化结构域可被认为是增强子结构域。如果具有催化活性，则所述增强子结构域为致密TALEN支架提供了功能和/或结构支持，导致当与致密TALEN支架融合时产生增强致密TALEN。如果是催化非活性的，所述增强子结构域为致密TALEN支架提供了结构支持，导致当与致密TALEN支架融合时产生增强致密TALEN。可由本发明设想使根据本发明的催化结构域与经典TALEN的一部分融合以给出由至少一个所述催化结构域活性提供的这些经典TALEN的新催化性质或者提高其DNA加工效率。
–“核酸酶催化结构域”指包含内切核酸酶或外切核酸酶的活性位点的蛋白质结构域。这样的核酸酶催化结构域可以是例如“切割酶结构域”或“切口酶结构域”。“切割酶结构域”指其催化活性在DNA靶标中生成双链断裂（DSB）的蛋白质结构域。“切口酶结构域”指其催化活性在DNA靶标序列中生成单链断裂的蛋白质结构域。通过基因库或NCBI或UniProtKB/Swiss-Prot编号作为参考，表1和表2中给出了这样的催化结构域的非限制性实例。
-“TALE核酸酶”（TALEN）或“经典TALEN”指由来源于转录激活物样效应物（TALE）的DNA结合结构域与一个FokI催化结构域组成的融合蛋白，其需要二聚化以形成能够切割DNA靶标序列的活性实体。
–“致密TALE核酸酶”（cTALEN）指根据本发明对于一种融合蛋白的一般命名，所述融合蛋白是包含至少一个重复可变二肽结构域的工程化的核心TALE支架与至少一个催化结构域之间的融合蛋白，所述融合蛋白构成致密TALEN（或cTALEN）活性实体并且对于DNA加工活性不需要二聚化。设计致密TALEN以减少当靶向DNA切割事件时对多个独立蛋白质部分的需要。重要的是，对于目前的TALEN功能必不可少的需要的“间隔物”区和双靶位点区是不必要的。换言之，根据本发明的致密TALEN是一个活性实体，其自身能够通过一个DNA结合结构域仅靶向一个特定目的单一双链DNA靶标序列并且加工所述目的单一双链DNA靶标序列附近的DNA。此外，因为催化结构域不需要特定的DNA接触，所以对于核心TALE DNA结合结构域周围的区域没有限制。在本发明的范围中，可设想在催化结构域中有一些序列偏好。当cTALEN包含仅一个催化结构域时，cTALEN可限定为“基础cTALEN”或“cTALEN”。当cTALEN还包含至少一个“增强子结构域”时，cTALEN可限定为增强cTALEN或“eTALEN”。包含至少一个切割酶催化结构域和一个切口酶催化结构域或至少两个切割酶催化结构域的cTALEN或eTALEN可具体限定为双切割cTALEN或“dcTALEN”。以反式与辅助结构域一起作用的cTALEN或eTALEN限定为反式致密TALEN或反式增强致密TALEN，两者都是“反式TALEN”。
本发明的以上描述提供了制备本发明和使用其的方法和过程，使得本领域技术人员能够制备和使用本发明，构成原始描述一部分的所附权利要求的主题中特别地提供了这种能力。
以上使用的短语“选自”等包括指定材料的混合物。
在本文中说明数值界限或范围时，包括端点。另外，具体地包括数值界限或范围中的所有数字和子范围，正如明确地写出一样。
呈现以上描述以使得本领域技术人员能够制备和使用本发明，并且在具体应用及其要求的上下文中提供了以上描述。对优选实施方案的多种修改对于本领域技术人员是非常显而易见的，并且本文定义的一般准则可适用于其他实施方案和应用而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明不旨在限制于所示出的实施方案，而是应符合与本文所公开的准则和特征相一致的最广泛的范围。
已经对本发明进行了一般描述，可参照某些具体实施例得到进一步的理解，除非另有说明，否则在本文中提供所述实施例仅为了说明性目的，并且不旨在限制。
实施例
实施例1
选择野生型I-CreI兆核酸酶（SEQ ID NO:106）作为亲本支架，在其上融合I-TevI（SEQ ID NO:107）的催化结构域。野生型I-TevI作为GIY-YIG家族的单体切割酶起作用以在其靶标DNA中生成交错的双链断裂。根据生物化学和结构数据，由I-TevI的N端区域设计可变长度构建体，所述构建体包含整个催化结构域和其接头的不耐缺失区（deletion-intolerant region）（SEQ ID NO:109至SEQ ID NO:114）。在除了一种情况之外的所有情况下，片段通过间插的5-残基多肽接头（-QGPSG-;SEQ ID NO:103）与I-CreI的N端融合。缺少接头的融合构建体自然包含与人工接头中的那些类似的残基（-LGPDGRKA-;SEQ ID NO:104）。因为I-CreI是同二聚体，所以所有的融合构建体包含三个催化中心（图4，其中“催化结构域”=切割酶）：二聚体界面处的I-CreI天然活性位点和每个单体中的一个I-TevI活性位点。
使用先前国际PCT公开WO2004/067736和（Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006）中所述的酵母测定来评价每种“三功能”兆核酸酶的活性。所有构建体能够切割C1221靶标DNA，其活性比得上野生型I-CreI（表4）。
为了验证I-TevI催化结构域的活性不依赖于I-CreI催化核心，制备了D20N点突变体以使I-CreI支架失活[SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:115至SEQ ID NO:120;Chevalier,Sussman等.2004)]。酵母测定中的测试示出在单独的失活I-CreI（D20N）突变蛋白质中没有可见的活性（表4）。但是，对于具有I-TevI催化结构域的融合物可观察到切割活性（表4）。
表4：I-TevI/I-CreI融合物在酵母测定中的活性。示出了野生型和融合蛋白对两种亲本蛋白质靶标（对于I-CreI的C1221和对于I-TevI的Tev）的相对活性。看到了每种给定蛋白质对其天然DNA靶标的最大活性（++++）。I-CreI_N20是野生型I-CreI支架的失活变体。在所有的其他情况下，仅对C1221靶标检测到活性，原因是DNA识别是由I-CreI支架驱动。“N20”融合变体说明了由于I-TevI催化结构域的切割活性。
相对活性规范为：-，无可检测活性；+，<25%活性；++，25%至<50%活性；+++，50%至<75%活性；++++，75%至100%活性。
实施例2
基于I-CreI（SEQ ID NO:106,I-CreI_X:SEQ ID NO:121）的截短形式和三个不同接头肽（NFS1=SEQ ID NO:98;NFS2=SEQ ID NO:99;CFS1=SEQ ID NO:100）与蛋白质的N端或C端融合设计了蛋白质融合支架。在所有情况下生成了结构模型，目的是设计穿过I-CreI亲本支架而对其DNA结合或切割活性有很少或没有影响的“基线”融合接头。对于两个N端融合支架，使用跨越I-CreI残基2至153的多肽，其中K82A突变允许接头放置。C端融合支架包含野生型I-CreI的残基2至155。对于两种融合支架类型，将接头的“自由”末端（即，可连接多肽到其上的末端）设计成接近DNA，如由使用I-CreI/DNA复合物结构作为起始点（PDB id:1g9z）建立的模型所确定的。在我们的酵母测定中测试了两个I-CreI N端融合支架（I-CreI_NFS1=SEQ ID NO:122和I-CreI_NFS2=SEQ ID NO:123）和单个C端融合支架（I-CreI_CFS1=SEQ ID NO:124）（参见实施例1）并且发现其具有与野生型I-CreI的活性类似的活性（表5）。
表5：ColE7/I-CreI融合物在酵母测定中的活性。示出了野生型和融合蛋白对C1221靶标的相对活性。I-CreI_X表示基于晶体结构的I-CreI的截短版本并且用作融合支架（I-CreI_NFS1、I-CreI_NFS2和I-CreI_CFS1）的基础。“N20”构建体是基于I-CreI支架的各自的失活变体。在其中I-CreI支架是活性的所有情况下或者当由ColE7结构域提供DNA催化时检测活性。
相对活性规范为：-，无可检测活性；+，<25%活性；++，25%至<50%活性；+++，50%至<75%活性；++++，75%至100%活性。
大肠杆菌素E7是能够加工单链和双链DNA的HNH家族的非特异性核酸酶（Hsia,Chak等.2004）。根据生物化学和结构数据，选择包含整个催化结构域的ColE7的区域（SEQ ID NO:140;（Hsia,Chak等.2004））。这种ColE7结构域与I-CreI_NFS1（SEQ ID NO:122）或I-CreI_NFS2（SEQ ID NO:123）的N端融合以分别产生hColE7Cre_D0101（SEQ ID NO:128）或hColE7Cre_D0102（SEQ ID NO:129）。此外，使用I-CreI_CFS1（SEQ ID NO:124）生成了C端融合构建体hCreColE7_D0101（SEQ ID NO:130）。因为I-CreI是同二聚体，所以所有的融合构建体包含三个催化中心（图4，其中“催化结构域”=切割酶）：二聚体界面处的天然I-CreI活性位点和每个单体中的一个ColE7活性位点。
使用我们的酵母测定来评价每种“三功能”兆核酸酶的活性（参见实施例1）。所有构建体能够切割C1221靶标DNA，其活性比得上野生型I-CreI（表5）。
为了验证ColE7催化结构域的活性不依赖于I-CreI催化核心，制备了D20N点突变体以使I-CreI支架失活[SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133;（Chevalier,Sussman等.2004）]。我们酵母测定中的测试示出在单独的失活I-CreI（D20N）突变蛋白质中没有可见的活性（表5）。但是，对于具有ColE7催化结构域的融合物可观察到切割活性（表5）。
实施例3
生成了两种核心TALE支架：（a）不同组RVD结构域可插入到其上以改变DNA结合特异性；以及（b）选择催化结构域可附加到其上的N端或C端以影响DNA切割（或产生切口）。核心支架（sT1:SEQ ID NO:134和sT2:SEQ ID NO:135）的N端区域和C端区域不同，其中与sT1相比，sT2是N端缺少152个氨基酸残基（Szurek,Rossier等.2002）并且C短缺少最后220个残基的截短变体。在sT1中，C端区域是相对野生型TLAE结构域的截短形式，其在DNA编码序列中的偶然限定的限制位点（BamHI）处终止。
使用两种核心支架，通过插入识别天然发生的不对称序列AvrBs3（19bp）和PthXo1（25bp）的对应组重复结构域生成了四种“基线”TALE DNA结合蛋白（bT1-Avr=SEQ ID NO:136、bT2-Avr=SEQ ID NO:137、bT1-Pth=SEQ ID NO138和bT2-Pth=SEQ ID NO139）（图3）。基线支架的示例性蛋白质序列列于SEQID NO:136至SEQ ID NO:139中。同样地，可测试这些支架在体外对仅具有单一识别序列的靶标的DNA结合能力。为了与现有TALEN比较，FokI核酸酶（作为非限制性实例的SEQ ID NO:368和特定残基P381至F583）的催化结构域可与基线支架的N端或C端融合。使用这些控制的有效切割需要包含两个TALE结合序列的靶标位点DNA。
除了使用天然发生的序列验证活性之外，生成了识别相关序列的五个人工RVD构建体（图3）：RagT2-R、NptIIT5-L、NptIIT5-R、NptIIT6-L、NptIIT6-R。插入RVD的示例性蛋白质序列列于SEQ ID NO:253至SEQ ID NO:257中。人工RVD序列如上所述用于sT1或sT2支架中以生成期望的靶向致密TALEN。
通过使催化结构域与基线支架的N端或C端（分别为图5，A或B）生成了基础致密TALEN（cTALEN）。经历与TALE DNA结合结构域融合的催化结构域的非穷举性列表呈现于表2中。可使用的接头的非穷举性列表呈现于表3中。可注意到，接头设计可取决于所附件催化结构域的性质及其给定应用。还可期望，可构建具体工程化的接头以更好地控制或调节任一或两个结构域的活性。以下的实施例5、6和7讨论了其中可限定接头的另外的和替代方法。所有的cTALEN设计都使用我们的酵母测定来评价（参见实施例1）并且提供了比得上现有工程化的兆核酸酶的可检测活性。
实施例3a：TALE::TevI致密TALEN
使GIY-YIG内切核酸酶家族成员I-TevI（SEQ ID NO:20）的催化结构域与TALE源支架（由N端结构域、由RVD构成的中央核心和C端结构域构成）融合以产生新一类的cTALEN（TALE::TevI）。为了区分催化结构域（CD）融合物的方向（N端与C端），构建体名称写为CD::TALE-RVD（催化结构域与TALE结构域N端融合）或TALE-RVD::CD（催化结构域与TALE结构域C端融合），其中“-RVD”任选地指示由TALE结构域识别的序列并且“CD”是催化结构域类型。本文中我们描述了例如靶向AvrBs3序列的新型TALE::TevI构建体，因此称为TALE-AvrBs3::TevI。
酵母中TALE::TevI的活性
选择这样的核心TALE支架sT2（SEQ ID NO:135）：（a）不同组RVD结构域可插入到其上以改变DNA结合特异性；并且（b）选择I-TevI源催化结构域可附加到其上的N端或C端以影响DNA切割（或产生切口）。先前提到的sT2截短支架通过PCR由全长核心TALEN支架模板（pCLS7183,SEQ ID NO:141）使用引物CMP_G061（SEQ ID NO:142）和CMP_G065（SEQ ID NO:143）生成，并且克隆到载体pCLS7865（SEQ ID NO:144）中以生成pCLS7865-cTAL11_CFS1（pCLS9009,SEQ ID NO:145），其中CFS1指示氨基酸序列-GSSG-（编码的DNA中具有基本的限制位点BamHI和Kpn2I以有助于克隆）。在模板TevCreD01[质粒pCLS6614（SEQ ID NO:146）中的SEQ ID NO:109蛋白质]上使用引物对CMP_G069（SEQID NO:147）和CMP_G070（SEQ ID NO:148），TevCreD02[质粒pCLS6615（SEQID NO:203）中的SEQ ID NO:110蛋白质]上使用引物对CMP_G069（SEQ ID NO:147）和CMP_G071（SEQ ID NO:149）或者TevCreD05[质粒pCLS6618（SEQ IDNO:258）中的SEQ ID NO:113蛋白质]上使用引物对CMP_G069（SEQ ID NO:147）和CMP_G115（SEQ ID NO:259），通过PCR扩增I-TevI（SEQ ID NO:20）催化结构域的三个变体，并且通过使用BamHI和EagI限制位点的限制和连接亚克隆到pCLS9009骨架中，分别产生pCLS7865-cT11_TevD01（pCLS9010,SEQ ID NO:150）、pCLS7865-cT11_TevD02（pCLS9011,SEQ ID NO:151）和pCLS7865-cT11_TevD05（pCLS15775,SEQ ID NO:260）。所有的融合物包含连接TALE源DNA结合结构域和I-TevI源催化结构域的二肽-GS-。
使用用于接收质粒的IIS型限制酶BsmBI以及用于所插入RVD序列的BbvI和SfaNI，将编码靶向AvrBs3位点的RVD的DNA序列（SEQ ID NO:152）亚克隆到质粒pCLS9010（SEQ ID NO:150，编码SEQ ID NO:420的蛋白质）、pCLS9011（SEQ ID NO:151，编码SEQ ID NO:421的蛋白质）和pCLS15775（SEQ ID NO:260，编码SEQ ID NO:422的蛋白质）中以分别产生随后的TALE-AvrBs3::TevI构建体cT11Avr_TevD01（pCLS9012,SEQ ID NO:218,编码SEQ ID NO:423的蛋白质）、cT11Avr_TevD02（pCLS9013,SEQ ID NO:153,编码SEQ ID NO:424的蛋白质）和cT11Avr_TevD05（pCLS15776,SEQ ID NO:261,编码SEQ ID NO:425的蛋白质）。对这些TALE-AvrBs3::TevI构建体进行测序并根据需要将插入物转移至另外的载体（见下）。
使用质粒pCLS9012、pCLS9013和pCLS15776通过酵母体内克隆分别制备最后的TALE-AvrBs3：：Tevl酵母表达质粒pCLS8523（SEQ ID NO:154）、pCLS8524（SEQ ID NO:155）和pCLS12092（SEQ ID NO:262）。为了通过体内同源重组生成完整的编码序列，使用高效率LiAc转化方案（Arnould等.2007），分别使用通过用BssHII消化的线性化约40ng每种质粒以及通过用NcoI和EagI消化的线性化1ng pCLS0542（SEQ ID NO:156）质粒DNA来转化酵母啤酒酵母菌株FYC2-6A（MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中在假回文靶标上测试了TALE-AvrBs3::TevI构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590,SEQ ID NO:244）的活性。AvrBs3靶标包含带有3’近端并列的两个相同识别序列，其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开（SEQ ID NO:157至192,表6）。在酵母细胞中对其各自靶标的TALE-AvrBs3::TevI活性水平示于图9中，图9中归纳的数据示出TALE-AvrBs3::TevI对酵母中的几个靶标具有活性。
哺乳动物细胞中TALE::TevI的活性
使用用于接收质粒的AscI和XhoI限制酶以及用于TALE-AvrBs3::TevI插入的BssHII和XhoI限制酶将来自pCLS9012（SEQ ID NO:218）或pCLS9013（SEQ IDNO:153）的编码TALE-AvrBs3::TevI构建体的DNA亚克隆到pCLS1853（SEQ IDNO:193）哺乳动物表达质粒中，分别产生哺乳动物表达质粒pCLS8993和pCLS8994（SEQ ID NO:194和195）。
使用标准Gateway方案（INVITROGEN）将包含TALEN DNA靶标序列的所有哺乳动物靶标报道质粒构建到CHO报道载体中（Arnould,Chames等.2006,Grizot,Epinat等.2010）。在哺乳动物细胞（CHO K1）中的染色体外测定中测试针对假回文靶标的TALE-AvrBs3::TevI构建体，以将其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN的活性进行比较。AvrBs3靶标包含带有3’末端并列的两个相同识别序列，其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开（SEQ IDNO:157至192,表6）。
对于该测定，在PolyFect试剂（1μL/孔）存在下，在96孔板形式中用75ng靶载体和增加量的每种变体DNA（0.7至25ng）转染CHO K1细胞。使用空载体将转染DNA的总量完成至125ng（靶标DNA、变体DNA、载剂DNA）。转染72小时后，移除培养基并添加150μL裂解/暴露（revelation）缓冲液用于进行β-半乳糖苷酶液体测定。在37℃下孵育之后，在420nm下测量光学密度。整个过程在自动化Velocity11BioCel平台上进行（Grizot,Epinat等.2009）。
哺乳动物细胞中TALE-AvrBs3::TevI构建体（转染12.5ng DNA）对Avr15靶标（SEQ ID NO:167）的活性水平示于图10中。TALE-AvrBs3::TevI似乎对于切割靶标序列是有效的。
TALE::TevI切口酶活性
以上实施例中所述的结果阐明了两种TALE::TevI融合物，每一种包含一个基于TALE的DNA结合结构域和一个基于I-TevI的催化结构域，以产生可检测活性。使用的测定通过单链退火（基本由DSB引起的过程）来测量串联重复重组（Sugawara和Haber1992;Paques和Duchateau2007）。TALE::TevI融合物可具有不足以单独引起基于细胞的测定中的信号的切口酶活性。但是，与两个邻近位点结合的两个TALE::TevI蛋白质可有时产生两个独立切口，其当邻近不同DNA链或在不同DNA链上时可产生DSB。在这种情况下，每种TALE::TevI是能够产生切口的cTALEN。
建立不同实验以测量TALE::TevI切口酶活性：
超螺旋环状质粒切口和/或线性化测定
使用NcoI/Eagl限制位点将编码TALE-AvrBs3::TevI构建体的序列cT11Avr_TevD01和cT11Avr_TevD02克隆到基于T7的表达载体中以分别产生质粒pCLS9021（SEQ ID NO:201）和pCLS9022（SEQ ID NO:202）。该克隆步骤导致了具有用于纯化的另外的六个组氨酸（hexa-His）标签的TALE-AvrBs3::TevI蛋白质。然后通过以下两种方法之一将质粒pCLS9021和pCLS9022用于产生活性蛋白质：
1、将质粒用于标准体外转录/翻译系统；直接使用来自翻译的裂解物而不进行进一步纯化。
2、使用标准方法将质粒用于转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞以表达，所述标准方法即：生长至对数期，用IPTG诱导，收获，细胞裂解以及经过亲和方法纯化组氨酸（His）标记的蛋白质。
针对不具有AvrBs3识别位点序列，具有一个或两个AvrBs3识别位点序列测定活性蛋白质。当存在多于一个的位点时，相同识别序列以3’端近端并列，并被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开。
进行了超螺旋环状质粒切口和/或线性化测定。通过标准方法制备含有上述靶标序列的PCR产物并通过柱纯化以得到＞98%纯度的超螺旋质粒。将增加量的TALE-AvrBs3::TevI蛋白质（如上制备）与每种质粒在37℃下在促进DNA切割的条件下一起孵育1小时。在琼脂凝胶上分离反应产物并通过EtBr染色可视化。
线状DNA切口和/或切割测定
还进行了线状DNA切口和/或切割测定。通过标准方法制备含有上述DNA靶标的质粒并通过柱纯化以得到＞98%纯度的线状底物。然后将增加量的TALE-AvrBs3::TevI蛋白质（如上制备）与每种PCR底物在37℃下在促进DNA切割的条件下一起孵育1小时。在变性丙烯酰胺凝胶上分离反应产物并使单链DNA可视化。
工程化的TALE::TevI
选择AvrBs3源TALEN（SEQ ID NO:196）的C端结构域的不同截短的变体作为初始支架。这些变体的子集包括在位置E886(C0),P897(C11),G914(C28),L926(C40),D950(C64),R1000(C115),D1059(C172)后的截短（截短的C端结构域C11至C172的蛋白质结构域分别在SEQ ID NO:204至209中给出）和P1117后的截短[也称为缺少天然AvrBs3（SEQ ID NO:220）C端结构域的活化结构域的Cterwt或WT Cter（SEQ ID NO:210）]。编码包含AvrBs3源N端结构域、AvrBs3源的不同组重复结构域和截短的AvrBs3源C端结构域的变体支架的质粒[基于pCLS7184（SEQ ID NO:196）的pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817（SEQ ID NO:211至217）]，允许使用限制位点BamHI和EagI克隆与C端结构域融合的任何催化结构域。
由I-TevI的N端区域设计I-TevI（SEQ ID NO:20）的催化结构域的变体。这些变体的子集合包括催化结构域的截短，如Liu等,2008中命名的其接头的不耐缺失区，其接头的耐缺失区和其锌指（SEQ ID NO:197至200）（Liu,Dansereau等.2008）。
对应于I-TevI这些变体的DNA通过PCR扩增以引入DNA水平上的BamHI（在编码链的5’）和EagI（在编码链的3’）限制位点，以及蛋白质水平上的TALEC端结构域与I-TevI催化结构域变体之间的接头（例如，-SGGSGS-延伸，SEQ IDNO:219）。使用BamHI和EagI和标准分子生物学方法通过将I-TevI催化结构域变体插入到支架变体中生成最后的TALE::TevI构建体。
如之前所述（国际PCT公开WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TALE-AvrBs3::TevI构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590,SEQ ID NO:244）的活性。AvrBs3靶标包含以3’端近端排列的两个相同识别序列，其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开的（SEQ ID NO:157至192,表6）。
实施例3b：TevI::TALE致密TALEN
选择实施例3a中所述的sT2（SEQ ID NO:135）核心TALE支架以生成pCLS7865-cTAL11_NFS1（pCLS9008,SEQ ID NO:234），其中NFS1表示氨基酸序列-GSSG-（在编码DNA中具有潜在的限制位点BamHI和Kpn2I以帮助克隆）。在模板TevCreD01[质粒pCLS6614（SEQ ID NO:146）中的SEQ ID NO:109蛋白质]上使用引物对CMP_G001(SEQ ID NO:239)和CMP_G067(SEQ ID NO:263)或CMP_G152(SEQ ID NO:264)，TevCreD02[质粒pCLS6615（SEQ ID NO:203）中的SEQ ID NO:110蛋白质]上使用引物对CMP_G001(SEQ ID NO:239)和CMP_G068(SEQ ID NO:240)或者TevCreD05[质粒pCLS6618（SEQ ID NO:258）中的SEQ ID NO:113蛋白质]上使用引物对CMP_G001(SEQ ID NO:239)和CMP_G114(SEQ ID NO:265)，通过PCR扩增I-TevI（SEQ ID NO:20）催化结构域的四个变体，并且通过使用NcoI和Kpn2I限制位点的限制和连接亚克隆到pCLS9008骨架中，分别产生pCLS7865-TevW01_cT11（pCLS15777,SEQ ID NO:266，编码SEQ ID NO:426的蛋白质）、pCLS7865-TevD01_cT11（pCLS15778,SEQID NO:267，编码SEQ ID NO:427的蛋白质）、pCLS7865-TevD02_cT11（pCLS12730,SEQ ID NO:235，编码SEQ ID NO:428的蛋白质）和pCLS7865-TevD05_cT11（pCLS15779,SEQ ID NO:268，编码SEQ ID NO:429的蛋白质）。而基于TevW01_cT11的融合物包含连接TALE源DNA结合结构域和I-TevI源催化结构域的二肽-GS-，所有的其他构建体包含更长的五肽-QGPSG-以连接结构域。
酵母中TevI::TALE的活性
使用用于接收质粒的IIS型限制酶BsmBI以及用于所插入RVD序列的BbvI和SfaNI，将编码靶向AvrBs3位点的RVD的DNA序列（SEQ ID NO:152）亚克隆到质粒pCLS15777（SEQ ID NO:266）、pCLS15778（SEQ ID NO:267）和pCLS12730（SEQ ID NO:235）中以分别产生随后的TevI::TALE-AvrBs3构建体TevW01_cT11Avr（pCLS15780,SEQ ID NO:269,编码SEQ ID NO:430的蛋白质）、TevD01_cT11Avr（pCLS15781,SEQ ID NO:270,编码SEQ ID NO:431的蛋白质）和TevD02_cT11Avr（pCLS12731,SEQ ID NO:236,编码SEQ ID NO:432的蛋白质）。类似的克隆技术用于将靶向RagT2-R位点（SEQ ID NO:271）的RVD引入到质粒pCLS15779（SEQ ID NO:268）中以产生后续的构建体TevD05_cT11RagT2-R（pCLS15782,SEQ ID NO:272）。对所有的TevI::TALE构建体进行测序并根据需要将插入物转移至另外的载体（见下）。
使用质粒pCLS15780（SEQ ID NO:269）、pCLS15781（SEQ ID NO:270）、pCLS12731（SEQ ID NO:236）和pCLS15782（SEQ ID NO:272）通过酵母体内克隆分别制备最后的基于TevI::TALE的酵母表达质粒pCLS11979（SEQ ID NO:273）、pCLS8521（SEQ ID NO: 274）、pCLS8522（SEQ ID NO: 237）和pCLS12100（SEQ ID NO: 275）。为了通过体内同源重组生成完整的编码序列，使用高效率LiAc转化方案（Arnould等.2007），分别使用通过用BssHII消化的线性化约40ng每种质粒以及通过用NcoI和EagI消化的线性化1ng pCLS0542（SEQ ID NO:156）质粒DNA来转化酵母啤酒酵母菌株FYC2-6A（MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TevI::TALE-AvrBs3和TevI::TALE-RagT2-R构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590, SEQ ID NO: 244）的活性。AvrBs3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别序列（SEQ ID NO: 157至192,表6），其被与范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开的。此外，在仅具有一个AvrBs3或RagT2-R识别位点的靶标上对构建体进行了测试（SEQ ID NO: 238,表8）。酵母中TevI::TALE-AvrBs3活性水平比得上TALE-AvrBs3::TevI（pCLS8524, SEQ ID NO: 155）对适合靶标的活性水平。表8中阐明了根据本发明的cTALEN对于样品单位点靶标的显著活性。
Figure BDA0000429500830000861
表8：TevI::TALE-AvrBs3和TevI::TALE-RagT2-R对双位点和单位点DNA靶标的活性。相对活性规范为：n.d.，无可检测活性；+，<25%活性；++，25%至<50%活性；+++，50%至<75%活性；++++，75%至100%活性。
植物中TevI::TALE的活性
使用用于接收质粒的IIS型限制酶BsmBI和用于所插入RVD序列的BbvI和SfaNI将编码靶向NptIIT5-L和NptIIT6-L位点的RVD的DNA序列（SEQ ID NO:276至279）亚克隆到质粒pCLS12730（SEQ ID NO:235）中，以分别产生后续的TevI::TALE构建体TevD02_cT11NptIIT5-L(pCLS15783,SEQ ID NO:280)和TevD02_cT11NptIIT6-L(pCLS15784,SEQ ID NO:281)。对构建体进行测序并且通过标准克隆技术将TevI::TALE插入物转移至质粒pCLS14529（SEQ ID NO:282）中以分别生成最后的TevI::TALE-NptIIT5-L和TevI::TALE-NptIIT6-L表达质粒pCLS14579(SEQ ID NO:283)和pCLS14581(SEQ ID NO:284)。质粒pCLS14529允许在启动子下游的克隆目的基因序列，以在植物细胞中赋予高水平的构建表达。
为了测试在植物细胞中的活性，采用了基于YFP的单链退火（SSA）测定。YFP报道基因具有短的成倍的编码序列，其被NptIIT5或NptIIT6 TALEN靶位点中断。靶位点处的切割刺激重复序列之间的重组，导致了功能性YFP基因的重新构建。为了定量切割，通过PEG介导转化（如现有技术水平所已知的或者来源于现有技术水平）将报道分子与编码基于FokI的TALEN或致密TALEN的构建体一起引入到烟草原生质体中。通过在每次转化中使用相同量的质粒——即，15μg每个编码YFP和TALEN或cTALEN的质粒，得到了均匀的转化效率。24小时后，原生质体经历流式细胞术以定量YFP阳性细胞的数目。在植物中使用根据本发明的cTALEN的TevI::TALE活性水平与基于FokI的TALEN对照构建体对所测试靶标的活性是可比较的（表9）。
Figure BDA0000429500830000871
表9：TevI::TALE-NptIIT5-L和TevI::TALE-NptIIT6-L对适当DNA靶标的活性。对于对照构建体的相对活性规范为：n.a.，不适用；+，对照的100%活性（2%YFP阳性细胞）。
实施例3c：TALE::NucA致密TALEN
将来自于鱼腥藻种的非特异性内切核酸酶NucA（SEQ ID NO: 26）与TALE源支架（由N端结构域、由RVD构成的中央核心和C端结构域构成）融合以产生新一类的cTALEN（TALE::NucA）。为了区分催化结构域（CD）融合物的方向（N端与C端），构建体名称写为CD::TALE-RVD（催化结构域与TALE结构域N端融合）或TALE-RVD::CD（催化结构域与TALE结构域C端融合），其中“-RVD”任选地指示由TALE结构域识别的序列并且“CD”是催化结构域类型。本文中描述了例如靶向AvrBs3序列的新型构建体TALE::NucA，因此称为TALE-AvrBs3::NucA。尤其是，野生型NucA内切核酸酶可通过与NuiA蛋白（SEQ ID NO: 229）的复合物形成来抑制。在致密TALEN环境中，NuiA蛋白可作为辅助结构域起作用以调控TALE::NucA构建体的核酸酶活性。
酵母中TALE::NucA的活性
选择这样的核心TALE支架sT2（SEQ ID NO: 135）：（a）不同组RVD结构域可插入到其上以改变DNA结合特异性；并且（b）选择NucA源催化结构域可附加到其上的N端或C端以影响DNA切割（或产生切口）。先前提到的sT2截短支架通过PCR由全长核心TALEN支架模板（pCLS7183, SEQ ID NO: 141）使用引物CMP_G061（SEQ ID NO: 142）和CMP_G065（SEQ ID NO: 143）生成并且克隆到载体pCLS7865（SEQ ID NO:144）中以生成pCLS7865-cTAL11_CFS1（pCLS9009,SEQ ID NO:145），其中CFS1指示氨基酸序列-GSSG-（编码DNA中潜在的限制位点BamHI和Kpn2I有助于克隆）。通过使用BamHI和EagI限制位点的限制和连接将NucA（SEQ ID NO:26）催化结构域（对应于氨基酸残基25至274）亚克隆到pCLS9009骨架（SEQ ID NO:145）中，产生了pCLS7865-cT11_NucA（pCLS9937,SEQ ID NO:221，编码SEQ ID NO:433的蛋白质）。融合物包含连接TALE源DNA结合结构域和NucA源催化结构域的二肽-GS-。克隆步骤还在氨基酸水平上在NucA催化结构域的Cter处带来了AAD序列。
使用用于接收质粒的IIS型限制酶BsmBI以及用于所插入RVD序列的BbvI和SfaNI，将编码靶向AvrBs3位点的RVD的DNA序列（SEQ ID NO:152）亚克隆到质粒pCLS9937（SEQ ID NO:221）中以产生随后的TALE-AvrBs3::NucA构建体cT11Avr_NucA（pCLS9938,SEQ ID NO:222,编码SEQ ID NO:434的蛋白质）。对TALE-AvrBs3::NucA构建体进行测序并根据需要将插入物转移至另外的载体（见下）。
使用质粒pCLS9938（SEQ ID NO:222）通过酵母体内克隆制备最后的TALE-AvrBs3::NucA酵母表达质粒pCLS9924（SEQ ID NO:223）。为了通过体内同源重组生成完整的编码序列，使用高效率LiAc转化方案（Arnould等.2007），分别使用通过用BssHII消化的线性化约40ng质粒（pCLS9938）以及通过用NcoI和EagI消化的线性化1ng pCLS0542（SEQ ID NO:156）质粒DNA来转化酵母啤酒酵母菌株FYC2-6A（MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TALE-AvrBs3::NucA构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590,SEQ ID NO:244）的活性。AvrBs3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别位点（SEQ ID NO:157至192,表7），其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开。此外，对于仅具有单一AvrBs3识别位点（SEQ ID NO:224;表7）的靶标测试了构建体。
工程化的TALE::NucA
选择AvrBs3源TALEN（SEQ ID NO:196）的C端结构域截短不同的变体作为初始支架。这些变体的子集合包括在位置E886(C0)、P897(C11)、G914(C28)、L926(C40)、D950(C64)、R1000(C115)、D1059(C172)后的截短（截短的C端结构域C11至C172的蛋白质结构域分别在SEQ ID NO:204至209中给出）和P1117后的截短[也称为缺少天然AvrBs3（SEQ ID NO:220）C端结构域的活化结构域的Cter wt或WT Cter（SEQ ID NO:210）]。编码包含AvrBs3源N端结构域、AvrBs3源的重复结构域组和截短的AvrBs3源C端结构域的变体支架的质粒[基于pCLS7184（SEQ ID NO:196）的pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817（SEQ ID NO:211至217）]，允许使用限制位点BamHI和EagI克隆与C端结构域融合的任何催化结构域。
对应于NucA的氨基酸残基25至274的DNA通过PCR扩增以引入DNA水平上的BamHI（在编码链的5’）和EagI（在编码链的3’）限制位点，以及蛋白质水平上的TALE C端结构域与NucA催化结构域之间的接头（例如，-SGGSGS-延伸，SEQ ID NO:219）。使用BamHI和EagI和标准分子生物学方法通过将NucA催化结构域插入到支架变体中生成最后的TALE::NucA构建体。例如，将分别由pCLS7803、pCLS7807、pCLS7811编码的在位置P897(C11)、G914(C28)和D950(C64)后截短的支架变体（SEQ ID NO:212、213和215）与NucA催化结构域（SEQID NO:26）融合，产生了pCLS9596、pCLS9597和pCLS9599（SEQ ID NO:225至227）。克隆步骤还在氨基酸水平上在NucA催化结构域的Cter处带来了AAD序列。
如之前所述（国际PCT公开WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TALE-AvrBs3::TevI构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590,SEQ ID NO:244）的活性。AvrBs3靶标包含以3’端近端并列的两个相同识别序列，其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开的（SEQ ID NO:157至192,表7）。此外，对于仅具有单一AvrBs3识别序列（SEQ ID NO:224）的靶标测试了TALE-AvrBs3：：NucA构建体。图11中归纳的数据示出根据本发明的cTALEN，TALE-AvrBs3::NucA构建体对具有至少一个AvrBs3识别位点的所有靶标具有活性。
实施例3d：TALE::ColE7致密TALEN
将来自于大肠杆菌的非特异性内切核酸酶ColE7（SEQ ID NO:140）的催化结构域与TALE源支架（由N端结构域、由RVD构成的中央核心和C端结构域构成）融合以产生新一类的cTALEN（TALE::ColE7）。为了区分催化结构域（CD）融合物的方向（N端与C端），构建体名称写为CD::TALE-RVD（催化结构域与TALE结构域N端融合）或TALE-RVD::CD（催化结构域与TALE结构域C端融合），其中“-RVD”任选地指示由TALE结构域识别的序列并且“CD”是催化结构域类型。本文中描述了例如靶向AvrBs3序列的新型构建体TALE::ColE7，因此称为TALE-AvrBs3::ColE7。尤其是，野生型ColE7内切核酸酶可通过与Im7免疫蛋白（SEQ ID NO:230）的复合物形成来抑制。在致密TALEN环境中，Im7蛋白可作为辅助结构域起作用以调控TALE::ColE7构建体的核酸酶活性。
酵母中TALE::ColE7的活性
选择这样的核心TALE支架sT2（SEQ ID NO:135）：（a）不同组RVD结构域可插入到其上以改变DNA结合特异性；并且（b）选择ColE7源催化结构域可连附加其上的N端或C端以影响DNA切割（或产生切口）。先前提到的sT2截短支架通过PCR由全长核心TALEN支架模板（pCLS7183,SEQ ID NO:141）使用引物CMP_G061（SEQ ID NO:142）和CMP_G065（SEQ ID NO:143）生成并且克隆到载体pCLS7865（SEQ ID NO:144）中以生成pCLS7865-cTAL11_CFS1（pCLS9009,SEQ ID NO:145），其中CFS1指示氨基酸序列-GSSG-（编码DNA中具有潜在的限制位点BamHI和Kpn2I有助于克隆）。通过使用Kpn2I和EagI限制位点的限制和连接将ColE7（SEQ ID NO:140）催化结构域亚克隆到pCLS9009骨架中，产生了pCLS7865-cT11_ColE7（pCLS9939,SEQ ID NO:231，编码SEQ ID NO:435的蛋白质）。融合物包含连接TALE源DNA结合结构域和ColE7源催化结构域的二肽-GSSG-。
使用用于接收质粒的IIS型限制酶BsmBI以及用于所插入RVD序列的BbvI和SfaNI，将编码靶向AvrBs3位点的RVD的DNA序列（SEQ ID NO:152）亚克隆到质粒pCLS9939（SEQ ID NO:231）中以产生随后的TALE-AvrBs3::ColE7构建体cT11Avr_ColE7（pCLS9940,SEQ ID NO:232,编码SEQ ID NO:436的蛋白质）。对TALE-AvrBs3::ColE7构建体进行测序并根据需要将插入物转移至另外的载体（见下）。
使用质粒pCLS9940（SEQ ID NO:232）通过酵母体内克隆制备最后的TALE-AvrBs3::ColE7酵母表达质粒pCLS8589（SEQ ID NO:233）。为了通过体内同源重组生成完整的编码序列，使用高效率LiAc转化方案（Arnould等.2007），分别使用通过用BssHII消化的线性化约40ng质粒（pCLS9940）以及通过用NcoI和EagI消化的线性化1ng pCLS0542（SEQ ID NO:156）质粒DNA来转化酵母啤酒酵母菌株FYC2-6A（MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TALE-AvrBs3::ColE7构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590,SEQ ID NO:244）的活性。AvrBs3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别序列，其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开（SEQ ID NO:157至192,表7）。此外，对于仅具有单一AvrBs3识别位点（SEQ ID NO:224;表7）的靶标测试了构建体。酵母细胞中对于各自靶标的TALE-AvrBs3::ColE7活性水平示于图12中。
植物中TALE::ColE7的活性
使用用于接收质粒的IIS型限制酶BsmBI和用于所插入RVD序列的BbvI和SfaNI将编码靶向NptIIT5-L和NptIIT6-L位点的RVD的DNA序列（SEQ ID NO:276至279）亚克隆到质粒pCLS15785（SEQ ID NO:285，质粒pCLS9939,SEQ IDNO:231的C端修饰ColE7K497A突变体）中，以分别产生后续的TALE::ColE7_A497构建体cT11NptIIT5-L_ColE7_A497（pCLS15786,SEQ ID NO:286）和cT11NptIIT6-L_ColE7_A497（pCLS15787,SEQ ID NO:287）。对构建体进行测序并且通过标准克隆技术将TALE::ColE7_A497插入物转移至质粒pCLS14529（SEQ ID NO:282）中以分别生成最后的TALE-NptIIT5-L::ColE7_A497和TALE-NptIIT6-L::ColE7_A497表达质粒pCLS14584（SEQ ID NO:288，编码SEQID NO:437的蛋白质）和pCLS14587（SEQ ID NO:289，编码SEQ ID NO:438的蛋白质）。质粒pCLS14529允许在启动子下游克隆目的基因序列，以在植物细胞中赋予高水平的构建表达。
为了测试在植物细胞中的活性，采用了基于YFP的单链退火（SSA）测定。YFP报道基因具有短的成倍的编码序列，其被NptIIT5或NptIIT6TALEN靶位点中断。靶位点处的切割刺激重复序列之间的重组，导致了功能性YFP基因的重新构建。为了定量切割，通过PEG介导转化，将报道分子与编码基于FokI的TALEN或致密TALEN的构建体一起引入到烟草原生质体中。通过在每次转化中使用相同量的质粒——即，15μg每个编码YFP和TALEN或cTALEN的质粒，得到了均匀的转化效率。24小时后，原生质体经历流式细胞术以定量YFP阳性细胞的数目。在植物中使用根据本发明的cTALEN的TALE::ColE7_A497活性水平与基于FokI的TALEN对照构建体对所测试靶标的活性是可比较的（表10）。
Figure BDA0000429500830000911
表10：TALE-NptIIT5-L::ColE7_A497和TALE-NptIIT6-L::ColE7_A497对适当DNA靶标的活性。对于对照构建体的相对活性规范为：n.a.，不适用；+，对照的100%活性（8%YFP阳性细胞）。
工程化的TALE::ColE7
选择AvrBs3源TALEN（SEQ ID NO:196）的C端结构域截短不同的变体作为初始支架。这些变体的子集合包括在位置E886(C0)、P897(C11)、G914(C28)、L926(C40)、D950(C64)、R1000(C115)、D1059(C172)后的截短（截短的C端结构域C11至C172的蛋白质结构域分别在SEQ ID NO:204至209中给出）和P1117后的截短[也称为缺少天然AvrBs3（SEQ ID NO:220）C端结构域的活化结构域的Cter wt或WT Cter（SEQ ID NO:210）]。编码包含AvrBs3源N端结构域、AvrBs3源的重复结构域组和截短的AvrBs3源C端结构域的变体支架的质粒[基于pCLS7184（SEQ ID NO:196）的pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817（SEQ ID NO:211至217）]，允许使用限制位点BamHI和EagI克隆与C端结构域融合的任何催化结构域。
对应于ColE7的催化结构域的DNA通过PCR扩增以引入DNA水平上的BamHI（在编码链的5’）和EagI（在编码链的3’）限制位点，以及蛋白质水平上的TALE C端结构域与ColE7催化结构域变体之间的接头（例如，-SGGSGS-延伸，SEQ ID NO:219）。另外，可生成在以下位置处具有变化（单个或组合的）的调控催化活性的ColE7内切核酸酶的变体：K446、R447、D493、R496、K497、H545、N560和H573[位置指整个ColE7蛋白质（SEQ ID NO:11）的氨基酸序列]。使用BamHI和EagI和标准分子生物学方法通过将ColE7催化结构域插入到支架变体中生成最后的TALE::ColE7构建体。
如之前所述（国际PCT公开WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TALE-AvrBs3::ColE7构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590,SEQ ID NO:244）的活性。AvrBs3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别序列（SEQ ID NO:157至192,表7），其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开。此外，对于仅具有单一AvrBs3识别位点（SEQ ID NO:224;表7）的靶标测试了构建体。
实施例3e：TALE::CreI致密TALEN
选择野生型I-CreI兆核酸酶（SEQ ID NO:106）作为蛋白质模板以衍生序列特异性催化结构域，其在与TALE源支架（由N端结构域、由RVD构成的中央核心和C端结构域构成）融合以产生新一类的cTALEN（TALE::CreI）。为了区分催化结构域（CD）融合物的方向（N端与C端），构建体名称写为CD::TALE-RVD（催化结构域与TALE结构域N端融合）或TALE-RVD::CD（催化结构域与TALE结构域C端融合），其中“-RVD”任选地指示由TALE结构域识别的序列并且“CD”是催化结构域类型。本文中描述了靶向例如T细胞受体B基因（TCRB基因,SEQ IDNO:290,图13）序列的新的基于TALE::CreI的构建体，均通过TALE DNA结合结构域和再工程化的I-CreI结构域实现。显著地，TALE::CreI致密TALEN的特异性通过TALE DNA结合结构域和I-CreI源催化结构域二者驱动。在致密TALEN环境中，这样的蛋白质可在合理大小的单体蛋白质中提供治疗应用所要求的必要的高特异性。
酵母中TALE::CreI的活性
选择这样的核心TALE支架sT2（SEQ ID NO:135）：（a）不同组RVD结构域可插入到其上以改变DNA结合特异性；并且（b）选择I-Crel源催化结构域可连接到其上N端或C端以影响DNA切割（或产生切口）。先前提到的sT2截短支架通过PCR由全长核心TALEN支架模板（pCLS7183,SEQ ID NO:141）使用引物CMP_G061（SEQ ID NO:142）和CMP_G065（SEQ ID NO:143）生成并且克隆到载体pCLS7865（SEQ ID NO:144）中以生成pCLS7865-cTAL11_CFS1（pCLS9009,SEQ ID NO:145），其中CFS1指示氨基酸序列-GSSG-（编码DNA中具有潜在的限制位点BamHI和Kpn2I有助于克隆）。在两步中对设计成靶向T细胞受体B基因（TCRB基因,SEQ ID NO:290,图13）的再工程化的I-CreI催化结构域进行亚克隆。首先，将其中NFS1（SEQ ID NO:98）包含20个氨基酸-GSDITKSKISEKMKGQGPSG-（在编码DNA中具有潜在的限制位点BamHI和Kpn21已有助于克隆）接头的I-Crel_NFS1（SEQ ID NO:122）支架与pCLS7865-cTAL11_CFS1支架（使用BamHI和EagI限制位点）融合以将NFS1接头插入编码序列的框内。随后使用Kpn2I和XhoI限制位点将I-CreI兆核酸酶替换为工程化的TCRB02-A兆核酸酶（pCLS6857,SEQ ID NO:291）构建体，产生pCLS7865-cT11_scTB2aD01（pCLS15788,SEQ ID NO:292,编码SEQ ID NO:439的蛋白质）。TCRB02-A兆核酸酶的两点突变变体，TCRB02-A_148C（pCLS12083,SEQ ID NO:293，编码SEQ ID NO:442的蛋白质）和TCRB02-A_333C（pCLS12195,SEQ ID NO:294，编码SEQ ID NO:443的蛋白质）也亚克隆为催化结构域，与TALE结合核心融合，产生构建体pCLS7865-cT11_scTB2aD01_148C（pCLS15789,SEQ IDNO:295，编码SEQ ID NO:440的蛋白质）和pCLS7865-cT11_scTB2aD01_333C（pCLS15790,SEQ ID NO:296，编码SEQ ID NO:441的蛋白质）。
在距离兆核酸酶位点不同距离处设计编码靶向TCRB基因的RVD的三种DNA序列，产生RVD TCRB02A1（SEQ ID NO:297）、TCRB02A2（SEQ ID NO:298）和TCRB02A3（SEQ ID NO:299），其分别靶向位于兆核酸酶TCRB位点上游7bp、12bp和16bp处的序列（图13）。使用用于接收质粒的IIS型限制酶BsmBI以及用于所插入RVD序列的BbvI和SfaNI，将用于每个RVD的DNA序列独立地亚克隆到质粒pCLS15788（SEQ ID NO:292）中，以产生随后的TALE::scTB2aD01构建体cT11TB2A1_scTB2aD01（pCLS15791,SEQ ID NO:300）、cT11TB2A2_scTB2aD01（pCLS15792,SEQ ID NO:301）和cT11TB2A3_scTB2aD01（pCLS15793,SEQ ID NO:302）。另外，将TCRB02A2（SEQ ID NO:298）RVD类似地克隆到pCLS15789（SEQ ID NO:295）中以产生cT11TB2A2_scTB2aD01_148C（pCLS15794,SEQ ID NO:303）。对所有的构建体进行测序并根据需要将插入物转移至另外的载体（见下）。
分别使用质粒pCLS15791（SEQ ID NO:300）、pCLS15792（SEQ ID NO:301）、pCLS15793（SEQ ID NO:302）和pCLS15794（SEQ ID NO:303）通过酵母体内克隆制备最后的TALE::scTB2aD01酵母表达质粒pCLS13449（SEQ ID NO:304,编码SEQ ID NO:444的蛋白质）、pCLS13450（SEQ ID NO:305,编码SEQ ID NO:445的蛋白质）、pCLS13451（SEQ ID NO:306,编码SEQ ID NO:446的蛋白质）和pCLS15148（SEQ ID NO:307,编码SEQ ID NO:455的蛋白质）。为了通过体内同源重组生成完整的编码序列，使用高效率LiAc转化方案（Arnould等.2007），分别使用通过用BssHII消化的线性化约40ng每种质粒以及通过用NcoI和EagI消化的线性化1ng pCLS0542（SEQ ID NO:156）质粒DNA来转化酵母啤酒酵母菌株FYC2-6A（MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN或兆核酸酶DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对杂交靶标TCRB02Tsp7（SEQID NO:AC4）、TCRB02Tsp12（SEQID NO:AC5）和TCRB02Tsp16（SEQID NO:AC6）测试了基于TALE::scTB2aD01的构建体，如图14所示。仅有TCRB02.1的靶标包括在内以比较与对于活性不需要TALEDNA结合位点的工程化的TCRB02-A兆核酸酶（pCLS6857,SEQ ID NO:291）的活性。对于指示的基于TALE::scTB2aD01构建体，酵母细胞中对各自靶标的活性水平示于图14中。特别是，在体内条件下测试的TALE-TB2A2::scTB2aD01_148C（pCLS15794,SEQ ID NO:303）构建体不再切割缺少由TALE DNA结合部分识别的DNA序列的靶标。
哺乳动物细胞中TALE::CreI的活性
使用用于接收质粒的AscI和XhoI限制酶以及用于基于TALE::scTB2aD01的插入物的BssHII和XhoI限制酶将来自pCLS15792（SEQ ID NO:301）和pCLS15793（SEQ ID NO:302）的编码TALE-TB2A2::scTB2aD01和TALE-TB2A3::scTB2aD01构建体的DNA亚克隆到pCLS1853（SEQ ID NO:193）哺乳动物表达质粒中，分别产生哺乳动物表达质粒pCLS14894和pCLS14895（SEQ ID NO:308和309）。
使用标准Gateway方案（INVITROGEN）将包含TALEN DNA靶标序列的所有哺乳动物靶标报道质粒构建到CHO报道载体中（Arnould,Chames等.2006,Grizot,Epinat等.2010）。
为了监测蛋白质表达水平，将基于TALE::scTB2aD01的构建体和工程化的TCRB02-A兆核酸酶（pCLS6857,SEQ ID NO:291）一起转染到哺乳动物细胞（HEK293）中。简言之，在脂质体存在下用300ng编码质粒的每种蛋白质转染细胞。转然后48小时，使用多克隆抗I-CreI抗体通过Western印迹分析每个样品的20μg总蛋白质提取物。典型的western印迹示于图15中。
使用细胞存活测定来评价基于TALE::scTB2aD01的构建体的相对毒性。CHOK1细胞用于以2.5*103/孔的密度接种到板上。第二天，使用Polyfect试剂使用不同量的编码基于TALE::scTB2aD01的构建体（pCLS14894和pCLS14895;SEQID NO:308和309）或工程化的TCRB02-A兆核酸酶（pCLS6857,SEQ ID NO:291）的质粒以及恒定量的GFP编码质粒（10ng）转染总量为200ng的细胞。在转染后第1天和第6天通过流式细胞术（Guava Easycyte,Guava technologies）监测GFP水平。细胞存活表示为百分比，计算方法为对于第1天测定的转化效率作校正的（第6天表达GFP的TALEN和兆核酸酶转染细胞）/（第6天表达GFP的对照转染细胞）之比。典型的细胞存活测定数据示于图16中。
在TREX2外切核酸酶存在下，通过检测NHEJ事件来监测体内的切割活性。在脂质体存在下，使用编码基于TALE::scTB2aD01的构建体（pCLS14894和pCLS14895;SEQ ID NO:308和309）或工程化的TCRB02-A兆核酸酶（pCLS6857,SEQ ID NO:291）的质粒（3μg）和2μg scTrex2编码质粒（pCLS8982,SEQ ID NO:310）来转染HEK293细胞。在转染后2天和7天用DNeasy Blood和Tissue kit（Qiagen）提取基因组DNA，并且在转染后第2天用寡核苷酸TRBC2F3（Seq IDNO:311）和TRBC2R3B（SEQ ID NO:312），在转后后第7天用寡核苷酸TRBC2F4（SEQID NO:315）和TRBC2R4B（SEQID NO:314），使用PCR扩增包含TCRB02位点（图13）的区域。将各自的PCR产物（100ng）进行热变性，通过缓慢冷却使其重新退火，然后用T7内切核酸酶1（NEB）在37℃下处理15分钟。在10%丙烯酰胺凝胶上分离经消化的PCR产物，并通过SYBRgreen（Invitrogen）染色进行观察。通过T7内切核酸酶对错配DNA序列的切割是在靶向基因座处由cTALEN或兆核酸酶的活性造成的NHEJ事件的指示。图17说明了与工程化TCRB02-A兆核酸酶（pCLS6857,SEQ ID NO:291）相比，基于TALE::scTB2aD01的构建体（pCLS14894和pCLS14895;SEQ ID NO:308和309）的可检测NHEJ活性。虽然在第2天的NHEJ结果对于所有构建体是相当的，但是在第7天的NHEJ活性仅对于基于TALE::scTB2aD01的构建体检测得到，表明这些致密TALEN确实不诱导细胞毒性。
工程化TALE::CreI
TALE::CreI致密TALEN的显著的新性质在于其独立的工程化最终分子的“杂交”特异性的能力。同样地，可在TALE::CreI源构建体中调控固有的活性/特异性比，允许空前的特定靶向并且保留高DNA切割活性。在其最简单的形式中，通过与基础DNA碱基具有假的一对一对应的RVD密码（图3）实现了TALE DNA结合结构域的成功重新靶向。但是，I-CreI部分的工程化代表了更大的挑战，原因是存在对于合适的DNA结合和切割活性所需的蛋白质-DNA接触的可能对应。已描述了成功再工程化I-CreI兆核酸酶以靶向新DNA序列的方法（WO2006097854、WO2008093249、WO03078619、WO2009095793、WO2007/049095、WO2007/057781、WO2006/097784、WO2006/097853、WO2007/060495、WO2007/049156和WO2004/067736）。由于这些方法中的一些依赖于群聚方法，所以可设想使用所述方法可以以逐步方式减少I-CreI部分的“绝对”特异性。例如，I-CreIDNA相互作用表面分解为离散的10NNN、7NN、5NNN和2NN区（每个单体亚基一半）允许新的工程化，其中在以外侧10NNN-7NN区中的“宽松”或宽泛特异性为代价的情况下，在中央5NNN-2NN区中维持高特异性。基本上，这样的方法可降低再工程化用于致密TALEN环境的I-CreI源支架的复杂性，因为对于催化结构域仅需要切割的“选择性”，并且后续的特异性由蛋白质融合物的TALE DNA结合部分提供。总之，可能的高特异性和高DNA切割活性工程化组合的易于进行使得TALE::CreI源致密TALEN成为治疗应用的理想工具。最后，应注意，I-CreI部分原则上可替换为多种天然存在或再工程化的归巢内切核酸酶源催化结构域。
实施例3f：TALE::SnaseSTAUU的活性
酵母中TALE::SnaseSTAUU的活性
选择AvrBs3源TALEN（SEQ ID NO:196）的C端结构域截短不同的变体作为初始支架。这些变体的子集合包括在位置G914(C28)和L926(C40)后的截短（截短的C端结构域C28和C40的蛋白质结构域分别在SEQ ID NO:205和206中给出）。编码包含AvrBs3源N端结构域、AvrBs3源的重复结构域组和截短的AvrBs3源C端结构域的变体支架的质粒[基于pCLS7184（SEQ ID NO:196）的pCLS7807和pCLS7809（SEQ ID NO:213和214）]，允许使用限制位点BamHI和EagI克隆与C端结构域融合的任何催化结构域。
对应于SnaseSTAAU（SEQ ID NO:30）氨基酸残基83至231的DNA通过PCR扩增以引入DNA水平上的BamHI（在编码链的5’）和EagI（在编码链的3’）限制位点，以及蛋白质水平上的TALE C端结构域与SnaseSTAAU催化结构域之间的接头（例如，-SGGSGS-延伸，SEQ ID NO:219）。使用BamHI和EagI和标准分子生物学方法通过将SnaseSTAAU催化结构域插入到支架变体中生成最后的TALE::SnaseSTAAU构建体。使分别由pCLS7807和pCLS7809（SEQ ID NO:213和214）编码的在位置G914(C28)和L926(C40)后截短的支架变体与SnaseSTAAU催化结构域（SEQ ID NO:30）融合，产生pCLS9082和pCLS9081（SEQ ID NO:370和371）。克隆步骤还在SnaseSTAAU催化结构域Cter处在氨基酸水平上带来了AAD序列。
如之前所述（国际PCT公开WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TALE-AvrBs3::SnaseSTAAU构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN的活性。AvrBs3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别位点（SEQ ID NO:157至192,表7），其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开。此外，对仅具有单一AvrBs3识别位点的靶标（SEQ ID NO:224）测试了TALE-AvrBs3::SnaseSTAAU构建体。图19中归纳的数据示出，根据本发明的嵌合蛋白，TALE-AvrBs3::SnaseSTAAU构建体对具有两个AvrBs3识别位点的靶标是具有活性的，而且对仅包含一个AvrBs3识别位点的靶标也具有活性。
实施例4
基础cTALEN由与单一催化结构域融合的单一DNA结合结构域构成并且设计成通过单一双链DNA切割或单链切口产生事件来刺激HR。对于某些应用（例如，基因失活），其有利于增强NHEJ的水平。该实施例阐明了能够在TALE DNA结合结构域旁侧的两个不同位点处实施双链DNA切割的双切割cTALEN（dcTALEN）的产生（图5c）。期望两个位点处DNA的同时切割消除了间插序列并因此停止了通过NHEJ的“无痕”重新连接（图1）。
实施例3所述的基线支架（SEQ ID NO:136至SEQ ID NO:139）用作起点用于融合设计。经历与TALE DNA结合结构域融合的催化结构域的非穷举性列表呈现于表2中。可使用的接头的非穷举性列表呈现于表3中。对于关于选择接头或增强结构域的另外的详细内容，参见实施例3、5、6和7。对于dcTALEN设计，使至少一个切割酶结构域（N端或C端）与TALE DNA结合结构域融合。另外的催化结构域可以是切口酶或切割酶（内切核酸酶或外切核酸酶）结构域，并且取决于应用的性质。例如，一侧的切割酶结构域的偶联与另一侧的切口酶结构域的偶联可导致切除跨越TALE DNA结合区的DNA单链的切除。靶向生成延伸的单链悬垂端可应用于靶向DNA修复机制的应用。对于靶向基因失活，优选使用dcTALEN中的两个切割酶结构域。
使用我们的酵母测定（参见实施例1）评价所有的dcTALEN设计，并且提供了与现有工程化兆核酸酶可比较的可检测活性。此外，使用如实施例3所述的基于哺乳动物细胞的测定来监测NHEJ的潜在增强。
实施例4a：TevI::TALE::FokI和TevI::TALE::TevI双切割TALEN的活性
基于基线bT2-Avr（SEQ ID NO:137）支架生成了具有N端I-TevI源催化结构域和来源于FokI（SEQ ID NO:368）或I-TevI（SEQ ID NO:20）的C端催化结构域的双切割TALEN（CD::TALE::CD）。使用NcoI和NsiI限制位点通过限制和连接从质粒pCLS12731（SEQ ID NO:236）中切除I-TevI的催化结构域片段并亚克隆到载体pCLS15795（SEQ ID NO:351）和pCLS9013（SEQ ID NO:153）中，分别产生了TevD02_cT11Avr_FokI-L（pCLS15796,SEQ ID NO:352,编码SEQ ID NO:447的蛋白质）和TevD02_cT11Avr_TevD02（pCLS15797,SEQ ID NO:353,编码SEQ ID NO:448的蛋白质）。对所有的构建体进行测序并根据需要将插入物转移至另外的载体（见下）。
分别使用质粒pCLS15796（SEQ ID NO:352）和pCLS15797（SEQ ID NO:353）通过酵母体内克隆制备最后的TevI::TALE-AvrBs3::FokI和TevI::TALE-AvrBs3::TevI酵母表达质粒pCLS13299（SEQ ID NO:354,编码SEQ IDNO:449的蛋白质）和pCLS13301（SEQ ID NO:355,编码SEQ ID NO:450的蛋白质）。为了通过体内同源重组生成完整的编码序列，使用高效率LiAc转化方案（Arnould等.2007），分别使用通过用BssHII消化的线性化约40ng每种质粒以及通过用NcoI和EagI消化的线性化1ng pCLS0542（SEQ ID NO:156）质粒DNA来转化酵母啤酒酵母菌株FYC2-6A（MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TevI::TALE-AvrBs3::FokI和TevI::TALE-AvrBs3::TevI构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590,SEQ ID NO:244）的活性。AvrBs3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别序列，其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开（SEQ ID NO:157至192,表6）。此外，对仅具有一个AvrBs3或RagT2-R识别位点的靶标（SEQ ID NO:238,表11）测试了构建体。对于适合的靶标，在酵母中的TevI::TALE-AvrBs3::FokI和TevI::TALE-AvrBs3::TevI活性水平相当于其缺少N端I-TevI源催化结构域的亲本分子的活性水平。表11说明了根据本发明的dcTALEN对于样品单一位点靶标的显著活性。
Figure BDA0000429500830000981
Figure BDA0000429500830000991
表11：不同cTALEN和dcTALEN对双位点和单一位点DNA靶标的活性。相对活性规范为：n.d.，无可检测活性；+，<25%活性；++，25%至<50%活性；+++，50%至<75%活性；++++，75%至100%活性。
实施例4b：scTrex2::TALE::FokI双切割TALEN
基于基线bT2-Avr（SEQ ID NO:137）支架生成了具有N端scTrex2源催化结构域和来源于FokI的C端催化结构域的双切割TALEN（CD::TALE::CD）。使用NcoI和NsiI限制位点通过限制和连接从质粒pCLS15798（SEQ ID NO:356,编码SEQ ID NO:451的蛋白质）中切除scTrex2的催化结构域片段并亚克隆到载体pCLS15795（SEQ ID NO:351）中，产生了scTrex2_cT11Avr_FokI-L（pCLS15799,SEQ ID NO:357,编码SEQ ID NO:452的蛋白质）。对构建体进行测序并根据需要将插入物转移至另外的载体（见下）。
使用用于接收质粒的AscI和XhoI限制酶以及用于插入物的BssHII和XhoI限制酶分别将来自pCLS15795（SEQ ID NO:351）或pCLS15799（SEQ ID NO:357）的编码TALE-AvrBs3::FokI或scTrex2::TALE-AvrBs3::FokI构建体的DNA亚克隆到pCLS1853（SEQ ID NO:193）哺乳动物表达质粒中，分别产生哺乳动物表达质粒pCLS14972和pCLS14971（SEQ ID NO:358和359）。
使用标准Gateway方案（INVITROGEN）将包含TALEN DNA靶标序列的所有哺乳动物靶标报道质粒构建到CHO报道载体中（Arnould,Chames等.2006,Grizot,Epinat等.2010）。在哺乳动物细胞（CHO K1）中的染色体外测定中对于针对假回文靶标测试了TALE-AvrBs3::FokI和scTrex2::TALE-AvrBs3::FokI构建体，以将其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN的活性进行比较。AvrBs3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别序列，其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA分隔开（SEQ ID NO:157至192,表6）。
对于该测定，在PolyFect试剂（1μL/孔）存在下，在96孔板形式中用75ng靶载体和增加量的每种变体DNA（0.7至25ng）转染CHO K1细胞。使用空载体将转染DNA的总量完成至125ng（靶DNA、变体DNA、载体DNA），转染72小时后，移除培养基并添加150μL裂解/暴露（revelation）缓冲液用于进行β-半乳糖苷酶液体测定。在37℃下孵育之后，在420nm下测量光学密度。整个过程在自动化Velocity11BioCel平台上进行（Grizot,Epinat等.2009）。
哺乳动物细胞中scTrex2::TALE-AvrBs3::FokI构建体对合适靶标的活性水平相当于亲本TALE-AvrBs3::FokI分子的活性水平，表明额外的scTrex2部分不损害TALEN DNA切割功能。在适合于检测NHEJ事件的测定中进行scTrex2功能的评价。
实施例5
用于cTALEN支架的基线设计是基于建立的TALE DNA结合结构域。将致密TALEN设计成尽可能小且有效。因此，为了实现该目标，可能有必要使“增强子”结构域桥接致密TALE DNA结合结构域与多个催化结构域之间的功能性缺口。图6（A至E）阐明了多个非穷举性构造，其中可应用这样的增强子结构域。注意，附图仅是说明性的，并且暗指N端与C端（即，图6A也可具有N端增强子结构域和C端催化结构域）。表1和2列出了可有助于DNA结合（特异性和非特异性接触）的潜在的增强子结构域。
使用来自实施例3的功能性cTALEN产生增强TALEN（eTALEN）。在我们的酵母测定（参见实施例1）中评价了增强子结构域的添加。如果其提供了初始cTALEN效率的最小5%的增强，更优选最小10%的增强，更优选20%，更优选30%，更优选40%，更优选50%，更优选大于50%的增强，那么特定的增强子结构域被判定为有用的。
实施例5a：TALE::ColE7::TALE增强的TALEN
使用sT2（SEQ ID NO:135）核心支架生成了毗邻中央DNA切割结构域具有N端和C端TALE DNA结合结构域的增强TALEN（TALE::CD::TALE）。这类致密TALEN的布置显示于图6B中，其中N端“增强子结构域”自身是TALE DNA结合结构域。选择ColE7催化结构域（pCLS15785，SEQ ID NO:285）的点突变衍生物用于eTALEN的催化核心。用来自sT2（SEQ ID NO:135）、pCLS15785（SEQ IDNO:285）、AvrBs3（SEQ ID NO:152）和RagT2-R（SEQ ID NO:271）的DNA序列作为模板，使用标准分子克隆技术得到了两个最终的构建体TALE-AvrBs3::ColE7_A497::TALE-RagT2-R（pCLS15800,SEQ ID NO:360,编码SEQ ID NO:453的蛋白质）和TALE-RagT2-R::ColE7_A497::TALE-AvrBs3（pCLS15801,SEQ ID NO:361,编码SEQ ID NO:454的蛋白质）。对所有的TALE::CD::TALE构建体进行测序并且根据需要将插入物转移至另外的载体（见下）。
通过使用NcoI和EagI限制位点限制和连接制备了最终的基于TALE::CD::TALE的酵母表达质粒pCLS12106（SEQ ID NO:362）和pCLS12110（SEQ ID NO:363）以亚克隆到pCLS0542（SEQ ID NO:156）质粒中。使用高效率LiAc转化方案（Arnould等.2007）转化酵母啤酒酵母菌株FYC2-6A（MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对非对称AvrBs3/RagT2-R杂交靶标测试了TALE::CD::TALE构建体，以比较其与对具有单一结合位点的靶标具有活性的亲本致密TALEN（例如，pCLS8589,SEQ ID NO:233）的活性。此外，对仅具有单一AvrBs3或RagT2-R识别位点的靶标测试了构建体。
实施例6
迄今为止，所有已知的TAL效应物及其衍生物在识别序列的位置-1处（图3）看起来需要T碱基。为了克服该限制，使用增强子结构域来替换TALE蛋白质的N-端区域。bT2衍生物N端TALE区的基于序列和结构的同源性模拟产生了三个潜在的候选蛋白质（表1）：(i)来自秀丽隐杆线虫（C.elegans）的Fem-3结合因子，SEQ ID NO:4，（FBF1，RNA结合蛋白质的Puf家族）；(ii)人工α螺旋状重复蛋白质（αRep），SEQ ID NO:5；以及(iii)锚蛋白超家族的蛋白质。二级结构元件的内容物和排列允许使用这些模型作为起始点用于替换TALE蛋白质N-端区域的增强子结构域。
使用来自提到的3个候选物之一的类似区域代替N端TALE蛋白质区域直至第一规范重复结构域构建了嵌合蛋白质。使用同源性模型作为指导在硅（silico）上重新设计了新界面。该方法可用于确定对于靶标序列位置-1处需要的T的特异性的决定簇。替换增强子结构域应最小为cTALEN蛋白质提供结构完整性。在我们的酵母测定中（参见实施例1）评价了构建体。如果其在靶位置-1处不存在T的情况下，提供了初始cTALEN活性最小5%的保留，更优选最小10%的保留，更优选20%，更优选30%，更优选40%，更优选50%，更更优选大于50%的保留，那么特定的增强子结构域被判定为有用的。
实施例7
为了产生用于cTALEN更合适的且致密的支架，分析了TALE蛋白质的C-端区域（最终的半重复结构域之外）的性质。bT2衍生物C端TALE区域的基于序列和结构的同源性模拟产生了3种可能的候选蛋白质（表1）：(i)绿脓杆菌的水解酶/转移酶，SEQ ID NO:6；(ii)来自结核分枝杆菌连接酶D的聚合酶结构域，SEQID NO:7；(iii)来自火球菌属的起始因子eIF2，SEQ ID NO:8；(iv)翻译起始因子Aif2βγ，SEQ ID NO:9。如实施例6中的，将同源性模型用于确定产生可能的C端截短的区域；可能的截短位置包括保留在最后的半重复结构域之外28、40、64、118、136、169、190个残基。另外，来自上述蛋白质的同源区可用于替换整个C端结构域。接触预测程序可用于由蛋白质的基本序列开始鉴定在3D空间中可能邻近的残基对。这样的嵌合蛋白应提供在其上建立cTALEN的更稳定的支架。
在我们的酵母测定（参见实施例1）中评价了构建体。如果其提供了初始cTALEN活性的最小5%保留，更优选最小10%保留，更优选20%，更优选30%，更优选40%，更优选50%，更优选活性大于50%的保留，那么特定的增强子结构域被判定为有用的。
实施例8
为了生成具有替代活性的致密TALEN，通过（a）使用具有独立活性的催化结构域（图7A、B），或；（b）作为TALE融合体提供辅助活性（图7C）生成了反式cTALEN。III类的基于序列和结构的模拟（Chan,Stoddard等.2011）。IIS型限制性内切核酸酶（REase）用于产生反式TALEN（参见表2的非限制性列表）。如实施例3和4所述，最初的反式TALEN通过独立的活性催化结构域（例如，Nt.BspD6I切口酶）的融合产生。原则上，该反式TALEN可根据应用要使用。为了将cTALEN转化为功能性反式TALEN，提供了反式的辅助结构域（在这种情况下，ss.BspD6I）（图8A）。这样的任选的反式和/或异二聚体蛋白质可允许cTALEN支架具有可调控为给定应用的活性。
在我们的酵母测定（参见实施例1）中评价了构建体。如果特定的辅助结构域提供了初始cTALEN活性的替代活性，则判断其是有用的。
如果所使用的辅助结构域表现出不依赖于初始cTALEN的活性（即，在非反式TALEN环境下），其可很好地与TALE结构域融合用于特异性靶向（图7B）。也可以以反式提供辅助结构域作为靶向实体以提供与cTALEN无关的功能（图7C）。
实施例8a：TALEN催化活性的特异性抑制
如实施例3c和3d所述，NucA（SEQ ID NO:26）和ColE7（SEQ ID NO:140）可通过与其各自的抑制蛋白NuiA（SEQ ID NO:229）和Im7（SEQ ID NO:230）形成复合物来抑制。大肠杆菌素E9（SEQ ID NO:366）是可通过其各自的抑制剂Im9（SEQ ID NO:369）被抑制的蛋白质的另一个非限制性实例。关于来源于NucA（TALE::NucA）或ColE（TALE::ColE7）催化结构域的TALEN，抑制剂充当通过防止DNA切割调控活性的辅助结构域（图7A）。
使用NcoI和EagI限制位点通过限制和连接将Im7（SEQ ID NO:230）和NuiA（SEQ ID NO:229）抑制蛋白亚克隆到pCLS7763骨架（SEQ ID NO:241）中，分别产生了pCLS9922（SEQ ID NO:242）和pCLS9923（SEQ ID NO:243）。然后，在如前所述的标准酵母SSA测定中，将这些质粒也用于共转化实验中（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。
在酵母SSA测定中对假回文靶标测试了TALE-AvrBs3::NucA（pCLS9924,SEQ ID NO:223）和TALE-AvrBs3::COlE7（pCLS8589,SEQ ID NO:233）构建体，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN（pCLS8590,SEQ ID NO:244）的活性。AvrBS3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别序列，其被范围为5至40bp的“间隔物”DNA邻近且分隔开（SEQID NO:157至192,表7）。此外，对仅具有一个AvrBs3识别位点的靶标（SEQ IDNO:224,表7）测试了构建体。使用TALE-AvrBs3::FokI TALEN作为对照，在特异性或非特异性抑制蛋白存在或不存在下，评价了TALEN的活性调控。
归纳于表12中的数据表明，根据本发明，通过存在其各自的抑制蛋白NuiA和Im7使TALE-AvrBs3::NucA和TALE-AvrBs3::ColE7构建体特异性地失活。
表12：在抑制蛋白存在下TALEN构建体的活性。相对活性规范为：n.d.，无可检测活性；+，<25%活性；++，25%至<50%活性；+++，50%至<75%活性；++++，75%至100%活性。
实施例8b：通过反式TALEN增强TALEN催化活性
实施例3b说明了TevI::TALE在独立地作为致密TALEN（pCLS8522,SEQ IDNO:237）起作用。为了进一步增强活性，使用图7C所绘布置的TALE::TevI构建体设计了反式TALEN。使用用于接收质粒的IIS型限制酶BsmBI以及用于所插入RVD序列的BbvI和SfaNI将编码靶向RagT2-R位点的RVD的DNA序列（SEQ IDNO:271）亚克隆到质粒pCLS7865-cT11_TevD02（pCLS9011,SEQ ID NO:151）中，以产生后续的TALE-RagT2-R::TevI构建体cT11RagT2-R_TevD02（pCLS15802,SEQ ID NO:364）。对构建体进行测序并使用NcoI和EagI限制位点通过限制和连接将插入物亚克隆到pCLS7763骨架（SEQ ID NO:241）中，产生pCLS8990（SEQID NO:365）。然后，在如前所述的标准酵母SSA测定中，将质粒对pCLS8522（SEQID NO:237）和pCLS7763（SEQ ID NO:241）或pCLS8522（SEQ ID NO:237）和pCLS8990（SEQ ID NO:365）用于共转化实验中（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006）。
如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），构建了包含TALEN DNA靶标序列的所有酵母靶标报道质粒。如之前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在酵母SSA测定中对不对称RagT2-R/AvrBs3杂交靶标靶标测试了TALE-RagT2-R::TevI/TevI::TALE-AvrBs3构建体对，以比较其与仅对于单一结合位点的靶标具有活性的亲本致密TALEN（例如，pCLS8522,SEQ ID NO:237）的活性。RagT2-R/AvrBs3杂交靶标包含两个并列的不同识别序列，其中，第一（RagT2-R）的3’末端临近第二（AvrBs3）的5’末端，并且被范围从5至40bp的“间隔物”DNA分隔开（SEQ ID NO:G064至G099，表13）。图18说明了根据本发明的反式cTALEN，由TALE-RagT2-R::TevI构建体提供TevI::TALE-AvrBs3活性的调控。
实施例9：通过多肽接头将C端结构域替换为具有colE7催化结构域的活性
我们生成了37种不同接头的第一文库。其中许多具有包含可变区的共同结构（SEQ ID NO:372至408），所述可变区编码3至28个氨基酸残基，并且在5’和3’末端两侧是编码SGGSGS伸展（SEQ ID NO:219）的区域。这些接头在其5’和3’末端分别包含XmaI和BamHI限制位点。然后通过XmaI和BamHI限制位点将接头文库亚克隆到pCLS7183（SEQ ID NO:141）中以替换AvrBs3源TALEN（pCLS7184,SEQ ID NO:196）的C端结构域。在该骨架文库中克隆AvrBs3源重复结构域（RVD）组或具有或缺少末端半RVD的任何其他RVD序列。从培养皿中刮下集落之后，使用标准小量制备技术得到了来自文库的DNA。使用BamHI和EagI限制酶将FokI催化头移除，使用标准凝胶提取技术纯化剩余的骨架。
通过PCR扩增编码ColE7催化结构域（SEQ ID NO:11）的DNA以在DNA水平上引入BamHI（在编码链的5’端）和EagI（在编码链的3’端）限制位点，并且在蛋白质水平上在C端结构域文库与催化头之间引入接头（例如，-SGGSGS-延伸，SEQ ID NO:219）。在BamHI和EagI消化和纯化之后，将编码不同催化头的DNA各自亚克隆到先前制备的文库支架中。
从培养皿中刮下集落之后，使用标准小量制备技术得到了来自最后文库的DNA，并且如前所述（国际PCT申请WO2004/067736和Epinat,Arnould等.2003;Chames,Epinat等.2005;Arnould,Chames等.2006;Smith,Grizot等.2006），在我们的酵母SSA测定中基于假回文靶标筛选了所得文库，以比较其与对于活性需要两个结合位点的标准TALE-AvrBs3::FokI TALEN的活性。AvrBs3靶标包含以3’端的近端并列的两个相同识别序列，其被含有15、18、21、和24bp的“间隔物”DNA（SEQ ID NO:167,170,173和176，表7）分隔开。此外，对仅具有一个AvrBs3识别位点的靶标（SEQ ID NO:224）测试了构建体（SEQ ID NO:416至419）。归纳于图20中的数据表明，ColE7构建体一部分中接头的序列对具有两个AvrBs3识别位点或仅具有一个AvrBs3识别位点的靶标具有活性。
参考文献
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Claims (77)

1.一种用于靶向和加工双链DNA的方法，其包括：
（a）在双链DNA的一条链中选择一条目的DNA靶标序列；
（b）提供包含以下的独特的致密TALEN单体：
（i）一个核心TALE支架，所述核心TALE支架包含对所述目的DNA靶标序列具有DNA结合特异性的重复可变二肽区（RVD）；
（ii）至少一个催化结构域，其中所述催化结构域当与来自（i）的所述核心TALE支架的C和/或N端融合时能够加工距所述目的DNA靶标序列几个碱基对远的DNA；
（iii）任选的一个肽接头，所述肽接头在需要时使来自（ii）的所述催化结构域与来自（i）的所述核心TALE支架融合；
其中所述致密TALEN单体装配成结合并加工所述双链DNA而不需要二聚化；
（c）使所述双链DNA与所述独特的单体相接触，使得所述双链在3’和/或5’方向上在距所述一条链靶标序列几个碱基对远处被加工。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化结构域对所述双链DNA具有切割活性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化结构域与所述核心TALE支架的C端结构域融合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化结构域与所述核心TALE支架的N端结构域融合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中一个催化结构域与所述核心TALE支架的所述C端结构域融合并且另一个催化结构域与所述核心TALE支架的所述N端结构域融合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域选自表2所列的蛋白质或其功能突变体。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域是I-TevI（SEQ ID NO:20）或其功能突变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中I-TevI（SEQ ID NO:20）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端结构域融合。
9.根据权利要求8所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:426至432的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域是ColE7（SEQ ID NO:11）或其功能突变体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中ColE7（SEQ ID NO:11）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。
12.根据权利要求10所述的方法，其中ColE7（SEQ ID NO:11）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端部分融合。
13.根据权利要求11所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:435至438的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
14.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域是NucA（SEQ ID NO:26）或其功能突变体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中NucA（SEQ ID NO:26）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。
16.根据权利要求14所述的方法，其中NucA（SEQ ID NO:26）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端部分融合。
17.根据权利要求15所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:433至434的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
18.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述催化结构域是I-CreI（SEQ ID NO:1）或其功能突变体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中I-CreI（SEQ ID NO:1）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。
20.根据权利要求18所述的方法，其中I-CreI（SEQ ID NO:1）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端部分融合。
21.根据权利要求19所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:439至441和SEQ ID NO:444至446的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述核心TALE支架包含与选自SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述核心TALE支架包含与选自SEQ ID NO:136至SEQ ID NO:139的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述独特的致密TALEN单体还包含：
（i）至少一个增强子结构域；
（ii）任选的一个肽接头，其使所述增强子结构域与所述独特的致密TALEN单体活性实体的一部分融合。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述肽接头序列选自SEQID NO:67至104和SEQ ID NO:372至SEQ ID NO:415。
26.根据权利要求5所述的方法，其中所述独特的致密TALEN单体包含两个分别与所述核心TALE支架的所述C端部分和所述N端部分融合的催化结构域的组合，其选自：
（i）N端的Nuc A结构域（SEQ ID NO:26）和C端的Nuc A结构域（SEQ IDNO:26）；
（ii）N端的ColE7结构域（SEQ ID NO:11）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）；
（iii）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）；
（iv）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的NucA结构域（SEQ IDNO:26）；
（v）N端的ColE7结构域（SEQ ID NO:11）和C端的NucA结构域（SEQ IDNO:26）；
（vi）N端的NucA结构域（SEQ ID NO:26）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）。
27.根据权利要求29所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:448和450的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
28.根据权利要求5所述的方法，其中所述独特的致密TALEN单体包含两个分别与所述核心TALE支架的所述C端部分和所述N端部分融合的催化结构域的组合，其选自：
（i）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的FokI结构域（SEQ ID NO:368）；
（ii）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）；
（iii）N端的scTrex2结构域（SEQ ID NO:451）和C端的FokI结构域（SEQID NO:368）。
29.根据权利要求28所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:447-450和SEQID NO:452的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
30.一种致密TALEN单体，其包含：
（i）一个核心TALE支架，所述核心TALE支架包含对特定的目的双链DNA靶标序列具有DNA结合特异性的重复可变二肽区（RVD）；
（ii）至少一个催化结构域，其中所述催化结构域当与来自（i）的所述核心TALE支架的C或N端融合时能够加工距所述目的双链DNA靶标序列几个碱基对远的DNA；
（iii）任选的一个肽接头，所述肽接头在需要时使来自（ii）的所述催化结构域与来自（i）的所述工程化的核心TALE支架融合；
其中所述致密TALEN单体装配成结合所述靶DNA序列并加工双链DNA而不需要二聚化。
31.根据权利要求30所述的致密TALEN单体，其中所述催化结构域对所述双链DNA具有切割活性。
32.根据权利要求30所述的致密TALEN单体，其中所述催化结构域与所述核心TALE支架的C端结构域融合。
33.根据权利要求30所述的致密TALEN单体，其中所述催化结构域与所述核心TALE支架的N端结构域融合。
34.根据权利要求30所述的致密TALEN单体，其中一个催化结构域与所述核心TALE支架的所述C端结构域融合并且另一个催化结构域与所述核心TALE支架的所述N端结构域融合。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述催化结构域选自表2所列的蛋白质或其功能突变体。
36.根据权利要求30至34中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述催化结构域是I-TevI（SEQ ID NO:20）或其功能突变体。
37.根据权利要求36所述的致密TALEN单体，其中I-TevI（SEQ ID NO:20）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端结构域融合。
38.根据权利要求37所述的致密TALEN单体，其包含与选自SEQ ID NO:426至432的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
39.根据权利要求30至34中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述催化结构域是ColE7（SEQ ID NO:11）或其功能突变体。
40.根据权利要求39所述的致密TALEN单体，其中ColE7（SEQ ID NO:11）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。
41.根据权利要求39所述的致密TALEN单体，其中ColE7（SEQ ID NO:11）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端部分融合。
42.根据权利要求40所述的致密TALEN单体，其包含与选自SEQ ID NO:435至438的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
43.根据权利要求30至34中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述催化结构域是NucA（SEQ ID NO:26）或其功能突变体。
44.根据权利要求43所述的致密TALEN单体，其中NucA（SEQ ID NO:26）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。
45.根据权利要求43所述的致密TALEN单体，其中NucA（SEQ ID NO:26）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端部分融合。
46.根据权利要求44所述的致密TALEN单体，其包含与选自SEQ ID NO:433至434的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
47.根据权利要求30至34中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述催化结构域是I-CreI（SEQ ID NO:1）或其功能突变体。
48.根据权利要求47所述的致密TALEN单体，其中I-CreI（SEQ ID NO:1）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述C端部分融合。
49.根据权利要求47所述的致密TALEN单体，其中I-CreI（SEQ ID NO:1）或所述其功能突变体与所述核心TALE支架的所述N端部分融合。
50.根据权利要求48所述的致密TALEN单体，其包含与选自SEQ ID NO:444至446的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
51.根据权利要求30至50中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述核心TALE支架包含与选自SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
52.根据权利要求30至51中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述核心TALE支架包含与选自SEQ ID NO:136至SEQ ID NO:139的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
53.根据权利要求30至52中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述独特的致密TALEN单体还包含：
（i）至少一个增强子结构域；
（ii）任选的一个肽接头，其使所述增强子结构域与所述独特的致密TALEN单体活性实体的一部分融合。
54.根据权利要求30至56中任一项所述的致密TALEN单体，其中所述肽接头序列选自SEQ ID NO:67至104和SEQ ID NO:372至SEQ ID NO:415。
55.根据权利要求34所述的致密TALEN单体，其包含分别与所述核心TALE支架的所述C端部分和所述N端部分融合的两个催化结构域的组合，其选自：
（i）N端的Nuc A结构域（SEQ ID NO:26）和C端的Nuc A结构域（SEQ IDNO:26）；
（ii）N端的ColE7结构域（SEQ ID NO:11）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）；
（iii）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）；
（iv）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的NucA结构域（SEQ IDNO:26）；
（v）N端的ColE7结构域（SEQ ID NO:11）和C端的NucA结构域（SEQ IDNO:26）；
（vi）N端的NucA结构域（SEQ ID NO:26）和C端的ColE7结构域（SEQ IDNO:11）。
56.根据权利要求55所述的致密TALEN单体，其包含与选自SEQ ID NO:448和450的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
57.根据权利要求37所述的致密TALEN单体，其中所述独特的致密TALEN单体包含两个分别与所述核心TALE支架的所述C端部分和所述N端部分融合的催化结构域的组合，其选自：
（i）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的FokI结构域（SEQ ID NO:368）；
（ii）N端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）和C端的TevI结构域（SEQ ID NO:20）；
（iii）N端的scTrex2结构域（SEQ ID NO:451）和C端的FokI结构域（SEQID NO:368）。
58.根据权利要求63所述的方法，其包含与选自SEQ ID NO:447至450和SEQ ID NO:452的蛋白质序列具有至少80%，更优选90%，更优选95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
59.一种重组多核苷酸，其编码根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN。
60.一种载体，其包含根据权利要求59所述的重组多核苷酸。
61.一种组合物，其包含载剂和根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN。
62.一种药物组合物，其包含可药用载剂和根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN。
63.一种宿主细胞，其包含根据权利要求59所述的重组多核苷酸。
64.一种非人转基因动物，其包含根据权利要求59所述的重组多核苷酸。
65.一种非人转基因动物，其包含根据权利要求60所述的载体。
66.一种转基因植物，其包含根据权利要求59所述的重组多核苷酸。
67.一种转基因植物，其包含根据权利要求60所述的载体。
68.一种试剂盒，其包含说明书和根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN单体，用于增强对目的单一双链DNA靶标序列的DNA加工效率。
69.一种用于增加靶向同源重组的方法，所述靶向同源重组包含根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN单体，其中至少一个催化结构域具有切割酶活性。
70.一种用于增加具有很少非同源末端连接的靶向同源重组的方法，所述靶向同源重组包含根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN单体，其中至少一个催化结构域具有切口酶活性。
71.一种用于增加跨越根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN单体结合区的DNA单链切除的方法，其中：
（i）至少一个催化结构域具有切割酶活性；
（ii）至少一个催化结构域具有切口酶活性。
72.一种用于治疗由基因中特定单一双链DNA靶标序列中的突变引起的遗传疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN或其变体。
73.一种用于将转基因插入细胞、组织或非人动物的基因组基因座的特定的单一双链DNA靶标序列中的方法，其中将至少一个根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN单体引入到所述细胞、组织或非人动物中。
74.一种调控根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN单体在细胞中表达时的活性的方法，其中所述方法包括将调控所述致密TALEN的活性的辅助结构域引入到所述细胞中的步骤。
75.根据权利要求74所述的方法，其抑制根据权利要求30至58中任一项所述的致密TALEN单体的活性。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述致密TALEN单体的催化结构域是NucA（SEQ ID NO:26）并且所述辅助结构域是NuiA（SEQ ID NO:229）或其功能突变体。
77.根据权利要求74所述的方法，其中所述致密TALEN单体的催化结构域是ColE7（SEQ ID NO:11）并且所述辅助结构域是Im7（SEQ ID NO:230）或其功能突变体。
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