FR3008106A1 - Methode d'induction d'une recombinaison meiotique ciblee - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un procédé pour induire une recombinaison méiotique ciblée dans une cellule-hôte eucaryote, par co-expression dans ladite cellule d'une première protéine chimérique ME comprenant un domaine effecteur DE capable d'induire la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique et un domaine d'interaction DI1 constitué par le premier partenaire d'un couple d'affinité sélective protéine-protéine, et d'une seconde protéine chimérique comprenant un domaine d'interaction DI2 constitué par le second partenaire dudit couple d'affinité sélective protéine-protéine et un domaine de ciblage DC capable de se lier sélectivement à une séquence cible présente dans l'ADN de ladite cellule-hôte. L'interaction protéine-protéine entre les domaines DI1 et DI2 permet la formation d'un complexe non-covalent entre le module ME et le module MC, et l'induction de cassures double brin par le domaine effecteur DE à proximité de la séquence ciblée par le domaine de ciblage DC.

Description

MÉTHODE D'INDUCTION D'UNE RECOMBINAISON MÉIOTIQUE CIBLÉE La présente invention est relative à une méthode pour induire une recombinaison méiotique ciblée, et aux moyens de mise en oeuvre de cette méthode. La recombinaison méiotique est un échange d'ADN entre chromosomes homologues au cours de la méiose ; elle est initiée par la formation de cassures double-brin (CDBs) dans l'une ou l'autre des chromatides homologues, suivie de la réparation de ces cassures, utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue.

Les CDBs qui initient la recombinaison méiotique sont catalysées par la protéine Spoll, qui est apparentée à la sous-unité catalytique (A) d'une topo-isomérase de type II (TopoVI) présente chez les archaebactéries (BERGERAT et al., Nature, 386, 414-7, 1997; KEENEY et al., Cell, 88, 375-84, 1997). Spoll est active sous forme d'un dimère formé de 2 sous-unités Spoll, dont chacune clive un brin de l'ADN. Bien que l'activité de Spoll soit essentielle, la formation des CDBs nécessite également la présence d'autres partenaires (KEENEY, Genome Dyn Stab, 2, 81-123, 2008; KEENEY & NEALE, Biochem Soc Trans, 34, 523-5, 2006). Chez la levure S. cerevisiae, il s'agit notamment des protéines Ski8, Rec102, Rec104, Rec114, Mer2, Mei4, Mrell, Rad50, et Xrs2. Spoll est très conservée, et des homologues de cette protéine ont été trouvés chez tous les eucaryotes. Des homologues fonctionnels des partenaires de Spoll ont également été identifiés, aussi bien dans le règne animal que dans le règne végétal (COLE et al., Genes Dev, 24, 1201-7, 2010). Par exemple, chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, outre les deux paralogues de Spoll (Spoll-1 et Spoll-2, qui forment un hétérodimère Spoll-1/Spoll-2), les protéines Prdl, Prd2, Prd3, et Pshl ont été identifiées comme impliquées dans la formation de CDBs (EDLINGER & SCHLOGELHOFER, J Exp Bot, 62, 1545-63, 2011). La recombinaison méiotique provoque un 35 réassortiment des allèles d'origine paternelle et maternelle dans le génome, ce qui contribue à générer de la diversité génétique. Elle présente donc un intérêt particulier dans les programmes d'amélioration et d'ingénierie génétique. Une application majeure est la génération de nouvelles variétés de micro-organismes, plantes et 5 mammifères, provenant de variants naturels et/ou résultant de modifications génétiques. Cependant un obstacle majeur à l'exploitation du potentiel de la recombinaison méiotique est son caractère aléatoire et non-uniforme. Il est en effet connu que les 10 sites des CDBs sont distribués de manière hétérogène sur les chromosomes, définissant des régions chromosomiques « chaudes » (hot spots) où se produisent fréquemment des CDBs, et des régions chromosomiques « froides », où les CDBs sont rares, voire inexistants. Les déterminants qui 15 conditionnent le choix des sites de CDBs par Spoll et ses partenaires sont encore très mal connus à l'heure actuelle. Le contrôle de la formation des CDBs peut permettre de moduler la recombinaison méiotique, et ainsi faciliter le clonage positionnel de gènes d'intérêt, tout en 20 limitant le brassage des gènes ayant des effets inconnus sur les propriétés d'intérêt ciblées. Il peut permettre aussi d'associer ou de dissocier des traits génétiques ne se recombinant que très peu naturellement. Il a été montré qu'il était possible de modifier 25 les sites de formation de CDBs, en fusionnant Spoll avec le domaine de liaison à l'ADN de l'activateur de transcription Gal4 (Demande PCT WO 2004016795 (PECINA et al., Cell, 111, 173-84, 2002; NICOLAS, Methods Mol Biot, 557, 27-33, 2009). La protéine de fusion Ga14-Spoll introduit des cassures 30 double-brin non seulement dans les régions de recombinaison habituelles, mais également dans des régions chromosomiques froides, à proximité des sites naturels de liaison de Gal4 à l'ADN. Toutefois, bien que cette approche permette de 35 redistribuer les sites disponibles pour l'introduction de CDBs, le nombre et l'emplacement de ceux-ci restent conditionnés par la présence de sites de liaison de Ga14.

La présente invention propose un nouveau système de ciblage de la formation des CDBs, et donc de la recombinaison méiotique, permettant de s'affranchir des limitations du système Ga14-Spoll connu dans l'art antérieur.

Dans le système de la présente invention, la fonction de formation des CDBs et la fonction de ciblage de ces cassures vers un ou plusieurs site(s) de l'ADN cellulaire sont assurées par deux modules protéiques distincts, respectivement dénommés ci-après module effecteur (ME) et module de ciblage (MC). Lorsqu'ils sont co-exprimés dans la même cellule dans des conditions appropriées, ces deux modules peuvent interagir entre eux pour former un complexe non-covalent dont le module effecteur est capable de catalyser la formation de CDBs à proximité du ou des site(s) reconnu(s) par le module de ciblage. Plus spécifiquement, le module effecteur ME est une protéine chimérique comprenant un domaine effecteur (DE) capable d'induire la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique, qui est fusionné, directement ou par l'intermédiaire d'un lieur peptidique, avec un domaine d'interaction (DI1) constitué par un premier partenaire d'un couple d'affinité sélective protéine-protéine. Le module de ciblage MC est une protéine chimérique comprenant un domaine d'interaction (DI2) constitué par le second partenaire dudit couple d'affinité sélective protéine-protéine, fusionné directement ou par l'intermédiaire d'un lieur peptidique, avec un domaine de ciblage DC capable de se lier sélectivement à une séquence cible présente dans l'ADN de la cellule-hôte où les modules ME et MC sont destinés à être exprimés. La structure des deux modules ME et MC est schématisée sur la Figure 1. La présente invention a notamment pour objet un procédé pour provoquer une recombinaison méiotique ciblée 35 dans une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il comprend la co-expression dans ladite cellule : - d'un module effecteur ME constitué par une protéine chimérique comprenant : i) un domaine effecteur DE capable d'induire la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique ; ii) un domaine d'interaction DI1 constitué par le 5 premier partenaire d'un couple d'affinité sélective protéine-protéine ; et - d'un module de ciblage MC constitué par une protéine chimérique comprenant : iii) un domaine d'interaction DI2 constitué par 10 le second partenaire dudit couple d'affinité sélective protéine-protéine iv) un domaine de ciblage DC capable de se lier sélectivement à une séquence cible présente dans l'ADN de ladite cellule ; 15 ladite co-expression étant effectuée dans des conditions permettant la formation d'un complexe non covalent entre le module ME et le module MC par interaction entre les domaines DI1 et DI2. Le domaine effecteur DE est constitué par une 20 protéine capable d'induire, directement ou en combinaison avec d'autres protéines présentes dans la cellule hôte, la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique. Il s'agit de préférence d'une protéine Spoll, et avantageusement d'une protéine Spoll 25 originaire de la même espèce que la cellule-hôte dans laquelle les modules ME et MC seront exprimés ; il peut toutefois s'agir d'une protéine Spoll provenant d'une autre espèce, à condition que celle-ci soit capable de complémenter fonctionnellement la protéine Spoll endogène. Il peut 30 également être constitué par l'une des protéines qui participent avec Spoll à la formation des CDBs. Par exemple, chez la levure S. cerevisiae, le domaine DE peut être constitué par Spoll, ou le cas échéant par au moins l'une des protéines Ski8, Rec102, Rec104, Rec114, Mer2, Mei4, Mrell, 35 Rad50, et Xrs2 ; chez A. thaliana, il peut être constitué par Spoll-1 ou Spo11-2, ou le cas échéant par au moins l'une des protéines Prdl, Prd2, Prd3, et Pshl.

Le domaine d'interaction DI1 du module ME et le domaine d'interaction DI2 du module MC forment ensemble un couple d'affinité sélective protéine-protéine. Ils sont donc capables de se lier l'un avec l'autre, mais ne se lient de manière significative à aucun composant endogène (notamment protéine ou acide nucléique) de la cellule-hôte. On considèrera que l'affinité entre deux partenaires de liaison est sélective, si la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) du complexe formé entre ces deux partenaires est au moins 5 fois plus faible, de préférence au moins 20 fois plus faible, et de manière tout à fait préférée au moins 100 fois plus faible que la constante de dissociation à l'équilibre d'un complexe éventuellement formé entre l'un ou l'autre des deux partenaires et un quelconque composant endogène de la cellule-hôte. A titre indicatif, la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) du complexe formé entre ces deux partenaires doit être généralement inférieure à 10 pM, de préférence comprise entre 1 pM et 1nM, et la constante de dissociation à l'équilibre d'un complexe éventuellement formé entre l'un ou l'autre des deux partenaires et un quelconque composant endogène de la cellule-hôte doit être généralement supérieure à 50 pM. Avantageusement, pour des raisons d'encombrement stérique, la taille des domaines DI1 et DI2 sera inférieure à 25 20 kDa, de préférence inférieure à 10 kDa. Un grand nombre de couples d'affinité sélective protéine-protéine répondant à ces critères et donc utilisables dans le cadre de la présente invention pour constituer les domaines DI1 et DI2 sont connus en eux-mêmes. 30 On peut utiliser par exemple d'un couple d'affinité constitué par le paratope d'un anticorps et l'épitope peptidique correspondant ; dans ce cas on choisira de préférence un anticorps de camélidé, dont le paratope, qui n'est constitué que des trois régions hypervariables de la chaine lourde est 35 de taille moindre que celui des anticorps classiques, qui implique les régions hyparvariables de la chaîne lourde et celles de la chaîne légère.

On peut utiliser également un couple d'affinité constitué par une ossature protéique « non immunoglobuline » contenant un domaine de liaison capable de reconnaître spécifiquement un ligand choisi a priori, et le ligand peptidique correspondant. Une grande variété de couples d'affinités de ce type est disponible à l'heure actuelle. A titre d'exemples non-limitatifs on citera notamment : les nanobodies, les affibodies, les maxibodies, les tetranectines, les iMabs, les adnectines, les evibodies, les microbodies, les anticalines, les avimères, les DARpins, les domaines Kunitz, les domaines PTZ, les knottines, les aptamères peptidiques, les protéines à motifs répétés telles que les protéines LRR, associés avec leurs ligands peptidiques al., Trends Biotechnol, Biotechnol, 2-6, 2003; respectifs. (pour revue cf. par exemple (HEY et Biotechnol, 23, 514-22, 2005; GRONWALL & STAHL, J 140, 254-69, 2009; BOERSMA & PLUCKTHUN, Curr Opin 22, 849-57, 2011; FORRER et al., FEBS Lett, 539, LOFBLOM et al., FEBS Lett, 584, 2670-80, 2010; LOFBLOM et al., Curr Opin Biotechnol, 22, 843-8, 2011).

Un couple d'affinité préféré est un couple dockerine/cohésine bactériennes. Les dockerines et les cohésines sont des constituants du cellulosome, qui est un complexe multienzymatique localisé à la surface de certaines bactéries cellulolytiques. Le cellulosome est constitué de sous-unités catalytiques ancrées à une charpente protéique par l'intermédiaire de l'interaction spécifique entre les domaines dockerine, portés par ces sous-unités catalytiques, et les domaines cohésine présents sur la charpente protéique (BAYER et al., Annu Rev Microbiol, 58, 521-54, 2004). La taille des domaines cohésine et dockérine est généralement respectivement de l'ordre de 15 kDa et 8 kDa environ, et l'affinité de l'interaction dockerine/cohésine, qui est dépendante des ions calcium, est très élevée (Kd de 10-7 à 10- 9 M selon la concentration en ions calcium, et l'origine des domaines en question). Il existe une variété de domaines dockerine et cohésine provenant de différentes espèces bactériennes. Généralement, les domaines dockerine interagissent avec les domaines cohésine provenant de la même espèce bactérienne, mais pas avec ceux d'espèces différentes. Les propriétés du couple d'affinité dockerine/cohésine ont conduit à proposer son utilisation dans diverses applications, parmi lesquelles notamment la chromatographie d'affinité (KARPOL et al., J Mol Recognit, 22, 91-8, 2009), la création de cellulosomes artificiels (FIEROBE et al., J Biol Chem, 280, 16325-34, 2005), ou l'exposition de protéines d'intérêt à la surface de cellules de S. cerevisiae (HAN et al., Appl Environ Microbiol, 78, 3249-55, 2012). Dans le cadre de la présente invention, l'utilisation d'un couple dockerine/cohésine pour constituer les domaines d'interaction DI1 et DI2 (le domaine DI' pouvant être constitué par la dockerine et le domaine DI2 par la 15 cohésine ou vice versa), présente, outre les avantages résultant de l'affinité élevée et de la spécificité de cette interaction, celui de pouvoir le cas échéant permettre de moduler, si on le souhaite, l'association entre ces deux domaines d'interaction, et donc la formation de 20 l'hétérodimère entre les modules ME et MC, en faisant varier la concentration en ions calcium. Le domaine de ciblage DC peut être n'importe quel domaine protéique de liaison à l'ADN capable de se lier spécifiquement à une séquence-cible d'ADN de la cellule-hôte. 25 Il peut s'agir par exemple du domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription. Afin de pouvoir disposer d'un large choix de sites de formation des CDBs, on préfèrera généralement un domaine de liaison à l'ADN dont la spécificité de liaison 30 peut être pré-définie en fonction de la cible visée. Différents types de domaines de liaison à l'ADN remplissant ce critère sont connus en eux-mêmes et sont à l'heure actuelle de plus en plus fréquemment utilisés en génie génétique, le plus souvent en association avec un domaine 35 nucléase (TZFIRA et al., Plant Biotechnol J, 10, 373-89, 2012; CURTIN et al., Plant Gen., 5, 42-50, 2012; GAJ et al., Trends Biotechnol, 2013).

A titres d'exemples non limitatifs, on peut citer notamment : - les domaines de liaison à l'ADN des effecteurs TALE (pour Transcription Activator-Like Effector) qui sont 5 constitués de modules structuraux reconnaissant chacun une seule base de l'ADN, et pouvant être assemblés pour reconnaître spécifiquement n'importe quelle séquence d'ADN, selon l'ordre de cet assemblage (JOUNG & SANDER, Nat Rev Mol Cell Biol, 14, 49-55, 2013; STREUBEL et al., Nat Biotechnol, 10 30, 593-5, 2012; ZHANG et al., Plant Physiol, 161, 20-7, 2013) ; - des peptides à doigts de zinc, constitués d'un assemblage modulaire de motifs à doigts de zinc de spécificités connues (CARROLL, Genetics, 188, 773-82, 2011; 15 ISALAN, Nat Methods, 9, 32-4, 2012; MILLER et al., Nat Biotechnol, 25, 778-85, 2007) ; - les domaines de liaison à l'ADN de méganucléases(GRIZOT et al., Nucleic Acids Res, 38, 2006-18, 2010; HAFEZ & HAUSNER, Genome, 55, 553-69, 2012; FONFARA et 20 al., Nucleic Acids Res, 40, 847-60, 2012). Dans le cadre de la présente invention, le domaine de liaison à l'ADN utilisé, au lieu d'être associé à un domaine nucléase, est associé à un domaine d'interaction tel que défini ci-dessus. 25 L'ordre des domaines DE et DI1 dans le module effecteur ME, ainsi que celui des domaines DC et DI2 dans le module de ciblage MC n'est pas critique : le domaine DE peut être positionné en N-terminal, ou en C-terminal par rapport au domaine DI' ; de même, le domaine DC peut être positionné 30 en N-terminal, ou en C-terminal par rapport au domaine DI2. Le domaine DE et le domaine DI1 du module effecteur ME, de même que le domaine DC et le domaine DI2 du module de ciblage MC, peuvent le cas échéant être directement liés entre eux. Toutefois, ils sont de préférence reliés par 35 l'intermédiaire d'un lieur peptidique, afin de favoriser un repliement correct de la protéine chimérique, et/ou d'éviter des encombrements stériques et/ou des interactions inter- domaines qui pourraient interférer avec la fonctionnalité de l'un et/ou de l'autre des domaines. La taille et la séquence des lieurs peptidiques utilisés seront choisies en fonction de la nature des domaines à relier entre eux. Les principes sur la base desquels peut s'effectuer ce choix sont connus en eux mêmes (cf. par exemple (ARAI et al., Protein Eng, 14, 529-32, 2001; WALDO et al., Nat Biotechnol, 17, 691-5, 1999). A titre indicatif, des polypeptides utilisés en tant que lieurs peptidiques dans la construction de protéines chimériques multidomaines sont en général principalement constitués d'acides aminés de petite taille et non-chargés (alanine, glycine, et sérine). Généralement, la taille de ces polypeptides varie d'environ 5 à environ 30 acides aminés ; elle est le plus souvent de 10 à 20 acides aminés. Le cas échéant, dans le cas où l'un des domaines DE ou DI1 du module ME, ou l'un des domaines DI2 ou DC du module MC est lui même issu d'une protéine contenant plusieurs domaines reliés par des lieurs peptidiques, l'un de 20 ces lieurs (de préférence immédiatement adjacent au domaine concerné dans la protéine d'origine) peut être utilisé dans la construction du module où sera incorporé le domaine en question. Généralement, le module effecteur et/ou le module 25 de ciblage comprennent en outre une séquence permettant l'adressage nucléaire du module correspondant. De manière préférentielle, le module effecteur comprend deux séquences d'adressage nucléaire, qui peuvent être identiques ou différentes. L'une de ces séquences d'adressage nucléaire 30 peut le cas échéant être celle naturellement présente dans le domaine effecteur DE s'il en contient une (tel est le cas par exemple si le domaine DE est une protéine Spoll). Très préférentiellement, la séquence d'adressage nucléaire (ou au moins l'une des séquences d'adressage nucléaire si le module 35 en contient 2) sera placée à proximité immédiate de l'extémité N-terminale du module concerné. La séquence cible au niveau de laquelle seront induites les CDBs peut être n'importe quelle séquence d'ADN présente dans la cellule-hôte. Il peut s'agir d'une séquence endogène de ladite cellule, ou d'une séquence d'origine exogène qui y a été introduite. Elle peut être située sur l'ADN chromosomique de la cellule, sur un réplicon extra- chromosomique. Lors de la mise en oeuvre du procédé de la présente invention, la formation de CDBs au niveau de la séquence cible n'intervient que si le module ME et le module MC forment un complexe, ce qui présuppose : i) que les deux modules soient présents en même temps dans la cellule ; ii) que les conditions du milieu intracellulaire permettent l'interaction entre les domaines DI1 et DI2. Si ces conditions ne sont pas réunies, par exemple si un seul des deux modules est exprimé, ou si les 15 deux modules sont exprimés mais les domaines DI1 et DI2 n'interagissent pas, l'expression des modules est sans conséquence sur le mécanisme endogène de formation des CDBs existant dans la cellule hôte. Dans le cas particulier où la cellule hôte utilisée est une cellule dans laquelle le 20 mécanisme endogène de formation des CDBs est défectueux du fait que la protéine endogène homologue de celle qui constitue le domaine effecteur DE est absente ou inactive, l'expression du module ME permet de complémenter la fonction manquante, même en l'absence d'interaction avec le module MC. 25 Si les conditions de formation du complexe ME/MC sont réunies, le complexe formé peut interagir, par l'intermédiaire du module ME, avec les protéines endogènes de la cellule-hôte intervenant dans la formation des CDBs, et rediriger celle-ci vers le site ciblé par le module MC. 30 Ces caractéristiques permettent de réguler le ciblage des CDBs en agissant sur les niveaux d'expression des modules ME et MC, et/ou le moment de l'induction de cette expression, ce qui permet de contrôler la proportion relative des deux modules, et/ou sur les conditions d'interaction 35 entre les domaines DI1 et D12. A titre d'illustration, lorsque le domaine effecteur DE est une protéine Spoll, le module effecteur ME exprimé dans une cellule-hôte peut soit s'associer avec un autre module effecteur pour former un homodimère (ME/ME), soit s'associer avec une protéine Spoll endogène de la cellule-hôte pour former un hétérodimère (ME/Spol1). L'un comme l'autre de ces dimères possède la fonctionnalité 5 d'induction des CDBs de l'homodimère naturel Spoll/Spoll. En présence du module MC, deux types de complexe peuvent être formés : un complexe quaternaire (MC/ME/ME/MC) comprenant deux modules de ciblage, et un complexe ternaire (MC/ME/Spoll) comprenant un seul module de ciblage. Le niveau 10 de ciblage et sa spécificité peuvent être ajustés en agissant sur les niveaux d'expression des modules ME et/ou MC et/ou le cas échéant sur celui de la protéine Spoll endogène. Par exemple, si l'on souhaite obtenir un niveau de ciblage très élevé, on peut inactiver la protéine Spoll 15 endogène de la cellule-hôte ; dans ce cas, lorsque le module effecteur ME est exprimé, seul l'homodimère ME/ME (qui complémente la fonction de l'homodimère endogène Spoll/Spoll) est formé, et en présence du module MC seul le complexe quaternaire MC/ME/ME/MC est formé. 20 La présente invention a également pour objet des outils pour la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces outils comprennent notamment une combinaison de cassettes d'expression comprenant : 25 - une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour un module effecteur ME tel que défini ci-dessus, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et - une cassette d'expression comprenant une 30 séquence codant pour un module de ciblage MC tel que défini ci-dessus, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. On peut utiliser le cas échéant, pour l'expression du module ME et du module MC, des promoteurs 35 identiques. Généralement, on préfèrera toutefois utiliser des promoteurs différents. Le choix des promoteurs appropriés dépend d'une part de la cellule-hôte utilisée (ils doivent être fonctionnels dans celle-ci) et d'autre part de la manière dont on souhaite réguler l'induction de l'expression des modules ME et MC. Une large variété de promoteurs utilisables pour 5 l'expression de gènes d'intérêt dans des cellules ou des organismes hôtes est disponible dans l'art. Ils incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions 10 environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule-spécifiques, qui sont actifs uniquement ou principalement dans certains tissus, certains types de cellules ou certains états cellulaires, et des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli 15 physiques ou chimiques exogènes. Dans le cadre de la présente invention, on utilisera préférentiellement des promoteurs tissu- ou cellule-spécifiques, notamment des promoteurs spécifiques de la méiose (c'est-à-dire actifs exclusivement ou 20 préférentiellement dans les cellules en méiose) et/ou des promoteurs inductibles. De manière particulièrement préférée, l'un des promoteurs utilisés est un promoteur spécifique de la méiose, et l'autre est un promoteur inductible, activé ou réprimé par 25 un stimulus exogène. Avantageusement, on utilisera le promoteur spécifique de la méiose pour l'expression du module ME et le promoteur inductible pour l'expression du module MC. Des promoteurs spécifiques de la méiose utilisables dans le cadre de la présente invention sont 30 notamment le promoteur endogène de Spoll (ou celui de l'un de ses partenaires pour la formation des CDBs). On peut toutefois utiliser d'autres promoteurs spécifiques de la méiose ; à titre d'exemples non limitatifs on citera : - chez la levure, le promoteur Rec8 (MURAKAMI & 35 NICOLAS, Mol Cell Biol, 29, 3500-16, 2009), ou le promoteur Spol3 (MALKOVA et al, Genetics, 143, 741-754, 1996) ; - chez les plantes, le promoteur DMC1 (KLIMYUK & JONES, Plant J., 11, 1-14, 1997), ainsi que les promoteurs des gènes SOLO DANCERS et SWITCH1 (VAN EX et al., Plant Cell Rep, 28, 1509-20, 2009). Des promoteurs inductibles utilisables dans le cadre de la présente invention sont, à titre d'exemples non 5 limitatifs : - chez la levure le promoteur estradiol (CARLILE & AMON, Cell, 133, 280-91, 2008 ; SOURIRAJAN & LICHTEN, Genes Dev, 22, 2627-32, 2008 ; DAYANI et al., PLoS Genet, 7, e1002083, 2011), ou le promoteur méthionine (MET3)(Care et 10 al, Molecular Microb, 34, 792-798, 1999 ; Mao et al, Current Microb, 45, 37-40, 2002). - chez les plantes, le promoteur HSP18.2 inductible par la chaleur (TAKAHASHI & KOMEDA, Mol Gen Genet, 219, 365-72, 1989) ; le promoteur alcA inductible par 15 l'éthanol (ROSLAN et al., Plant J, 28, 225-35, 2001) ; le système GVG (GAL-4/VP16-GR) - UAS, inductible par les glucocorticoides (AOYAMA & CHUA, Plant J, 11, 605-12, 1997). Les cassettes d'expression de l'invention comprennent en outre les séquences usuelles dans ce type de 20 construction, telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription tels que des amplificateurs. Les cassettes d'expression conformes à l'invention peuvent être insérées dans l'ADN chromosomique de 25 la cellule-hôte, et/ou portées par un ou plusieurs réplicon(s) extra-chromosomique. La présente invention a également pour objet une cellule-hôte eucaryote, de préférence une cellule de levure, une cellule de plante, ou une cellule animale, contenant une 30 combinaison de cassettes d'expression conforme à l'invention, ainsi qu'un organisme pluricellulaire, notamment une plante ou un animal non humain, de préférence une plante, dont au moins une cellule contient une combinaison de cassettes d'expression conforme à l'invention. 35 La présente invention peut être utilisée dans toutes les applications où il est souhaitable d'améliorer et de contrôler la recombinaison méiotique, par exemple dans les applications indiquées dans la Demande PCT WO 2004016795 pour le système Ga14-Spoll. Par rapport à ce système Gal4-Spoll la présente invention possède l'avantage de permettre l'accès à un choix plus étendu de sites de recombinaison et donc d'améliorer le ciblage, de permettre un meilleur contrôle du niveau de recombinaison, et également un meilleur contrôle dans le temps des évènements de recombinaison. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple non-limitatif décrivant la construction d'un module effecteur et d'un module de ciblage conforme à l'invention. EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION D'UN MODULE EFFECTEUR ET D'UN MODULE 15 DE CIBLAGE Les constructions ont été effectuées en utilisant la méthode d'assemblage de GIBSON (GIBSON et al., Nat Methods, 6, 343-5, 2009). Module de ciblage : 20 La séquence cible choisie pour ce module est celle du gène APT d'Arabidopsis thaliana. Cette séquence cible est située, chez Arabidopsis thaliana, dans une zone placée dans un intervalle centromérique, région où n'interviennent naturellement que très peu de crossing-over. 25 Un squelette TALE ciblant cette séquence a été déterminé in silico grâce au logiciel TAL Effector-Nucleotide Targeter 2.0 (http ://boglabx.plp.iastate.edu/TALENT/). Ce squelette est constitué de 17 répétitions de séquences d'acides aminés comportant un polymorphisme de deux 30 résidus en position 12 et 13 de chaque répétition, spécifiques de la séquence cible choisie. La séquence synthétique codant pour ce squelette est clonée dans le plasmide pTAL3 pour générer le plasmide pTAL3-TAL1 (CERMAK et al., Nucleic Acids Res, 39, e82, 2011). 35 Un gène codant pour la dockérine de type I de Clostridium thermocellum Ce1S, flanquée en N-terminal d'un lieur protéique flexible (GSAGSAAGSGEF) (LILLY et al., FEMS Yeast Res, 9, 1236-49, 2009), et dont la séquence nucléotidique est optimisée pour l'expression chez Saccharomyces cerevisiae, a été synthétisé puis cloné dans le plasmide pUC57 (GenBank: Y14837.1) pour générer le pRH003.Cette séquence synthétique est dotée en 5' de l'extrémité C-ter du module TALE(allant de +3180 à 3323pb de l'ATG du TALE par rapport au pTAL3-TAL1) tandis que son extrémité 3' est pourvue d'une séquence homologue à l'extrémité 5' du terminateur Cycl.

La séquence codant pour le module TAL complet (fragment BamHI) obtenue à partir de pTAL3-TAL1, et la séquence codant pour la dockérine précédée du lieur flexible, ont été assemblées, et la séquence résultante a été introduite au site BamHI/StuI du plasmide pCM185 (ATCC 87659), pour donner le plasmide pRH042. Ce plasmide contient la séquence complète codant pour le module de ciblage, sous contrôle du promoteur ptetoft de pCM185. Des variants de pRH042, dans lesquels une 20 séquence codant soit pour une étiquette 3HA ou 3FLAG à l'extrémité 3' de la séquence codant pour la dockerine ont également été construits. Ces variants sont respectivement dénommés pRH041 et pRH040. Module effecteur : 25 La séquence promotrice (-522 ; -1) de SP011, ainsi que l'ORF SP011 pourvue de son terminateur (+1 ; +1597) ont été amplifiées à partir de l'ADN génomique de la souche SK1 de Saccharomyces cerevisiae. Une séquence codant pour la cohésine en deuxième 30 position de la chaine polypeptidique CIPA (pour Cellulosomal scaffoldIng Protein A) de Clostridium thermocellum CelS, flanquée en C-terminal de son lieur protéique naturel, et optimisée pour l'expression chez Saccharomyces cerevisiae, a été synthétisée. Ce fragment de synthèse possède L'extrémité 35 3' du promoteur SP011 (-146 à -1 par rapport à l'ATG de SP011) suivie d'un signal de localisation nucléaire (séquence NLS de SV40) et d'une étiquette HA à son extrémité 5'.

Tandis qu'en 3' de la cohésine, la région +1 à +77 de SPO11 est fusionnée à la séquence codant pour le lieur peptidique de la cohésine. Ce gène synthétique, cloné en PsiI/AvaII du plasmide pUC57 constitue alors le plasmide pRH004.

Les deux fragments d'amplification contenant respectivement la séquence promotrice de SPO11 et son ORF flanquée de son terminateur , et le fragment de restriction psil/AvaII de pRH004, contenant la séquence codant pour la cohésine précédée du signal de localisation nucléaire et de l'étiquette HA, et suivie de son lieur peptidique, sont assemblés par la méthode Gibson et la séquence résultante est introduite dans le vecteur pFL36 (ATCC 77202) préalablement digéré par BamHI/HindIII pour donner le plasmide pRH021. Le Tableau I ci-dessous récapitule les 15 constructions effectuées. Tableau I Plasmide Gène d'intérêt Type de Marqueur génétique plasmide pRH003 Gène de synthèse Dockérine E.coli pRH004 Gène de synthèse Cohésine E.coli pTAL3-TAL1 Talen dans pTAL3 CEN, ARS HIS3 pRH021 Ps0011-NLS.HA-Coh-Spo11 CEN6, ARS LEU pCM185 Vecteur Ptetoff CEN4, ARS416 TRP pRH042 Ptetoff.TAL-Doc CEN4, ARS416 TRP pRH041 Ptetoff.TAL-Doc.HA CEN4, ARS416 TRP pRH040 Ptetoff.TAL-Doc.FLAG CEN4, ARS416 TRP Des essais d'expression du module effecteur Pspon-NLS.HA-Coh-Spoll, et du module de ciblage Ptetoff.TALDoc (flanqué d'une étiquette HA ou FLAG) chez S. cerevisiae 20 ont été effectués. Ces essais ont montré d'une part que la protéine de fusion cohésine-Spoll pouvait complémenter une délétion homozygote de la protéine Spoll native de S. cerevisiae, et qu'elle est donc fonctionnelle, et d'autre part que la 25 protéine de fusion TAL-dockérine placée sous contrôle du promoteur Ptetoff et que son niveau d'expression pouvait être modulée par la présence ou l'absence de doxycycline dans le milieu.

Claims (5)

1. REVENDICATIONS1) Procédé pour provoquer une recombinaison méiotique ciblée dans une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il comprend la co-expression dans ladite cellule : a) d'un module effecteur ME constitué par une 5 protéine chimérique comprenant : i) un domaine effecteur DE capable d'induire la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique ; ii) un domaine d'interaction DI1 constitué par le 10 premier partenaire d'un couple d'affinité sélective protéine-protéine ; et b) d'un module de ciblage MC constitué par une protéine chimérique comprenant : iii) un domaine d'interaction DI2 constitué par 15 le second partenaire dudit couple d'affinité sélective protéine-protéine iv) un domaine de ciblage DC capable de se lier sélectivement à une séquence cible présente dans l'ADN de ladite cellule ; 20 ladite co-expression étant effectuée dans des conditions permettant la formation d'un complexe non-covalent entre le module ME et le module MC par interaction entre les domaines DI1 et DI2.
2. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé 25 en ce que le domaine effecteur DE est constitué par une protéine Spoll.
3. 3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le couple d'affinité sélective protéine-protéine est un couple 30 dockerine/cohésine bactériennes.
4. 4) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le domaine de ciblage est un domaine de liaison à l'ADN d'un effecteur TALE. ) Combinaison de cassettes d'expression pour la mise en oeuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend : une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour 5 un module effecteur ME tel que défini dans lesdites revendications, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié et une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour un module de ciblage MC tel que défini dans lesdites revendications, sous contrôle transcriptionnel 10 d'un promoteur approprié. 6) Cellule eucaryote contenant une combinaison de cassettes d'expression selon la revendication
5. 5. 7) Cellule eucaryote selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de levure. 15 8) Organisme multicellulaire contenant au moins une cellule selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les plantes et les animaux non-humains.