JP7170090B2 - タンパク質をゲノム内の特定の遺伝子座に導くための組成物および方法 - Google Patents

タンパク質をゲノム内の特定の遺伝子座に導くための組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、２０１５年６月１７日に出願された米国仮出願ＵＳＳＮ６２／１８１，１６２の利益を主張し、当該出願の内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。
２０１６年６月１６日に作成され、サイズが２０５ＫＢである「ＰＯＴＨ－００３／００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、標的化遺伝子改変のための組成物および方法に関する。
タンパク質に特定の機能を実行させるためにそのタンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座に局在化させることが望ましいと思われる事例が多く存在する。タンパク質をゲノム内の特定の場所に局在化させることが望ましい１つの例は、遺伝子編集の場合である。そのような遺伝子編集ツールの例では、ＤＮＡ結合性ドメインとヌクレアーゼドメインを、ペプチド結合を介した共有結合による連結によって融合する。本開示は、有効性が優れた遺伝子編集のための融合タンパク質のための組成物および方法を提供する。
本開示は、タンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）または遺伝子座（ｌｏｃｉ）に導くための組成物および方法を提供する。ゲノムに本開示の組成物またはポリペプチドが接触すると、二本鎖ＤＮＡの１つまたは複数の鎖が切断され得る。切断が１つまたは複数のＤＮＡ修復経路またはその成分の存在下でなされれば、遺伝子発現を妨害するか、または１つもしくは複数の塩基対の挿入、欠失、もしくは置換によるゲノム配列の改変をもたらすことができる。本開示の組成物および方法は、ゲノム内の標的遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）または標的遺伝子座（ｌｏｃｉ）において優れた予想外に効率的なヌクレアーゼ活性をもたらすものである。
本開示は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる融合タンパク質を提供する。
本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。これらの実施形態のある特定の態様では、ＤＮＡ局在化成分は、２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ここで、第１のｇＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的配列の第１の鎖に特異的に結合し、第２のｇＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的配列の第２の鎖に特異的に結合する。
本開示のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）または不活化ヌクレアーゼドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、不活化小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。これらの実施形態のそれぞれにおいて、エフェクター分子は、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、ｄＳａＣａｓ９、またはそのヌクレアーゼドメインおよび第２のエンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。第２のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。第２のエンドヌクレアーゼは、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１のうちの１つまたは複数を含めた、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ｄＣａｓ９またはそのヌクレアーゼドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるものであってよい。第２のエンドヌクレアーゼは、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、またはＣｌｏ０５１のうちの１つまたは複数を含めた、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ｄＣａｓ９またはそのヌクレアーゼドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであり、ＦｏｋＩを含む、それから本質的になるまたはそれからなるものではなくてよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、またはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、またはＣｌｏ０５１のうちの１つまたは複数を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のＤＮＡ結合性ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメイン（ＴＡＬタンパク質とも称される）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、エンドヌクレアーゼを含むものであってよい。ＤＮＡ結合性ドメイン、またはＴＡＬタンパク質は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来するものであってよい。ＤＮＡ結合性ドメイン、またはＴＡＬタンパク質は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するものであってよい。
本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬタンパク質を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１のうちの１つまたは複数を含めた、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬタンパク質を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、ＦｏｋＩを含まない、それから本質的になるものはでない、またはそれからなるものではないものであってよい。本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬタンパク質を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１を含まない、それから本質的になるものはでない、またはそれからなるものではないものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、またはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、またはＣｌｏ０５１のうちの１つまたは複数を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬタンパク質を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１のうちの１つまたは複数を含めた、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬタンパク質を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、エフェクター分子は、ＦｏｋＩを含まない、それから本質的になるものはでない、またはそれからなるものではないものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、またはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、またはＣｌｏ０５１のうちの１つまたは複数を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示のヘテロ二量体およびホモ二量体を含めた本開示のエフェクター分子は、ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示のヘテロ二量体およびホモ二量体を含めた本開示のエフェクター分子は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。Ｃａｓ９は、不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）または不活化ヌクレアーゼドメインであってよい、または、それを含む、それから本質的になる、もしくはそれからなるものであってよい。Ｃａｓ９は、不活化小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）であってよい、または、それを含む、それから本質的になる、もしくはそれからなるものであってよい。
本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ｄＣａｓ９またはその不活化ヌクレアーゼドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ｄＣａｓ９またはその不活化ヌクレアーゼドメインおよび、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ｄＣａｓ９またはその不活化ヌクレアーゼドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ＦｏｋＩを含まない、それから本質的になるものはでない、またはそれからなるものではないものであってよい。
本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ｄＳａＣａｓ９またはその不活化ヌクレアーゼドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ｄＳａＣａｓ９またはその不活化ヌクレアーゼドメイン、および、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるものであってよい。
本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、１つまたは複数のＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１を含めた、１つまたは複数のＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の融合タンパク質のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼのホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示のヘテロ二量体およびホモ二量体を含めた本開示のエフェクター分子は、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ＴＡＬＥＮは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓまたはＲａｌｓｔｏｎｉａに由来するものであってよい。
本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｕｓに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｕｓに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメイン、および、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｕｓに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ＦｏｋＩを含まない、それから本質的になるものはでない、またはそれからなるものではないものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｕｓに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、Ｃｌｏ０５１を含まない、それから本質的になるものはでない、またはそれからなるものではないものであってよい。
本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメイン、およびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示のある特定の実施形態では、エフェクター分子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメイン、および、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、またはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示のヘテロ二量体およびホモ二量体を含めた本開示のエフェクター分子は、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示は、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
本開示は、本開示の核酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなるベクターを提供する。好ましくは、本開示は、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなるベクターを提供する。
本開示は、本開示の融合タンパク質、核酸、ベクターまたは組成物を含む細胞を提供する。細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるものであってよい。細胞は、例えば、細菌、古細菌、原生生物、単細胞（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ）藻類および／または単細胞（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ）真菌を含めた、単細胞（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ）または単細胞（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌｅｄ）生物のものであってよい。
本開示は、本開示の融合タンパク質、核酸、ベクターまたは細胞を含む組成物を提供する。本開示の組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含む、それから本質的になるまたはそれからなるものであってよい。
本開示は、本開示の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、または組成物を含む、それから本質的になる、またはそれからなる多細胞生物を提供する。多細胞生物は、植物であってよい。多細胞生物は、動物であってよい。ある特定の実施形態では、動物は、ヒトもしくはヒト胚でもなく、ヒトもしくはヒト胚のいずれに由来するものでもない。
本開示は、タンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座に導くための方法であって、ゲノムＤＮＡ配列に、本開示の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物もたらすステップを含む方法を提供する。この方法のある特定の実施形態では、融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてゲノムＤＮＡ配列に接触する。この方法のある特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡ配列は、ヒトゲノムＤＮＡ配列ではない。
本開示は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる組成物であって、ＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子が、非共有結合による連結によって作動可能に連結することができる、組成物を提供する。
本開示のＤＮＡ局在化成分は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の組成物および方法のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ここで、第１のｇＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的配列の第１の鎖に特異的に結合し、第２のｇＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的配列の第２の鎖に特異的に結合する。あるいは、本開示のＤＮＡ局在化成分は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のＤＮＡ結合性ドメインを含んでよい。本開示の例示的なＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓまたはＲａｌｓｔｏｎｉａに由来するものであり得る。
本開示のエフェクター分子は、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、ヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、触媒として不活性なまたは「不活化された」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、触媒として不活性であるまたは「不活化された」Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインである。好ましい実施形態では、ｄＣａｓ９は、本明細書では「小型」ｄＣａｓ９またはｄＳａＣａｓ９と称される、触媒として不活化された全長Ｃａｓ９に由来する、より短い配列によってコードされるものである。
ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。好ましい実施形態では、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩとヘテロ二量体を形成するＣａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１とヘテロ二量体を形成するＣａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩとヘテロ二量体を形成するｄＣａｓ９またはその不活化ヌクレアーゼドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。好ましい実施形態では、ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１とヘテロ二量体を形成するｄＣａｓ９またはその不活化ヌクレアーゼドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩとヘテロ二量体を形成するｄＳａＣａｓ９を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。好ましい実施形態では、ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１とヘテロ二量体を形成するｄＳａＣａｓ９を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
ホモ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、触媒として不活性の形態のＣａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９もしくはｄＳａＣａｓ９）またはその断片、およびＣｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、それから本質的になる、またはそれからなるホモ二量体を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、ホモ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、触媒として不活性の形態のＣａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９もしくはｄＳａＣａｓ９）またはその断片、およびＣｌｏ０５１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるホモ二量体を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなるものであってよい。
ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の例示的なＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓまたはＲａｌｓｔｏｎｉａに由来するものであり得る。
ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩとヘテロ二量体を形成するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。好ましい実施形態では、ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１とヘテロ二量体を形成するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
ホモ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメイン、およびＣｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、それから本質的になる、またはそれからなるホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、ホモ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメイン、およびＣｌｏ０５１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩとヘテロ二量体を形成するＲａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。好ましい実施形態では、ヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１とヘテロ二量体を形成するＲａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
ホモ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメイン、および、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、それから本質的になる、またはそれからなるホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、ホモ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断ドメイン、および、Ｃｌｏ０５１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるホモ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の非共有結合による連結は、エフェクター分子に共有結合によって付着しており、ＤＮＡ局在化成分に非共有結合によって直接結合する抗体断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の非共有結合による連結は、ＤＮＡ局在化成分に共有結合によって付着しており、エフェクター成分に非共有結合によって直接結合する抗体断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に共有結合によって付着したエピトープタグに非共有結合によって結合する抗体断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の抗体断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）、小型モジュール式免疫医薬品（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）分子、またはナノボディを含むまたはそれからなるものであってよい。
本開示の非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に非共有結合によって結合するタンパク質結合性ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に共有結合によって付着したタンパク質に結合することが可能なタンパク質を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に共有結合によって付着したタンパク質または他の小分子に非共有結合によって結合する小分子を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示の非共有結合による連結は、抗体模倣物を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の例示的な抗体模倣物は、標的配列に特異的に結合し、天然に存在する抗体とは別個の構造を有する有機化合物を含む、またはそれからなる。抗体模倣物は、タンパク質、核酸、または小分子を含むまたはそれからなるものであってよい。抗体模倣物は、アフィボディ（affibody）、アフィリン（afflilin）、アフィマー（affimer）、アフィチン（affitin）、アルファボディ（alphabody）、アンチカリン（anticalin）、およびアビマー（avimer）、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（Fynomer）、クニッツドメインペプチド、またはモノボディ（monobody）を含むまたはそれからなるものであってよい。
本開示は、本開示のＤＮＡ局在化成分、エフェクター分子、および／または非共有結合による連結をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
本開示は、本開示のベクターによってコードされるポリペプチドを提供する。本開示は、本開示のベクターによってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する。
本開示は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含むポリペプチドであって、ＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子が、非共有結合による連結によって作動可能に連結することができる、ポリペプチドを提供する。本開示は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む組成物であって、ＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子が、非共有結合による連結によって作動可能に連結することができる、組成物を提供する。
本開示の組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。
本開示は、本開示の核酸、ベクター、ポリペプチド、または組成物を含む細胞を提供する。細胞は、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるものであってよい。本開示のベクターを含む細胞としては、細菌および古細菌を含めた単細胞（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌｅｄ）生物が挙げられる。
本開示は、本開示のベクター、ポリペプチドまたは組成物を含む細胞を含む多細胞生物を提供する。例示的な多細胞生物としては、これだけに限定されないが、植物または動物が挙げられる。本開示のある特定の実施形態では、本開示のベクター、ポリペプチドまたは組成物を含む細胞を含む動物は、ヒトではない。本開示のある特定の実施形態では、本開示のベクター、ポリペプチドまたは組成物を含む細胞を含む動物は、ヒト胚ではない。
本開示は、タンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座に導くための方法であって、本開示の組成物、核酸、ベクター、またはポリペプチドをゲノムにもたらすステップを含む方法を提供する。この方法のある特定の実施形態では、組成物、核酸、ベクター、またはポリペプチドを、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてゲノムＤＮＡ配列に接触させる。この方法のある特定の実施形態では、ゲノムは、ヒトゲノムではない。
本開示は、生物のゲノムを改変するための方法であって、本開示による融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物をゲノムＤＮＡ配列または塩基対にもたらすステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、もたらすステップは、ゲノム配列または塩基対と融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物の少なくとも１つを接触させることを含む。ある特定の態様では、ゲノム配列または塩基対と融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物の少なくとも１つの接触は、流体伝達によって実現することができる。
この方法によると、ゲノム配列または塩基対の改変は、エンドヌクレアーゼの活性によって配列および／または塩基対を分離することを含んでよい。その代わりに、またはそれに加えて、ゲノム配列または塩基対の改変は、配列または塩基対の欠失、挿入、置換、反転、および／または再配置を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ修復機構により、欠失、挿入、置換、反転、および／または再配置が誘導される。例えば、ＤＮＡ修復機構が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を含む場合、ＮＨＥＪ経路により、標的部位における挿入または欠失（ＩｎＤｅｌｓ）が誘導され、その結果、フレームシフトおよび／または中途終止コドンが生じ得る。したがって、ＤＮＡ修復機構が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を含む場合、ＮＨＥＪ経路により、標的遺伝子またはゲノム配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊される。標的遺伝子またはゲノム配列のＯＲＦの破壊により、標的遺伝子またはゲノム配列の発現がサイレンシングされ得る。例えばＤＮＡ修復機構が相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を含む場合、修復鋳型を使用してゲノム配列における一本鎖または二本鎖切断を再接続させることができる。本開示の修復鋳型を使用して、所望の配列をゲノムのエンドヌクレアーゼ活性の部位に挿入することができる。本開示の例示的な修復鋳型は、外因性配列、人工配列、および／または異種配列を含んでよい。
機構またはＤＮＡ修復経路にかかわらず、本開示の挿入配列は、外因性配列、人工配列、および／または異種配列を含んでよい。ある特定の実施形態では、挿入を含むゲノム配列は、天然に存在しないものである。例えば、挿入が、外因性配列、人工配列、および／または異種配列を含む場合、得られるゲノム配列は、天然に存在しないものになる。
本開示は、本開示の方法に従って改変されたゲノム配列を提供する。
本開示は、請求項４７に記載のゲノム配列を含む細胞を提供する。
本開示は、本開示の方法により生じた改変を含む細胞を提供する。細胞またはそのゲノム配列の改変は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施することができる。例えば、細胞をｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて改変し、対象に投与することができる。ある特定の実施形態では、本開示の改変された細胞または改変されたゲノム配列は、ヒト細胞でもヒトゲノム配列でもない。ある特定の実施形態では、本開示の改変された細胞または改変されたゲノム配列は、ヒト胚細胞でもヒト胚ゲノム配列でもない。
本開示の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む融合タンパク質。
（項目２）
前記ＤＮＡ局在化成分が、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
前記ＤＮＡ局在化成分が、２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、第１のｇＲＮＡが、二本鎖ＤＮＡ標的配列の第１の鎖に特異的に結合し、第２のｇＲＮＡが、前記二本鎖ＤＮＡ標的配列の第２の鎖に特異的に結合する、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
前記ＤＮＡ局在化成分が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のＤＮＡ結合性ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目５）
前記エフェクター分子が、ホモ二量体を含む、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目６）
前記エフェクター分子が、ヘテロ二量体を含む、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目７）
前記エフェクター分子が、ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを含む、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目８）
前記エフェクター分子が、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、項目７に記載の融合タンパク質。
（項目９）
前記エフェクター分子が、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含む、項目７または８に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
前記エフェクター分子が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む、項目１、２、３、５、６、７または８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
前記Ｃａｓ９が、不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）または不活化ヌクレアーゼドメインである、項目１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
前記ｄＣａｓ９が、不活化小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）である、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、項目１０、１１または１２に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１を含む、項目１０、１１または１２に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩまたはＢｍｒＩを含む、項目１または４から９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
前記エフェクター分子が、Ｃｌｏ０５１を含む、項目１または４から９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
前記ＴＡＬＥＮが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するものである、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
前記ＴＡＬＥＮが、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来するものである、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
項目１から１８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（項目２０）
項目１９に記載の核酸を含むベクター。
（項目２１）
項目１から１８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む細胞。
（項目２２）
項目１９に記載の核酸を含む細胞。
（項目２３）
項目２０に記載のベクターを含む細胞。
（項目２４）
項目１から１８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物。
（項目２５）
項目１９に記載の核酸を含む組成物。
（項目２６）
項目２０に記載のベクターを含む組成物。
（項目２７）
項目２１から２３までのいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
（項目２８）
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
項目１から１８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む多細胞生物。
（項目３０）
項目１９に記載の核酸を含む多細胞生物。
（項目３１）
項目２０に記載のベクターを含む多細胞生物。
（項目３２）
項目２１から２３までのいずれか一項に記載の細胞を含む多細胞生物。
（項目３３）
項目２４から２８までのいずれか一項に記載の組成物を含む多細胞生物。
（項目３４）
植物である、項目２９から３３までのいずれか一項に記載の多細胞生物。
（項目３５）
動物である、項目２９から３３までのいずれか一項に記載の多細胞生物。
（項目３６）
前記動物が、ヒトまたはヒト胚ではない、項目２９から３３までのいずれか一項に記載の多細胞生物。
（項目３７）
タンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座に導くための方法であって、ゲノムＤＮＡ配列に、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物をもたらすステップを含む方法。
（項目３８）
前記融合タンパク質、前記核酸、前記ベクター、前記細胞または前記組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記ゲノムＤＮＡ配列に接触する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ゲノムＤＮＡ配列が、ヒトゲノムＤＮＡ配列ではない、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
生物のゲノムを改変するための方法であって、ゲノムＤＮＡ配列または塩基対に、前記項目のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物をもたらすステップを含む方法。
（項目４１）
前記もたらすステップが、ゲノム配列または塩基対に、前記融合タンパク質、前記核酸、前記ベクター、前記細胞または前記組成物の少なくとも１つを接触させることを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
接触を、流体伝達によって実現することができる、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ゲノム配列または塩基対がエンドヌクレアーゼの活性によって分離される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記ゲノム配列または塩基対が欠失する、挿入される、置換される、反転する、および／または再配置する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ＤＮＡ修復機構により、欠失、挿入、置換、反転、および／または再配置が誘導される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記挿入が、外因性配列、人工配列、および／または異種配列を含む、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４７）
前記挿入を含むゲノム配列が、天然に存在しないものである、項目４６に記載の方法。（項目４８）
項目４０から４７までのいずれか一項に記載の方法に従って改変されたゲノム配列。
（項目４９）
項目４８に記載のゲノム配列を含む細胞。
（項目５０）
前記改変が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて起こる、項目４９に記載の細胞。
（項目５１）
ヒト細胞またはヒト胚細胞ではない、項目４９または５０に記載の細胞。
図１は、細菌株由来のメチルトランスフェラーゼ配列に対してＢＬＡＳＴにより整列させたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のＤＮＡ結合性タンパク質のコンセンサス配列を描いたアラインメントである。配列アラインメントに基づき、配列のＤＮＡ結合機能が示されている。上から下に、配列番号２４８～２８３が示されており、コンセンサス配列ＴＴＥＲＩＶＡＩＧＴＳＴＧＧＴＯＡＬＥＡＶＬＴＡＬＰＲＶＣ（配列番号２８４）。
図２は、ＲＴＮ機能性を示すゲル電気泳動の写真である。
図３は、本開示の代表的なＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ－ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１（ＸＴＣ）空の骨格を描いた構築物マップである。
図４は、本開示の代表的なＸＴＣにクローニングされたＤＮＡ結合性ドメインを描いた構築物マップである。カスタマイズされたＴＡＬＥアレイをＸＴＣ骨格内にクローニングして１６～２０ｂｐ特異的ＤＮＡ配列を標的とすることができる。
図５は、本開示のポリペプチド構築物に対する特異的結合およびエンドヌクレアーゼ活性の効率を確認するためのデュアルレポータープラスミドの使用を描いた概略図である。
図６は、トランスフェクションの２２時間後のＡＡＶＳ１（アデノ随伴ウイルス組込み部位１）ベクターインジケーターのエンドヌクレアーゼ活性を描いた一連の写真である。ＡＡＶＳ１は図５にも描かれている本開示の代表的なデュアルレポータープラスミドである。Ｃｌｏ０５１およびＦｏｋＩのエンドヌクレアーゼ活性はエンドヌクレアーゼを含まない対照と比べて示されている。
図７は、ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１を用いたＣｅｌ１アッセイの結果を描いたゲルの写真である。ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１の切断効率（複製の平均切断効率８．１％）をＴＡＬＥ－ＦｏｋＩの切断効率と比較した。ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１の複製の平均切断効率は、７．１％であったＴＡＬＥ－ＦｏｋＩの複製の平均切断効率と比較して８．１％であった。このように、ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１はＴＡＬＥ－ＦｏｋＩよりも秀でた切断効率を有する。
図８は、本開示に包含されないＴＡＬＥＮに対して、本開示のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ－ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ（ＸＴＮ）ＴＡＬＥＮの相対的なヌクレアーゼ活性を比較するＣｅｌ１アッセイを描いたゲルの写真である。本開示のＸＴＮ ＴＡＬＥＮＳは、本開示に包含されないＴＡＬＥＮより有意に高い活性を有する。
図９は、Ｃｓｙ４－Ｔ２Ａ－Ｃｌｏ０５１－Ｇ４Ｓリンカー－ｄＣａｓ９構築物マップの概略図である。
図１０はＣｌｏ０５１－Ｃａｓ９活性を描く一連の写真である。状態（１）は、この実験で陰性対照として役立つ組合せである非特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびインジケーターと共にトランスフェクトされた（Ｃｌｏ０５１－ｄＣａｓ９をコードする）ｐＣａｇｓＣｌｏ０５１Ｃ４ＲＧＮプラスミドを示す。状態（２）は、ＮＧ－ＡＡＶＳ１－ｇＲＮＡおよびインジケーターと共にトランスフェクトされた（ＣＬｏ０５１－ｄＣａｓ９をコードする）ｐＣａｇｓＣｌｏ０５１Ｃ４ＲＧＮプラスミドを示す。状態（３）は、この実験で陽性対照として役立つ組合せであるＮＧ－ＡＡＶＳ１－ｇＲＮＡおよびインジケーターと共にトランスフェクトされた（ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９をコードする）ｐＣａｇｓＣ４ＲＧＮプラスミドを示す。
図１１は、Ｃｌｏ０５１－ＸＴＮのクローンのアラインメントの写真である。ＡＡＶ１遺伝子座をＣｌｏ０５１－ＸＴＮ処理した試料から増幅し、ＴＯＰＯクローニングし、各試料からの４８クローンを配列決定した。配列決定の結果は、４３のＣｌｏ０５１－ＸＴＮクローンが使用可能な配列を含有することを示した。４３のＣｌｏ０５１－ＸＴＮクローンのうち４つがｉｎｄｅｌ（配列中の塩基の挿入または欠失）をもっており、ｉｎｄｅｌ率は９．３％であった。これら４つのＣｌｏ０５１－ＸＴＮクローンのうちで、１つのクローン（＃４３）が単一の塩基対（１ｂｐ）欠失を有し、２つのクローン（＃１３および３８）が２つの塩基対（２ｂｐ）欠失を有し、１つのクローン（＃２７）が－５２／＋２４のｉｎｄｅｌを有する。上から下に、配列番号２８５～２９３が示されている。
図１２は、ＦｏｋＩ－ＸＴＮのクローンのアラインメントの写真である。ＡＡＶ１遺伝子座をＦｏｋＩ－ＸＴＮ処理した試料から増幅し、ＴＯＰＯクローニングし、各試料からの４８クローンを配列決定した。配列決定の結果は、４６のＦｏｋＩ－ＸＴＮクローンが使用可能な配列を含有することを示した。４６のＦｏｋＩ－ＸＴＮクローンのうちの３つがｉｎｄｅｌ（配列中の塩基の挿入または欠失）を有し、ｉｎｄｅｌ率は６．５％であった。これら３つのユニークなＦｏｋＩ－ＸＴＮクローンのうちで、１つのクローン（＃２４）が単一の塩基対（１ｂｐ）欠失を有し、１つのクローン（＃２１）が５つの塩基対（５ｂｐ）挿入を有し、１つのクローン（＃３５）が－４７／＋４のｉｎｄｅｌを有する。上から下に、配列番号２９４～２９９が示されている。
図１３は、本発明で陽性対照として使用したＸＴＮ－ＦｏｋＩによる処理と比較したときの、ＴＡＬ－ＢｆｉＩ（ＸＴＮ－ＢｆｉＩ）またはＴＡＬ－ＢｍｒＩ（ＸＴＮ－ＢｍｒＩ）で処理したＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクションおよびヌクレアーゼ活性の結果を描く一連の写真である。インジケーターのみの状態を陰性対照として使用した。写真は、インジケーターと共にＡＡＶＳ１ ＸＴＮ（１つまたはＸＴＮ－ＢｆｉＩ、ＸＴＮ－ＢｍｒＩまたはＸＴＮ－ＦｏｋＩ）による細胞のトランスフェクションの３日後に撮った。
タンパク質をゲノム内の特定の遺伝子座に導くための組成物および方法ならびにその使用が開示されている。一態様では、開示されている方法は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む融合タンパク質をもたらすステップを含み、タンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座に導くことを可能にするものである。あるいは、開示されている方法は、非共有結合による連結によって作動可能に連結することが可能なＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子をもたらすステップを含み、タンパク質を生物のゲノム内の特定の遺伝子座に導くことを可能にするものである。この方法のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、特定のＤＮＡ配列に結合することができる。
ＤＮＡ局在化成分
本開示のＤＮＡ局在化成分は、特定のＤＮＡ配列に結合することが可能なものであってよい。ＤＮＡ局在化成分は、例えば、ＤＮＡ結合性オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ結合性タンパク質、ＤＮＡ結合性タンパク質複合体、およびこれらの組合せから選択することができる。他の適切なＤＮＡ結合性成分は、当業者には理解されよう。
ＤＮＡ局在化成分は、ゲノム内の特定の遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）または遺伝子座（ｌｏｃｉ）に導かれるオリゴヌクレオチドを含んでよい。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびこれらの組合せから選択することができる。
ＤＮＡ局在化成分は、標的ＤＮＡに結合するとオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド結合性タンパク質またはタンパク質複合体を含んでよい。タンパク質またはタンパク質複合体は、ＲＮＡ－ＤＮＡヘテロ二重鎖、Ｒ－ループ、またはこれらの組合せから選択される特徴を認識することができるものであってよい。一態様では、ＤＮＡ局在化成分は、Ｃａｓ９、カスケード複合体、ＲｅｃＡ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはこれらの組合せから選択されるＲ－ループを認識することができるタンパク質またはタンパク質複合体を含んでよい。
ＤＮＡ局在化成分は、標的ＤＮＡに結合することができる、工学的に操作されたタンパク質を含んでよい。この態様では、ＤＮＡ局在化成分は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーアレイ、転写活性化因子様（ＴＡＬ）アレイ、およびこれらの組合せから選択されるＤＮＡ配列に結合することができるタンパク質を含んでよい。
ＤＮＡ局在化成分は、天然に存在するＤＮＡ結合性ドメインを含有するタンパク質を含んでよい。ＤＮＡ局在化成分は、例えば、ｂＺＩＰドメイン、へリックス－ループ－へリックス、ヘリックス・ターン・ヘリックス、ＨＭＧ－ボックス、ロイシンジッパー、ジンクフィンガー、またはこれらの組合せから選択される天然に存在するＤＮＡ結合性ドメインを含むタンパク質を含んでよい。
本開示の例示的なＤＮＡ局在化成分としては、これだけに限定されないが、ＤＮＡ結合性オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ結合性タンパク質、ＤＮＡ結合性タンパク質複合体、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
本開示のＤＮＡ局在化成分は、ゲノム内の特定の遺伝子座に導かれるオリゴヌクレオチドを含んでよい。例示的なオリゴヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
本開示のＤＮＡ局在化成分は、ＲＮＡ－ＤＮＡヘテロ二重鎖、Ｒ－ループ、およびそれらの任意の組合せから選択される特徴を認識することができるタンパク質またはタンパク質複合体を含んでよい。Ｒ－ループを認識することができる例示的なタンパク質またはタンパク質複合体としては、これだけに限定されないが、Ｃａｓ９、カスケード複合体、ＲｅｃＡ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。本開示の方法のある特定の実施形態では、Ｒ－ループを認識することができるタンパク質またはタンパク質複合体は、Ｃａｓ９を含む。
本開示のＤＮＡ局在化成分は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーアレイ、ＴＡＬアレイ、およびそれらの任意の組合せから選択されるＤＮＡ配列に結合することができるタンパク質を含んでよい。
本開示のＤＮＡ局在化成分は、天然に存在するＤＮＡ結合性ドメインを含むタンパク質を含んでよい。例示的な天然に存在するＤＮＡ結合性ドメインとしては、これだけに限定されないが、ｂＺＩＰドメイン、へリックス－ループ－へリックス、ヘリックス・ターン・ヘリックス、ＨＭＧ－ボックス、ロイシンジッパー、ジンクフィンガー、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
本開示のＤＮＡ局在化成分は、ゲノム内の標的位置に導かれるオリゴヌクレオチドおよび標的ＤＮＡ配列に結合することができるタンパク質を含んでよい。
エフェクター分子
本開示の方法は、エフェクター分子をもたらすステップを含む。
本開示の例示的なエフェクター分子は、ゲノム内の特定の遺伝子座において所定の効果を及ぼすことができる。
本開示の例示的なエフェクター分子としては、これだけに限定されないが、転写因子（活性化因子または抑制因子）、クロマチンリモデリング因子、ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、ヘリカーゼ、フルオロフォア、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
本開示の例示的なエフェクター分子は、トランスポザーゼを含んでよい。他の態様では、エフェクター分子は、ＰＢトランスポザーゼ（ＰＢａｓｅ）を含んでよい。
本開示の例示的なエフェクター分子は、ヌクレアーゼを含む。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、リョクトウヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、制限エンドヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを含む。
本開示の例示的なエフェクター分子は、エンドヌクレアーゼを含むものであってよい。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩおよびＣｌｏ０５１。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ＢｍｒＩ、ＢｆｉＩ、またはＣｌｏ０５１を含む。エフェクター分子は、ＢｍｒＩを含んでよい。エフェクター分子は、ＢｆｉＩを含んでよい。エフェクター分子は、Ｃｌｏ０５１を含んでよい。
連結
本開示は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる融合タンパク質を提供する。本開示のポリペプチドが融合タンパク質である場合、融合タンパク質の１つまたは複数の成分をコードする核酸配列は、例えば、発現ベクター内で作動可能に連結していてよい。本開示の融合タンパク質は、キメラタンパク質であってよい。本開示の融合タンパク質は、１つまたは複数の組換え核酸配列によってコードされるタンパク質も含んでよい。融合タンパク質は、融合タンパク質の２つの成分を作動可能に連結するためのリンカー領域も含んでよい。例えば、本開示は、リンカー領域によって作動可能に連結したＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる融合タンパク質を提供する。この実施形態では、ＤＮＡ局在化成分、リンカー領域、およびエフェクター分子は、核酸配列の翻訳により融合タンパク質がもたらされるように発現カセットおよび／または発現ベクターに挿入された１つまたは複数の核酸配列によってコードされるものであってよい。
本開示のポリペプチドおよび組成物は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子の間に非共有結合による連結を含んでよい。非共有結合による連結は、抗体、抗体断片、抗体模倣物、または足場タンパク質を含んでよい。
本開示の例示的な非共有結合による連結は、エフェクター分子に共有結合によって付着しており、ＤＮＡ局在化成分に非共有結合によって直接結合する抗体断片を含んでよい。
本開示の例示的な非共有結合による連結は、ＤＮＡ局在化成分に共有結合によって付着しており、エフェクター成分に非共有結合によって直接結合する抗体断片を含んでよい。
本開示の例示的な非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に共有結合によって付着したエピトープタグに非共有結合によって結合する抗体断片を含んでよい。本開示のある特定の実施形態では、抗体断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）、小型モジュール式免疫医薬品（ＳＭＩＰ）分子、またはナノボディを含むまたはそれからなるものであってよい。
本開示の例示的な非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に非共有結合によって結合するタンパク質結合性ドメインを含んでよい。
本開示の例示的な非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に共有結合によって付着したタンパク質に結合することが可能なタンパク質を含んでよい。
本開示の非共有結合による連結は、抗体模倣物を含むまたはそれからなるものであってよい。例示的な抗体模倣物としては、これだけに限定されないが、標的配列に特異的に結合し、天然に存在する抗体とは別個の構造を有する有機化合物が挙げられる。さらに、例示的な抗体模倣物としては、これだけに限定されないが、タンパク質、核酸、または小分子が挙げられる。本開示のある特定の実施形態では、抗体模倣物は、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、およびアビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、またはモノボディを含む、またはそれからなる。
本開示の例示的な非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に共有結合によって付着したタンパク質または他の小分子に非共有結合によって結合する小分子を含んでよい。
抗体およびその断片としては、これだけに限定されないが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）、モノボディ、およびナノボディが挙げられる。例えば、非共有結合による連結は、１つまたは複数のエフェクター分子に共有結合によって付着しており、ＤＮＡ局在化成分と非共有結合によって会合することができる、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）を含んでよい。さらなる態様では、非共有結合による連結は、ＤＮＡ局在化成分に共有結合によって付着しており、エフェクター成分に非共有結合によって直接結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含んでよい。さらなる態様では、非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含んでよい。そこで、ｓｃＦＶは、他方の成分（すなわち、ＤＮＡ局在化成分またはエフェクター分子）に共有結合によって付着したエピトープタグに非共有結合によって結合し得る。
非共有結合による連結は、例えば、抗体模倣物を含んでよい。本明細書で使用される場合、用語「抗体模倣物」は、標的配列に特異的に結合し、天然に存在する抗体とは別個の構造を有する有機化合物を説明するものとする。抗体模倣物は、タンパク質、核酸、または小分子を含み得る。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は、抗原であり得る。抗体模倣物は、これだけに限定されないが、優れた溶解性、組織透過性、熱および酵素素に対する安定性（例えば、酵素による分解に対する抵抗性）、および低産生費用を含めた、抗体よりも優れた性質をもたらすものであり得る。例示的な抗体模倣物としては、これだけに限定されないが、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、およびアビマー（結合活性多量体としても公知）、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリンリピートタンパク質）、フィノマー、クニッツドメインペプチド、およびモノボディが挙げられる。
本開示のアフィボディ分子は、いかなるジスルフィド架橋も伴わない１つまたは複数のアルファヘリックスを含む、またはそれからなるタンパク質足場を含む。本開示のアフィボディ分子は、３つのアルファへリックスを含む、またはそれからなることが好ましい。例えば、本開示のアフィボディ分子は、免疫グロブリン結合性ドメインを含んでよい。本開示のアフィボディ分子は、プロテインＡのＺドメインを含んでよい。
本開示のアフィリン分子は、例えば、ガンマ－Ｂクリスタリンまたはユビキチンのいずれかの露出したアミノ酸の改変によって作製されたタンパク質足場を含む。アフィリン分子は、抗原に対する抗体の親和性を機能的に模倣するが、抗体を構造的に模倣するものではない。アフィリンを作出するために使用される任意のタンパク質足場では、適正にフォールディングされたタンパク質分子内で溶媒または可能性のある結合パートナーと接触可能なこれらのアミノ酸が、露出したアミノ酸とみなされる。これらの露出したアミノ酸の任意の１つまたは複数を、標的または抗原配列に特異的に結合するように改変することができる。
本開示のアフィマー分子は、特定の標的配列に対する高親和性結合性部位をもたらすペプチドループを示すように工学的に操作された高度に安定なタンパク質を含むタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、シスタチンタンパク質またはその三次構造に基づくタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、逆平行ベータ－シートの上部に位置するアルファヘリックスを含む、一般的な三次構造を共有し得る。
本開示のアフィチン分子は、人工タンパク質足場を含み、その構造は、例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来するものであってよい。本開示のアフィチンは、抗原の全体または一部であり得る標的配列に選択的に結合する。本開示の例示的なアフィチンは、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合表面上の１つまたは複数のアミノ酸配列をランダム化し、得られたタンパク質をリボソームディスプレイおよび選択に供することによって製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、例えば、ペプチド、タンパク質、ウイルス、または細菌のゲノム内または表面上に見出すことができる。本開示のある特定の実施形態では、アフィチン分子を、酵素の特異的阻害剤として使用することができる。本開示のアフィチン分子は、熱抵抗性タンパク質またはその誘導体を含んでよい。
本開示のアルファボディ分子は、細胞透過性アルファボディ（ＣＰＡＢ）とも称することもできる。本開示のアルファボディ分子は、種々の標的配列（抗原を含む）に結合する小さなタンパク質（一般には１０ｋＤａ未満）を含む。アルファボディ分子は、細胞内の標的配列に到達し、結合することができる。構造的には、本開示のアルファボディ分子は、単鎖アルファヘリックス（天然に存在するコイルドコイル構造と同様のもの）を形成する人工的な配列を含む。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するように改変された１つまたは複数のアミノ酸を含むタンパク質足場を含んでよい。分子の結合特異性にかかわらず、本開示のアルファボディ分子は、正確なフォールディングおよび耐熱性を維持する。
本開示のアンチカリン分子は、タンパク質内または小分子内のいずれかの標的配列または部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリンに由来する人工タンパク質を含んでよい。本開示のアンチカリン分子は、例えば、モノクローナル抗体またはその断片の代わりに使用することができる。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体またはその断片よりも優れた組織透過性および耐熱性を示し得る。本開示の例示的なアンチカリン分子は、約１８０アミノ酸を含み、およそ２０ｋＤａの質量を有するものであってよい。構造的には、本開示のアンチカリン分子は、ループによって接続された逆平行ベータ鎖および付着したアルファヘリックスで構成されるバレル構造を含む。好ましい実施形態では、本開示のアンチカリン分子は、ループによって接続された８つの逆平行ベータ鎖および付着したアルファヘリックスで構成されるバレル構造を含む。
本開示のアビマー分子は、標的配列（同じく抗原であり得る）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同じ標的内または別個の標的内の多数の結合性部位を認識し得る。本開示のアビマーが１つ超の標的を認識するものである場合、アビマーは、二重特異性抗体の機能を模倣する。人工タンパク質アビマーは、それぞれおよそ３０～３５アミノ酸である、２つまたはそれ超のペプチド配列を含んでよい。これらのペプチドは、１つまたは複数のリンカーペプチドで接続されていてよい。アビマーのペプチドの１つまたは複数のアミノ酸配列は、膜受容体のＡドメインに由来するものであってよい。アビマーは、場合によりジスルフィド結合および／またはカルシウムを含み得る、強固な構造を有する。本開示のアビマーは、抗体と比較して大きな熱安定性を示し得る。
本開示のＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリンリピートタンパク質）は、標的配列に対して高い特異性および高い親和性を有する遺伝子操作された組換えまたはキメラタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＤＡＲＰｉｎは、アンキリンタンパク質に由来し、場合により、アンキリンタンパク質の少なくとも３つの反復モチーフ（反復構造単位とも称される）を含む。アンキリンタンパク質は、高親和性タンパク質間相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは、大きな標的相互作用表面を含む。
本開示のフィノマーは、ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに由来し、標的配列および分子に抗体と同等の親和性および同等の特異性で結合するように工学的に操作された、小さな結合性タンパク質（約７ｋＤａ）を含む。
本開示のクニッツドメインペプチドは、クニッツドメインを含むタンパク質足場を含む。クニッツドメインは、プロテアーゼ活性を阻害するための活性部位を含む。構造的には、本開示のクニッツドメインは、ジスルフィドリッチアルファ＋ベータフォールディングを含む。この構造は、ウシ膵臓トリプシン阻害物質によって例示される。クニッツドメインペプチドは、特定のタンパク質構造を認識し、競合的なプロテアーゼ阻害剤として機能する。本開示のクニッツドメインは、エカランチド（ヒトリポタンパク質関連凝固阻害因子（ＬＡＣＩ）に由来する）を含み得る。
本開示のモノボディは、単鎖抗体と同等のサイズの小さなタンパク質である（約９４アミノ酸で構成され、約１０ｋＤａの質量を有する）。これらの遺伝子操作されたタンパク質は、抗原を含めた標的配列に特異的に結合する。本開示のモノボディは、１つまたは複数の別個のタンパク質または標的配列を特異的に標的とし得る。好ましい実施形態では、本開示のモノボディは、ヒトフィブロネクチンの構造を模倣し、より好ましくはフィブロネクチンの第１０の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造を模倣するタンパク質足場を含む。フィブロネクチンの第１０の細胞外ＩＩＩ型ドメイン、ならびにそのモノボディ模倣物は、バレルを形成する７つのベータシート、および抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する各側面上の３つの露出したループを含有する。抗体の可変ドメインの構造とは対照的に、モノボディは、金属イオンに対するいかなる結合性部位も欠き、中心的なジスルフィド結合も欠く。多重特異性モノボディは、ループＢＣおよびＦＧを改変することによって最適化することができる。本開示のモノボディは、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）を含み得る。
非共有結合による連結は、例えば、足場タンパク質を含んでよい。本開示の足場タンパク質としては、例えば、本開示の抗体模倣物が挙げられる。本開示の足場タンパク質は、例えば、小型モジュール式免疫医薬品（ＳＭＩＰ）分子、ドメイン抗体、およびナノボディをさらに含む。
本開示のＳＭＩＰ分子は、免疫グロブリン（抗体）の１つまたは複数の配列または部分を含む標的配列または抗原に対して単一特異性である人工タンパク質である。本開示のＳＭＩＰをモノクローナル抗体の使用の代わりにすることができる。構造的には、ＳＭＩＰは、結合性領域、ヒンジ領域（すなわち、コネクター）、およびエフェクタードメインを含む単鎖タンパク質である。ＳＭＩＰの結合性領域は、改変された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含んでよい。ＳＭＩＰは、遺伝子改変細胞から二量体として作製することができる。
本開示のドメイン抗体は、単一のモノマー性可変抗体ドメイン（すなわち、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれか）を含む。本開示のドメイン抗体は、全抗体およびインタクトな抗体と同じ抗原特異性を示す。本開示のドメイン抗体は、少なくとも一部において、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカまたはサメを所望の抗原で免疫し、その後、重鎖抗体をコードするｍＲＮＡを単離することによって製造することができる。
本開示のナノボディは、ＶＨＨ単一ドメイン抗体を含む。本開示のナノボディは、本開示の単一ドメイン抗体を含み得る。
非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分と非共有結合によって相互作用することができきるタンパク質結合性ドメインを含んでよい。タンパク質結合性ドメインの非限定的な例としては、例えば、ＳＨ２、ＳＨ３、ＰＴＢ、ＬＩＭ、ＳＡＭ、ＰＤＺ、ＦＥＲＭ、ＣＨ、Ｐｌｅｃｋｓｔｉｎ、ＷＷ、ＷＳｘＷＳ、およびＥ３リガーゼドメインが挙げられる。
非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に共有結合によって付着したタンパク質に結合することが可能なタンパク質を含んでよい。非限定的な例として、非共有結合によって相互作用する任意の２つタンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質は、Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＤＩＰ）、ＳＴＲＩＮＧ、ＢｉｏＧＲＩＤ、ＭＩＰＳなどによって容易に同定される。
非共有結合による連結は、エフェクター分子またはＤＮＡ局在化成分のいずれかに共有結合によって付着しており、他方の成分に共有結合によって付着したタンパク質または他の小分子と非共有結合を形成することができる小分子を含んでよい。そのような例の１つとしては、オリゴヌクレオチドに付着したビオチンおよびエフェクター分子に共有結合によって連結したアビジンが挙げられる。
上記の方法および組成物は、例えば、特定のタンパク質がいくつかの機能を有し得る状況において使用することができる。例えば、トランスポザーゼタンパク質は、所望の機能を実現するために、トランスポゾンを認識するステップ、ＤＮＡを切断してトランスポゾンを切り取るステップ、トランスポゾン配列を新しい遺伝子位置に移動させるステップ、新しい標的部位を認識するステップ、およびＤＮＡを切断して新しい遺伝子座にトランスポゾンを組み込むステップを含めたいくつかのステップを行わなければならない。ある特定の態様では、トランスポザーゼを、トランスポゾンをゲノム内の特定の部位に組み込むように導くことが望ましい場合がある。これらの態様では、これは、例えば、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する異種タンパク質を付加することによって行うことができる。しかし、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する異種タンパク質は、標的部位認識ステップにおいてのみ必要になり、上記の過程のより早い段階でこのタンパク質が存在することは、他のステップでは有害になり得る。そのように、この態様では、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する異種タンパク質とトランスポザーゼの一過性の会合により、トランスポザーゼをゲノムの目的の部位に導くことが可能になると同時に、過程の他のステップを、非共有結合に起因するタンパク質の干渉を限定して行うことが可能になる。
別の例として、例えばヌクレアーゼ、メチラーゼ、脱アセチル化酵素などの酵素タンパク質を、ゲノム内の特定の場所で活性が生じるように、特定のＤＮＡ結合性ドメインと一時的に相互作用させることが望ましい場合がある。例えば、Ｃｌｏ０５１制限ヌクレアーゼを、ＤＮＡ切断に関して触媒として不活性なＣａｓ９タンパク質と一時的に相互作用させることが望ましい場合がある。
一態様では、リンカーは、ＤＮＡ結合性エレメントとエフェクターの間の非共有結合による連結を含む。例えば、一態様では、ファージディスプレイ（ＰｈＤ）を使用して、特定の標的に対する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を作製することができる。ＰｈＤを使用して、連結をもたらす、エフェクター、例えばＰｉｇｇｙ ＢＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼに対するｓｃＦｖ抗体を同定することができる。親和性選択過程のストリンジェンシーを限定することにより、ｓｃＦｖ親和性の大きな多様性を得ることができる。一態様では、連結は、ＰＢトランスポザーゼ（ＰＢａｓｅ）と、多指ジンクフィンガー、ＴＡＬアレイ、またはｄＣａｓ９タンパク質（会合したガイドＲＮＡを伴う）などのモジュール式ＤＮＡ結合性ドメインの間のものであってよい。一部の態様では、解離速度がより速いｓｃＦｖ抗体により、許容される複合体の「ゆらぎ」が生じ得る。他の態様では、エフェクターおよびＤＮＡ結合性エレメントのコンフォメーションおよび／または柔軟性が重大になり得る。非共有結合による連結により、開示されている遺伝子編集組成物にコンフォメーションのしなやかさがもたらされ得る。あるいは、エフェクターの特定のエピトープに結合するｓｃＦｖの解離速度がより遅い（Ｋｄがより高い）ことにより、従来のペプチド連結によっては得られない、遺伝子編集複合体の最適な安定性およびコンフォメーションがもたらされ得る。ｓｃＦｖ抗体をほぼ徹底的に検索することにより、多様性の大きな可能性のある遺伝子編集複合体のコンフォメーションの中からの選択が可能になる。ＰｈＤ戦略では、多数の独特のエピトープに対する独特の一価ｓｃＦｖの生成を通じて、そのような多様性が創出される。
さらに、ｓｃＦｖ抗体の使用によって実現されるものなどの、非共有結合による連結方法では、改変されていないネイティブなエフェクター（例えば、ＰＢ）を使用することができる。これにより、共有結合による連結に供された際に生じ得るエフェクターの活性へのいかなる恒久的な干渉も回避することができる、エフェクターとＤＮＡ結合性エレメントの間の可逆的会合がもたらされる。ある特定の非共有結合による会合により、エフェクター反応を損なう立体的な障害が導入される可能性がある。いくつかの活性が関与し得るので（部位認識、鎖切断、トランスポゾン結合および組み込み）、別々のステップのそれぞれが特定の立体的な障害の影響を、異なる形で受ける可能性がある。例えば、トランスポザーゼとＤＮＡトランスポゾンの会合（ゲノムの１つの部位から別の部位へのトランスポゾン動員の間）の解離速度が非常に遅い場合、ＤＮＡ結合性エレメント－ｓｃＦｖ間の親和性が非常に高い会合およびこの会合を破壊するＰＢａｓｅが有害になり得る。しかし、ＤＮＡ結合性エレメント－ｓｃＦｖタンパク質が、より低いが有意な親和性で結合している場合、トランスポゾン動員の間、一時的に置き換えることができる。そのような初期のステップにＰＢａｓｅを用いたＤＮＡ結合性因子－ｓｃＦｖの一過性解離を含め、その後、後のステップで複合体を再集合させて、完全に機能的でありＤＮＡ結合性因子が使用可能な部位特異的トランスポザーゼを創出することが可能である。
二重レポータープラスミド
ヌクレアーゼを含むポリペプチドの、標的化部位においてＤＮＡを切断（cut）する効率を確認するために、本開示のポリペプチドを二重レポータープラスミドに導入することができる。
図５は、標的配列へのポリペプチド特異的結合の効率およびその後の、その部位におけるエンドヌクレアーゼ活性を確認するために使用することができる、本開示の例示的な二重レポータープラスミドの使用を示す。図５に示され、実施例８においてさらに記載されているプラスミドに応じて、構成的レポーターの制御下での赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の発現により、プラスミドのトランスフェクション効率が例示される。図５に示され、実施例８においてさらに記載されているプラスミドに応じて、標的化二本鎖切断およびその後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復による修復によって誘導される活性である、プロモーターの制御下での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現により、プラスミドのカスタマイズされた標的配列を特異的に標的とする本開示のポリペプチドのヌクレアーゼ活性の有効性が例示される。
図６は、エンドヌクレアーゼを含まない対照と比較した、少なくともＣｌｏ０５１またはＦｏｋＩのいずれかのヌクレアーゼドメインを含有するＡＡＶＳ１ベクターのエンドヌクレアーゼ活性を実証する。上の行の写真の中で、構成的レポーターの制御下での赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の発現により、プラスミドのトランスフェクション効率が例示される。陽性対照と比較して、Ｃｌｏ０５１を含有するベクターにより、ＦｏｋＩを含有するベクターと比較して優れたトランスフェクション効率が実証される。下の行の写真の中で、標的化二本鎖切断およびその後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復による修復によって誘導される活性である、プロモーターの制御下での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現により、エンドヌクレアーゼドメインを欠く陰性対照と比較した、Ｃｌｏ０５１またはＦｏｋＩのいずれかのヌクレアーゼ活性の有効性が例示される。陰性対照と比較して、Ｃｌｏ０５１を含有するベクターでは、ＦｏｋＩを含有するベクターと比較して大きなヌクレアーゼ活性が実証される。
Ｃａｓ９構築物
本開示のポリペプチドは、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる融合タンパク質である。あるいは、ポリペプチドは、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子は、共有結合または非共有結合による連結によって作動可能に連結することができる。
本開示の組成物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ局在化成分は、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、エフェクターは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、本開示のエフェクターは、エンドヌクレアーゼホモ二量体またはヘテロ二量体を含むものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクターは、ある形態のＣａｓ９およびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ、あるいは、２つの別個のＩＩ型の触媒ドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるエンドヌクレアーゼホモ二量体またはヘテロ二量体を含むものであってよい。ある特定の実施形態では、エフェクターは、２つの同一のＩＩ型エンドヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなるエンドヌクレアーゼホモ二量体を含むものであってよい。
例示的なＣａｓ９構築物は、触媒として不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）およびエフェクターを含んでよい。例えば、本開示のＣａｓ９構築物は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含んでよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ＢｍｒＩ、ＢｆｉＩ、またはＣｌｏ０５１を含む。ある特定の実施形態では、エフェクターは、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むホモ二量体を含む。
例示的なＣａｓ９構築物は、触媒として不活性な小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）およびエフェクターを含んでよい。例えば、本開示のＣａｓ９構築物は、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含んでよい。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、ＢｍｒＩ、ＢｆｉＩ、またはＣｌｏ０５１を含む。ある特定の実施形態では、エフェクターは、これだけに限定されないが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６ＩまたはＣｌｏ０５１を含めたＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むホモ二量体を含む。
小型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）（配列番号２０）と全長Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（配列番号２１）のアラインメント
Figure 0007170090000001
Figure 0007170090000002
Figure 0007170090000003
 小型Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）
本開示は、エフェクターと作動可能に連結した小型Ｃａｓ９（Ｃａｓ９）を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる融合タンパク質であって、エフェクターが、小型Ｃａｓ９（Ｃａｓ９）を含む、融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の小型Ｃａｓ９構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含んでよい。
活性な触媒部位を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９のアミノ酸配列。
Figure 0007170090000004
Figure 0007170090000005
不活化小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）
本開示は、エフェクターと作動可能に連結した不活化小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる融合タンパク質であって、エフェクターが、小型不活化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む、融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の小型不活化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含んでよい。
ｄＳａＣａｓ９配列：Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ突然変異（太字、大文字、および下線）により、触媒部位が不活化される。
Figure 0007170090000006
例示的な本開示のＣａｓ９構築物としては、これだけに限定されないが、Ｃｌｏ０５１－Ｃａｓ９が挙げられる。図９は、本開示の例示的なベクターであるＣｓｙ４－Ｔ２Ａ－Ｃｌｏ０５１－Ｇ４Ｓリンカー－ｄＣａｓ９の構築物マップを提示する。この構築物の対応するアミノ酸配列を以下に提示する：
Figure 0007170090000007
Figure 0007170090000008
図１０は、本開示のＣｓｙ４－Ｔ２Ａ－Ｃｌｏ０５１－Ｇ４Ｓリンカー－ｄＣａｓ９構築物を含めた例示的なＣｌｏ０５１－Ｃａｓ９構築物が活性であることを実証する。
Ｃａｓ９は、これだけに限定されないが、Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩおよびＢｍｒＩを含めた任意のヌクレアーゼと組み合わせることができる。Ｃｌｏ０５１、ＢｆｉＩおよびＢｍｒＩのヌクレアーゼドメインの例示的な配列が以下に提供される。
例示的なＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、
Figure 0007170090000009
Figure 0007170090000010
 のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
例示的なＢｆｉＩヌクレアーゼドメインは、触媒残基がＨ１０５、Ｋ１０７、Ｎ１２５、およびＥ１３６を含む以下のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい：
Figure 0007170090000011
例示的なＢｍｒＩヌクレアーゼドメインは、触媒残基がＨ１０５、Ｋ１０７、Ｎ１２５、およびＥ１３６を含む以下のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい：
Figure 0007170090000012
 転写活性化因子様（ＴＡＬ）タンパク質
プログラム可能なＤＮＡ結合性ドメインを有する転写因子により、内因性の系において外因性の生物学的回路を創出し、所定のＤＮＡ配列または個々の核酸に結合するデザイナータンパク質を創出する手段がもたらされる。転写活性化因子様（ＴＡＬ）タンパク質、または、より詳細には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）においてモジュール式ＤＮＡ結合性ドメインが同定されており、それにより、目的のＤＮＡ配列に結合する合成転写因子を新規に創出することが可能になり、望ましい場合には、タンパク質またはポリペプチド上に存在する、ＤＮＡに関連する活性をなす第２のドメインも可能になる。ＴＡＬタンパク質は、生物ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓおよびＲａｌｓｔｏｎｉａから得られている。
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
本開示は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓアミノ酸配列またはそれに関連するアミノ酸配列に由来するポリペプチド、それをコードする核酸、それを含む組成物、それを含むキット、それを含む非ヒトトランスジェニック動物、およびそれの使用方法を提供する。
本明細書に記載の通り、ＴＡＬタンパク質を含めた、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のエフェクタータンパク質を、より大きな標的化キメラタンパク質の一部（すなわち、キメラタンパク質の成分）として使用することができる。ＴＡＬタンパク質または任意のその成分を含む、またはそれからなるものを含めた、本開示のキメラエフェクタータンパク質は、ヌクレアーゼ活性などの核酸に関連するアクセサリー活性を示し得る。例えば、一部の実施形態では、ゲノムの工学的操作において相同組換えを容易にすることができるポリペプチドまたはプロヌクレアーゼ（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｓｅ）をキメラタンパク質の成分として使用することができる。ある特定の実施形態では、転写因子をキメラタンパク質の成分として使用し、それにより、得られるキメラタンパク質を、非常に高いレベルの特異性が必要とされる治療用組成物およびその使用（病原体（例えば、ウイルス）を対象とする治療用組成物およびその使用を含む）に特に有用なものにすることができる。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓにおいて見出されるポリペプチドまたはタンパク質に由来するものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓにおいて見出されるポリペプチドまたはタンパク質のいずれとも同一ではなく、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓに天然に存在するものでもない１つまたは複数の配列を含有してよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも第１のドメインおよび第２のドメインを含んでよく、第１のドメインは、少なくとも１つの核酸認識エレメントのコード配列を含み、第２のドメインは、少なくとも１つの核酸エフェクターエレメントのコード配列を含む。
本開示は、好ましいＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ－ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１（ＸＴＣ）ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、Ｃｌｏ０５１エンドヌクレアーゼと融合したＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のＴＡＬ ＤＮＡ結合性ドメインを含む。
図３および４は、ＸＴＣポリペプチドについての例示的な空の骨格およびクローニングされたＤＮＡ結合性ドメインに対応する構築物マップを提示する。
ＸＴＣポリペプチドのある特定の実施形態では、Ｎ末端ドメイン配列は、３ｘＦＬＡＧ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ内にＴ７プロモーターおよび核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬ ＤＮＡ結合性ドメインをコードするアミノ酸配列は、
「MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHRGVPMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLN」（配列番号２８）
を含み、配列「MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK」（配列番号２９）は、３ｘＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグであり、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬ ＤＮＡ結合性ドメインは、配列
「MAPKKKRKVGIHRGVPMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLN」（配列番号３０）
によってコードされる。
ＸＴＣポリペプチドのＣ末端ドメイン配列は、４つの潜在的な配列のうちの１つを含んでよい。可変アミノ酸位は、文字「Ｘ」で示される。ＸＴＣ Ｃ末端ドメインのコンセンサス配列は、
Figure 0007170090000013
 を含み、太字の「ＸＸＸ」位は、可変である。
ＸＴＣ Ｃ末端ドメインの配列の第１の実施形態では、ＸＸＸ可変アミノ酸は、「ＮＮＮ」であり、グリシン（Ｇ）を指定する。ＸＴＣ Ｃ末端ドメインの配列の第１の実施形態の完全な配列は、
Figure 0007170090000014
 である。
ＸＴＣ Ｃ末端ドメインの配列の第２の実施形態では、ＸＸＸ可変アミノ酸は、「ＳＮＧ」であり、トレオニン（Ｔ）を指定する。ＸＴＣ Ｃ末端ドメインの配列の第２の実施形態の完全な配列は、
Figure 0007170090000015
 である。
ＸＴＣ Ｃ末端ドメインの配列の第３の実施形態では、ＸＸＸ可変アミノ酸は、「ＳＨＤ」であり、システイン（Ｃ）を指定する。ＸＴＣ Ｃ末端ドメインの配列の第３の実施形態の完全な配列は、
Figure 0007170090000016
 である。
ＸＴＣ Ｃ末端ドメインの配列の第４の実施形態では、ＸＸＸ可変アミノ酸は、「ＳＮＩ」であり、アラニン（Ａ）を指定する。ＸＴＣ Ｃ末端ドメインの配列の第４の実施形態の完全な配列は、
Figure 0007170090000017
 である。
本開示の好ましいＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ－ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１（ＸＴＣ）ポリペプチドは、
「EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKY」（配列番号３６）のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインを含む。
図７に示されている通り、例えば、ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１を含めた本開示のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ－ＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１（ＸＴＣ）ポリペプチドは、ＴＡＬＥ－ＦｏｋＩと比較して優れた切断効率を示す。本実験では、エンドヌクレアーゼ活性（切断効率）を、ＣＥＬ ＩミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイにおいてＴＡＬＥ－Ｃｌｏ０５１またはＴＡＬＥ－ＦｏｋＩのいずれかを使用して決定した。ＣｅｌＩアッセイは、Kulinskiら、The CEL I Enzymatic Mutation Detection Assay、BioTechniques２９巻（１号）：４４～４８頁（２０００年７月）においてより詳細に記載されている（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、図８は、別の、同じくＣＥＬ Ｉアッセイによって実証された、本開示のＸＴＮ ＴＡＬＥＮ組成物と本開示に包含されない代替ＴＡＬＥＮ構築物の間のエンドヌクレアーゼ活性の比較を示す。
図８に示されているアッセイの結果から、本開示のＸＴＮ ＴＡＬＥＮＳは、当技術分野で公知のＴＡＬＥＮＳよりも有意に高い活性を有する。
図１１は、ＸＴＮ－Ｃｌｏ０５１クローン（本開示のＸＴＣポリペプチドをコードする）のアラインメントを示す。配列解析により、これらのクローンのＤＮＡ配列における低率の挿入または欠失（ｉｎｄｅｌ）が明らかになった。
本開示のＸＴＮ組成物は、これだけに限定されないが、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ－ＴＡＬＥ－ＢｆｉＩおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ－ＴＡＬＥ－ＢｍｒＩを含めた任意のエンドヌクレアーゼを含んでよい。ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされたこれらのＸＴＮ組成物の活性は図１３に示されている。
例示的なＢｆｉＩヌクレアーゼドメインは、触媒残基がＨ１０５、Ｋ１０７、Ｎ１２５、およびＥ１３６を含む以下のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい：
Figure 0007170090000018
例示的なＢｍｒＩヌクレアーゼドメインは、触媒残基がＨ１０５、Ｋ１０７、Ｎ１２５、およびＥ１３６を含む以下のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい：
Figure 0007170090000019
Figure 0007170090000020
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ
本開示は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａアミノ酸配列またはそれに関連するアミノ酸配列に由来するポリペプチド、それをコードする核酸、それを含む組成物、それを含むキット、それを含む非ヒトトランスジェニック動物、およびそれの使用方法を提供する。
Ｒａｌｓｔｏｎｉａエフェクターの反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）（ＲＶＤｓ）は、それらの標的部位のヌクレオチドに、直接、直線的に、１つのヌクレオチドに対して１つのＲＶＤで対応し、いくらかの縮重を伴い、明らかな文脈依存性は伴わない。この所見は、新しい標的特異的Ｒａｌｓｔｏｎｉａエフェクターの標的部位の予測を可能にするタンパク質－ＤＮＡ認識の機構を表すものである。
本明細書に記載の通り、ＴＡＬタンパク質を含めた、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するエフェクタータンパク質は、より大きな標的化キメラタンパク質の一部（すなわち、キメラタンパク質の成分）として使用することができる。ＴＡＬタンパク質または任意のその成分を含む、またはそれからなるものを含めた、本開示のキメラエフェクタータンパク質は、ヌクレアーゼ活性などの核酸に関連するアクセサリー活性を示し得る。例えば、一部の実施形態では、ゲノムの工学的操作において相同組換えを容易にすることができるポリペプチドまたはプロヌクレアーゼをキメラタンパク質の成分として使用することができる。ある特定の実施形態では、転写因子をキメラタンパク質の成分として使用し、それにより、得られるキメラタンパク質を、非常に高いレベルの特異性が必要とされる治療用組成物およびその使用（病原体（例えば、ウイルス）を対象とする治療用組成物およびその使用を含む）に特に有用なものにすることができる。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａにおいて見出されるポリペプチドまたはタンパク質に由来するものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａにおいて見出されるポリペプチドまたはタンパク質のいずれとも同一ではなく、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに天然に存在するものでもない１つまたは複数の配列を含有してよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも第１のドメインおよび第２のドメインを含んでよく、第１のドメインは、少なくとも１つの核酸認識エレメントのコード配列を含み、第２のドメインは、少なくとも１つの核酸エフェクターエレメントのコード配列を含む。
本開示全体を通して使用される場合、用語「ＲＴＮ」は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥヌクレアーゼを指す。本開示のＲＴＮは、少なくとも第１のドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質であって、第１のドメインが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するアミノ酸配列に由来する少なくとも１つの核酸認識エレメントのコード配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。本開示のＲＴＮは、少なくとも第１のドメインおよび第２のドメインを含む本発明のポリペプチドまたはタンパク質であって、第１のドメインが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するアミノ酸配列に由来する少なくとも１つの核酸認識エレメントのコード配列を含み、第２のドメインが、エフェクタータンパク質であるアミノ酸を含むポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。本開示のＲＴＮは、少なくとも第１のドメインおよび第２のドメインを含む本発明のポリペプチドまたはタンパク質であって、第１のドメインが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａに由来するアミノ酸配列に由来する少なくとも１つの核酸認識エレメントのコード配列を含み、第２のドメインが、ヌクレアーゼであるアミノ酸を含むポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。
ＲＴＮ ＤＮＡ結合特異性は、ＤＮＡ結合性ドメインにおける反復ドメインの数および順序に依存する。例えば、反復は、約３０アミノ酸から約４０アミノ酸までを含んでよい。あるいは、反復は、約３２アミノ酸から約３８アミノ酸まで、約３３アミノ酸から約３７アミノ酸まで、約３４アミノ酸から約３５アミノ酸まで、約３３アミノ酸から約３６アミノ酸まで、または約３３アミノ酸から約３５アミノ酸までを含んでよい。反復は、３４～３５アミノ酸からなってよい、３３～３５アミノ酸からなってよい、または３４～３６アミノ酸からなってよい。
本開示の反復ドメインのヌクレオチド結合特異性は、各反復ドメインの１２アミノ酸および１３アミノ酸によって決定することができる。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、以下：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、およびＧＳから選択される少なくとも１つのＲＶＤ配列を含んでよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、以下：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧおよびＧＳから選択される少なくとも１つのＲＶＤ配列を任意の組合せで含んでよく、ここで、ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、およびＮＨは、任意の核酸塩基に結合し、ＮＴ、ＮＫ、およびＮＮは、アデニンに結合し、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、およびＨＨは、アデニンおよび／またはグアニンに結合し、ＮＧは、チミンに結合し、ＲＮ、ＲＳ、およびＧＳは、グアニンに結合する。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、以下：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧおよびＧＳから選択される少なくとも１つのＲＶＤ配列を任意の組合せで含んでよく、ここで、ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、およびＮＨは、任意の核酸塩基に結合し、ＮＫは、グアニンに結合し、ＮＮは、アデニンまたはグアニンに結合し、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、およびＨＨは、シトシンに結合し、ＮＧは、チミンに結合し、ＲＮ、ＲＳ、およびＧＳは、グアニンに結合する。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、以下：ＳＩ、ＳＮ、ＳＨ、ＮＰ、ＮＨ、ＮＴ、ＮＫ、ＮＮ、ＮＤ、ＨＮ、ＨＹ、ＨＤ、ＨＨ、ＲＮ、ＲＳ、ＮＧおよびＧＳから選択される少なくとも１つのＲＶＤ配列を任意の組合せで含んでよく、ここで、ＳＩは、アデニンに結合し、ＳＮは、グアニンおよび／またはアデニンに結合し、ＳＨ、ＮＰ、およびＮＨは、任意の核酸塩基に結合し、ＮＫは、グアニンに結合し、ＮＮは、アデニンおよび／またはグアニンに結合し、ＮＤは、シトシンに結合し、ＨＮは、グアニンに結合し、ＨＹ、ＨＤ、およびＨＨは、シトシンに結合し、ＮＧは、チミンに結合し、ＲＮは、グアニンおよび／またはアデニンに結合し、ＲＳおよびＧＳは、グアニンに結合する。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つのＲＶＤ配列を任意の組合せで含んでよく、ここで、ＲＶＤ配列の少なくとも１つは、ＮＰ、ＮＤ、またはＨＮであり、ＮＰは、シトシン、アデニン、およびグアニンに結合し、ＮＤは、シトシンに結合し、ＨＮは、アデニンおよび／またはグアニンに結合する。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ここで、Ｘ１Ｘ２は、単一の核酸に結合する。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ここで、Ｘ１Ｘ２は、少なくとも１つの核酸に結合する。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASX1X2GGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよく、ここで、Ｘ１＝天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸であり、Ｘ２＝天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸である。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASX1X2GGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよく、ここで、任意の組合せで、Ｘ１およびＸ２は、独立に、可変性であり、Ｘ１＝Ａ、Ｎ、Ｈ、ＲまたはＧであり、Ｘ２＝Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｄ、Ｓ、またはＰである。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASX1X2GGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよく、ここで、Ｘ１＝ＳおよびＸ２＝Ｉである。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASX1X2GGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよく、ここで、Ｘ１＝ＳおよびＸ２＝Ｎである。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９２％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９３％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９４％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９６％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を含むものであってよい。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を含むものであってよく、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択されるポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸置換のうちの１つ超を含む。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むものであってよく、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択されるポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸置換のうちの１つ超を含む。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を含むものであってよく、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択されるポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸置換のうちの１つ超を含む。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９９％の配列同一性を含むものであってよく、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９から選択されるポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸置換のうちの１つ超を含む。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むポリペプチドから選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチド配列を含んでよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASSIGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号２）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASSNGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASSHGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号４）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASNPGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号５）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASNHGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号６）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASNTGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号７）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASNKGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号８）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASNPGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号９）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASNNGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１０）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASNDGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASNGGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１２）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASHNGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１３）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASHYGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１４）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASHDGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１５）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASHHGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１６）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASRNGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１７）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASRSGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１８）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、
LSTEQVVAIASGSGGKQALEAVKAQLLVLRAAPYE（配列番号１９）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の任意の組合せを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の任意の組合せを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ここで、ポリペプチド配列の少なくとも１つの１２番目のアミノ酸および１３番目のアミノ酸が少なくとも１つの核酸に結合する。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるポリペプチドに対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の任意の組合せを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、第１のドメインおよび第２のドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ここで、第１のドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるポリペプチドに対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の少なくとも１つの組合せを含む、それから本質的になる、またはそれからなる核酸認識ドメインである。
本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、第１のドメインおよび第２のドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよく、ここで、第１のドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から選択されるポリペプチドに対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列の少なくとも１つの組合せを含む、それから本質的になる、またはそれからなる核酸認識ドメインであり、少なくとも１つのポリペプチド配列の１２番目のアミノ酸および１３番目のアミノ酸が核酸に結合する。
本開示は、上記のポリペプチドまたはタンパク質の任意の１つまたは複数をコードする核酸も提供する。本開示の核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むポリペプチドから選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ超のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、それから本質的に構成される、またはそれからなるものであってよい。
組成物
本開示は、本明細書に記載の任意のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示の組成物は、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の組成物は、複数の（すなわち、１つまたは複数の）、本明細書に記載の任意のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。本開示の組成物は、複数の（すなわち、１つまたは複数の）、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであってよい。
本開示は、本開示のタンパク質の任意の１つまたは複数をコードする本開示の核酸配列の任意の１つまたは複数を含む、それから本質的になる、またはそれからなるベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスである。本開示のレトロウイルスベクターは、例えば、長い末端反復、ｐｓｉパッケージングシグナル、クローニング部位、および選択マーカーをコードする配列を含んでよい。
本開示は、本開示の核酸またはベクターの任意の１つまたは複数を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、精子または卵である。
本開示は、本開示のタンパク質の任意の１つまたは複数をコードする核酸を含むベクターを含むキットを提供する。
本開示は、本開示のタンパク質の任意の１つまたは複数をコードする核酸分子を含む非ヒト、トランスジェニック動物を提供する。
本開示の生物は、単細胞（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ）または多細胞である。多細胞生物としては、これだけに限定されないが、脊椎動物を挙げることができる。例示的な脊椎動物としては、これだけに限定されないが、哺乳動物を挙げることができる。例示的な脊椎動物としては、これだけに限定されないが、非ヒト哺乳動物を挙げることができる。
発現カセットおよびベクター
本発明のＤＮＡ配列は、これだけに限定されないが、細菌、真菌、藻類、植物、および動物を含めた任意の目的の原核細胞または真核細胞および／または生物における発現のための発現カセットとして提供することができる。例示的なカセットは、本発明のＤＮＡ配列に作動可能に連結した５’および３’調節配列を含む。
本開示全体を通して使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、２つまたはそれ超のエレメント間の機能的な連結を指す。例えば、目的のポリヌクレオチドまたは遺伝子と調節配列（すなわち、プロモーター）の間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な連結である。作動可能に連結したエレメントは、連続していても連続していなくてもよい。作動可能に連結した２つのタンパク質コード領域の接合を指すために使用される場合、それらのコード領域は同じ読み枠内にあるものとする。カセットは、生物を同時形質転換するための少なくとも１つの追加的な遺伝子をさらに含有してよい。あるいは、追加的な遺伝子（複数可）を多数の発現カセットとして提供することができる。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節の下に置かれるＤＮＡ配列の挿入のための複数の制限部位および／または組換え部位と共に提供される。発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含有してよい。
例示的な発現カセットは、５’－３’転写方向に、植物または他の生物または非ヒト宿主細胞において機能的な転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含んでよい。本発明の調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域、および翻訳終結領域）ならびに／またはＤＮＡ配列は、宿主細胞に対してまたは互いに対してネイティブ／自己由来のものであってよい。あるいは、本発明の調節領域および／またはＤＮＡ配列は、宿主細胞に対してまたは互いに対して異種性のものであってよい。本開示全体を通して使用される場合、用語「異種性」は、外来種を起源とする配列、または、同じ種に由来する場合には、組成物および／またはゲノム遺伝子座におけるそのネイティブな形態から意図的で人為的な介入によって実質的に改変された配列を指す。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種に由来するものである、または、同じ／類似の種に由来する場合には、一方もしくは両方がそれらの元の形態および／もしくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されたものである、または、プロモーターは、作動可能に連結したポリヌクレオチドに対してネイティブなプロモーターではない。本明細書で使用される場合、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種性の転写開始領域に作動可能に連結したコード配列を含む。
本開示の終結領域は、転写開始領域に対してネイティブであってよい、作動可能に連結した目的のＤＮＡ配列に対してネイティブであってよい、宿主に対してネイティブであってよい、または、プロモーター、目的のＤＮＡ配列、植物宿主、もしくはそれらの任意の組合せとは別の供給源に由来するもの（すなわち、外来または異種性）であってよい。植物における使用に都合のよい終結領域は、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域などの、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ－プラスミドから入手可能である。Guerineauら（１９９１年）、Mol. Gen. Genet.、２６２巻：１４１～１４４頁；Proudfoot（１９９１年）Cell、６４巻：６７１～６７４頁；Sanfaconら（１９９１年）、Genes Dev.、５巻：１４１～１４９頁；Mogenら（１９９０年）、Plant Cell、２巻：１２６１～１２７２頁；Munroeら（１９９０年）、Gene、９１巻：１５１～１５８頁；Ballasら（１９８９年）、Nucleic Acids Res.、１７巻：７８９１～７９０３頁；およびJoshiら（１９８７年）、Nucleic Acids Res.、１５巻：９６２７～９６３９頁も参照されたい。
本開示のポリヌクレオチドは、形質転換された生物における発現を増大させるために最適化することができる。すなわち、発現を改善するために、宿主に好まれるコドンを使用してポリヌクレオチドを合成することができる。宿主に好まれるコドン使用に関する考察については、例えば、CampbellおよびGown（１９９０年）、Plant Physiol.、９２巻：１～１１頁を参照されたい。宿主に好まれる遺伝子、特に植物に好まれる遺伝子を合成するための方法は当技術分野において利用可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３８０，８３１号、および同第５，４３６，３９１号、ならびにMurrayら（１９８９年）、Nucleic Acids Res.、１７巻：４７７～４９８頁を参照されたい。
細胞宿主における遺伝子発現を増強するために、追加的な配列改変を使用することができる。例示的な配列改変としては、これだけに限定されないが、偽ポリアデニル化シグナル、エクソン－イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列、および遺伝子発現に対して有害になり得る他のそのようなよく特徴付けられた配列の排除が挙げられる。配列のＧ－Ｃ含量を、宿主細胞において発現する既知の遺伝子を参照することによって算出される所与の細胞宿主についての平均レベルまで調整することができる。可能な場合には、配列を、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造が回避されるように改変する。
本開示の発現カセットは、５’リーダー配列を含有してよい。そのようなリーダー配列は、翻訳が増強されるように作用し得る。翻訳リーダーが当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、：ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Elroy-Steinら（１９８９年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８６巻：６１２６～６１３０頁）；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチ病ウイルス）（Gallieら（１９９５年）、Gene１６５巻（２号）：２３３～２３８頁）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Virology、１５４巻：９～２０頁）、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合性タンパク質（ＢｉＰ）（Macejakら（１９９１年）、Nature、３５３巻：９０～９４頁）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡに由来する非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）（Tablingら（１９８７年）、Nature、３２５巻：６２２～６２５頁）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Gallieら（１９８９年）、in Molecular Biology of RNA編、Cech（Liss、New York）、２３７～２５６頁）；およびトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Lommelら（１９９１年）、Virology、８１巻：３８２～３８５頁）が挙げられる。Della-Cioppaら（１９８７年）、Plant Physiol.、８４巻：９６５～９６８頁も参照されたい。
発現カセットの調製において、ＤＮＡ配列を適切な方向、および必要に応じて適切な読み枠内でもたらすために、種々のＤＮＡ断片を操作することができる。この目的で、アダプターまたはリンカーを使用してＤＮＡ断片を接合することもでき、他の操作を含めて、都合のよい制限部位、不必要なＤＮＡの除去、制限部位の除去などをもたらすこともできる。この目的のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転移および塩基転換を含めることができる。
本開示は、本明細書に開示されている核酸配列の任意の１つまたは１つ超を含むウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターは、場合により、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、スプーマウイルス、レンチウイルスベクターおよびプラスミドまたは他のベクター、例えば、適用に記載されているトランスポゾンなどで構成される群から選択される。レトロウイルスベクターは、場合により、オンコレトロウイルスベクターを含む。レトロウイルスベクターは、場合により、レンチウイルスベクターを含む。
植物を形質転換するための多数の植物の形質転換ベクターおよび方法が利用可能である。例えば、An, G.ら（１９８６年）、Plant Pysiol.、８１巻：３０１～３０５頁；Fry, J.ら（１９８７年）、Plant Cell Rep.、６巻：３２１～３２５頁；Block, M.（１９８８年）、Theor. Appl Genet.、７６巻：７６７～７７４頁；Hincheeら（１９９０年）、Stadler. Genet. Symp.、２０３２１２．２０３～２１２頁；Cousinsら（１９９１年）、Aust. J. Plant Physiol.、１８巻：４８１～４９４頁；Chee, P. P.およびSlightom, J. L.（１９９２年）、Gene.、１１８巻：２５５～２６０頁；Christouら（１９９２年）、Trends. Biotechnol.、１０巻：２３９～２４６頁；D'Halluinら（１９９２年）、Bio/Technol.、１０巻：３０９～３１４頁；Dhirら（１９９２年）、Plant Physiol.、９９巻：８１～８８頁；Casasら（１９９３年）、Proc. Nat. Acad Sci. USA、９０巻：１１２１２～１１２１６頁；Christou, P.（１９９３年）、In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant；２９巻：１１９～１２４頁；Daviesら（１９９３年）、Plant Cell Rep.、１２巻：１８０～１８３頁；Dong, J. A.およびMchughen, A.（１９９３年）、Plant Sci.、９１巻：１３９～１４８頁；Franklin, C. I.およびTrieu, T. N.（１９９３年）、Plant. Physiol.、１０２巻：１６７頁；Golovkinら（１９９３年）、Plant Sci.、９０巻：４１～５２頁；Guo Chin Sci. Bull.、３８巻：２０７２～２０７８頁；Asanoら（１９９４年）、Plant Cell Rep.、１３巻；Ayeres N. M.およびPark, W. D.（１９９４年）、Crit. Rev. Plant. Sci.、１３巻：２１９～２３９頁；Barceloら（１９９４年）、Plant. J.、５巻：５８３～５９２頁；Beckerら（１９９４年）、Plant. J.、５巻：２９９～３０７頁；Borkowskaら（１９９４年）、Acta. Physiol Plant.、１６巻：２２５～２３０頁；Christou, P.（１９９４年）、Agro. Food. Ind. Hi Tech.、５巻：１７～２７頁；Eapenら（１９９４年）、Plant Cell Rep.、１３巻：５８２～５８６頁；Hartmanら（１９９４年）、Bio-Technology、１２巻：９１９９２３頁；Ritalaら（１９９４年）、Plant. Mol. Biol.、２４巻：３１７～３２５頁；ならびにWan, Y. C.およびLemaux, P. G.（１９９４年）、Plant Physiol.、１０４巻：３７４８頁を参照されたい。
医薬組成物
本開示の組成物は、医薬組成物であってよい、本開示の医薬組成物は、疾患、障害または異常な身体状態を有する患者を処置するために使用することができるものであり、許容される担体、補助的なまたは賦形剤を含む。
医薬組成物は、場合により、電気穿孔、ＤＮＡ微量注射、リポソームＤＮＡ送達、ならびに、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、セムリキ森林ウイルスを含めたＲＮＡまたはＤＮＡゲノムを有するウイルスベクターなどのｅｘ ｖｉｖｏ方法およびｉｎ ｖｉｖｏ方法によって投与される。これらのベクターの誘導体またはハイブリッドも有用である。
投与される投与量は、患者の必要性、所望の効果および選択される投与経路に依存する。発現カセットは、場合により、細胞またはそれらの前駆体に、リポソームまたはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターなどのｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ送達ビヒクルを使用して導入される。発現カセットはまた、場合により、これらの細胞に、微量注射などの物理的技法または共沈などの化学的方法を使用して導入される。医薬組成物は、一般には、患者に投与される薬学的に許容される組成物を調製するための公知の方法により、混合物中で有効数量の核酸分子と薬学的に許容されるビヒクルが合わさるように調製される。適切なビヒクルは、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、USA）に記載されている。任意の選択マーカー遺伝子を本発明において使用することができる。
これに基づいて、医薬組成物は、核酸分子などの活性化合物または物質を、１つまたは複数の薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤を伴って含んでよく、生理的流体を伴う適切なｐＨおよび等浸透圧の緩衝溶液中に含有される。発現カセットをビヒクルと合わせるまたは発現カセットを希釈剤と合わせる方法は、当業者には周知である。組成物は、活性化合物を細胞内の指定の部位に輸送するための標的化薬剤を含んでよい。発現カセットは、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子も含んでよい。選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織を選択するために利用される。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）をコードする遺伝子およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子、ならびに、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）などの除草化合物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。追加的な選択マーカーとして、ベータ－ガラクトシダーゼ、ならびに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Suら（２００４年）、Biotechnol Bioeng、８５巻：６１０～９頁およびFetterら（２００４年）、Plant Cell、１６巻：２１５～２８頁）、シアン蛍光タンパク質（ＣＹＰ）（Bolteら（２００４年）、J. Cell Science、１１７巻：９４３～５４頁およびKatoら（２００２年）、Plant Physiol、１２９巻：９１３～４２頁）、および黄色蛍光タンパク質（Ｅｖｒｏｇｅｎ製のＰｈｉＹＦＰ（商標）、Bolteら（２００４年）、J. Cell Science、１１７巻：９４３～５４頁を参照されたい）などの蛍光タンパク質などの表現型マーカーが挙げられる。追加的な選択マーカーについては、一般に、Yarranton（１９９２年）、Curr. Opin. Biotech.、３巻：５０６～５１１頁；Christophersonら（１９９２年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：６３１４～６３１８頁；Yaoら（１９９２年）、Cell、７１巻：６３～７２頁；Reznikoff（１９９２年）、Mol. Microbiol.、６巻：２４１９～２４２２頁；Barkleyら（１９８０年）、The Operon、１７７～２２０頁；Huら（１９８７年）、Cell、４８巻：５５５～５６６頁；Brownら（１９８７年）、Cell、４９巻：６０３～６１２頁；Figgeら（１９８８年）、Cell、５２巻：７１３～７２２頁；Deuschleら（１９８９年）、Proc. Natl. Acad. Aci. USA、８６巻：５４００～５４０４頁；Fuerstら（１９８９年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８６巻：２５４９～２５５３頁；Deuschleら（１９９０年）、Science、２４８巻：４８０～４８３頁；Gossen（１９９３年）、Ph.D. Thesis、University of Heidelberg；Reinesら（１９９３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻：１９１７～１９２１頁；Labowら（１９９０年）、Mol. Cell. Biol.、１０巻：３３４３～３３５６頁；Zambrettiら（１９９２年）、Proc. Natl Acad. Sci. USA、８９巻：３９５２～３９５６頁；Baimら（１９９１年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８８巻：５０７２～５０７６頁；Wyborskiら（１９９１年）、Nucleic Acids Res.、１９巻：４６４７～４６５３頁；Hillenand－Wissman（１９８９年）、Topics Mol. Struc. Biol.、１０巻：１４３～１６２頁；Degenkolbら（１９９１年）、Antimicrob. Agents Chemother.、３５巻：１５９１～１５９５頁；Kleinschnidtら（１９８８年）、Biochemistry、２７巻：１０９４～１１０４頁；Bonin（１９９３年）、Ph.D. Thesis、University of Heidelberg；Gossenら（１９９２年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：５５４７～５５５１頁；Olivaら（１９９２年）、Antimicrob. Agents Chemother.、３６巻：９１３～９１９頁；Hlavkaら（１９８５年）、Handbook of Experimental Pharmacology、７８巻（Springer-Verlag、Berlin）；Gillら（１９８８年）、Nature、３３４巻：７２１～７２４頁を参照されたい。そのような開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
遺伝子改変細胞および生物
本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸またはポリペプチドの導入によって引き起こされる突然変異、異種遺伝子、バリアントおよび／または別の遺伝子改変を含む真核細胞を提供する。
本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸またはポリペプチドの導入によって引き起こされる突然変異、異種遺伝子、バリアントおよび／または別の遺伝子改変を含む哺乳動物細胞を提供する。
本開示は、本明細書に開示されているタンパク質または核酸配列の任意の１つまたは組合せを含むヒト細胞を提供する。例えば、本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸またはポリペプチドの導入によって引き起こされる突然変異、異種遺伝子、バリアント、および／または別の遺伝子改変を含むヒト細胞を提供する。あるいは、本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸またはポリペプチドの導入によって引き起こされる突然変異、異種遺伝子、バリアントおよび／または別の遺伝子改変を含む非ヒト細胞を提供する。
本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸またはポリペプチドの導入によって引き起こされる突然変異、異種遺伝子、バリアントおよび／または他の遺伝子改変を含む昆虫細胞を提供する。
本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸またはポリペプチドの導入によって引き起こされる突然変異、異種遺伝子、バリアントおよび／または他の遺伝子改変を含む魚類細胞を提供する。
本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸またはポリペプチドの導入によって引き起こされる突然変異、異種遺伝子、バリアントおよび／または他の遺伝子改変を含む植物細胞を提供する。
本開示は、本開示の単離された核酸分子で形質転換された植物（およびその一部（ｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｐａｒｔｓ ｔｈｅｒｅｏｆ））、種子、植物細胞および他の非ヒト宿主細胞、ならびに本開示の核酸分子（そのコード領域を含む）によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを提供する。本明細書に記載のポリペプチドおよびＤＮＡ分子は、動物およびヒト細胞、ならびに、これだけに限定されないが、真菌または植物を含めた他の生物の細胞に導入することができる。
本開示の組成物は、これだけに限定されないが、幹細胞および配偶子を含めた、任意の細胞のゲノムの部位特異的改変のために使用することができる。例示的な幹細胞としては、多能性細胞、全能性細胞、体性幹細胞、精原幹細胞（ＳＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚、生殖細胞、始原生殖細胞（ＰＧＣ）、塊茎細胞、花粉細胞、および胞子が挙げられる。
幹細胞の部位特異的工学的操作により、遺伝子（複数可）または遺伝子産物（複数可）の機能の変化および遺伝子改変生物がもたらされ、また、これらの工学的に操作された幹細胞から細胞または組織培養モデルが作製される。改変された幹細胞および生物としては、ノックアウトおよびノックイン細胞および生物が挙げられる。
本開示の組成物および方法を使用した部位特異的工学的操作によって創出される遺伝子改変生物としては、これだけに限定されないが、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、モルモット、イヌ、非ヒト霊長類、ミニブタ）ならびに植物（例えば、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ジャガイモ、コムギ、タバコ、トマト、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ならびにそのような生物の後裔および祖先）が挙げられる。
遺伝子療法
本出願は、個体の細胞にコード核酸分子をもたらし、その結果、細胞におけるコード核酸分子の発現により、コード核酸分子によってコードされるポリペプチドの生物活性または表現型をもたらすための方法および組成物を含む。方法は、疾患、障害または異常な身体状態を有する個体に、本出願の核酸分子を投与することによって生物活性ポリペプチドをもたらすための方法にも関する。方法は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。遺伝子療法方法および組成物は、例えば、米国特許第５，８６９，０４０号、同第５，６３９，６４２号、同第５，９２８，２１４号、同第５，９１１，９８３号、同第５，８３０，８８０号、同第５，９１０，４８８号、同第５，８５４，０１９号、同第５，６７２，３４４号、同第５，６４５，８２９号、同第５，７４１，４８６号、同第５，６５６，４６５号、同第５，５４７，９３２号、同第５，５２９，７７４号、同第５，４３６，１４６号、同第５，３９９，３４６号および同第５，６７０，４８８号、同第５，２４０，８４６において実証されている。ポリペプチドの量は、対象の必要に応じて変動する。ベクターの最適な投与量は、経験的技法を使用して、例えば、用量を漸増させることによって容易に決定することができる（用量漸増の例については、米国特許第５，９１０，４８８号を参照されたい）。本出願の核酸分子を含有するベクターは、一般には、遺伝子療法において下記の技法を使用して哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。場合により、核酸分子から産生されるポリペプチドも、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。本出願は、それを必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、本出願のベクターを含有する本出願の哺乳動物ベクターまたは細胞に医学的処置を行う方法に関する。移植片対宿主病などの有害事象を生じるレシピエント、好ましくはヒトに、一般には、本出願の改変されたｔｍｐｋ分子の基質であるＡＺＴなどの薬物を投与する。容易に処置される血液疾患または神経疾患（神経変性）などの疾患は、本出願に記載されており、当技術分野で公知である（例えば、カナダ特許出願第２，２４６，００５号に記載の通り、グロビン遺伝子を投与することによって処置されるサラセミアまたは鎌状赤血球貧血などの疾患）。幹細胞移植によって処置される血液疾患としては、白血病、骨髄異形成症候群、幹細胞障害、骨髄増殖性疾患、リンパ球増殖性障害、食細胞障害、遺伝性代謝障害、組織球性障害、遺伝性赤血球異常、遺伝性免疫系障害、遺伝性血小板異常、形質細胞障害、悪性腫瘍が挙げられる（Medical Professional's Guide to Unrelated Donor Stem Cell Transplants、第４版も参照されたい）。神経幹細胞移植によって処置される幹細胞神経疾患としては、神経系細胞の損傷または喪失をもたらす疾患（例えば、麻痺、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、多発性硬化症）が挙げられる。本出願のベクターは、幹細胞マーカーとして、および、幹細胞の分化を引き起こす遺伝子（例えば、増殖因子）を発現させるために有用である。
遺伝子療法のための種々のアプローチを使用することができる。本開示は、ヒトに治療用ポリペプチドをもたらすための方法であって、ヒト細胞をヒトに導入するステップを含み、ヒト細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて、本出願のベクターが挿入されるように処理されたものであり、ヒト細胞が、ヒトにおいてｉｎ ｖｉｖｏにおいて治療有効量の治療用ポリペプチドを発現する、方法を提供する。
方法は、グロビンをコードする改変ＤＮＡを含む遺伝子療法に適したウイルスを作製することによって組換えウイルスのストックを作製するための方法にも関する。この方法は、ウイルス複製に許容的な細胞にトランスフェクトするステップ（改変されたグロビンを含有するウイルス）および産生されたウイルスを収集するステップを伴うことが好ましい。
同時トランスフェクション（別々の分子上のＤＮＡおよびマーカー）を使用することができる（例えば、米国特許第５，９２８，９１４号および米国特許第５，８１７，４９２号を参照されたい）。その上、ベクター自体（好ましくはウイルスベクター）内に検出カセットまたはマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質マーカーまたは誘導体、ＣＤ１９またはＣＤ２５など）を使用することができる。
本開示の方法は、これだけに限定されないが、一倍体、二倍体、三倍体、四倍体、または異数体を含めた任意の真核生物幹細胞を突然変異させるために使用することができる。一実施形態では、細胞は、二倍体である。本発明の方法を有利に使用することができる幹細胞としては、これだけに限定されないが、体性幹細胞、ＳＳＣ、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、胚、または１つまたは複数の生物に発達することができる任意の細胞などの幹細胞が挙げられる。
本開示は、部位特異的ノックアウト、ノックインまたは他のやり方で遺伝子改変された幹細胞を作製する方法を提供する。所望の部位を切断する本開示の組成物を使用して部位特異的突然変異、その後、ＮＨＥＪ修復を生じさせ、その結果、欠失突然変異を生じさせる。部位特異的突然変異を精原幹細胞（ＳＳＣ）において生じさせ、それを使用して、ヘテロ接合性またはホモ接合性の遺伝子改変生物を生成することができる。
本開示は、部位特異的ノックアウト、ノックインまたは他のやり方で遺伝子改変された幹細胞を作製する方法を提供する。所望の部位を切断する本開示の組成物を使用して部位特異的突然変異を生じさせ、その結果、欠失突然変異を生じさせる。部位特異的突然変異を胚性幹（ＥＳ）細胞において生じさせ、それを使用して、ヘテロ接合性またはホモ接合性の遺伝子改変生物を生成する。
本開示は、部位特異的ノックアウト、ノックインまたは他のやり方で遺伝子改変された幹細胞を作製する方法を提供する。所望の部位を切断する組成物を使用して部位特異的突然変異を生じさせ、その結果、欠失突然変異を生じさせる。部位特異的突然変異を人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞において生じさせ、それを使用して、ヘテロ接合性またはホモ接合性の遺伝子改変生物を生成する。
本開示は、部位特異的ノックアウト、ノックインまたは他のやり方で遺伝子改変された幹細胞を作製する方法を提供する。所望の部位を切断する組成物を使用して部位特異的突然変異を生じさせ、その結果、欠失突然変異を生じさせる。部位特異的突然変異を胚において生じさせ、それを使用して、ヘテロ接合性またはホモ接合性の遺伝子改変生物を生成する。
本開示は、生物内の細胞または組織外植片のようなネイティブな環境内の細胞を突然変異させる方法（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ）を提供する。あるいは、当技術分野で公知の方法および遺伝子を使用して生物から単離された組織または幹細胞を、本開示の方法に従って突然変異させることができる。組織または幹細胞を、培養物で維持するか（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、または組織または生物内に再度埋め込む（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ）。
ＸＴＮおよびＲＴＮを作出する方法
本開示のＦＬＡＳＨ組立て方法に記載のアーキテクチャと同様に、本開示は、アミノ酸がわずかに異なる３つの別個のＴＡＬＥ反復骨格およびＤＮＡ配列が反復パターンで存在するＴＡＬＥ反復アレイを構築するための好ましい組立て方法を提供する。最初の、アレイ内のアミノ末端ＴＡＬＥ反復をα単位と呼称した。この後にβ単位およびγ単位、次いで、５’末端および３’末端のＩＩＳ型制限部位（組織化されたアレイへのクローニングに必要な独特の突出部の創出を可能にするために必要）の位置が異なる以外は最初のα単位と実質的に同一であるα単位を続ける。次いで、α単位の後ろに再度β単位およびγ単位の反復を続ける。
４種のＤＮＡ塩基のうちの１つを指定する４種の反復可変二残基（ＲＶＤ）（ＮＩ＝Ａ、ＨＤ＝Ｃ、ＮＮ＝Ｇ、ＮＧ＝Ｔ）のそれぞれについて１０種のプラスミドを合成し（ＩＤＴ）、合計４０種のｐＲＶＤプラスミド（アンピシリン選択マーカー）のライブラリーとして生成した。例えば、ＲＶＤ ＮＩについて、ＮＩ－１がα単位、ＮＩ－２がβ単位、ＮＩ－３がγ単位、ＮＩ－４がα単位になるように、１０種のプラスミドを生成した。これらのｐＲＶＤプラスミドの全てについて、ＴＡＬＥ反復ドメインをコードする配列はＢｓａＩ制限部位に挟まれ、したがって、互いに（例えば、１および２、２および３など）ＢａｓＩに隣接するように設計された単位をコードする任意のｐＲＶＤプラスミドの消化によって生じる突出部は、互いと相補的である。
ＸＴＮ中へのｐＲＶＤの組立てを２つの広範なステップで実現した：
ステップ１ａ：ｐＲＶＤ１～１０（pRVD 1 through 10）（最初の１０個の標的化ヌクレオチドを指定する）をｐＩＮ－Ｘにクローニングする。
ステップ１ｂ：ｐＲＶＤ１～１０（pRVD 1 up to 10）（１１番目から２０番目までの標的化ヌクレオチドを指定する）をｐＩＮ－Ｚにクローニングする。
ステップ２：ＴＡＬＥ反復骨格のｐＩＮ－ＸアレイおよびｐＩＮ－Ｚアレイを正確なＸＴＮ発現骨格にクローニングして、２０番目までの指定のヌクレオチド配列を標的とするＸＴＮを作製する。
ステップ１ａに関して：ｐＲＶＤ（ｐＲＶＤ１～１０（pRVD 1 through 10））を、最初の１０個の標的化ＤＮＡ配列にマッチするように正確な順序で選択する。各ｐＲＶＤ １００ｎｇをｐＩＮ－Ｘ １００ｎｇと、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中ＢｓａＩ（１０Ｕ、ＮＥＢ）１μｌおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ、ＮＥＢ）１μｌを含有する単一の２０μｌの反応物中で混合する。次いで、反応物をサーモサイクラー中、３７℃で５分および１６℃で１０分を１０サイクルでインキュベートし、次いで、５０℃で５分、次いで８０℃で５分、加熱する。次いで、混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天上でプレーティングする。次いで、コロニーをコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、配列決定して、所望の１０ＲＶＤアレイを含有するクローンを同定する。
ステップ１ｂに関して：ｐＲＶＤを、１１番目～２０番目の（11th through (upto) 20th）標的化ＤＮＡ配列にマッチするように正確な順序で選択する。各ｐＲＶＤ、１００ｎｇをｐＩＮ－Ｚ １００ｎｇと混合し、上のステップ１ａに記載されている手順を繰り返して、所望のクローンを同定する。
ステップ２に関して：中間の反復アレイを含有する各ｐＩＮ－ＸおよびｐＩＮ－Ｚプラスミド１５０ｎｇを所望のＸＴＮ発現プラスミド１５０ｎｇと、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中ＢｓｍＢＩ（１０Ｕ ＮＥＢ）１μｌおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ ＮＥＢ）１μｌを含有する単一の２０μｌの反応物中で混合する。形質転換体の選択のためにカナマイシンの代わりにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を使用する以外はステップ１ａと同様に反応物を処理し、それを使用してＥ ｃｏｌｉを形質転換する。クローンをコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、配列決定して所望のクローンを同定する。
ＸＴＮ中間プラスミドｐＩＮ－ＸおよびｐＩＮ－Ｚ：ｐＩＮ－ＸおよびｐＩＮ－Ｚは、それぞれＢｓａＩおよびＢｓｍＢＩに対する２つの部位を含有し、したがって、ＢｓａＩを用いて消化されると、ｐＲＶＤ１～１０（pRVD 1 through 10）のアレイを中間プラスミドに組み入れるためのｐＲＶＤ－１およびｐＲＶＤ－１０のＢｓａＩ突出部と相補的な突出を生じる、カナマイシンにより選択可能なプラスミドである。組み入れられる反復の数（６～１０反復）に応じて、使用されるｐＩＮ－Ｘのいくつかのバージョンが生成されている。中間プラスミドがＢｓｍＢＩで消化されると、互いのＢｓｍＢＩ突出部およびＸＴＮ発現骨格のＢｓｍＢＩ突出部と相補的な突出部（クローニングされたＴＡＬＥ反復アレイを挟む）が生じる。これにより、このアーキテクチャ：Ｎ末端配列－ＴＡＬＥ反復アレイ（ｐＩＮ－Ｘから１０反復）－ＴＡＬＥ反復アレイ（ｐＩＮ－Ｚから６～１０反復）－Ｃ末端配列－ヌクレアーゼのＸＴＮの生成が可能になる。
ＸＴＮ発現骨格：本開示のＦＬＡＳＨシステムと同様に、最後の半分のエフェクター結合性エレメント（ＥＢＥ）によって指定される最後の標的化ヌクレオチドを発現骨格に組み込み、したがって、それぞれ最後の標的化ヌクレオチドをＡ、Ｃ、ＴまたはＧと指定する４つの発現骨格が存在する。発現骨格は、ＸＴＮ Ｎ末端配列、ＦｏｋＩ（Ｃｌｏ５１、ＢｆｉＩ、ＢｍｒＩ）などの特定の必須の二量体ヌクレアーゼと連結したＣ末端配列を含有する。
使用方法
本開示は、生物（多細胞または単細胞（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ））の細胞または少なくとも１つの細胞の遺伝子材料を改変する方法であって、生物の細胞または少なくとも１つの細胞に本開示の核酸またはポリペプチドのうちの１つまたは複数を直接投与するステップを含む方法を提供する。
本開示のポリペプチドは、タンパク質をコードする核酸として提供または投与することができる。一部の実施形態では、タンパク質をコードする核酸を、第２のエフェクターをコードする核酸配列と一緒に投与する。
本開示は、新しい反復単位を構築し、標的ＤＮＡ配列内の塩基対を特異的に認識する人工的に構築された反復単位の特異的結合活性を試験するための方法を提供する。最適な特異的結合のために、反復ドメインに使用される反復単位の数を変動させることができる。一般に、少なくとも１．５反復単位が最小であるとみなされるが、一般には、少なくとも約８反復単位が使用される。サイズが半分の反復単位を使用することができるので、反復単位は完全な反復単位である必要はない。さらに、本開示のポリペプチドおよびポリペプチドを作出し、使用する方法は、特定の数の反復単位を伴う反復ドメインに依存する。したがって、本開示のポリペプチドは、例えば、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５またはそれ超の反復単位を含み得る。
本開示のポリペプチドは、反復単位を伴う反復ドメインを含んでよく、反復単位には、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する超可変領域が含まれる。例えば、本開示の反復ドメインの各反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の１塩基対の認識を決定する超可変領域を含んでよい。あるいは、標的ＤＮＡ配列内の塩基対を特異的に認識しない１または２の反復単位が反復ドメイン内に含まれていてよい。
本明細書に開示されている認識コードを考慮して、各反復単位が標的ＤＮＡ配列内の１塩基対の特異的な認識に関与する反復単位のモジュール式配置が意図されている。したがって、このモジュール式配置では、反復単位の配列を標的ＤＮＡ配列内の塩基対の配列に対応させ、したがって、１反復単位を１塩基対に対応させることができる。
本開示は、少なくとも１つの反復ドメインを含むポリペプチドによって標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識するための方法であって、少なくとも１つの反復ドメインが複数の反復単位を含み、各反復単位が少なくとも１つのＲＶＤ領域を含む、方法を提供する。本開示のＲＶＤ領域により、標的ＤＮＡ配列内の塩基対またはヌクレオチドの認識が決定される。より詳細には、本開示のＲＶＤ領域は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の選択的な認識に関与する、ＤＮＡ結合性ポリペプチド内のアミノ酸を含む。これらの認識コード（すなわち、ＲＶＤ領域）を定義して、本開示は、ポリペプチド内の選択されたアミノ酸によって標的ＤＮＡ配列内の特定の塩基対を認識するための一般的な原理を提供する。種々のアミノ酸長の反復単位アレイ（またはポリマー）の一部である別個の型のモノマーは、１つの定義された／特定の塩基対を認識する能力を有する。反復ドメインを形成する各反復単位内で、ＲＶＤ領域が標的ＤＮＡ配列内の塩基対の特異的な認識に関与する。
したがって、本開示は、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含むポリペプチドによって標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識するための方法だけでなく、ポリペプチド内の反復ドメインによって選択的に認識される標的ＤＮＡ配列を生成するための方法も提供する。これらのポリペプチドは、単離された核酸配列または他のｉｎ ｖｉｖｏ配列をクローニングする、突然変異誘発させるまたは他のやり方で変更するための分子生物学ツールとして有用である。本明細書に記載のポリペプチドおよび使用方法は、選択的な突然変異誘発の効率的な手段を提供する。
本開示は、特定のＤＮＡ配列を認識するポリペプチドを構築および／または作出するための方法も提供する。本開示のポリペプチドは、本開示の反復モノマーを少なくとも１つ含み、また、モジュール式アプローチによって構築することができる。このモジュール式アプローチは、標的ベクター内の反復単位を予め組み立てることを含んでよく、その後、それを、最終的なデスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）に組み立てることができる。本開示のＤＮＡ構築物は、本開示の組換えポリペプチドが組換えにより作製および／または分泌されるようにコドン最適化することができる。当技術分野における任意の組換え系を使用して、本開示の組換えタンパク質を作製することができる。例示的な組換え系としては、これだけに限定されないが、バキュロウイルス細胞、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）、または細菌細胞が挙げられる。
標的ＤＮＡ配列が既知である場合、本開示の組成物および方法を使用して、特定の認識アミノ酸配列を含む一連のモジュール式反復単位を構築し、これらの反復単位を、所望の標的ＤＮＡ配列の認識およびそれへの特異的結合が可能になるように適切な順序でポリペプチドに組み立てることができる。本開示のモジュール式反復単位ＤＮＡ結合性ドメインを組み合わせることによって任意のポリペプチドを改変することができる。そのような例としては、転写活性化因子および抑制因子タンパク質、耐性媒介タンパク質、ヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、デメチラーゼ、脱アセチル化酵素であるポリペプチド、およびＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を改変することができる任意の他のポリペプチドが挙げられる。
本開示のモジュール式反復単位ＤＮＡ結合性ドメインは、細胞区画局在化シグナル（例えば、核局在化シグナル）と組み合わせて、これだけに限定されないが、転写調節領域および翻訳終結領域を含めた任意の他の調節領域において機能させることができる。
本開示のモジュール式に設計された反復単位は、ＤＮＡに近づけるとＤＮＡを切断することができる（例えば、反復ドメインによる結合の結果として）エンドヌクレアーゼドメインと組み合わせることができる。そのようなエンドヌクレアーゼによる切断により、真菌、植物、および動物を含めた真核生物相同組換えの率が刺激される。部位特異的エンドヌクレアーゼによる切断の結果としての特定の部位における相同組換えをシミュレートできることにより、目的のＤＮＡ配列が、特定の部位に、部位特異的切断を行わずに可能なものよりもはるかに高い頻度で組み込まれた形質転換細胞を回収することが可能になる。さらに、反復ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインから形成されたポリペプチドによって引き起こされるものなどのエンドヌクレアーゼによる切断は、時には、細胞内ＤＮＡ代謝機構により、例えば、切断部位において、変化していない配列と比較して、短い挿入または欠失が引き起こされることによって切断部位の配列が変化するように修復される。これらの配列の変化により、例えば、タンパク質をコードする配列が変化して非機能的タンパク質が作出されること、スプライス部位が改変され、その結果、遺伝子転写物が適正に切断されないこと、非機能的転写物が作出されること、および／または遺伝子のプロモーター配列が変化し、その結果、もはや適切に転写されないことによって、遺伝子またはタンパク質の機能の不活化が引き起こされる。
部位特異的なエンドヌクレアーゼを使用してＤＮＡを切断することにより、切断領域における相同組換えの率が上昇する。一部の実施形態では、エフェクター内にＣｌｏ０５１エンドヌクレアーゼを利用してＤＮＡ切断を誘導することができる。Ｃｌｏ０５１エンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合性ドメインとは独立して機能し、一般には、二量体として二本鎖ＤＮＡを切断する。例えば、所望の標的ＤＮＡ配列を認識するための反復ドメイン、ならびに、標的ＤＮＡ配列またはその付近でのＤＮＡ切断を誘導するためのＣｌｏ０５１エンドヌクレアーゼドメインを含有するエフェクターを構築することができる。そのようなエフェクターを利用することにより、ゲノム内の標的化変化（例えば、全てそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bibikovaら（２００３年）、Science、３００巻、７６４頁；Urnovら（２００５年）、Nature、４３５巻、６４６頁；Wrightら（２００５年）、The Plant Journal、４４巻：６９３～７０５頁；および米国特許第７，１６３，８２４号および同第７，００１，７６８号の通り、ジンクフィンガーヌクレアーゼに関して報告されている使用と類似した付加、欠失および他の改変含む）を生じさせることが可能になる。
任意の他のエンドヌクレアーゼドメインを、エフェクターとして利用される異種ＤＮＡ結合性ドメインと作動可能に連結することができる。そのような非限定的な例の１つはＣｌｏ０５１エンドヌクレアーゼである。すでに存在していなければ、特定のエンドヌクレアーゼを使用する前に、そのエンドヌクレアーゼの認識部位を所望の位置に導入して、その位置における相同組換えを増強する必要がある。
新規のエンドヌクレアーゼは、例えば、公知のエンドヌクレアーゼを改変すること、または、新規の標的ＤＮＡ配列を認識し、したがって、そのような工学的に操作されたエンドヌクレアーゼドメインの生成により目的の内因性標的ＤＮＡ配列が切断されるのを可能にする、１つもしくは複数のそのようなエンドヌクレアーゼのキメラバージョンを作出することによって設計および／または合成することができる（それらの全体が参照により組み込まれる、Chevalierら（２００２年）、Molecular Cell、１０巻：８９５～９０５頁；ＷＯ２００７／０６０４９５；ＷＯ２００９／０９５７９３；Fajardo-Sanchezら（２００８年）、Nucleic Acids Res.、３６巻：２１６３～２１７３頁）。本開示の組成物および方法に関して、公知のエンドヌクレアーゼによって誘導されるものと同様（例えば、上記のＣｌｏ０５１の使用によって誘導される切断と同様）のＤＮＡ切断を誘導するために、エンドヌクレアーゼドメインを、公知のエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合性活性は非機能的になるが、ＤＮＡ切断活性は保存されるように同様に工学的に操作することができることが意図されている。そのような適用では、標的ＤＮＡ配列認識は、エフェクターの反復ドメインによってもたらされるが、ＤＮＡ切断は、工学的に操作されたエンドヌクレアーゼドメインによって実現されることが好ましい。
本開示のエフェクターは、所望の特定の標的配列に対する特異的な認識を伴う反復ドメインを含んでよい。好ましい実施形態では、エフェクターは、内因性の染色体ＤＮＡ配列に特異的に結合する。特異的な核酸配列またはより好ましくは特異的な内因性の染色体配列は、相同組換えを増強することが望ましい核酸領域内の任意の配列であってよい。例えば、核酸領域は、点突然変異もしくは欠失などの突然変異を導入することが望ましい遺伝子を含有する領域、または、所望の表現型を付与する遺伝子を導入することが望ましい領域であってよい。
本開示は、所望の付加が導入された改変植物を生成する方法を提供する。方法は、改変を導入することが望ましい内因性の標的ＤＮＡ配列を含む植物細胞を得るステップ、内因性の標的ＤＮＡ配列に結合する反復ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインを含むエフェクターを用いて内因性の標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じさせるステップ、内因性の標的ＤＮＡの少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性の核酸を、外因性の核酸と内因性の標的ＤＮＡ配列の間で相同組換えが起こるのを可能にする条件下で植物細胞に導入するステップ、ならびに、相同組換えが生じた植物細胞から植物を生成するステップを含んでよい。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子改変植物および動物細胞の生成に適用することができる。標的ＤＮＡ配列は、人工的なものであっても天然に存在するものであってもよい。これらの方法は、任意の生物（動物、ヒト、真菌、卵菌細菌およびウイルスを含む非限定的な生物）において、当技術分野で公知であり、そのような生物においてそのような目的のために利用される技法および方法を使用して、使用することができる。
モジュールにより設計された本開示の反復ドメインは、これだけに限定されないが、植物遺伝子、動物遺伝子、真菌遺伝子、卵菌遺伝子、ウイルス遺伝子、および／またはヒト遺伝子を含めた遺伝子の発現の調節または制御に関与する１つまたは複数のドメインと組み合わせることができる。ジンクフィンガードメインを含有するＤＮＡ結合性ポリペプチドを生成することによって遺伝子発現を調節するための方法が記載されている（米国特許第７，２８５，４１６号、同第７，５２１，２４１号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２７３，９２３号、同第７，２６２，０５４号、同第７，２２０，７１９号、同第７，０７０，９３４号、同第７，０１３，２１９号、同第６，９７９，５３９号、同第６，９３３，１１３号、同第６，８２４，９７８、そのそれぞれの全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる）。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｕｓおよび／またはＲａｌｓｔｏｎｉａファミリーのエフェクターを、例えば、特定の標的ＤＮＡ配列に結合するように改変することができる。そのようなポリペプチドとしては、例えば、遺伝子の転写を活性化する、抑制するまたは他のやり方で調節するために、プロモーター内の遺伝子制御領域または目的の遺伝子に対する他の調節領域に特異的に結合するように本開示の方法によって改変される転写活性化因子または転写の抑制因子タンパク質が挙げられる。
本開示の標的ＤＮＡ配列は、天然に存在する反復ドメインまたは改変された反復ドメインによって特異的に認識されるように改変することができる。一例として、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｕｓおよび／またはＲａｌｓｔｏｎｉａファミリーのメンバーの標的ＤＮＡ配列をプロモーターに挿入して、対応するエフェクターによって誘導することができる新規の制御可能なプロモーターを生成することができる。トランス活性化因子および標的遺伝子を使用して二次的な誘導系を構築することができ、ここで、トランス活性化因子は、ポリペプチドであり、ポリペプチドは、標的遺伝子に結合し、発現を誘導する、本発明の反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含む。トランス活性化因子と標的遺伝子は、１つの細胞株に導入することができるが、異なる細胞株に存在させ、後で遺伝子移入することもできる。発現後に、耐性媒介遺伝子の活性化による植物の防御反応を導く遺伝子の前に本発明のポリペプチドを含有する反復ドメインの標的ＤＮＡ配列を挿入することにより、耐病植物を生成することができる。
新規の標的ＤＮＡ結合特異性を有する反復ドメインの生成をもたらす反復単位型を再構成することにより、カスタムＤＮＡ結合性ポリペプチドを構築することができる。本開示の個々の反復単位は、ＤＮＡレベルではほぼ同一であり、古典的なクローニング戦略が妨げられる。本開示の組成物および方法は、反復ドメインを有するカスタムポリペプチドを組み立てるための迅速かつ安価な戦略を提供する。そのようなポリペプチドのクローニング多用性を改善するために、本開示は、二段階の組立て方法を提供する。この方法は、新規の反復型を有するポリペプチドを組み立てて、それらの標的ＤＮＡの認識および結合特異性を試験するために使用することができる。
本開示の組成物および方法を使用して、特異的な認識および互いとの結合が容易になるように改変されたＤＮＡ配列に結合する反復単位で構成される反復ドメインを有するポリペプチドを特異的に標的とするために、本開示の反復ドメイン含有ポリペプチドによる結合が可能になるように、任意のＤＮＡ領域もしくは遺伝子の特定の領域、または遺伝子制御エレメントに塩基対を導入することによって、ＤＮＡ配列を生成することができる。
本開示のポリペプチドは、有機化学合成の当業者によく知られている公知のアミノ酸化学を使用して合成により製造することができる。そのような手順は、例えば、ＢｏｃまたはＦｍｏｃ方法体系のいずれかを使用する、液相手順および固相手順のどちらも含む。
本開示の化合物は、固相合成技法を使用して合成することができる。
本開示は、目的の標的ＤＮＡ配列に特異的なモジュール式反復単位を構築するステップ、反復モノマーを付加することによってポリペプチドを改変してポリペプチドが標的ＤＮＡを認識することを可能にするステップ、改変されたポリペプチドを原核細胞または真核細胞に導入するかまたは発現させて、改変されたポリペプチドが標的ＤＮＡ配列を認識することを可能にするステップ、および、そのような認識の結果として、細胞における標的遺伝子の発現を調節するステップにより、遺伝子発現を標的化調節するための方法も提供する。
本開示は、標的ＤＮＡ配列を認識する本発明の反復ドメインを少なくとも１つ含み、標的ＤＮＡを改変し（例えば、部位特異的組換え、制限またはドナー標的配列の組み込みによってなど）、それにより、複雑なゲノム内での標的化ＤＮＡ改変を可能にすることができる機能的なドメインも含有するポリペプチドを構築することによる、標的ＤＮＡ配列の定方向改変のための方法も提供する。
本開示は、さらに、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含む改変されたポリペプチドであって、反復単位のそれぞれ内の超可変領域により標的ＤＮＡ配列内の塩基対の選択的な認識が決定される、ポリペプチドの作製を提供する。本開示は、上記の反復ドメインを含有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
本開示は、ポリペプチドによって標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識するための方法であって、ポリペプチドが、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、各反復単位が、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する超可変領域を含有し、連続した反復単位が連続した標的ＤＮＡ配列内の塩基対に対応する、方法を提供する。
本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。例示的な細胞としては、これだけに限定されないが、植物細胞、ヒト細胞、動物細胞、真菌細胞または任意の他の生細胞が挙げられる。本開示の細胞は、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含む本開示のポリペプチドを含有してよい。本開示の反復単位は、超可変領域を含む。各反復単位は、１つの標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識に関与する。本開示のポリペプチドを、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして導入するか、または、ポリペプチド自体を細胞に本明細書に記載の方法によって導入する。ポリペプチドを細胞にどのように導入するかにかかわらず、本開示のポリペプチドは、特異的に認識し、好ましくは標的ＤＮＡ配列塩基対に結合し、標的遺伝子の発現を調節する少なくとも１つの反復ドメインを含む。反復単位の全てが、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する超可変領域を含有することが好ましい。
細胞へのエフェクターの取り込みを容易にするために本開示のポリペプチドまたはＲＴＮに連結することができるペプチド配列の例としては、これだけに限定されないが、ＨＩＶのｔａｔタンパク質の１１アミノ酸ペプチド；ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４～１０３に対応する２０残基のペプチド配列（Fahraeusら（１９９６年）、Current Biology、６巻：８４頁を参照されたい）；アンテナペディアの６０アミノ酸長ホメオドメインの第３のへリックス（Derossiら（１９９４年）、J. Biol. Chem.、２６９巻：１０４４４頁）；カポジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ－ＦＧＦ）ｈ領域などの、シグナルペプチドのｈ領域；またはＨＳＶ由来のＶＰ２２転座ドメイン（ElliotおよびO'Hare（１９９７年）、Cell、８８巻：２２３～２３３頁）が挙げられる。細胞内取り込みの増強をもたらす他の適切な化学的部分もエフェクターに化学的に連結することができる。本明細書に記載の通り、エフェクターは、選択された任意の内因性遺伝子の発現を調節するために、任意の適切な標的部位を認識するように設計することができる。調節に適した内因性遺伝子例としては、ＶＥＧＦ、ＣＣＲ５、ＥＲα、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＨＢＶ Ｃ、Ｓ、Ｘ、およびＰ、ＬＤＬ－Ｒ、ＰＥＰＣＫ、ＣＹＰ７、フィブリノーゲン、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ（ａ）、レニン、ＮＦ－κＢ、Ｉ－κＢ、ＴＮＦ－α、ＦＡＳリガンド、アミロイド前駆体タンパク質、心房性ナトリウム利尿因子（atrial naturetic factor）、ｏｂ－レプチン、ｕｃｐ－１、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＰＤＧＦ、ＰＡＦ、ｐ５３、Ｒｂ、胎児ヘモグロビン、ジストロフィン、ユートロフィン（eutrophin）、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ－１、ＶＥＧＦ受容体 ｆｌｔおよびｆｌｋ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ｂｃｌ－２、サイクリン、アンジオスタチン、ＩＧＦ、ＩＣＡＭ－１、ＳＴＡＴＳ、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｍｙｂ、ＴＨ、ＰＴＩ－１、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、ＦＡＤ２－１、デルタ－１２デサチュラーゼ、デルタ－９デサチュラーゼ、デルタ－１５デサチュラーゼ、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシルＡＣＰ－チオエステラーゼ、ＡＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ウイルス遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、および細菌遺伝子が挙げられる。一般に、調節するのに適した遺伝子としては、これだけに限定されないが、サイトカイン、リンフォカイン、増殖因子、分裂促進因子、走化性因子、有機体活性因子（ｏｎｔｏ－ａｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）、受容体、カリウムチャネル、Ｇタンパク質、シグナルトランスダクション分子、耐病性遺伝子、および他の疾患関連遺伝子が挙げられる。
細胞膜を渡ってポリペプチドを輸送するために、毒素分子を使用することができる。多くの場合、そのような分子は、少なくとも２つの部分：転座または結合性ドメインまたはポリペプチドおよび別個の毒素ドメインまたはポリペプチドで構成される（「二成分毒素」と称される）。一般には、転座ドメインまたはポリペプチドが細胞受容体に結合し、次いで、毒素が細胞内に輸送される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓイオタ毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、百日咳毒素（ＰＴ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ毒素、および百日咳アデニル酸シクラーゼ（ＣＹＡ）を含めたいくつかの細菌毒素が、ペプチドを細胞の細胞質基質に内部またはアミノ末端融合物として送達するための試みにおいて使用されている（Aroraら（１９９３年）、J. Biol. Chem.、２６８巻：３３３４～３３４１頁；Perelleら（１９９３年）、Infect. Immun.、６１巻：５１４７～５１５６頁（１９９３年）；Stenmarkら（１９９１年）、J. Cell Biol.、１１３巻：１０２５～１０３２頁（１９９１年）；Donnellyら（１９９３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻：３５３０～３５３４頁；Carbonettiら（１９９５年）、Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. ９５巻：２９５頁；Seboら（１９９５年）、Infect. Immun.、６３巻：３８５１～３８５７頁；Klimpelら（１９９２年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：１０２７７～１０２８１頁；およびNovakら（１９９２年）、J. Biol. Chem.、２６７巻：１７１８６～１７１９３頁）。
エフェクターは、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞に、リポソームおよび免疫リポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）などのリポソーム誘導体によって導入することもできる。用語「リポソーム」は、水相が封入された、１つまたは複数の同心性に配列した脂質二重層で構成される小胞を指す。水相は、一般には、細胞に送達される化合物、この場合ではエフェクターを含有する。リポソームは原形質膜と融合し、それにより、エフェクターが細胞質基質中に放出される。あるいは、リポソームは、輸送小胞として細胞によって貪食されるまたは取り込まれる。エンドソームまたはファゴソームに入ったら、リポソームは、分解されるかまたは輸送小胞の膜と融合し、その内容物が放出される。
本開示は、生殖細胞系列突然変異を含む非ヒト、トランスジェニック動物を生成する方法であって、本開示のタンパク質のうちの１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを非ヒト、トランスジェニック動物の細胞に導入するステップを含む方法を提供する。本開示の組成物は、生物に局所的にまたは全身的に投与することができる。
本開示は、非ヒト、トランスジェニック動物の生殖細胞系列の突然変異誘発を行う方法であって、本開示のタンパク質のうちの１つまたは複数をコードする核酸分子を細胞に、トランスジェニック動物を生成するために十分な条件下で導入するステップを含む方法を提供する。
定義
本開示を通じて、使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、前後関係が明らかに他の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの方法」に対する言及は複数のそのような方法を含み、「１つの用量」に対する言及は１つまたは複数の用量および当業者に公知のその均等物に対する言及、などを含む。
用語「約」または「およそ」は、当業者により決定される、その値がどのように測定または決定されるか、例えば測定系の限界に一部依存する特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は１または複数の標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、ある所与の値の２０％まで、または１０％まで、または５％まで、または１％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的な系または過程に関して、この用語は、ある値の一桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。本出願および特許請求の範囲中で特定の値が記載されている場合、特に断らない限り、用語「約」は特定の値に対して許容可能な誤差範囲内を意味することが前提とされている。
本開示は、単離または実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を提供する。「単離された」もしくは「精製された」ポリヌクレオチドもしくはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境で見られる、そのポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常伴うかまたは相互作用する成分を実質的または本質的に含まない。したがって、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により生産されたとき他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成されたとき化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない。最適な場合、「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来した生物のゲノムＤＮＡ内で天然にはそのポリヌクレオチドに隣接する配列（最適にはタンパク質をコードする配列）（すなわち、そのポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来した細胞のゲノムＤＮＡ内で天然にはそのポリヌクレオチドに隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換えにより生産されたとき、最適な培養培地は（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満の化学的前駆物質または目的のタンパク質以外の化学物質を示す。
本開示は、開示されているＤＮＡ配列およびこれらのＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の断片およびバリアントを提供する。本開示を通じて、使用されるとき、用語「断片」とは、ＤＮＡ配列の一部分またはそれによりコードされるアミノ酸配列、したがってタンパク質の一部分を指す。ＤＮＡ配列のコード配列を含む断片は、ネイティブなタンパク質の生物学的活性、したがって本明細書に記載されている標的ＤＮＡ配列に対するＤＮＡ認識または結合活性を保持するタンパク質断片をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なＤＮＡ配列の断片は、一般に、生物学的活性を保持するタンパク質をコードしないか、またはプロモーター活性を保持しない。したがって、ＤＮＡ配列の断片は少なくとも約２０ヌクレオチドから、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、そして全長までの本発明のポリヌクレオチドの範囲であり得る。
本開示の核酸またはタンパク質は、モノマー単位および／または反復単位を標的ベクターに予め組み立てることを含むモジュール式アプローチにより構築することができ、この標的ベクターはその後最終の目標ベクターに組み立てることができる。本開示のポリペプチドは、本開示の反復モノマーを含み得、反復単位をデスティネーションベクターに予め組み立てることによってモジュール式アプローチにより構築することができ、このデスティネーションベクターはその後最終の目標ベクターに組み立てることができる。本開示は、この方法により生産されるポリペプチドおよびこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュール式アプローチにより生産されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物および細胞を提供する。
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、特に単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）および多エピトープ特異性をもつ抗体組成物に及ぶ。また、本明細書に定義されているような本発明の抗体の天然または合成のアナログ、突然変異体、バリアント、アレル、ホモログおよびオルソログ（本明細書ではまとめて「アナログ類」という）を使用することも本発明の範囲内である。したがって、本発明の一実施形態によると、用語「本発明の抗体」はその最も広い意味でそのようなアナログ類にも及ぶ。一般に、そのようなアナログ類においては、本明細書に定義されているような本発明の抗体と比較して、１または複数のアミノ酸残基が置き換えられ、欠失され、および／または追加されていてもよい。
「抗体断片」、およびそのあらゆる文法上の変化形は、本明細書で使用されるとき、インタクトな抗体の一部分であって、そのインタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含む部分と定義され、ここでその一部分はインタクトな抗体のＦｃ領域の不変重鎖ドメイン（すなわち、抗体のアイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まない。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；連続したアミノ酸残基の１つの途切れない配列からなる一次構造を有するポリペプチドであるあらゆる抗体断片（本明細書では「単鎖抗体断片」または「単鎖のポリペプチド」という）、例えば、無制限に、（１）単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）１つの軽鎖可変ドメイン、または軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片のみを含有し、関連する重鎖部分をもたない単鎖のポリペプチド、ならびに（３）１つの重鎖可変領域、または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片のみを含有し、関連する軽鎖部分をもたない単鎖のポリペプチド；ならびに抗体断片から形成される多特異的または多価の構造体を含む。１または複数の重鎖を含む抗体断片において、重鎖は、インタクトな抗体の非Ｆｃ領域に見られる任意の定常ドメイン配列（例えばＩｇＧアイソタイプのＣＨＩ）を含有することができ、および／またはインタクトな抗体に見られる任意のヒンジ領域配列を含有することができ、および／または重鎖のヒンジ領域配列または定常ドメイン配列に融合しているかまたは位置するロイシンジッパー配列を含有することができる。用語はさらに、一般に単一のモノマー性可変抗体ドメイン（例えば、ラクダ由来）を有する抗体断片を指す単一ドメイン抗体（「ｓｄＡＢ」）を含む。そのような抗体断片のタイプは当業者により容易に理解されるであろう。
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合性の相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。
「結合性タンパク質」は、別の分子に非共有結合によって結合することができるタンパク質である。結合性タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ－結合性タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ－結合性タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質－結合性タンパク質）に結合することができる。タンパク質－結合性タンパク質の場合、タンパク質は自身に結合する（ホモ二量体、ホモ三量体、等を形成する）ことができ、および／または異なる複数のタンパク質（複数可）の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合性タンパク質は１より多くの種類の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質はＤＮＡ－結合性、ＲＮＡ－結合性およびタンパク質－結合性の活性を有する。
用語「含む」は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味することを意図している。組成物および方法を定義するのに使用される場合「から本質的になる」は、意図された目的に対して使用されるときその組合せに対して本質的な意義を有する他の要素を排除することを意味する。したがって、本明細書に定義されている要素から本質的になる組成物は微量の汚染物質または不活性担体を排除しない。「からなる」は、微量より多い他の構成成分の要素および実質的な方法ステップを排除することを意味している。これらの移行用語の各々により定義される実施形態は本発明の範囲内である。
用語「エフェクター分子」は、細胞内で局所的効果を発揮することができるタンパク質またはタンパク質ドメイン、大抵の場合酵素タンパク質のような分子を意味する。エフェクター分子は様々な異なる形態をとり得、例えば、タンパク質またはＤＮＡに選択的に結合して、例えば生物学的活性を調節する。エフェクター分子は、限定されることはないがヌクレアーゼ活性を含めて多種多様な異なる活性を有し得、酵素活性を上昇もしくは低下させ、遺伝子発現を増大もしくは減少させ、または細胞シグナリングに影響を及ぼす。その他のエフェクター分子の例は当業者には容易に認識されるであろう。
用語「エピトープタグ」、または「親和性タグ」とは、タンパク質またはリガンドとの特異的な相互作用を可能にする短いアミノ酸配列またはペプチドを意味する。
用語「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、当エピトープに独特の空間的コンフォメーションにある３個のアミノ酸を含むことができよう。一般に、エピトープは少なくとも４、５、６、または７個のそのようなアミノ酸からなり、より普通には、少なくとも８、９、または１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む。
本明細書で使用されるとき、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程および／またはその転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するならば、発現は真核細胞内でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれている情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡまたはその他のあらゆる種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳により生産されるタンパク質であることができる。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、およびエディティングのような過程により修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化により修飾されたタンパク質も含む。
遺伝子発現の「モジュレーション」または「調節」とは遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションは、限定されることはないが、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を含むことができる。
用語「作動可能に連結した」またはその等価な表現（例えば、「作動できるように連結した」）は、２つまたはそれ超の分子が互いに対して、相互作用して、１つもしくは両方の分子またはそれらの組合せに帰すことができる機能に影響を及ぼすことができるように位置することを意味する。
非共有結合によって連結した成分ならびに非共有結合によって連結した成分を作製および使用する方法が開示されている。様々な成分は本明細書に記載されているように多種多様な異なる形態をとり得る。例えば、非共有結合によって連結した（すなわち、作動可能に連結した）タンパク質を使用して、当技術分野の１つまたは複数の問題を回避する一時的な相互作用を可能にし得る。タンパク質のような非共有結合によって連結した成分の会合し解離する能力は、所望の活性にとってそのような会合が必要とされる状況下でのみ、または主としてそのような状況下で機能的会合を可能にする。連結は所望の効果が可能になるのに充分な持続時間であり得る。
タンパク質を生物のゲノム内の特異的な遺伝子座に導くための方法が開示されている。この方法は、ＤＮＡ局在化成分を提供し、エフェクター分子をもたらすステップを含み得、ここでＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子は非共有結合による連結によって作動可能に連結することができる。
用語「ｓｃＦｖ」は単鎖の可変断片を指す。ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域がリンカーペプチドで接続された融合タンパク質である。リンカーペプチドは約５～４０個のアミノ酸または約１０～３０個のアミノ酸または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０個のアミノ酸の長さであり得る。単鎖の可変断片は完全な抗体分子で見られる定常Ｆｃ領域を欠き、したがって、抗体を精製するのに使用される共通の結合部位（例えば、プロテインＧ）を欠いている。この用語はさらに、細胞の細胞質内で安定であり、細胞内タンパク質に結合し得る抗体である細胞内抗体であるｓｃＦｖを含む。
用語「単一ドメイン抗体」は、特異的な抗原に選択的に結合することができる単一のモノマー性可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は一般に、全抗体と類似の抗原に対する親和性を一般に有するが、より耐熱性であって、洗剤および高濃度の尿素に対して安定である、重鎖抗体または共通のＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む、約１１０個のアミノ酸の長さのペプチド鎖である。例はラクダまたは魚の抗体に由来するものである。あるいは、単一ドメイン抗体は、４つの鎖をもつ共通のネズミまたはヒトのＩｇＧから作製することができる。
用語「特異的に結合する」および「特異的な結合」は、本明細書で使用されるとき、抗体、抗体断片またはナノボディの、いろいろな抗原の均質な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する能力を意味する。ある特定の実施形態では特異的な結合相互作用は試料中の、一部の実施形態では約１０～１００倍またはそれ超（例えば、約１０００倍または１０，０００倍超）の望ましい抗原と望ましくない抗原とを区別する。「特異性」とは、免疫グロブリンまたはナノボディのような免疫グロブリン断片の、異なる抗原性標的よりも１つの抗原性標的に優先的に結合する能力を指し、必ずしも高い親和性を暗示しない。
「標的部位」または「標的配列」は、結合するのに充分な条件が存在する場合結合性分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。
用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合によって連結した少なくとも２個のヌクレオチドを指す。単一のストランドの記述は相補的なストランドの配列も規定する。したがって、核酸は、記述されている単一のストランドの相補的なストランドも包含し得る。また本開示の核酸は、同じ構造を保持するかまたは同じタンパク質をコードする実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。
本開示のプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができる一本鎖の核酸を含み得る。したがって、本開示の核酸はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを指し得る。
本開示の核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。本開示の核酸は、分子の大部分が一本鎖であるときでも二本鎖の配列を含有し得る。本開示の核酸は、分子の大部分が二本鎖であるときでも一本鎖の配列を含有し得る。本開示の核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらのハイブリッドを含み得る。本開示の核酸はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せを含有し得る。本開示の核酸はウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組合せを含有し得る。本開示の核酸は非天然のアミノ酸修飾を含むように合成され得る。本開示の核酸は化学的合成方法または組換え法によって得ることができる。
本開示の核酸は、その全配列、またはその任意の一部が、非天然であってもよい。本開示の核酸は、天然には起こらず、全体の核酸配列を非天然にする１または複数の突然変異、置換、欠失、または挿入を含有し得る。本開示の核酸は１または複数の重複、逆位または反復配列を含有し得、得られる配列は天然には存在せず、全体の核酸配列が非天然になる。本開示の核酸は天然には存在しない改変された、人工の、または合成のヌクレオチドを含有し得、全体の核酸配列が非天然となる。
遺伝子コードの多重性を考えると、複数のヌクレオチド配列が任意の特定のタンパク質をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列は全て本発明で考えられる。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「作動可能に連結した」は、空間的に接続されているプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との間隔は、そのプロモーターが由来した遺伝子内における、そのプロモーターとそれが制御する遺伝子との間隔とおよそ同じであることができる。プロモーターと遺伝子との間隔の変動はプロモーターの機能を損失することなく適応することができる。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「プロモーター」は、細胞内での核酸の発現を授与し、活性化し、または増強することができる合成または天然由来の分子を指す。プロモーターは、１または複数の特異的な転写調節配列を含み、発現をさらに増強し、および／またはその空間的な発現および／または一時的な発現を変更することができる。プロモーターはまた遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含むことができ、これは転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる。プロモーターはウイルス、細菌、菌類、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子成分の発現を、発現が起こる細胞、組織または臓器に関して、または、発現が起こる発生段階に関して構成的にまたは異なる形で、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、または誘発剤のような外的刺激に応答して調節することができる。プロモーターの代表的な例はバクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターを含む。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、またはそれ超のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である第１の配列を指すか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「実質的に同一」とは、第１および第２の配列が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０またはそれ超のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であることを指す、または核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体に対して実質的に相補的であることを指す。
本開示を通じて、使用されるとき、核酸を記載するのに使用されている場合用語「バリアント」とは、（ｉ）言及されているヌクレオチド配列の一部または断片；（ｉｉ）言及されているヌクレオチド配列またはその一部の相補体；（ｉｉｉ）言及されている核酸またはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）言及されている核酸、その相補体、またはそれと実質的に同一の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を指す。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「ベクター」は複製起点を含有する核酸配列を指す。ベクターはウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌性人工染色体または酵母の人工染色体であることができる。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターであることができる。ベクターは自己複製する染色体外ベクターであることができ、好ましくはＤＮＡプラスミドである。
本開示を通じて、使用されるとき、ペプチドまたはポリペプチドを記載するのに使用される場合用語「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを指す。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列をもつ言及されているタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列をもつタンパク質も意味することができる。
アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸が類似の性質（例えば、親水性、荷電した領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換わることは、当技術分野で、通例小さな変化を含むものとして認識されている。これらの小さな変化は、部分的に、当技術分野で理解されているようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考察することによって同定することができる。Kyteら、J. Mol. Biol. １５７巻：１０５～１３２頁（１９８２年）。アミノ酸の疎水性親水性指標はその疎水性および電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標のアミノ酸は置換することができ、それでもタンパク質の機能を保持することができる。１つの態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性も、生物学的機能を保持するタンパク質を生じる置換を明らかにするのに使用することができる。ペプチド中におけるアミノ酸の親水性を考察することにより、抗原性および免疫原性をうまく相互に関連付けることが報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大局所的平均親水性の計算が可能になる。参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号。
類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、±２内の親水性値を有するアミノ酸間で互いに行うことができる。アミノ酸の疎水性指標および親水性値の両方がそのアミノ酸の特定の側鎖により影響される。その観察と一致して、生物学的機能と適合性のアミノ酸置換は、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の、疎水性、親水性、電荷、サイズ、およびその他の性質により明らかにされる相対的類似性に依存すると理解される。
本明細書で使用される「保存的な」アミノ酸置換は以下の表Ａ、Ｂ、またはＣに示されているように定義し得る。一部の実施形態では、融合ポリペプチドおよび／またはそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変により導入された保存的置換を含む。アミノ酸は物理的性質ならびに二次および三次タンパク質構造に対する貢献度に従って分類することができる。保存的置換は１つのアミノ酸の類似の性質を有する別のアミノ酸による置換である。代表的な保存的置換を表Ａに示す。
Figure 0007170090000021
あるいは、保存的アミノ酸は、表Ｂに記載されているように、Lehninger、(Biochemistry、第２版; Worth Publishers., Inc. NY, N.Y. （１９７５年）、７１～７７頁)に記載されているように分類することができる。
Figure 0007170090000022
代わりに、代表的な保存的置換が表Ｃに記載されている。
Figure 0007170090000023
本開示のポリペプチドは１または複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、もしくは置換、またはそれらの任意の組合せ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失、もしくは置換以外の改変を有するポリペプチドを含むことが意図されているものと理解されたい。本開示のポリペプチドまたは核酸は１または複数の保存的置換を含有し得る。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「１より多くの」前述のアミノ酸置換とは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個またはそれ超の列挙されているアミノ酸置換を指す。用語「１より多くの」は２、３、４、または５個の列挙されているアミノ酸置換を指し得る。
本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、その全配列、またはその任意の一部が非天然であってもよい。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は天然には存在しない１または複数の突然変異、置換、欠失、または挿入を含有し得、そのため全体のアミノ酸配列が非天然となる。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は１または複数の重複、逆位または反復配列を含有し得、その結果得られる配列は天然には存在せず、全体のアミノ酸配列が非天然となる。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は天然には存在しない改変、人工、または合成のアミノ酸を含有し得、そのため全体のアミノ酸配列が非天然となる。
本開示を通じて使用される「配列同一性」は、デフォルトパラメーターを使用してNational Center for Biotechnology Information (NCBI)ｆｔｐサイトから検索することができる２つの配列をＢＬＡＳＴするためのスタンドアローンで実行可能なＢＬＡＳＴエンジンプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）を使用して決定され得る（TatusovaおよびMadden、FEMS Microbiol Lett.、１９９９年、１７４巻、２４７～２５０頁；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。２またはそれ超の核酸またはポリペプチド配列との関連で使用されるとき、用語「同一の」または「同一性」とは、各々の配列の指定された領域 にわたって同じである残基の指定された割合を指す。この割合は、２つの配列を最適に整列させ、２つの配列を指定された領域にわたって比較し、双方の配列中で同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、この一致した位置の数を指定された領域内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージ を得ることによって計算することができる。２つの配列の長さが異なるか、またはアラインメントにより１または複数のずれた末端が生成し、比較のための指定された領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は計算式の分母には含めるが分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は等価物とみなすことができる。同一性は手作業で、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０のようなコンピューターシーケンスアルゴリズムを使用して実行することができる。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「内因性」とは、標的遺伝子またはそれが導入される宿主細胞に天然において付随する核酸またはタンパク質配列を指す。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「外因性」とは、標的遺伝子またはそれが導入される宿主細胞に天然においては付随しない核酸またはタンパク質配列、例えば、天然に存在する核酸、例えば、ＤＮＡ配列の非天然の多重コピー、または非天然のゲノム位置に位置する天然に存在する核酸配列を指す。
本開示は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入する方法を提供する。「導入すること」により、宿主細胞の内部に構築物が接近するように、ポリヌクレオチド構築物を植物に提示することが意図されている。本発明の方法は、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部に接近する限り、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞中に導入する特定の方法に依存しない。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、菌類および動物に導入する方法は、限定されることはないが、安定な形質転換法、一過性の形質転換法、およびウイルス媒介法を含めて、当技術分野で公知である。
「安定な形質転換」によって、植物に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノム内に組み込まれ、その子孫により受け継がれることができるということが意図されている。「一過性形質転換」により、宿主に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノム内に組み込まれないことが意図されている。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「遺伝子改変植物（またはトランスジェニック植物）」とは、そのゲノム内に外因性ポリヌクレオチドを含む植物を指す。一般に、そして好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが後に続く世代に受け継がれるように、ゲノム内に安定に組み込まれる。外因性ポリヌクレオチドは単独で、または組換え発現カセットの一部としてゲノムに組み込まれ得る。「トランスジェニック」は、本明細書中で、その遺伝子型が最初にそのように変更された導入遺伝子を含む外因性核酸の存在によって変更されているあらゆる細胞、細胞株、カルス、組織、植物部位または植物、ならびに最初のトランスジェニックから有性交雑または無性繁殖により創成されるものを含む形で使用されている。用語「トランスジェニック」は、本明細書で使用されるとき、伝統的な植物育種方法による、または無作為交配、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、もしくは自然突然変異のような天然に起こる事象によるゲノム（染色体または染色体外）の変更を包含しない。
本開示を通じて、使用されるとき、用語「改変する」は、配列が単にポリペプチドの結合により改変されていると考えられることを意味することが意図されている。ヌクレオチドの配列が変化していることを示唆することは意図されていないが、目的の核酸へのポリペプチドの結合後そのような（およびその他の）変化が起きる可能性はある。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡである。目的の核酸の改変（モジュール式反復単位を含有するように改変されたポリペプチドによる結合の意味で）は、多くの方法（例えばゲル移動度シフトアッセイ、標識されたポリペプチドの使用－標識は放射能、蛍光、酵素またはビオチン／ストレプトアビジン標識を含むことができよう）のいずれかで検出することができよう。目的の核酸配列の改変（およびその検出）が（例えば疾患の診断で）必要とされる全てであり得る。しかし、望ましくは、試料のさらなる処理が行われる。便利には、ポリペプチド（およびそれに特異的に結合した核酸配列）が試料の残りの部分から分離される。有利には、そのような分離を容易にするためにポリペプチド－ＤＮＡ複合体が固相支持体に結合される。例えば、ポリペプチドはアクリルアミドまたはアガロースゲルマトリックス中に存在してもよく、または、より好ましくは、膜の表面もしくはマイクロタイタープレートのウェルに固定化される。
全ての割合および比は他に示されない限り重量で計算される。
全ての割合および比は他に示されない限り全組成物に基づいて計算される。
本開示を通じて与えられるあらゆる最大の数値限定は、それより低いあらゆる数値限定が明確に本明細書に記載されているかのように、そのようなより低いあらゆる数値限定を含む。本開示を通じて与えられるあらゆる最小の数値限定は、それより高いあらゆる数値限定が明確に本明細書に記載されているかのように、そのようなより高いあらゆる数値限定を含む。本開示を通じて与えられるあらゆる数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るそれより狭いあらゆる数値範囲が全て明確に本明細書に記載されているかのように、そのようなより狭いあらゆる数値範囲を含む。
本明細書に開示されている値は述べられている正確な数値に厳密に限定されることはないものと理解される。代わりに、他に断らない限り、各々のそのような値は述べられている値およびその値の周りの機能的に等価な範囲の両方を意味することが意図されている。例えば、「２０μｍ」として開示されている値は「約２０μｍ」を意味することが意図されている。
いずれかの相互参照されているかまたは関連する特許または出願を含めて本明細書で引用されたあらゆる文書は、明確に排除またはその他制限されない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いかなる文書の引用も、それが本明細書に開示されているかまたは特許請求の範囲に記載されているいずれかの発明に対する先行技術であること、またはそれが単独で、またはいずれかの他の文献とのいずれかの組合せで、そのようないずれかの発明を教示し、示唆し、または開示していることを承認するものではない。さらに、本文書中のいずれかの用語の意味または定義が参照により組み込まれた文書中の同じ用語のいずれかの意味または定義と矛盾する範囲については、本文書中でその用語に割り当てられている意味または定義が優先する。
本開示の特定の実施形態を例示し、記載して来たが、本開示の思想および範囲から逸脱することなく様々なその他の変形および修正をなすことができる。添付の特許請求の範囲は本開示の範囲内に入るそのような変形および修正を全て含む。
本明細書に開示されている本発明がより効率的に理解され得るように、以下に実施例を挙げる。これらの実施例は実例の目的のみのものであり、いかなる意味でも本発明を限定すると解すべきではないものと理解されたい。これらの実施例を通じて、分子クローニング反応、およびその他の標準的な組換えＤＮＡ技術は、Maniatisら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Press（１９８９年）に記載されている方法に従い、その他に記載されている以外は市販の試薬を使用して行った。
（実施例１）
機能解析によるＲａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬ（ＲＴＡＬ）をもつ核酸ベクターの作製
Ｒａｌｓｔｏｎｉａゲノムのクラスター解析および配列相同性の再調査により、公知のＴＡＬ配列と相同である配列番号１の配列が明らかになった。
特許請求されている本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は当業者に公知の分子生物学技術によって作製される。例えば、本発明のポリタンパク質をコードする各々の核酸配列に隣接するＸｂａＩおよび／またはＳａｌＩ制限部位をもつＤＮＡ配列を合成する。ポリメラーゼ連鎖反応を実施して、ある特定の制限エンドヌクレアーゼ部位をもつＤＮＡを増幅する。配列をゲル精製し、単離し、水またはライゲーション反応に適した緩衝液で復元する。必要な調節エレメントを含むエフェクター機能（例えばヌクレアーゼ機能）をもつタンパク質をコードするプラスミドを、プラスミドの多重クローニング部位で次の配列をコードする１または複数の核酸配列にライゲーションする：
ａ． LSTEQVVAIAS NK GGKQALEAVKAHLLDLLGAPYV（配列番号３９）
ｂ． LSTEQVVAIAS NN GGKQALEAVKAQLLELRAAPYE（配列番号４０）
ｃ． LSTAQVVAIAS NG GGKQALEGIGEQLLKLRTAPYG（配列番号４１）
ｄ． LSTAQVVAIAS HD GGKPALEAVWAKLPVLRGVPYA（配列番号４２）
ｅ． LSTEQVVTIAS SI GGKQALEAVKVQLPVLRAAPYE（配列番号４３）
プラスミド配列を、高コピー数のプラスミドの生産に適した細菌に形質転換する。少なくとも１つの上記ポリペプチドを含有するプラスミドは、抗生物質選択を使用して選択し、単離し、当業者に公知の技術を使用して細菌細胞から精製することができる。
プラスミドを構築し、発現したＤＮＡ－結合性ポリペプチドのｉｎ－ｖｉｔｒｏ試験は、参照によりその全体が組み込まれる、Nature Biotechnology ２０１２年５月；３０巻（５号）：４６０～５頁. 「FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.」 Reyon D、Tsai SQ、Khayter C、Foden JA、Sander JD、Joung JKに記載されている方法を使用して確認される。
予め組み立てられたＴＡＬＥ反復をコードするプラスミドアーカイブの構築
ＴＡＬＥ反復アレイを、Miller, J.C.ら（「A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.」、Nat Biotechnol. ２０１１年；２９巻：１４３～１４８頁；その内容は参照により本明細書に組み込まれる）により最初に記載された、そのアミノ酸およびＤＮＡ配列がわずかに異なる別個のＴＡＬＥ反復骨格が反復パターンで存在する同じアーキテクチャを使用して構築した。アレイ内の最初のアミノ－末端ＴＡＬＥ反復はα単位と呼称した。このα単位に続いてβ、γ、およびδ単位があり、次いで（クローニングのために必要なα単位上の独特のオーバーハングの創成を可能にするのに必要とされる）ＩＩＳ型制限部位の位置が異なり５’末端にあることを除いてα単位と本質的に同一のε単位が続く。次にこのε単位に続いて再びβ、γ、δおよびε単位の反復がある。クローニングのために必要とされる３’末端の創成に関連する制約のために、カルボキシ末端のγまたはε単位で終了するＴＡＬＥ反復アレイのためにわずかに改変されたＤＮＡ配列が必要とされた。
ＦＬＡＳＨ組み立てのためのＴＡＬＥ反復をコードするＤＮＡ断片の調製
ＦＬＡＳＨ組み立てに使用するα単位をコードするＤＮＡ断片を調製するために、各々のα単位プラスミドを鋳型とし、プライマーｏＪＳ２５８１（５’－ビオチン－ＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣ－３’）（配列番号４４）およびｏＪＳ２５８２（５’－ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧ－３’）（配列番号４５）を使用して２０ラウンドのＰＣＲを実施する。得られるＰＣＲ産物は５’末端でビオチン化されている。次に各々のαＰＣＲ産物を４０単位のＢｓａＩ－ＨＦ制限酵素で消化して４ｂｐのオーバーハングを生じさせ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ 精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を、最終産物を５０μｌの０．１Ｘ ＥＢ中に溶離する以外は製造業者の指示に従って使用して精製する。
ポリペプチド反復をコードするＤＮＡ断片を調製するために、１０μｇの各々のプラスミドを５０単位のＢｂｓＩ制限酵素によりＮＥＢｕｆｆｅｒ ２中において２時間３７℃で消化した後、５分間隔で加えた１００単位の各々のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ－ＨＦ、およびＳａｌＩ－ＨＦ酵素を使用してＮＥＢｕｆｆｅｒ ４中３７℃で連続制限消化を行う。後者の組の制限消化は、プラスミド骨格を切断して、このより大きいＤＮＡ断片がＦＬＡＳＨ組み立て過程中に行われるその後のライゲーションを妨げないことを確保するように設計されている。次に、これらの制限消化反応を、最終産物を１８０μｌの０．１Ｘ ＥＢ中に溶離する以外は製造業者の指示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製する。
自動化されたＦＬＡＳＨ組み立て
ＦＬＡＳＨ組み立ての全てのステップは、９６－ウェルプレート中でＳｃｉｃｌｏｎｅ Ｇ３リキッドハンドリングワークステーション（Ｃａｌｉｐｅｒ）または別の会社により販売されている同様な装置を使用し、ＳＰＲＩｐｌａｔｅ ９６－リングマグネット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびＤｙｎａＭａｇ－９６ Ｓｉｄｅマグネット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行われる。ＦＬＡＳＨの第１のステップでは、ビオチン化されたα単位断片を第１のβγδε断片にライゲーションした後、得られたαβγδε断片を２Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液中でＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｃ１ストレプトアビジンをコートした電磁ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合する。次いで、プレートをマグネット上に載せることによってビーズをウェルの側に引き寄せ、その後０．００５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００μｌのＢ＆Ｗ緩衝液で洗浄し、１００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で再び洗浄する。プレートをマグネットから取り外すことにより追加のβγδε断片をライゲーションし、各々のウェル内の溶液にビーズを再懸濁し、ビーズに結合した断片をＢｓａＩ－ＨＦ制限酵素で消化し、プレートをマグネット上に載せ、１００μｌのＢ＆Ｗ／Ｔｗｅｅｎ２０で、続いて１００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで洗浄し、その後次の断片をライゲーションする。この過程を追加のβγδε単位により数回繰返してビーズに結合した断片を延長する。ライゲーションするべき最後の断片は全長断片の発現ベクターへのクローニングを可能にするため常にβ、βγ＊、βγδ、またはδε＊単位である（δε＊単位で終了する断片は常にβγ単位のライゲーションが先行することが留意される）。
最終の全長ビーズ結合断片を４０単位のＢｓａＩ－ＨＦ制限酵素で、続いて２５単位のＢｂｓＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化する。ＢｂｓＩによる消化で断片がビーズから解放され、断片のクローニングのための独特の５’オーバーハングが生成する。ＢｓａＩ－ＨＦによる消化によって、クローニングのための独特の３’オーバーハングの創成がもたらされる。
ＴＡＬＥ反復アレイをコードするＤＮＡ断片のＴＡＬＥＮ発現ベクターへのサブクローニング
本発明者らのＦＬＡＳＨ組み立てされたＴＡＬＥ反復アレイをコードするＤＮＡ断片をＴＡＬＥ発現ベクターにサブクローニングする。一部の実験では、４またはそれ超の別々のプラスミドがある。一部の実験では、ベクターは、ＣＭＶプロモーター、哺乳動物細胞発現用に最適化された翻訳開始コドン、トリプルＦＬＡＧエピトープタグ、核局在化シグナル、ＴＡＬＥ １３タンパク質からのアミノ酸１５３～２８８（Miller, J.C.ら（Nat Biotechnol. ２０１１年；２９巻：１４３～１４８頁により番号付け；その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、２つのユニークかつ近傍に位置したＩＩＳ型ＢｓｍＢＩ制限部位、ＲＶＤをコードする０．５ＴＡＬＥ反復ドメイン、ＴＡＬＥ １３タンパク質からのアミノ酸７１５～７７７、および野生型ＦｏｋＩ切断ドメインを含む。
ＦＬＡＳＨにより組み立てられた全てのＤＮＡ断片は、ＢｓｍＢＩで消化される発現ベクターのいずれかへの方向性クローニングを可能にするオーバーハングを保有する。標準的なＴＡＬＥＮ発現ベクター（各々異なる０．５ＴＡＬＥ反復を保有する）はＡｄｄｇｅｎｅのような供給業者から入手可能であり、これらのプラスミドの全配列はこれらの構築物専用のウェブページから自由に入手可能である：ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ／ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ。
サブクローニング用のＴＡＬＥＮ発現ベクターを調製するために、５μｇのプラスミドＤＮＡを５０単位のＢｓｍＢＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によりＮＥＢｕｆｆｅｒ ３中８時間５５℃で消化する。消化したＤＮＡを、９０μｌのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を製造業者の指示に従って使用して精製し、１ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ中に最終濃度５ｎｇ／μｌまで希釈する。ＦＬＡＳＨ－組み立てしたＴＡＬＥ反復アレイを、４００ＵのＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してＴＡＬＥＮ発現ベクターにライゲーションする。ライゲーション産物を化学的にコンピテントなＸＬ－１ Ｂｌｕｅ細胞に形質転換する。通例、６つのコロニーを各々のライゲーションのために採取し、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶菌ミニプレップ法により単離する。同時に、同じコロニーを、プライマーｏＳＱＴ３４（５’－ＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＧ－３’）（配列番号４６）およびｏＳＱＴ３５（５’－ＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＧＧＧ－３’）（配列番号４７）を使用してＰＣＲによりスクリーニングする。ＰＣＲ産物をＱＩＡｘｃｅｌキャピラリー電気泳動系（Ｑｉａｇｅｎ）で解析する。正確な大きさのＰＣＲ産物を含有するクローンからのミニプレップＤＮＡをプライマーｏＳＱＴ１（５’－ＡＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＧ－３’）（配列番号４８）、ｏＳＱＴ３（５’－ＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣ－３’）（配列番号４９）、およびｏＪＳ２９８０（５’－ＴＴＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＧＧＣＡＣ－３’）（配列番号５０）によるＤＮＡ配列確認のために送る；ｏＳＱＴ１はＴＡＬＥ反復アレイコード配列の５’末端にアニールし、組み立てられたアレイのアミノ－末端半分の配列決定を可能にし、ｏＳＱＴ３はＴＡＬＥ反復アレイコード配列の３’末端にアニールし、組み立てられたアレイのカルボキシ－末端半分の配列決定を可能にし、ｏＪＳ２９８０はＦｏｋＩドメインのコード配列内にプライミングし（ｏＳＱＴ３の下流）、カルボキシ－末端の０．５ＴＡＬＥ反復ドメインの配列決定および検証を可能にする。
各々の組み立てについて６つのコロニーを、必要ならば続いて６つの追加のコロニーを上に記載されているようにしてスクリーニングする。このアプローチで、＞９０％の組み立て反応について１または複数の配列が確認されたクローンが生成する。これらの割合は、主として、１６．５ＴＡＬＥ反復をコードするＤＮＡ断片を構築するように設計された実験から導出される。
ＥＧＦＰ ＴＡＬＥＮ活性および毒性アッセイ
ＥＧＦＰレポーターアッセイは、ＥＧＦＰ－ＰＥＳＴ融合タンパク質を構成的に発現する組み込まれた構築物を有するクローンのＵ２ＯＳヒト細胞株で行われる。このクローン株はポリクローナルＵ２ＯＳ ＥＧＦＰ－ＰＥＳＴレポーター株に由来する。クローンのＵ２ＯＳ ＥＧＦＰ－ＰＥＳＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８が補充されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養する。細胞に、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥ、およびプログラムＤＮ－１００を製造業者の指示に従って使用して、５００ｎｇの各々のＴＡＬＥＮプラスミドＤＮＡおよび５０ｎｇのｐｔｄＴｏｍａｔｏ－Ｎ１プラスミドＤＮＡを三重にトランスフェクトする。１μｇのｐｔｄＴｏｍａｔｏ－Ｎ１プラスミド単独を陰性対照として三重にトランスフェクトする。トランスフェクションの２および５日後ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩフローサイトメーターを使用して細胞のＥＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ発現をアッセイする。
内因性のヒト遺伝子のＰＣＲ増幅および配列検証
標的とした遺伝子座を増幅するためのＰＣＲ反応を実施する。
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）による標準的なＰＣＲ条件を製造業者の指示に従って３５サイクル（９８℃、１０ｓの変性；６８℃、１５ｓのアニーリング；７２℃、３０ｓの延伸）実行する。標準的な条件下で増幅しない遺伝子座の場合、次の修正の１つを使用する：１）ベタインを最終濃度１．８Ｍまで添加、２）１．８Ｍベタインを用いたタッチダウンＰＣＲ（［９８℃、１０ｓ；７２～６２℃、－１℃／サイクル、１５ｓ；７２℃、３０ｓ］１０サイクル、［９８℃、１０ｓ；６２℃、－１℃／サイクル、１５ｓ；７２℃、３０ｓ］２５サイクル）、および３）３％または５％のＤＭＳＯの添加およびアニーリング温度６５℃。ＰＣＲ産物の正確な大きさをＱＩＡｘｃｅｌキャピラリー電気泳動系で解析する。正確な大きさの産物をＥｘｏＳａｐ－ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で処理して組み込まれなかったヌクレオチドまたはプライマーを取り除き、内因性遺伝子配列を確認するためにＤＮＡ配列決定へと送る。
内因性ヒト遺伝子のＮＨＥＪ－媒介突然変異を定量するためのＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ
Ｕ２ＯＳ－ＥＧＦＰ細胞を培養し、上に記載したようにして二重にトランスフェクトする。ゲノムＤＮＡを、ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドまたは対照プラスミドをトランスフェクトされた細胞から、高スループット磁気ビーズに基づく精製系（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ）を製造業者の指示に従って使用して単離する。内因性遺伝子座を増幅するためのＰＣＲを上に記載されたようにして３５サイクル実施し、断片をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）により製造業者の指示に従って精製した。２００ｎｇの精製したＰＣＲ産物を、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で、次のプロトコール（９５℃、５ｍｉｎ；９５～８５℃、－２℃／ｓ；８５～２５℃、－０．１℃／ｓ；４℃に保持）のサーモサイクラーを使用して変性しリアニールする。３３のハイブリダイズしたＰＣＲ産物を１０ＵのＴ７エンドヌクレアーゼＩにより３７℃で１５分２０μｌの反応体積中において処理した。２μｌの０．５ＭのＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰで精製し、方法ＯＭ５００を使用してＱＩＡｘｃｅｌキャピラリー電気泳動系で定量する。（切断された画分として示した親のアンプリコンピークの割合として示した）ＴＡＬＥＮ特異的な切断ピーク下の面積の合計を使用して、既に記載されているように次の式を使用して遺伝子改変レベルを推定する。
（％遺伝子改変＝１００×（１－（１－切断された画分）１／２）
（実施例２）
ＲＴＮ構築物
以下に示す５つの断片を合成し、各々ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて改変されたｐＵＣ５７：ｐＵＣ５７－ΔＢｓａＩ（Juong ら、FLASH assembly paperに開示されているベクター。この改変されたｐＵＣ５７：ｐＵＣ５７－ΔＢｓａＩはＢｓａＩ部位を破壊する単一の塩基対変化を含有する）にクローニングした。
ＲＴＮ１ ＥＢＥ：
ＮＫ （配列番号５１）：
Figure 0007170090000024
ＮＮ（配列番号５２）：
Figure 0007170090000025
ＮＧ（配列番号５３）：
Figure 0007170090000026
ＨＤ（配列番号５４）：
Figure 0007170090000027
ＳＩ（配列番号５５）：
Figure 0007170090000028
原理の証明のために、これらのクローニングした断片を使用して、ＦｏｋＩヌクレアーゼと融合した６つの反復単位のキメラタンパク質、すなわち一連のＡ（Ｃ、ＴおよびＧ）ヌクレオチドを標的とするキメラタンパク質を生成する。これらのキメラタンパク質を次に、レポーター構築物を使用して所望のＤＮＡ塩基に対する結合／標的効率に関して試験する。
これらの単位の結合効率が確認されたら、ＦＬＡＳＨ ＴＡＬＥＮのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＥＢＥライブラリーのコピーであるＲａｌｓｔｏｎｉａ ＥＢＥのライブラリーを生成する。次に、このライブラリーを使用して、ＦＬＡＳＨ ＴＡＬＥＮ系の正確なプロトコールに従ってＲａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥＮを生成することができる。
（実施例３）
メチルエステラーゼを用いて核酸ベクターを作製する
他の種からクローニングされたかまたは同じ種からクローニングされた追加の配列を、ＤＮＡ認識を用いる本明細書に開示されている実験のいずれかを行うためのモノマーまたはポリマー（タンパク質融合）としてそれ自身で、または連続して酵素として機能的に使用してもよい。当技術分野で公知の配列最適化技術を使用してＲＶＤ識別コンセンサス配列を創成した。細菌種のメチルエステラーゼ配列にわたってＢＬＡＳＴ検索を行った（図１参照）。次のポリペプチドが本明細書に開示されている核酸配列およびポリペプチド配列番号１～１９と類似のＤＮＡ塩基対認識能力を有するものとして同定された：
メチルエステラーゼに対するＴＡＬ ＥＢＥ
Figure 0007170090000029
Figure 0007170090000030
Figure 0007170090000031
Figure 0007170090000032
（実施例４）
一対のＢｍｐｒ２特異的ＥＢＥ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＤＮＡ結合性ドメイン、各々１６ＥＢＥ）を遺伝子合成し、ＸＴＮ－ＢＢ（ＦｏｋＩに融合したＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬ骨格）にクローニングする。これらの構築物をＲａｔ Ｃ６細胞にコトランスフェクトし、４８時間後Ｃｅｌ１サーベイヤーヌクレアーゼアッセイのためにｇＤＮＡを抽出する。アッセイが成功すると遺伝子座の元の４００ｂｐアンプリコンから２４０ｂｐおよび１５０ｂｐの亜集団が生成するはずである。結果を図２に示す。
アッセイにより、ＲａｌｓｔｏｎｉａおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥＮをトランスフェクトされた細胞内の予期された２５０ｂｐおよび１５０ｂｐバンドが明らかであるが、これはＷＴ陰性対照にはない。これは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＥＢＥがこの遺伝子座を標的とし、ＦｏｋＩヌクレアーゼのＲａｌｓｔｏｎｉａ ＥＢＥへの融合によりゲノムＤＮＡの標的とされた消化が起こることを示している。２５０ｂｐバンドを使用すると、５．７５％がＸＴＮ、１．８２％がＲＴＮであり、１５０ｂｐバンドを使用すると、３．６６％がＸＴＮ、５．４３％がＲＴＮである。
Figure 0007170090000033
Ｂｍｐｒ２ ＦＷＤ ＲＴＮ ＥＢＥのアミノ酸配列：
Figure 0007170090000034
Ｂｍｐｒ２ ＦＷＤ ＲＴＮ ＤＮＡ配列：
（太字：合成されたＲａｌｓｔｏｎｉａ ＥＢＥ）この配列は連続である（配列番号１６７）：
Figure 0007170090000035
Figure 0007170090000036
Figure 0007170090000037
Figure 0007170090000038
Figure 0007170090000039
Ｂｍｐｒ２ ＲＥＶ ＲＴＮ ＥＢＥのアミノ酸配列：
Figure 0007170090000040
Ｂｍｐｒ２ ＲＥＶ ＲＴＮ ＤＮＡ配列：
（太字：合成されたＲａｌｓｔｏｎｉａ ＥＢＥ）この配列は連続である（配列番号１８４）：
Figure 0007170090000041
Figure 0007170090000042
Figure 0007170090000043
Figure 0007170090000044
（実施例５）
ゴールデンゲートアセンブリ法を利用して、全長Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＤＮＡ結合性ドメインをＲａｌｓｔｏｎｉａまたはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥＮ骨格に組み立てるのに使用することができるＲａｌｓｔｏｎｉａ ＥＢＥおよび骨格ベクターのライブラリーを作製した。ＲＴＮをＲａｔ Ｃ６細胞株にコトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後解析のためにｇＤＮＡを抽出した。ＲＴＮ結合部位を含有する４２０ｂｐのｇＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。このアンプリコンを次に、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を製造業者のプロトコールに従って使用したＣｅｌ１アッセイにかけた。簡単にいうと、アンプリコンを一本鎖ＤＮＡに変性し、ゆっくりリアニーリングして二本鎖ＤＮＡに戻す。この過程の間、元のプールがＷＴおよび突然変異配列の混合物であったことを考慮すると、ＷＴおよび突然変異ストランド間でクロスハイブリダイゼーションが起こってヘテロ二重鎖が形成される。このリアニーリングしたプールをサーベイヤーヌクレアーゼで処理すると、ヘテロ二重鎖を認識してこれを切断し、元のアンプリコン（４２０ｂｐ）から２つのより短い断片（２５５ｂｐおよび１６５ｂｐ）を生成する。
術語：
ｐＲＶＤ：単一のＲａｌｓｔｏｎｉａ ＥＢＥを含有するプラスミド。個々のＥＢＥは遺伝子合成し、ＦＬＡＳＨ－ＸＴＮサブアレイ骨格（ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ）にクローニングした。
ｐＦｕｓＸ：任意の所与のＲＴＮの最初の１０個のＥＢＥを保持するサブアレイプラスミド。必要とされるピースは遺伝子合成し、ｐＨＳＧ－２９８（ＳａｃＩ、ＳｂｆＩ）にクローニングした。
ｐＦＵＳＺ：任意の所与のＲＴＮのＥＢＥ１１から最後から２番目のＥＢＥまでを保持するサブアレイプラスミド。Ｅｇ：Ｚ４はＥＢＥ１１～１４を保持し、Ｚ５はＥＢＥ１１～１５を保持し、Ｚ６はＥＢＥ１１～１６を保持する。遺伝子は合成し、ｐＨＳＧ－２９８（ＳａｃＩ、ＳｂｆＩ）にクローニングした。
ＸＴＮ－ｂｂ：ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合したＮ末端およびＣ末端のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬドメインを含有するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬ骨格。この骨格は、ＥＢＥにより特定される標的配列の５’のＴヌクレオチドを特定する。また標的配列の最後のヌクレオチドを特定する後半のＥＢＥも含有する。したがって、４つのＸＴＮ－ｂｂプラスミドがあり、各々が（ＦＬＡＳＨ ＸＴＮ骨格と同じ）標的配列の異なる最終のヌクレオチドを特定する。
全てのプラスミドは０．１×ＴＥ緩衝液中に１５０ｎｇ／ｕｌで保存する。
方法：（１６ＥＢＥ ＤＮＡ結合性ドメインの構築およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥＮ骨格へのクローニング）
カスタムＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクター構築物の組み立ては２つのステップを含む。（ｉ）反復モジュール（ｐＲＶＤ）の１～１０の反復のサブアレイへの組み立て、（ｉｉ）サブアレイの骨格への接合による最終構築物の作製。
１７ＲＶＤアレイ（５’－ＴＧＡＴＡＧＴＣＧＣ－ＣＴＴＡＴＧ－Ｔ－３’）を用いたＴＡＬＥＮモノマーの構築：ｐＲＶＤプラスミドから、順次番号付けされたプラスミドを使用してアレイのＲＶＤ１～１０をコードするものを選択する。例えば、最初のＲＶＤに対するプラスミドはｇＲＴＮ－１Ｔ、２番目はｇＲＴＮ－２Ｇ、３番目はｇＲＴＮ－３Ａ、等である。これらのプラスミドからのモジュールをサブアレイプラスミドｐＦＵＳ－Ｘにクローニングする。次に、再び１から番号付けされたプラスミドから出発して１６ＲＶＤアレイのＲＶＤ１１～１６に対するモジュールを選択する。すなわち、ＲＶＤ１１に対してはｇＲＴＮ－１Ｃを、ＲＶＤ１２に対してはｇＲＴＮ－２Ｔ等を使用する。ｐＦＵＳ－Ｚプラスミドは１～１０と番号付けられ、ＥＢＥの数に従って選択されるべきである。したがって、本発明者らの例では、ｐＦＵＳ－Ｚ６が使用されるべきである。
ｐＲＶＤおよびサブアレイプラスミド（各々１５０ｎｇ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）中に１μｌのＢｓａＩ（１０Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有する単一の２０μｌの反応中の消化およびライゲーションに付す。反応を、サーモサイクラー中で、３７℃で５分、１６℃で１０分、次いで５０℃に５分加熱、その後８０℃に５分の１０サイクルインキュベートする。次に、１μｌの２５ｍＭ ＡＴＰおよび１μｌのＰｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅ ＤＮａｓｅ（１０Ｕ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を加える。混合物を３７℃で１時間インキュベートした後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用する。細胞を、５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天に蒔き一晩３７℃にする。
各形質転換体からの６までのコロニーを、Ｍ１３フォワード（ｆｗｄ）およびリバース（ｒｅｖ）プライマーを用いてコロニーＰＣＲによりスクリーニングして、全長サブアレイを含有するクローンを同定した。全長のｐＦＵＳ－Ｘサブアレイクローンは１．１ｋｂのバンドを生成するはずであり、全長のｐＦＵＳ－Ｚ６クローンは７００ｂｐのバンド（多かれ少なかれ各ＥＢＥに対する１０５ｂｐの加減あり）を生成するはずである。全長のｐＦＵＳ－Ｘおよび全長のｐＦＵＳ－Ｚ６クローンの一晩培養を開始した。
プラスミドＤＮＡをｐＦＵＳ－ＸおよびｐＦＵＳ－Ｚ培養物から単離した。サブアレイを４つの骨格プラスミドの１つに接合した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中の各１５０ｎｇのｐＦＵＳ－ＸおよびｐＦＵＳ－Ｚプラスミド、１５０ｎｇの骨格プラスミド、この場合はＸＴＮ－ｂｂＴ、１μｌのＥｓｐ３Ｉ（１０Ｕ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で２０μｌの消化およびライゲーション反応混合物を調製する。次いで反応をサーモサイクラーで３７℃１０分、１６℃１５分の３サイクルインキュベートする。次に、反応をさらに３０分３７℃でインキュベートし、５０℃に５分、次いで８０℃に５分加熱する。室温に冷却した後、１μｌの２５ｍＭ ＡＴＰおよび１μｌのＰｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅ ＤＮａｓｅ（１０Ｕ、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後、反応をＰｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅ以外は上記のように使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換する。また、このステップで、カナマイシンの代わりにアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）を形質転換体の選択に使用する。
ＸＴＮ－ＶＦおよびＸＴＮ－ＶＲ２プライマーを用いて各形質転換からコロニーＰＣＲにより３個までのコロニーをスクリーニングし、各ＲＴＮに対する１全長クローン（２．１ｋｂバンドは１７ＥＢＥアレイを示す）の一晩培養を開始した。次に本発明者らはプラスミドＤＮＡを単離し、ＸＴＮ－ＶＦ、ＸＴＮ－ＶＲ１およびＸＴＮ－ＶＲ２を用いるＤＮＡ配列決定により最終の全長反復アレイを含有するクローンを同定する。
ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ消化したＸＴＮサブアレイ骨格（下線部位）（配列番号１８５）：
Figure 0007170090000045
Figure 0007170090000046
ＸＴＮ－ｂｂ（ＢｓｍＢＩ消化、部位は消化中に骨格から自己切除される）：
下線を付した配列はサブアレイｐＦＵＳ－ＸおよびｐＦＵＳ－Ｚと重複する。
ＸＴＮ－ｂｂＡ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＴＣＴＡＡＣＡＴＣ（配列番号１８６）で置き換えられている
ＸＴＮ－ｂｂＣ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＴＣＣＣＡＣＧＡＣ（配列番号１８７）で置き換えられている
ＸＴＮ－ｂｂＧ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＡＡＴＡＡＴＡＡＣ（配列番号１８８）で置き換えられている
ＸＴＮ－ｂｂＴ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮがＴＣＴＡＡＴＧＧＧ（配列番号１８９）で置き換えられている
Figure 0007170090000047
Figure 0007170090000048
Figure 0007170090000049
Figure 0007170090000050
ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩが隣接するｐＲＶＤ断片（遺伝子合成、ＢａｍＨＩ－ＥＢＥ－ＸｂａＩ））：
ｇＸＴＮ－１Ｃ：
Figure 0007170090000051
ｇＸＴＮ－２Ｃ：
Figure 0007170090000052
ｇＸＴＮ－３Ｃ：
Figure 0007170090000053
ｇＸＴＮ－４Ｃ：
Figure 0007170090000054
ｇＸＴＮ－５Ｃ：
Figure 0007170090000055
ｇＸＴＮ－６Ｃ：
Figure 0007170090000056
ｇＸＴＮ－７Ｃ：
Figure 0007170090000057
ｇＸＴＮ－８Ｃ：
Figure 0007170090000058
ｇＸＴＮ－９Ｃ：
Figure 0007170090000059
ｇＸＴＮ－１０Ｃ：
Figure 0007170090000060
ｇＸＴＮ－１Ｔ：
Figure 0007170090000061
ｇＸＴＮ－２Ｔ：
Figure 0007170090000062
ｇＸＴＮ－３Ｔ：
Figure 0007170090000063
ｇＸＴＮ－４Ｔ：
Figure 0007170090000064
ｇＸＴＮ－５Ｔ：
Figure 0007170090000065
ｇＸＴＮ－６Ｔ：
Figure 0007170090000066
ｇＸＴＮ－７Ｔ：
Figure 0007170090000067
ｇＸＴＮ－８Ｔ：
Figure 0007170090000068
ｇＸＴＮ－９Ｔ：
Figure 0007170090000069
ｇＸＴＮ－１０Ｔ：
Figure 0007170090000070
ｇＸＴＮ－１Ａ：
Figure 0007170090000071
ｇＸＴＮ－２Ａ：
Figure 0007170090000072
ｇＸＴＮ－３Ａ：
Figure 0007170090000073
ｇＸＴＮ－４Ａ：
Figure 0007170090000074
ｇＸＴＮ－５Ａ：
Figure 0007170090000075
ｇＸＴＮ－６Ａ：
Figure 0007170090000076
ｇＸＴＮ－７Ａ：
Figure 0007170090000077
ｇＸＴＮ－８Ａ：
Figure 0007170090000078
ｇＸＴＮ－９Ａ：
Figure 0007170090000079
ｇＸＴＮ－１０Ａ：
Figure 0007170090000080
ｇＸＴＮ－１Ｇ：
Figure 0007170090000081
ｇＸＴＮ－２Ｇ：
Figure 0007170090000082
ｇＸＴＮ－３Ｇ：
Figure 0007170090000083
ｇＸＴＮ－４Ｇ：
Figure 0007170090000084
ｇＸＴＮ－５Ｇ：
Figure 0007170090000085
ｇＸＴＮ－６Ｇ：
Figure 0007170090000086
ｇＸＴＮ－７Ｇ：
Figure 0007170090000087
ｇＸＴＮ－８Ｇ：
Figure 0007170090000088
ｇＸＴＮ－９Ｇ：
Figure 0007170090000089
ｇＸＴＮ－１０Ｇ：
Figure 0007170090000090
ＳｂｆＩおよびＳａｃＩが隣接するｐ－ＦＵＳ断片（遺伝子合成、ＳｂｆＩ－ｐＦＵＳ－ＳａｃＩ）
ｐＦＵＳ－Ｘ：
Figure 0007170090000091
ｐＦＵＳ－Ｚ１：
Figure 0007170090000092
ｐＦＵＳ－Ｚ２：
Figure 0007170090000093
ｐＦＵＳ－Ｚ３：
Figure 0007170090000094
ｐＦＵＳ－Ｚ４：
Figure 0007170090000095
ｐＦＵＳ－Ｚ５：
Figure 0007170090000096
ｐＦＵＳ－Ｚ６：
Figure 0007170090000097
ｐＦＵＳ－Ｚ７：
Figure 0007170090000098
ｐＦＵＳ－Ｚ８：
Figure 0007170090000099
ｐＦＵＳ－Ｚ９：
Figure 0007170090000100
ｐＦＵＳ－Ｚ１０：
Figure 0007170090000101
 （実施例７）
メチルエステラーゼおよびメチルトランスフェラーゼ３４ａａコンセンサスＥＢＥ：
QTTERIVAIGT（配列番号３００）nn（ｎｎが関連するＲＶＤで置き換えられている）GGTQALEAVLTALPRVCPGMV（配列番号２４２）
３４ａａＱＴＴＥＲＩＶＡＩＧＴ（配列番号３０１）ＳＨのＢａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ＳＨは非特異的なＲＶＤである）GGTQALEAVLTALPRVCPGMV（配列番号２４３）および
CAGACCACCGAGAGGATCGTGGCCATCGGCACCAGCCACGGCGGCACCCAGGCCCTGGAGGCCGTGCTGACCGCCCTGCCCAGGGTGTGCCCCGGCATGGTG（配列番号２４４）
メチルエステラーゼＥＢＥ（ＸＴＮ骨格中１４ＥＢＥ）（配列番号２４５）：
太字：メチルエステラーゼＥＢＥ。この実施例では全て非特異的ＲＶＤ ＳＨをもつ。
黒字：ＦＬＡＳＨ ＸＴＮ骨格。
Figure 0007170090000102
Figure 0007170090000103
Figure 0007170090000104
（実施例８）
代表的な非共有結合による連結の生成
ファージディスプレイを使用して、最適な連結を提供するＦＬＡＧ親和性タグに対するｓｃＦｖ抗体を同定する。親和性選択過程のストリンジェンシーを限定することにより、ｓｃＦｖ親和性における大きな多様性を得ることができる。この多様性は、ＦＬＡＧ親和性タグとＦＬＡＧタグに対する親和性をもつｓｃＦｖとの間の上首尾な連結を同定するためのＰｈＤアプローチの重要な利点を表し得る。一部の例で、より速いオフレートを有する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体はｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ複合体の許容可能な「ゆらぎ」を提供し得る。ｓｃＦｖ抗体のほぼ徹底的な検索により、ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ親和性タグ複合体の多種多様な可能なコンフォメーションの中から選択することが可能になる。ＰｈＤ戦略では、ＦＬＡＧエピトープに対する独特の一価ｓｃＦｖの生成を通じて、そのような多様性が創出され得る。
ｓｃＦｖ抗体の使用によって達成されるような非共有結合による連結法は、ＦＬＡＧ親和性タグとｓｃＦｖとの間の可逆的な会合を提供するｓｃＦｖに融合したタンパク質を使用し、これにより、共有結合による連結に供したときに起こり得る標的タンパク質との永久的な干渉を回避し得る。
抗－ＦＬＡＧ抗体を生産する免疫付与
抗体ライブラリーは当技術分野で周知のように免疫化したウサギから生産される。６匹のニュージーランドホワイトウサギを各々２００ｐｇのＦＬＡＧ親和性タグペプチド配列プラスアジュバントで免疫化し、免疫化の６週間後抗体力価を決定するために血清を集める。固定化したＦＬＡＧ親和性タグでＥＬＩＺＡにより力価を決定し、最も高い力価（少なくとも１：１０００）の動物を犠牲にして脾臓と骨髄を単離する。ウサギが十分な力価を示さないならば、胎児ウサギ組織に由来するナイーブなライブラリーを使用する。これにより、再配列されてない重鎖および軽鎖の遺伝子の無作為のコレクションが提供される。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを組織から抽出し、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）でｃＤＮＡ合成を実施する。
ｓｃＦｖ遺伝子融合の生成
重鎖および軽鎖遺伝子の発現した可変領域をウサギから単離するために、いくつかのプライマーを使用する。カッパおよびラムダ軽鎖の増幅に８つのプライマーを使用し、重鎖遺伝子の増幅に５つのプライマーを使用する。プラスマーはまた、重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を連結する１８アミノ酸のリンカー配列のコード配列（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳ）（配列番号２４６）も含有する。この長めのリンカー配列はモノマー形態のｓｃＦｖ断片のより良い安定性を提供する。ＶＨおよびＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物このリンカー領域でオーバーラップしており、その後オーバーラップ－エクステンション（ＯＬＥ）ＰＣＲによって組み立てることができる（図１）。次に、ＰＣＲ産物をＳｆｉ１で消化し、Ｓｆｉ１で消化したｐＣｏｍｂ３Ｈとライゲーションした後、ＤＮＡをゲル電気泳動によりサイズ選択する。このプラスミドはピルコートタンパク質に融合したｓｃＦｖのファージミドディスプレイを可能にする。各ファージ粒子に約５分子のピルファージコートタンパク質が存在する。ｐＣｏｍｂ３ＨプラスミドはｓｃＦｖ－ピル融合物を、約１または２分子が野生型ピル（ヘルパーファージにより提供される）に組み込まれるようなレベルで発現する。単一の調製で１０１２までのファージ粒子を生成することができるので、非常に多数のｓｃＦｖをスクリーニングすることができる。ＰｈＤで、ｓｃＦｖコード配列は常にタンパク質を表示するファージ粒子に連結しており、したがってその後のＤＮＡサブクローニングが便利に達成される。
ファージライブラリーの生成およびスクリーニング
ライゲーションしたプラスミドＤＮＡ（５０～１００ｎｇ）をＥＲ２５３８ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にエレクトロポレーションする。次に、Ｅ．ｃｏｌｉを、５ｍＬのＳＯＣ中３７℃で１時間振盪することによって回収する。欠陥のある複製起点を有するＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを用いてファージを生産する。ファージ粒子をＰＥＧ－８０００で沈降させた後、さらに遠心分離することにより単離する。このファージプレップは一次ライブラリーであり、「パニング」により親和性選択する。ファージ溶離物を固定化された抗原と共に再度インキュベートし、洗浄し、再度溶離する二重認識パニングを行う。これは非特異的ファージを排除する役に立つ。各ラウンドの選択を試験するために、ファージプールのＰＢ抗原に対する親和性をＥＬＩＳＡでアッセイする。ＰＢまたはＢＳＡを９６ウェルプレートにコートし、ファージと共にインキュベートし、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした抗－Ｍ１３抗体と共にインキュベートする。これはＭ１３ファージコートタンパク質を認識する。ＥＬＩＳＡ力価の上昇は各ファージプールの上首尾な親和性選択を示す。
ｓｃＦｖライブラリーのレンチウイルスベクターへの移行およびＥ．ｃｏｌｉでの拡大
ファージミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉに各ファージプールを感染させ、カルベニシリンで選択し、その後標準的なプラスミド調製により、パニングの第２（Ｒ２）および第３（Ｒ３）のラウンドの後細菌から単離する。プラスミドＤＮＡをＳｆｉ１で消化してｓｃＦｖコード配列を遊離させ、ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ベクター内のＥ２ｃコード配列の上流にライゲーションする。Ｅ２ｃコード配列はまた短いリンカー配列（ＧＧＳＳＲＳＳ）（配列番号２４７）も有し、ｓｃＦｖライブラリーのＥ２ｃのＮ末端部分への融合を作り出す。次いで、２つのレンチウイルスライブラリーの生産のために、２つの次のプラスミドライブラリー（Ｒ２およびＲ３）をＡｉｍ２と同様に調製する。
レンチウイルスライブラリーの生産
レンチウイルス粒子の生産のために、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＨＴ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する。これは１ｍＬ当たり５×１０８感染単位の大きさのウイルス力価を生じる。ウイルスは製造業者の仕様に従って生産する。ウイルス上清をＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７細胞で滴定し、続いてＺｓＧｒｅｅｎ１レポーターにより生成したＦＡＣＳ蛍光によって形質導入された細胞をカウントする。
別の態様では、ｓｃＦｖに関してスクリーニングする方法が開示される。この態様では、細胞質で安定なｓｃＦｖを、ｓｃＦｖとＥＧＦＰとの融合タンパク質を形成し、代理母の哺乳動物細胞株で発現させることによって同定し得る。

Claims (11)

  1. ＤＮＡ局在化成分とエフェクター分子とを含む組成物であって、
    前記ＤＮＡ局在化成分が少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記エフェクター分子が、（ｉ）不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはその不活化ヌクレアーゼドメインと、（ｉｉ）Ｃｌｏ０５１またはそのヌクレアーゼドメインとを含む、組成物。
  2. 前記ＤＮＡ局在化成分が、２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、第１のｇＲＮＡが、二本鎖ＤＮＡ標的配列の第１の鎖に特異的に結合し、第２のｇＲＮＡが、前記二本鎖ＤＮＡ標的配列の第２の鎖に特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ｄＣａｓ９が、不活化小型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）である、請求項１に記載の組成物。
  4. 請求項１、２または３のいずれか一項に記載の組成物に含まれる前記ＤＮＡ局在化成分と前記エフェクター分子をコードする核酸。
  5. Ｔ２Ａペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項４に記載の核酸。
  6. 請求項４もしくは５に記載の核酸を含むベクター。
  7. （ａ）請求項１から３までのいずれか一項に記載の組成物、または
    （ｂ）請求項４もしくは５に記載の核酸、または
    （ｃ）請求項６に記載のベクター
    を含む細胞。
  8. （ａ）請求項１から３までのいずれか一項に記載の組成物、または
    （ｂ）請求項４もしくは５に記載の核酸、または
    （ｃ）請求項６に記載のベクター、または
    （ｄ）請求項７に記載の細胞
    を含む組成物。
  9. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
  10. （ａ）請求項１から３までのいずれか一項に記載の組成物、または
    （ｂ）請求項４もしくは５に記載の核酸、または
    （ｃ）請求項６に記載のベクター、または
    （ｄ）請求項７に記載の細胞、または
    （ｅ）請求項８もしくは９に記載の組成物
    を含む多細胞生物であって、ヒトまたはヒト胚ではない、多細胞生物。
  11. （ａ）前記多細胞生物が植物であるか、または
    （ｂ）前記多細胞生物が動物である、請求項１０に記載の多細胞生物。
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