JP5089984B2 - 方向性クローニング用ベクター - Google Patents
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Description
及び、これらのアイソシゾマーを含めた、認識部位の外に末端を生成する制限酵素など、IIS型酵素、例えばSapI又はEarIである。別の実施形態では、前述の制限酵素の1つがクラスIIS制限酵素であり、これには、限定されるものではないが、
又は、
と同一の認識部位を有する制限酵素、又は、
と同一の認識部位を有する制限酵素である。一実施形態では、前述の制限酵素の1つがAarI、AscI、BbrCI、CspI、DraI、FseI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、SapI、SdaI、SfiI、SgfI、SplI、SrfI、SwaI、又は、AarI、AscI、BbrCI、CspI、DraI、FseI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、SapI、SdaI、SfiI、SgfI、SplI、SrfI、若しくはSwaIと同一の認識部位を有する制限酵素である。
若しくは、これらのアイソシゾマーの1つの部位である。一実施形態では、対象のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも1つの制限酵素部位は、SgfI(AsiSI)、PacI、又はPvuI(Afa22MI、Afal6RI、BspCI、EagBI、ErhB9I、MvrI、NblI、Ple19I、Psu161I、RshI、XorII)の1つの部位である。
又は、これらのアイソシゾマーによって生成された末端の連結は、3’末端でオープンリーディングフレームを伸長させることもできる。
及び第2の制限酵素によって生成された平滑末端が隣接した、ペプチド又はポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むDNA断片と連結すると、このペプチド又はポリペプチドをコードする組換えベクターを産生し、この場合、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、配列中、X1は、このオープンリーディングフレームの開始コドンの3’側にある最初のコドンであり、X2はX1に対して相補的であり、Y1はこのオープンリーディングフレームの残部であり、Y2はYに対して相補的である。一実施形態では、X1=GR1R2であり、配列中、R1又はR2=A、T、C、又はGである。
「ユニークな制限酵素部位」という用語は、所与の制限酵素の認識配列が核酸分子中に1つ存在することを示す。
本発明では、方向性クローニング及び秩序ある遺伝子集合に対する2つの一般的アプローチを使用する。1つのアプローチでは、ハパックス末端制限酵素、例えば、縮重認識又は開裂配列を有する制限酵素認識部位(図1〜2参照)の制限部位を使用する。ハパックス末端酵素は、ユニークな末端を生成することが可能な酵素である(表1)。IIS型酵素のFokIが含まれ、分断されたパリンドロームのAlwNIも含まれる。切断部位は不特定の塩基内に位置しているので、末端はNで表される。分断又は隣接する認識部位の完全なヌクレオチド配列が書かれていない限り、末端の詳細な性質を述べることはできない。統計学的に述べると、すべての一本鎖のオーバーハングは異なっている。また、これらのオーバーハングが対称要素を有することも考えられない。一般的に、このことは、突出塩基は逆方向の相補配列が後に続く非対称単位の構成はとらず、末端は自己相補的とはならず、そのような末端を有する断片を有するコンカテマーを形成することは不可能となる、ことを意味する。EcoRIなどの非ハパックス末端酵素では、反対の状況が支配的である。認識部位G↓AATTC及び切断によって生成されるオーバーハング末端AATTの両方は、常にパリンドローム様エレメントを示し、あらゆる断片のオーバーハングは、それ自体と相補的であり、同じ酵素によって生成された他のすべての断片の突出末端と相補的である。
SapI及びそのアイソシゾマーVapK32Iは7塩基隣接配列を認識し、SfiIは8塩基隣接配列を認識し、これらの酵素も使用可能である。有用な酵素のさらなる例は、4塩基分離配列を認識する酵素(例えば、Bse4I(BseLI、MsiYI、BslI)、MwoI)及び6塩基分離配列を認識する酵素(例えば、AccB7I(Esp1396I、PflMI、Van91I)、AdeI(DraIII)、AhdI(AspEI Eam1105I、EchHKI、NruGI)、AhwNI、ApaBI(BstAPI)、AspI(PflFI、Tth111I)、BglI、BstXI、DrdI(DseDI)及びEcoNI(XagI)、XcmI)を含む。さらなる適切なクラスIIS制限酵素は、当業者に知られている(例えば、Szybalskiら、Gene100:13(1991年)参照)。
又はそのアイソシゾマー、
である。
図3は、本発明の実施形態に従って遺伝分析を実施するための方法300のフローチャートである。この方法は、1つ又は複数のコンピュータプログラム又はコンピュータ実行形式の指示から成るモジュールによって実行することができる。フローチャートを参照することによって、この方法を説明することは、当業者がそのようなプログラム又はモジュールを開発することを可能にし、これには適切なコンピュータ上(RAM、ROM、CD−ROM、DVD−ROM、ハードディスク、フロッピー(登録商標)ドライブ及びその他のそのようなメディアなどのコンピュータ可読メディアからの指示を実行するコンピュータの1つ又は複数のプロセッサー)でその方法を実行するためのそのような指示が含まれる。図3に示す方法は、本発明の典型的な実施形態を実行する操作環境によって実行できる行為を含む。
ドナー又はレシピエントベクターを使用して、別のベクター、例えば、発現ベクター又は分離した断片、例えば、PCR断片から得たベクター内の対象のDNA配列、例えば、ライブラリー、例えば、cDNAライブラリー内のDNA配列で、所望の制限酵素認識部位が隣接する対象のDNA配列を、別のベクター(アクセプターベクター)に導入して、レシピエント(発現)ベクター、例えば、対象のDNA配列の発現に有用なベクターを作製する。アクセプターベクター内及び対象のDNA配列に隣接している所望の制限酵素認識部位の存在及び配置は、対象のDNA配列をアクセプターベクターに一定方向で迅速にサブクローニング又は挿入することを可能にする。
対象のDNA配列をドナーベクターへ、又はドナーベクターからアクセプターベクターへ導入する工程において、対象のDNA配列に隣接する制限酵素部位、すなわち、クローニングに有用な制限酵素部位は、対象のDNA配列又はベクター配列のいずれか一方に存在することもできる。特定の制限酵素を含む部位を対応する酵素による切断から保護するために、DNA結合タンパク質及びメチル化を使用してもよい。例えば、RecA(RecA切断及び産生)によって制限部位を保護する工程は、部分的な制限消化に比べて、より再現性があり、より良好な収量をもたらし、より取り扱いやすい。制限酵素認識部位を保護するその他の手段は、リプレッサータンパク質、真核生物転写制御因子、大腸菌宿主組込み因子又は三重らせん体構造を形成することが可能なオリゴヌクレオチドを使用することを含むが、RecAを使用した保護の特異性は、完全に合成一本鎖DNAによるものである。ATP[γ−S]などの加水分解抵抗性ATP類似体の存在下で、RecAタンパク質は、一本鎖DNA(ssDNA)に非特異的に結合し(およそ、3つのヌクレオチドごとに1つのRecAモノマー)、シナプス前フィラメントと呼ばれる構造を形成する。次に、このRecA被覆オリゴヌクレオチドを相同の2本鎖DNAでアニールして、安定した三重鎖DNA−たんぱく質複合体を形成する。シナプス前フィラメントは、i)反応に加えられるssDNAの配列及び長さは、シナプス前フィラメントの部位と範囲を判定する、及びii)シナプス前フィラメントは、DNAメチラーゼ及び制限酵素による修飾からハイブリッド形成部位のDNAを保護するという点で、有用な分子的研究手段となる。これらの特徴は、RecAタンパク質−媒介DNA複合体が、ゲノムマッピング及びDNA断片のサブクローニングなどの、所定部位でのDNA切断を必要とする分子生物学的処理に新しいレベルの特異性を加えることを可能にする。PCR法と比較して、DNA結合タンパク質の使用は、より迅速であり、in vitroの増幅の複数のサイクルにより生じる突然変異を導入しない。
RecA濃度
RecA保護の特異性及び有効性を最大にするために、オリゴヌクレオチド:RecA比を操作する必要があることがある。10μL反応に6.25μgのRecAの濃度は、よく作用する。
RecAに対するオリゴヌクレオチドの結合のモルストイキオメトリー(RecAタンパク質のモルに対するヌクレオチドのモルに関する)は3:1である。換言すれば、あらゆる一本鎖DNAの3つのヌクレオチドごとに、1つのRecAタンパク質が結合する。この比は、オリゴヌクレオチドの容積とは関係がなく、RecA 6.25μgあたりオリゴヌクレオチド160ngに相当する。40ng単位の増加による40〜280ngの一連の滴定は、RecAに対して使用するオリゴヌクレオチドの最適濃度を判定するために有用である。次に、非特異的保護が問題である場合、ATP[γ−S]添加後の反応にオリゴ(dT)160ngを添加してもよい。
溶液中でのRecA切断及びRecA保護のために、30〜36塩基長のオリゴヌクレオチドが推奨される。保護部位は、このプロトコールの開発を通して使用した30塩基のオリゴヌクレオチドの中央部に位置していた(また、以下も参照。Promega Notes Magazine #50より「ゲノムマッピング及びサブクローニングに関するRecA切断及び保護(RecA Cleavage and Protection for Genomic Mapping and Subcloning)」)。
メチル化後、塩濃度を調整して、酵素の活性を改善する必要があろう。酢酸塩は、塩化物よりRecAトリプレックスに対して不安定化しないと思われ、したがって、塩化カリウム又は塩化ナトリウムよりむしろ酢酸カリウムを使用するとよい。
RecA切断反応の生成物がメチル化されるので、宿主の制限/修飾系との不和合性によって、形質転換頻度が低い可能性がある。形質転換の有効性が低い場合、宿主の遺伝子型を既知のメチル化誘発制限系と比較して、このことが原因であるか判定する。
一実施形態において、ドナーベクター内及び/又は対象のDNA配列に隣接している、少なくとも1つの制限酵素部位は、縮重認識配列を有する制限酵素、例えば、SfiIが分断されたパリンドローム配列(図6)を認識する縮重認識配列を有する制限酵素のためのものである。分断されたパリンドローム配列を認識し、方向性クローニングに使用する一本鎖DNAオーバーハングを生成する制限酵素を使用するために、その制限酵素ための少なくとも2つのユニークな部位及び/又は第1の制限酵素によって生成されるオーバーハングと相補的である、非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングを生成する異なる制限酵素のためのユニークな部位を使用する。他の方法を使用して、例えば、メチル化の使用によって、所望のベクター並びに/又は選択可能及び対抗選択可能な遺伝子の頻度を高めることができる。
本発明のベクターは、特定の生物体のゲノムの少なくとも10%、及び50%まで又は50%を超えるオープンリーディングフレームを表すライブラリーなどの、オープンリーディングフレームのライブラリー、並びに突然変異オープンリーディングフレームのライブラリーを作成するために使用してもよい。例えば、個々のオープンリーディングフレームに対する増幅プライマーをデザインする。フォワードプライマーに関して、一実施形態では、SgfI部位は、オープンリーディングフレームの開始コドン(ATG)から(上流の)5’側の1塩基を配列し、このプライマーは、増幅中にプライマーをアニールするために適切なTm(例えば、>45℃)を、オープンリーディングフレームの補体を有する鋳型に提供するための長さであって、このためにリーディングフレームからの十分な配列を有する。リバースプライマーは、オープンリーディングフレームの終止コドンより前の最終コドンのアンチセンスに、直接に追加したPmeI部位を含む。リバースプライマーは、増幅中にプライマーをアニールするための適切なTmを鋳型に提供するための長さであって、このためにオープンリーディングフレームのC末端の部分から十分なアンチセンス配列を有し、対応するフォワードプライマーとTmが一致することが好ましい(例えば、>45℃)。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、SgfI及びPmeI部位に対して5’側に追加された3〜5塩基をさらに有し、これら酵素による増幅オープンリーディングフレームの迅速な消化を確実にすることが好ましい。次に、オープンリーディングフレームを、オープンリーディングフレームを有するcDNAテンプレート、RNAプレパラート、ゲノムDNA又はプラスミドクローンから増幅する。オープンリーディングフレームは、特に、増幅領域が800bpを超えている場合、高フィデリティーポリメラーゼ、例えば、Pfu DNAポリメラーゼによって増幅することが好ましい。
アンピシリン感受性ドナーベクターを、緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子を有し、この遺伝子が消化後に相補的一本鎖DNAオーバーハングを生成しないSfiI部位が隣接するように作製する(図20A)。また、アンピシリン耐性アクセプターベクターを、赤色発行ルシフェラーゼ遺伝子を有し、この遺伝子が消化後に相補的一本鎖DNAオーバーハングを生成しないが、それぞれが緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子に隣接した一本鎖DNAオーバーハングのうちの1つに相補的であるSfiI部位が隣接するように作製する。これらの2つのベクターを、SfiIを含むT4DNAリガーゼ緩衝液により50℃で1時間消化した。反応物を室温まで冷却し、T4DNAリガーゼを添加した。連結反応を、22℃で30〜60分間実施した。一部の連結反応物をゲル電気泳動にかけ、別の一部分はJM109を形質転換するために使用した。形質転換細胞を、ニトロセルロース上に置き、一晩インキュベートした。
ベクター
pDONOR−4CATベクターは、SgfI及びPmeI部位間の天然プロモーターのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子源として利用した。pDONOR−4は、細菌選択のためのカナマイシン耐性遺伝子、方向性フレキシブルクローニングのための制限酵素部位SgfI及びPmeIを含む。
pDONOR−6LacZ由来のLacZレポーター遺伝子を、2段階の工程でpACCEPT−Fに導入した。最初に、pDONOR−6LacZを、BSAを含むPromega緩衝液Cの制限酵素SgfI及びPmeIによって37℃で1時間消化し、ベクターからLacZ遺伝子を遊離させた。消化後、反応管を65℃へ20分間加熱することでこの制限酵素を、不活化した。第2の線状pACCEPT−F、T4DNAリガーゼ、ATP、DTT及び追加の緩衝液Cを反応管に加え、管を22℃で1時間インキュベートすることで連結を開始した。連結の後で、反応物の一定分量を大腸菌細胞(JM109)に形質転換し、形質転換混合物をアンピシリン、X−gal及びラムノースを含むL培地(LB)プレート上に蒔いて培養した。コロニーを、それによって青色を発するX−galの利用能について視覚的スクリーニングをした。結果は、約90%のコロニーが、LacZ遺伝子のpDONOR−6LacZからpACCEPT−Fベクターへの導入パーセント(パーセンテージは、総青色コロニー数/総コロニー数×100によって算出した)を示す青色を発することを実証した。
方向性クローニングを含むクローニングに有用な誘導系は、誘導プロモーターによって調節される遺伝子産物をコードする組換え宿主細胞を含み、この遺伝子産物は、細胞に導入されたベクターにおける対象のDNAの転写を特異的に増加する。一実施形態では、第1のベクターは、プロモーター、例えば、T7プロモーターに作用可能に連結した対象の遺伝子のためのオープンリーディングフレームを含み、本ベクターは、プロモーターの5’側の転写ターミネーター配列、例えば、rrnBターミネーター(異常発現を減少する)、薬剤耐性遺伝子、例えば、kanR、宿主細胞における高いコピー数でのベクターの維持を可能にする配列、場合によって、ベクターの多量体化を減少する配列、例えば、cer配列を有し、さらにオープンリーディングフレームに隣接した制限酵素を有する。一実施形態では、オープンリーディングフレームに隣接した制限酵素部位は、相補DNA末端を生成しない2つの異なる低頻度切断酵素のためのものである(酵素I及び酵素II)(図21)。また、図21のベクターは、PmeI部位のT7転写ターミネーター3’を含む。オープンリーディングフレームのための対象の骨格を有する第2のベクターは、好ましくは、異なる薬剤耐性遺伝子、例えば、ampRを含み、さらに、場合によって、同一の転写ターミネーター配列、プロモーター、宿主細胞における高いコピー数でのベクターの維持を可能にする配列を含み、さらに、場合によって、対象のオープンリーディングフレームを含むベクターのような、ベクターの多量体化を減少させる配列を含み、第2のベクターにおける転写ターミネーター配列及びプロモーターは、それぞれ、酵素I及び酵素IIにより生成された末端と互換性を持つ末端を生成する2つの制限酵素(酵素III及び酵素IV)のための制限酵素部位に対して5’側にある。例えば、酵素IはSgfI、酵素IIはPmeI、酵素IIIはPvuI及び酵素IVはDraIである。他の実施形態では、酵素I及びIIIにより認識される制限部位は同一であって、例えば、SgfIのための部位であり、酵素II及びIVにより認識される制限部位は同一であって、例えば、PmeIのための部位である。得られたベクターは、誘導して遺伝子産物を発現することができる宿主細胞に導入し、遺伝子産物は、例えば、T7RNAポリメラーゼなどの遺伝子産物で、オープンリーディングフレームの5’側であるプロモーターの転写を増加する。
毒性遺伝子の発現系を作製した。安定して形質転換された宿主細胞(JM109)を、lamBに統合された構成的プロモーター、例えば、4cプロモーターから発現した、バルナーゼ、バルスターの免疫因子をコードした発現ベクターを含むように作製した。分泌配列を欠いた切断バルナーゼ遺伝子(参照、例えば、登録番号X12871又はM14442(バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)由来のバルナーゼ遺伝子)或いはAE007600(アロストリヂウム・アセトブチリカム(Alostridium acetobutylicum)由来のバルナーゼ遺伝子))に連結したλPLプロモーターを含むベクターを、これらの安定して形質転換された細胞に導入した。
Claims (13)
- DNA断片の方向性サブクローニングの方法であって、以下のステップ、
a)第1の選択マーカー遺伝子及びオープンリーディングフレームを含む対象のDNA配列を含む第1のベクターを準備するステップであって、
対象のDNA配列には、少なくとも2つの制限酵素部位が隣接し、
隣接制限酵素部位の少なくとも1つは、第1の制限酵素の部位であり、第1の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的である一本鎖DNA3'TAオーバーハングを生成し、
他の隣接制限酵素部位は、第2の制限酵素の部位であり、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、平滑末端を生成し、
第1の制限酵素及び第2の制限酵素で前記第1のベクターを消化することによって、
(i)第1の選択マーカー遺伝子を欠くが、前記オープンリーディングフレームを含む対象のDNA配列を含む第1の線状DNA断片;及び
(ii)前記第1の選択マーカー遺伝子を含む第2の線状DNA断片;
が生成される、
第1のベクターを準備するステップと、
b)第1の選択マーカー遺伝子から識別可能な第2の選択マーカー遺伝子及び少なくとも2つの制限酵素部位が隣接した致死遺伝子をコードするDNA配列を含む、第2のベクターを準備するステップであって、
第2のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも1つは、第3の制限酵素の部位であり、第3の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成し、
第2のベクター中の他の隣接制限部位は、第4の制限酵素の部位であり、
第4の制限酵素は、平滑末端を生成し、かつ
第3の制限酵素及び第4の制限酵素で第2のベクターを消化することによって、
(i)前記致死遺伝子を欠くが、第2の選択マーカーを含み、かつ第1の線状DNA断片に一定方向で結合するのを可能にする末端を有する、第3の線状DNA断片であって、 (a)前記第3の制限酵素により生成されたオーバーハングの一部分を含む配列
が、前記第1の線状DNA断片との一定方向での結合の後に前記オープンリーデ
ィングフレームとインフレームである1つ以上のコドンを含み、これによって前
記オープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子産物とのN末端融
合物をコードし、及び/又は、
(b)前記第4の制限酵素により生成された切断部位の3'側である一部分を形
成する配列が、
(I)前記第1の線状DNA断片との一定方向での結合の後に前記オープ
ンリーディングフレームとインフレームとなる終止コドンのための、若し
くは
(II)前記第1の線状DNA断片との一定方向での結合の後に前記オー
プンリーディングフレームとインフレームとなる1つ以上のコドン、
のための1つ以上の塩基を含み、
これによって前記オープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子
産物とのC末端融合物をコードする配列、及び
(ii)前記致死遺伝子を有する第4の線状DNA断片、
が生成される、
第2のベクターを準備するステップと、
c)(i)適当な緩衝液中の第1のベクター及び第2のベクターを、適当な緩衝液中の前記第1、第2、第3及び第4制限酵素及びDNAリガーゼと、一定方向で結合している、前記第1の線状DNA断片及び第3の線状DNA断片を含む混合物を産生する消化及び連結をもたらすのに効果的なpH及び温度で、又は
(ii)適当な緩衝液中の、前記第1のベクター、第3の線状DNA断片及び第4の線状DNA断片;及び前記第2のベクター、第1の線状DNA断片及び第2の線状DNA断片を、一定方向で結合している、前記第1の線状DNA断片及び第3の線状DNA断片を含む混合物を産生する消化及び連結をもたらすのに効果的なpH及び温度で、
一体とするステップ、
を含むことを特徴とする、方法。 - 第1の制限酵素及び第3の制限酵素が同一でない、請求項1に記載の方法。
- 第2の制限酵素及び第4の制限酵素が同一でない、請求項1に記載の方法。
- 第1の制限酵素がSgfIである、請求項1に記載の方法。
- 第2の制限酵素がPmeIである、請求項4に記載の方法。
- 第3の制限酵素がPvuI又はPacIである、請求項5に記載の方法。
- 第3のベクターが、対象のアミノ酸配列の発現に適している、請求項1に記載の方法。
- 第3のベクターが、第1の酵素認識部位及び対象のDNA配列におけるオープンリーディングフレームの5'側にあるオープンリーディングフレームを含む配列によってコードされるN−末端融合タンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- 第3のベクターが、第2の酵素認識部位及び対象のDNA配列におけるオープンリーディングフレームの3'側にあるオープンリーディングフレームを含む配列によってコードされるC末端融合タンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- 第3のベクターが、第1の酵素認識部位の5'側にあるオープンリーディングフレーム、対象のDNA配列におけるオープンリーディングフレーム、及び第2の酵素認識部位の3'末端にあるオープンリーディングフレームを有する配列によってコードされる融合タンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- 連結によって、以下の配列、
AAGGAGCGATCGCYATG(配列番号69)又は
X1X2X3GCGATCGCCATG(配列番号70)
(配列中、X1〜X3、X2X3G、又はX3GCは、終止コドンではないコドンであり、Yは、A、T、G、又はCである。);
X1X2X3GTTTY1Y2
(配列中、X1X2X3は、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Y1及びY2がそれぞれAであるか、Y1=AかつY2=Gであるか、Y1=GかつY2=Aである。);又は
X1X2X3GTTTY1Y2
(配列中、X1X2X3、X2X3G、又はX3GTが、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Y2がA又はGである場合にY1がAでないか、或いは、Y2がAである場合にY1がGでない。)
が第3のベクター中に生成される、請求項1に記載の方法。 - 前記致死遺伝子は、分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする、請求項1に記載の方法。
- 第1の制限酵素によって切断されたヌクレオチドの5'側に、適切に配置されたリボソーム結合部位を含む、請求項1に記載の方法。
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