JP2014511698A - コンパクトtale−ヌクレアーゼを作製する方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明は、二本鎖DNAを効率的に標的しプロセシングすることのできるコンパクトな転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)の作製方法に関する。より具体的には、本発明は、活性実体が、単純で効率的なベクター化のために単一ポリペプチド鎖から構成され、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該DNA標的配列の近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としない、少なくとも1つの触媒ドメインに融合された単一TALE DNA結合ドメインからなるTALENの作製方法に関する。本発明はまた、前記方法を実施するために使用するコンパクトTALEN、ベクター、組成物及びキットに関する。
哺乳動物ゲノムは、種々のタイプの損傷に継続的に悩まされており、そのうち二本鎖破断(DSB)が最も危険であると考えられている(Haber 2000)。DSBの修復は、細胞の状況に依存し得る多様な機構により起こり得る。相同組換え(HR)を介する修復は、破断点に元の配列を回復することができる。広範な配列相同性に対する厳格な依存性のために、この機構は、主に細胞サイクルのS期及びG2期(姉妹染色分体が非常に近接している)の間に活性であると示唆されている(Sonoda, Hocheggerら,2006)。一本鎖アニーリング(SSA)は、直列反復間のDSBを修復することにより、欠失を促進し得る別の1つの相同性依存プロセスである(Paques及びHaber 1999)。最後に、DNAの非相同末端結合(NHEJ)は、細胞サイクルを通して機能し得、相同組換えに依存しないDSB修復の主要経路である(Moore及びHaber 1996;Haber 2008)。NHEJは、少なくとも2つの異なる構成要素を含むようである:(i)DSB端部の直接再結合から本質的になり、XRCC4、Lig4及びKuタンパク質に依存する経路、及び;(ii)XRCC4、Lig4及びKuに依存せず、特に誤りが生じ易く、大抵は欠失を生じる代替のNHEJ経路(微小相同間に接合が生じる)(Frank, Sekiguchiら,1998;Gao, Sunら,1998;Guirouilh-Barbat, Huckら,2004;Guirouilh-Barbat, Rassら,2007;Haber 2008;McVey及びLee 2008)。
本発明は、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としない、単一のポリペプチド鎖から構成されるコンパクトな転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を作製する方法に関する。本発明はまた、単純で効率的なベクター化のための機能的な単一のポリペプチド融合タンパク質の作製に関する。別の観点では、本発明は、少なくともエンハンサードメインを含んでなるコンパクトTALENに関し、ここで、エンハンサードメインは、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍でのコンパクトTALENのDNAプロセシング効率を増強する。本発明はまた、前記方法の実施に使用するコンパクトTALEN、ベクター、組成物及びキットに関する。本発明はまた、標的付けられたDNA切断から標的付けられた遺伝子調節までに及ぶ種々の適用に本発明によるコンパクトTALENを使用する方法に関する。本発明による方法は、トランスジェニック生物の作製から遺伝子疾患の治療までにわたる種々の分野において使用し得る。
前述の特徴に加えて、本発明は、下記の説明及び添付の図面から明らかとなる他の特徴を更に含む。下記の詳細な説明と共に図面を参照することにより本発明を十分に理解するにつれ、本発明及び付随する多くの利点を更に完全に正当に評価することが容易にできるようになる。
本明細書中で特に規定しない限り、使用する全ての技術及び科学用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学及び分子生物学の分野で当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。
本明細書に記載したものと類似するか又は等価である全ての方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができ、適切な方法及び材料を本明細書中に記載する。本明細書中で言及する全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照よりその全体が本明細書中に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法及び例は、単なる例示に過ぎず、特に断らない限り、限定する意図はない。
(i)(a)DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなり、(b)DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能であるコアTALE足場を遺伝子操作する工程;
(ii)(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させたとき、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる少なくとも1つの触媒ドメインを決定するか又は遺伝子操作する工程;
(iii)任意に、(ii)の触媒ドメインを(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させるためのペプチド性リンカーを決定するか又は遺伝子操作する工程
により、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としない、単一のポリペプチド鎖から構成されるコンパクトTALEN実体を取得する
ことを含んでなる、コンパクトな転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(cTALEN)を作製する方法である。換言すれば、本発明によるコンパクトTALENは、それ自体で、1つのDNA結合ドメインにより唯1つの興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的し、該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる活性実体単位である。
(a)興味対象の1つのDNA標的配列を二本鎖DNAの一方の鎖上で選択し;
(b)下記:
(i)興味対象のDNA標的配列に対するDNA結合特異性を有する反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなる1つのコアTALE足場;
(ii)(i)のコアTALE足場のC末端及び/又はN末端に融合されたとき興味対象のDNA標的配列から数塩基対離れたDNAをプロセシングし得る少なくとも1つの触媒ドメイン;
(iii)任意に、必要な場合に(ii)の触媒ドメインを(i)のコアTALE足場に融合させるための1つのペプチド性リンカー
を含んでなり、二量体化を要することなく、二本鎖DNAに結合してプロセシングするように組み立てられている独特なコンパクトTALENモノマーを提供し;
(c)二本鎖DNAを独特なモノマーと、該二本鎖が一本鎖標的配列から3'及び/又は5'方向に数塩基対離れた場所でプロセシングされるように接触させる
ことを含んでなる、二本鎖DNAを標的してプロセシングする方法である。
別の1つの実施形態では、本発明による遺伝子操作コアTALE足場は、追加のC末端ドメインを含んでなり、その結果、DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)及びC末端ドメインをこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。
別の1つの実施形態では、コア足場は、前記セットのRVDのC-末端に位置する20アミノ酸から作られる追加の単一短縮型RVD、すなわち追加のC-末端ハーフ-RVDを含んでなる。この場合、本発明のコア足場は8.5〜30.5のRVDを含んでなる。ここで、「.5」はハーフ-RVD(又は末端RVD、又はハーフ-反復)をいう。本発明のコア足場は、より好ましくは8.5〜20.5のRVD、またより好ましくは15.5のRVDを含んでなる。1つの好適な実施形態では、ハーフ-RVDは、ヌクレオチドA、C、G、Tに対するハーフ-RVDの特異性の欠如を可能にするコア足場形態中に存在する。1つのより好適な実施形態では、ハーフ-RVDは存在しない。
別の1つの実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のN末端ドメインは、エンハンサードメインである。別の1つの実施形態では、エンハンサードメインは、非限定例としてのPuf RNA結合タンパク質又はアンキリンスーパーファミリーからなる群より選択される。別の1つの実施形態では、エンハンサードメイン配列は、表1に列挙される非限定例としての配列番号4及び配列番号5のタンパク質ドメイン、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択される。
別の1つの好適な実施形態では、触媒ドメインは、NucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の1つの好適な実施形態では、触媒ドメインNucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のN末端ドメインに融合される。別の1つの好適な実施形態では、触媒ドメインNucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のC末端ドメインに融合される。別の1つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号433〜434の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
別の1つの実施形態では、触媒ドメインは、制限酵素、例えば表2に列挙される非限定例のようなMmeI、R-HinPII、R.MspI、R.MvaI、Nb.BsrDI、BsrDI A、Nt.BspD6I、ss.BspD6I、R.PleI、MlyI及びAlwIである。別の1つのより好適な実施形態では、触媒ドメインはエキソヌクレアーゼ活性を有する。
(i)N末端のNuc Aドメイン(配列番号26)及びC末端のNuc Aドメイン(配列番号26);
(ii)N末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11);
(iii)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11);
(iv)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のNucAドメイン(配列番号26);
(v)N末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びC末端のNucAドメイン(配列番号26);
(vi)N末端のNucAドメイン(配列番号26)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11)
からなる群より選択される2つの触媒ドメインの組合せを含んでなる。
別の1つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、コアTALE足場のC末端部及びN末端部にそれぞれ融合され、下記:
(i)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のFokIドメイン(配列番号368);
(ii)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のTevIドメイン(配列番号20);
(iii)N末端のscTrex2ドメイン(配列番号451)及びC末端のFokIドメイン(配列番号368)。
からなる群より選択される、2つの触媒ドメインの組合せを含んでなる。
別の1つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号447〜450及び配列番号452からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
(i)少なくとも1つのエンハンサードメインを遺伝子操作する工程;
(ii)任意に、エンハンサードメインをコンパクトTALEN実体の1つの部分に融合させるための1つのペプチドリンカーを決定するか又は遺伝子操作する工程
により、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍に増強したDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN実体、すなわち増強コンパクトTALENを取得することを含んでなる。
換言すれば、本発明の方法による独特なコンパクトTALENモノマーは、
(i)少なくとも1つのエンハンサードメイン;
(ii)任意に、エンハンサードメインを独特なコンパクトTALENモノマーの活性実体の1つの部分に融合させるための1つのペプチドリンカー
を更に含んでなる。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、最後にリンカーのタイプ及びエンハンサードメインのタイプ]に依存して、本発明による増強コンパクトTALENは、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで提示し得、これにより、増強コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率がもたらされ、異なる酵素活性の各々は独自のDNAプロセシング効率を有する。
この好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング効率は、少なくとも1つのエンハンサードメイン及び1つのペプチド性リンカーの遺伝子操作により増強され、それにより、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍に増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体、すなわち本発明による増強コンパクトTALENを得ることができる。
別の1つの好適な実施形態では、本発明の方法によるエンハンサーは、増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体が得られるように、DNA標的配列に関するコンパクトTALEN実体の結合及び触媒ドメインの触媒活性の両方を増強する。これら全ての非限定例は、興味対象の遺伝子座でDNA標的配列に関して増強したDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN実体、すなわち本発明による増強コンパクトTALENを導く。
1つの好適な実施形態では、出発材料のコンパクトTALEN実体と比較した、本発明によるコンパクトTALEN実体の全体のDNAプロセシング効率の増強は、切断部位での追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。
本発明に従う少なくとも1つのエンハンサーによる切断部位での追加のホスホジエステル結合の加水分解は、DSB切断部位で一方のDNA鎖若しくは両DNA鎖に影響し、5'オーバーハング端部若しくは3'オーバーハング端部若しくは両端部に影響し、又は切除の長さに依存する異なるタイプのDSB切除を導き得る。よって、コンパクトTALEN実体の既存のクリベース活性への新たなニッカーゼ又はクリベース活性の付加は、得られる本発明による増強コンパクトTALENの効率を興味対象の遺伝子座で増強し得る(図8B〜8E)。非限定例として、向かい合う鎖への2つのニッカーゼ活性の付加(図8D)又は第2のDSBを生じる新たなクリベース活性の付加(図8E)は、二本鎖ギャップをもたらし得る。結果として、完全な再ライゲーションは、もはや可能ではなく、1又は幾つかの代替の修復帰結(例えば、不正確なNHEJ、相同組換え又はSSA)が刺激され得る。別の非限定例として、1つのニッカーゼ活性の付加は、一本鎖ギャップをもたらし得、端部の付着性を抑制する。このこともまた、得られる本発明による増強コンパクトTALENの効率を興味対象の遺伝子座で、上記の1又は幾つかの代替の修復帰結の刺激を介して増強し得る。
本発明によれば、コンパクトTALENは、DNAプロセシング事象を標的するときの複数の独立タンパク質成分の必要性を軽減するように設計される。重要なことには、現在のTALENの機能に必須である「スペーサー」領域及び二重の標的部位が不必要になる。コアTALE足場の各端部は融合に従順であるので、触媒及び増強ドメインの付加の順序(N-末端 対 C-末端)は適用により変化させ得る。加えて、触媒ドメインは特異的なDNA接触を必要としないので、図5に示す非限定例のように、コアTALE足場を取り囲む領域に関して制限がない:(A)クリベースドメイン又はニッカーゼドメインにより誘導される相同組換えを促進するN-末端融合構築物。(B)(A)と同様の特性を有するC-末端融合構築物。(C)コアTALE足場の両端部への2つの触媒ドメインの付着により、NHEJが増強した二重切断が可能になる。融合点(N-末端 対 C-末端)及びリンカーのデザインは適用により変化し得る。
(i)DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である1つのコアTALE足場;
(ii)(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させたとき、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる少なくとも1つの触媒ドメイン;
(iii)任意に、必要な場合に(ii)の触媒ドメインを(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させるための1つのペプチド性リンカー
を、興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的して該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングするために二量体化を必要としないように含んでなるコンパクトTALENに関する。換言すれば、本発明によるコンパクトTALENは、それ自体で、1つのDNA結合ドメインにより唯1つの興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的し、該興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍のDNAをプロセシングすることができる活性実体単位である。
(i)興味対象の特異的な二本鎖DNA標的配列に対するDNA結合特異性を有する反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなる1つのコアTALE足場;
(ii)(i)のコアTALE足場のC末端又はN末端に融合されたとき興味対象の二本鎖DNA標的配列から数塩基対離れたDNAをプロセシングし得る少なくとも1つの触媒ドメイン;
(iii)任意に、必要な場合に(ii)の触媒ドメインを(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させるための1つのペプチド性リンカー
を含んでなり、二量体化を要することなく、標的DNA配列に結合して二本鎖DNAをプロセシングするように組み立てられているコンパクトTALENモノマーに関する。
別の1つの実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの遺伝子操作コアTALE足場は、追加のC末端ドメインを含んでなり、その結果、DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)及びC末端ドメインをこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。
別の1つの実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの遺伝子操作コアTALE足場は、追加のN-末端及びC末端ドメインを含んでなり、その結果、N末端ドメイン、DNA結合特異性を変化させ興味対象の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列を標的するための異なるセットの反復可変ジペプチド領域(RVD)及びC末端ドメインをこの順で含んでなり、DNAプロセシングをもたらすように選択した触媒ドメインを付着させることが可能である遺伝子操作コアTALE足場を生じる。
別の1つの実施形態では、コア足場は、前記セットのRVDのC-末端に位置する20アミノ酸から作られる追加の単一短縮型RVD、すなわち追加のC-末端ハーフ-RVDを含んでなる。この場合、本発明のコア足場は8.5〜30.5のRVDを含んでなる。ここで、「.5」はハーフ-RVD(又は末端RVD、又はハーフ-反復)をいう。本発明のコア足場は、より好ましくは8.5〜20.5のRVD、またより好ましくは15.5のRVDを含んでなる。1つの好適な実施形態では、ハーフ-RVDは、ヌクレオチドA、C、G、Tに対するハーフ-RVDの特異性の欠如を可能にするコア足場形態中に存在する。1つのより好適な実施形態では、ハーフ-RVDは存在しない。
別の1つの実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの遺伝子操作コアTALE足場の追加のN末端ドメインは、エンハンサードメインである。別の1つの実施形態では、エンハンサードメインは、非限定例としてのPuf RNA結合タンパク質又はアンキリンスーパーファミリーからなる群より選択される。別の1つの実施形態では、エンハンサードメイン配列は、表1に列挙される非限定例としての配列番号4及び配列番号5のタンパク質ドメイン、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体からなる群より選択される。別の1つの実施形態では、遺伝子操作コアTALE足場の追加のC末端ドメインは、エンハンサードメインである。別の1つの実施形態では、エンハンサードメインは、非限定例としてのPseudomonas Aeuriginosa科のヒドロラーゼ/トランスフェラーゼ、Mycobacterium tuberculosisリガーゼDファミリーのポリメラーゼドメイン、Pyrococcus科の開始因子elF2、翻訳開始因子Aif2ファミリーからなる群より選択される。別の1つの実施形態では、エンハンサードメイン配列は、表1に列挙される非限定例としての配列番号6〜配列番号9のタンパク質ドメインからなる群より選択される。
別の1つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENの触媒ドメインは、NucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の1つの好適な実施形態では、触媒ドメインNucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のN末端ドメインに融合される。別の1つの好適な実施形態では、触媒ドメインNucA(配列番号26)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体は、本発明の方法によるコアTALE足場のC末端ドメインに融合される。別の1つの好適な実施形態では、本発明の方法によるコンパクトTALENは、配列番号433〜434の群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
(i)N末端のNuc Aドメイン(配列番号26)及びC末端のNuc Aドメイン(配列番号26);
(ii)N末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11);
(iii)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11);
(iv)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のNucAドメイン(配列番号26);
(v)N末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びC末端のNucAドメイン(配列番号26);
(vi)N末端のNucAドメイン(配列番号26)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11)
からなる群より選択される2つの触媒ドメインの組合せを含んでなる。
別の1つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENは、コアTALE足場のC末端部及びN末端部にそれぞれ融合され、下記:
(i)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のFokIドメイン(配列番号368);
(ii)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のTevIドメイン(配列番号20);
(iii)N末端のscTrex2ドメイン(配列番号451)及びC末端のFokIドメイン(配列番号368)
からなる群より選択される、2つの触媒ドメインの組合せを含んでなる。
別の1つの好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALENは、配列番号447〜450及び配列番号452からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
換言すれば、本発明のコンパクトTALENモノマーは、配列番号420〜450及び452〜455からなる群より選択されるタンパク質配列と少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、最後にリンカーのタイプ]に依存して、本発明によるコンパクトTALENは、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで含み得、これにより、コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率がもたらされ、異なる酵素活性の各々は独自のDNAプロセシング効率を有する。
(i)少なくとも1つのエンハンサードメイン;
(ii)任意に、エンハンサードメインをコンパクトTALEN活性実体の1つの部分に融合させるための1つのペプチドリンカー
を更に含んでなり、そのことにより、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍に増強したDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN実体、すなわち増強コンパクトTALENを得る。
換言すれば、独特なコンパクトTALENモノマーは、
(i)少なくとも1つのエンハンサードメイン;
(ii)任意に、エンハンサードメインを独特なコンパクトTALENモノマーの活性実体の1つの部分に融合させるための1つのペプチドリンカー
を更に含んでなる。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、リンカーのタイプ及びエンハンサードメインのタイプ]に依存して、本発明による増強コンパクトTALENは、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで提示し得、これにより、増強コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率がもたらされ、異なる酵素活性の各々は独自のDNAプロセシング効率を有する。
この好適な実施形態では、本発明によるコンパクトTALEN実体のDNAプロセシング効率は、少なくとも1つのエンハンサードメイン及び1つのペプチド性リンカーの遺伝子操作により増強され、それにより、興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列近傍に増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体、すなわち本発明による増強コンパクトTALENを得ることができる。
別の1つの好適な実施形態では、本発明によるエンハンサーは、増強したDNAプロセシング活性を有するコンパクトTALEN実体が得られるように、DNA標的配列に関するコンパクトTALEN実体の結合及び触媒ドメインの触媒活性の両方を増強する。これら全ての非限定例は、興味対象の遺伝子座でDNA標的配列に関して増強したDNAプロセシング効率を有するコンパクトTALEN実体、すなわち本発明による増強コンパクトTALENを導く。
ゲノム工学実験においては、稀切断性エンドヌクレアーゼの効率、例えば或る遺伝子座で所望の事象(相同遺伝子ターゲッティング、標的付けられた変異誘発、配列の除去又は切り出し)を誘導する能力は、ヌクレアーゼの比活性、おそらく標的の接近可能性及び所望の事象を生じる修復経路(遺伝子ターゲッティングについては相同性修復、標的化された変異誘発についてはNHEJ経路)の効力及び帰結を含む幾つかのパラメータに依存する。
1つの好適な実施形態では、出発材料のコンパクトTALEN実体と比較した、本発明によるコンパクトTALEN実体の全体のDNAプロセシング効率の増強は、切断部位での追加のホスホジエステル結合の加水分解であり得る。
本発明に従う少なくとも1つのエンハンサーによる切断部位での追加のホスホジエステル結合の加水分解は、DSB切断部位で一方のDNA鎖若しくは両DNA鎖に影響し、5'オーバーハング端部若しくは3'オーバーハング端部若しくは両端部に影響し、又は切除の長さに依存する異なるタイプのDSB切除を導き得る。よって、コンパクトTALEN実体の既存のクリベース活性への新たなニッカーゼ又はクリベース活性の付加は、得られる本発明による増強コンパクトTALENの効率を興味対象の遺伝子座で増強し得る(図8B〜8E)。非限定例として、向かい合う鎖への2つのニッカーゼ活性の付加(図8D)又は第2のDSBを生じる新たなクリベース活性の付加(図8E)は、二本鎖ギャップをもたらし得る。結果として、完全な再ライゲーションは、もはや可能ではなく、1又は幾つかの代替の修復帰結(例えば、不正確なNHEJ、相同組換え又はSSA)が刺激され得る。別の非限定例として、1つのニッカーゼ活性の付加は、一本鎖ギャップをもたらし得、端部の付着性を抑制する。このこともまた、得られる本発明による増強コンパクトTALENの効率を興味対象の遺伝子座で、上記の1又は幾つかの代替の修復帰結の刺激を介して増強し得る。
構造的組成[コアTALE足場のタイプ、関連する酵素活性を有する触媒ドメインのタイプ、エンハンサーのタイプ、最後にリンカーのタイプ]に依存して、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、上記のように、DNAを異なってプロセシングすることができる別々の酵素活性を異なるレベルで含んでなり得る。新たな酵素活性をコンパクトTALEN若しくは増強コンパクトTALENに付加することにより、又は1若しくは幾つかの構成的酵素活性のDNAプロセシング効率を増強することにより、或るコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの全体のDNAプロセシング効率を、出発材料のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENと比較して増強させることができる。
別の1つの好適な実施形態では、本発明は、本発明によるDNA標的配列を標的するコンパクトTALENにおいて一本鎖破断活性が促進されるとき、NHEJの少ない(すなわち、より保存的な様式で)標的付けられたHRを増大させる方法に関する。
別の1つの好適な実施形態では、本発明は、1つのクリベースエンハンサードメイン及び1つのニッカーゼエンハンサードメインが本発明によるコアTALE足場のN-末端及びC-末端にそれぞれ融合されるとき、コンパクトTALENの結合領域を跨ぐDNAの一本鎖の切り出しを増大させる方法に関する。
別の1つの好適な実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象者に有効量の本発明によるコンパクトTALENのバリアントを投与することを含んでなる、遺伝子中の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列における変異により引き起こされる遺伝子疾患の治療方法に関する。
別の1つの実施形態では、本発明は、細胞で発現させたとき、コンパクトTALENの活性を変調する方法に関し、該方法は、細胞に、コンパクトTALENの活性を変調する補助ドメインを導入する工程を含んでなる。1つの好適な実施形態では、本発明は、一旦コンパクトTALENが活性(DNA切断、DNAニック生成又は他のDNAプロセシング活性)を達成したら、細胞に、コンパクトTALENの活性を変調する補助ドメインを導入することによって、細胞で発現させたときのコンパクトTALENの活性の一時的な制御を可能にする方法に関する。1つの好適な実施形態では、本発明は、細胞で発現させたとき、コンパクトTALENの活性を阻害する方法に関し、該方法は、細胞に、コンパクトTALENの活性を阻害する補助ドメインを導入する工程を含んでなる。1つのより好適な実施形態では、コンパクトTALENの触媒ドメインは、NucA(配列番号26)であり、補助ドメインはNuiA(配列番号229)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。別の1つのより好適な実施形態では、コンパクトTALENの触媒ドメインはColE7(配列番号11)であり、補助ドメインはIm7(配列番号230)、その機能的変異体、バリアント若しくは誘導体である。
本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENをコードするベクター及び/又は組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞もまた本発明の範囲に包含される。
本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENをコードするベクター及び/又は組換えポリヌクレオチドを含んでなる非ヒトトランスジェニック動物もまた本発明の範囲に包含される。
本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENをコードするベクター及び/又は組換えポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物もまた本発明の範囲に包含される。
本発明はまた、本発明による方法を実施するために使用するキットに関する。より好ましくは、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN及び興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列のDNAプロセシング効率を増強させることに使用するための指示書を含んでなるキットは、本発明の範囲に包含される。
本発明の別の1つの観点は、本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN及びキャリアを含んでなる組成物である。本発明によるコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN及び先行技術において公知の医薬的に活性なキャリアを含んでなる医薬組成物がより好ましい。
−ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中では一文字コードに従って指称する。一文字コードでは、例えば、QはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
−アミノ酸置換は、或るアミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置き換えを意味し、例えば、ペプチド配列におけるアルギニン残基のグルタミン残基での置き換えはアミノ酸置換である。
−増強/増大/改善したDNAプロセシング活性とは、標的DNA配列又はDNA標的配列に対する所与のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENに関連するDNAプロセシング活性の検出レベルの、第2のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENによる、標的DNA配列に対する第1のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENの活性と比較しての増加をいう。第2のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、第1のもののバリアントであり得、第1のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENとの比較で1又はそれより多い置換アミノ酸残基を含んでなり得る。第2のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENは、第1のもののバリアントであり得、第1のコンパクトTALEN又は増強コンパクトTALENとの比較で1又はそれより多い触媒ドメイン及び/又はエンハンサードメインを含んでなり得る。この定義は、より広義には、他のエンドヌクレアーゼ及び稀切断性エンドヌクレアーゼについて適用される。
−「メガヌクレアーゼ」により、12より大きい二本鎖DNA標的配列を有する稀切断性エンドヌクレアーゼサブタイプが意図される。メガヌクレアーゼは、各ドメインがモノマー上にあるダイマー型酵素であるか、又は2つのドメインを単一ポリペプチド上に含んでなるモノマー型酵素である。
−「メガヌクレアーゼドメイン」により、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用する領域であって、該DNA標的の他方の半分と相互作用する(同メガヌクレアーゼの)他方のドメインと会合して該DNA標的を切断し得る機能的メガヌクレアーゼを形成することができる領域が意図される。
−(特には、表現「選択した細胞タイプ又は生物に関連する1つの細胞タイプ」における)「に関連する」により、選択した細胞タイプ又は選択した生物と特徴を共有する細胞タイプ又は生物が意図される;選択した細胞タイプ又は生物に関連するこの細胞タイプ又は生物は、選択した細胞タイプ又は生物に由来することもあり、しないこともある。
−「サブドメイン」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域であって、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的のハーフ部位(half-site)の別々の部分と相互作用する領域が意図される。
−「I-CreI部位」により、I-CreIによって切断される22〜24bpの二本鎖DNA配列が意図される。I-CreI部位には、野生型非パリンドロームI-CreIホーミング部位及びC1221又はC1221標的とも呼ばれる配列5'-t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12(配列番号2)のような派生パリンドローム配列が含まれる。
−「βヘアピン」により、ループ又はターンにより接続された、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの連続する2つのβストランドの逆平行βシート(β1β2又はβ3β4)が意図される。
−「単鎖メガヌクレアーゼ」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ」、「単鎖メガヌクレアーゼ誘導体」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体」又は「単鎖誘導体」により、ペプチド性スペーサーにより連結された2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含んでなるメガヌクレアーゼが意図される。単鎖メガヌクレアーゼは、親メガヌクレアーゼ標的配列の各々からの異なる1つの半分を含んでなるキメラDNA標的配列を切断することができる。
特定のゲノム工学応用で幾つかのコンパクトTALENを使用しなければならない場合、使用すべき組合せの各コンパクトTALENのDNA標的配列は、同じ興味対象の内因性ゲノムDNA遺伝子座に位置しいることもあり、していないこともある。DNA標的配列は、1〜1000塩基対(bp)、より好ましくは1〜500bp、より好ましくは1〜100bp、より好ましくは1〜100bp、より好ましくは1〜50bp、より好ましくは1〜25bp、より好ましくは1〜10bのおよその距離に位置し得る。別の1つの実施形態では、使用すべき組合せの各コンパクトTALENのDNA標的配列は、同じDNA鎖上に位置していることもあり、していないこともある。上記の距離で位置するDNA標的配列は、本発明によるDNAプロセシングの標的DNA配列に関して「近傍」のDNA配列である。
−「単一の二本鎖DNA標的配列」により、コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN又は二重切断コンパクトTALENの結合部位が意図される。コンパクトTALEN又は増強コンパクトTALEN又は二重切断コンパクトTALENの認識DNA結合部位は、長さが12〜100塩基対(bp)の範囲であり得、通常12bp長より大きくあり得る。
−用語「エンドヌクレアーゼ」とは、DNA又はRNA分子内、好ましくはDNA分子内の核酸同士間の結合の加水分解(切断)を触媒し得る任意の野生型の又はバリアントの酵素をいう。エンドヌクレアーゼは、代表的には約12塩基対(bp)長より大きい(より好ましくは14〜45bp長の)ポリヌクレオチド認識部位を有するとき、稀切断性エンドヌクレアーゼとして分類され得る。稀切断性エンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座でのDNA二本鎖破断(DSB)を誘導することによってHRを有意に増加させる(Rouet, Smihら,1994;Rouet, Smihら,1994;Choulika, Perrinら,1995;Pingoud及びSilva 2007)。稀切断性エンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ(Paques及びDuchateau 2007)、遺伝子操作ジンクフィンガードメインとFokIのような制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(Porteus及びCarroll 2005)、又は化学的エンドヌクレアーゼ(Eisenschmidt, Lanioら,2005;Arimondo, Thomasら,2006;Simon, Cannataら,2008)であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいて、化学的又はペプチド性切断物質は、特異的標的配列を認識する核酸ポリマー又は別のDNAに結合されて、切断活性を特異的配列に対して標的付けられている。化学的エンドヌクレアーゼはまた、オルトフェナントロリンとDNA切断性分子と三重鎖形成性オリゴヌクレオチド(TFO;特異的DNA配列に結合することが知られている)との結合体(Kalish及びGlazer 2005)のような合成ヌクレアーゼを包含する。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。
稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当該分野で周知である(Stoddard 2005)。ホーミングエンドヌクレアーゼはDNA標的配列を認識し、一本鎖又は二本鎖破断を生じさせる。12〜45塩基対(bp)長、通常は14〜40bp長のDNA標的部位を認識するホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的である。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ又はGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。
HEは4つの主要なファミリーに属する。LAGLIDADGファミリー(これは、触媒中心に関与する保存されたペプチド性モチーフに因んで名付けられた)は、最も広範で、最も特徴付けられた群である。現在、7つの構造が利用可能である。このファミリーのほとんどのタンパク質はモノマー型であり、2つのLAGLIDADGモチーフを提示する一方で、少数のものは唯1つのモチーフを有し、よって二量体化してパリンドローム又は偽パリンドロームの標的配列を切断する。
N-末端I-DmoIドメインとI-CreIモノマーとの融合による機能的なキメラメガヌクレアーゼの作製は、LAGLIDADGタンパク質の可塑性を証明している(Chevalier, Kortemmeら,2002;Epinat, Arnouldら,2003);国際PCT出願WO 03/078619(Cellectis)及びWO 2004/031346(Fred Hutchinson Cancer Research Center, Stoddardら))。
加えて、局所的に変更した特異性を有する数百のI-CreI誘導体が、半合理的アプローチ及び高スループットスクリーニングを組み合わせることにより人工的に創り出された:
− I-CreIの残基Q44、R68及びR70、又はQ44、R68、D75及びI77が変異誘発され、DNA標的の±3〜5位(5NNN DNA標的)で変更した特異性を有するバリアントの一団がスクリーニングにより同定された(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853(Cellectis);(Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
− I-CreIの残基K28、N30及びQ38、又はN30、Y33及びQ38、又はK28、Y33、Q38及びS40が変異誘発され、DNA標的の±8〜10位(10NNN DNA標的)で変更した特異性を有するバリアントの一団がスクリーニングにより同定された(Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006);国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156(Cellectis))。
更に、I-CreIの残基28〜40及び44〜77は、ホーミングエンドヌクレアーゼの標的ハーフ部位(half-site)の異なる部分に結合し得る2つの部分的に分離可能な機能的サブドメインを形成していることが示された(Smith, Grizotら,2006);国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781(Cellectis))。
I-CreIの同じモノマー内の2つのサブドメインからの変異を組み合わせることにより、各サブドメインが結合する±3〜5位及び±8〜10位のヌクレオチドを含んでなるパリンドロームの組合せDNA標的配列を切断し得る新規キメラ分子(ホモダイマー)のデザインが可能になった((Smith, Grizotら,2006);国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781(Cellectis))。
前の2つの工程の組合せにより、4つの異なるサブドメインを含むより大きなコンビナトリアルアプローチが可能になる。この異なるサブドメインは別々に改変されて、選択された特異性を有する完全に再設計されたメガヌクレアーゼバリアント(へテロダイマー又は単鎖分子)が得られるように組み合わされる。第1の工程において、新規なメガヌクレアーゼの二者一組が、切断したい標的に由来するパリンドローム状標的を切断する新たな分子(「ハーフ-メガヌクレアーゼ」)に組み合わされる。その後、この「ハーフ-メガヌクレアーゼ」を組み合わせることで、興味対象の標的を切断するへテロダイマー型の種が生じ得る。4セットの変異の、モデル標的配列又は異なる遺伝子からの配列を切断するへテロダイマー型エンドヌクレアーゼへの組立てが、以下のCellectisの国際特許出願:XPC遺伝子(WO2007/093918)、RAG遺伝子(WO2008/010093)、HPRT遺伝子(WO2008/059382)、β-2ミクログロブリン遺伝子(WO2008/102274)、Rosa26遺伝子(WO2008/152523)、ヒトヘモグロビンβ遺伝子(WO2009/13622)及びヒトインターロイキン-2レセプターγ鎖遺伝子(WO2009019614)に記載されている。
このようなエンドヌクレアーゼの例としては、I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-MsoIが挙げられる。
ホーミングエンドヌクレアーゼは、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、例えばI-SceI、I-CreI、I-CeuI、I-MsoI及びI-DmoIであり得る。
本出願で言及するエンドヌクレアーゼは、野生型(天然に生じる)及びバリアントのエンドヌクレアーゼの両方を包含する。本発明によるエンドヌクレアーゼは、「バリアント」エンドヌクレアーゼ、すなわち天然には存在せず、遺伝子工学的操作又はランダム変異誘発により得られるエンドヌクレアーゼ、すなわち遺伝子操作エンドヌクレアーゼであり得る。このバリアントエンドヌクレアーゼは、例えば、野生型の、天然に生じるエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列における少なくとも1つの残基の異なるアミノ酸での置換により得ることができる。置換は、例えば、部位-特異的変異誘発及び/又はランダム変異誘発により導入することができる。本発明の枠内で、このようなバリアントエンドヌクレアーゼは依然として機能的である。すなわち、それらは、標的配列を認識し(結合機能)、任意に特異的に切断して遺伝子ターゲッティングプロセスを開始する能力を保持する。
エンドヌクレアーゼバリアントは、ホモダイマー(2つの同一モノマーを含んでなるメガヌクレアーゼ)であってもよいし、へテロダイマー(2つの非同一なモノマーを含んでなるメガヌクレアーゼ)であってもよい。本発明の範囲にはまた、ポリヌクレオチド配列中又はゲノム中の1つの興味対象の標的を切断することができるエンドヌクレアーゼバリアント(非限定的例として、ヘテロダイマー(WO2006097854)、偏性ヘテロダイマー(WO2008093249)及び単鎖メガヌクレアーゼ(WO03078619及びWO2009095793)を含む)自体も包含されると理解される。本発明はまた、異なる起源に由来する2つのモノマーから構成されるハイブリッドバリアント自体(WO03078619)も包含する。
新規特異性を有するエンドヌクレアーゼは、遺伝子を標的することにより興味対象の導入遺伝子をゲノム中に所定の位置で組み込む、本発明による方法において使用することができる。
−「送達ベクター」により、本発明で必要とされる因子/化学物質及び分子(タンパク質又は核酸)を細胞に接触させるか(すなわち「接触」)又は細胞内若しくは細胞区画内へ送達するために、本発明において使用することができる任意の送達ベクターが意図される。これには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬剤送達ベクター、化学キャリア、ポリマーキャリア、リポプレックス(lipoplex)、ポリプレックス(polyplex)、デンドリマー、超微粒気泡(超音波造影剤)、ナノ粒子、エマルジョン又は他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これら送達ベクターは、分子、化学物質、高分子(遺伝子、タンパク質)、又は他のベクター、例えばプラスミド、Diatosにより開発されたペプチドの送達を可能にする。これらの場合において、送達ベクターは分子キャリアである。「送達ベクター」により、トランスフェクションを実行するための送達方法もまた意図される。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ関連ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、及び二本鎖DNAウイルス(アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)、及びポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む)が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては:トリ白血病-肉腫群、哺乳動物C-型、B-型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルス(Coffin, J. M., Retroviridae:The viruses及びtheir replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)が挙げられる。
−「組込みレンチウイルスベクター(又はLV)」は、非限定例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るベクターを意味する。
−対して、「非組込みレンチウイルスベクター(又はNILV)」は、ウイルスインテグラーゼの作用により標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
送達ベクター及びベクターは、ソノポレーション(sonoporation)若しくはエレクトロポレーションのような任意の細胞透過技法又はこれら技法の派生法と組み合わされ得る。
−細胞により、任意の原核生物又は真核生物の生存細胞、インビトロ培養用にこれら生物から導いた細胞株、動物又は植物起源の初代細胞が意図される。
−「初代細胞」により、非常に少数のものしか分裂を経験していないので、連続分裂性(continuous tumorigenic)の又は人工的に不死化した細胞株と比較して、由来する組織の主要な機能的構成要素及び特徴をより代表する、生存組織(すなわち生検材料)から直接取り出し、インビトロ増殖用に樹立した細胞が意図される。よって、これら細胞は、言及するインビボ状態についてより価値のあるモデルである。
これら全ての細胞株は、本発明の方法により、興味対象の遺伝子又はタンパク質を産生し、発現し、定量し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するように改変され得る;これらモデルはまた、研究及び製造及び(非限定例として、化学、バイオ燃料、治療薬及び農学のような)種々の分野において、興味対象の生物学的に活性な分子をスクリーニングするために使用し得る。遺伝子操作T細胞を用いる養子免疫治療は、悪性腫瘍及び感染性疾患の治療の見込みのあるアプローチである。最も最近のアプローチは、適切なT細胞レセプター(TCR)又はキメラ抗原レセプター(CAR)のランダム組込みによる遺伝子導入に依拠する。稀切断性エンドヌクレアーゼを用いる標的付けられたアプローチは、T細胞中に遺伝子を導入し、遺伝子操作T細胞を作製するための効率的で安全な代替法である。
−「同一性」とは、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、比較のために整列させ得る各配列中の位置を比較して決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、それら分子は、当該位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一の又は適合するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラム(GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能であるFASTA又はBLASTを含む)を使用して、2つの配列間の同一性を算出してもよく、例えばデフォルト設定で使用することができる。
−「変異」により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列中の1又はそれより多いヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入が意図される。変異は、遺伝子のコーディング配列又はその調節配列に影響することがある。これはまた、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造/安定性に影響し得る。
−「遺伝子」は、特定のタンパク質又はタンパク質セグメントをコードする、染色体に沿って直鎖状様式で整列したDNAセグメントからなる、遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、代表的には、プロモーター、5'非翻訳領域、1又はそれより多いコーディング配列(エキソン)、任意にイントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー及び/又はサイレンサーを更に含んでなり得る。
−本明細書中で使用する場合、用語「導入遺伝子」とは、ポリペプチドをコードする配列をいう。好ましくは、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、該導入遺伝子を挿入する細胞、組織又は個体中で発現していないか、又は発現しているが生物学的に活性でない。最も好ましくは、導入遺伝子は、個体の治療に有用である治療用ポリペプチドをコードする。
−用語「興味対象の遺伝子」又は「GOI」とは、既知又は推定の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列をいう。
−「無瘢痕再ライゲーション」により、二本鎖破断事象の生成後における、NHEJプロセスによる、DNA破断端部の遺伝情報の喪失なし(挿入/欠失事象なし)での完璧な再ライゲーション事象が意図される。
−「不正確なNHEJ」により、DSBにより生じた核酸端部の、ヌクレオチドの挿入又は欠失を伴う再ライゲーションが意図される。不正確なNHEJは結果であり、修復経路ではなく、種々のNHEJ経路(非限定例として、Ku依存性又はKu非依存性)に起因し得る。
−「融合タンパク質」により、元来は別々のタンパク質又はその部分をコードする2又はそれより多い遺伝子の連結から本質になる当該分野における周知プロセスの結果が意図される。「融合遺伝子」の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一ポリペプチドを生じる。
−「TALE-ヌクレアーゼ」(TALEN)又は「古典的TALEN」により、転写アクチベータ様エフェクター(TALE)に由来するDNA結合性ドメインと1つのFokI触媒ドメインとからなり、DNA標的配列を切断することができる活性実体を形成するために二量体化する必要がある融合タンパク質が意図される。
上記で使用するように、句「からなる群より選択される」、「から選択される」などは、特定されたものの組合せを含む。
本明細書中で数値限定又は範囲に言及する場合には終点は含まれる。また、数値限定内の全ての値又は部分的範囲は、あたかも明示的に記載されているように明確に含まれる。
上記の説明は、当業者が本発明の対象を作製し、使用することができるように提示されており、特定の適用及びその要件に関して提供されている。好適な実施形態の種々の改変が、当業者に容易に明らかとなる。本明細書中で規定される包括的原理は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、他の実施形態及び応用に適用され得る。よって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図しておらず、本明細書中に開示された原理及び特徴と一致する最も広い範囲を意図される。
本発明を概説してきたので、(例示のためだけに提供され、そうでないと記載されない限り限定を意図していない)或る種の具体例を参照することにより更なる理解を得ることができる。
実施例1
野生型I-CreIメガヌクレアーゼ(配列番号106)を、I-TevI(配列番号107)の触媒ドメインを融合させる親足場として選択した。野生型I-TevIは、GIY-YIGファミリーのモノマー型クリベースとして機能して標的DNAに段違いの(staggered)二本鎖破断を生じる。生化学的及び構造学的データを指針として、可変長の構築物を、触媒ドメイン全体及びリンカーの欠失-不耐性領域を包むI-TevIのN-末端領域から設計した(配列番号109〜配列番号114)。1つを除き全ての場合において、フラグメントを、介在性の5残基ポリペプチドリンカー(-QGPSG-;配列番号103)を用いて、I-CreIのN-末端に融合させた。リンカーなしの融合構築物は、人工リンカー中のものと類似する残基(-LGPDGRKA-;配列番号104)を天然に含有していた。I-CreIはホモダイマーであるので、全ての融合構築物は3つの触媒中心を含有する(図4、ここで「触媒ドメイン」=クリベース):ダイマー界面の天然I-CreI活性部位及びモノマーあたり1つのI-TevI活性部位。
各「3機能性」メガヌクレアーゼの活性を、国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006に以前に記載した本発明者らの酵母アッセイを用いて評価した。全ての構築物は、C1221標的DNAを、野生型I-CreIのものに匹敵する活性で切断可能であった(表4)。
I-CreI触媒コアとは独立したI-TevI触媒ドメインの活性を検証するため、D20N点変異体を作製してI-CreI足場を不活化した[配列番号108、配列番号115〜配列番号120;Chevalier, Sussmanら,2004)]。本発明者らの酵母アッセイでの試験により、不活化I-CreI(D20N)変異体タンパク質単独の活性は認められなかった(表4)。しかし、切断活性は、I-TevI触媒ドメインを有する融合体について観察することができた(表4)。
相対的活性を下記のとおり分類する:−,検出可能な活性なし;+,<25%の活性;++,25%〜<50%の活性;+++,50%〜<75%の活性;++++,75%〜100%の活性。
タンパク質-融合足場を、短縮型形態のI-CreI(配列番号106、I-CreI_X:配列番号121)及び該タンパク質のN-又はC-末端のいずれかに融合させた3つの異なるリンカーポリペプチド(NFS1 = 配列番号98;NFS2 = 配列番号99;CFS1 = 配列番号100)をベースにして設計した。DNA結合活性にもDNA切断活性にもほとんど又は全く影響しないでI-CreI親足場の表面を横切る「ベースライン」の融合リンカーを設計することを目的として、全ての場合で構造モデルを作製した。2つのN-末端融合足場については、I-CreIの残基2〜残基153にわたるポリペプチドを使用した(リンカーの配置を可能にするためのK82A変異を有する)。C-末端融合足場は野生型I-CreIの残基2〜残基155を含有する。両方の融合足場タイプについて、リンカーの「遊離」端(すなわち、ポリペプチドを連結することが可能である端)は、出発点としてI-CreI/DNA複合体構造(PDB id:1g9z)を用いて構築したモデルから決定されたように、DNAに対して近位であるように設計する。2つのI-CreI N-末端融合足場(I-CreI N-terminal fusion scaffold;I-CreI_NFS1 = 配列番号122及びI-CreI_NFS2 = 配列番号123)並びに1つのC-末端融合足場(I-CreI C-terminal fusion scaffold;I-CreI_CFS1 = 配列番号124)を本発明者らの酵母アッセイ(実施例1を参照)で試験して、野生型I-CreIのものと類似する活性を有することを見出した(表5)。
相対的活性を下記のとおり分類する:−,検出可能な活性なし;+,<25%の活性;++,25%〜<50%の活性;+++,50%〜<75%の活性;++++,75%〜100%の活性。
各「3-機能性」メガヌクレアーゼの活性を、本発明者らの酵母アッセイ(実施例1を参照)を用いて評価した。全ての構築物は、C1221標的DNAを、野生型I-CreIのものに匹敵する活性で切断可能であった(表5)。
I-CreI触媒コアとは独立したColE7触媒ドメインの活性を検証するため、D20N点変異体を作製してI-CreI足場を不活化した(配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号131、配列番号132、配列番号133;(Chevalier, Sussmanら,2004))。本発明者らの酵母アッセイでの試験により、不活化I-CreI(D20N)変異体タンパク質単独の活性は認められなかった(表5)。しかし、切断活性は、ColE7触媒ドメインを有する融合体について観察することができた(表5)。
(a)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(b)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択した触媒ドメインをN-末端又はC-末端に付着させ得る2つのコアTALE足場を作製する。コア足場(sT1:配列番号134及びsT2:配列番号135)はN-末端領域及びC-末端領域が異なり、sT2は、sT1と比較して、N-末端から152アミノ酸残基(Szurek, Rossierら,2002)を欠きC-末端から最後の220残基を欠く短縮型バリアントである。sT1において、C-末端領域は野生型TALEドメインに関して短縮形であり、DNAコーディング配列中に偶然に規定された制限部位(BamHI)で終端する。
この2つのコア足場を用いて、4つの「ベースライン」のTALE DNA結合性タンパク質(bT1-Avr = 配列番号136、bT2-Avr = 配列番号137、bT1-Pth = 配列番号138及びbT2-Pth = 配列番号139)を、天然に存在する非対称配列AvrBs3(19bp)及びPthXo1(25bp)を認識する反復ドメインの対応するセットの挿入により作製する(図3)。ベースライン足場のタンパク質配列の例を配列番号136〜配列番号139に列挙する。これら足場は、そのまま、唯1つの認識配列を有する標的に対するDNA結合能力についてインビトロで試験し得る。既存のTALENとの比較のために、FokIヌクレアーゼの触媒ドメイン(配列番号368及び非限定例として特に残基P381〜F583)を、ベースライン足場のN-末端又はC-末端のいずれかに融合させ得る。これらコントロールを用いる効果的切断には、2つのTALE結合配列を含有する標的部位DNAが必要である。
基本のコンパクトTALEN(cTALEN)は、ベースライン足場のN-末端又はC-末端のいずれかへの触媒ドメインの融合により作製する(図5、それぞれA又はB)。TALE DNA結合ドメインとの融合に適切な触媒ドメインの非限定的リストを表2に示す。使用し得るリンカーの非限定的リストを表3に示す。リンカーのデザインは、付着させる触媒ドメインの性質及び所与の用途に依存することに留意すべきである。また、特別に遺伝子操作されたリンカーを構築して、一方又は両方のドメインの活性をより良好に制御又は調節することもできると予想される。下記の実施例5、6及び7では、リンカーを規定し得る追加の方法及び代替の方法を議論する。全てのcTALENデザインを本発明者らの酵母アッセイ(実施例1を参照)評価する。全てのcTALENデザインは、既存の遺伝子操作メガヌクレアーゼに匹敵する検出可能な活性を提供する。
I-TevI(配列番号20)(GIY-YIGエンドヌクレアーゼファミリーのメンバー)の触媒ドメインをTALE-由来足場(N末端ドメイン、RVDから構成される中心コア及びC末端ドメインから構成)に融合させて、新たなクラスのcTALEN(TALE::TevI)を作製した。触媒ドメイン(CD)融合体の方向(N-末端 対 C-末端)を区別するため、構築物の名称をCD::TALE-RVD(触媒ドメインをTALEドメインのN-末端に融合)又はTALE-RVD::CD(触媒ドメインをTALEドメインのC-末端に融合)と記述する(ここで、「-RVD」は、任意に、TALEドメインにより認識される配列を指称してもよく、「CD」は触媒ドメインタイプである)。本実施例で、本発明者らは、例えばAvrBs3配列を標的する(よってTALE-AvrBs3::TevIと名付けられた)新規なTALE::TevIを説明する。
(a)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(b)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択したI-TevI-由来触媒ドメインをN-末端又はC-末端に付着させ得るコアTALE足場sT2(配列番号135)を選択した。前記のsT2短縮型足場を、完全長コアTALEN足場テンプレート(pCLS7183、配列番号141)からプライマーCMP_G061(配列番号142)及びCMP_G065(配列番号143)を用いるPCRにより作製し、ベクターpCLS7865(配列番号144)中にクローニングして、pCLS7865-cTAL11_CFS1(pCLS9009、配列番号145)(ここで、CFS1はアミノ酸配列-GSSG-を指称する)を作製した(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。I-TevI(配列番号20)触媒ドメインの3つのバリアントを、プライマー対CMP_G069(配列番号147)及びCMP_G070(配列番号148)を用いるテンプレートTevCreD01[配列番号109、プラスミドpCLS6614(配列番号146)中のタンパク質]に対するPCRにより、又はプライマー対CMP_G069(配列番号147)及びCMP_G071(配列番号149)を用いるテンプレートTevCreD02[配列番号110、プラスミドpCLS6615(配列番号203)中のタンパク質]に対するPCRにより、又はプライマー対CMP_G069(配列番号147)及びCMP_G115(配列番号259)を用いるテンプレートTevCreD05[配列番号113、プラスミドpCLS6618(配列番号258)中のタンパク質]に対するPCRにより増幅させ、BamHI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS9009骨格中にサブクローニングして、それぞれpCLS7865-cT11_TevD01(pCLS9010、配列番号150)、pCLS7865-cT11_TevD02(pCLS9011、配列番号151)及びpCLS7865-cT11_TevD05(pCLS15775、配列番号260)を得た。全ての融合体は、TALE-由来DNA結合ドメイン及びI-TevI-由来触媒ドメインを連結するジペプチド-GS-を含む。
最終のTALE-AvrBs3::TevI酵母発現プラスミドpCLS8523(配列番号154)、pCLS8524(配列番号155)及びpCLS12092(配列番号262)を、それぞれプラスミドpCLS9012、pCLS9013及びpCLS15776を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngの各プラスミドとNcoI及びEagIでの消化により線状化した1ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら,2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TALE-AvrBs3::TevI構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表6)。酵母細胞でのそれぞれの標的に対するTALE-AvrBs3::TevIの活性レベルを図9に示す。図9に要約したデータは、TALE-AvrBs3::TevIが酵母で幾つかの標的に対して活性であることを示す。
pCLS9012(配列番号218)又はpCLS9013(配列番号153)に由来するTALE-AvrBs3::TevI構築物をコードするDNAを、受容プラスミド用のAscI及びXhoI制限酵素並びにTALE-AvrBs3::TevI挿入物用のBssHII及びXhoI制限酵素を用いてpCLS1853(配列番号193)哺乳動物発現プラスミド中にサブクローニングして、哺乳動物発現プラスミドpCLS8993及びpCLS8994(配列番号194及び195)を得た。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての哺乳動物標的レポータープラスミドを、標準のGatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、CHOレポーターベクター中に構築した(Arnould, Chamesら,2006, Grizot, Epinatら,2010)。TALE-AvrBs3::TevI構築物を偽パリンドローム標的に対して哺乳動物細胞(CHO K1)における染色体外アッセイで試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALENと比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表6)。
Avr15標的(配列番号167)に対するTALE-AvrBs3::TevI構築物(12.5ngのトランスフェクトDNA)の哺乳動物細胞での活性レベルを図10に示す。TALE-AvrBs3::TevIは、標的配列を効率的に切断するように見える。
上記実施例に記載した結果は、2つのTALE::TevI融合体(各々1つのTALE-ベースのDNA結合ドメイン及び1つのI-TevI-ベースの触媒ドメインを含有する)が検出可能な活性を生じるように作用することを説明する。使用したアッセイは、一本鎖アニーリング(本質的にはDSBにより誘引されるプロセス)による縦列反復組換えを測定する(Sugawara及びHaber 1992;Paques及びDuchateau 2007)。TALE::TevI融合体は、細胞ベースアッセイにおいて単独でシグナルを誘引するには不十分であるニッカーゼ活性を有し得る。しかし、近傍の2部位での2つのTALE::TevIタンパク質の結合は、時に、(近位であり異なるDNA鎖上であるときにはDSBを作製することができる)2つの独立のニックを生じ得る。この場合、各TALE::TevIは、ニックを生じることができるcTALENである。
TALE::TevIニッカーゼ活性を測定するために異なる実験を設定する:
TALE-AvrBs3::TevI構築物T11Avr_TevD01及びcT11Avr_TevD02をコードする配列を、NcoI/EagI制限部位を用いてT7-ベースの発現ベクター中にクローニングし、それぞれプラスミドpCLS9021(配列番号201)及びpCLS9022(配列番号202)を得る。このクローニング工程は、精製用の追加のヘキサ-Hisタグを有するTALE-AvrBs3::TevIタンパク質を生じる。次いで、プラスミドpCLS9021及びpCLS9022を用いて、2つの方法の一方により活性タンパク質を作製する:
1.プラスミドを標準的なインビトロ転写/翻訳系で使用し;翻訳物からの溶解物を更なる精製なしで直接使用する。
2.標準プロトコル(すなわち:対数増殖期まで増殖させ、IPTGで誘導し、採集し、His-タグ化タンパク質用のアフィニティー法による細胞溶解及び精製)で、プラスミドを使用して発現用E.coli BL21(DE3)細胞を形質転換する。
活性タンパク質を、AvrBs3認識部位配列を有しないか、1つ又は2つ有するDNA標的に対してアッセイする。1より多い部位が存在するとき、同一認識配列は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離される。
スーパーコイル状環状プラスミドニック生成及び/又は線状化アッセイを行う。上記のDNA標的を有するプラスミドを標準方法により作製し、カラム精製して、>98%純度のスーパーコイル状プラスミドを得た。漸増量の(上記のように作製した)TALE-AvrBs3::TevIタンパク質を各プラスミドとDNA切断を促進する条件下で37℃にて1時間インキュベートする。反応生成物をアガロースゲル上で分離し、EtBr染色により可視化する。
線状DNAニック生成及び/又は切断アッセイもまた行う。上記の標的配列を含むPCR産物を標準方法により作製し、カラム精製して、>98%純度の線状基質を得る。次いで、漸増量の(上記のように作製した)TALE-AvrBs3::TevIタンパク質を各PCR基質とDNA切断を促進する条件下で37℃にて1時間インキュベートする。反応生成物を変性アクリルアミドゲル上で分離し、一本鎖DNAを可視化する。
AvrBs3-由来TALEN(配列番号196)のC末端ドメインの異なる短縮化によるバリアントを出発材料の足場として選択する。これらバリアントのサブセットは、位置E886(C0)、P897(C11)、G914(C28)、L926(C40)、D950(C64)、R1000(C115)、D1059(C172)(短縮型C末端ドメインC11〜C172のタンパク質ドメインはそれぞれ配列番号204〜209で示される)及びP1117[天然AvrBs3(配列番号220)のC末端ドメインの活性化ドメインを欠くCter wt又はWT Cter(配列番号210)とも呼ぶ]の後での短縮形を含む。AvrBs3-由来N末端ドメイン、AvrBs3-由来の反復ドメインセット及び短縮型AvrBs3-由来C末端ドメインを含むバリアント足場をコードするプラスミド[pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817(配列番号211〜217)。これらはpCLS7184(配列番号196)をベースにする。]により、制限部位BamHI及びEagIを用いる、C末端ドメインに融合した任意の触媒ドメインのクローニングが可能になる。
I-TevI(配列番号20)の触媒ドメインのバリアントは、I-TevIのN-末端領域から設計する。これらバリアントのサブセットは、(Liu, Dansereauら,2008)において名付けられたリンカーの欠失-不耐性領域、リンカーの欠失-耐性領域及びジンクフィンガーとしての触媒ドメインの短縮形を含む(配列番号197〜200)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
TALE-AvrBs3::TevI構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表6)。
実施例3aに記載したsT2(配列番号135)コアTALE足場を選択して、pCLS7865-cTAL11_NFS1(pCLS9008、配列番号234)を作製した(ここで、NFS1は、アミノ酸配列-GSSG-を指称する)(クローニングを容易にするためにコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。I-TevI(配列番号20)触媒ドメインの4つのバリアントを、プライマー対CMP_G001(配列番号239)及びCMP_G067(配列番号263)又はCMP_G152(配列番号264)を用いるテンプレートTevCreD01[配列番号109、プラスミドpCLS6614(配列番号146)中のタンパク質]に対するPCRにより、又はプライマー対CMP_G001(配列番号239)及びCMP_G068(配列番号240)を用いるテンプレートTevCreD02[配列番号110、プラスミドpCLS6615(配列番号203)中のタンパク質]に対するPCRにより、又はプライマー対CMP_G001(配列番号239)及びCMP_G114(配列番号265)を用いるテンプレートTevCreD05[配列番号113、プラスミドpCLS6618(配列番号258)中のタンパク質]に対するPCRにより増幅させ、NcoI及びKpn2I制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS9008骨格中にサブクローニングして、それぞれpCLS7865-TevW01_cT11(pCLS15777、配列番号266、配列番号426のタンパク質をコードする)、pCLS7865-TevD01_cT11(pCLS15778、配列番号267、配列番号427のタンパク質をコードする)、pCLS7865-TevD02_cT11(pCLS12730、配列番号235、配列番号428のタンパク質をコードする)及びpCLS7865-TevD05_cT11(pCLS15779、配列番号268、配列番号429のタンパク質をコードする)を得た。TevW01_cT11-ベースの融合体はTALE-由来DNA結合ドメインとI-TevI-由来触媒ドメインとを連結するジペプチド-SG-を含む一方、他の全ての構築物は該ドメインを連結するより長いペンタペプチド-QGPSG-が組み込まれている。
AvrBs3部位(配列番号152)を標的するためのRVDをコードするDNA配列を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS15777(配列番号266)、pCLS15778(配列番号267)及びpCLS12730(配列番号235)中にサブクローニングして、TevI::TALE-AvrBs3構築物、それぞれTevW01_cT11Avr(pCLS15780、配列番号269、配列番号430のタンパク質をコードする)、TevD01_cT11Avr(pCLS15781、配列番号270、配列番号431のタンパク質をコードする)及びTevD02_cT11Avr(pCLS12731、配列番号236、配列番号432のタンパク質をコードする)を作製した。類似のクローニング技法を用いて、RagT2-R部位(配列番号271)を標的するためのRVDをプラスミドpCLS15779(配列番号268)中に導入して、構築物TevD05_cT11RagT2-R(pCLS15782、配列番号272)を作製した。全てのTevI::TALE構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTevI::TALE-ベースの酵母発現プラスミドpCLS11979(配列番号273)、pCLS8521(配列番号274)、pCLS8522(配列番号237)及びpCLS12100(配列番号275)を、それぞれプラスミドpCLS15780(配列番号269)、pCLS15781(配列番号270)、pCLS12731(配列番号236)及びpCLS15782(配列番号272)を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngの各プラスミドとNcoI及びEagIでの消化により線状化した1ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら,2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TevI::TALE-AvrBs3構築物及びTevI::TALE-RagT2-R構築物を、偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置させ5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表6)。加えて、唯一のAvrBs3又はRagT2-R認識部位(配列番号238)を有する標的について構築物を試験した(表8)。酵母でのTevI::TALE-AvrBs3活性レベルは、適切な標的に対するTALE-AvrBs3::TevI(pCLS8524、配列番号155)のものに匹敵した。サンプルの単一部位標的についての本発明のcTALENによる有意な活性を表8に示す。
NptIIT5-L及びNptIIT6-L部位標的するためのRVDをコードするDNA配列(配列番号276〜279)を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS12730(配列番号235)中にサブクローニングして、TevI::TALE構築物、それぞれTevD02_cT11NptIIT5-L(pCLS15783、配列番号280)及びTevD02_cT11NptIIT6-L(pCLS15784、配列番号281)を作製した。構築物を配列決定し、TevI::TALE挿入物を標準のクローニング技法によりプラスミドpCLS14529(配列番号282)に移入して、最終のTevI::TALE-NptIIT5-L及びTevI::TALE-NptIIT6-L発現プラスミド、それぞれpCLS14579(配列番号283)及びpCLS14581(配列番号284)を作製した。プラスミドpCLS14529により、植物細胞での高レベルの構成的発現を付与するプロモーターの下流への興味対象の遺伝子配列のクローニングが可能になる。
NucA(配列番号26)(Anabaena sp.由来の非特異的エンドヌクレアーゼ)をTALE-由来足場(N末端ドメイン、RVDから構成される中心コア及びC末端ドメインから構成される)に融合させて、新たなクラスのcTALEN(TALE::NucA)を作製した。触媒ドメイン(CD)融合体の方向(N-末端 対 C-末端)を区別するため、構築物の名称をCD::TALE-RVD(触媒ドメインをTALEドメインのN-末端に融合)又はTALE-RVD::CD(触媒ドメインをTALEドメインのC-末端に融合)と記述する(ここで、「-RVD」は、任意に、TALEドメインにより認識される配列を指称してもよく、「CD」は触媒ドメインタイプである)。本実施例で、本発明者らは、例えばAvrBs3配列を標的する(よってTALE-AvrBs3::NucAと名付けられた)新規なTALE::NucA構築物を説明する。特には、野生型NucAエンドヌクレアーゼは、NuiAタンパク質(配列番号229)との複合体形成により阻害され得る。コンパクトTALENに関しては、NuiAタンパク質は、TALE::NucA構築物のヌクレアーゼ活性を変調する補助ドメインとして機能し得る。
(a)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(b)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択したNucA-由来触媒ドメインをN-末端又はC-末端に付着させ得るコアTALE足場sT2(配列番号135)を選択した。前記のように、sT2短縮型足場を、完全長コアTALEN足場テンプレート(pCLS7183、配列番号141)からプライマーCMP_G061(配列番号142)及びCMP_G065(配列番号143)を用いるPCRにより作製し、ベクターpCLS7865(配列番号144)中にクローニングして、pCLS7865-cTAL11_CFS1(pCLS9009、配列番号145)(ここで、CFS1はアミノ酸配列-GSSG-を指称する)を作製した(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。NucA(配列番号26)触媒ドメイン(アミノ酸残基25〜274に相当)を、BamHI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS9009骨格(配列番号145)中にサブクローニングして、pCLS7865-cT11_NucA(pCLS9937、配列番号221、配列番号433のタンパク質をコードする)を得た。この融合体は、TALE-由来DNA結合ドメインとNucA-由来触媒ドメインとを連結するジペプチド-GS-を含む。このクローニング工程はまた、アミノ酸レベルで、NucA触媒ドメインのC末端にAAD配列をもたらす。
AvrBs3部位を標的するためのRVD(配列番号152)をコードするDNA配列を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS9937(配列番号221)中にサブクローニングして、TALE-AvrBs3::NucA構築物cT11Avr_NucA(pCLS9938、配列番号222、配列番号434のタンパク質をコードする)を作製した。このTALE-AvrBs3::NucA構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
TALE-AvrBs3::NucA構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表7)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的について構築物を試験した(配列番号224;表7)。
AvrBs3-由来TALEN(配列番号196)のC末端ドメインの異なる短縮化によるバリアントを出発材料の足場として選択する。これらバリアントのサブセットは、位置E886(C0)、P897(C11)、G914(C28)、L926(C40)、D950(C64)、R1000(C115)、D1059(C172)(短縮型C末端ドメインC11〜C172のタンパク質ドメインはそれぞれ配列番号204〜209で示される)及びP1117[天然AvrBs3(配列番号220)のC末端ドメインの活性化ドメインを欠くCter wt又はWT Cter(配列番号210)とも呼ぶ]の後での短縮形を含む。AvrBs3-由来N末端ドメイン、AvrBs3-由来の反復ドメインセット及び短縮型AvrBs3-由来C末端ドメインを含むバリアント足場をコードするプラスミド[pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817(配列番号211〜217)。これらはpCLS7184(配列番号196)をベースにする。]により、制限部位BamHI及びEagIを用いる、C末端ドメインに融合した任意の触媒ドメインのクローニングが可能になる。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
TALE-AvrBs3::NucA構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表7)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的(配列番号224)についてTALE-AvrBs3::NucA構築物を試験した。図11に要約したデータは、本発明のcTALENによるTALE-AvrBs3::NucA構築物が少なくとも1つのAvrBs3認識部位を有する全ての標的について活性であることを示す。
ColE7(配列番号140)(E.coli由来の非特異的エンドヌクレアーゼ)の触媒ドメインをTALE-由来足場(N末端ドメイン、RVDから構成される中心コア及びC末端ドメインから構成)に融合させて、新たなクラスのcTALEN(TALE::ColE7)を作製した。触媒ドメイン(CD)融合体の方向(N-末端 対 C-末端)を区別するため、構築物の名称をCD::TALE-RVD(触媒ドメインをTALEドメインのN-末端に融合)又はTALE-RVD::CD(触媒ドメインをTALEドメインのC-末端に融合)と記述する(ここで、「-RVD」は、任意に、TALEドメインにより認識される配列を指称してもよく、「CD」は触媒ドメインタイプである)。本実施例で、本発明者らは、例えばAvrBs3配列を標的する(よってTALE-AvrBs3::ColE7と名付けられた)新規なTALE::ColE7構築物を説明する。特には、野生型ColE7エンドヌクレアーゼは、Im7免疫タンパク質(配列番号230)との複合体形成により阻害され得る。コンパクトTALENに関しては、Im7タンパク質は、TALE::ColE7構築物のヌクレアーゼ活性を変調する補助ドメインとして機能し得る。
(a)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(b)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択したColE7-由来触媒ドメインをN-末端又はC-末端に付着させ得るコアTALE足場sT2(配列番号135)を選択した。前記のように、sT2短縮型足場を、完全長コアTALEN足場テンプレート(pCLS7183、配列番号141)からプライマーCMP_G061(配列番号142)及びCMP_G065(配列番号143)を用いるPCRにより作製し、ベクターpCLS7865(配列番号144)中にクローニングして、pCLS7865-cTAL11_CFS1(pCLS9009、配列番号145)(ここで、CFS1はアミノ酸配列-GSSG-を指称する)を作製した(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。ColE7(配列番号140)触媒ドメインを、Kpn2I及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS9009骨格中にサブクローニングして、pCLS7865-cT11_ColE7(pCLS9939、配列番号231、配列番号435のタンパク質をコードする)を得た。この融合体は、TALE-由来DNA結合ドメインとColE7-由来触媒ドメインとを連結するジペプチド-GSSG-を含む。
AvrBs3部位を標的するためのRVD(配列番号152)をコードするDNA配列を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS9939(配列番号231)中にサブクローニングして、TALE-AvrBs3::ColE7構築物cT11Avr_ColE7(pCLS9940、配列番号232、配列番号436のタンパク質をコードする)を作製した。TALE-AvrBs3::ColE7構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
TALE-AvrBs3::ColE7構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表7)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的について構築物を試験した(配列番号224;表7)。酵母細胞におけるそれぞれの標的に対するTALE-AvrBs3::ColE7の活性レベルを図12に示す。
NptIIT5-L及びNptIIT6-L部位を標的するためのRVDをコードするDNA配列(配列番号276〜279)を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のタイプIIS制限酵素BbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS15785(配列番号285;プラスミドpCLS9939(配列番号231)のC-末端改変ColE7 K497A変異体)中にサブクローニングして、TALE::ColE7_A497構築物、それぞれcT11NptIIT5-L_ColE7_A497(pCLS15786、配列番号286)及びcT11NptIIT6-L_ColE7_A497(pCLS15787、配列番号287)を作製した。この構築物を配列決定し、TALE::ColE7_A497挿入物を標準のクローニング技法によりプラスミドpCLS14529(配列番号282)に移入して、最終のTALE-NptIIT5-L::ColE7_A497及びTALE-NptIIT6-L::ColE7_A497発現プラスミド、それぞれpCLS14584(配列番号288、配列番号437のタンパク質をコードする)及びpCLS14587(配列番号289、配列番号438のタンパク質をコードする)を作製した。プラスミドpCLS14529により、植物細胞での高レベルの構成的発現を付与するプロモーターの下流への興味対象の遺伝子配列のクローニングが可能になる。
AvrBs3-由来TALEN(配列番号196)のC末端ドメインの異なる短縮化によるバリアントを出発材料の足場として選択する。これらバリアントのサブセットは、位置E886(C0)、P897(C11)、G914(C28)、L926(C40)、D950(C64)、R1000(C115)、D1059(C172)(短縮型C末端ドメインC11〜C172のタンパク質ドメインはそれぞれ配列番号204〜209で示される)及びP1117[天然AvrBs3(配列番号220)のC末端ドメインの活性化ドメインを欠くCter wt又はWT Cter(配列番号210)とも呼ぶ]の後での短縮形を含む。AvrBs3-由来N末端ドメイン、AvrBs3-由来の反復ドメインセット及び短縮型AvrBs3-由来C末端ドメインを含むバリアント足場をコードするプラスミド[pCLS7821、pCLS7803、pCLS7807、pCLS7809、pCLS7811、pCLS7813、pCLS7817(配列番号211〜217)。これらはpCLS7184(配列番号196)をベースにする。]により、制限部位BamHI及びEagIを用いる、C末端ドメインに融合した任意の触媒ドメインのクローニングが可能になる。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
TALE-AvrBs3::ColE7構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較する。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表7)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的について構築物を試験した(配列番号224、表7)。
野生型I-CreIメガヌクレアーゼ(配列番号106)を、TALE-由来足場(N末端ドメイン、RVDから構成される中心コア及びC末端ドメインから構成)に融合させたときに新たなクラスのcTALEN(TALE::CreI)を生じる配列-特異的触媒ドメインを導くタンパク質テンプレートとして選択した。触媒ドメイン(CD)融合体の方向(N-末端 対 C-末端)を区別するため、構築物の名称をCD::TALE-RVD(触媒ドメインをTALEドメインのN-末端に融合)又はTALE-RVD::CD(触媒ドメインをTALEドメインのC-末端に融合)と記述する(ここで、「-RVD」は、任意に、TALEドメインにより認識される配列を指称してもよく、「CD」は触媒ドメインタイプである)。本実施例で、本発明者らは、例えば、TALE DNA結合ドメイン及び再遺伝子操作I-CreIドメインの両方を介してT細胞レセプターB遺伝子(TCRB遺伝子、配列番号290、図13)の配列を標的する新規なTALE::CreI-ベースの構築物を説明する。特には、TALE::CreIコンパクトTALENの特異性は、TALE DNA結合ドメイン及びI-CreI-由来触媒ドメインの両方に由来する。コンパクトTALENに関しては、このようなタンパク質は、適度な大きさのモノマー型タンパク質内で、治療適用に必須の高度特異性を提供し得る。
(a)DNA結合特異性を変化させるために異なるセットのRVDドメインを挿入し得、(b)DNA切断(又はニック生成)をもたらすために選択したI-CreI-由来触媒ドメインをN-末端又はC-末端に付着させ得るコアTALE足場sT2(配列番号135)を選択した。前記のように、sT2短縮型足場を、完全長コアTALEN足場テンプレート(pCLS7183、配列番号141)からプライマーCMP_G061(配列番号142)及びCMP_G065(配列番号143)を用いるPCRにより作製し、ベクターpCLS7865(配列番号144)中にクローニングして、pCLS7865-cTAL11_CFS1(pCLS9009、配列番号145)(ここで、CFS1はアミノ酸配列-GSSG-を指称する)を作製した(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する)。(T細胞レセプターB遺伝子(TCRB遺伝子、配列番号290、図13)中の配列を標的するように設計された)再遺伝子操作I-CreI触媒ドメインを2工程でサブクローニングした。最初に、I-CreI_NFS1(配列番号122)足場(ここで、NFS1(配列番号98)は、20アミノ酸-GSDITKSKISEKMKGQGPSG-のリンカーを含んでなる(クローニングを容易にするためのコーディングDNAに内在する制限部位BamHI及びKpn2Iを有する))を、(BamHI及びEagI制限部位を用いて)pCLS7865-cTAL11_CFS1足場に融合させてコーディング配列にインフレームでNFS1リンカーを挿入した。I-CreIメガヌクレアーゼを、その後、Kpn2I及びXhoI制限部位を用いて、遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)構築物に置換し、pCLS7865-cT11_scTB2aD01(pCLS15788、配列番号292、配列番号439のタンパク質をコードする)を得た。TCRB02-Aメガヌクレアーゼの2点変異体バリアントTCRB02-A_148C(pCLS12083、配列番号293、配列番号442のタンパク質をコードする)及びTCRB02-A_333C(pCLS12195、配列番号294、配列番号443のタンパク質をコードする)もまた、TALE結合コアに融合した触媒ドメインとしてサブクローニングして、構築物pCLS7865-cT11_scTB2aD01_148C(pCLS15789、配列番号295、配列番号440のタンパク質をコードする)及びpCLS7865-cT11_scTB2aD01_333C(pCLS15790、配列番号296、配列番号441のタンパク質をコードする)を得た。
TALEN又はメガヌクレアーゼDNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
TALE::scTB2aD01-ベースの構築物を図14に示されるハイブリッド標的TCRB02Tsp7(配列番号AC4)、TCRB02Tsp12(配列番号AC5)及びTCRB02Tsp16(配列番号AC6)に対して以前に記載され酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験した。遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)(これは、活性にTALE DNA結合部位を必要としない)と活性を比較するためにTCRB02.1単独標的を含ませた。示したTALE::scTB2aD01-ベース構築物について、酵母細胞でのそれぞれの標的に対する活性レベルを図14に示す。特に、試験したインビボ条件下で、TALE-TB2A2::scTB2aD01_148C(pCLS15794、配列番号303)構築物は、もはや、TALE DNA結合成分により認識されるDNA配列を欠く標的を切断しない。
pCLS15792(配列番号301)及びpCLS15793(配列番号302)からのTALE-TB2A2::scTB2aD01構築物及びTALE-TB2A3::scTB2aD01構築物をコードするDNAを、受容プラスミド用のAscI及びXhoI制限酵素並びにTALE::scTB2aD01-ベース挿入物用のBssHII及びXhoI制限酵素を用いてpCLS1853(配列番号193)哺乳動物発現プラスミド中にサブクローニングし、哺乳動物発現プラスミド、それぞれpCLS14894及びpCLS14895(配列番号308及び309)を得た。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての哺乳動物標的レポータープラスミドを、標準のGatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてCHOレポーターベクター中に構築した(Arnould, Chamesら,2006, Grizot, Epinatら,2010)。
タンパク質発現レベルをモニターするために、TALE::scTB2aD01-ベースの構築物を、哺乳動物細胞(HEK293)中に、遺伝子操作TCRB02-Aメガヌクレアーゼ(pCLS6857、配列番号291)のそばにトランスフェクトした。簡潔には、細胞を、300ngの各タンパク質をコードするそれぞれのプラスミドで、リポフェクタミンの存在下にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、各サンプルについて20μgの総タンパク質抽出物を、ポリクローナル抗-I-CreI抗体を用いるウェスタンブロットにより分析した。代表的なウェスタンブロットを図15に示す。
TALE::CreIコンパクトTALENの重要な新規特性は、該最終分子の「ハイブリッド」特異性を独立して操作可能であることにある。このように、本来的な活性/特異性の比を、TALE::CreI-由来構築物内で変調させることができる。このことにより、予測し得なかった、高いDNA切断活性を保持する特異的なターゲティングが可能になる。最も単純な形態において、TALE DNA結合ドメインの再ターゲティングの成功は、基本のDNA塩基との擬似1対1対応性を有するRVD暗号(図3)により達成される。しかし、I-CreI成分の遺伝子操作は、適切なDNA結合及び切断活性に必要なタンパク質-DNA接触の潜在的対応性が存在するので、より難題である。新規なDNA配列を標的するようにI-CreIメガヌクレアーゼを成功裡に遺伝子再操作する方法は記載されている(WO2006097854、WO2008093249、WO03078619、WO2009095793、WO 2007/049095、WO 2007/057781、WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495、WO 2007/049156及びWO 2004/067736)。これら方法の幾つかはクラスター化アプローチに依拠するので、当該アプローチを用いれば、I-CreI成分の「絶対的」特異性は段階的に減少すると考えられる。例えば、I-CreI DNA相互作用面を不連続な10NNN、7NN、5NNN及び2NN領域(モノマーサブユニットハーフあたり)に分断することで、外側の10NNN-7NN領域中での「緩い」又は広い特異性と引き換えに中央の5NNN-2NN領域中での高特異性が維持される新規な遺伝子操作が可能になる。本質的には、コンパクトTALENに関しては、このようなアプローチは、I-CreI-由来足場を再遺伝子操作することの複雑性を減じ得る。なぜなら、触媒ドメインについては切断における「選択性」のみが必要とされ、特異性はタンパク質融合体のTALE DNA結合部分により提供されるからである。まとめると、潜在的に高い特異性及び高いDNA切断活性と組み合わされた遺伝子操作の容易性は、TALE::CreI-由来コンパクトTALENを治療応用の理想的なツールとする。最後に、I-CreI成分は、原理上、天然に存在するか又は再遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ-由来の触媒ドメインの宿主と置換し得ることに留意すべきである。
酵母でのTALE::SnaseSTAUUの活性
AvrBs3-由来TALEN(配列番号196)のC末端ドメインの異なる短縮化によるバリアントを出発材料の足場として選択する。これらバリアントのサブセットは、位置G914(C28)及びL926(C40)(短縮型C末端ドメインC28及びC40のタンパク質ドメインをそれぞれ配列番号205及び206に示す)の後での短縮形を含む。AvrBs3-由来N末端ドメイン、AvrBs3-由来の反復ドメインセット及び短縮型AvrBs3-由来C末端ドメインを含むバリアント足場をコードするプラスミド[pCLS7807及びpCLS7809(配列番号213及び214)。これらはpCLS7184(配列番号196)をベースにする。]により、制限部位BamHI及びEagIを用いる、C末端ドメインに融合した任意の触媒ドメインのクローニングが可能になる。
SnaseSTAAU(配列番号30)のアミノ酸残基83〜231に対応するDNAを、TALEのC末端ドメインとSnaseSTAAU触媒ドメインとの間に、DNAレベルでBamHI制限部位(コーディング鎖の5'側)及びEagI制限部位(コーディング鎖の3'側)を、タンパク質レベルでリンカー(例えば、-SGGSGS-ストレッチ、配列番号219)を導入するようにPCRにより増幅する。最終のTALE::SnaseSTAAU構築物は、BamHI及びEagI並びに標準の分子生物学的手順を用いて足場バリアント中へのSnaseSTAAU触媒ドメインの挿入により作製する。位置G914(C28)及びL926(C40)の後で短縮化され、それぞれpCLS7807及びpCLS7809(配列番号213及び214)によりコードされる足場バリアントをSnaseSTAAU触媒ドメイン(配列番号30)に融合させて、pCLS9082及びpCLS9081(配列番号370及び371)を導いた。クローニング工程はまた、アミノ酸レベルで、SnaseSTAAU触媒ドメインのC末端にAAD配列をもたらす。
TALE-AvrBs3::SnaseSTAAU構築物を偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALENと比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表7)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的(配列番号224)についてTALE-AvrBs3::SnaseSTAAU構築物を試験した。図19に要約したデータは、本発明のキメラタンパク質によるTALE-AvrBs3::SnaseSTAAU構築物が2つのAvrBs3認識部位を有する標的に対しても、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的についても活性であることを示す。
基本cTALENは、単一の触媒ドメインに融合した単一のDNA結合ドメインから構成され、単一の二本鎖DNA切断又は一本鎖ニック生成事象によりHRを刺激するように設計される。或る種の適用(例えば、遺伝子不活化)には、NHEJのレベルを亢進させることが好ましい。この例は、TALE DNA結合ドメインに隣接する2つの別個の部位で二本鎖DNAの切断をもたらし得る二重切断cTALEN(dcTALEN)の作製を説明する(図5C)。当該2つの部位でのDNAの同時切断は、介在配列を除去し、したがってNHEJによる「瘢痕なしの」再ライゲーションを止めると予測される(図1)。
実施例3に記載したベースラインの足場(配列番号136〜配列番号139)を、融合体デザインの出発点として使用する。TALE DNA結合ドメインとの融合に適する触媒ドメインの非限定的リストを表2に示す。使用可能なリンカーの非限定的リストを表3に示す。リンカー又は増強ドメインの選択に関する追加の詳細については、実施例3、5、6及び7を参照。dcTALENデザインについては、少なくとも1つのクリベースドメインをTALE DNA結合ドメインに融合させる(N-末端又はC-末端)。追加の触媒ドメインは、ニッカーゼ又はクリベース(エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ)ドメインであり得、適用の性質に依存する。例えば、一方の側のクリベースドメインと他方の側のニッカーゼドメインとのカップリングは、TALE DNA結合領域を跨ぐDNAの一本鎖の切除を生じ得る。延長された一本鎖オーバーハングの標的付けられた生成は、DNA修復機構を標的する応用において適用され得る。標的付けられた遺伝子不活化には、dcTALENにおける2つのクリベースドメインの使用が好ましい。
全てのdcTALENデザインは、本発明者らの酵母アッセイを用いて評価され(実施例1を参照)、既存の遺伝子操作メガヌクレアーゼに匹敵する検出可能な活性を提供する。更に、NHEJにおける増強の可能性は、実施例3に記載したような哺乳動物細胞ベースアッセイを用いて、モニターする。
二重切断TALEN(CD::TALE::CD)(N-末端I-TevI-由来触媒ドメイン及びFokI(配列番号:368)又はI-TevI(配列番号20)に由来するC-末端触媒ドメインを有する)を、ベースラインのbT2-Avr(配列番号137)足場に作製した。I-TevIの触媒ドメインフラグメントをプラスミドpCLS12731(配列番号236)から切り出し、NcoI及びNsiI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりベクターpCLS15795(配列番号351)及びpCLS9013(配列番号153)中にサブクローニングして、それぞれTevD02_cT11Avr_FokI-L(pCLS15796、配列番号352、配列番号447のタンパク質をコードする)及びTevD02_cT11Avr_TevD02(pCLS15797、配列番号353、配列番号448のタンパク質をコードする)を得た。全ての構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTevI::TALE-AvrBs3::FokI及びTevI::TALE-AvrBs3::TevI酵母発現プラスミド、pCLS13299(配列番号354、配列番号449のタンパク質をコードする)及びpCLS13301(配列番号355、配列番号450のタンパク質をコードする)を、それぞれプラスミドpCLS15796(配列番号352)及びpCLS15797(配列番号353)を用いる酵母インビボクローニングにより作製した。インビボ相同組換えによりインタクトなコーディング配列を作製するために、BssHIIでの消化により線状化した約40ngの各プラスミドとNcoI及びEagIでの消化により線状化した1ngのpCLS0542(配列番号156)プラスミドDNAとを使用して、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら,2007)で酵母S. cerevisiae株FYC2-6Aを形質転換させた(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)。
TevI::TALE-AvrBs3::FokI構築物及びTevI::TALE-AvrBs3::TevI構築物を、偽パリンドローム標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表6)。加えて、唯一のAvrBs3又はRagT2-R認識部位(配列番号238)を有する標的について構築物を試験した(表11)。適切な標的に対する酵母でのTevI::TALE-AvrBs3::FokI及びTevI::TALE-AvrBs3::TevIの活性レベルは、N-末端I-TevI-由来触媒ドメインを欠く親分子のものに匹敵した。サンプルの単一部位標的についての本発明のdcTALENによる有意な活性を表11に示す。
二重切断TALEN(CD::TALE::CD)(N-末端scTrex2-由来触媒ドメイン及びFokIに由来するC-末端触媒ドメインを有する)を、ベースラインのbT2-Avr(配列番号137)足場に作製した。scTrex2の触媒ドメインフラグメントをプラスミドpCLS15798(配列番号356、配列番号451のタンパク質をコードする)から切り出し、NcoI及びNsiI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりベクターpCLS15795(配列番号351)中にサブクローニングして、scTrex2_cT11Avr_FokI-L(pCLS15799、配列番号357、配列番号452のタンパク質をコードする)を得た。この構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
pCLS15795(配列番号351)又はpCLS15799(配列番号357)に由来するそれぞれTALE-AvrBs3::FokI又はscTrex2::TALE-AvrBs3::FokI構築物をコードするDNAを、受容プラスミド用のAscI及びXhoI制限酵素及び挿入物用のBssHII及びXhoI制限酵素を用いてpCLS1853(配列番号193)哺乳動物発現プラスミド中にサブクローニングして、それぞれ哺乳動物発現プラスミドpCLS14972及びpCLS14971(配列番号358及び359)を得た。
このアッセイのために、CHO K1細胞を、96-ウェルプレートフォーマットにおいて、75ngの標的ベクター及び0.7〜25ngの漸増量の各バリアントDNAで、PolyFect試薬(1μL/ウェル)の存在下にトランスフェクトした。トランスフェクトDNAの全量を、空ベクターを用いて125ngとした(標的DNA、バリアントDNA、キャリアDNA)。トランスフェクションの72時間後、培養培地を除去し、150μlのβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイ用溶解/顕色緩衝液を加えた。37℃でのインキュベーション後、光学密度を420nmにて測定した。全プロセスは、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行う(Grizot, Epinatら,2009)。
scTrex2::TALE-AvrBs3::FokI構築物についての哺乳動物細胞での適切な標的に対する活性レベルは、親TALE-AvrBs3::FokI分子のものに匹敵した。このことは、余分なscTrex2成分がTALEN DNA切断機能を害さないことを示す。scTrex2機能の評価はNHEJ事象の検出に適切なアッセイで行う。
cTALEN足場のためのベースラインデザインは、確立されたTALE DNA結合ドメインをベースにする。コンパクトTALENは、できる限り小さく効率的であるように設計する。したがって、この目的を達成するため、コンパクトTALE DNA結合ドメインと種々の触媒ドメインとの間の機能的ギャップの橋渡しをする「エンハンサー」ドメインを組み入れる必要があり得る。図6(A〜E)は、そのようなエンハンサードメインが適用され得る種々の非限定的構成を説明する。この図は例示に過ぎず、N-末端 対 C-末端のバリエーションが示されていることに留意すべきである(すなわち、図6Aはまた、N-末端エンハンサードメイン及びC-末端触媒ドメインを有し得る)。表1及び2は、DNA結合(特異的及び非特異的接触)を支援し得る可能なエンハンサードメインを列挙する。
増強TALEN(eTALEN)は、実施例3の機能的cTALENを用いて作製する。エンハンサードメインの付加は、本発明者らの酵母アッセイで評価する(実施例1を参照)。出発材料のcTALENの効率の最低限5%増強、より好ましくは最低限10%増強、より好ましくは20%、より好ましくは30%、より好ましくは40%、より好ましくは50%、またより好ましくは50%を超える増強を提供する場合、特定のエンハンサードメインを有用であると判断する。
増強TALEN(TALE::CD::TALE)(中央のDNA切断ドメインに隣接するN-末端及びC-末端のTALE DNA結合ドメインを有する)を、sT2(配列番号135)コア足場を用いて作製した。このクラスのコンパクトTALENのレイアウトを図6Bに示す(ここで、N-末端「エンハンサードメイン」はそれ自体がTALE DNA結合ドメインである)。ColE7触媒ドメインの点変異体誘導体(pCLS15785、配列番号285)を、eTALENの触媒コア用に選択した。2つの最終構築物TALE-AvrBs3::ColE7_A497::TALE-RagT2-R(pCLS15800、配列番号360、配列番号453のタンパク質をコードする)及びTALE-RagT2-R::ColE7_A497::TALE-AvrBs3(pCLS15801、配列番号361、配列番号454のタンパク質をコードする)を、テンプレートとしてsT2(配列番号135)、pCLS15785(配列番号285)、AvrBs3(配列番号152)及びRagT2-R(配列番号271)のDNA配列を用いる標準の分子クローニング技法を使用して得た。全てのTALE::CD::TALE構築物を配列決定し、必要に応じて、挿入物を追加のベクターに移した(下記参照)。
最終のTALE::CD::TALE-ベースの酵母発現プラスミド、pCLS12106(配列番号362)及びpCLS12110(配列番号363)を、NcoI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションにより作製して、pCLS0542(配列番号156)プラスミド中にサブクローニングした。酵母S. cerevisiae株FYC2-6A(MATα、trp1Δ63、leu2Δ1、his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Arnouldら,2007)で形質転換させた。
TALE::CD::TALE構築物を非対称AvrBs3/RagT2-Rハイブリッド標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、活性を、親コンパクトTALEN(例えば、pCLS8589、配列番号233)(これは、単一の結合部位を有する標的に対して活性を有する)と比較する。加えて、唯一のAvrBs3又はRagT2-R認識部位を有する標的に対して構築物を試験する。
今日まで、公知の全てのTALエフェクター及びその誘導体は、認識配列中の-1位にT塩基を必要とするようである(図3)。この制限を克服するため、エンハンサードメインを使用して、TALEタンパク質のN-末端領域を置き換える。bT2-誘導体のN-末端TALE領域の配列及び構造に基づく相同性モデリングにより、3つの可能な候補タンパク質を得た(表1):(i)C.elegansに由来するFem-3結合性因子、配列番号4(FBF1、PufファミリーのRNA結合タンパク質);(ii)人工α-らせん形反復タンパク質(αRep)、配列番号5;及び(iii)アンキリンスーパーファミリーのタンパク質。二次構造エレメントの内容及び配置(arrangement)により、TALEタンパク質のN-末端領域に置き換わるエンハンサードメインの出発点としてのこれらモデルの使用が可能になる。
第1の正準(canonical)反復ドメインまでのN-末端TALEタンパク質領域を置き換えるために上記3つの候補の1つからの類似領域を用いて、キメラタンパク質を構築する。指針として相同性モデルを用いてコンピュータで新たな界面を再設計する。このアプローチは、標的配列の-1位に必須のTに対する特異性の決定要因を突き止めるために使用することができる。置換要員たるエンハンサードメインは、最低限、cTALENタンパク質に構造的一体性を提供すべきである。構築物を本発明者らの酵母アッセイで評価する(実施例1を参照)。標的の-1位でのTの不存在下で、出発材料のcTALENの活性の最低限5%の保持、より好ましくは最低限10%の保持、より好ましくは20%、より好ましくは30%、より好ましくは40%、より好ましくは50%、またより好ましくは50%を超える活性の保持を提供する場合に、特定のエンハンサードメインを有用であると判断する。
cTALEN用のより適切でコンパクトな足場を作製するために、TALEタンパク質の(最終ハーフ-反復ドメインを超える)C-末端領域の性質を分析した。bT2-誘導体のC-末端TALE領域の配列及び構造に基づく相同性モデリングにより、3つの可能な候補タンパク質を得た(表1):(i)Pseudomonas Aeuriginosaのヒドロラーゼ/トランスフェラーゼ、配列番号6;(ii)Mycobacterium tuberculosisリガーゼD由来のポリメラーゼドメイン、配列番号7;(iii)Pyrococcus由来の開始因子eIF2、配列番号8;(iv)翻訳開始因子Aif2βγ、配列番号9。実施例6のように、可能なC-末端短縮形の作製用の領域を突き止めるために相同性モデルを使用する;可能性のある短縮位置としては、最後のハーフ-反復ドメインを超えて残存する28、40、64、118、136、169、190残基が挙げられる。追加的に、C末端ドメイン全体を置き換えるために上記タンパク質からの相同領域を使用し得る。タンパク質の一次配列から出発して、3D空間中で近位である可能性が高い残基対を同定するために、接触予測プログラムを使用し得る。このようなキメラタンパク質は、cTALENを構築するためのより安定な足場を提供すべきである。
構築物を本発明者らの酵母アッセイで評価する(実施例1を参照)。出発材料のcTALENの活性の最低限5%の保持、より好ましくは最低限10%の保持、より好ましくは20%、より好ましくは30%、より好ましくは40%、より好ましくは50%、またより好ましくは50%を超える活性の保持を提供する場合に、特定のエンハンサードメインを有用であると判断する。
代替の活性を有するコンパクトTALENを作製するため、(a)分離可能な活性を有する触媒ドメインを使用することにより(図7A、B);又は(b)補助的活性を提供する(図7C)ことにより、トランスcTALENをTALE-融合体として作製する。クラスIIIの配列及び構造に基づくモデリング(Chan, Stoddardら,2011)。TypeIIS制限エンドヌクレアーゼ(REase)を用いてトランスTALENを作製した(非制限的リストについては表2を参照)。当初のトランスTALENは、実施例3及び4に記載のように、独立して活性な触媒ドメイン(例えばNt.BspD6Iニッカーゼ)の融合により作製する。原理上は、このトランスTALENは、適用に応じてそのままで使用することもできる。cTALENを機能的トランスTALENに変換するために、補助ドメイン(この場合、ss.BspD6I)をトランスで提供する(図8A)。このような随意にトランスの及び/又はヘテロダイマー型タンパク質は、所与の適用に対して変調され得る活性を有するcTALEN足場を可能にする。
構築物を本発明者らの酵母アッセイで評価する(実施例1を参照)。出発材料のcTALENの活性に代替する活性を提供する場合に、特定の補助ドメインを有用と判断する。
使用する補助ドメインは、当初のcTALEN(すなわち、非-トランスTALEN形態)とは独立した活性を示す場合には、特異的ターゲッティング用のTALEドメインに融合させることもできる(図7B)。補助ドメインはまた、cTALENに関連しない機能を提供する標的付けられた実体としてトランスで提供され得る(図7C)。
実施例3c及び3dで記載したように、NucA(配列番号26)及びColE7(配列番号140)は共に、それぞれの阻害タンパク質NuiA(配列番号229)及びIm7(配列番号230)との複合体形成により阻害され得る。コリシン-E9(配列番号366)は、阻害剤Im9(配列番号369)により阻害され得るタンパク質の別の1つの非限定例である。NucA又はColE7触媒ドメインに由来するTALEN(TALE::NucA又はTALE::ColE7)に関して、阻害剤は、DNA切断を妨げることにより活性を変調する補助ドメインとして役立つ(図7A)。
Im7(配列番号230)及びNuiA(配列番号229)阻害タンパク質を、NcoI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS7763骨格(配列番号241)中にサブクローニングして、それぞれpCLS9922(配列番号242)及びpCLS9923(配列番号243)を得た。次いで、これらプラスミドを、同時形質転換実験において以前に記載された標準酵母SSAアッセイで使用した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
TALE-AvrBs3::NucA(pCLS9924、配列番号223)構築物及びTALE-AvrBs3::ColE7(pCLS8589、配列番号233)構築物を偽パリンドローム標的に対して酵母SSAアッセイで試験して、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALEN(pCLS8590、配列番号244)と比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号157〜192、表7)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的について構築物を試験した(配列番号224、表7)。TALENの活性変調を、特異的又は非特異的阻害タンパク質の存在下又は不在下に、コントロールとしてTALE-AvrBs3::FokI TALENを用いて評価した。
表12に要約したデータは、本発明によるTALE-AvrBs3::NucA及びTALE-AvrBs3::ColE7構築物が、それぞれの阻害タンパク質NuiA及びIm7の存在により、特異的に不活化されることを示す。
実施例3bは、TevI::TALEが支援なしでコンパクトTALEN(pCLS8522、配列番号237)として機能することを説明する。活性を更に増強するため、図7Cに示したレイアウトでTALE::TevI構築物を用いてトランスTALENを設計した。RagT2-R部位を標的するためのRVDをコードするDNA配列(配列番号271)を、受容プラスミド用のタイプIIS制限酵素BsmBI並びに挿入RVD配列用のBbvI及びSfaNIを用いてプラスミドpCLS7865-cT11_TevD02(pCLS9011、配列番号151)中にサブクローニングして、TALE-RagT2-R::TevI構築物cT11RagT2-R_TevD02(pCLS15802、配列番号364)を作製した。この構築物を配列決定し、挿入物を、NcoI及びEagI制限部位を用いる制限及びライゲーションによりpCLS7763骨格(配列番号241)中にサブクローニングして、pCLS8990(配列番号365)を得た。次いで、プラスミド対pCLS8522(配列番号237)及びpCLS7763(配列番号241)又はpCLS8522(配列番号237)及びpCLS8990(配列番号365)を、同時形質転換実験において以前に記載された標準酵母SSAアッセイで使用した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。
TALEN DNA標的配列を含有する全ての酵母標的レポータープラスミドを、以前に記載されたように構築した(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)。TALE-RagT2-R::TevI/TevI::TALE-AvrBs3構築物対を非対称RagT2-R/AvrBs3ハイブリッド標的に対して以前に記載された酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)で試験して、その活性を、1つの結合部位を有する標的に対して活性を有する親コンパクトTALEN(例えば、pCLS8522、配列番号237)と比較した。RagT2-R/AvrBs3ハイブリッド標的は、第1のもの(RagT2-R)の3'端部を第2のもの(AvrBs3)の5'端部に近位で並置され5〜40bpの範囲の「スペーサー」DNAで分離された2つの異なる認識配列を含有する(配列番号G064〜G099、表13)。図18は、本発明のトランスcTALENによるTALE-RagT2-R::TevI構築物により提供されたTevI::TALE-AvrBs3活性における変調を説明する。
本発明者らは、37の異なるリンカーの最初のライブラリを作製した。これらの多くは、3〜28アミノ酸残基をコードする可変領域を含んでなり、5'端及び3'端の両方でSGGSGSストレッチ(配列番号219)をコードする領域が隣接する共通構造を有する(配列番号372〜408)。これらリンカーは、5'及び3'端にそれぞれXmaI及びBamHI制限部位を含有する。次いで、このリンカーライブラリを、XmaI及びBamHI制限部位でpCLS7183(配列番号141)にサブクローニングして、AvrBs3-由来TALEN(pCLS7184、配列番号196)のC末端ドメインを置き換える。AvrBs3-由来の反復ドメイン(RVD)セット又は末端ハーフRVDを有するか若しくは欠く任意の他のRVD配列をこの骨格ライブラリにクローニングする。ペトリ皿からコロニーを擦り取った後、標準のミニプレップ技法を用いてこのライブラリからDNAを得る。FokI触媒性頭部をBamHI及びEagI制限酵素を用いて除去し、残る骨格を標準的なゲル抽出技法を用いて精製する。
ColE7触媒ドメイン(配列番号11)をコードする配列を、C末端ドメインライブラリと触媒性頭部との間に、DNAレベルでBamHI制限部位(コーディング鎖の5'側)及びEagI制限部位(コーディング鎖の3'側)を、タンパク質レベルでリンカー(例えば、-SGGSGS-ストレッチ、配列番号219)を導入するようにPCRにより増幅させた。BamHI及びEagI消化及び精製の後、異なる触媒性頭部をコードするDNAを、個々に、事前に作製したライブラリ足場中にサブクローニングした。
ペトリ皿からコロニーを擦り取った後、標準のミニプレップ技法を用いて最終ライブラリからDNAを得る。得られたライブラリを偽パリンドローム標的に対して以前に記載した本発明者らの酵母SSAアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら,2003;Chames, Epinatら,2005;Arnould, Chamesら,2006;Smith, Grizotら,2006)でスクリーニングして、活性を、その活性に2つの結合部位を必要とする標準のTALE-AvrBs3::FokI TALENと比較した。AvrBs3標的は、3'端部同士を近位に並置され15、18、21及び24bpを含む「スペーサー」DNAで分離された2つの同一認識配列を含有する(配列番号167、170、173及び176、表7)。加えて、唯一のAvrBs3認識部位を有する標的(配列番号224)について構築物(配列番号416〜419)を試験した。図20に要約したデータは、ColE7構築物の一部のリンカー配列が、2つのAvrBs3認識部位又は唯一のAvrBs3認識部位を有する標的に対して活性であることを示す。
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Claims (77)
- (a)興味対象の1つのDNA標的配列を二本鎖DNAの一方の鎖上で選択し;
(b)下記:
(i)前記興味対象のDNA標的配列に対するDNA結合特異性を有する反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなる1つのコアTALE足場;
(ii)(i)のコアTALE足場のC末端及び/又はN末端に融合されたとき前記興味対象のDNA標的配列から数塩基対離れたDNAをプロセシングし得る少なくとも1つの触媒ドメイン;
(iii)任意に、必要な場合に(ii)の触媒ドメインを(i)のコアTALE足場に融合させるための1つのペプチド性リンカー
を含んでなり、二量体化を要することなく、前記二本鎖DNAに結合してプロセシングするように組み立てられている独特なコンパクトTALENモノマーを提供し;
(c)前記二本鎖DNAを前記独特なモノマーと、該二本鎖が前記一本鎖標的配列から3'及び/又は5'方向に数塩基対離れた場所でプロセシングされるように接触させる
ことを含んでなる、二本鎖DNAを標的してプロセシングする方法。 - 前記触媒ドメインが前記二本鎖DNAに対する切断活性を有する請求項1に記載の方法。
- 前記触媒ドメインが前記コアTALE足場のC末端ドメインに融合されている請求項1に記載の方法。
- 前記触媒ドメインが前記コアTALE足場のN末端ドメインに融合されている求項1に記載の方法。
- 1つの触媒ドメインが前記コアTALE足場のC末端ドメインに融合され、別の1つの触媒ドメインがN末端ドメインに融合されている請求項1に記載の方法。
- 前記触媒ドメインが表2に列挙されたタンパク質又はその機能的変異体からなる群より選択される請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記触媒ドメインがI-TevI(配列番号20)又はその機能的変異体である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- I-TevI(配列番号20)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のN末端ドメインに融合されている請求項7に記載の方法。
- 配列番号426〜432の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項8に記載の方法。
- 前記触媒ドメインがColE7(配列番号11)又はその機能的変異体である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ColE7(配列番号11)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のC末端部に融合されている請求項10に記載の方法。
- ColE7(配列番号11)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のN末端部に融合されている請求項10に記載の方法。
- 配列番号435〜438の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項11に記載の方法。
- 前記触媒ドメインがNucA(配列番号26)又はその機能的変異体である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- NucA(配列番号26)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のC末端部に融合されている請求項14に記載の方法。
- NucA(配列番号26)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のN末端部に融合されている請求項14に記載の方法。
- 配列番号433〜434の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項15に記載の方法。
- 前記触媒ドメインがI-CreI(配列番号1)又はその機能的変異体である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- I-CreI(配列番号1)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のC末端部に融合されている請求項18に記載の方法。
- I-CreI(配列番号1)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のN末端部に融合されている請求項18に記載の方法。
- 配列番号439〜441及び配列番号444〜446の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項19に記載の方法。
- 前記コアTALE足場が配列番号134及び配列番号135からなる群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コアTALE足場が配列番号136〜配列番号139からなる群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記独特なコンパクトTALENモノマーが下記:
(i)少なくとも1つのエンハンサードメイン;
(ii)任意に、前記エンハンサードメインを前記独特なコンパクトTALENモノマー活性実体の1つの部分に融合させるための1つのペプチドリンカー
を更に含んでなる請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ペプチド性リンカー配列が配列番号67〜104及び配列番号372〜配列番号415からなる群より選択され得る請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記独特なコンパクトTALENモノマーが、前記コアTALE足場のC末端部及びN末端部にそれぞれ融合された2つの触媒ドメインの組合せを含んでなり、下記:
(i)N末端のNuc Aドメイン(配列番号26)及びC末端のNuc Aドメイン(配列番号26);
(ii)N末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11);
(iii)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11);
(iv)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のNucAドメイン(配列番号26);
(v)N末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びC末端のNucAドメイン(配列番号26);
(vi)N末端のNucAドメイン(配列番号26)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11)
からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。 - 配列番号448及び450からなる群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項29に記載の方法。
- 前記独特なコンパクトTALENモノマーが、前記コアTALE足場のC末端部及びN末端部にそれぞれ融合された2つの触媒ドメインの組合せを含んでなり、下記:
(i)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のFokIドメイン(配列番号368);
(ii)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のTevIドメイン(配列番号20);
(iii)N末端のscTrex2ドメイン(配列番号451)及びC末端のFokIドメイン(配列番号368)
からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。 - 配列番号447〜450及び配列番号452からなる群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項28に記載の方法。
- 下記:
(i)興味対象の特異的二本鎖DNA標的配列に対するDNA結合特異性を有する反復可変ジペプチド領域(RVD)を含んでなる1つのコアTALE足場;
(ii)(i)のコアTALE足場のC末端及び/又はN末端に融合されたとき前記興味対象の二本鎖DNA標的配列から数塩基対離れたDNAをプロセシングし得る少なくとも1つの触媒ドメイン;
(iii)任意に、必要な場合に(ii)の触媒ドメインを(i)の遺伝子操作コアTALE足場に融合させるための1つのペプチド性リンカー
を含んでなり、二量体化を要することなく、前記標的DNAに結合して二本鎖DNAをプロセシングするように組み立てられている独特なコンパクトTALENモノマー。 - 前記触媒ドメインが二本鎖DNAに対する切断活性を有する請求項30に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記触媒ドメインが前記コアTALE足場のC末端ドメインに融合されている請求項30に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記触媒ドメインが前記コアTALE足場のN末端ドメインに融合されている請求項30に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 1つの触媒ドメインが前記コアTALE足場のC末端ドメインに融合され、別の1つの触媒ドメインがN末端ドメインに融合されている請求項30に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記触媒ドメインが表2に列挙されたタンパク質又はその機能的変異体からなる群より選択される請求項30〜34のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記触媒ドメインがI-TevI(配列番号20)又はその機能的変異体である請求項30〜34のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。
- I-TevI(配列番号20)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のN末端ドメインに融合されている請求項36に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 配列番号426〜432の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項37に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記触媒ドメインがColE7(配列番号11)又はその機能的変異体である請求項30〜34のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。
- ColE7(配列番号11)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のC末端部に融合されている請求項39に記載のコンパクトTALENモノマー。
- ColE7(配列番号11)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のN末端部に融合されている請求項39に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 配列番号435〜438の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項40に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記触媒ドメインがNucA(配列番号26)又はその機能的変異体である請求項30〜34のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。
- NucA(配列番号26)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のC末端部に融合されている請求項43に記載のコンパクトTALENモノマー。
- NucA(配列番号26)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のN末端部に融合されている請求項43に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 配列番号433〜434の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項44に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記触媒ドメインがI-CreI(配列番号1)又はその機能的変異体である請求項30〜34のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。
- I-CreI(配列番号1)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のC末端部に融合されている請求項47に記載のコンパクトTALENモノマー。
- I-CreI(配列番号1)又はその機能的変異体が前記コアTALE足場のN末端部に融合されている請求項47に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 配列番号444〜446の群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項48に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記コアTALE足場が配列番号134及び配列番号135からなる群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項30〜50のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記コアTALE足場が配列番号136〜配列番号139からなる群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項30〜51のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。
- 前記独特なコンパクトTALENモノマーが下記:
(i)少なくとも1つのエンハンサードメイン;
(ii)任意に、前記エンハンサードメインを前記独特なコンパクトTALENモノマー活性実体の1つの部分に融合させる1つのペプチドリンカー
を更に含んでなる請求項30〜52のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。 - 前記ペプチド性リンカー配列が配列番号67〜104及び配列番号372〜配列番号415からなる群より選択され得る請求項30〜56のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー。
- それぞれ前記コアTALE足場のC末端部及びN末端部に融合された2つの触媒ドメインの組合せを含んでなり、下記:
(i)N末端のNuc Aドメイン(配列番号26)及びC末端のNuc Aドメイン(配列番号26);
(ii)N末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11);
(iii)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11);
(iv)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のNucAドメイン(配列番号26);
(v)N末端のColE7ドメイン(配列番号11)及びC末端のNucAドメイン(配列番号26);
(vi)N末端のNucAドメイン(配列番号26)及びC末端のColE7ドメイン(配列番号11)
からなる群より選択される請求項34に記載のコンパクトTALENモノマー。 - 配列番号448及び450からなる群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項55に記載のコンパクトTALENモノマー。
- それぞれ前記コアTALE足場のC末端部及びN末端部に融合された2つの触媒ドメインの組合せを含んでなり、下記:
(i)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のFokIドメイン(配列番号368);
(ii)N末端のTevIドメイン(配列番号20)及びC末端のTevIドメイン(配列番号20);
(iii)N末端のscTrex2ドメイン(配列番号451)及びC末端のFokIドメイン(配列番号368)
からなる群より選択される請求項に37記載のコンパクトTALENモノマー。 - 配列番号447〜450及び配列番号452からなる群より選択されるタンパク質配列と、少なくとも80%、より好ましくは90%、またより好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質配列を含んでなる請求項63に記載の方法。
- 請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENをコードする組換えポリヌクレオチド。
- 請求項59に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
- 請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENとキャリアとを含んでなる組成物。
- 請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENと医薬的に活性なキャリアとを含んでなる医薬組成物。
- 請求項59に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
- 請求項59に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなる非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項60に記載のベクターを含んでなる非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項59に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物。
- 請求項60に記載のベクターを含んでなるトランスジェニック植物。
- 請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマー及び興味対象の単一の二本鎖DNA標的配列のDNAプロセシング効率を増大させることに使用するための指示書を含んでなるキット。
- 少なくとも1つの触媒ドメインがクリベース活性を有する請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマーを含んでなる、標的とする相同組換えを増加させる方法。
- 少なくとも1つの触媒ドメインがニッカーゼ活性を有する請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマーを含んでなる、非相同末端結合を減少させ標的とする相同組換えを増加させる方法。
- (i)少なくとも1つの触媒ドメインがクリベース活性を有し;
(ii)少なくとも1つの触媒ドメインがニッカーゼ活性を有する
請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマーの結合領域を跨ぐDNAの一本鎖の切除を増加させる方法。 - 必要とする対象に、有効量の請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALEN又はそのバリアントを投与することを含んでなる、遺伝子の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列における変異によって引き起こされる遺伝子疾患の治療方法。
- 細胞、組織又は非ヒト動物の遺伝子座の特異的な単一の二本鎖DNA標的配列中に導入遺伝子を挿入する方法であって、少なくとも1つの請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマーが前記細胞、組織又は非ヒト動物に導入される方法。
- 細胞中で発現させたときに請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマーの活性を変調させる方法であって、前記コンパクトTALENの活性を変調させる補助ドメインを前記細胞に導入する工程を含んでなる方法。
- 請求項30〜58のいずれか1項に記載のコンパクトTALENモノマーの活性を阻害するための請求項74に記載の方法。
- 前記コンパクトTALENモノマーの触媒ドメインがNucA(配列番号26)であり、前記補助ドメインがNuiA(配列番号229)又はその機能的変異体である請求項74に記載の方法。
- 前記コンパクトTALENモノマーの触媒ドメインがColE7(配列番号11)であり、前記補助ドメインがIm7(配列番号230)又はその機能的変異体である請求項74に記載の方法。
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