JP4247430B2 - クローニングベクターと分子クローニングの方法 - Google Patents

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Description

発明の属する技術分野
本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。特に、新規クローニングベクターファミリーおよび興味ある核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのクローニング方法が開示される。
効率的なゲノムおよびｃＤＮＡクローニングベクターは、高品質で、代表的なライブラリーが多くの遺伝子の分析の豊富な源泉になるので、分子遺伝学研究では重要な手段である。
完全長ｃＤＮＡは、完全長ライブラリーの構築のための出発材料である（例えば、ＲＩＫＥＮ ｍｏｕｓｅ ｃＤＮＡ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ、ＲＩＫＥＮＮ ａｎｄ Ｆａｎｔｏｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｕｓｅ ｃＤＮＡ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ"， Ｎａｔｕｒｅ，２００１年２月８日号，４０９巻：６８５−６９０）。標準クローニング技術に比べて、完全長ｃＤＮＡクローニングは、当該ライブラリーからの長いクローンの表現不足または欠落の危険性を本来もっており、また、非常に長いｍＲＮＡ類に由来するｃＤＮＡは、ベクターの容量が十分でなければ、クローン化されない。
現在利用できるプラスミドクローニングベクター類は、短いｃＤＮＡ類用に片寄って(バイアスして)いる：すなわち、連結（ライゲーション）反応およびライブラリー増幅の工程で競合すれば、短い断片の方が長い断片よりずっと効率よくクローニングされる。プラスミド電気穿孔は、ライゲーション工程でのプラスミド分子の環状化の際、関連するサイズバイアスを示さないが、混合ライゲーション反応では、短いｃＤＮＡのほうが長いｃＤＮＡよりずっと効率的に連結される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＮＹ， ＵＳＡ）。
バクテリオファージ由来のクローニングベクターは、ＤＮＡ類のクローニングや増殖およびライブラリー構築に特に有用なことが明らかにされている。挿入体およびバクテリオファージベクターＤＮＡ類の連結混合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的にパッケージされ、感染により細菌へ導入が可能である。バクテリオファージベクターはｃＤＮＡ配列のクローニングを可能するが、大規模配列決定のための最終産物は、大規模なコロニー収集、増殖、ＤＮＡ調製および配列決定反応のためのプラスミドであるべきである（Ｓｈｉｂａｔａら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１０：１７５７−１７７１）。
自動プラスミド切出しのためのクローニングベクターは、広範なｃＤＮＡクローニング用の容量をもつべきで、０．５Ｋｂ程度に短いｃＤＮＡおよび１５Ｋｂ程度に長いｃＤＮＡを含み、それらは、第１鎖ｃＤＮＡ合成の際トレハロースを使えば、アガロースゲル上で可視化できる（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：５２０−５２４）。
全ライブラリーバルク切出しを可能にするバクテリオファージベクターは多数あるが、それらは、クローニングサイズまたはバルク切出しプロトコールの点からは最適ではない。
クローン化挿入体をもつバクテリオファージベクターからのプラスミド切出しの例は、λ−ＺａｐIIで得られた（Ｓｈｏｒｔら，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：７８５３−７６００）。しかし、λ−ＺａｐIIからのバルク切出しは、長短両クローンを含むｃＤＮＡライブラリーのような混合試料を用いた場合、短いインサートの方へサイズバイアスを示す。λ−ＺａｐIIを用いた場合、長い希少なｃＤＮＡを得るのは難しい。
λ−Ｌｏｘ誘導体（Ｐａｌａｚｚｏｌｏ Ｍ．ら，１９９０，Ｇｅｎｅ，８８：２５−３６），λ−ＹＥＳ（Ｅｌｌｅｄｇｅら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：１７３１−５）およびλ−ＴｒｉｐｌｅｘＴＭ（ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ，１９９６年１月）のようなｃＤＮＡクローニングおよびプラスミド切出しのためにデザインされた他のベクターは、９〜１０Ｋｂを超えないＤＮＡを受け入れる。一方、ゲノムライブラリー構築用のベクターおよびＣｒｅ−ｌｏｘ仲介プラスミド切出しは、７Ｋｂｐより長い挿入体を受け入れる：例えばλＰＳ（Ｎｅｈｌｓら，１９９４ａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：７７０−７７５），λｐＡｎ（Ｈｏｌｔら，１９９３，Ｇｅｎｅ，１３３：９５−９７），λＧＥＴ（Ｎｅｈｌｓら，１９９４ｂ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９：２１６９−２１７５），λＭＧＵ２（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ，１９９２，Ｇｅｎｅ，１２０：１３５−１４１）およびＴｎ１７２１切出しシステムに基づくベクター、λＲＥＳ（Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｅｒ，Ｊ，１９９３，Ｇｅｎｅ，１２３：６３−６８）。しかしこれらのベクターは、広域サイズｃＤＮＡライブラリーの調製物を許容しない。
λＳＫシリーズの中だけに０．２から１５．４Ｋｂの計算容量をもついくつかのベクター（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｉら，１９９３，Ｇｅｎｅ，１２７：１−１４）があって、それらは広域サイズｃＤＮＡクローニングの目的に適していると考えられた。残念ながら、λＳＫの基本的切出しシステムは、単純な制限酵素消化に基づくので、ｃＤＮＡの内部切断を起し、それが、ｃＤＮＡクローニングにこれらのベクターがあまり使われない理由と思われる。特開２０００−３２５０８０号の日本特許出願は、修飾λＰＳベクターを開示している。名称λＦＬＣ−１で示されるその新ベクターは、λＰＳベクターの左アームに６ｋｂの核酸配列（スタッファーII）を含むので、興味あるｃＤＮＡを考慮に入れない場合のサイズは３８ｋｂであった。この修飾λＰＳベクターは、広範なサイズのｃＤＮＡを挿入できると記載されている。
上記λＦＬＣ−１は、一般的な（または「標準的」）大型ｃＤＮＡライブラリーに有用ではあるとしても、短い、また非完全長のｃＤＮＡに、なおバイアスを示すので、非常に長く希少で重要な完全長ｃＤＮＡ、特に強く均等化および／または差引き化されたｃＤＮＡライブラリーの場合は、得ることが困難である。当該技術分野におけるさらなる問題点は、バルク切出し組換え機構に関するものである。
バルクｃＤＮＡｓ（ｃＤＮＡライブラリー）、すなわち短、中、および長のｃＤＮＡのような広域サイズのｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーは、クローニングベクター中へ挿入される。次いで、この挿入体は、発現ベクターのような所望の特徴を備えた機能的または特殊化された別のベクターに移される。この転移はサブクローニングと呼ばれる。ＤＮＡセグメントのサブクローニングに使われる機能的または特殊化ベクター類は、機能的に多様である。そのようなベクター類は、さまざまな生物において遺伝子を発現するための；遺伝子発現を調節するための；タンパク質精製を助けるために、または、細胞中のタンパク質の追跡を可能にするために標識を備えるための；クローン化ＤＮＡセグメントを修飾する（例えば、欠失を作出する）ための；プローブ類（例えばリボプローブ類）の合成のための；ＤＮＡ配列分析用の鋳型の調製のための；タンパク質コード領域の同定のための；種々のタンパク質コード領域を融合させるための；興味あるＤＮＡを大量に提供するためのベクター類を含むが、これは非限定的例示である。特定の研究は、興味あるＤＮＡセグメントをいくつかの異なる特殊化ベクター中へサブクローニングすることを含むのが普通である。
制限酵素類およびリガーゼを用いる旧来のサブクローニング法は、時間がかかり、比較的信頼性も低い。
特定の組換え酵素認識配列を用いる組換え酵素認識系の利用が提案され、それらはＣｒｅ−ｌｏｘ（Ｐａｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，Ｇｅｎｅ，８８：２５−３６）およびＧａｔｅｗａｙＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ；Ｗａｌｈｏｕｔ Ａ．Ｊ．Ｍ．ら，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ３２８巻：５７５−５９２；および米国特許第５８８８７３２号）として知られる。
Ｃｒｅ−リコンビナーゼによる固相ｉｎ ｖｉｖｏ切出しは、増幅されたｃＤＮＡライブラリーを、構成的にＣｒｅ−リコンビナーゼを発現する細菌株、例えばＢＮＮ１３２（Ｅｌｌｅｄｇｅら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：１７３１−５）へ感染させることが必要である。しかしながら、この方法は、低いプラスミド収量（Ｐａｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，上記に同じ）およびプラスミドの不安定性（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９８４，Ｃｅｌｌ，３６：１０９７−１１０３）のため、推奨できない：実際、Ｃｒｅ−リコンビナーゼは構成的に発現され、プラスミドの２量体／多量体の生成を起し、高比率の無プラスミド細胞を生じて、シークエンシング効率を損なう。
Ｇａｔｅｗａｙ切出しは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ切出しとは別のシステムである。一般的なＧａｔｅｗａｙＴＭシステムによれば、興味あるＤＮＡ（挿入体）および相互に異なる一対の組換えサイトをもつ挿入体供与ベクターは、サブクローニングベクターおよび相互に異なるが組換え可能な一対の組換え体サイトを含む供与ベクターと、組換えをする。最終産物は、興味あるＤＮＡ（挿入体）をもつサブクローン産物および副産物である。当該組換え体サイトは、ａｔｔＢ，ａｔｔＰ，ａｔｔＬおよびａｔｔＲである。
しかし前記ＧａｔｅｗａｙＴＭは短いｃＤＮＡに対するバイアスを示し；長いｃＤＮＡは低い効率で得られる（Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｂｒａｓｃｈ，スライド“Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｔｔＢ−ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ"，ＧＩＢＣＯＢＲＬＲ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｍｉｎａｒ，“Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"，Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ，１９９９）。
クローニングシステムのさらに別の問題は、バックグラウンドの存在であり、これは環境ＤＮＡ汚染および、非組換えプラスミド（興味あるＤＮＡのないプラスミド）であるサブクローニングプロセス副産物によるものである。
バックグラウンドを完全に排除するか、ほとんどもたないことを可能にする、バックグラウンド排除クローニングシステムを提供することが特に望ましい。
当該技術分野では、いくつかのバックグラウンド排除の戦略が提案されている。例えば、Ｗａｌｈｏｕｔら（上記参照）は、ＧａｔｅｗａｙＴＭベクター類，ａｔｔＰ１−ａｔｔＰおよびａｔｔＲ１−ａｔｔＲ２は、ａｔｔ部位とａｔｔ部位の間に、タンパク質産物がＤＮＡジャイレース（ｇｙｒａｓｅ）を妨害するｃｃｄＢ遺伝子（Ｂｅｒｎａｒｄ Ｐ．およびＣｏｕｔｕｒｉｅｒ Ｍ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：７３５−７４６）も含むと報告している。組換え後は、ｃｃｄＢ遺伝子を失った（つまり組換え体である）プラスミドのみが、ｇｙｒＡに対して変異していない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で増殖可能で、従って、選択的長所を備えている。遺伝子ｃｃｄＢをもつプラスミドは、ｇｙｒＡ遺伝子に突然変異をもちｃｃｄＢに対する耐性を授かった特定の大腸菌株ＤＢ３．１中でのみ増殖可能である（Ｗａｌｈｏｕｔら、上記参照）。それ故、この種の組換えはプラスミドに限られる。何故なら他のベクター、例えばクローニング系で使われるλ置換ベクターは、ｒｅｃＡタンパク質をもたないＤＢ３．１のような細胞中では増殖および複製できないからである（ｒｅｃＡ産物は置換型バクテリオファージλの増殖に必要である：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。
結論として、ａ）サイズバイアスがなく、しかも非常に長く希少な完全長ｃＤＮＡを含む「サイズバランスのとれた」調製物を許容し；ｂ）改良された組換え機構が可能で；ｃ）バックグラウンドが排除できる、という特徴ををもつベクターを提供することが、当該技術分野では必要とされている。
当該技術分野で現在利用できるクローニングベクターは、上記の特徴を満足できない。
本発明は、当該技術分野のそれらの問題の解決を目的とする。
本発明は、広域サイズの核酸、好ましくは非常に長い核酸を、高効率の切出しと、バックグラウンドおよび汚染（コンタミネーション）が低減された状態で、クローニングすることが可能な新しいファミリーのベクターを提供する。また、それらのベクターを用いた、クローニング方法およびバルクライブラリーの調製方法も提供する。
第１の態様によれば、本発明は、構築ベクターセグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、ＣＳのサイズが３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂ、好ましくはＣＳが３７．５ｋｂである、クローニングベクターを提供する。この構築ベクターセグメントは、好ましくは、バクテリオファージλベクターで作られる、またはそれを含む。この可換ベクターセグメント（ＲＳ）は、クローニングしようとする興味ある核酸挿入体により置換されるセグメントを表す。
意外なことに、このサイズをもつクローニングベクターは、非常に長いサイズのｃＤＮＡを好ましくも挿入可能で、従ってそれは、非常に完全長のｃＤＮＡのクローニングに特に有利なことが見い出された。３８ｋｂの構築ベクターセグメントをもち、短いサイズのｃＤＮＡに強いバイアスを示すという現行のベクターλ−ＦＬＣの当該技術分野における問題を、このベクターは克服する（表１を参照されたい）。
完全長ｃＤＮＡライブラリーの調製のためのベクターの特定の有利なサイズの選択は、λ以外のバクテリオファージにも適用可能である。従って、本発明は、構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、ＣＳのサイズがＸ−１．２ｋｂ≦ＣＳ＜Ｘｋｂで、Ｘはパッケージングを受けるバクテリオファージベクターに必要な最小サイズに相当する、クローニングバクテリオファージベクターにも関する。ＣＳのサイズは好ましくはＸ−０．２ｋｂである。
本発明は、少なくとも複製起点（ｏｒｉ）を含む細菌人工染色体（ｐＢＡＣ）またはそのセグメントを含むバクテリオファージベクター、好ましくは、λバクテリオファージベクターに関する。このベクターは、ＤＮＡフラグメントをクローン化することができる部位；およびＤＮＡフラグメントをクローン化することができるこの部位を含む切除可能フラグメントを規定する１対の誘導性切除媒介部位を含むこともできる。この切除媒介部位の対は、好ましくは、ＦＲＴ部位である。
このベクターは、誘導性複製起点、好ましくは、ｏｒｉＶを更に含んでいてよい。
本発明のクローニングベクターは、既知の組換え系、例えばＣｒｅ−ｌｏｘおよび／またはＧａｔｅｗａｙＴＭシステムを用いて、プラスミドまたは核酸挿入体の切出しを行うことが可能である。
本発明のベクター類は、ｃｃｄＢ遺伝子、ｌｏｘ配列またはｌａｃＺ遺伝子などのバックグラウンド低減システム、または制限エンドヌクレアーゼにより認識される非対称サイト配列も含むことが可能である。
本発明は、上記ベクターを使うクローニング方法にも関する。
別の態様によれば、本発明は、本発明のベクターのＲＳセグメント中に、または、ＧａｔｅｗａｙＴＭシステムの場合には、デスティネーションまたは受入れベクターのＲＳセグメント中に含まれる、ｃｃｄＢ遺伝子および／またはｌｏｘ配列のようなバックグラウンド低減配列を含むクローニングベクターを提供することにより、バックグラウンドまたはコンタミネーションを低減するためのシステムに関する。ファージまたはプラスミドベクターのＲＳは、制限エンドヌクレアーゼにより認識される２つの非対称サイト配列により隣接されることも可能である。
本発明は、これらのベクターを用いることによりバックグラウンドまたはコンタミネーションを低減する方法にも関する。
本発明は、本発明のベクター類を用い、改良Ｃｒｅ−リコンビナーゼまたはＧａｔｅｗａｙＴＭシステムを提供し、プラスミドまたは興味ある核酸の効率的な切出しのための方法にも関する。
好ましくは、本発明は、本発明のベクター類を用いて、長いまたは完全長のｃＤＮＡライブラリーのバルクを調製する方法に関する。
本発明は、本発明の少なくとも１つのクローニングベクターまたは少なくとも１つのベクター類のライブラリーを含むキットにも関する。
本発明はさらに、本発明の切出し法により得られたプラスミドベクター、または、均等化および／または差引き化ドライバーとして、好ましくは１本鎖に減らされた本発明のデスティネーションベクターを使うことを含む、少なくとも１つの均等化および／または差引き化ライブラリーを調製するための方法にも関する。
完全長クローニングは、長いｃＤＮＡの調製およびクローニングの両方に関係する問題によって阻まれてきた。当該諸問題の多くの部分は、熱安定化および熱活性化逆転写酵素による長いｃＤＮＡの調製（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：５２０−５２４）およびキャップ構造に基づく完全長ｃＤＮＡ選択技術の開発（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３７：３２７−３３６；Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９７，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，４：６１−６６；Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３０３：１９−４４；Ｃａｒｎｉｎｃｉら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：１６１７−１６３０）によって克服された。
しかし、クローニング法およびバルクｃＤＮＡライブラリーを調製する方法は、短いサイズのｃＤＮＡになおバイアスを示す。
本発明は、核酸を広範なサイズで、好ましくは非常に長くかつ完全長のｃＤＮＡとしてクローニングし、切出しの高効率、および低減されたバックグラウンドとコンタミネーションを達成できる新しいファミリーのベクターを提供する。そのようなベクターを用いたクローニング方法も提供する。
第１の態様によれば、構築ベクターセグメント（ＣＳ）、および、可換セグメント（ＲＳ）（「スタッファーＩ」と言うこともある）（図１参照）を含むクローニングベクターが提供される。ＲＳは、クローニングしようとする興味ある核酸挿入体により置換される予定のセグメントである。
本発明のバクテリオファージまたはプラスミドベクターは直線状または環状のいずれでもよい（図５、ａ−ｉ参照）。直線状ベクターの場合、セグメントＣＳは、ＲＳの左側の１本と右側の１本の２本のアームまたはセグメントに分かれていると、模式的に考えてもよい。しかし、より明確に述べるなら、ＣＳの左アームまたはセグメントおよび右アームまたはセグメントという用語は、環状ベクターの場合にも用いられる。
当該技術分野で利用できるベクターは修飾タイプのλＰＳベクターであり、３２ｋｂの「基本的」サイズに６ｋｂの核酸配列（スタッファーII）をプラスしたもので、したがって、当該ベクターのサイズは、興味あるｃＤＮＡを考慮から除くと、３８ｋｂであった（本出願人の特開２０００−３２５０８０号）。しかしこのベクターは、短いｃＤＮＡおよび非完全長ｃＤＮＡにバイアスする短所をもっており、そのようなｃＤＮＡの存在は、完全長ｃＤＮＡライブラリーまたはエンサイクロペディアの調製には不都合である。
本発明者らは、意外にも、ＣＳのサイズが３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂ、好ましくはＣＳが３７．５ｋｂであるベクター、好ましくはバクテリオファージ、さらに好ましくはλバクテリオファージが、３８ｋｂのλファージの問題を回避し、長いおよび完全長ｃＤＮＡの選択を許容することを見い出した。
本発明のＣＳの３７．５ｋｂという好ましいサイズは、３７．７ｋｂ（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｉら，１９９３，上記に同じ）に相当する、λファージがパッケージングを受けるのに必要な最小サイズより、０．２ｋｂ短い。
従来のベクターのＣＳ３８ｋｂに比べて、本発明によるＣＳ３７．５ｋｂのベクターが有する利点は表１に示した。短いものに対するバイアスを避け、完全長ｃＤＮＡの好ましい調製のためのこのシステムは、λとは異なるバクテリオファージにも適用可能である。
従って、本発明は、構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、ＣＳのサイズが、Ｘ−１．２ｋｂ≦ＣＳ＜Ｘで、Ｘ（ｋｂで表記される）は、パッケージングを受けるためのバクテリオファージベクターに必要な最小サイズに相当する（上記Ｚａｂａｒｏｗｓｋｉらの報告にあるように、名目上は、λについて３７．７ｋｂである）、クローニングバクテリオファージベクターにも関する。ＣＳのサイズは好ましくはＸ−０．２ｋｂである。
Ｘのサイズから短い断片を減少させることは、ＣＳ断片をパッケージングレベル以下にするが、ＲＳ（「スタッファーＩ」とも言う）の存在は、バクテリオファージベクターのパッケージングを可能にする。図１および２において、本発明のベクターが、所望サイズのスタッファーIIを挿入して、構築されている。スタッファーIIは好ましくは５．５ｋｂで、その結果、ＣＳは３７．５ｋｂに相当する。しかしスタッファーIIは４．５≦スタッファーII＜６でよい。スタッファーIIはどのような起源およびどのような核酸であってもよい。それは外来配列、例えばマウスゲノムＤＮＡまたはプラスミドから取ってきてもよい。スタッファーIIは元々既にベクター中に存在することも可能である。本発明のベクターのＣＳは、好ましくはバクテリオファージセグメントであるか、バクテリオファージ断片を含むことも可能である。好ましくは、バクテリオファージはλバクテリオファージである。利用可能なバクテリオファージおよびλバクテリオファージのリストは、本出願の属する技術分野で報告されており（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら２．１６−２．５３に報告されているものを参照されたい）あるいはそれらに由来するものも使用できる。
ＣＳは、ｏｒｉを少なくとも含むプラスミドセグメントを含ませることによっても修飾可能である。ｏｒｉを含むプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋），ｐＵＣ，ｐＢＲ３２２，およびｐＢＡＣの群から選ばれるのが好ましい。例えば、図１では、ｏｒｉを含む修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）の断片が、ＣＳの左アームに挿入されている。ｐＢＡＣまたはその誘導体の、本発明のベクターの調製のための使用についての例は、例えば図９から図１２および実施例２０に示した。しかしながら、ｐＢＡＣまたはその誘導体は、本発明のいずれのベクター構築物の調製についても効率よく使用できる。本発明のベクター類の構築に用いられるベクターおよびリンカー、アダプター、プライマー配列などの例は、ＮＣＢＩ ＶｅｃＳｃｒｅｅｎ，ＵＮＩＶＥＣ Ｂｕｉｌｄ ＃３．２ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｎｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ＵＳ）に報告されている。これらのベクター類に関する具体的な情報は、ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＵＳ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，ＵＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳ；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳにも見られる。
本発明のクローニングベクターは、選択マーカーも含むことが可能である。従って、有毒な化合物に対する耐性を付与する産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、抗生物質耐性遺伝子）；遺伝子産物の活性を抑圧する産物をコードするＤＮＡセグメント；識別可能な産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ベータ・ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および細胞表面タンパク質のような表現型マーカー類）；細胞機能を阻害する産物をコードするＤＮＡセグメント；所望の分子の単離を可能にするＤＮＡセグメント（例えば、特定タンパク質への結合サイト）；および酵素により認識される特定のヌクレオチド認識配列をコードするＤＮＡセグメント、より成る群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを、ＣＳが含む。
前記選択マーカーは、より具体的には、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、酵素切断サイト、タンパク質結合サイト、より成る群から選択される少なくとも１つのマーカーおよびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列である。
選択マーカーの例としてのＡｍｐが図１および２に示されている。
本発明のベクター類のＲＳは、（図１、５に示すように）、2つの組換えサイトにより隣接されることが可能であるが、それら2つの組換えサイトは相互に組換えをしない。より具体的には、それらの組換えサイトは、ＧaｔｅｗａｙＴＭ方法論に従う組換え切出しを行うためのａｔｔＢ，ａｔｔＰ，ａｔｔＬ，およびａｔｔＲまたはそれらの誘導体より成る群から選択される（Ｗａｌｈｏｕｔら，２０００，上記に同じ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅ；Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＵＳ５８８８７３２）。Ｇａｔｅｗａｙ組換えサイトおよび誘導体の完全リストは、上記Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ参考文献に開示されている。
ＧａｔｅｗａｙＴＭシステムは、プラスミド間の成分の交換のために、また、興味ある核酸挿入体を特定の機能性プラスミド中へ移すために、当該技術分野で提案された。しかしＧａｔｅｗａｙシステムは短いｃＤＮＡにバイアスを示し、長いｃＤＮＡは低い効率で得られた（Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ． Ｂｒａｓｃｈ，スライド“Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｔｔＢ−ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ"，ＧＩＢＣＯＢＲＬＲ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｍｉｎａｒ，“Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"， Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ，１９９９）。
ところが、本発明者らは、本発明に従ってＧａｔｅｗａｙ組換えサイトを、バクテリオファージベクター中へ移し、（図１，２および５，ａ，ｂ，ｅ，ｆに示すように）ＲＳに隣接配置したところ、当該クローン化ｃＤＮＡライブラリーは短いｃＤＮＡへバイアスを示さないことが、意外にも見い出された。それ故、本発明は、好ましくはＣＳサイズが３２ｋｂ≦ＣＳ＜４５ｋｂ，特に３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂ，より好ましくはＣＳが３７．５ｋｂであり、相互に組換えをしない2つの組換えサイトを含み、ＲＳに隣接する（図５，ａ−ｇ）、バクテリオファージベクターを提供する。バクテリオファージは好ましくはλバクテリオファージである。
しかし本発明のバクテリオファージベクターは、λバクテリオファージに限らず、当該技術分野で知られる他のバクテリオファージも使用可能である（例えば、上記のようにＺａｂａｒｏｖｓｋｉら、１９９３，に記載されているもの）。
本発明のベクターで、Ｇａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ，Ｐ，ＬまたはＲまたはそれらの誘導体とは別に、ＲＳに隣接する２つのｌｏｘ組換えサイト（例えば２つの一般的なｌｏｘ１およびｌｏｘ２サイトが図５、gに示されている）を使ってもよい。これらのｌｏｘ組換えサイトは、どのような変異型または誘導型ｌｏｘサイト、例えば変異型または誘導型ｌｏｘＰサイト、Ｈｏｅｓｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８６，１４（５）：２２８７に記載されている（例えばｌｏｘＰ５１１）でもよい。
本発明のベクターは、２つのｌｏｘ組換え体サイトで、それらの各々がＣＳの各アーム（またはセグメント部分）（図１，２，および５，ｃ−ｆ，ｉ）、すなわち、一方のｌｏｘサイトは、ＲＳの（または興味ある核酸挿入体の）左側のＣＳ中にあり、もう一方のｌｏｘサイトは、ＲＳの（または興味ある核酸挿入体の）右側のＣＳ中にあり、それらのｌｏｘ組換えサイトは相互に組換え可能である、ように配置された前記組換え体サイトを、含んでもよい。
これらのサイトは、２つのｌｏｘ組換えサイトで、修飾、変異、または誘導されたｌｏｘサイト（Ｈｏｅｓｓら，１９８６，上記に同じ）、好ましくはｌｏｘＰまたはそれの修飾または誘導体であってもよい。例えば、ｌｏｘはｌｏｘＰ５１１（Ｈｏｅｓｓら，１９８６、上記に同じ）であってもよい。ｌｏｘＰ５１１はもう１つのｌｏｘＰ５１１サイトと組換えをするが、ｌｏｘPサイトとは組換えしない。ｌｏｘサイトの上記すべての変化体、変異体、修飾体または誘導体は、本発明の目的については、「ｌｏｘサイトおよびその誘導体」と通常表示する。
この場合、ＲＳが興味ある核酸挿入体により置換された後は、組換えはＣｒｅ−ｌｏｘ組換え酵素により行われる。
Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系は、いくつかの先行技術文献中に記載されている、例えば、Ｐａｌａｚｚｕｏｌｏら，１９９０（上記に同じ）；Ｅｌｌｅｄｇｅら，１９９１（上記に同じ）；およびＳｕｍｍｅｒｓら，１９８４（上記に同じ）を参照されたい。
前記Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え酵素系とは別に、他の組換え系を本発明の目的のために使ってもよい。それらには、Ｋｗ組換え酵素（Ｒｉｎｇｒｏｓｅ Ｌ．ら，１９９７，ＦＥＢＳ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４８：９０３−９１２），Ｔｎ３レス／レソルバーゼ（解離酵素）からのエレメントとのハイブリッド部位特異的組換え系（Ｋｉｌｂｒｉｄｅ Ｅ．ら，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９：１２１９−１２３０）、β組換え酵素系（Ｃａｎｏｓａ Ｉ．ら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３巻，２２号，５月２９日：１３８８６−１３８９１）；ＦＬＰ組換え酵素系（Ｈｕｆｆｍａｎ Ｋ．Ｅ．およびＬｅｖｅｎｅ Ｓ．Ｄ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，：２８６：１−１３；およびＷａｉｔｅ Ｌ．Ｌ．およびＣｏｘ Ｍ．Ｍ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０巻，４０号：２３４０９−２３４１４）が含まれる。これらの組換え部位の修飾、変異または誘導体も使用可能で、それらは通常「それらの誘導体」と表示される。
Ｃｒｅリコンビナーゼまたは他の組換え酵素に仲介されるこの組換え工程の結果は、興味ある核酸を含むプラスミドの切出しである。
本発明の一つの態様によれば、組換えＧａｔｅｗａｙ様システムに対するＲＳに隣接する組換えサイト、およびＣｒｅ−ｌｏｘ，Ｋｗ，Ｔｎ３レス／レソルバーゼ、β組換え酵素およびＦＬＰ組換えに対するＣＳの２本のアーム中の組換えサイトの両方をベクター中に存在させて、当該ベクターをクローニング、興味ある核酸材料の転移、およびライブラリーの調製に特に適するようにする。事実、特定の場合には、最も便利な切出し系は、当該ベクターを変えたり修飾したりせずに選択可能である。
さらなる側面によれば、本発明のクローニングベクターは、バックグラウンドが低いか無いライブラリーのクローニングまたは調製にも使用できる。従って、本発明は、構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、当該ＣＳがバクテリオファージベクターセグメントで、当該ＲＳがバックグラウンド低減系として少なくともｃｃｄＢ遺伝子を含む、クローニングベクターを提供する。
本発明のバクテリオファージまたはプラスミドクローニングベクターは、また、構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）も含み、当該ＣＳはバクテリオファージまたはプラスミドベクターセグメントであり、ａ）当該ＲＳはバックグラウンド低減系として少なくとも１つの組換えサイト（ＣＳの左右のアームに存在する２つの組換えサイトとの組換えが可能）を含むか、またはｂ）当該ＲＳは、制限エンドヌクレアーゼ類により認識される、相互に連結しない２つのエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列により隣接されていてもよい。
ＲＳ中に含まれる前記組換えサイトは、ＣＳの左右のアーム中に存在する組換えサイトと組換え可能でなければならない。それ故、このＲＳ組換えサイトを「第三の」組換えサイトと呼んでもよい。その「第三の」組換えサイトは、ｌｏｘ組換えサイトまたはその誘導体、好ましくはｌｏｘＰサイトまたはその誘導体でもよい。
前記２つのエンドヌクレアーゼ非対称サイト配列バックグラウンド低減系は、例えば、ａ）ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、またはｂ）クラスIIＳ制限酵素類が認識可能な非対称制限エンドヌクレアーゼ切断サイト配列であってもよい。
前記バックグラウンド低減バクテリオファージベクターは、ＣＳのサイズが好ましくは３２ｋｂ≦ＣＳ≦４５ｋｂで、有利にはＣＳが３６．５≦ＣＳ＜３８ｋｂ，さらに好ましくはＣＳが３７．５ｋｂである。前記バクテリオファージは好ましくはλバクテリオファージである。前記バクテリオファージＣＳまたは当該ベクターは、少なくとも一つのｏｒｉを含むプラスミドセグメントを含んでもよい。ｏｒｉを含む前記プラスミドセグメントは、好ましくは、しかし非限定的に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋），ｐＵＣ，ｐＢＲ３２２およびｐＢＡＣより成る群から選択されるか、または上記のように、ＮＣＢＩデータベースに含まれるいずれかのプラスミドである。
バックグラウンド低減プラスミドの場合、当該技術分野で既知の如何なる種類のプラスミド、例えば、上述のプラスミドまたはＮＣＢＩデータベースに開示されたどのプラスミドでもよい。
このベクターは、上記に示した群から選択された少なくとも１つの選択マーカーを含む。特に、当該少なくとも選択されるマーカーは、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、酵素切断サイト、タンパク質結合サイトより成る群およびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列から選択可能である。
前記バックグラウンド低減クローニングバクテリオファージまたはプラスミドベクターはまた、上記のような組換え系の少なくとも１つ、すなわち、ａ）ＲＳに隣接し、相互に組換えをしない２つの組換えサイト（Ｇａｔｅｗａｙサイトまたはｌｏｘ修飾サイト）、および／またはｂ）組換え酵素により認識され、ＣＳの２アーム中に配置された、相互に組換えをする少なくとも２つの組換えサイト、を含むことも可能である。相互に組換えできるそれらの組換えサイトは、上記のように、ｌｏｘサイト，Ｋｗ，Ｔｎ３レス／レソルバーゼ，β組換え酵素サイト，およびＦＬＰサイトより成る群より、好ましくは選択される。
バックグラウンド低減ｃｃｄＢ系に関しては、Ｂｅｒｎａｒｄ Ｐ．およびＣｏｕｔｕｒｉｅｒ Ｍ．（１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：７３５−７４６）によりプラスミド中へ、およびＷａｌｈｏｕｔら（上記に同じ）によってもＧａｔｅｗａｙＴＭベクター用に、開示されている。
前記ｃｃｄＢ遺伝子の産物はＤＮＡジャイレースを妨害する。組換え後、ｃｃｄＢ遺伝子を消失したプラスミド（それらは組換え体である）だけが、ｇｙｒＡに対して変異していない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で増殖できるので、選択的利点がある（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｏｌｉｅｓ文献を参照されたい）。
遺伝子ｃｃｄＢをもつプラスミドは特定の大腸菌株でのみ増殖可能である。例えばＤＢ３．１で、この株はｇｙｒＡ遺伝子に変異があり、ｃｃｄＢに対して耐性を付与する（Ｗａｌｈｏｕｔら，上記に同じ）。それ故、この種の組換えはプラスミドに限られる。何故なら、クローニング系で使われるバクテリオファージベクター、例えばλ置換ベクターは、ｒｅｃＡタンパク質を欠くＤＢ３．１のような細胞中では増殖、複製することはできないからである（ｒｅｃＡ産物は置換型バクテリオファージλの増殖に必要である：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。
これに対して、本発明者らは、本発明によりＲＳ中にｃｃｄＢ遺伝子を含ませたバクテリオファージ、好ましくはλバクテリオファージが、Ｃ６００細胞の培養物中で増殖し、複製可能なことを、意外にも見い出した。なお、ｃｃｄＢ遺伝子を含むプラスミドはＣ６００細胞中で増殖できない。
本発明のベクターにおけるバックグラウンド低減ｃｃｄＢ系の機構を図１，ｇに示す。
興味ある核酸挿入体とＲＳとの置換の際に、置換が起らないか、不完全な連結または置換が生じる可能性がある。この場合、完全な興味ある核酸挿入体をもたないバクテリオファージまたはプラスミドのベクターが培養液中に存在することになって、バックグラウンドを与える。ｃｃｄＢ「自殺遺伝子」を存在下させると、バックグラウンドまたは副産物をゼロ近くまで低減できると考えられる。
バックグラウンドコンタミネーションの問題は、スタッファーＩ（ＲＳ）の除去がゲル（例えばアガロースゲル）上で行われ、スタッファーＩ核酸の断片がＣＳと共に集められ、従ってベクターに再度挿入されうる場合には、精製中にも起りうる。
もう１つのバックグラウンド低減系は「第三の」組換えサイトで、これはＲＳ中に置かれ、本発明のバクテリオファージまたはプラスミドベクターのＣＳの左右のアームの中にある組換えサイトと組換えが可能である（図１，ｉ；図５，ｉ）。この「第三の」組換えサイトは、ｃｃｄＢ遺伝子の存在下または非存在下でも機能しうる。
好ましくは、このバックグラウンド低減「第三」組換えサイトは、上述のように、ｌｏｘサイトまたはその誘導体、より好ましくは、ｌｏｘＰサイトまたはその誘導体、修飾体または変異体である。しかし、ＲＳ中に存在するバックグラウンド組換えサイトは、ＣＳの両腕中に存在する２つの組換えサイトと、組換えができなければならない。従って、Ｃｒｅリコンビナーゼにより仲介される組換えの場合、３つのサイトはいずれも、相互に組換え可能なｌｏｘ組換えまたはそれらの誘導体でなければならない。
例えば、図１，ａおよび１，ｆにおいて、（バクテリオファージまたはプラスミドベクターの）ＣＳの左右のアームにある２つの組換えサイトおよびＲＳ（スタッファーＩ）中のバックグラウンド低減「第三」組換えサイトは、いずれもすべてｌｏｘＰサイトである。
図１．ｉ）において、「第三」組換えサイトの作用機構が説明されている。興味ある核酸挿入体が不完全連結した場合、ＣＳのアームのｌｏｘＰサイトの１つは、切出し工程の間に、「第三」ｌｏｘＰと好ましく組換えし、切出しプラスミドを形成するが、そのプラスミドは、ある場合にはｏｒｉを欠くので複製できず、また別の場合には選択マーカー（図中のＡｍｐ）を欠くので成長できない。
従って、本発明は、記述のように、少なくとも一つの「第三の」組換えサイトを含むバクテリオファージまたはプラスミドベクターを用いて、バックグラウンドの低いまたは無いバルクライブラリーをクローニングするか、または調製する方法にも関する。
このバックグラウンド低減「第三」組換えサイトは、ｌｏｘ以外のどの組換えサイトでも、例えば、上記のような組換えに使われる組換えサイトでもよい。
本発明のバックグラウンド低減バクテリオファージまたはプラスミドクローニングベクターは、ｃｃｄＢ遺伝子または「第三」組換えサイトなどの存在下であっても、ＲＳ中にｌａｃＺ遺伝子を加え、または存在させてもよい。
本発明のバクテリオファージまたはプラスミドクローニングベクターは、上記のようなバックグラウンド低減配列の代わりに、またはその存在下で、制限エンドヌクレアーゼ類により認識される２つの非対称サイトも含んでもよい。これら２つの非対称サイト配列は、当該ベクターのＲＳに隣接する（図６）。
本発明の目的に有用な非対称サイト配列は、ａ）２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列またはｂ）クラスIIＳ制限酵素類により認識可能な制限エンドヌクレアーゼ非対称切断サイトである。
ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ａにより販売および記載されている；前記非対称サイト配列の記述もＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇから入手できる。これらのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列は、１８から３９ｂｐである。しかしながら、本発明においては認識サイト配列はこれらの配列やこれらのサイズには限定されない。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇは、Ｉ−Ｃｅｕ−Ｉによる５回の繰返し消化の後、ＤＮＡ断片の９５％以上が、本酵素により連結および再切断可能と、報告している。
好ましくは、前記非対称サイト配列を切断できる制限ホーミングエンドヌクレアーゼ類は、Ｉ−ＣｅｕＩ，ＰＩ−ＳｃｅＩ，ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＩ−ＳｃｅＩより成る群から選択される。
図６，ａ）は、そのＲＳが除かれ、相互に連結しない２つのホーミングエンドヌクレアーゼ認識サイト配列をＣＳ腕の末端部にもつようになったベクターを示す；ＲＳは、これらのサイトの配列に特異的なホーミングエンドヌクレアーゼを用いて取り除かれた。図６，ｂ）では、隣接して配置された一対のホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列（これらの配列はベクターのものと同じである）をもつ興味ある核酸挿入体が、上記のＲＳを除去したベクターへの連結のために提供されている。図６，ｃ）では、ベクターの１つのホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列が、当該挿入体の相補性ホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列を認識し、ハイブリッド形成する。図６，ｄ）では、ベクターの第２ホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列が、ある時間経過後、好ましくは一晩後に、興味ある挿入体のもう一方の末端部に配置された相補性ホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列を認識し、ハイブリッド形成する。結局、本システムを用いて、ある時間の後、挿入体のすべての相補性部位配列は、ベクターの相補性サイト配列を認識し、ハイブリッド形成する。結果として、挿入体・ベクター連結が行われる。挿入体・挿入体およびベクター・ベクターの連結は、それらの末端部が相補的でないため起らず、副産物が低減する。このシステムの場合、当該ベクターに入る核酸コンタミネーションも低減される。
ホーミングエンドヌクレアーゼ認識サイト配列は、デスティネーションベクター、好ましくはプラスミド、ヘ配置も可能で、そのサブクローニング工程は、有利に実施できる。このデスティネーションベクターは、当該ベクターのものと同一の２つのエンドヌクレアーゼ認識サイト配列を隣接して配置した、興味ある核酸挿入体と連結する。
同じ工程は、クラスIIＳエンドヌクレアーゼ酵素類により認識される非対称サイト配列を、ホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列の代わりに使う場合にも実施可能である。クラスIIＳ制限酵素類は、ＡｌｗＡ，ＡｌｗＸＩ，Ａｌｗ２６Ｉ，ＢｂｓＩ，ＢｂｖＩ，ＢｂｖII，ＢｃｓｆＩ，ＢｃｃＩ，ＢｃｇＩ，ＢｃｉＶＩ，ＢｉｎＩ，ＢｍｒＩ，ＢｐｍＩ，ＢｓａＩ，ＢｓｅＲＩ，ＢｓｇＩ，ＢｓｍＡＩ，ＢｓｍＢＩ，ＢｓｐＭＩ，ＢｓｒＤＩ，ＢｓｔＦ５Ｉ，ＥａＲＩ，Ｅｃｏ３１Ｉ，Ｅｃｏ５７Ｉ，Ｅｓｐ３Ｉ，ＦａｕＩ，ＦｏｋＩ，ＧｓｕＩ，ＨｇａＩ，ＨｉｎＧＵII，ＨｐｈＩ，Ｋｓｐ６３２Ｉ，ＭｂｏII，ＭｍｅＩ，ＭｎII，ＮｇｏＶIII，ＰｌｅＩ，ＲｌａＡＩ，ＳａｐＩ，ＳｆａＮＩ，ＴａｑII，ＴｔｈｌｌｌII，ＢｓｎＩｓ，ＢｓｍＦＩ，ＢｓｅＭII，および同様なもの（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ Ｗ．ら，１９９１，Ｇｅｎｅ，１００，１３−２６；およびＣａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を含む。
いくつかの制限酵素の認識サイトおよび切断サイトの例（括弧内は、認識サイトおよび切断サイト）は、ＢｂｖＩ（ＧＣＡＧＣ ８／１２），ＨｇａＩ（ＧＡＣＧＣ ５／１０），ＢｓｍＦＩ（ＧＧＧＡＣ １０／１４），ＳｆａＮＩ（ＧＣＡＴＣ ５／９），およびＢｓｐＩ（ＡＣＣＴＧＣ ４／８）である。
上述のエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列は、ｃｃｄＢ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、および／またはＲＳ中への「第三」バックグラウンド低減組換えサイト（例えばｌｏｘ）の存在下でも、本発明のバクテリオファージまたはプラスミドクローニングベクター中へ配置することが可能である。
上述のようにエンドヌクレアーゼ非対称系と連結されたベクターは、引き続いて、ＣＳ中に存在する任意の組換え系、例えばｃｒｅ−ｌｏｘ組換え酵素、好ましくはｌｏｘＰ，Ｋｗ，ＦＬＰ，Ｔｎ３レス／レソルバーゼ、β組換え酵素、などにより切出されることが可能である。それ故、エンドヌクレアーゼ非対称性を含む本発明のベクターは、少なくとも一対の組換えサイトもＣＳ中に含む。
本発明のクローニングベクターのＲＳ（またはスタッファーＩ）は当該ベクターにより除去され、連結工程で興味ある核酸挿入体と置換される。
本発明の態様のすべてで使われる興味ある核酸挿入体は、ＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドより成る群から選択される。有利には、長いｃＤＮＡおよび好ましくは完全長ｃＤＮＡである。完全長ｃＤＮＡは好ましくは均等化および／または差引き完全長ｃＤＮＡである。
本発明に従うベクター類はいずれも、興味ある核酸のクローニングに、およびライブラリー、特に完全長ｃＤＮＡライブラリー／ライブラリー類、の調製に非常に有用であることが判明した。
従って、本発明は、少なくとも１つの興味ある核酸挿入体をクローニングする、または少なくとも１つの興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、ａ）少なくとも１つの本発明のクローニングベクターを調製する；ｂ）当該クローニングベクター中のＲＳを、興味ある核酸挿入体と置換し、興味ある核酸挿入体を含むベクターを得る；ｃ）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含むプラスミドのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの切出しを行う；ｄ）興味ある核酸挿入体をもつ（組換え体）プラスミド、または興味ある核酸挿入体をもつ（組換え体）プラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法に関する。
所望により、工程ｂ）およびｃ）の間に、クローニングベクターの増幅の工程を行うことが可能である。
本発明の前記方法は、バックグラウンドを減らしたまたは無い状態で、興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製するために使用可能である。
従って、本発明は、バックグラウンドが低いか無い状態で、興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）上述のように、バックグラウンド低減系を含む、本発明の少なくとも１つのクローニングベクターを調製する；（ｂ）工程（ａ）のベクターのＲＳを興味ある核酸挿入体と置換する；（ｃ）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含むプラスミドのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しを行う；（ｄ）興味ある核酸挿入体をもち、またバックグラウンド低減配列を欠く（組換え体）プラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法を提供する。
所望により、工程ｂ）およびｃ）の間に増幅工程が行われる。
本発明によるバックグラウンド低減系は、遺伝子ｃｃｄＢまたは「第三」組換えサイト配列（ＣＳの左右アームの中にある２つのｌｏｘ組換えサイトと組換え可能な）であってよく、それは、本発明のバクテリオファージまたはプラスミドのＲＳ中に配置される。前記「第三」組換えサイトは、好ましくはｌｏｘサイトまたはその誘導体であり、より好ましくはｌｏｘＰサイトまたはその誘導体である。
Ｇａｔｅｗａｙ様の方法の場合、遺伝子ｃｃｄＢは、デスティネーションベクターのＲＳ中へ配置される。
前記バクテリオファージまたはプラスミドベクターまたはデスティネーションベクターは、ｌａｃＺ遺伝子を含むことも可能である。
別途、本発明による前記バックグラウンド低減法では、バクテリオファージまたはプラスミドベクターは、ＲＳに隣接する２つのエンドヌクレアーゼ非対称認識部位配列を含むことも可能である。
従って、本発明は、興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ベクターのＲＳに隣接して配置された２つのエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列を含む、少なくとも１つのバクテリオファージまたはプラスミドベクターを調製する；（ｂ）工程ａ）のベクター中へ配置された２つの配列と連結できる２つのエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列を両隣に含む興味ある核酸挿入体によってＲＳを置換し、興味ある核酸挿入体を含むベクターを得る；（ｃ）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含む少なくとも１つのプラスミドのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの切出しを行う；（ｄ）バックグラウンドが低いか無い状態で、興味ある核酸をもつ（組換え体）切出しプラスミドまたはデスティネーションプラスミド、または当該プラスミド（類）のライブラリーを回収する、工程を含む前記方法にも関する。
さらに、本発明は、本発明のベクターを用いる、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのＣｒｅ−ｌｏｘ組換え系に関する。
従来技術の項に記載したように、当該技術で周知（Ｐｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，Ｇｅｎｅ，８８：２５−３６）のＣｒｅリコンビナーゼ固相ｉｎ ｖｉｖｏ切出し（図３も参照されたい）は、低いプラスミド収量（Ｐａｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，上記に同じ）およびプラスミドの不安定性という欠点がある；実際、Ｃｒｅリコンビナーゼは構成的に発現されて、プラスミドの２量体／多量体の生成を起こして、高比率の無プラスミド細胞をもたらし、配列分析の効率を損なう（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９８４，Ｃｅｌｌ，３６：１０９７−１１０３）。
一方、Ｃｒｅ液相ｉｎ ｖｉｖｏ切出しの使用は、これまで成功していない。その理由は、液培養では短いプラスミドを含む細胞は非常に長いプラスミドを含む細胞より速く複製し、短いプラスミド（すなわち興味ある短い核酸挿入体）の方にバイアスを生じ、長いまたは完全長核酸挿入体を得るのが極めて難しいためである。
本発明者らは、増殖（複製）および増幅の極めて低いか無い条件下の液相でプラスミドの切出しを行い、興味ある核酸挿入体を抽出し、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しない細胞中で増殖が可能な種々のプラスミドを調製し、および固相中で（プレート上で）さらに増殖（増幅）を行わせることにより、従来技術の前述の欠点を実質的に回避できることを、意外にも見い出した。
従って、本発明は、少なくとも１つの興味ある核酸挿入体をクローニングする、または少なくとも１つの興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、ａ）構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含む少なくとも１つのクローニングベクターであって、当該ＣＳがその左右アームに位置する少なくとも２つのｌｏｘ組換えサイトまたはそれらの誘導体を含むバクテリオファージベクターである、前記クローニングベクターを調製する；ｂ）当該クローニングベクター中のＲＳを興味ある核酸挿入体で置換する；ｃ）当該ベクターをパッケージングする；ｄ）ｃｒｅ組換え酵素を発現する少なくとも１つの細胞をｉｎ ｖｉｖｏ液相感染させる；ｅ）切出しプラスミドが短時間しかまたは全く増殖しない条件下で、興味ある核酸挿入体を含むプラスミドのｉｎ ｖｉｖｏ液相切出しを行わせる；ｆ）細胞溶解を行わせ、前記挿入体をもつプラスミドまたはそれらのプラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法を提供する。
この方法は、所望により、ｇ）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しない少なくとも１つの細胞を電気穿孔または形質転換し、工程ｆ）のプラスミドを当該細胞中へ貫入させる；ｈ）工程ｇ）におけるように感染させた細胞をプレーティングし、興味ある核酸挿入体をもつプラスミドまたはそれらのプラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む。
前記電気穿孔は、当該技術分野で周知の方法に従って行われる。前記形質転換は、好ましくは化学的処置、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１．７１−１．８４に従って行われる。
本方法で用いるバクテリオファージベクターは、好ましくはλバクテリオファージである。
相互に組換えするｌｏｘ組換えサイトは、上記のように、変異、修飾または誘導のいずれの型のｌｏｘサイトでもよく、好ましくはｌｏｘＰであり、変異、修飾または誘導化されていてもよい（従って、通常、ｌｏｘＰまたはその誘導体と表示される）。
本方法の工程ｅ）は、好ましくは２０〜４℃の温度で、０〜３時間で行われる。当該温度は好ましくは室温から３７℃である。
本発明者らは、新しいかつ創意に富むｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え法も開発した。
このｉｎ ｖｉｔｒｏ法では、興味ある核酸挿入体を含むバクテリオファージベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、当該技術分野で知られる（細菌用）パッケージング抽出物（エキス）（例えば、ＧｉｇａｐａｃｋＲ またはＧｉｇａｐａｃｋｇｏｌｄＲ または同等物、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳ）の存在下で、パッケージされる。エキス中にあるヌクレアーゼ類は、パッケージされなかった短い核酸および核酸コンタミネーション全般を切断する。その結果、パッケージされたベクターの核酸が精製される。
５．５ｋｂのスタッファーIIを含むベクター（または３７．５ｋｂのＣＳのサイズをもつバクテリオファージベクター）が使われる好ましい場合、０．５ｋｂ未満のサイズをもつ短いおよび完全長でないｃＤＮＡは、パッケージされず、エソヌクレアーゼにより除去される。その結果、短いｃＤＮＡに対するバイアスが低いか無いライブラリーが得られる。このライブラリーは、非常に長いおよび完全長ｃＤＮＡの調製に非常に有用である。
従って、本発明は、少なくとも１つの興味ある核酸挿入体または少なくとも１つの興味あるバルク核酸ライブラリーをクローニングする方法であって、（ａ）構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、当該ＣＳがその左右アームに位置する２つのｌｏｘ組換えサイトまたはそれらの誘導体を含むバクテリオファージベクターである、少なくとも１つのクローニングベクターを調製する；（ｂ）少なくとも１つのクローニングベクター中のＲＳを興味ある核酸挿入体で置換する；（ｃ）パッケージングエキスの存在下で、工程ｂ）のバクテリオファージクローニングベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行う；（ｄ）キャプシドからバクテリオファージクローニングベクターを抽出する；（ｅ）Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で、当該ベクターから、興味ある核酸挿入体を含むプラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏで切出す；（ｆ）当該プラスミドまたはプラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法を提供する。
本方法は、（ｇ）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しない少なくとも１つの細胞を電気穿孔または形質転換して前記プラスミドを当該細胞へ導入する；（ｈ）工程ｇ）の細胞をプレーティングして、興味ある核酸挿入体をもつプラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する、工程をさらに含んでもよい。
所望により、工程ｃ）およびｄ）の間にプレート上でバクテリオファージの増幅工程を行ってもよい。
前記ｌｏｘ組換えサイトは、それらの変異、修飾、または誘導されたｌｏｘサイトでよく、好ましくはｌｏｘＰまたはその誘導体でもよい。
このｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｒｅ−ｌｏｘ法で使われるバクテリオファージは、好ましくはλバクテリオファージである。
さらに、本発明者らは、本発明のベクターからの興味ある核酸挿入体を、少なくとも１つのデスティネーション機能性ベクターヘ移すことによる、Ｇａｔｅｗａｙ機構に基づく方法を開発した。この機能性ベクターは、さまざまな用途、例えば、配列分析、細菌または真核生物細胞中でのタンパク質の発現、タンパク質融合産物の作出、その他に利用可能である。
既に述べたように、Ｇａｔｅｗａｙ法は、プラスミドにのみ関係し、短いｃＤＮＡに強いバイアスを示す。Ｇａｔｅｗａｙ法では、ｃＤＮＡがＰＣＲにより増幅され、プラスミドデスティネーションベクターへ挿入される。しかし、ｃＤＮＡのＰＣＲ反応時間は非常に長く、一般に反応は一晩行われるが、それは効率の低くさおよびサイズバイアスを意味している。短い挿入体をもつ断片は、長い挿入体をもつ断片より、速やかに組換えする。従って、混合した場合、常にサイズバイアスがあり、最も短いものがより長いものと競合し、短い方が効率よくクローニングされ、サイズバイアスを起こす。
本発明者らは、Ｇａｔｅｗａｙ法のこのバイアス問題を解決した。本発明の方法は、（異なるサイズの）興味ある核酸をバクテリオファージベクター中へ連結する工程を含む。
本発明のバクテリオファージベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ法の供与ベクターよりサイズが大きい（例えば、３７．５ｋｂプラス核酸挿入体）。本発明に従うＣＳサイズをもつベクターは、短および長挿入体を識別せず、長短両方の挿入体を含むベクター類は、同じような効率で、増幅および／または切出しされるので、短い核酸挿入体に対するバイアスはない。
従って、本発明は、少なくとも１つの興味ある核酸挿入体をクローニングする、または少なくとも１つの興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する、「Ｇａｔｅｗａｙ様」方法であって、（ａ）構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、当該ＣＳがバクテリオファージベクターセグメントであり、ＲＳは２つの組換えサイトにより隣接され、これらの組換え体サイトが相互に組み換えをしない、少なくとも１つのクローニングベクターを調製する；（ｂ）本発明に従い核酸挿入体で前記ＲＳを置換する；（ｃ）工程ｂ）の少なくとも１つのバクテリオファージクローニングベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングする；（ｄ）工程（ａ）のクローニングベクターの組換えサイトと組換え可能な２つの組換えサイトに隣接されるデスティネーション可換セグメント（ＲＳ）を含む少なくとも１つのデスティネーションベクターを工程ｃ）のクローニングベクターに提供することにより、興味ある核酸挿入体のｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しを行う；（ｅ）興味ある前記核酸挿入体をもつ組換えプラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法を提供する。
好ましくは、前記バクテリオファージはλバクテリオファージである。
前記バクテリオファージクローニングベクターまたはデスティネーションベクターのＲＳに隣接する、相互に組換えない２つの組換え部位は、ａ）ａｔｔＢ，ａｔｔＰ，ａｔｔＬ，およびａｔｔＲまたはそれらの誘導体より成る群から選択される組換え部位、またはｂ）ｌｏｘ組換え部位またはその誘導体、好ましくはｌｏｘＰまたはその誘導体（例えば、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ５１１）であってもよい。
興味ある核酸が、Ｇａｔｅｗａｙ技術を使って、デスティネーションベクターに移された後、興味ある当該核酸は、図３および実施例に示されている、ａ）ＧＷ直接；ｂ）ＧＷ間接；ｃ）ＧＷ増幅法という手続きに従って、さらなるデスティネーションまたは受入れベクターへ移してもよい。
本発明に従い興味ある核酸挿入体を運ぶ前記切出しプラスミドまたはデスティネーションプラスミドは、均等化および／または差引き化法でドライバーとして使用可能である。
ｃＤＮＡライブラリー、好ましくは完全長ｃＤＮＡライブラリーの均等化および／または差引き化の方法は、Ｃａｒｎｉｎｃｉら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：１６１７−１６３０によって開示されている。
従って、本発明は、少なくとも１つの均等化および／または差引き化ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）本発明の前記方法に従って、切出される少なくとも１つのプラスミドまたは調製されるデスティネーションプラスミドを、提供する；（ｂ）工程ｂ）のプラスミドを核酸標的のプールへ提供する；（ｃ）前記プラスミド／標的ハイブリッドを除去する；（ｄ）本発明の前記プラスミドにハイブリッド形成しなかった均等化および／または差引き化核酸標的を集める、工程を含む前記方法に関する。
一つの態様によれば、工程ａ）のプラスミドは１本鎖とされる。例えば、それは、２本鎖プラスミドの１本鎖に少なくとも１つのニックをつくることにより処理される。次いで、ニックされた鎖は除去され、最終的に工程（ｃ）から（ｄ）が適用される。
好ましくは、ニックは、タンパク質ＧｅｎｅII（Ｇｅｎｅ−ｔｒａｐｐｅｒ Ｋｉｔ，Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳ）を使って導入し、ニックされた鎖は、エクソヌクレアーゼにより除去される。そのエクソヌクレアーゼは好ましくはＥｘｏIIIである。
さらなる態様によれば、本発明は、少なくとも１つの均等化および／または差引き化ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、ＣＳがＦ１のｏｒｉを含む、本発明の少なくとも１つのベクターを提供する；（ｂ）本発明に従い興味ある核酸挿入体でＲＳを置換する；（ｃ）ヘルパーファージを添加し、細胞から分泌される多数の１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ベクターコピーをつくる；（ｄ）工程ｃ）からのコピーを核酸標的のプールへ提供する；（ｅ）当該プラスミド／標的ハイブリッドを除去する；（ｆ）当該標的とハイブリッド形成しなかった均等化および／または差引き化核酸標的を集める、工程を含む前記方法に関する。
ヘルパーファージは好ましくはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できる。ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ）で細菌細胞を感染し、当該細胞から分泌される１本鎖プラスミドを回収し、そのＤＮＡを抽出し、最後に１本鎖プラスミドから当該ＤＮＡを回収することから成る、ｓｓＤＮＡベクターを調製する方法のより詳細な記述は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｔｒａｔａｇｅｎｅユーザーマヌアルで見ることができる。ベクターを１本鎖にするためにヘルパーファージを使う方法も、（Ｂｏｎａｌｄｏら，１９９６．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６：７９１−８０６）に記載されている。
ｆ１（＋）複製起点を使う場合、Ｒ４０８のようなヘルパーファージを使ってもよい（Ｓｈｏｒｔら，１９８８，上記に同じ）。
本発明によるバクテリオファージベクターは、当該技術分野において知られているいずれかの種類のプラスミドまたはプラスミドフラグメント、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、細菌人工染色体プラスミド（ｐＢＡＣ）、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Kim et al., 1996, Genomics, 34:213-218）、ＵＳ５，８７４，２５９号（本明細書中に援用される）による修飾または誘導体ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、または公共デーベースに挙げられるようなまたは上に示される Company's Catalogues より入手可能ないずれか他のプラスミドを用いて製造することができる。
一つの態様によれば、本発明は、少なくとも複製起点（ｏｒｉ）を含む細菌人工染色体（ｐＢＡＣ）またはｐＢＡＣ誘導体またはそのセグメントを含むバクテリオファージベクターを提供する。このバクテリオファージは、好ましくは、λバクテリオファージである。このｏｒｉは、好ましくは、プラスミドを単コピーで維持することができるｏｒｉでありうる。
このバクテリオファージ中に含まれるｐＢＡＣまたはそのセグメントは、
−ＤＮＡフラグメントをクローン化することができる部位；
−ＤＮＡフラグメントをクローン化することができるこの部位に隣接した少なくとも１対の誘導性切除媒介部位であって、互いに相対して平行した配向で与えられていて且つＤＮＡフラグメントをクローン化することができる部位を含む切除可能フラグメントを規定する切除媒介部位を更に含んでいてよい。この誘導性切除媒介部位の対は、例えば、互いに相対して平行した配向で与えられる部位でありうる（ＵＳ５，８７４，２５９号を参照されたい）。切除媒介部位の対は、好ましくは、ＦＲＴ部位である。このバクテリオファージは、切除媒介部位の対中に、配列番号４５に示される配列を更に含んでいてよい（ＵＳ５，８７４，２５９号による）。
このバクテリオファージ中に含まれるｐＢＡＣまたはそのセグメントは、誘導性複製起点、好ましくは、ｏｒｉＶを更に含んでいてよい。したがって、ｏｒｉＶは、ＢＡＣプラスミドの多重コピーを生じるように誘導されてよい（ｐＢＡＣは、通常は、単コピーで存在する）。
このバクテリオファージは、本出願中に記載される１個またはそれを超える組換え部位を含むことができる。例えば、このバクテリオファージは、次の、（ａ）二つの組換え部位であって、どちらの部位も他方と組換えしない部位；（ｂ）二つのｌｏｘ組換え部位であって、どちらの部位も互いに組換えすることができる部位；（ｃ）二つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識部位配列；（ｄ）クラスIIＳ制限酵素によって認識可能な二つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断部位配列であって、どちらの部位配列も他方と連結する部位配列；より選択される少なくとも二つの組換え部位を含んでいてよい。
これら二つの組換え部位（ａ）は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲおよびそれらの誘導体からなる群より選択されてよい。
これら二つの組換え部位（ａ）は、互いに組換えしないｌｏｘ組換え部位誘導体であってもよい。
これら二つの組換え部位（ｂ）は、好ましくは、ｌｏｘＰ部位である。
二つのホーミングエンドヌクレアーゼ部位配列（ｃ）は、好ましくは、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＩ−ＳｃｅＩからなる群より選択される。
用いられる切除は、図３に記載のものが含まれる、いずれの切除システムでもありうる。
このバクテリオファージは、少なくとも一つのバックグラウンド減少性配列、例えば、（ａ）ｃｃｄＢ遺伝子；（ｂ）ｌａｃＺ遺伝子；（ｃ）ｌｏｘ配列を更に含んでいてよい。
興味ある核酸をクローニングするまたは興味ある大量核酸ライブラリーを製造する方法であって、
（ａ）ｐＢＡＣ（またはｐＢＡＣ誘導体）またはそのフラグメントを含むバクテリオファージクローニングベクターを製造し；
（ｂ）このバクテリオファージクローニングベクター中に興味ある核酸を挿入し；
（ｃ）興味ある核酸インサートを含むプラスミド（ｐＢＡＣまたはその誘導体）の in vivo または in vitro 切除を可能にし；そして
（ｄ）興味ある核酸インサートを有するＢＡＣプラスミドまたはこれらＢＡＣプラスミドのライブラリーを回収する；
工程を含む方法も提供する。
本発明は、本発明に従う少なくとも１つのクローニングベクターまたは少なくとも１つのベクター類のライブラリーを、含むキットにも関する。
本発明を、下記の実施例を参照して、さらに詳細に説明する。
細菌株
以下の実施例では以下の限定的でないリストの細菌株を使用した：Ｃ６００，Ｆ− ｔｈｉ−１ ｔｈｒ−１ ｌｅｕＢ６ ｌａｃＹ１ ｔｏｎＡ２１ ｓｕｐＥ４４−λ；ＸＬ１−Ｂｌｕｅ−ＭＲＡ（Ｐ２），△（ｍｃｒＡ）１８３ △（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３ ｅｎｄＡ１ ｓｕｐＥ４４ ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ（Ｐ２ｌｙｓｏｇｅｎ）； ＤＢ３．１， Ｆ−ｇｙｒＡ４６２ ｅｎｄＡ−△（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ） ｍｃｒＢ ｍｒｒ ｈｄｓＳ２０（ｒＢ −，ｍＢ −） ｓｕｐＥ４４ ａｒａ−１４ ｇａｌＫ２ ｌａｃＹ１ ｐｒｏＡ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５λ− ｌｅｕ ｍｔｌ１；ＢＮＮ１３２，ｅ１４− （ＭｃｒＡ−）△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ） ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７ ｒｅｌＡ１ ｓｕｐＥ４４ ［Ｆ，ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｃＺ△Ｍ１５］Ｃｒｅリコンビナーゼを構成的に発現（Ｅｌｌｅｄｇｅら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１７３１−１７３５）；およびＤＨ１０Ｂ，Ｆ− ｍｃｒＡ △（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｌａｃＺ△Ｍ１５ △ｌａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ− ｒｐｓＬ ｎｕｐＧ（これらの細菌株はすべて商業的に入手可能である）。
λ−ＦＬＣベクターの構造および命名法
本説明に使われる構築ベクターの基本的名称は完全長ｃＤＮＡ（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ）に由来する；ローマ数字は次のような表示である：Ｉ、一般用；II、Ｇａｔｅｗａｙ配列（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在；III、ホーミングエンドヌクレアーゼサイトの存在。ＬおよびＳは、当該ベクターのクローニング容量が長い（ｌｏｎｇ）（サイズ選択された）または短い（ｓｈｏｒｔ）ｃＤＮＡに、より適応するかどうかを示す。Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，およびＦは、図１ｂ−ｆに記載のように、スタッファーＩのタイプを示す。
λ−ＦＬＣベクターの基本成分
完全長ｃＤＮＡの広サイズ指向的クローニング用の一連のλ基盤のクローニングベクターを構築した。これらのλ−ＦＬＣベクターは、約０．２から１５．４ｋｂの挿入体を名目上パッケージ可能である。
このλ−ＦＬＣベクターのもう１つの利点は、同一ライブラリー内の短かいおよび長いｃＤＮＡのクローニングおよびバルク切出しを、同じような効率で可能にすることである。次いでこれらのベクターを、５．５ｋｂ（３７．５ｋｂの構築セグメントＣＳの完全サイズである）のスタッファーIIを使うことによって、別の目的、例えば、非常に長いまたは完全長のｃＤＮＡを選択するように適合させた。
前記ベクター類を構築するために用いた成分は、図１および２に示したいくつかの構築物を産生するためにアセンブリーさせた。
図１ａは、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＧａｔｅｗａｙ組換えシステムを用いることによる、λ−ＦＬＣベクターのアセンブリーおよびプラスミドライブラリー中への切出しの全体スキームを示したものである。
本発明のλ基盤ベクターの基本構造は、機能的にはλ−２００１（Ｋａｒｎら，１９８４，Ｇｅｎｅ，３２：２１７−２２４）のものと同じ、左および右λアームより成る。上記左右アームの間に、スタッファー（スタッファーＩ）および修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔまたはｐＢＡＣを挿入し、その両側は、λ−ＰＳ（Ｎｅｈｌｓら，１９９４ａ，上記に同じ）の構造に似せて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーのバルク切出し用の２つのｌｏｘＰサイトにより隣接させた。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物の例は、図１３および配列番号５１に示した。
上記λアームとプラスミドの合計算定サイズは、スタッファーＩ（ライブラリー中のｃＤＮＡで置換される）およびスタッファーIIを除いて、約３２ｋｂである。スタッファーIIは、「クローニングサイズレギュレーター」であり、名目上のラムダパッケージング容量に応じて挿入体のサイズを決定する（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙら，１９９３，Ｇｅｎｅ，１２７：１−１４）。ここで提示したいくつかの構築物のように、スタッファーIIが５．５ｋｂの長さの場合、スタッファーＩを除いた当該ベクターのサイズ（つまり構築セグメントＣＳのサイズ）は３７．５ｋｂと計算される。表１に報告されているように、５．５ｋｂのスタッファーIIをもつベクター（３７．５ｋｂのＣＳサイズ）は、６ｋｂのスタッファーIIをもつ同じベクター（３８ｋｂのＣＳサイズ）の使用に比べて、長いおよび完全長ｃＤＮＡを選択するのに特に有用である。
０および６．３ｋｂまたはより大きい別のスタッファーIIも、クローニングサイズを変動させ、広範囲のサイズのｃＤＮＡを集めるために用いた。
Ｉ型スタッファー（図１ｄ−ｆ）は、バックグラウンドインディケーターＬａｃＺ、および、切出しの際抗生物質耐性遺伝子と複製起点とを分離する（図１ｉ）、ｃｃｄＢ毒性エレメントまたは追加のｌｏｘＰサイトのような、バックグラウンド低減エレメントを含むことが可能である。
切出されたプラスミドはすべて、通常の前進（Ｆｗｄ）および逆（Ｒｅｖ）プライマー配列およびＴ７／Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、転写シークエンシング（Ｓａｓａｋｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：３４５５−３４６０）および転写（図２ｇ−ｊ、下線を付した配列）が可能である。
加えて、すべてのプラスミドは１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の産生に使うことが可能で、それらはすべてｆ１（＋）起点をもつ（Ｓｈｏｒｔら，１９８８，上記に同じ）。ｓｓＤＮＡをレスキューするためにＲ４０８（Ｓｈｏｒｔら，１９８８，上記に同じ）のようなヘルパーファージとともにｆ１（＋）複製起点を用いる場合、レスキューされる鎖は、図２ｇ−ｊに示された鎖の反対鎖である。
構築体によっては、クローン化挿入体のバルクまたは個別の切出しのために、ＲＳまたは興味あるｃＤＮＡに隣接するＧａｔｅｗａｙ配列のようなクローニングまたは組換えサイト、またはホーミングエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、ＮＥＢとしても表される）用の配置サイト配列も導入した。
実施例１：ベクター構築
本発明のベクターはいずれも、標準的な分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従い、および図に示す成分を用いて作出した。本発明のベクター中のλアーム（スタッファーＩの左および右側の部分）は、λ−ＰＳ（Ｎｅｈｌｓら，１９９４ａ，上記に同じ）に由来し、原報はλ−２００１（Ｋａｒｎら，１９８４，Ｇｅｎｅ，３２：２１７−２２４）についての記載に見られる。λ−ＰＳの左アームのＸｂａＩ部位中へ、マウスゲノムＤＮＡをＸｂａＩで切断してからＡｓｃＩ制限サイトを含むリンカー／プライマー アダプター（挿入体を後で除去または修飾するためのもの）を連結したＤＮＡをＰＣＲ増幅して得られた５．５ｋｂゲノム断片を挿入した：リンカー／プライマー上方オリゴヌクレオチドは、５“−ＣＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧ（配列番号９）であり；下方オリゴヌクレオチドは：５’−ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＧＧＣＧＣ−３'（配列番号１０）である。この上方ヌクレオチドはＰＣＲ増幅にも使われる。
ＰＣＲ増幅の前に、当該ゲノムＤＮＡはＸｈｏＩ，ＳａｌＩ，およびＳｆｉＩでも切断し、増幅断片からこれらのサイトを除去した。増幅およびアガロースゲル精製工程（Ｂｏｏｍら，１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：４９５−５０３）は、３回繰返した。λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂベクターのためのサイズレギュレーター（スタッファーII）として５．５ｋｂ断片サイズを選び、さらに、同様に得られた約４．５から５．５ｋｂの断片をクローニングすることによりλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂベクターの誘導体を作り、０．５ｋｂ程度に短い挿入体がクローニングできることを証明した。加えて、ポリリンカーの配列（図２の切出しプラスミド中に現れるような配列）およびスタッファーＩの配列（図１）を指向クローニングに適するように変更し（例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの標準的な分子生物学技術により）、基本的には、制限消化に続いて所望の配列をもつリンカーを再連結し（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）、それを当該ファージの元の断片の間に挿入する方法を用いた）。１０ｋｂスタッファー（図１ｂ）はλ−ＰＳ（Ｎｅｈｌｓら，１９９４ａ，上記に同じ）から得た。３ｋｂの短いスタッファー断片（図１ｃ）は、前記１０ｋｂスタッファーＩをＸｈｏＩおよびＳａｌＩで消化して得た。引き続き、この３ｋｂをプライマー５’−ＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴ−３'（配列番号１１）および５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴ−３'（配列番号１２）で増幅し、当該３ｋｂスタッファー（図１ｃ）に複数の制限サイトを加えた。この修飾スタッファー（図１ｃ）に、平滑末端ＬａｃＺカセットをＳｗａＩサイトへ挿入した。次いで、当該修飾スタッファーをＳｆｉＩで制限消化し、図１ｅのスタッファーＩを得るために、三重連結してｃｃｄＢ遺伝子を挿入した。ｃｃｄＢ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＢ３．１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖可能な鋳型ｐＤＥＳＴ−ＣのＰＣＲ増幅により得た；プライマーペアは、５’−ＧＡＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＧＧＣＴＴＡＣＴＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡ−３'（配列番号１３）および逆プライマー５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３'（配列番号１４）（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ中のものと同様）および５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＡ−３'（配列番号１５）および前進プライマー５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３'（配列番号１６）であった。ＬａｃＺカセットは、ＮａｅＩおよびＡｆｌIIでｐＵＣ１８を消化し、適当な断片を、クローニング前にＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて、ブランティング（平滑化）して得た。
ＬｏｘＰ，ａｔｔＢ，および修飾ポリリンカー配列は、相補的オリゴヌクレオチド類をアニーリングすることにより調製した。
図１ｅのスタッファーＩは、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限サイトをブランティング後、ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で連結して二量体化し、図１ｄのスタッファーを得た。図１ｆのスタッファーは、ＬｏｘＰサイトを含むプライマー、５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＴＴＡＡ−３'（配列番号１７）（ＢａｍＨＩ側）およびプライマー５’−ＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴ−３'（配列番号１８）（ＳａｌＩ側）で、図１ｃのスタッファーをＰＣＲ増幅することにより得た。精製（Ｂｏｏｍら，１９９０，上記に同じに従い）および制限消化後、この断片を、ＤＮＡリガーゼ（Ｓａｍｂｒｏｏｋらに従う）で前記ｃｃｄＢ断片へ連結し、図１ｆのスタッファーを産生した。
切出し後に得られるプラスミド（後記）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＢＡＣの誘導体である。ｐＤＥＳＴ−Ｃベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＬｘＲ反応（Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の受容プラスミドであり、切出し後、ｐＦＬＣ−ＤＥＳＴを産生する（図２．ｊ）。ｐＤＥＳＴは、制限酵素ＳｏｃＩおよびＫｐｎＩでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋を消化し、当該ポリリンカーを除去することにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から調製した。次いでその切断末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｍｂｒｏｏｋらに従う）でブランティングした。当該切断プラスミド中へ、Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ，１８．４版，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの指示に従って、前記ｃｃｄＢ遺伝子を含むｒｆＢ IIカセット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した）を挿入し、連結した。次にその連結プラスミドベクターをＢｓｓＨＩ制限酵素で切断し、当該切断断片を逆転させ（すなわち、１８０度回転）、再度当該ベクターヘ入れた（既知の方法に従う、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。
ｐＤＥＳＴ−Ｃベクターは、ｐＤＥＳＴ１２．２（Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ， ＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧＩＢＣＯＢＲＬＲ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と同じように使用した。
λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂベクターは、一般に本発明の他のベクターの構築の出発点として用いた。
λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅは、図１ｅのスタッファーをλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂのものと置換することにより得た。λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｂは、λ−ＦＬＣ−Ｉ−ＢからスタッファーIIを除去することにより得、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｄは、図１ｅに示すスタッファーをλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂのものと置換することにより作出した。λ−ＦＬＣ−II−Ｃは、修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入）を図１ｃのようなスタッファーとつなげて得た；そのベクターの他の部分はλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ中のものと同じである。λ−ＦＬＣ−III−Ｆは、プラスミド配列および図１ｆのスタッファーＩを含む構築体（構築体は図２ｄに示した）を、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ由来ファージアーム（５．５−ｋｂスタッファーＩＩを含む）へ、“λ−ＦＬＣ−ＩＩＩ−Ｃの調製”の例に記載したのと同じように（しかし、スタッファー１ｃの代わりにスタッファー１ｆを導入する）挿入して作出した。λ−ＦＬＣ−ＩＩＩ−Ｆもまた図７に示したように調製した。λ−ＦＬＣ−III−Ｌ−Ｄは、λ−ＦＬＣ−III−Ｆから、まず図１ｆのスタッファーＩを図１ｄのものと置換し、次いでスタッファーIIを削除して得た。λ−ＦＬＣ−III−Ｓ−Ｆは、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ（スタッファーIIを含まない）からのコンカテネートされたアームを、６．３Ｋｂの長いスタッファーIIおよびλ−ＦＬＣ−III−Ｆ由来の「プラスミド＋スタッファーＩ」と、（Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されているようにＤＮＡリガーゼを用いて）連結することにより得た。ベクターλ−ＦＬＣ−III−Ｅを、λ−ＦＬＣ−III−Ｆ（およびλ−ＦＬＣ−III−Ｃ）について記載されたのと同様の方法で、スタッファー１ｃまたは１ｆの代わりにスタッファー１ｅを導入して製造した（「スタッファー１ｅ」は、図１ｅのスタッファーＩを意味し、他のスタッファーについても同様である）。ｐＢＡＣまたはｐＢＡＣ誘導体を含むベクターは、実施例２０に示されるようにおよび図９〜１２にしたがって製造することができる。
実施例２：クローニング用λアームの調製
最終λＤＮＡ構築体は、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）またはＬａｍｂｄａ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（＃１２５６２，Ｑｉａｇｅｎ）を用いることにより調製した。１０μｇのλ−ＤＮＡの付着末端（ｃｏｓ末端）は、１８０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５）／１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中 ４２℃で２時間インキュベートすることによりアニールした。次に、２０μＬの１０ｘライゲーションバッファーおよび４００ＵのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、その混合液を室温で５時間インキュベートした。リガーゼは、６５℃で１５分間インキュベートすることにより失活させた。
この時点で、当該λ−ＤＮＡは、必要な制限酵素（下記のもの；いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入）により、必要なＮａＣｌ濃度が異なるため３段階で消化した。第１段階では、５０ｍＭ ＮａＣｌ中、各ベクターにつき２μＬの５Ｍ ＮａＣｌ，６Ｕ ＦｓｅＩ、および８Ｕ ＰａｃＩの添加により制限処理を行った。試料（ベクター）は、３７℃で４時間または１晩インキュベートした。第２段階は、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、２μＬの５Ｍ ＮａＣｌ，３０μＬの１０ｘＮＥＢ３バッファー，２７０μＬのＨ２Ｏ、および２０ＵのＳｗａＩを前段階からの反応物に添加し、室温で２時間インキュベートすることにより行った。この段階の後、反応チューブを６５℃で１５分間加熱した。最後に第３段階は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、５μＬの５Ｍ ＮａＣｌ，４０ＵＸｈｏＩ（λ−ＦＬＣ−Ｉおよび−IIIベクターの場合には、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ断片のサイズを縮めることによりバックグラウンドを低減するため；また、λ−ＦＬＣ−IIベクターの場合には、クローニングサイトをつくるため）、４０Ｕ ＳａｌＩ、および４０Ｕ ＢａｍＨＩを前記加熱不活性化反応物に添加し、３７℃で４時間インキュベートすることにより、行った。λ−ＦＬＣ−IIベクターについては、ＳａｌＩを省略してもよいし、あるいはＸｈｏＩクローニング部位の代替物をつくるのに使うことも可能である。ＦｓｅＩ，ＰａｃＩおよびＳｗａＩ段階は、これらの配列をもっていないλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂについては省略した。
制限処理後、ＤＮＡは、０．１％ＳＤＳおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下でプロテイナーゼＫ処理により精製し、１：１フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。再懸濁中の問題を避けるため、ＤＮＡ濃度は２０μｇ／ｍＬを超えないようにした。
少なくとも３０分間かけて注意深く再懸濁した後、消化したＤＮＡを、下記の段階に従って、０．６％低融点アガロースゲル（ＳｅａｐｌａｑｕｅＲ，ＦＭＣ）中で分離した。ウェルはゲルの中央に置いた。８Ｖ／ｃｍで１．５時間電気泳動後、１９ｋｂより短いＳｔｙＩ消化λ−ＤＮＡをゲルから切り取り、廃棄した（段階１）。次いで、電気泳動バッファー１ｘＴＢＥ（電気泳動バッファーＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、を参照）を新しいバッファーと交換し、ゲル中に残っているＤＮＡを、８Ｖ／ｃｍで２．５時間、反対方向に電気泳動した。次いで、１９ｋｂより短いＤＮＡを、再び廃棄した（段階２）。バッファーを再度取替えた。λアームＤＮＡを含む領域を濃縮して反応容量を減らすため、ゲル中に残っているＤＮＡを、段階１と同じ方向に８Ｖ／ｃｍで３０分間電気泳動した。最後に、λアームＤＮＡを含むゲル部分を取り出し（段階３）、ゲルをＴＥバッファー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）で平衡化し、λアームを、βアガラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、文献記載（ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，１９９９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３０３：１９−４４）の方法で精製およびチェックした。典型的回収率は、出発λ−ＤＮＡの３０％から５０％であった。精製λアームは、１回宛の使用量に分けて、−８０℃では無期限に、＋４℃では１週間まで貯蔵した。典型的なクローニング効率は、６ｋｂのテスト挿入体の場合、１〜２ｘ１０７ｐｆｕ／μｇλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂベクターで、１％以下の非組換え体クローンのバックグラウンドを含んでいた。
実施例３：λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂの調製
λ−ＰＳベクターをＢａｍＨＩ制限酵素を用いて切断し、２つの相補的オリゴヌクレオチド：上方オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧ−３'（配列番号１９）および下方オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＡＴＴＴＧＧＣＣＴ−３'（配列番号２０）を含む左リンカーアダプター、および２つの相補的オリゴヌクレオチド：上方オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡ−３'（配列番号２１）および下方オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＡＴＡＡＧＧＧＣＣＴ−３'（配列番号２２）を含む右リンカーアダプターを使って、スタッファーＩを挿入した。
前記左アダプターの２つのオリゴヌクレオチドの各１つ、すなわち、配列番号１９および配列番号２０は、下記のように、ＫｉｎａｓｅによりコールドのＡＴＰで３７℃，２０分間処理した：１μｇの各オリゴヌクレオチド，１μｌのＡＴＰ ５ｍＭ，２μｌのＰＮＫバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），０．５μｌのＰＮＫ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），および水で２０μｌとした。得られた産物は、５’リン酸化された２つの相補的オリゴヌクレオチドである。それら２つのオリゴ（配列番号１９および２０）溶液は一緒に混合し、終濃度１００ｍＭになるまでＮａＣｌを添加した。その混合物を６５℃で１５分間、次いで４５℃で１０分間インキュベートし、アニーリングを行った。アニールされた当該オリゴはクローニングに適する０．５ｎｇ／μｌの濃度に希釈した。同じ処法をオリゴペア（配列番号２１および２２）についても行い、同様にアニーリングして右アダプターを形成した。
上記ＢａｍＨＩで切断したλ−ＰＳベクター２００ｎｇ（すなわち、左および右アーム）を０．４ｎｇの左アダプターおよび０．４ｎｇの右アダプター、および６０ｎｇのスタッファーＩと混合し、終容量５μｌとした。ライゲーションは一晩行った（またはライゲーションは１６℃で２時間行ってもよい）。連結されたベクター／アダプター／スタッファーＩは、当該技術分野で知られる方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従ってパッケージした。
ＸｂａＩで切断したマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得た５．５ｋｂゲノム断片のスタッファーIIは、挿入体を後で除去または修飾するためのＡｓｃＩ制限部位を含むリンカー／プライマー アダプターで両端を連結した。当該リンカー／プライマーの上方オリゴヌクレオチドは：５’−ＣＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧ（配列番号９）；下方オリゴヌクレオチドは：５’−ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＧＧＣＧＣ−３'（配列番号１０）である。
前記アダプターをもつスタッファーIIを、上で調製したλベクターの左アームのＸｂａＩ部位に導入し、ベクターλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂを得た。
このベクターからインビトロＣｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼで切出し後（後述のように）、プラスミドｐＦＬＣ−Ｉ−ｂ（図１ｂのスタッファーＩを含む図２ｇのプラスミド）を得た。
実施例４：λＦＬＣ−III−Ｃの調製
上記のようにλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂの切出しから得たプラスミドｐＦＬＣ−Ｉ−ｂを鋳型として用い、ＰＣＲにより増幅した。使用したプライマーは：Ｔ７ Ｒｅｖ（５６ｍｅｒ） ５’−ＧＴＧＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧ−３'（配列番号２３）およびＴ３ Ｆｗｄ（７０ｍｅｒ） ５’−ＧＡＧＡＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣ−３'（配列番号２４）であり、直線状の“産物１”を得た。
プラスミドｐＦＬＣ−IIｃを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅して得た。使用したプライマーは：ＦＬＣIIＸ２（６８ｍｅｒ） ５’−ＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴ−３'（配列番号２５）およびプライマーＦＬＣIIＢ２（６３ｍｅｒ） ５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴ−３'（配列番号２６）である。このＰＣＲの産物をＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、直線状の３ｋｂの断片を得た。この断片を鋳型として用い、プライマー：５’Ｉ−ＣｅｕＩ−ＳａｌＩ（５９ｍｅｒ） ５'−ＧＴＧＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴ−３’（配列番号２７）および３'ＰＩ−ＳｅｃＩ−ＢａｍＨＩ（６７ｍｅｒ） ５’−ＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡ−３'（配列番号２８）により、ＰＣＲ増幅を行い、直線状の“産物２”を得た。
次に“産物２”をＰＮＫ−ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−ＡＴＰを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９の方法に従ってリン酸化した。
次に、“産物１”をＥｃｏＲＶ制限酵素で切断し、得られた断片を（標準法に従い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）上記のように調製した“産物２”と連結した。“産物３”と呼称する（環状の）プラスミドを得た。
プラスミド“産物３”を鋳型として用い、プライマー：ＸｂａＩ−ＬｏｘＰ Ｔａｇプライマー３Ｆ（６９ｍｅｒ） ５’−ＧＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴ−３'（配列番号２９）およびＸｂａＩ−ＬｏｘＰ Ｔａｇプライマー３Ｒ（６９ｍｅｒ） ５’−ＧＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧ−３'（配列番号３０）で、ＰＣＲにより増幅して直線状の産物を得て、次にこれをＸｂａＩ制限酵素で切断して、直線状の“産物４”を得た。 λ−ＦＬＣ−Ｉ−ＢをＸｂａＩ制限酵素で切断し、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従って電気泳動で精製し、得られたλ左アーム、λ右アーム、およびスタッファーIIを、電気泳動による精製から回収した。２００ｎｇのλ左アーム、９０ｎｇのλ右アーム、５５nｇのスタッファーII、および６０ｎｇの“産物４”を、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従い一晩連結した。得られたベクターλ−ＦＬＣ−III−Ｃは、当該技術分野で知られる方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従ってパッケージした。
Ｃｒｅリコンビナーゼでの処理により、in vitro ｃｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼ切除を行い、プラスミドｐＦＬＣ−III−ｃ（図１ｃのスタッファーＩを含む図２ｉのプラスミド）を得た。
他のλ−ＦＬＣベクターは、λ−ＦＬＣ−III−Ｃベクターから出発して製造することができる。例えば、ベクターλ−ＦＬＣ−III−Ｆまたはλ−ＦＬＣ−III−Ｅは、λ−ＦＬＣ−III−ＣのスタッファーＩｃをスタッファーＩｆまたはＩｅでそれぞれ置き換えることによって製造することができる。
実施例５：λ−ＦＬＣ−II−Ｃの調製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより購入）をＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化した。当該大断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、精製した。
λ−ＦＬＣ−Ｉ−ＢをＸｈｏＩおよびＳａｌＩで消化し、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従い、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。３ｋｂ断片をアガロースゲルにより分離し、精製した。
次に、３つの2 本鎖リンカー（ＡｔｔＢ１，ＡｔｔＢ２およびＬｏｘＰ）を下記のように合成した。
ＡｔｔＢ１リンカー：上方オリゴヌクレオチドは ５’−ＣＧＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡ−３'（配列番号３１）、下方オリゴヌクレオチドは ５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣ−３'（配列番号３２）。
ＡｔｔＢ２リンカー：上方オリゴヌクレオチドは ５’−ＧＧＣＣＡＴＧＡＣＧＧＣＣＧＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧ−３'（配列番号３３）、下方オリゴヌクレオチドは ５’−ＧＡＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＣＴＣＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＣＣ−３'（配列番号３４）。
ＬｏｘＰリンカー：上方オリゴヌクレオチドは ５’−ＣＣＧＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣ−３'（配列番号３５）、下方オリゴヌクレオチドは ５’−ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡ−３'（配列番号３６）。
ａｔｔＢ２リンカーの下方鎖およびＬｏｘＰリンカーの上方鎖を、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂの調製で上述した方法に従って、ポリヌクレオチドキナーゼＰＮＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてリン酸化した。
上記２つのオリゴ（配列番号３１および３２）溶液を一緒に混合し、ＮａＣｌを１００ｍＭの終濃度まで添加した。混合液を６５℃で１５分間、次いで４５℃で１０分間インキュベートし、アニーリングを行った。アニールされたオリゴは、クローニングに適する０．５ｎｇ／μｌに希釈した。同じ処法を上記オリゴペア（配列番号３３および３４；並びに配列番号３５および３６）について行い、それぞれアニーリングした。ＡｔｔＢ２リンカー（０．５ｎｇ）およびＬｏｘＰリンカー（０．５ｎｇ）を容量５μｌ中で混合し、連結した。反応チューブを１６℃でインキュベートした。２０分後、ａｔｔＢ１リンカー（０．５ｎｇ），ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ（２５ｎｇ）で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂからの３ｋｂ断片（２５ｎｇ）を反応チューブに添加して、１０μ容量にした。これを次に１６℃で一晩インキュベートし、連結断片を含むプラスミドを含むライゲーション溶液を得た。プラスミドを含むライゲーション溶液は、電気泳動によりＤＨ１０Ｂ細胞中へ導入し、培地上へプレートした。当該組換え体細胞からプラスミドを調製した。細胞を溶解し、プラスミドをＸｂａＩで切断し、プラスミド断片（“断片１”）を得た。
上方オリゴヌクレオチド：５’−ＧＧＣＣＡＴＧＡＧＡＴ−３'（配列番号３７）をもち、下方オリゴヌクレオチドは、５’−ＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＴ−３'（配列番号３８）である結合リンカーを調製した。これら２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、“断片２”を得た。
λ−ＦＬＣ−Ｉ−ＢをＮｏｔＩで切断し、２６ｋｂ断片をアガロースゲルで分離し、精製した（“断片３”）。
９ｋｂ断片もλ−ＦＬＣ−Ｉ−ＢをＸｂａＩで切断して調製した（“断片４”）。
これらの断片１から４（２６ｋｂ左アーム、結合リンカー、スタッファー・プラスミド、９ｋｂ右アーム）は、５μｌの容量中で連結した。連結溶液をパッケージおよび増幅し、ベクターλ−ＦＬＣ−II−Ｃを得た。これらの工程は、標準処法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従って、実施した。
上記ベクターλ−ＦＬＣ−II−Ｃから、Ｃｒｅリコンビナーゼ（下記参照）でインビトロ切除した後、プラスミドｐＦＬＣ−II−ｃ（図１ｃのスタッファーＩを含む図２ｊのプラスミド）を得た。
実施例６：λ−ＦＬＣ−III−Ｆの製造
λ−ＦＬＣ−III−Ｆベクターは、実施例４の最後に記載のように製造することができるが、しかしながら、他の製造方法も可能である。λ−ＦＬＣ−III−Ｆ製造の一つの代替法は、本実施例に記載されるが、図７に示されている。
λアームおよびスタッファーII（５．５ｋｂ）を得るために、１０μｇのλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂの付着末端を、１８０μｌの１０ｍＭトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）／１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中において４２℃で２時間インキュベートすることによってアニーリングした。次に、２０μＬの１０ｘ連結反応緩衝液および４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を加え、その混合物を室温で５時間インキュベートした。このリガーゼを、６５℃で１５分間インキュベートすることによって失活させた。鎖状体形成したλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂを、３０単位のＸｂａＩ（ＮＥＢ）で、１ｘ製造者推奨緩衝液中において消化した。この試験管を３７℃で２時間インキュベートした。
制限後、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ／ＸｂａＩ ＤＮＡを、０．１％ＳＤＳおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下におけるプロテイナーゼＫ（Qiagen）処理によって精製し、１：１のフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた（Sambrook et al., 1989）。再懸濁の際の問題を免れるために、ＤＮＡ濃度は２０μｇ／ｍＬを超えなかった。
少なくとも３０分間注意深く再懸濁後、消化したＤＮＡを、０．６％低融点アガロースゲル（Seaplaque（登録商標），ＦＭＣ）中において８Ｖ／ｃｍで１．５時間分離した。２９ｋｂのλＤＮＡ（ＬアームとＲアームとの間の連結反応生成物）を含有するゲル部分および５．５ｋｂのスタッファーIIを切り取り、ＴＥ緩衝液（Sambrook et al., 1989）で平衡させた。これらＤＮＡを、記載されたように（Carninci and Hayashizaki, 1999, Methods Enzymology, 303:19-44）、β−アガラーゼ（New England Biolabs）を用いることによって精製し且つ調べた。
３μｇのｐＢＳIIＳＫ＋（Stratagene）を、９単位のＢｓｓＨII（ＮＥＢ）で３７℃において２時間消化し、ＣＩＰ（Takara, Japan）によって脱リン酸化した（Sambrook et al., 1989, 標準的な技法）。
ホーミングヌクレアーゼ部位（Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ）をｐＢＳIIＳＫ＋中に導入するために、オリゴヌクレオチドアップアダプター鎖：
５’−ｐＣＧＣＧＣＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号３９）
およびオリゴヌクレオチドダウンアダプター鎖：
５’−ｐＣＧＣＧＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＧ−３’）（配列番号４０）
を含む二本鎖のＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩアダプターオリゴヌクレオチドを（標準的な技法にしたがって）製造し、ｐＢＳIIＳＫ＋／ＢｓｓＨII（ＮＥＢ）／ＣＩＰ（Takara, Japan）と連結させた。
ｐＢＳIIＳＫ＋／ＢｓｓＨII／ＣＩＰおよびＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩアダプターは、１００ｎｇのｐＢＳIIＳＫ＋／ＢｓｓＨII／ＣＩＰ、２ｎｇのＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩアダプター、４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１ｘ連結反応緩衝液を、５μｌの全容量で混合することによって連結した。この試験管を１６℃で一晩インキュベートした。
これら連結反応生成物を、ＤＨ１０Ｂ中に導入し、培養した。適当なプラスミドを含有するクローンは、プラスミドを製造することおよびＩ−ＣｅｕＩを用いた制限によって選択した（Sambrook et al., 1989, 標準的な技法）。次に、Ｉ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩアダプターを、記載されるスタッファーＩｆ（図１ｆのスタッファーＩ）と次のように置き換えた。
Ｉ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩアダプターを含む３μｇのプラスミドを、９ユニットのＳａｌＩおよび９ユニットのＢａｍＨＩで３０μｌ中において消化した。ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩの短いフラグメントを取り出すために、プラスミド／ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩを、０．６％低融点アガロースゲル（Seaplaque（登録商標），ＦＭＣ）中において８Ｖ／ｃｍで１．５時間分離した。３ｋｂのＤＮＡを切り取り、ＴＥ緩衝液（Sambrook et al., 1989）で平衡させた。この３ｋｂ ＤＮＡを、記載されたように（Carninci and Hayashizaki, 1999, Methods Enzymology, 303:19-44）、β−アガラーゼ（New England Biolabs）を用いることによって精製し且つ調べた。典型的には、３０％〜５０％の出発ＤＮＡを回収した。
１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１４０ｎｇのスタッファーＩｆを、５μｌの全容量中において４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、０．５μｌの１０ｘ連結反応緩衝液で連結した。この試験管を１６℃で一晩インキュベートした。
これら連結反応生成物を、ＤＨ１０Ｂ中に導入し、培養した。適当なプラスミドを含有するクローンは、プラスミドを製造することおよびＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いた制限によって選択した（Sambrook et al., 1989, 標準的な技法）。
次の工程において、ｌｏｘＰ部位を、ベクター中のａｍｐｒ遺伝子とｏｒｉとの間に導入した。ｌｏｘＰは、配列：
５’−ＧＡＧ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＧＡＴ−ＡＡＣ−ＴＴＣ−ＧＴＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＴＴＡ−ＴＡＣ−ＧＡＡ−ＧＴＴ−ＡＴＡ−ＡＡＴ−ＣＡＡ−ＴＣＴ−ＡＡＡ−ＧＴＡ−ＴＡＴ−ＡＴＧ−ＡＧＴ−３’（配列番号４１）
を有するＸｂａＩ−ＬｏｘＰ Ｔａｇプライマー３Ｆ（６９ｍｅｒ）および配列：
５’−ＧＡＧ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＧＡＴ−ＡＡＣ−ＴＴＣ−ＧＴＡ−ＴＡＡ−ＴＧＴ−ＡＴＧ−ＣＴＡ−ＴＡＣ−ＧＡＡ−ＧＴＴ−ＡＴＡ−ＡＡＡ−ＣＴＴ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−ＴＡＡ−ＴＴＴ−ＡＡＡ−ＡＧＧ−３’（配列番号４２）
を有するＸｂａＩ−ＬｏｘＰ Ｔａｇプライマー３Ｒ（６９ｍｅｒ）を用いたＰＣＲによって（標準的な技法にしたがって）導入した。
得られたＰＣＲ産物（７．２ｋｂ）３μｇを用いて、このＰＣＲ産物を、９ユニットのＸｂａＩで３７℃において１時間消化した（Sambrook et al.,）。ＰＣＲ産物／ＸｂａＩから得られた短いＤＮＡフラグメントを取り出すために、この消化産物を、０．６％低融点アガロースゲル（Seaplaque（登録商標），ＦＭＣ）中において８Ｖ／ｃｍで１．５時間分離した。７．２ｋｂのＤＮＡを切り取り、ＴＥ緩衝液（Sambrook et al., 1989）で平衡させた。この７．２ｋｂ ＤＮＡを、記載されたように（Carninci and Hayashizaki, 1999, Methods Enzymology, 303:19-44）、β−アガラーゼ（New England Biolabs）を用いることによって精製し且つ調べた。
この７．２ｋｂ ＰＣＲ産物、精製されたアームおよびスタッファーII（５．５ｋ）を、２５ｎｇ：１００ｎｇ：１９ｎｇの比率で、４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結した（Sambrook et al., 1989）。
この連結反応溶液をパッケージングし且つ増幅させて、ベクターλ−ＦＬＣ−III−Ｆを得た。これら工程は、標準法（Sambrook et al., 1989）にしたがって行った。
実施例７：λ−ＦＬＣ−III−Ｅの製造
λ−ＦＬＣ−III−Ｅベクターは、他のＦＬＣ−IIIベクターのスタッファーＩをスタッファーＩｅで置き換えることによって製造することができる。
本実施例において、λ−ＦＬＣ−III−Ｅは、次の工程にしたがって、実施例６で製造されたλ−ＦＬＣ−III−ＦベクターのスタッファーＩｆをスタッファーＩｅ（すなわち、図１ｅのスタッファーＩ）で置き換えることによって得た。
１０μｇのλ−ＦＬＣ−III−Ｆの付着末端を、１８０μｌの１０ｍＭトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）／１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中において４２℃で２時間インキュベートすることによってアニーリングした。次に、２０μＬの１０ｘ連結反応緩衝液および４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を加え、その混合物を室温で５時間インキュベートした。このリガーゼを、６５℃で１５分間インキュベートすることによって失活させた。
この時点で、鎖状体形成したλ−ＦＬＣ−III−Ｆを、必要な制限酵素で、３０ユニットのＢａｍＨＩ、３０ユニットのＳａｌＩおよび４０μｌの１０ｘＢａｍＨＩ緩衝液（全て、New England Biolabs より購入される）を４００μｌの全容量で加えることにより消化した。この試験管を３７℃で２時間インキュベートした。
制限後、ＤＮＡを、０．１％ＳＤＳおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下におけるプロテイナーゼＫ（Qiagen）処理によって精製し、１：１のフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた（Sambrook et al., 1989）。再懸濁の際の問題を免れるために、このＤＮＡ濃度は２０μｇ／ｍＬを超えなかった。
少なくとも３０分間注意深く再懸濁した後、消化したＤＮＡを、０．６％低融点アガロースゲル（Seaplaque（登録商標），ＦＭＣ）中において８Ｖ／ｃｍで１．５時間分離した。λＤＮＡを含有するゲル部分を切り取り、ＴＥ緩衝液（Sambrook et al., 1989）で平衡させた。このλＤＮＡを、記載されたように（Carninci and Hayashizaki, 1999, Methods Enzymology, 303:19-44）、β−アガラーゼ（New England Biolabs）を用いることによって精製し且つ調べた。典型的には、３０％〜５０％の出発λ−ＤＮＡを回収した。
スタッファーＩｅ（図１ｅ）を得るために、１０ｎｇのλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅを、３０ユニットのＢａｍＨＩ、３０ユニットのＳａｌＩで、２００μｌの１ｘＢａｍＨＩ緩衝液中において消化した。この試験管を３７℃で２時間インキュベートした。
制限後、５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、０．６％低融点アガロースゲル（Seaplaque（登録商標），ＦＭＣ）中において８Ｖ／ｃｍで１．５時間分離した。この５ｋｂ ＤＮＡ（スタッファーＩｅ）を切り取り、ＴＥ緩衝液（Sambrook et al., 1989）で平衡させた。この５ｋｂ ＤＮＡを、記載されたように（Carninci and Hayashizaki, 1999, Methods Enzymology, 303:19-44）、β−アガラーゼ（New England Biolabs）を用いることによって精製し且つ調べた。典型的には、３０％〜５０％の出発ＤＮＡを回収した。
スタッファーＩｆが取り出されたλ−ＦＬＣ−III−Ｆと、スタッファーＩｅ（上のように製造される）とを、１０μｌの１ｘ連結反応緩衝液（ＮＥＢ）中において４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼと混合することにより連結した（比率は２１０ｎｇ対３０ｎｇであった）。この試験管を１６℃で一晩インキュベートした。
この連結溶液をパッケージングし且つ増幅させて、ベクターλ−ＦＬＣ−III−Ｅを得た。これら工程は、標準法（Sambrook et al., 1989）にしたがって行った。
実施例８：ｐＤＥＳＴ−Ｃの調製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより購入）をＡａｃＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で切断し、次いでＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）でブランティングし、２つの断片を得た。短い断片はアガロースゲル電気泳動により除去し、長い断片を精製し、回収した。精製された長い断片は、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従って、１６℃で一晩ＲｆＢカセットと連結し、電気穿孔によりＤＨ１０Ｂ細胞中へ導入した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。組換え体クローンを増幅し、プラスミドを抽出した（ｐＤＥＳＴ−Ａ）。ｐＤＥＳＴ−Ａ中のＢｓｓＨII断片を逆位させるため、ｐＤＥＳＴ−ＡをＢｓｓＨII制限酵素で切り、フェノール／クロロホルムにより抽出し、エタノールで沈澱させ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）、２つの断片を得た。ｐＤＥＳＴ−Ａの消化産物であるこれら２つの断片は、ＲｆＢカセットを１８０度逆転させて１６℃で一晩連結させ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）、得られたプラスミドを電気穿孔によりＤＨ１０Ｂ細胞へ導入した。逆位された当該断片をもつクローンを、制限マッピングにより選択した（ｐＤＥＳＴ−Ｃ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。
実施例９：ｐＦＬＣ−ＤＥＳＴの調製
λ−ＦＬＣ−II−ＣおよびｐＤＯＮＲ２０１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＢＰクロナーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により組換えた。次に当該組換えベクターをｐＤＥＳＴ−Ｃと混合し、ＬＲクロナーゼにより組換えた。その反応溶液を電気穿孔によりＤＨ１０Ｂ細胞へ導入し、組換え体クローンをアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択した。組換え体細胞を増幅し、プラスミド（ｐＦＬＣ−ＤＥＳＴ）を調製した。
実施例１０：精製ｐＦＬＣ−III−ｆの調製
１００ｎｇのλ−ＦＬＣ−III−Ｆを１ＵのＣｒｅリコンビナーゼ（インビトロｃｒｅ−ｌｏｘ仲介リコンビナーゼ）により３００μｌ中、３７℃１時間処理し、ＦＬＣ−III−ｆプラスミドを切り出した。このプラスミドを次にフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、に従う）。回収されたプラスミドは２．５ｋｂ／ｃｍでＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中へ電気穿孔した。細胞をアンピシリンを含むＬＢ寒天、Ｘ−ｇａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）上に広げ、３７℃で一晩培養した。アンピシリンを含むＬＢプレートからの青いコロニーを拾い上げ、ＱＩＡＧＥＮキットを用いてプラスミドを調製した。
このプラスミドは以下の工程により、制限酵素（Ｉ−ＣｅｕＩ，ＰＩ−ＳｃｅＩ）で消化した。
第１制限消化工程：２０μｌの１０ｘＩ−ＣｅｕＩバッファー，２０μｌの１０ｘＢＳＡおよび３ＵのＩ−ＣｅｕＩの溶液（全容量２００μｌ）をチューブ内に調製し、３７℃で５時間インキュベートした。
第２制限消化工程：２２．５μｌの１０ｘＰＩ−ＳｅｃＩバッファーおよび３ＵのＰＩ−ＳｃｅＩを加え、得られた溶液を３７℃で５時間インキュベートした。この工程の後、チューブを６５℃で１５分間加熱した。次に、消化ＤＮＡをプロテイナーゼＫ処理（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）により精製し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、に記載のとおり）。慎重に再懸濁した後、消化ＤＮＡは、以下のように０．８％低融点アガロースゲル中で分離した。５０Ｖで１．５時間電気泳動後、ＤＮＡ断片（２．９ｋｂ）をゲルから切り出し、回収した。それらはＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ キットで精製し、次いでライゲーションに使用した。
実施例１１：ｃＤＮＡの調製およびクローニング
完全長ｃＤＮＡは文献記載（ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，１９９９，上記に同じ；Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９７，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，４：６１−６６）のように調製し、クローニングの前に均等化および／または差引き化した（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：１６１７−１６３０）。２５ＵのＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）／μｇ ｃＤＮＡ（３’端を切断するため）および２５ＵのＸｈｏＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｖｉｌｎｉｕｓ， Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）／μｇ ｃＤＮＡ（５'端を切断するため）で消化し、当該ｃＤＮＡを１．３Ｕの熱感受性シュリンプアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）／μｇ ｃＤＮＡで処理し、大容量クローニングベクター類を扱う場合に問題となるｃＤＮＡのコンカテマー化およびキメラ化を回避した。次いで、当該ｃＤＮＡをプロテイナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＣＬ−４Ｂスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にかけた。精製されたｃＤＮＡはエタノール沈澱させる（ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，１９９９，上記に同じ）か、サイズ分画した。アガロースゲルを使ってサイズ分画したｃＤＮＡについては、均等化／差引化は適用しなかった。この工程は、前記ベクターのλアームの単離に用いられたものと同様である：すなわち、電気泳動の方向を、短い断片が流出した後に、逆転させるものである（電気泳動を続行する前にバッファーを交換した）。ｃＤＮＡは、既述のようにβアガラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるか、７Ｍ塩化グアニジンの存在下で、文献記載（Ｂｏｏｍ，１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：４９５−５０３）と実質的に同様に、酸で２回洗浄し、サイズ分画した珪藻土（Ｓｉｇｍａ）に結合させさせて、前記ゲルから分離した。
ｃＤＮＡおよびベクターの連結は常に（ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３０３：１９−４４）に従って、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む５μＬ反応液中で等モル比で行った。ｃＤＮＡの量は、第１および第２鎖の合成の際に取り込ませた放射能により推定した（ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，１９９９，上記に同じ）。ベクター上のクローニング部位はＳａｌＩ（ＸｈｏＡとの付着末端）およびＢａｍＨＩ部位を用いたが、λ−ＦＬＣ−II−ＣベクターについてのみはＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ部位を用いた。
ｃＤＮＡ配列分析は、文献記載（Ｓｈｉｂａｔａら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：１７５７−１７７１）のように行い、配列分析およびクラスタリングは、文献記載（ｋｏｎｎｄｏら，２００１，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１１：２８１−２８９）のように実施した。
実施例１２：ｃＤＮＡライブラリーのバルク切出し
Ｉ）Ｉｎ ｖｉｖｏ固相切出し（従来技術）
ｃＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉＣ６００細胞中で増幅した。約１〜５ｘ１０４ｐｆｕをＬＢ寒天の１５０ｍｍ皿上にプレートし、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含むＬＢ寒天を上乗せし、集密状態（コンフルエント）になるまで一晩増殖させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，上記に同じ）。続いて、ファージ粒子をＳＭバッファーで溶出し、力価を測定した。次に、ＢＮＮ１３２細胞をＬＢブロスおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中で一晩増殖させた。細胞をペレット化し、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中に再懸濁し、直ちにファージライブラリーに感染させ、それをｉｎ ｖｉｖｏでプラスミドＤＮＡライブラリーに転換し、ＬＢアンピシリンプレート上にプレートした。
ＩＩ）Ｉｎ ｖｉｖｏ液相切出し
上記のように調製した５ x １０１０までのファージ粒子を、１０ｍＬの、ペレット化および１０ｍＭ ＭｇＳＯ４に再懸濁した後、一晩増殖させたＢＮＮ１３２細胞（ＯＤ６００＝ 〜０．５），に感染させ、次いで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補給した９０ＬＢ培地中で培養した。３０℃または３７℃で１、２、または３時間後に培養を停止し、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ってプラスミドを抽出した。このプラスミドライブラリーを、上記のように（Ｓｈｉｂａｔａら，２０００，上記に同じ）配列分析操作に適した２．０Ｋｖ／ｃｍで、ＤＨ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ電気穿孔した。
ＩＩＩ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｒｅ−ｌｏｘ仲介切出し
ファージｃＤＮＡライブラリーを、既述のように、Ｃ６００細胞中で増幅した。その増幅ファージ溶液から、Ｗｉｚａｒｄ Ｌａｍｂｄａ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って、ライブラリーファージＤＮＡを単離した。得られたファージＤＮＡの４分の１を、推奨（Ｎｏｖａｇｅｎ）されているように，３００μＬ中３７℃１時間１ＵのＣｒｅリコンビナーゼで処理して、プラスミドへ転換し、次いで精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、に従って、プロテイナーゼＫ処理、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱）。バルク切出しプラスミドライブラリーは、２．０ｋＶ／ｃｍでＤＨ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中へ電気穿孔した。
ＩＶ）Ｇａｔｅｗａｙ仲介バルク切出し（「間接的」）プロトコール
１６ｎｇのライブラリーファージＤＮＡ，３００ｎｇのｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），４μＬのＢＰバッファー，およびＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２０μＬに混合した。２５℃で一晩インキュベートし、次いで０．２％ＳＤＳおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で、４５℃で１５分間プロテイナーゼＫ処理を行った。１μｇのグリコーゲンを添加し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用いて反応物を抽出した；得られた試料をイソプロパノールを用いて沈澱させた。沈澱を，３００ｎｇのｐＤＥＳＴ１２．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），４μＬのＬＲバッファー，および４μＬのＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックスと混合し、２０μＬの容量とした。当該試料は、プロテイナーゼＫ／フェノール クロロホルム抽出、次いでエタノール沈澱により、さらに精製した。
Ｖ）「増幅間接的」プロトコール
試料は、ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ反応までは、前のプロトコール（Ｇａｔｅｗａｙ仲介バルク切出し「間接的」）のときと同様に処理した。２０μLの反応物のうち１μLをＤＨ１０Ｂ細胞へ電気穿孔した。細胞を、カナマイシンを含むＬＢ上に広げ、得られたコロニーをプラスミド抽出（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に付した。調製されたプラスミドは、個々にＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅと反応させ、前と同じように精製および電気穿孔した。
ＶＩ）「１チューブ」（「直接的」）プロトコール
処法は、BP Clonase反応(Life Technologies)までは、前記間接的プロトコールと同じである。次に、４５０ｎｇのＰＤＥＳＴ１２．２，６μＬのＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ酵素ミックス、および１μＬの０．７５M ＮａＣｌを、前記チューブ（全容量３０μＬ）に加えた。この試料を、既述のように、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅで処理し、精製した。当該ＢＰ／ＬＲ反応試料は、滅菌水に溶解し、ＤＨ１０Ｂ細胞中へ電気穿孔した。形質転換細胞は、アンピシリンまたはカナマイシンを含むＬＢプレート上に広げ、３７℃で一晩培養した。
各切出し法の転換頻度を査定するため、ＬＢプレートの６０のランダムコロニーからプラスミドを調製した。それらのプラスミドをＰｖｕIIで切断し、挿入体のサイズを０．８％アガロースゲルを用いて分析した。なお、転換効率は、アンピシリンまたはカナマイシン含有プレート上にできるコロニーを計数することによっても算定できる。
実施例１３：ホーミングエンドヌクレアーゼ系：挿入体のライゲーション仲介転移用ベクター：λ−ＦＬＣ−III−Ｆ
（１）インサートｃＤＮＡ標品
ｃＤＮＡライブラリーは、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ（New England Biolabs）を両側のクローニング部位（ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ）に有するλ−ＦＬＣ−III−Ｆベクター（実施例６）中に、ｃＤＮＡ（Carninci et al., 2000, Genome Research, 10:1617-1630 の場合のように製造される）をクローニングすることによって製造した。これらホーミングエンドヌクレアーゼは、それぞれ、２６ｂｐおよび３９ｂｐの配列を認識し且つ切断するが、マウスゲノムを切断しない（事実、これらホーミングエンドヌクレアーゼは、統計的には、それぞれ、１．８ｘ１０１８塩基対毎に１回および１．２ｘ１０２４塩基対毎に１回切断し、したがって、Human および Mouse のような、全サイズが約３ｘ１０９塩基対であるきわめて複雑なゲノムをちょうど１回で切断するとは全く考えられない）。したがって、それらは、ライブラリー中の幾万ものクローンのいずれかを内部切断することなくｃＤＮＡをサブクローニングするのに最適である。
ファージｃＤＮＡライブラリーを、キャップ・トラッパー技術（Carninci et al., 2000, Genome Research, 10:1617-1630）の一つの変法にしたがって製造し、λ−ＦＬＣ−III−Ｆ中にクローン化し、そしてＣ６００細胞中で増幅させた（Sambrook et al., 1989）。１ｍｌの増幅ファージ溶液から、Wizard Lambda Preps DNA Purification System（Promega）を用いることにより、ライブラリーファージＤＮＡを単離した。精製されたライブラリーファージＤＮＡを、制限酵素（Ｉ−ＣｅｕＩ，ＰＩ−ＳｃｅＩ）で消化した。第一制限工程：５μｌの１０ｘＩ−ＣｅｕＩ緩衝液、５μｌの１０ｘＢＳＡおよび２．５ＵのＩ−ＣｅｕＩの溶液（全容量５０μｌ）を、試験管中で調製し、３７℃で４時間インキュベートした。
この工程後、この制限試験管を、６５℃で１５分間加熱した。消化したＤＮＡを、プロテイナーゼＫ処理（Sambrook et al., 1989）によって精製し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてきわめて注意深く再懸濁させた。第二工程制限は、次のように行った。４０μｌの水中にＤＮＡを再溶解させ、５μｌの１０ｘＰＩ−ＳｃｅＩ緩衝液および４ＵのＰＩ−ＳｃｅＩ（New England Biolabs，全容量５０μｌ）を加え、３７℃で４時間インキュベートする。この工程後、この制限試験管を、６５℃で１５分間加熱した。消化したＤＮＡを、プロテイナーゼＫ処理によって精製し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてきわめて注意深く再懸濁させた（Sambrook et al., 1989 の場合のように）。
（２）ｐＦＬＣIII−ｆ標品
λ−ＦＬＣIII−Ｆベクター（実施例６）を、in vitro ｃｒｅ−ｌｏｘ媒介リコンビナーゼで切除した。最初に、１００ｎｇのλ−ＦＬＣIII−Ｆを、１Ｕのｃｒｅ−リコンビナーゼで、３００μｌの最終容量中、３７℃において１時間処理した。次に、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させた（Sambrook et al., 1989）。これらプラスミドを、大腸菌（E.coli）ＤＨ１０Ｂ（Life Technologies）中に、製造者の指示にしたがって２．５ｋｖ／ｃｍでエレクトロポレーションした。細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天（Sambrook et al., 1989）上に塗抹した。ＬａｃＺスタッファーＩを有するプラスミドを比色分析検出して、後のバックグラウンド識別を容易にするために、９ｃｍペトリ皿中のアガロース表面に、４０マイクロリットルの２％Ｘ−ｇａｌおよび７マイクロリットルの２００ｍＭ ＩＰＴＧも加えた（理論的考察について：Sambrook et al., 1989）。このプレートを３７℃で一晩培養し、その後日（the day after）に数十個のコロニーが現れる。一つの青色コロニーを上のＬＢから採取し、５０ｍｌのＬＢ培養液／５０マイクログラム／ｍｌアンピシリン中に接種し、そして３００ｒｐｍで振とうしながら一晩成長させた（Sambrook et al., 1989）。翌日、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレプキット（ＱＩＡＧＥＮ）によってプラスミドＤＮＡを製造した。
（３）プラスミドベクター標品（スタッファーＩの除去）（図８も参照されたい）
この工程は、組み換えを最大限にするために、スタッファーＩ（この場合、図１ｆのスタッファー）を欠いたプラスミド（この場合、ｐＦＬＣ−III−ｆ）を製造するためである。
３μｇのプラスミドｃＤＮＡを、制限酵素（Ｉ−ＣｅｕＩ，ＰＩ−ＳｃｅＩ）で消化した。第一工程において、制限は、５０μｌの全容量において、５μｌの１０ｘＩ−ＣｅｕＩ緩衝液（New England Biolabs）、５μｌの１０ｘＢＳＡ（New England Biolabs によって供給される、酵素を含むウシ血清アルブミン）および４ＵのＩ−ＣｅｕＩ（New England Biolabs）の存在下で行い、３７℃で４時間インキュベーションした。この工程後、この制限試験管を、６５℃で１５分間加熱した。消化したＤＮＡを、プロテイナーゼＫ処理によって精製し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてきわめて注意深く再懸濁させた（Sambrook et al., 1989）。第二制限工程は、５μｌの１０ｘＰＩ−ＳｃｅＩ緩衝液（New England Biolabs）、４ＵのＰＩ−ＳｃｅＩ（New England Biolabs）を補足された５０μｌの全容量で行い、３７℃で４時間インキュベートした。この工程後、この制限試験管を、６５℃で１５分間加熱した。消化したＤＮＡを、プロテイナーゼＫ処理によって精製し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させた（Sambrook et al., 1989）。きわめて注意深く再懸濁した後、消化したＤＮＡを、ＴＡＥ（トリス−アセテート−ＥＤＴＡ；Sambrook et al., 1989 を参照されたい）で緩衝化された０．８％低融点アガロースゲル（seaplaque アガロースＦＭＣ）中で分離した。引き続きの工程において、５０Ｖで１．５時間の電気泳動後、エンプティープラスミドベクター（２．９ｋｂ）に該当するＤＮＡフラグメントをゲルから切り取り、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Gel Extraction キット（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製した。
（４）切断されたプラスミドｐＦＬＣ−III−ｆおよびｃＤＮＡインサートの連結反応（図８も参照されたい）
７．５ｎｇの製造されたインサートと、上の工程（３）で製造された１００ｎｇのｐＦＬＣIII−ｆプラスミドベクターとを、１０ｘＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）および２００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）も含有する１００μｌの最終容量で混合し、１６℃で一晩インキュベートした。連結されたプラスミドを、ＤＨ１０Ｂ中に製造者の指示にしたがって２．５Ｋｖ（Kilovolt）／ｃｍ（Invitrogen）でエレクトロポレーションした。細胞を、（上のように）アンピシリンを含有するＬＢ上に塗抹し、３７℃で一晩培養した。次に、無作為に１２コロニーを採取し、プラスミドを製造し（３ｍｌのＬＢ培養液／５０マイクログラム／ｍｌアンピシリン中に接種）、そして３００ｒｐｍで振とうしながら一晩成長させた（Sambrook et al., 1989）。プラスミドＤＮＡを、Quiagen プラスミドＤＮＡ抽出キットで製造した。
これらプラスミドを、１Ｘ ＰｖｕII緩衝液の存在下においてＰｖｕII（New England Biolabs）で切断し、それらのインサートサイズを、臭化エチジウムで染色された０．８％ＴＢＥアガロースゲルを用いて分析した（Sambrook et al., 1989）。
（５）結果
力価：ｐＦＬＣIII−ｆ＋インサート（ｃＤＮＡ）：２．１ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌ
インサートサイズ検査（平均サイズ）
ここで示される切除プロトコール：３．０７ｋｂ
in vitro Ｃｒｅ−ｌｏｘ媒介リコンビナーゼ（対照実験）：３．１ｋｂ。
この対照実験では、実施例１２のような後述のプロトコールにしたがって Ｃｒｅ−ｌｏｘで切除されるのと同じライブラリーが構成された（番号III，in vitro Ｃｒｅ−ｌｏｘ媒介切除）。
当該技術分野において、制限酵素の使用が高いサイズバイアスを与えるということは知られている。事実、連結反応によって製造されるプラスミドライブラリーは、通常は、λ切除ｃＤＮＡライブラリーの半分のサイズを示す（表２において、小脳ライブラリーは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の１．４Ｋｂであるが、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂについては３．３６Ｋｂである。このサイズは、４１．６％にすぎないので、きわめて有効ではない）。
この実施例においては、代わりに、ホーミングヌクレアーゼを含むサイズは、３．０ｋｂに対して３．０７ｋｂであり、その９９％は、ほとんど関係のないサイズ偏向である（１％のサイズ偏向は、統計的変動に入る）。結論として、本発明者は、ホーミングエンドヌクレアーゼ制限酵素を用いた切除システムが有効な切除システムであるということを証明した。
実施例１４：サイズ選択用ベクターおよびバックグラウンド低減系
図１および２に示すλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂおよび他のベクター類は、完全長マウスｃＤＮＡのライブラリーの調製に使われて成功し、〜０．２から１５．４ｋｂ ｃＤＮＡのクローニング容量をもつことが示された。
強く差引き化されたキャップトラップドｃＤＮＡのクローニングを試みたとき（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：１６１７−１６３０に記載の方法）、ｃＤＮＡ不足（１０ｎｇ以下）のため、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂの使用は、ある種のバックグラウンドをもたらした。このバックグラウンドが２０ないし３０％を超えると、後の大規模配列決定操作のコスト性能に影響した。より低いバックグラウンドのベクターを開発するため、プラスミド中へ切出されるλファージライブラリーのバックグラウンドを減らすための新しい非常に有効な方法を開発した。すなわち、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ中のスタッファーＩを，図１ｅ中のものと置換し、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅを産生した。このベクターのスタッファーは、「自殺遺伝子」ｃｃｄＢ（ＢｅｒｎａｒｄおよびＣｏｕｔｕｒｉｅｒ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：７３５−７４５）の２コピーおよびブルー・ホワイト選択用の機能性ＬａｃＺとをもっている（図１ｆ）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来断片中にあるＬａｃＺは、スタッファーＩまたはクローン化ｃＤＮＡのいずれかにより破断されるので、非機能性であることに注目すべきである。興味深いことに、ｃｃｄＢ遺伝子をもつλファージは、Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中で複製できる；このことは、ｃｃｄＢ遺伝子産物の標的であるＤＮＡジャイレースは、λファージの溶解サイクルの際には存在する必要がないことを示唆している。
前記切出し手順の後、切出しベクター（挿入体なし）の３００ｐｇまでに相当する量をプレートしたが、コロニーは全く得られなかった。それに対する対照実験で、３．６ｋｂ挿入体をもつが、スタッファーの代わりのｃｃｄＢをもたない同様な構築体の〜３．５ｐｇに相当する量をプレートしたところ、１１７５以上のコロニー（バックグラウンドに相当）を得た。この差は、λ−ＦＬＣ−III−Ｆ（後述）の場合と同様に、少なくとも１０5倍という圧倒的なバックグラウンド低減を示している。
実施例１５：ＤＮＡコンタミネーションバックグラウンド
図１ｄ−ｆに示した、テストしたバックグラウンド低減スタッファーはいずれも、非組換え体ベクターに由来するバックグラウンドを検出可能な程度に産生しなかったので、互換性があると考えられる。λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅ，λＦＬＣ−Ｃ−Ｆ，λ−ＦＬＣ−III−Ｄ，λ−ＦＬＣ−III−Ｓ−Ｆ，およびλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｄなどのベクターの場合、そのバックグラウンドは環境ＤＮＡコンタミネーションによる。あるテスト実験では、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅに何のｃＤＮＡも連結しなかった。λプレーティング段階では、低減すべきバックグラウンドがなかったので、得られた８．４ ｘ １０４ｐｆｕ／μｇベクターという値は、非組換え体ベクターの寄与を含んでおり、これに対して、正のコントロールの代表的な値は ＞１０７ｐｆｕ／μｇであった。当該バックグラウンドプラークを増幅し、プラスミドを切出し、１２クローンを分析し、異なる電気泳動パターンを示す代表的な試料の配列分析を行った。選択後に残ったバックグラウンドクローンは、ベクターＤＮＡ調製中の死んだＥ．ｃｏｌｉ細胞からの残物と思われるＥ．ｃｏｌｉゲノム由来のものだけで、どの挿入体にもベクター配列は見られなかった。それ故、バックグラウンドを完全に無くすのが目標であれば、すべてのコンタミゲノムＤＮＡをλＤＮＡ調製物から排除しなければならないし、恐らくさらに重要なことは、ｃＤＮＡが、容易にクローニングできるように、無傷の末端をもたなければならないことである。
実施例１６：バックグラウンド低減ｌｏｘＰ系
スタッファーＩに関連するバックグラウンド低減は、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅのスタッファーの場合と異なる。ｃｃｄＢの単一コピーおよびスタッファーＩに挿入した追加のｌｏｘＰサイト（図１ｆ）を用いて、二重の戦略を独立にテストしたためである。その切出し過程の際、図１ｉに示すように、第３のｌｏｘＰサイトは、ｂｌａ（アンピシリンに耐性を付与するためのβラクタマーゼ遺伝子）からの複製起点の分離を生じやすい。この問題を解決するため、λベクター中のプラスミド配列とｌｏｘＰエレメントの順序を操作して、スタッファーＩ上のｌｏｘＰがｂｌａと複製起点の間になるようにした。これにより、どの欠陥切出しプラスミドも、複製または抗生物質耐性の獲得が不可能になる（図１ｉ）。
予備実験で、スタッファーとして図１ｉのバックグラウンド低減配列のみを含み、ｃｃｄＢ遺伝子のないλ−ＦＬＣ−III型ベクターを構築した。当該切出しプラスミドの〜３．５ｐｇから４３コロニーを得たが、これに比べて、ｌｏｘＰバックグラウンド低減配列およびｃｃｄＢ遺伝子の両方を欠く、同じサイズのコントロール切出しプラスミドの〜３．５ｐｇからは７７１コロニーが得られた。従って、当該ｌｏｘＰバックグラウンド低減配列は、バックグラウンドの９４．４％を排除したことになる。ｃｃｄＢを当該ｌｏｘＰ含有スタッファーに加えたところ、得られたベクターは、図１ｆのようにバックグラウンド低減エレメントをもつ切出しプラスミドを３５０ｐｇまでも電気穿孔した場合でも、全くコロニーを生じなかった。この結果は、少なくとも７．７ ｘ １０4倍のバックグラウンド低減に相当し、この数値は、前記λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅベクターのバックグラウンド低減エレメントで得られたものと同様である。λ−ＦＬＣ−III−Ｆおよびλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅの両ベクターのバックグラウンド低減系は、完全長ｃＤＮＡクローニングの目的に十分と考えられた。
実施例１７：ｃＤＮＡライブラリーのバルク切出し
バルク切出し前に、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを固相培地上で場合により増幅した。この方法は、ｃＤＮＡライブラリーのサイズを減少しないが、長いファージを選択的にパッケージするため、約≦０．５ｋｂのｃＤＮＡ挿入体をもつファージの頻度を（排除はしないが）減少させる。Ｃ６００細胞中での増幅は、ｃＤＮＡのクローニングに使われるヘミメチル化（ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，１９９９，上記に同じ）を排除する。一次ｃＤＮＡライブラリーのヘミメチル化ｃＤＮＡは，ＢＮＮ１３２中のｉｎ ｖｉｖｏ切出し（後記）の際に切断されると思われる。
Ｉ）Ｃｒｅ−ｌｏｘに基づく切出し−Ｉｎ ｖｉｖｏ固相切出し
Ｉｎ ｖｉｖｏ固相切出し法（図３）（本分野の現行技術を代表する）は、増幅されたｃＤＮＡライブラリーを、構成的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するＢＮＮ１３２細菌株（Ｅｌｌｅｄｇｅら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１７３１−５）へ感染させるだけなので、簡単のように思える。しかしこの方法は、プラスミドの不安定性（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９８４，上記に同じ）およびプラスミドの低収量（Ｐａｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，上記に同じ）のため、推奨できない。実際、Ｃｒｅリコンビナーゼが構成的に発現され、プラスミドの２量体や多量体を形成させ、高率の無プラスミド細胞を生成し（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９８４，上記に同じ）、配列決定の効率を損なう。ｃＤＮＡライブラリーの宿主株としてＢＮＮ１３２を用いると、決まって、プラスミドは低収量で、長期の培養後に消失することが確かめられている。
ＩＩ）Ｃｒｅ−ｌｏｘに基づく切出し−Ｉｎ ｖｉｖｏ液相切出し
Ｉｎ ｖｉｖｏ液相切出し法は、長期培養後のプラスミドの消失および低収量の問題を克服した：すなわち、３０℃または３７℃で短期培養後、切出しプラスミドｃＤＮＡライブラリーを抽出し、ＤＨ１０Ｂなどのいずれか適当なＥ．ｃｏｌｉ株へ電気穿孔する。当該プラスミドを低コピー数に保つことにより、ライブラリーのサイズを非バイアスに保持すると考えられる３０℃（Ｌｉｎ−Ｃｈａｏら，１９９２，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：３３８５−３３９３）またはプラスミドが高いコピー数で発現される３７℃で、１、２、または３時間の培養／切出し後に、切出しライブラリーのサイズについて同じような結果が得られた。コピー数は、ｃＤＮＡ挿入体のサイズに逆比例することも認められた。λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ中にクローニングされたｃＤＮＡライブラリーを切出した場合、切出し後の最終力価は、３０℃で１時間培養後２．４ ｘ １０８ｃｆｕ／μｇ、３０℃で２時間後９．１ ｘ １０８ｃｆｕ／μｇ、および３０℃で３時間後１．４ ｘ １０９ｃｆｕ／μｇであった。３７℃での増殖後の力価は、１時間のインキュベーション後１．５ ｘ １０９ｃｆｕ／μｇ、２時間後９．８ ｘ １０８ｃｆｕ／μｇ、および３時間後２．８ ｘ １０９ｃｆｕ／μｇであった。平均挿入体サイズはそれぞれ、３０℃で１、２、および３時間の場合４．１，３．９，および３．３ｋｂ、および３７℃で１、２、および３時間の場合２．９，３．６，および３．８ｋｂであった。これらの結果は、挿入体の長さまたはＢＮＮ１３２Ｅ．ｃｏｌｉ培養の温度および期間に関し、特記するような切出し関連の問題がないことを示唆している。当該Ｃｒｅ−ｌｏｘ切出し系に関連するサイズバイアスをよりよく定量するため、１０ｋｂスタッファーをもつ同数の非組換え体λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂベクターを、増幅ｃＤＮＡライブラリーからのファージと混合し、細胞に感染させた。１０ｋｂ挿入体を含むクローンの割合は、上記条件のすべてで５０％近くであった。この結果から、当該Ｃｒｅ−ｌｏｘ切出し系のサイズバイアスに対する強健さが確かめられた。本ｉｎ ｖｉｖｏ液相切出し法の長所のなかには、高いＤＮＡ収量があり、それは、増幅されたライブラリーのサイズを減らす恐れがあるプラスミド増幅工程を避けながら、現存ｃＤＮＡライブラリーのさらなる均等化／差引き化（Ｂｏｎａｌｄｏら，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６：７９１−８０６）に使える、ＧｅｎｅII−ＥｘｏIIIを用いる終始一貫した量の１本鎖プラスミドＤＮＡの産生のような、下流操作を容易にする。
ＩＩＩ）Ｃｒｅ−ｌｏｘに基づく切出し−Ｉｎ ｖｉｔｒｏ切出し
Ｉｎ ｖｉｖｏ液相切出し法は、サイズバイアスを示さないが、なお短いラウンドのライブラリー増幅が含まれ、それが配列特異的、再現的バイアスの原因となる可能性がある。そこで、Ｃｒｅ仲介組換えに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ切出し法を開発した。この切出し系は、増幅ｃＤＮＡライブラリーからの精製λＤＮＡを使い、続いて電気穿孔を行うものである。その適用に当っては、長いＢＡＣ挿入体について記載された電気穿孔条件をテストした（Ｓｈｅｎｇら，１９９５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：１９９０−１９９６）。ＰｖｕIIによる制限消化後の６０プラスミドのサイズ分析の結果に照らすと、１．７から２．５ｋＶ／ｃｍのパルスを用いた場合、プラスミドｃＤＮＡライブラリーの最終サイズに有意な差は認められなかった。本Ｃｒｅ−ｌｏｘ ｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しプロトコールは、ＢＮＮ１３２中でｃＤＮＡライブラリーの短期増幅工程さえ必要とせず、サイズバイアスに関して優れており、さらに、ここに記載されているすべてのベクターで使用可能なため、ここでテストした中では最適と考えられた。
ＩＶ）Ｇａｔｅｗａｙ ＴＭ 系仲介切出し
λ−ＦＬＣ−II−Ｃの場合、ｐＦＬＣ−IIプラスミド切出しのＣｒｅ−ｌｏｘ切出しプロトコール（図２ｈ）に加えて、Ｇａｔｅｗａｙ系に基づくバルク切出し用のプロトコールを開発した。
挿入体をまずエントリーベクターｐＤＯＮＲ２０１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移入し、次いでデスティネーションベクターｐＤＥＳＴ１２．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，構造は示されていない）に移した。
ここで調製したλ−ＦＬＣ−II−Ｃベクターは、個々のクローンまたはバルクライブラリーを、異なる機能性ベクター（図２ｃ）中へまたはシークエンスのためにｐＦＬＣ−ＤＥＳＴ（図２ｊ）中へ移入するためのＧａｔｅｗａｙ ａａｔＢ１およびａｔｔＢ２配列（Ｗａｉｈｏｕｔら，２０００，上記に同じ）をもっている。
３つのＧａｔｅｗａｙ切出しプロトコール（「間接」、「増幅間接」、「直接」プロトコール）は、図３に概要を示し、上記実験の部に記載してある。
前記Ｇａｔｅｗａｙ仲介バルク切出しプロトコールはいずれも、前記Ｃｒｅ−ｌｏｘバルク切出し処法の代わりとして有効である。事実、対照のＣｒｅ−ｌｏｘ反応（ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｒｅリコンビナーゼプロトコール）の場合、切出しｃＤＮＡサブライブラリーからの６０クローンの平均サイズは２．３ｋｂであり、「間接」プロトコールの場合２．４ｋｂで、「増幅間接」プロトコールの場合２．５ｋｂで、「直接」プロトコールの場合３．３ｋｂであった。切出し前のこのｃＤＮＡの平均サイズは３．７ｋｂであった。その最終サイズがゲル上のｍＲＮＡの平均サイズに近いことを考えると、本切出し系は満足できるものである。いずれにせよ、当該Ｇａｔｅｗａｙ仲介切出し系は、Ｇａｔｅｗａｙ切出しプロトコールの使用が可能なλ−ＦＬＣ−II−Ｃ中へのクローニングに十分量のｃＤＮＡが利用できる場合には、極めて魅力的である。ここでは、シークエンス操作の必要性に照らして、デスティネーションベクターとしてｐＦＬＣ−ＤＥＳＴ（図２ｊ）を使用した。
実施例１８：６．０ｋｂおよび５．５ｋｂスタッファーIIベクター間の比較例
１）ベクター構築
５．５ＫｂのスタッファーIIをもつλ−ＦＬＣ−Ｉを、上記実施例で既に述べたように構築した。そのクローニングサイズを比較するため、６．０ＫｂのスタッファーIIをもつλ−ＦＬＣ−Ｉを構築した。当該５．５ＫｂスタッファーIIにＨｉｎｄIIIサイト中の０．５Ｋｂ断片を加えた。０．５Ｋｂ断片は、マウスゲノムＤＮＡのＨｉｎｄIIIによる制限消化で得た。マウスゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．５Ｋｂ断片をゲル電気泳動により分離した。当該断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＋ （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へサブクローニングし、ＨｉｎｄIIIにより切断し、そのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へサブクローニングした５．５ＫｂスタッファーII上のＨｉｎｄIIIサイトへ挿入した。前記６．０ＫｂのスタッファーIIは、ＡｓｃＩの制限消化により回収し、１０ＫｂスタッファーＩおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔとともに、左アームおよび右アームへ連結した。
２）クローニング用のアームの調製
λＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ ｌａｍｂｄａ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（＃１２５４３）により調製した。
１０μｇの当該ラムダＤＮＡの付着末端を、１８０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2中、４２℃で２時間インキュベートによりアニールし、２０μｌの１０ｘライゲーションバッファーおよび４００単位のＴ４ Ｌｉｇａｓｅ（いずれもＮＥＢ Ｋｉｔ）を加え、室温で７時間インキュベートし、次いで６５℃で１５分間リガーゼを不活性化した。上記λＤＮＡは、５０ｍＭ，１００ｍM、および１５０ｍＭのＮａＣｌ（３工程のそれぞれの終濃度）を添加する３工程で、制限酵素（すべてＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．より購入）で消化した。第１工程の制限消化は、両ベクターにつき、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で、２μｌの５Ｍ ＮａＣｌ，１０μｌのＮＥＢ２バッファー，７３μｌのＨ2Ｏ，４０単位のＸｈｏＩ，２０単位のＳｐｅＩおよび３２単位のＰａｃＩの添加により行い、次いで試料を３７℃で２時間インキュベートした。第２工程は、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で、２μｌの５Ｍ ＮａＣｌ，２０μｌの１０ｘＮＥＢ３バッファー，１８０μｌのＨ2Ｏおよび２０単位のＳｗａＩの添加により行い、室温で２時間インキュベートした。この工程後、反応チューブを６５℃で１５分間加熱した。最後に、第３工程は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で、５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、６０単位のＳａｌＩおよび６０単位のＢａｍＨＩの添加により行い、３７℃で４時間インキュベートした。制限消化後、ＤＮＡは、０．１％ＳＤＳおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下でＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理により精製し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。ＤＮＡ濃度は、再懸濁問題を避けるために、２０μｇ／ｍｌを超えないようにした。少なくとも３０分間かけて、極めて慎重に再懸濁した後、当該消化ＤＮＡを、下記の工程で、０．７％低融点アガロースゲル（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ，ＦＭＣ）中で分離した。８Ｖ／ｃｍで１．５時間電気泳動後、ＳｔｙＩ消化λＤＮＡの１９Ｋｂより短いＤＮＡ断片は、ゲルからカットオフされた（工程１）。次に、その電気泳動バッファー（１ｘＴＢＥ）を新しいものと替え、ゲル中に残ったＤＮＡを８Ｖ／ｃｍで２．５時間逆方向に電気泳動した。この時点で１９ｋｂより短いＤＮＡは、再度カットオフされた（工程２）。バッファーを再び替えた。ゲル中に残ったＤＮＡを、より短い反応容量のλアームＤＮＡを含む領域をコンパクトにするために、８Ｖ／ｃｍで３０分間、工程１と同じ方向に電気泳動した。最後に、λアームＤＮＡをカットオフし（工程３）、ゲルをＴＥバッファーで平衡化後（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）、βアガラーゼ（ＮＥＢ）で、既報（ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，１９９９，上記に同じ）のように精製およびチェックした。
３）テスト挿入体の構築
２５０ｂｐテスト挿入体
λＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、２％低融点アガロースゲル中で電気泳動した。２００−３００ｂｐバンドをカットオフし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。２００−３００ｂｐのＰｓｔＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へサブクローニングし、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した。２５０ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を２．０％低融点アガロースゲル中で分離し、切り取って、Ｑｉａｇｅｎ Ｋｉｔで精製した。
２ｋｂテスト挿入体
２．０ＫｂマウスｃＤＮＡを含むプラスミドをＰＣＲ鋳型として用いた。２Ｋｂ挿入体を１ｓｔＢＳプライマーおよび２ｎｄＸプライマーで増幅し、０．１％ＳＤＳおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理により精製し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた（Ｓａｎｂｒｏｏｋら，１９８９，上記に同じ）。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（ＳａｌＩとの付着末端）で消化し、上記のように精製した。
６Ｋｂテスト挿入体
６Ｋｂテスト挿入体は、前記各挿入体についての記載と同様に調製した。
１０Ｋｂテスト挿入体
１０ＫｂスタッファーＩをもつｐ−ＦＬＣ−ＩをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、上記のようにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋで精製した。当該１０ＫｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片は、０．７％低融点アガロースゲル電気泳動で分離し、ＴＥバッファー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）でゲルを平衡化後、βアガラーゼ（ＮＥＢ）でゲルから分離した。
４）挿入体サイズチェック
４種類のテスト挿入体を，５．５ＫｂスタッファーIIを有するλ−ＦＬＣ−Ｉへ、および６．０ＫｂスタッファーIIを有するλ−ＦＬＣ−Ｉへ連結した。２００ｂｐ，２Ｋｂ，６Ｋｂおよび１０Ｋｂのテスト挿入体は、それぞれ両ベクターへ１：１：１：１または３：１：１：１の比率で連結した。次いで、パッケージング反応を、ＭａｘＰｌａｘ Ｌａｍｂｄａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。ファージ溶液はＣ６００細胞中で増幅した。１ｘ１０４ｐｆｕをＬＢ寒天の９０ｍｍ皿にプレートし、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含むＬＢ寒天を上乗せし、一晩増殖させて集密状態（コンフルエント）にした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。ファージ粒子をＳＭバッファーで溶出させ、力価を測定した。ファージＤＮＡは、推奨されているように（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ），３００μＬ中、１ＵのＣｒｅリコンビナーゼにより３７℃１時間抽出し、プラスミドへ転換し、Ｓ４００スパンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。切り出されたプラスミドは、２．５ＫＶ／ｃｍでＤＨ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中へ電気穿孔し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上へプレートした。各９６コロニーを取り上げ、プラスミド調製を、ＫＵＲＡＢＯによるプラスミド抽出自動装置、溶液類およびプロトコールにより行った（しかし、プラスミドの他の任意の精製法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、の方法に従ってもよい）。プラスミドはＰｖｕIIで消化し、挿入体サイズをアガロースゲル電気泳動によりチェックした。
結果を表１に示す。
５．５ｋｂのスタッファーIIをもつベクターは、６ｋｂの挿入体を４３例、１０ｋｂの挿入体を５例で受け入れ可能であった。６および１０ｋｂの挿入体は、長いそして完全長のｃＤＮＡに相当する。
この結果は、５．５ｋｂのスタッファーIIを含むベクターが、６．０ｋｂのスタッファーIIを含むベクターより、長いサイズ（６．０および１０．０ｋｂ）のｃＤＮＡ挿入体の効率的な挿入が可能であることを証明している。３７．５ｋｂのＣＳ（すなわち５．５ｋｂのスタッファーII）をもつベクターは、３０ｋｂのサイズのＣＳ（すなわち６ｋｂのスタッファーII）をもつベクターより、完全長ｃＤＮＡライブラリーの調製に有利である。
実施例１９：遺伝子発見はｃＤＮＡライブラリーの平均挿入体サイズに相関している
Ｉ）ライゲーション仲介クローン転移によるクローニングサイズ選択性ｃＤＮＡ用のベクター：λ−ＦＬＣ−III−Ｌ−Ｄ（図２ｅ）
λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｂおよびλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｄと同様に、λ−ＦＬＣ−III−Ｌ−Ｄは、スタッファーIIをもたないため、大きい挿入体をもつｃＤＮＡライブラリーに使われる。このベクターは、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｄと同じバックグラウンド低減エレメントをもつが、λ−ＦＬＣ−III−Ｌ−Ｄからの切り出しは、ｃＤＮＡの内部切断なしのサブクローニングに適するｐＦＬＣIII−ｄプラスミド（図１ｄのスタッファーＩを含む図２ｉのプラスミド）を生じる点で、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｄと異なる。
ＩＩ）短いｃＤＮＡおよび挿入体のライゲーション仲介転移用のベクター：λ−ＦＬＣ−III−Ｓ−Ｆ（図２ｆ）
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）およびＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）のような脊椎動物から進化的に遠い多くの生物のｍＲＮＡは、脊椎動物のものより短い（典型的には、アガロースゲル上で１から１．５ｋｂ）。無脊椎動物を扱う場合、既述のすべての実施例で使われたようなサイズ選択は、当初のｍＲＮＡを代表しないと思われる長い挿入体にバイアスする可能性がある。λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂを使っても、３つのイネライブラリーからの遺伝子発見は優れていたが、この問題の解決のために、λ−ＦＬＣ−III−Ｓ−Ｆを調製した。λ−ＦＬＣ−III−Ｓ−Ｆは既述のλ−ＦＬＣ−III−Ｆと同じだが、長いスタッファーII（６．３ｋｂ）をもっている。６．３ｋｂスタッファーIIの場合、名目のクローニングサイズは０から１４．９ｋｂで、比較的短いｃＤＮＡのクローニングに便利である。λ−ＦＬＣ−III−Ｓ−Ｆのバックグラウンド低減エレメントは図１ｆに示され、このベクターは、切出し後、ｐＦＬＣIII−ｆプラスミド（図１ｆのスタッファーＩを含む図２ｉのプラスミド）を産生する。
ＩＩＩ）完全長ｃＤＮＡ
ここで用いた完全長ｃＤＮＡは、文献記載（ＣａｒｎｉｎｃｉおよびＨａｙａｓｈｉｚａｋｉ，１９９９，上記に同じ）のように調製し、均等化／差引化した（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：１６１７−１６３０）。他の任意の技術により調製されたｃＤＮＡでも、制限サイトが適合し、ベクターが適切に修飾されていれば、λ−ＦＬＣベクターへ正しい向きにクローニングが可能である。λ−ＦＬＣ−Ｉ−ＢへクローニングされたｃＤＮＡの平均挿入体サイズは、他のベクター類へクローニングされた同じｃＤＮＡのものに比べて常に長かった（表２；種々のベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーの平均サイズ）。
λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂライブラリーの平均挿入体サイズは、λ−ＺａｐIIライブラリーのものより１．８倍大きく、プラスミドｃＤＮＡライブラリーのものより２．４倍大きかった。
表３および図４に、各ｃＤＮＡライブラリーの平均挿入体サイズを、当該ライブラリーの複雑度と相関させて示した。実際、これらのライブラリーは、完全長ｃＤＮＡエンサイクロペディアの構築の際、当該遺伝子発見プログラム用に配列分析をした（ＲＩＫＥＮ ｍｏｕｓｅ ｃＤＮＡ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ，ＲＩＫＥＮ ａｎｄ Ｆａｎｔｏｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ， Ｎａｔｕｒｅ，４０９巻：６８５−６９０）。同一末端をもつランダムに拾い上げたクローンおよびクラスタークローンのシークエンスにより得られた重複性（Ｋｏｎｎｏら，２００１，上記に同じ）を、λ−ＺａｐII（従来ベクター）中にクローニングされた７つのｃＤＮＡライブラリーおよびλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ中にクローニングされた９つのｃＤＮＡライブラリーを使って比較した（表３）。これらのライブラリーの複雑度の差異の比較を容易にするために、あるライブラリーのシークエンスの終了後のクラスターデータだけでなく、５０００シークエンスに最も近い有効回数後のクラスターの数を示した。従来ベクターは、どの組織からも複雑で低重複性のｃＤＮＡライブラリーを与えなかった。これに対して、λ−ＦＣＬ−Ａ−Ｂ中へクローニングされた均等化／差引き化ｃＤＮＡライブラリーはすべて、従来ベクターでの均等化／差引き化されたライブラリー（平均、２０８９クラスター／４７７３反応；重複性、２．２８）より、高い複雑度（平均、３３９２クラスター／４８２６反応；重複性、１．４２）を示した。特定の器官における遺伝子発現の多様性（複雑度）を予測によって知ることは期待できないとしても、プールされた全「胎児１０＋１１」ライブラリー（表３）については、複雑度は非常に高いと推定された。しかし、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂへクローニングされ、比較的限られた生体現象をカバーする「胎児１３前肢」ライブラリーは、多くの発生中の器官やニューロン性組織を含むため、遺伝子の多様性も高いはずの「胎児１０＋１１」ライブラリーより高い複雑度を示した。
より直接的な比較は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）由来のライブラリーから得られる；これらのライブラリーはすべて、出発源を同じくするＲＮＡから調製されたものである。５１０４シークエンス反応後のクラスターの数（シークエンスしたサンプルの全体の数）は、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂクローン化ｃＤＮＡの場合、３０６８であるが、従来ベクター中のライブラリーの場合、５１６０シークエンス反応後２３６２に過ぎなかった。すなわち、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂを使うことによって３１％多いクラスターが発見された。この差は、さらにシークエンス反応回数が加わると、一層顕著になる：λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂに基づくライブラリーの場合、１０５１４シークエンス反応の後に４９７１クラスターがカテゴリー化され、そして、従来のＺＡＰベクターライブラリーでは１０４９２シークエンス反応の後に３７９５クラスターのみであり（図１４参照）；そして従来のＺＡＰベクターライブラリーでは１５５２０シークエンス経過で（４８％多）、わずか４５６６クラスター（９％少）であった（図１４参照）。また、両ＥＳ細胞ライブラリーは、同じドライバーにより均等化および軽度に差引き化されたにもかかわらず、Ｃ３ライブラリー（λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ中にあった）は、既にカテゴリー化された遺伝子類により差引かれたことも付記したい。強く差引かれたライブラリーは、遺伝子の種類が少ないであろうと予測されたが、そうではなかった。
これらのデータは、長いｃＤＮＡをクローニングする容量が、完全長アプローチが使われる場合、新しい遺伝子の発見を加速するという考えを支持している。加えて、マウスｃＤＮＡエンサイクロペディアの調製の過程で、λ−ＦＣＬベクターを導入したことが、高率の遺伝子発見を回復した（表３）。
また、λ−ＦＬＣに基づくライブラリーの５’端の読みにより同定された新遺伝子の割合が増加したことは、従来利用されているクローニングプロトコールやベクターは、短いｃＤＮＡの遺伝子発見にバイアスしていたことを示唆している。
本発明のλ−ＦＬＣベクターファミリーは、完全長ｃＤＮＡの高効率クローニング、遺伝子発見、および発現ベクターのような機能分析用のベクター中へ選択されたｃＤＮＡクローンをバルク転移するための、強力なツールであることが証明された。
実施例２０：λ−ＢＡＣベクター構築
（１）「成分１」（図９）の製造
１０μｇのｐＦＬＣ−III−ｅと称されるプラスミドを、１０ユニットの制限酵素ＢｓｓＨII（ＮＥＢとしても示される New England Biolabs）で、２０μｌの１ｘ供給（supplied）緩衝液（ＮＥＢ）中において３７℃で１時間消化した。ｐＦＬＣ−III−ｅ／ＢｓｓＨIIを、ＴＡＥ（トリス−アセテート−ＥＤＴＡ緩衝液，Sambrook et al., 1989）０．８％低融点アガロースゲル（SeaPlaque，ＦＭＣ）で５０Ｖにおいて１時間分離した（Sambrook et al., 1989 を参照されたい）。このプラスミドバンドを、ゲルから切り取り、β−アガラーゼ（New England Biolabs）で、製造者によって示唆されるように消化した（或いは、Sambrook et al., 1989 に記載される標準的な技法を用いることもできる）。
５ｋｂのスタッファーＩを、ゲルから切り取り、スライスした。このゲルを、１ｍｌの１ｘβ−アガラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と混合した。このゲルが入った試験管を氷上に３０分間置いて、１ｘβ−アガラーゼ緩衝液で平衡させた。この緩衝液を、ピペッティングによって試験管から除去し、新しい１ｘβ−アガラーゼ緩衝液を入れた。試験管を氷上に３０分間置いた。この緩衝液交換サイクルをもう１回繰り返した。緩衝液を除去し、試験管を６５℃で５分間インキュベートして、ゲルを溶融させた。１０ユニットのβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）をこの試験管に加え、５時間インキュベートした。標準的な技法（Sambrook et al., 1989）にしたがって、フェノール／クロロホルム抽出を行い、エタノールで沈殿させた。沈殿した５ｋｂフラグメントを、５μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）で溶解させ、「成分１」と表示した。
（２）「成分２」（図９）の製造
ＵＳ５，８７４，２５９号（本明細書中に援用される）の図１にしたがって製造されるｐＢｅｌｏＢＡＣ１１誘導体を、次の「成分２の製造」実験で用いた。ＵＳ５，８７４，２５９号の説明にしたがって、基本のｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Kim et al., 1996, Genomics, 34:213-218）を、次のようにして修飾した。ｏｒｉＶ要素（配列番号４３）およびＦＲＴ要素（配列番号４４）を互いに連結し、そして得られたフラグメントをブラントにし且つ末端にした後、ブラント末端にされたＸｈｏＩ部位中に連結した。二つの連結されたフラグメントの配向は、フラグメントがＸｈｏＩ部位中にクローン化された場合に、ｏｒｉが、近くのＦＲＴ部位とインサートクローニング部位との間に物理的に位置しているようにある。
３μｇのこのｐＢｅｌｏＢＡＣ１１誘導体（図９）を、１０Ｕの制限酵素ＳａｌＩ（ＮＥＢ）で、製造者によって推奨されるように３０μｌ中（供給緩衝液中、３７℃）で切断した後、１ユニットのＣＩＰ（Calf Intestinal Phosphatase）（Takara, Japan）を加えることによって３７℃で３０分間脱リン酸化し（クローニングバックグラウンドを減少させるための脱リン酸化の一般的な使用は、Sambrook et al., 1989 に開示されている）、次に、ＴＡＥ ０．８％低融点アガロース（SeaPlaque，ＦＭＣ）を用いて５０Ｖで１時間分離した（標準的な技法，Sambrook et al., 1989）。
図９に「成分２」として示されている６．７ｋｂのプラスミドフラグメントを含有するアガロースゲル領域を、ゲルから切り取り（約２００マイクロリットル）、１０ユニットのβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）で５時間消化し、フェノール／クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿を成分１の場合に示されたのと同様に行った。
（３）「成分３」（図９）の製造
５’末端がリン酸化された上方鎖：５’−ｐＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４５）および下方鎖５’−ＣＧＣＧＣＧＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４６）を含む二本鎖オリゴヌクレオチド「アダプター」（図９）を、自動合成機（標準的なプロトコールおよび試薬を用いるＥＸＰＥＤＩＴＥ８９０９）を用いてオリゴ合成して製造した。
（４）「成分１、２および３」の連結（図９）
「成分１」（ｐＦＬＣ−III−ｅ／ＢｓｓＨIIフラグメント）、「成分２」および「成分３」を、５０ｎｇ：３７ｎｇ：０．１ｎｇの比率で、１ｘ緩衝液（製造者ＮＥＢによって供給される１０ｘ原液から１／１０への希釈によって調製される）、４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）の存在下の５μｌの最終容量反応（１ｘ希釈緩衝液，ＤＮＡ，アダプター，ＤＮＡリガーゼ）中において互いに混合した。
この混合物を１６℃で一晩インキュベートして、連結反応を完了させた。
この連結反応中に０．２Ｍ最終濃度でＮａＣｌを添加後、これら連結反応生成物を、標準的な技法（Sambrook et al., 1989）にしたがって、２容量の９６％エタノールおよび１μｇの Glycogen（Roche）で沈殿させ、そして連結した生成物を、標準的なプロトコール（Sambrook et al., 1989）にしたがってエタノール沈殿によって回収した。これら連結反応生成物を、１０μｌのＨ２Ｏ中に溶解させた。
１μｌの回収された連結反応生成物を、２０μｌのＤＨ１０Ｂエレクトロコンポーネント細胞（Invitrogen）中に２．５ＫＶ．ｃｍ（Invitrogen の指示による）でエレクトロポレーション後、エレクトロポレーションされたプラスミド細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天上にプレーティングした。修飾ｐＢＡＣを有する、所望のインサートを含むコンストラクト（「成分１」）を有するポジティブクローンを選択するために、無作為に採取されたクローンを培養し且つプラスミドを調べた（リコンビナントプラスミドを選択し且つ分析する一般的な戦略については、Sambrook et al. を参照されたい）。図１ｅにインサートとして示されているスタッファーＩを有するプラスミド（図９の修飾ｐＢＡＣ）を、次の工程のために選択した。
（５）ｌｏｘＰ部位およびＸｂａＩ部位の導入（図１０）
上のように製造された修飾ｐＢＡＣ中にｌｏｘＰ部位およびＸｂａＩ部位を導入するために、１μｇの修飾ｐＢＡＣを、０．５μＭの「プライマー１」
（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴＧ−３’）（配列番号４７）、０．５μＭの「プライマー２」：
（５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴ−３’）（配列番号４８）、１２５μＭのｄＮＴＰ混合物、１ｘ「ＧＣ緩衝液１」（Takara, Japan）、５ユニットのＬＡ−Ｔａｑ（Takara, Japan）と一緒に５０μＬの容量で混合した。
次に、次のＰＣＲ増幅サイクルを２５回繰り返した。工程１：９４℃５秒間；工程２：５０℃５秒間、７２℃１２分間。
増幅後、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳおよび１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ原液）（Sigma）を、得られたＰＣＲ産物に加え、４５℃で１５分間インキュベートした後、フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム抽出、次にエタノール沈殿を行った（Sambrook et al., 1989）。エタノール沈殿後、ペレットを水で溶解させ、そして製造者（ＮＥＢ）によって供給される緩衝液中において５ユニットの制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）で切断した。ＴＡＥ ０．８％低融点アガロースゲル（SeaPlaque，ＦＭＣ）での５０Ｖにおいて１時間の電気泳動分離後、ＰＣＲ産物を精製した（Sambrook et al., 1989）。このＰＣＲ産物を切断し、製造者によって示唆されるように１０ユニットのβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）で消化した（或いは、Sambrook et al., 1989 に開示される標準的な技法を用いることもできる）。
１１．７ｋｂのＰＣＲ産物を、ゲルから切り取り、スライスした。このゲルを、１ｍｌの１ｘβ−アガラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と混合した。このゲルが入った試験管を氷上に３０分間置いて、１ｘβ−アガラーゼ緩衝液で平衡させた。この緩衝液を試験管から除去し、新しい１ｘβ−アガラーゼ緩衝液を入れた。試験管を氷上に３０分間置いた。この緩衝液交換サイクルをもう１回繰り返した。緩衝液を除去し、試験管を６５℃で５分間インキュベートして、ゲルを溶融させた。１０ユニットのβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）をこの試験管に加え、５時間インキュベートした。標準的な技法（Sambrook et al., 1989）にしたがって、フェノール／クロロホルム抽出を行い、エタノールで沈殿させた。沈殿した１１．７ｋｂフラグメントを、５μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）で溶解させ、「成分４」と表示した（図１０）。
（６）スタッファーII（「成分５」）の製造（図１１）
サイズバランサーとしての１．８ｋｂスタッファー（「スタッファーII」としても示される）を製造するために、３μｇのマウスゲノムＤＮＡを、２０ユニットのＳａｕ３ＡＩおよび１ｘ供給緩衝液（Nippon Gene, Japan）で、２０μｌの容量中において３７℃で２時間消化した。消化したＤＮＡを、λ／ＳｔｙＩ分子マーカー（Nippon Gene, Japan）と共に１．２％低融点アガロースゲルで、５０Ｖにおいて２時間分離した。約１ １．８ｋｂのサイズを示す、移動したＤＮＡフラグメントを、ゲルから切り取り、スライスした。このゲルを、１ｍｌの１ｘβ−アガラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と混合した。このゲルが入った試験管を氷上に３０分間置いて、１ｘβ−アガラーゼ緩衝液で平衡させた。この緩衝液を試験管から除去し、新しい１ｘβ−アガラーゼ緩衝液を入れた。試験管を氷上に３０分間置いた。この緩衝液交換サイクルをもう１回繰り返した。緩衝液を除去し、試験管を６５℃で５分間インキュベートして、ゲルを溶融させた。１０ユニットのβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）をこの試験管に加え、５時間インキュベートした。標準的な技法（Sambrook et al., 1989）にしたがって、フェノール／クロロホルム抽出を行い、エタノールで沈殿させた。沈殿した１．８ｋｂスタッファーII ＤＮＡを、１０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）で溶解させた。
精製された１．８ｋｂ ＤＮＡ（１００ｎｇ）と、上方鎖：５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＣＣＡ−３’（配列番号４９）および下方鎖：５’−ＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＴ−３’（配列番号５０）を含む１０ｎｇのＳａｕ３ＡＩ／ＸｂａＩアダプターとを、１ｘ連結反応緩衝液（上記のように原液を希釈した）および４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）の存在下、５μｌの最終容量中において１６℃で１６時間連結した。６５℃で５分間のリガーゼ失活後、これら連結反応生成物を、ＴＡＥ １．２％低融点アガロースゲル（SeaPlaque，ＦＭＣ）によって５０Ｖで１時間分離し（Sambrook et al., 1989）、再度、１．８ｋｂ ＤＮＡを切り出し、製造者によって示唆されるようにβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）で消化した（或いは、Sambrook et al., 1989 に記載される技法を用いることができる）。
１．８ｋｂのＰＣＲ産物を、ゲルから切り取り、スライスした。このゲルを、１ｍｌの１ｘβ−アガラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と混合した。このゲルが入った試験管を氷上に３０分間置いて、１ｘβ−アガラーゼ緩衝液で平衡させた。この緩衝液を試験管から除去し、新しい１ｘβ−アガラーゼ緩衝液を入れた。試験管を氷上に３０分間置いた。この緩衝液交換サイクルをもう１回繰り返した。緩衝液を除去し、試験管を６５℃で５分間インキュベートして、ゲルを溶融させた。１０ユニットのβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）をこの試験管に加え、５時間インキュベートした。標準的な技法（Sambrook et al., 1989）にしたがって、フェノール／クロロホルム抽出を行い、エタノールで沈殿させた。沈殿した１．８ｋｂフラグメントを、５μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）で溶解させた。
１．８ｋｂの精製ＤＮＡを、０．５μＭのＸｂａＩプライマー（５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＣＣＡ−３’）（配列番号４９）、１２５μＭのｄＮＴＰ混合物、１ｘＧＣ緩衝液Ｉ（Takara, Japan）、５ユニットのＬＡ−Ｔａｑ（Takara）を用いて５０μＬの最終容量中で増幅させた。
ＤＮＡのＰＣＲ増幅のために、次のサイクルを２５回繰り返した。工程１：９４℃５秒間；工程２：６８℃１．５分間。
増幅後、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳおよび１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ原液）（Qiagen）を、得られたＰＣＲ産物に加え、４５℃で１５分間インキュベートした後、フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム抽出、次にエタノール沈殿を行った（Sambrook et al., 1989）。エタノール沈殿後、ペレットを水で溶解させ、そして製造者（ＮＥＢ）によって供給される緩衝液中において１５ユニットの制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）で切断した。
ＰＣＲ産物／ＸｂａＩを、ＴＡＥ ０．８％低融点ゲルで５０Ｖにおいて１時間分離し、１．８ｋｂ ＤＮＡフラグメントを切り取った。このＤＮＡフラグメントを、製造者によって示唆されるようにβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）で消化した。
１．８ｋｂのＰＣＲ産物を、ゲルから切り取り、スライスした。このゲルを、１ｍｌの１ｘβ−アガラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と混合した。このゲルが入った試験管を氷上に３０分間置いて、１ｘβ−アガラーゼ緩衝液で平衡させた。この緩衝液を試験管から除去し、新しい１ｘβ−アガラーゼ緩衝液を入れた。試験管を氷上に３０分間置いた。この緩衝液交換サイクルをもう１回繰り返した。緩衝液を除去し、試験管を６５℃で５分間インキュベートして、ゲルを溶融させた。１０ユニットのβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）をこの試験管に加え、５時間インキュベートした。標準的な技法（Sambrook et al., 1989）にしたがって、フェノール／クロロホルム抽出を行い、エタノールで沈殿させた。沈殿した１．８ｋｂフラグメントを、５μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）で溶解させた。
精製されたＰＣＲ産物／ＸｂａＩを、「成分５」と命名した（図１１を参照されたい）。
（７）「成分６」の製造（図１２）
１０μｇの（直鎖状）λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅ（図２ａ）の付着末端（ｃｏｓ末端）は、１８０μｌの１０ｍＭトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、およびＮＥＢによって提供される２０μＬの１０ｘ連結反応緩衝液中において４２℃で２時間のインキュベーションによってアニーリングした（二つの相補的ｃｏｓ末端およびこれら末端は、この処理後に互いにアニーリングするが、これは、後の工程での連結効率を増加させ且つ追加の手順を簡単にする）。４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）をこの溶液に加え、そしてこの試料を室温で５時間インキュベート後、６５℃で１５分間のリガーゼ失活を行った。前の工程で連結されたｃｏｓ末端を含むλＤＮＡを、５ユニットのＸｂａＩ（Nippon Gene, Japan）、１ｘ製造者供給緩衝液で、５０μｌの容量中において３７℃で２時間消化した。消化後、１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１μｌの１０％ＳＤＳおよび１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ原液）（Qiagen）を、得られたＤＮＡに加え、４５℃で１５分間インキュベートした後、フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム抽出、次にエタノール沈殿を行った（Sambrook et al., 1989）。エタノール沈殿後、試験管を氷上で保持しながら、ペレットを水で３０分間溶解させ、消化したＤＮＡを、ＴＡＥ ０．６％低融点アガロースゲル中において５０Ｖで５時間分離した。ｃｏｓ連結フラグメント（２９ｋｂｐ）を、ゲルから切り取り、スライスした。このゲルを、１ｍｌの１ｘβ−アガラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と混合した。このゲルが入った試験管を氷上に３０分間置いて、１ｘβ−アガラーゼ緩衝液で平衡させた。この緩衝液を試験管から除去し、新しい１ｘβ−アガラーゼ緩衝液を入れた。試験管を氷上に３０分間置いた。この緩衝液交換サイクルをもう１回繰り返した。緩衝液を除去し、試験管を６５℃で５分間インキュベートして、ゲルを溶融させた。１０ユニットのβ−アガラーゼ（ＮＥＢ）をこの試験管に加え、５時間インキュベートした。標準的な技法（Sambrook et al., 1989）にしたがって、フェノール／クロロホルム抽出を行い、エタノールで沈殿させた。沈殿した２９ｋｂのｃｏｓ連結フラグメントを、５μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）で溶解させ、「成分６」と命名した（図１２）。
（８）「成分４、５および６」の連結（図１２）
「成分４」（修飾ｐＢＡＣ）、「成分５」（スタッファー）および「成分６」（アーム）を、次の、１２０ｎｇ：１９ｎｇ：３００ｎｇの比率で、１ｘ連結反応緩衝液（ＮＥＢ連結反応緩衝液）および４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼＮＥＢの存在下の５μｌ中において１６℃で１６時間混合した。
in vitro パッケージング（"MaxPlaxＴＭ Lambda Packaging Extract", ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Madison ＷＩ，ＵＳ）およびリコンビナントλファージ（Sambrook et al., 1989 に記載のような）のプレーティング後、数百プラークのλファージを得た。
Sambrook et al., 1989 に記載の方法にしたがって、５クローン（ファージプラーク）を無作為に選択した。
これら採取されたファージプラークを、ＳＭ緩衝液（Sambrook et al., 1989）中に入れ、室温で１時間放置した。次に、溶離したファージ溶液を用いて、Ｃ６００細胞に感染させ、そして標準的なプロトコール（Sambrook et al., 1989）にしたがって増幅させた。
５クローンの内の３クローンにおいて、本発明者は、制限酵素（ＸｂａＩ＋ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ，ＸｂａＩ＋ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ＋ＳａｌＩ）での分析によって所望のインサート（「成分１」に該当する）を得た（Sambrook et al., 1989）。このクローンの内の一つは、λ−ＦＬＣ−III−ｐＢＡＣ（図１２）と称され、他の記載されたλベクター（例えば、λ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂ、λ−ＦＬＣ−II−Ｃ、λ−ＦＬＣ−III−Ｆ）の同じクローニング領域を示し、０．２〜１５．４ｋｂであった。

図１は本発明のベクターファミリーの全体図である。本研究では、下記の機能性エレメント（尺度どおりでない）を産生した。図１（ａ）には、ベクター構築セグメント（ＣＳ）の機能性エレメントが示され、それらは：左および右アーム；クローニングサイズレギュレーター（またはスタッファーII）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのプラスミド誘導体；およびバルク切出しエレメント（組換えサイト）ｌｏｘＰであり；構築セグメント（ＣＳ）のサイズは３２から３８．３ｋｂの間である。可換ベクターセグメント（スタッファーＩまたはＲＳとして示す）は、切出しＧａｔｅｗａｙＴＭセグメント（ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２）により隣接されている；これはｃＤＮＡにより交換されるセグメントである。 図１（ａ）の右側には、ｃｒｅ−ｌｏｘ系によるプラスミド切出しの機構、またはＧａｔｅｗａｙＴＭ系によるデスティネーションまたは受取りベクターへのｃＤＮＡ挿入体の切出しを示す。 図１（ｂ）−（ｆ）には、スタッファーＩ（ＲＳ）のさまざまな構築およびサイズを示し：（ｂ）はλ−ＰＳベクターからの１０Ｋｂである；（ｃ）はアーム精製を簡略化するためのスタッファーＩの短縮版である；（ｄ）はバックグラウンドをカットするため４つのｃｃｄＢおよび２つのＬａｃＺをもつ１０Ｋｂスタッファーである；（ｅ）は２つのｃｃｄＢおよび１つのＬａｃＺをもつ５Ｋｂスタッファーである；（ｆ）はｃｃｄＢおよびｌｏｘＰ二重バックグラウンドカッティング用のスタッファーである。 特に、（ｇ）には、増殖を阻害するｃｃｄＢ遺伝子を含むが、一方、ＬａｃＺ（ｈ）は色選択を可能にする、非組換え体プラスミドを示す。（ｉ）には、複製起点と耐性遺伝子とを分離するｌｏｘＰサイトを用いたバックグラウンド低減系を示す。 略号：Ｓｗ＝ＳｗａＩ，Ｓｆ＝ＳｆｉＩ，Ｓｐ＝ＳｐｅＩ，Ｆｓ＝ＦｓｅＩ，Ｐａ＝ＰａｃＩ，Ｘａ＝ＸｂａＩ。 ＰａｃＩ，ＦｓｅＩ，ＳｆｉＩ，ＳｗａＩ，およびクローニングサイトは、示されたサイトのみを切断し、ベクター中の他の部位は切断しない。 本発明のベクターのいくつかの構築を、簡略化のために、λ−ＦＬＣの属名を使って示す。（ａ）それぞれ図１ｂおよびの１ｅスタッファーＩをもつλＦＬＣ−Ｉ−Ｂおよびλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｅ。（ｂ）スタッファーIIを欠き、それぞれ図１ｂおよび１ｄのスタッファーＩをもつλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｂおよびλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｌ−Ｄで、（ａ）と同じクローニングサイトをもつ。（ｃ）クローンのバルク転移用のＧａｔｅｗａｙＴＭａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列をもつλ−ＦＬＣ−II−Ｃ；これは図１ｃと同様のスタッファーＩをもつ。（ｄ）バックグラウンド低減用に図１ｆと同様なスタッファーＩをもつλ−ＦＬＣ−III−Ｆ。（ｅ）スタッファーIIを欠き、図１ｄと同様なスタッファーＩをもつλ−ＦＬＣ−III−Ｌ−Ｄ。（f）図１ｆと同様なスタッファーＩをもつが、より長いスタッファーII（６．３Ｋｂ）をもつλ−ＦＬＣ−III−Ｓ−Ｆ。 ベクター（ｄ−ｅ）これらのベクターは、挿入体の他のベクターへの転移を容易にするために、クローニングサイトの隣にホーミングエンドヌクレアーゼ用のサイト（Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ）をもつ；当該クローニングサイトは（ｄ）にのみ示す。 ベクター（ｇ−ｊ）は、スタッファーＩ（図１ｂ−ｆに示した）またはｃＤＮＡ（星印の配列で示される）に隣接して左右に位置するポリリンカー配列を示す。当該ポリリンカー中の下線配列はプライマー、組換えサイト、制限サイトなどを表す。これらの制限サイトは、当該λベクターまたはプラスミドの他の部位を全く切断しない。より具体的には、ｐＦＬＣ−Ｉ中で、左ポリリンカー（配列番号１）は：Ｆｏｒｗａｒｄ（Ｆｗｄ） Ｍ１３プライマーサイト、Ｔ７ポリメラーゼ用のサイト、組換えサイトｌｏｘＰ、制限サイトＳｆｉＩおよびＳａｌＩを含み；右ポリリンカー（配列番号２）は：制限サイトＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩ、Ｔ３ポリメラーゼ用のサイト、Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒｅｖ） Ｍ１３プライマーサイトを含む。ｐＦＬＣ−II中では、左ポリリンカー（配列番号３）は：Ｆｗｄ Ｍ１３プライマーサイト、Ｔ７，ａｔｔＢ１，ＸｈｏＩおよびＳａｌＩを；右ポリリンカー（配列番号４）は：ＢａｍＨＩ，ａｔｔＢ２，ｌｏｘＰ，Ｔ３，Ｒｅｖ Ｍ１３プライマーサイトを含む。ｐＦＬＣ−IIIでは、左ポリリンカー（配列番号５）は：Ｆｗｄ Ｍ１３プライマーサイト、Ｔ３，Ｉ−ＣｅｕＩ，ＳａｌＩ；右ポリリンカー（配列番号６）は：ＢａｍＨＩ，ＰＩ−ＳｃｅＴ７，Ｒｅｖ Ｍ１３プライマーサイトを含む。ｐＦＬＣ−ＤＥＳＴでは、左ポリリンカー（配列番号７）は：Ｆｗｄ Ｍ１３プライマーサイト、Ｔ３，ａｔｔＢ１，ＸｈｏＩ，ＳａｌＩ；右ポリリンカー（配列番号８）は：ＢａｍＨＩ，ａｔｔＢ２，Ｔ７，Ｒｅｖ Ｍ１３プライマーサイトを含む。 図２ｈの一般のｐＦＬＣ−ＩＩ（すなわち、特定のスタッファーＩまたは“挿入体ｃＤＮＡ”には言及しない）は修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫを用いて構築することができる。この構築体を有する一般のｐＦＬＣ−ＩＩは図１３に示し、そして全体の配列（スタッファーＩまたは“挿入体ｃＤＮＡ”は除く）は配列番号５１に示した。 ベクター（ｇ−ｊ）は、スタッファーＩ（図１ｂ−ｆに示した）またはｃＤＮＡ（星印の配列で示される）に隣接して左右に位置するポリリンカー配列を示す。当該ポリリンカー中の下線配列はプライマー、組換えサイト、制限サイトなどを表す。これらの制限サイトは、当該λベクターまたはプラスミドの他の部位を全く切断しない。より具体的には、ｐＦＬＣ−Ｉ中で、左ポリリンカー（配列番号１）は：Ｆｏｒｗａｒｄ（Ｆｗｄ） Ｍ１３プライマーサイト、Ｔ７ポリメラーゼ用のサイト、組換えサイトｌｏｘＰ、制限サイトＳｆｉＩおよびＳａｌＩを含み；右ポリリンカー（配列番号２）は：制限サイトＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩ、Ｔ３ポリメラーゼ用のサイト、Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒｅｖ） Ｍ１３プライマーサイトを含む。ｐＦＬＣ−II中では、左ポリリンカー（配列番号３）は：Ｆｗｄ Ｍ１３プライマーサイト、Ｔ７，ａｔｔＢ１，ＸｈｏＩおよびＳａｌＩを；右ポリリンカー（配列番号４）は：ＢａｍＨＩ，ａｔｔＢ２，ｌｏｘＰ，Ｔ３，Ｒｅｖ Ｍ１３プライマーサイトを含む。ｐＦＬＣ−IIIでは、左ポリリンカー（配列番号５）は：Ｆｗｄ Ｍ１３プライマーサイト、Ｔ３，Ｉ−ＣｅｕＩ，ＳａｌＩ；右ポリリンカー（配列番号６）は：ＢａｍＨＩ，ＰＩ−ＳｃｅＴ７，Ｒｅｖ Ｍ１３プライマーサイトを含む。ｐＦＬＣ−ＤＥＳＴでは、左ポリリンカー（配列番号７）は：Ｆｗｄ Ｍ１３プライマーサイト、Ｔ３，ａｔｔＢ１，ＸｈｏＩ，ＳａｌＩ；右ポリリンカー（配列番号８）は：ＢａｍＨＩ，ａｔｔＢ２，Ｔ７，Ｒｅｖ Ｍ１３プライマーサイトを含む。 図２ｈの一般のｐＦＬＣ−ＩＩ（すなわち、特定のスタッファーＩまたは“挿入体ｃＤＮＡ”には言及しない）は修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫを用いて構築することができる。この構築体を有する一般のｐＦＬＣ−ＩＩは図１３に示し、そして全体の配列（スタッファーＩまたは“挿入体ｃＤＮＡ”は除く）は配列番号５１に示した。 切出しプロトコールを示す。左から右へ、ｉｎ ｖｉｖｏ固相Ｃｒｅリコンビナーゼ（現行技術）、ｉｎ ｖｉｖｏ液相Ｃｒｅリコンビナーゼ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｒｅリコンビナーゼの各プロトコールが示され、さらにそれらの右側に、ＧａｔｅｗａｙＴＭ（ＧＷ）配列により仲介される「直接」、「間接」、「増幅間接」プロトコールが示されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ切出し用の酵素類も示されている。 λ−ＺａｐIIまたはλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂにより調製され、得られたｃＤＮＡライブラリーの平均サイズを示す。 図５は、本発明の可能なベクター構築を示す。 本発明のベクターは、構築セグメント（ＣＳ）として示される第１セグメントおよび可換セグメント（ＲＳ）として示される第２セグメントを含み、環状または直線状でもよい。直線状の形態では、ベクターの構築セグメント（ＣＳ）は左セグメントおよび右セグメントを含んで示されている。ＲＳは、興味ある核酸挿入体、例えば、完全長ｃＤＮＡで交換される。 本は発明のベクターは、環状または直線状でもよい。 （ａ）および（ｂ）には、ＧａｔｅｗａｙＴＭ組換え／切出し系（ＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ， ＧＩＢＣＯＢＲＬＲ，Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＲ）に従い、ＲＳに隣接し、相互に組換えない組換えサイト（ここでは一般的にａｔｔ１およびａｔｔ２と示す）を示す。 （ｃ）および（ｄ）では、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え機構のために相互に組換えする組換えサイト（この場合はｌｏｘサイト）がＣＳ中に存在する。 （ｅ）および（ｆ）では、ＲＳに隣接するＧａｔｅｗａｙ様サイトとｌｏｘサイト（（ｃ）および（ｄ）に示す）ような組換えサイトは、同時に存在することが可能であることが示されている。 （ｇ）では、ＲＳに隣接する組換えサイトは、相互に組換えしない２つのｌｏｘサイトである。それらはＧａｔｅｗａｙサイトと同様に働く。 （ｈ）には、バックグラウンド低減配列として、ＲＳ中の遺伝子ｃｃｄＢの存在を示す。 （ｉ）には、ＣＳ中のｌｏｘサイト配列と組換えができるバックグラウンド低減配列として、「第３の」ｌｏｘ組換えサイトの存在を示す。 ２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列（ａ）の作用の機構を示す。相互に連結できないこれら２つの配列は、連結過程の際にＲＳに隣接して位置される。これらの配列のそれぞれは、興味ある核酸挿入体（ｂ）に隣接する１つの配列を認識して連結する。ベクター・挿入体連結のみが許容される。挿入体・挿入体またはベクター・ベクター連結は、このように避けられる。 図７は、λ−ＦＬＣ−III−Ｆの製造例を記載している。スタッファーＩｆは、図１ｆのスタッファーＩである。 図８は、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩを用いた具体的な実施例における非対称認識部位配列の切除例を開示している。 図９は、λ−ＢＡＣベクターの製造用の修飾ｐＢＡＣの製造を記載している。このプロセスの詳細な説明は、実施例２０に開示されている。 図１０は、図７の修飾ｐＢＡＣ中へのｌｏｘＰ部位およびＸｂａＩ部位の挿入を記載している。このプロセスの詳細な説明は、実施例２０に開示されている。 図１１は、スタッファーII（「成分５」）の製造工程を含むチャートを記載している。このプロセスの詳細な説明は、実施例２０に開示されている。 図１２は、λ−ＦＬＣ−III−ｐＢＡＣの製造工程を含むチャートを記載している。このプロセスの詳細な説明は、実施例２０に開示されている。 図１３は、図２ｈに記載のような一般的なｐＦＬＣ−IIの一例の完全ヌクレオチド配列を（すなわち、スタッファーＩまたは「インサートｃＤＮＡ」の配列を示すことなく）報告している。「インサートｃＤＮＡ」またはスタッファーＩ（図２ｈに星印の線で示される）は、図１３に、配列ＣＴＣＧＡＧ------ＧＧＡＴＣＣの間の線で示されている。一般的なｐＦＬＣ−IIのこのコンストラクトは、修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（＋）である。 図１３のプラスミドの配列は、配列番号５１に、配列ＧＧＡＴＣＣ（上記）から出発し且つ配列ＣＴＣＧＡＧ（上記）で終結する単一配列として、したがって、具体的なスタッファーＩまたはクローニングｃＤＮＡの配列を示すことなく示されている。 図１４は、本発明のクローニングベクターλ−ＦＬＣ−Ｉ−Ｂと慣用的なＺＡＰベクターとを、クローニング効率について比較しているグラフである。

Claims (63)

  1. 以下：
    （ａ）構築セグメント（ＣＳ）、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つのｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、当該ｌｏｘ組換えサイトは相互に組換えできる；および
    （ｂ）興味ある核酸挿入体により置換された又は置換される可換セグメント（ＲＳ）、ここで当該ＲＳは以下：
    ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列；
    ｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列；
    ｉｉｉ）相互に組換えをしない、２つのａｔｔ組換えサイト；および
    ｉｖ）相互に組換えをしない、２つのｌｏｘ組換えサイト；
    からなる群より選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    を含む、バクテリオファージクローニングベクター。
  2. ＣＳが３７．５ｋｂである、請求項１に記載のクローニングベクター。
  3. ＣＳが、５．５ｋｂの外来セグメントを含む、請求項２に記載のクローニングベクター。
  4. バクテリオファージがλである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  5. ＣＳが、少なくともｏｒｉを有するプラスミドセグメントをさらに含むバクテリオファージベクターセグメントである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  6. 少なくともｏｒｉを有するプラスミドセグメントが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＡＣの群から選ばれる、請求項５に記載のクローニングベクター。
  7. 有毒な化合物に対する耐性を付与する産物をコードするＤＮＡセグメント；遺伝子産物の活性を抑圧する産物をコードするＤＮＡセグメント；識別可能な産物をコードするＤＮＡセグメント；細胞機能を阻害する産物をコードするＤＮＡセグメント；所望の分子の単離を可能にするためのＤＮＡセグメント；および、酵素により認識される特定のヌクレオチド認識配列をコードするＤＮＡセグメント；からなる群より選択される少なくとも一つの選択マーカーを、ＣＳがさらに含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  8. 選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、酵素切断サイト、タンパク質結合サイト、およびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列、からなる群より選択される少なくとも一つのマーカーを含む、請求項７に記載のクローニングベクター。
  9. ＲＳが、ａ）ｃｃｄＢ遺伝子、ｂ）ｌａｃＺ遺伝子、およびｃ）組換えサイトからなる群より選択される、少なくとも１つのバックグラウンド低減配列をさらに含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  10. 組換えサイトがｌｏｘ組換えサイトである、請求項９に記載のクローニングベクター。
  11. ｌｏｘ組換えサイトがｌｏｘＰサイトである、請求項１０に記載のクローニングベクター。
  12. ＲＳに隣接する２つの切出しエレメントが、ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列；またはｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列；である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  13. ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、およびＩ−ＳｃｅＩからなる群より選択される、請求項１ないし１２のい ずれか１項に記載のクローニングベクター。
  14. ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列が、１８から３９ｂｐの配列である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  15. ＲＳに隣接する２つのａｔｔ組換えサイトが、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲからなる群より選択される、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  16. ＲＳに隣接する２つのｌｏｘ組換えサイトが、ｌｏｘＰサイトである、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  17. ＣＳに含まれる２つのｌｏｘ組換えサイトがｌｏｘＰサイトである、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  18. ＣＳに含まれる２つのｌｏｘ組換えサイトがｌｏｘＰサイトであり、そしてＲＳがバックグラウンド低減配列としてｌｏｘ組換えサイトをさらに含む、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  19. 直鎖状である、請求項１ないし１８のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  20. 核酸挿入体が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからなる群より選択される、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  21. 核酸挿入体が完全長ｃＤＮＡである、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のクローニングベクター。
  22. 完全長ｃＤＮＡが、均等化および／または差引き化完全長ｃＤＮＡである、請求項２１に記載のクローニングベクター。
  23. 以下：
    （ａ）構築セグメント（ＣＳ）、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つのｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、当該ｌｏｘ組換えサイトは相互に組換えできる；および
    （ｂ）興味ある核酸挿入体により置換された又は置換される可換セグメント（ＲＳ）、ここで当該ＲＳは以下：
    ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列；
    ｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列；
    ｉｉｉ）相互に組換えをしない、２つのａｔｔ組換えサイト；および
    ｉｖ）相互に組換えをしない、２つのｌｏｘ組換えサイト；
    からなる群より選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    を含むバクテリオファージクローニングベクターであって、
    ここで当該ＲＳはｃＤＮＡにより置換される第一のスタッファーセグメントを含み、そして当該ＣＳは６．０ｋｂまでの第二のスタッファー断片を含んでいても、含んでいなくてもよく、そしてここで当該バクテリオファージクローニングベクターは、当該第二のスタッファー断片が５．５ｋｂの長さである場合に６ｋｂないし１０ｋｂの長さのｃＤＮＡを優先的にクローニングし、そして当該第二のスタッファー断片が６．０ｋｂの長さである場合に２ｋｂの長さのｃＤＮＡを優先的にクローニングする、
    前記バクテリオファージクローニングベクター。
  24. 興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、
    （１）構築セグメント（ＣＳ）および興味ある核酸挿入体により置換される可換セグメント（ＲＳ）を含むバクテリオファージクローニングベクターを調製する、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つの相互に組換えできるｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、そしてここで当該ＲＳは以下：ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、ｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切 断サイト配列、ｉｉｉ）相互に組換えをしない、２つのａｔｔ組換えサイト、およびｉｖ）相互に組換えをしない、２つのｌｏｘ組換えサイト、からなる群より選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    （２）前記クローニングベクター中のＲＳを、興味ある核酸挿入体と置換する；
    （３）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含むプラスミドの、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しを行う；
    （４）興味ある核酸挿入体をもつ（組換え体）プラスミドまたはそれらのプラスミドのライブラリーを回収する；
    工程を含む、前記方法。
  25. 工程（２）および（３）の間に当該クローニングベクターの増幅の工程が行われる、請求項２４に記載の方法。
  26. 興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、
    （１）構築セグメント（ＣＳ）および興味ある核酸挿入体により置換される可換セグメント（ＲＳ）を含むバクテリオファージクローニングベクターを調製する、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つの相互に組換えできるｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、そしてここで当該ＲＳはｃｃｄＢ遺伝子を含み、そしてＲＳは以下：ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、ｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列、ｉｉｉ）相互に組換えをしない、２つのａｔｔ組換えサイト、およびｉｖ）相互に組換えをしない、２つのｌｏｘ組換えサイト、からなる群より選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    （２）当該クローニングベクター中へ興味ある核酸挿入体でＲＳを置換する；
    （３）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含むプラスミドの、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しを行う；
    （４）興味ある核酸挿入体をもち、かつｃｃｄＢ遺伝子を欠く（組換え体）プラスミドまたはそれらのプラスミドのライブラリーを回収する；
    工程を含む、前記方法。
  27. 工程（３）において、相互に連結または組換えを起こさない２つの組換えサイトにより隣接されしかもｃｃｄＢ遺伝子を含むデスティネーション可変セグメント（ＲＳ）、を含む少なくとも１つのデスティネーションベクターを工程（２）のクローニングベクターに配備することにより、興味ある核酸挿入体のｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しを可能にし、そして工程（４）において前記興味ある核酸挿入体をもち、前記ｃｃｄＢ遺伝子を欠く組み換え体プラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  28. 工程（２）および（３）の間に当該クローニングベクターの増幅の工程が行われる、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. 工程（１）のクローニングベクターおよび工程（４）のデスティネーションベクターの両者のＲＳに隣接する前記２つの組換えサイトが、ａｔｔＢ，ａｔｔＰ，ａｔｔＬ，およびａｔｔＲからなる群より選択された組換えサイトに由来する、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. ＲＳに隣接する組換えサイトが、ｌｏｘ組換えサイトであり、かつ相互に組換えを起こさない、請求項２７または２８に記載の方法。
  31. ｌｏｘ組換えサイトがｌｏｘＰサイトである、請求項３０に記載の方法。
  32. 興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、
    （１）構築セグメント（ＣＳ）および興味ある核酸挿入体により置換される可換セグメント（ＲＳ）を含むバクテリオファージクローニングベクターを調製する、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つの相互に組換えで きるｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、そしてここで当該ＲＳはＣＳ中へ置かれる前記２つのｌｏｘ組換えサイトの１つと組換え可能な組換えサイトを含み、そしてＲＳは以下：ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、ｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列、ｉｉｉ）相互に組換えをしない、２つのａｔｔ組換えサイト、およびｉｖ）相互に組換えをしない、２つのｌｏｘ組換えサイト、からなる群より選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    （２）前記クローニングベクター中のＲＳを、興味ある核酸挿入体で置換する；
    （３）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含むプラスミドの、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しを行う；
    （４）興味ある核酸挿入体をもつ（組換え体）プラスミドまたはそれらのプラスミドのライブラリーを回収する；
    工程を含む、前記方法。
  33. 前記ＣＳおよびＲＳ中に含まれるｌｏｘ組換えサイトがｌｏｘＰサイトである、請求項３２に記載の方法。
  34. 興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、
    （１）構築セグメント（ＣＳ）および興味ある核酸挿入体により置換される可換セグメント（ＲＳ）を含むバクテリオファージクローニングベクターを調製する、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つの相互に組換えできるｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、そしてここで当該ＲＳは以下：ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、またはｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列、から選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    （２）興味ある核酸挿入体であって、当該興味ある挿入体に隣接する２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、または、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列を含み、当該配列が工程（１）のベクター中へ挿入された２つの配列と連結できる、前記挿入体でＲＳを置換し、そして前記興味ある核酸挿入体を含むベクターを得る；
    （３）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含むプラスミドの、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しを行う；
    （４）興味ある核酸挿入体を含む（組換え体）切出しプラスミド、デスティネーションプラスミド、または前記プラスミドのライブラリーを回収する；
    工程を含む、前記方法。
  35. 前記非対称サイト配列を切断できるホーミングエンドヌクレアーゼ類が、Ｉ−ＣｅｕＩ，ＰＩ−ＳｃｅＩ，ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＩ−ＳｃｅＩからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列が１８から３９ｂｐである、請求項３４に記載の方法。
  37. 興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、
    （１）構築セグメント（ＣＳ）および興味ある核酸挿入体により置換される可換セグメント（ＲＳ）を含むバクテリオファージクローニングベクターを調製する、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つの相互に組換えできるｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、そしてここで当該ＲＳは以下：ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、ｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列、ｉｉｉ）相互に組換えをしない、２つのａｔｔ組換えサイト、およびｉｖ）相互に組換えをしない、２つのｌｏｘ組換えサイト、からなる群より選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    （２）当該クローニングベクター中のＲＳを興味ある核酸挿入体で置換する；
    （３）当該ベクターをパッケージングする、
    （４）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する少なくとも１つの細胞をｉｎ ｖｉｖｏで液相感染させる；
    （５）切出しプラスミドが短期増殖するまたは増殖しない条件下で、興味ある核酸挿入体を含む少なくとも１つのプラスミドのｉｎ ｖｉｖｏ液相切出しを行う；
    （６）細胞溶解、および挿入体をもつプラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーの回収を行う；
    工程を含む、前記方法。
  38. さらに以下の工程：
    （７）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しない少なくとも１つの細胞を電気穿孔するかまたは形質転換して、当該細胞中へ工程（６）のプラスミドを貫入させる、
    （８）工程（７）におけるように感染された細胞を平板培養（プレーティング）し、興味ある核酸挿入体をもつプラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する；
    を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. バクテリオファージがλである、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 前記ＣＳに含まれるｌｏｘ組換えサイトがｌｏｘＰサイトである、請求項３７ないし３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 工程（３）および（４）の間にパッケージされたベクターの増幅が行われる、請求項３７ないし４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 工程（５）が、２０℃から４５℃の温度において、０から３時間行われる、請求項３７ないし４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、
    （１）構築セグメント（ＣＳ）および興味ある核酸挿入体により置換される可換セグメント（ＲＳ）を含むバクテリオファージクローニングベクターを調製する、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つの相互に組換えできるｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、そしてここで当該ＲＳは以下：ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、ｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列、ｉｉｉ）相互に組換えをしない、２つのａｔｔ組換えサイト、およびｉｖ）相互に組換えをしない、２つのｌｏｘ組換えサイト、からなる群より選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    （２）前記クローニングベクター中のＲＳを興味ある核酸挿入体で置換する；
    （３）パッケージングエキスの存在下での、工程（２）のバクテリオファージクローニングベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング；
    （４）キャプシドからのバクテリオファージクローニングベクターの抽出；
    （５）Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下でベクターから、興味ある核酸挿入体を含むプラスミドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切出し；
    （６）当該プラスミドまたはプラスミドライブラリーの回収；
    の工程を含む、前記方法。
  44. さらに以下の工程：
    （７）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しない少なくとも１つの細胞を電気穿孔するかまたは形質転換して、当該細胞中へプラスミドを導入する；
    （８）工程（７）の細胞をプレーティングし、興味ある核酸挿入体をもつプラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する；
    を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 工程（３）および（４）の間にプレート上でバクテリオファージの増幅工程が行われる、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. ＣＳに含まれるｌｏｘ組換えサイトがｌｏｘＰサイトである、請求項４ ３ないし４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記バクテリオファージがλである、請求項４３ないし４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、
    （１）構築セグメント（ＣＳ）および興味ある核酸挿入体により置換される可換セグメント（ＲＳ）を含むバクテリオファージクローニングベクターを調製する、ここで当該ＣＳのサイズは３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂであり、そしてＣＳは２つの相互に組換えできるｌｏｘ組換えサイトをさらに含み、そしてここで当該ＲＳは以下：ｉ）相互に連結しない、２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、ｉｉ）相互に連結せず、クラスＩＩＳ制限酵素類により認識される、２つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断サイト配列、ｉｉｉ）相互に組換えをしない、２つのａｔｔ組換えサイト、およびｉｖ）相互に組換えをしない、２つのｌｏｘ組換えサイト、からなる群より選択される２つの切出しエレメントにより隣接される；
    （２）前記ＲＳを核酸挿入体と置換する；
    （３）工程（２）のバクテリオファージクローニングベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングする；
    （４）工程（３）のクローニングベクターに、２つの組換えサイトにより隣接され当該２つの組換えサイトが相互に組換えをしないデスティネーション可換セグメントを含む少なくとも１つのデスティネーションベクターを提供することにより、興味ある核酸挿入体のｉｎ ｖｉｔｒｏ切出しを行う、
    （５）興味ある核酸挿入体をもつ組換え体プラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する；
    工程を含む、前記方法。
  49. 前記バクテリオファージがλである、請求項４８に記載の方法。
  50. 工程（１）のクローニングベクターおよび工程（４）のデスティネーションベクターの両方のＲＳに隣接する前記２つの組換えサイトが、ａｔｔＢ，ａｔｔＰ，ａｔｔＬ，およびａｔｔＲからなる群より選択される組換えサイトに由来する、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 工程（１）および工程（４）の両方のＲＳに隣接する前記２つの組換え体サイトが、相互に組換えをしないｌｏｘ組換えサイトである、請求項４８または４９に記載の方法。
  52. 前記ｌｏｘ組換えサイトがｌｏｘＰサイトである、請求項５１に記載の方法。
  53. 工程（４）のデスティネーションベクターの前記ＲＳが少なくともｃｃｄＢ遺伝子をさらに含む、請求項４８ないし５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. クローニングベクターのＣＳが選択マーカーをさらに含む、請求項４８ないし５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. さらに以下の工程：
    （６）２つの組換えサイトにより隣接されたデスティネーション可換セグメント（ＲＳ）を含む少なくとも１つの第２のデスティネーションベクターであって、当該２つの組換えサイトが、工程（５）のプラスミドと接触しても、相互に組換えをしない、前記第２のデスティネーションベクターを備える；
    をさらに含む請求項４８ないし５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. さらに以下の工程：
    （７）少なくとも１つの細胞を電気穿孔し、工程（５）または（６）で得られたプラスミドを当該細胞中に導入し；次いで
    （８）工程（７）の細胞をプレーティングし、挿入体をもつプラスミドまたはプラスミド類を回収する；
    をさらに含む、請求項４８ないし５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 請求項１ないし２３のいずれか１項に記載のクローニングベクター、または当該ベクター類のライブラリーを含むキット。
  58. 均等化および／または差引き化ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）請求項２４ないし５６のいずれか１項に記載の方法に従って調製された切出しプラスミドまたはデスティネーションプラスミドを用意する、（ｂ）工程（ａ）のプラスミドを核酸標的のプールへ提供する、（ｃ）ハイブリッド体を除く、（ｄ）均等化および／または差引き化された核酸標的を集める、工程を含む前記方法。
  59. 工程（ｂ）のプラスミドに対し、１）２本鎖プラスミドの１本のみに少なくとも１つの切れ目（ニック）をつくる、２）ニックされたプラスミド断片を除き、３）ニックされていない１本鎖を集める、処置を行い、そして、工程（ｃ）から（ｄ）を適用する、請求項５８に記載の方法。
  60. ＧｅｎｅＩＩタンパク質を用いることによりニックが導入される、請求項５９の方法。
  61. ニックされた鎖がエキソヌクレアーゼにより除去される、請求項５９の方法。
  62. エキソヌクレアーゼがＥｘｏＩＩＩである、請求項６１の方法。
  63. 均等化および／または差引き化ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ベクターのＣＳがＦ１ ｏｒｉを含む請求項１ないし２３のいずれか１項に記載のベクターを提供する、（ｂ）興味ある核酸挿入体でＲＳを置換する、（ｃ）ヘルパーファージを添加し、多数の１本鎖プラスミドベクターコピーを産生する、（ｄ）工程（ｃ）のコピーを核酸標的のプールへ提供する、（ｅ）ハイブリッドを除く、（ｆ）均等化および／または差引き化核酸標的を集める、工程を含む前記方法。
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