JP2007159512A - Ｉｉｓ型制限酵素を用いる翻訳終止コドンの除去方法 - Google Patents

Abstract

【課題】目的遺伝子、特に、完全なＣ末端領域を有するタンパク質をコードする遺伝子について、ＰＣＲを行わずに翻訳終止コドンを除去することのできる新規な方法を提供する。
【解決手段】目的タンパク質をコードする遺伝子の翻訳終止コドンの３’隣接領域に、ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡを調製する工程、ここで、導入された認識配列は、当該制限酵素により前記タンパク質のＣ末端アミノ酸コドンと翻訳終止コドンとの間の位置又は終止コドンの内部で前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断されるように設計されてなり、前記２本鎖ＤＮＡを前記制限酵素で切断する工程、及び前記切断された２本鎖ＤＮＡ末端を平滑化する工程を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は組換えＤＮＡ技術に関し、特に、ＩＩＳ型制限酵素を用いてタンパク質をコードする遺伝子の翻訳終止コドンを除去する方法、及びその方法に用いるベクター等に関する。

ベクター交換（乗せ換え）システムは、クローン化したｃＤＮＡを種々の機能性ベクターへ同時平行的に移行させることを容易にし、分子生物学研究に革新的な効率化をもたらした。このシステムは、特異的な組換え反応、例えば、λファージのインテグラーゼ−ａｔｔ部位（非特許文献１参照）やＣｒｅ−ｌｏｘＰ（非特許文献２参照）に基づく。また、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位を用いたベクター交換についても報告されている（非特許文献３参照）。

当業者に広く利用されている１つのシステムとして、インビトロジェン社から市販されているＧＡＴＥＷＡＹシステムがある。このシステムは、（１）ＰＣＲ産物をエントリーベクターにクローン化する方法；（２）クローン化されたＤＮＡ断片を種々の目的ベクター、例えば大腸菌、酵母、バキュロウイルス、又は哺乳類細胞での発現ベクター等へ乗せ換える方法；及び（３）クローン化したＤＮＡ断片を所望の方向、順番で連結したり、その翻訳領域のＮ末端やＣ末端にタグ配列や蛍光タンパク質等を容易に付加する方法を提供する。これら全ての方法は、大腸菌λファージ生物学の洗練された知識に基づく。すなわち、λファージは溶菌性ファージ、又は可逆的な組換え反応により大腸菌ゲノムに組み込まれた溶原性ファージの何れかの形で増殖する。最初に、ファージのａｔｔＰ部位が大腸菌のａｔｔＢ部位と組み変わることにより、ａｔｔＬ部位及びａｔｔＲ部位で挟まれたプロファージとして組み込まれる。次に、ａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位が組換えを起こした切り出し反応によって、ファージと大腸菌ゲノムの夫々にａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位を再生する。野生型のａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位は夫々、２４３、２５、１００及び１６８塩基対からなる。ＧＡＴＥＷＡＹシステムでは、インビトロでのａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との組換え反応が「ＢＰクロナーゼ」と呼ばれるファージインテグラーゼと大腸菌の宿主因子で触媒され、ａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位との組換え反応が「ＬＲクロナーゼ」と呼ばれるλファージの除去酵素及びインテグラーゼと大腸菌の宿主因子によって触媒される。さらにこれらの組み換え部位を改良することにより、目的遺伝子をエントリーベクターから目的ベクターへと一方向に組み換えることが可能となる（例えば、非特許文献４参照）。

一方、比較的長いｃＤＮＡ断片を低いバックグラウンドで、かつ高効率でクローン化することができる一群のクローニングベクターも報告されている（特許文献１参照）。これらのベクターでは、クローン化したＤＮＡ断片の両側に、ホーミングエンドヌクレアーゼやＩＩＳ型制限酵素の切断部位を設けることによって上記方法等によるベクター乗せ換え反応におけるバックグラウンドの出現を低下させることができる。

国際公開第０２／０７０７２０号パンフレット Walhout AJ, Temple GF, Brasch MA, Hartley JL, Lorson MA, van den Heuvel S, Vidal M. Methods Enzymol. (2000), Vol. 328, pp.575-592 http://www.clontech.com/clontech/products/families/creator/index.shtml Goderis IJ, De Bolle MF, Francois IE, Wouters PF, Broekaert WF, Cammue BP. Plant Mol Biol. 2002 Vol.50, pp.17-27. Brasch MA, Hartley JL, and Vidak M, Genome Research. (2001), Vol.14, pp.2001-1009

完全長ｃＤＮＡを含むエントリークローンからＣ末端融合タンパク質発現ベクターを構築する際、従来法によればベクター乗せ換え前にＰＣＲ等により翻訳終止コドンを除去しなければならない。ところが、ＰＣＲ反応を行うとコドンの読み枠(reading frame)に突然変異を起こしてしまう可能性があるため、融合タンパク質を発現させる前に再度塩基配列を確認する必要がある。特に、ゲノムネットワーク等の解析のためｃＤＮＡライブラリーから得られた数多くのクローンを取り扱う場合には、これらの手順に要するコストと労力の負担が大きいという問題があった。

そこで、本発明は、目的遺伝子、特に、完全なＣ末端領域を有するタンパク質をコードする遺伝子について、ＰＣＲを行わずに翻訳終止コドンを除去することのできる新規な方法を提供することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、除去すべき翻訳終止コドンの３’隣接領域に、認識部位の外側を切断するＩＩＳ型制限酵素の認識配列を導入することによってＰＣＲ反応を行わずに終止コドンを除去する方法を開発した。

すなわち、本発明の翻訳終止コドンの除去方法は、目的タンパク質をコードする遺伝子の翻訳終止コドンの３’隣接領域に、ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡを調製する工程、ここで、導入された認識配列は、当該制限酵素により前記タンパク質のＣ末端アミノ酸コドンと翻訳終止コドンとの間の位置又は終止コドンの内部で前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断されるように設計されてなり、前記２本鎖ＤＮＡを前記制限酵素で切断する工程、及び前記切断された２本鎖ＤＮＡ末端を平滑化する工程を含むことを特徴とする。前記目的タンパク質は完全な(intact)Ｃ末端アミノ酸配列を有することが好ましい。

好ましい実施形態において、前記ＩＩＳ型制限酵素は、ＰｐｉＩ又はＰｓｒＩである。また、１つの実施形態において、前記認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製することができる。

本発明の異なる観点において、目的タンパク質のＣ末端アミノ酸に他のタンパク質又はペプチドが結合した融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡの構築方法が提供される。当該方法は、目的タンパク質をコードする遺伝子を用意し、その翻訳終止コドンの３’隣接領域に、ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡを調製する。ここで、導入された認識配列は、当該制限酵素により前記タンパク質のＣ末端アミノ酸コドンと翻訳終止コドンとの間の位置又は終止コドンの内部で前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断されて一本鎖突出末端が生ずるように設計されてなる。続いて、前記２本鎖ＤＮＡを前記制限酵素で切断し、前記切断された２本鎖ＤＮＡ末端の１本鎖突出部分を欠失又は充填して平滑末端にし、さらに前記平滑末端に直接又は（任意の長さの）リンカーＤＮＡを介して他のタンパク質又はペプチドの翻訳領域（ＯＲＦ）を連結する。前記リンカーＤＮＡは、目的タンパク質のＣ末端アミノ酸コドンの後ろに連結されたときに、アミノ酸の読み枠として終止コドンを含まないことを特徴とする。

本発明のさらに異なる観点において、完全長ｃＤＮＡをクローン化したプラスミド又はファージベクターが提供される。当該ベクターは、前記完全長ｃＤＮＡの翻訳終止コドンの３’隣接領域に、ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡと、当該２本鎖ＤＮＡの両端にホーミングエンドヌクレアーゼの非対称認識配列とを含み、導入されたＩＩＳ型制限酵素の認識配列が当該制限酵素により前記ｃＤＮＡのＣ末端アミノ酸コドンと翻訳終止コドンとの間の位置又は終止コドンの内部で前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断されるように設計されてなることを特徴とする。

本発明の方法によれば、ＰＣＲを用いることなく翻訳終止コドンを除去することができるため、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えベクターから他のベクター、特に、Ｃ末端融合タンパク質発現用ベクターへ容易に当該遺伝子を乗せ換えることができる。本発明のベクターにクローン化された遺伝子は、上記Ｃ末端融合タンパク質の発現を含む種々の用途に効率的に使用することができるため、数多くの遺伝子クローンからなる大規模な生物資源構築に極めて有用である。

（翻訳終止コドンの除去方法）
本発明の翻訳終止コドンの除去方法は、ＩＩＳ型制限酵素を用いることを特徴とする。「ＩＩＳ型制限酵素(type IIS restriction endonuclease)」とは、認識部位と離れたところに切断部位を有する制限酵素であって、認識部位は非パリンドローム配列であってもよい。ＩＩＳ型制限酵素が例えばＰｐｉＩの場合、以下の式に示すように、５’−ＧＡＡＣ（Ｎ）_５ＣＴＣ−３’とその相補鎖からなる認識部位とこの認識部位から離れた部位に切断部位（以下に矢印で示す）を有する。認識部位の配列及び認識部位と切断部位との間隔は、制限酵素の種類により異なる。

５’・・・ ↓_７（Ｎ）ＧＡＡＣ（Ｎ）_５ＣＴＣ（Ｎ）_１３↓・・・３’
３’・・・↑_１２（Ｎ）ＣＴＴＧ（Ｎ）_５ＧＡＧ（Ｎ）_８↑ ・・・５’

その他のＩＩＳ型制限酵素としては、具体的には、例えば、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＸＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｉｎＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＥａｒＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎＧＵＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＮｇｏＶＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＰｓｒＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＴａｑＩＩ、Ｔｔｈ１１１ＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｅＭＩＩ（Szybalski, W. et al. Gene 100 (1991) 13-26、及びニューイングランドバイオラボ社カタログ http://www.neb.comを参照）等がある。いくつかの制限酵素の認識部位及び切断部位は以下の通りである。ＢｂｖＩ（ＧＣＡＧＣ８／１２）、ＨｇａＩ（ＧＡＣＧＣ５／１０）、ＢｓｍＦＩ（ＧＧＧＡＣ１０／１４）、ＳｆａＮＩ（ＧＣＡＴＣ５／９）、ＢｓｐＭＩ（ＡＣＣＴＧＣ４／８）、ＰｓｒＩ（７／１２ＧＡＡＣＮＮＮＮＮＮＴＡＣ１２／７）（カッコ内の塩基配列は認識部位を示し、数字は切断部位を表す）。

以下に図面を参照しながら本発明の方法について説明する。図１は、本発明の方法を実施するために設計された２本鎖ＤＮＡ及びそれにコードされるアミノ酸配列の具体例である。

図１Ａに示した配列は、本発明の方法に使用する２本鎖ＤＮＡの１つの具体例である。図中、目的タンパク質をコードする遺伝子は翻訳開始のメチオニンコドン（ＡＴＧ）から始まり翻訳終止コドン（ＴＧＡ、＊＊＊で示す）で終わる。翻訳終止コドンの３’末端側には、下線で示したＰｐｉＩの認識配列が導入されている。このＩＩＳ型制限酵素は、認識配列が長く、認識サイトから遠い２つの部位（４つの矢印で示した）を切断する。図１Ａに示した配列は、その両端にさらに２つのホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位（Ｉ−ＳｃｅＩ部位、及びＩ−ＰｐｏＩ部位）と、一方の末端にＴＯＰＯクローニング用の配列（5'-caccgc-3'）が付加され、これらを利用して適当なベクターにクローン化することができる。このような２本鎖ＤＮＡは、当業者に公知の種々の方法で調製することができる。例えば、所望の２本鎖ＤＮＡを化学合成しても良いし、あるいは目的遺伝子の５’末端及び３’末端配列と相補的な配列を有し、さらにＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行うことにより容易に調製することができる。ＰＣＲ産物をそのまま用いてもよいし、又は適当なベクターにクローン化してプラスミドやファージＤＮＡを調製した後、これらを用いてもよい。

上記２本鎖ＤＮＡをＰｐｉＩで切断すると、目的タンパク質のＣ末端アミノ酸のコドンと翻訳終止コドンとの間の位置で、アンチセンス鎖が切断されてセンス鎖の３’末端が突出した一本鎖粘着末端が生成する。上記ＰＣＲプライマーの長さを調節して、終止コドン（ＴＧＡ）の内部で切断されるように上記２本鎖ＤＮＡを設計してもよい。この場合には、後工程でリンカーＤＮＡと連結する際に終止コドンが再生しないよう注意する。ＰｐｉＩサイトが目的遺伝子の翻訳領域内に存在しているときには、その他のＩＩＳ型制限酵素、例えば、ＰｓｒＩ（ＳｉｂＥｎｚｙｍｅ、ロシア）等を用いてもよい。ＰｐｉＩやＰｓｒＩは、認識部位から離れたところに存在する切断部位を正確に切断するため本発明の方法に使用することが特に好ましい。あるいは、別のＩＩＳ型制限酵素認識配列を用いて、目的タンパク質のＣ末端アミノ酸のコドンと翻訳終止コドンとの間の位置若しくは終止コドンの内部で、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断されてアンチセンス鎖の５’末端が突出した一本鎖粘着末端が生成するように設計してもよい。前者、すなわちＰｐｉＩやＰｓｒＩの切断により生じた５’陥没末端の場合には、３’突出末端が削られ、後者、すなわち５’突出末端の場合には３’陥没部分に塩基が付加されることにより目的タンパク質のＣ末端アミノ鎖のコドンで終わる平滑末端とすることができる。

このような翻訳終止コドンを除去するためのＤＮＡ末端の平滑化反応は当業者において公知の手段を用いて行うことができる。例えば、ｄＮＴＰｓの存在下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’ポリメラーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いてもよい。平滑化した末端は目的タンパク質のＣ末端アミノ酸のコドンが存在するため、これに直接又はリンカーＤＮＡを介して他のタンパク質やペプチドの翻訳領域（ＯＲＦ：Open Reading Frame）を連結することができる。このリンカーＤＮＡは、目的タンパク質と他のタンパク質とのアミノ酸の読み枠をシフトさせない限り任意の長さのＤＮＡでよいが、好ましくは数塩基対から数十塩基対である。また、当該配列部分にアミノ酸の読み枠として終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、及びＴＡＧ）を含まないことが必要である。

図１Ｂは、上記翻訳終止コドン除去反応後の塩基配列である。プラスミドｐＥＮＴＥＲ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にクローン化した２本鎖ＤＮＡを用いて上記終止コドンの除去反応を行い、さらに自己連結反応を行った結果の塩基配列である。目的タンパク質のＣ末端アミノ酸のコドンにアラニンをコードするＧＣＡなるコドンが連結されている。図１Ｃは、上記図１Ａに対応し、プラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯにクローン化された翻訳領域のアミノ酸配列である。図１Ｄは、上記図１Ｂに対応し、翻訳終止コドン除去反応後のアミノ酸配列である。図１Ｂ及びＤに示されるように、終止コドンを除去した後の翻訳領域（ＯＲＦ）はｐＥＮＴＲベクター領域に移動し、ａｔｔ領域と連結されているためクロナーゼを用いるＬＲ反応により他の所望のベクターに乗せ換えることができる。

（ベクター乗せ換えによるＣ末端融合タンパク質発現ベクターの構築）
翻訳終止コドンを除去した目的タンパク質の遺伝子は、種々の組換えＤＮＡ技術により他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として発現させることができる。上述したＬＲ反応の他にも、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを用いる方法がある（非特許文献３参照）。ホーミングエンドヌクレアーゼとは、ＲＮＡスプライシングで除かれるようなイントロンの中やプロテインスプライシングで除かれるようなインテインの中にコードされていることが多い酵素である。自身のＤＮＡ切断活性を使ってゲノムＤＮＡの中に自分の遺伝情報を組み込むことによって、動く遺伝子として自身が生き延びていくと考えられている。このようなホーミングエンドヌクレアーゼとして、単細胞緑藻から得られるＩ−ＣｅｕＩや酵母から得られるＩ−ＳｃｅＩ等が知られているが、これらの遺伝子は何れもグループＩイントロンに、独立した翻訳領域として存在する。あるいは、プロテインインサート（インテイン）にコードされているものとしてＰＩ−ＳｅｃＩやＰＩ−ＰｓｐＩ等がある。ホーミングエンドヌクレアーゼの特徴は１４〜４０塩基対の長い配列を認識して２本鎖ＤＮＡを切断することである。従って、ゲノムＤＮＡ中に存在する認識部位が極めて稀であるため、ｃＤＮＡライブラリー等から目的遺伝子をクローン化する上で有用である。

（本発明のベクター）
本発明は、さらに完全長ｃＤＮＡをクローン化したプラスミド又はファージベクターを提供する。当該ベクターは、上記翻訳終止コドンを除去するためのＩＩＳ型制限酵素認識配列を備え、且つその両端にホーミングエンドヌクレアーゼの非対称認識配列を含むものである。このベクターは、クローン化したｃＤＮＡの完全な(intact)Ｃ末端領域を有する状態で発現させる場合には、両端のホーミングエンドヌクレアーゼ認識配列を用いて種々のベクターに乗せかえることができる。タンパク質のＣ末端領域は酵素活性やタンパク質−タンパク質相互作用等の生物学的機能にとって重要な場合が多く、例えば、受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達機能などである（非特許文献４参照）。一方、Ｃ末端融合タンパク質を発現させる場合には、本発明の方法を用いて終止コドンを除去した後、所望のタンパク質と連結して融合タンパク質を発現させることができる。Ｃ末端アミノ酸残基を切り詰めることなく完全なＣ末端領域を保持したままで他のタンパク質との融合タンパク質を調製することも、当該タンパク質の生物学的機能を調べる上で極めて重要となろう。種々の目的に使用できるエントリークローンに所望の遺伝子をクローン化することのできる本発明のベクターは、数多くの遺伝子クローンからなる大規模な生物資源を構築する上で極めて有用である。

（分子生物学等の基本的手技）
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual) 第３版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Striling編、Humana Press、2003）；Animal Cell Culture: A Practical Approach 第３版（Masters編、Oxford University Press、2000）等がある。また、本明細書において参照される組換えＤＮＡ技術、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はシグマ社やアルドリッチ社、インビトロジェン社、クロンテック社、プロメガ社、ロッシュダイアグノスチクス社、ニューイングランドバイオラボ社、ファーメンタス社、ＳｉｂＥｎｚｙｍｅ社、ＴａＫａＲａ（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

好熱性細菌サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus）のＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子（ｐｏｌＡ）の翻訳終止コドンを除去するために、以下のような制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡを調製した。

まず、ｐｏｌＡ遺伝子特異的なプライマーとして、２つのプライマーを合成した。
５’末端特異的プライマー（配列番号１）：5'-GAAGGAGCCGCCACCatgagggggatgctgccc-3’及び、
３’末端特異的プライマー（配列番号２）：5'-CAATTGTTCACAGGAAACtcactccttggcggagag-3'（小文字は開始コドン及びｐｏｌＡフレームを示し、下線はＰｐｉＩ認識部位の一部を示す）。

続いて、ｐｏｌＡ遺伝子を鋳型とし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＨｉｆｉ(インビトロジェン社)を用いて、９５℃で１分間の変性、６０℃（Ｔｍ値）で１分間のアニーリング、及び６８℃で３分間の伸長反応を３０サイクル繰り返し第一段階目のＰＣＲを行った。その増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図２（右レーン）に示した。図２の左のレーンは、分子量マーカーとしてのｌａｍｄａ−ＳｔｙＩ消化物（ラムダファージＤＮＡのＳｔｙＩ消化産物）である。

次に、ホーミングエンドヌクレアーゼによる認識部位を導入するために２つのアダプタープライマーを合成した。
５’末端Ｉ−ＳｃｅＩアダプタープライマー（配列番号３）：5'-caccgcTAGGGATAACAGGGTAATaGAAGGAGCCGCCACCatg-3'（下線はＩ−ＳｃｅＩ認識部位）及び
３’末端Ｉ−ＰｐｏＩアダプタープライマー（配列番号４）：5'-tGCTACCTTAAGAGAGgagCAATTGTTCACAGGAAACtca-3'（下線はＩ−ＰｐｏＩ認識部位の相補配列）

続いて、第一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＨｉｆｉ(インビトロジェン社)を用いて、９５℃で１分間の変性、６２℃で１分間アニーリングした後、６８℃、３分間の伸長反応を３０サイクル繰り返し第二段階目のＰＣＲを行った。その増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図３（右レーン）に示した。図３の左のレーンは、分子量マーカーとしてのｌａｍｄａ−ＳｔｙＩ消化物である。図２及び３の結果より、目的とする２本鎖ＤＮＡ断片が増幅されたことが分かる。

増幅された２本鎖ＤＮＡ断片は、DNA Blunting Kit (TaKaRa)を用いて平滑末端化した（１６０ｎｇのＰＣＲ産物（１０μｌ、０．５ｐｍｏｌ）に１μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加え３７℃、５分間反応した）。続いて、平滑化したＤＮＡをＴＯＰＯ反応によりpENTR-TOPO（登録商標、インビトロジェン社）へクローン化した（６μｌ反応、５ｎｇのＤＮＡと１μｌのＴＯＰＯベクターとを室温にて５分間反応した）。ＴＯＰＯ反応終了後、反応混合液を用いて大腸菌TOP10 one-competent cellを形質転換した。形質転換されたコロニーはプラスミドを選択する十分量を得ることができた。４つのコロニーを拾い、プラスミドＤＮＡ調製のために抽出した。インサートチェックのためにプラスミドＤＮＡをＩ−ＳｃｅＩまたはＩ−ＰｐｏＩで消化した（図４）。図４のレーン１は分子量マーカーとしてのｌａｍｄａ−Ｓｔｙｌ消化物である。レーン２〜５は、制限酵素処理していないプラスミドである。レーン６〜９はＩ−ＳｃｅＩ消化産物である。レーン１０〜１３はＩ−ＰｐｏＩ消化したプラスミドである。これらの結果より、得られた４種類のプラスミドは何れもＩ−ＳｃｅＩ及びＩ−ＰｐｏＩ切断部位を１ヶ所有することが分かる。プラスミドの核酸配列を決定し、所望の配列が得られたことを確認した。

終止コドンの除去
目的タンパク質のＣ末端融合タンパクを作成する際には、ベクター乗せ換えの前に終止コドンを除去しなくてはならない。このために、上述したようにＰｐｉＩサイトを翻訳領域の３’末端側に導入した。ＰｐｉＩはその認識配列から７塩基対以上離れた２ヶ所で２本鎖ＤＮＡを切断し、一本鎖粘着末端を生成する。得られたプラスミドを、ＰｐｉＩで消化した結果を図５に示した。図５の左のレーンは分子量マーカーとしてのｌａｍｄａ−ＳｔｙＩ消化物である。真中のレーンは制限酵素処理をしていないプラスミドであり、右のレーンはＰｐｉＩで消化したプラスミドＤＮＡである。ＰｐｉＩ消化したＤＮＡをBlunting kit（タカラバイオ社）を用い、１０μｌの反応溶液中で５００ｎｇ（０．１５ｐｍｏｌ）のプラスミドＤＮＡに１μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを添加して３７℃、５分間インキュベートすることにより一本鎖突出末端を平滑化した。

平滑化したプラスミドＤＮＡを自己連結反応に供し、未反応のバックグランドを軽減するため、自己連結反応したプラスミドＤＮＡをＩ−ＰｐｏＩで消化した。エタノール沈殿により消化プラスミドを回収し、大腸菌を形質転換した。得られたコロニーの数は、平滑化したプラスミドＤＮＡだけの形質転換よりも確実に多かった。複数のコロニーからプラスミドを調製し、プラスミドＤＮＡの塩基配列を決定したところ全てのクローンが所望の配列を有していることが分かった。

ヒトｐ５３翻訳領域をＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社）を用いたＰＣＲで増幅した。使用した特異的なプライマーは次の通りである。
５’末端特異的プライマー（配列番号５）：5'-GAAGGAGCCGCCACCatgactgccatggaggagt-3'及び、３’末端特異的プライマー（配列番号６）：5'-CAATTGTTCACAGGAAACtcagtctgagtcaggccc-3'（小文字はｐ５３特異的な配列を示す）。

第２回目のＰＣＲはホーミングエンドヌクレアーゼサイトを含むアダプタープライマーを用いておこなった。
５’末端Ｉ−ＳｃｅＩアダプタープライマー（配列番号３）：5'-caccgcTAGGGATAACAGGGTAATaGAAGGAGCCGCCACCatg-3'（５’末端のcaccの４塩基はｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯクローニングに必須な配列である。下線はＩ−ＳｃｅＩ認識部位を示す。下線の無い大文字は第１回ＰＣＲで用いたプライマーに特異的な相補配列である。）
３’末端Ｉ−ＰｐｏＩアダプタープライマー（配列番号４）:5'-tGCTACCTTAAGAGAGgagCAATTGTTCACAGGAAACtca-3'（下線はＩ−ＰｐｏＩ認識部位と相補的であり、下線の無い大文字は第１回ＰＣＲで用いたプライマーに特異的な相補配列である。）

ＰＣＲにより得られる増幅産物を図１Ａに示す。ホーミングエンドヌクレアーゼサイトは両端に位置し、ＰｐｉＩ認識部位は目的タンパク質のコード領域の外側でＣ末端に位置している（図１Ａ）。この増幅産物をｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてプラスミドにクローン化した。出現コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、核酸配列を決定した。得られたプラスミドの翻訳領域に変異は認められなかった。

上記プラスミドにクローニングされたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を図１Ｃに示す。挿入断片の読み取り枠は、ｐＥＮＴＲのａｔｔサイトの上流まで続いている。これは、天然型及びＮ末端融合タンパク質の両方の発現が可能であることを示す。また、翻訳領域由来の終止コドンと、Ｉ−ＰｐｏＩサイト由来の終止コドンが存在する。

得られたプラスミドＤＮＡを用いて終止コドンを除去した。すなわち、プラスミドＤＮＡをＩＩＳ型制限酵素ＰｐｉＩ（ファーメンタス社）で消化した。図１Ａに示されているように終止コドンの外側に認識サイトを有している。この酵素は、他のＩＩＳ型制限酵素より長い配列を認識でき、切断部位が固定されているので用いた。この場合、必ず一箇所は、終止コドン部位を切断することになる。次に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰｓを用いてＤＮＡの末端を平滑化し、希釈して低濃度の条件で自己連結した。これらの反応の結果得られる読み取り枠を図１Ｂと図１Ｄに示す。翻訳領域が移動してｐＥＮＴＲベクターのＣ末端ａｔｔ読み取り枠まで続いている。連結反応後の溶液を用いて大腸菌を形質転換した。

出現したコロニーを用いてプラスミドを抽出し塩基配列を決定した。上記で予想された読み取り枠には全く変異が認められなかった。さらに、ｐ５３タンパク質のＣ末端にＧＦＰを結合した融合タンパク質を発現するため、得られたプラスミドＤＮＡを目的のベクターｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４７（インビトロジェン社）と共にＧＡＴＥＷＡＹシステムの使用説明書に基づいてＬＲ反応を行った。形質転換後、得られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出し、ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞をトランスフェクションした。形質転換細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を図６に示す。

ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、１０％熱処理牛胎児血清、２００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び２００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル最小培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞を蒔いてから２４時間後にリポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン社）を用いてトランスフェクションした。ｐ５３−ＧＦＰ融合タンパク質発現ベクターを２４ウェルプレートあたり０．５μｇ用いて、５×１０^４個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞をトランスフェクションした。２４時間インキュベーションした後、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。図６の（ａ）はｐ５３−ＧＦＰタンパク質の蛍光を示し、（ｂ）は位相差顕微鏡による細胞の形態を示す。発現されたｐ５３−ＧＦＰ融合タンパクは正常なｐ５３タンパクと同様に局在していた。つまり、発現された融合タンパクは生体内で機能していることが示された。

翻訳終止コドン除去のために設計された構築物の構造を示す。（Ａ）は、プラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯへクローン化されたＰＣＲ産物の塩基配列である。（Ｂ）は、翻訳終止コドン除去反応後の塩基配列である。（Ｃ）は、プラスミドｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯにクローン化された翻訳領域のアミノ酸配列である。（Ｄ）は、翻訳終止コドン除去反応後のアミノ酸配列である。 第１回ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果である。 第２回ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果である。 第２回ＰＣＲ産物をクローン化した大腸菌コロニーから抽出したプラスミドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果である。 第２回ＰＣＲ産物をクローン化したプラスミドＤＮＡのＰｐｉＩ消化産物のアガロースゲル電気泳動の結果である。 ＮＩＨ／３Ｔ３細胞で発現させたｐ５３−ＧＦＴ融合タンパク質の局在化を示す顕微鏡写真である。

Claims (9)

1. 目的タンパク質をコードする遺伝子から翻訳終止コドンを除去する方法であって、
   前記遺伝子の翻訳終止コドンの３’隣接領域に、ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡを調製する工程、ここで、導入された認識配列は、当該制限酵素により前記タンパク質のＣ末端アミノ酸コドンと翻訳終止コドンとの間の位置又は終止コドンの内部で前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断されるように設計されてなり、
   前記２本鎖ＤＮＡを前記制限酵素で切断する工程、及び
   前記切断された２本鎖ＤＮＡ末端を平滑化する工程、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記ＩＩＳ型制限酵素がＰｐｉＩ又はＰｓｒＩである請求項１に記載の方法。
3. 前記認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応により調製されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記平滑化する工程が、前記制限酵素で切断された２本鎖ＤＮＡ末端の一本鎖突出部分を欠失又は充填することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の方法。
5. 目的タンパク質のＣ末端アミノ酸に他のタンパク質又はペプチドが結合した融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡの構築方法であって、
   目的タンパク質をコードする遺伝子を用意し、その翻訳終止コドンの３’隣接領域に、ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡを調製する工程、ここで、導入された認識配列は、当該制限酵素により前記タンパク質のＣ末端アミノ酸コドンと翻訳終止コドンとの間の位置又は終止コドンの内部で前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断されるように設計されてなり、
   前記２本鎖ＤＮＡを前記制限酵素で切断する工程、
   前記切断された２本鎖ＤＮＡ末端の１本鎖突出部分を欠失又は充填して平滑末端にする工程、及び
   前記平滑末端に直接又はリンカーＤＮＡを介して他のタンパク質又はペプチドの翻訳領域（ＯＲＦ）を連結する工程
   を含むことを特徴とする方法。
6. 前記リンカーＤＮＡは、目的タンパク質のＣ末端アミノ酸コドンの後ろに連結されたときに、アミノ酸の読み枠として終止コドンを含まないことを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 前記ＩＩＳ型制限酵素がＰｐｉＩ又はＰｓｒＩである請求項５又は６に記載の方法。
8. 完全長ｃＤＮＡをクローン化したプラスミド又はファージベクターであって、
   前記完全長ｃＤＮＡの翻訳終止コドンの３’隣接領域に、ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を導入した２本鎖ＤＮＡと、当該２本鎖ＤＮＡの両端にホーミングエンドヌクレアーゼの非対称認識配列とを含み、導入されたＩＩＳ型制限酵素の認識配列が当該制限酵素により前記ｃＤＮＡのＣ末端アミノ酸コドンと翻訳終止コドンとの間の位置又は終止コドンの内部で前記２本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断されるように設計されてなることを特徴とするベクター。
9. 前記ＩＩＳ型制限酵素がＰｐｉＩ又はＰｓｒＩである請求項８に記載のベクター。