JP2007508012A - 方向性クローニング用ベクター - Google Patents
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Abstract
Description
及び、これらのアイソシゾマーを含めた、認識部位の外に末端を生成する制限酵素など、IIS型酵素、例えばSapI又はEarIである。別の実施形態では、前述の制限酵素の1つがクラスIIS制限酵素であり、これには、限定されるものではないが、
又は、
と同一の認識部位を有する制限酵素、又は、
と同一の認識部位を有する制限酵素である。一実施形態では、前述の制限酵素の1つがAarI、AscI、BbrCI、CspI、DraI、FseI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、SapI、SdaI、SfiI、SgfI、SplI、SrfI、SwaI、又は、AarI、AscI、BbrCI、CspI、DraI、FseI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、SapI、SdaI、SfiI、SgfI、SplI、SrfI、若しくはSwaIと同一の認識部位を有する制限酵素である。
若しくは、これらのアイソシゾマーの1つの部位である。一実施形態では、対象のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも1つの制限酵素部位は、SgfI(AsiSI)、PacI、又はPvuI(Afa22MI、Afal6RI、BspCI、EagBI、ErhB9I、MvrI、NblI、Ple19I、Psu161I、RshI、XorII)の1つの部位である。
又は、これらのアイソシゾマーによって生成された末端の連結は、3’末端でオープンリーディングフレームを伸長させることもできる。
及び第2の制限酵素によって生成された平滑末端が隣接した、ペプチド又はポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むDNA断片と連結すると、このペプチド又はポリペプチドをコードする組換えベクターを産生し、この場合、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、配列中、X1は、このオープンリーディングフレームの開始コドンの3’側にある最初のコドンであり、X2はX1に対して相補的であり、Y1はこのオープンリーディングフレームの残部であり、Y2はYに対して相補的である。一実施形態では、X1=GR1R2であり、配列中、R1又はR2=A、T、C、又はGである。
「ユニークな制限酵素部位」という用語は、所与の制限酵素の認識配列が核酸分子中に1つ存在することを示す。
本発明では、方向性クローニング及び秩序ある遺伝子集合に対する2つの一般的アプローチを使用する。1つのアプローチでは、ハパックス末端制限酵素、例えば、縮重認識又は開裂配列を有する制限酵素認識部位(図1〜2参照)の制限部位を使用する。ハパックス末端酵素は、ユニークな末端を生成することが可能な酵素である(表1)。IIS型酵素のFokIが含まれ、分断されたパリンドロームのAlwNIも含まれる。切断部位は不特定の塩基内に位置しているので、末端はNで表される。分断又は隣接する認識部位の完全なヌクレオチド配列が書かれていない限り、末端の詳細な性質を述べることはできない。統計学的に述べると、すべての一本鎖のオーバーハングは異なっている。また、これらのオーバーハングが対称要素を有することも考えられない。一般的に、このことは、突出塩基は逆方向の相補配列が後に続く非対称単位の構成はとらず、末端は自己相補的とはならず、そのような末端を有する断片を有するコンカテマーを形成することは不可能となる、ことを意味する。EcoRIなどの非ハパックス末端酵素では、反対の状況が支配的である。認識部位G↓AATTC及び切断によって生成されるオーバーハング末端AATTの両方は、常にパリンドローム様エレメントを示し、あらゆる断片のオーバーハングは、それ自体と相補的であり、同じ酵素によって生成された他のすべての断片の突出末端と相補的である。
SapI及びそのアイソシゾマーVapK32Iは7塩基隣接配列を認識し、SfiIは8塩基隣接配列を認識し、これらの酵素も使用可能である。有用な酵素のさらなる例は、4塩基分離配列を認識する酵素(例えば、Bse4I(BseLI、MsiYI、BslI)、MwoI)及び6塩基分離配列を認識する酵素(例えば、AccB7I(Esp1396I、PflMI、Van91I)、AdeI(DraIII)、AhdI(AspEI Eam1105I、EchHKI、NruGI)、AhwNI、ApaBI(BstAPI)、AspI(PflFI、Tth111I)、BglI、BstXI、DrdI(DseDI)及びEcoNI(XagI)、XcmI)を含む。さらなる適切なクラスIIS制限酵素は、当業者に知られている(例えば、Szybalskiら、Gene100:13(1991年)参照)。
又はそのアイソシゾマー、
である。
図3は、本発明の実施形態に従って遺伝分析を実施するための方法300のフローチャートである。この方法は、1つ又は複数のコンピュータプログラム又はコンピュータ実行形式の指示から成るモジュールによって実行することができる。フローチャートを参照することによって、この方法を説明することは、当業者がそのようなプログラム又はモジュールを開発することを可能にし、これには適切なコンピュータ上(RAM、ROM、CD−ROM、DVD−ROM、ハードディスク、フロッピー(登録商標)ドライブ及びその他のそのようなメディアなどのコンピュータ可読メディアからの指示を実行するコンピュータの1つ又は複数のプロセッサー)でその方法を実行するためのそのような指示が含まれる。図3に示す方法は、本発明の典型的な実施形態を実行する操作環境によって実行できる行為を含む。
ドナー又はレシピエントベクターを使用して、別のベクター、例えば、発現ベクター又は分離した断片、例えば、PCR断片から得たベクター内の対象のDNA配列、例えば、ライブラリー、例えば、cDNAライブラリー内のDNA配列で、所望の制限酵素認識部位が隣接する対象のDNA配列を、別のベクター(アクセプターベクター)に導入して、レシピエント(発現)ベクター、例えば、対象のDNA配列の発現に有用なベクターを作製する。アクセプターベクター内及び対象のDNA配列に隣接している所望の制限酵素認識部位の存在及び配置は、対象のDNA配列をアクセプターベクターに一定方向で迅速にサブクローニング又は挿入することを可能にする。
対象のDNA配列をドナーベクターへ、又はドナーベクターからアクセプターベクターへ導入する工程において、対象のDNA配列に隣接する制限酵素部位、すなわち、クローニングに有用な制限酵素部位は、対象のDNA配列又はベクター配列のいずれか一方に存在することもできる。特定の制限酵素を含む部位を対応する酵素による切断から保護するために、DNA結合タンパク質及びメチル化を使用してもよい。例えば、RecA(RecA切断及び産生)によって制限部位を保護する工程は、部分的な制限消化に比べて、より再現性があり、より良好な収量をもたらし、より取り扱いやすい。制限酵素認識部位を保護するその他の手段は、リプレッサータンパク質、真核生物転写制御因子、大腸菌宿主組込み因子又は三重らせん体構造を形成することが可能なオリゴヌクレオチドを使用することを含むが、RecAを使用した保護の特異性は、完全に合成一本鎖DNAによるものである。ATP[γ−S]などの加水分解抵抗性ATP類似体の存在下で、RecAタンパク質は、一本鎖DNA(ssDNA)に非特異的に結合し(およそ、3つのヌクレオチドごとに1つのRecAモノマー)、シナプス前フィラメントと呼ばれる構造を形成する。次に、このRecA被覆オリゴヌクレオチドを相同の2本鎖DNAでアニールして、安定した三重鎖DNA−たんぱく質複合体を形成する。シナプス前フィラメントは、i)反応に加えられるssDNAの配列及び長さは、シナプス前フィラメントの部位と範囲を判定する、及びii)シナプス前フィラメントは、DNAメチラーゼ及び制限酵素による修飾からハイブリッド形成部位のDNAを保護するという点で、有用な分子的研究手段となる。これらの特徴は、RecAタンパク質−媒介DNA複合体が、ゲノムマッピング及びDNA断片のサブクローニングなどの、所定部位でのDNA切断を必要とする分子生物学的処理に新しいレベルの特異性を加えることを可能にする。PCR法と比較して、DNA結合タンパク質の使用は、より迅速であり、in vitroの増幅の複数のサイクルにより生じる突然変異を導入しない。
RecA濃度
RecA保護の特異性及び有効性を最大にするために、オリゴヌクレオチド:RecA比を操作する必要があることがある。10μL反応に6.25μgのRecAの濃度は、よく作用する。
RecAに対するオリゴヌクレオチドの結合のモルストイキオメトリー(RecAタンパク質のモルに対するヌクレオチドのモルに関する)は3:1である。換言すれば、あらゆる一本鎖DNAの3つのヌクレオチドごとに、1つのRecAタンパク質が結合する。この比は、オリゴヌクレオチドの容積とは関係がなく、RecA 6.25μgあたりオリゴヌクレオチド160ngに相当する。40ng単位の増加による40〜280ngの一連の滴定は、RecAに対して使用するオリゴヌクレオチドの最適濃度を判定するために有用である。次に、非特異的保護が問題である場合、ATP[γ−S]添加後の反応にオリゴ(dT)160ngを添加してもよい。
溶液中でのRecA切断及びRecA保護のために、30〜36塩基長のオリゴヌクレオチドが推奨される。保護部位は、このプロトコールの開発を通して使用した30塩基のオリゴヌクレオチドの中央部に位置していた(また、以下も参照。Promega Notes Magazine #50より「ゲノムマッピング及びサブクローニングに関するRecA切断及び保護(RecA Cleavage and Protection for Genomic Mapping and Subcloning)」)。
メチル化後、塩濃度を調整して、酵素の活性を改善する必要があろう。酢酸塩は、塩化物よりRecAトリプレックスに対して不安定化しないと思われ、したがって、塩化カリウム又は塩化ナトリウムよりむしろ酢酸カリウムを使用するとよい。
RecA切断反応の生成物がメチル化されるので、宿主の制限/修飾系との不和合性によって、形質転換頻度が低い可能性がある。形質転換の有効性が低い場合、宿主の遺伝子型を既知のメチル化誘発制限系と比較して、このことが原因であるか判定する。
一実施形態において、ドナーベクター内及び/又は対象のDNA配列に隣接している、少なくとも1つの制限酵素部位は、縮重認識配列を有する制限酵素、例えば、SfiIが分断されたパリンドローム配列(図6)を認識する縮重認識配列を有する制限酵素のためのものである。分断されたパリンドローム配列を認識し、方向性クローニングに使用する一本鎖DNAオーバーハングを生成する制限酵素を使用するために、その制限酵素ための少なくとも2つのユニークな部位及び/又は第1の制限酵素によって生成されるオーバーハングと相補的である、非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングを生成する異なる制限酵素のためのユニークな部位を使用する。他の方法を使用して、例えば、メチル化の使用によって、所望のベクター並びに/又は選択可能及び対抗選択可能な遺伝子の頻度を高めることができる。
本発明のベクターは、特定の生物体のゲノムの少なくとも10%、及び50%まで又は50%を超えるオープンリーディングフレームを表すライブラリーなどの、オープンリーディングフレームのライブラリー、並びに突然変異オープンリーディングフレームのライブラリーを作成するために使用してもよい。例えば、個々のオープンリーディングフレームに対する増幅プライマーをデザインする。フォワードプライマーに関して、一実施形態では、SgfI部位は、オープンリーディングフレームの開始コドン(ATG)から(上流の)5’側の1塩基を配列し、このプライマーは、増幅中にプライマーをアニールするために適切なTm(例えば、>45℃)を、オープンリーディングフレームの補体を有する鋳型に提供するための長さであって、このためにリーディングフレームからの十分な配列を有する。リバースプライマーは、オープンリーディングフレームの終止コドンより前の最終コドンのアンチセンスに、直接に追加したPmeI部位を含む。リバースプライマーは、増幅中にプライマーをアニールするための適切なTmを鋳型に提供するための長さであって、このためにオープンリーディングフレームのC末端の部分から十分なアンチセンス配列を有し、対応するフォワードプライマーとTmが一致することが好ましい(例えば、>45℃)。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、SgfI及びPmeI部位に対して5’側に追加された3〜5塩基をさらに有し、これら酵素による増幅オープンリーディングフレームの迅速な消化を確実にすることが好ましい。次に、オープンリーディングフレームを、オープンリーディングフレームを有するcDNAテンプレート、RNAプレパラート、ゲノムDNA又はプラスミドクローンから増幅する。オープンリーディングフレームは、特に、増幅領域が800bpを超えている場合、高フィデリティーポリメラーゼ、例えば、Pfu DNAポリメラーゼによって増幅することが好ましい。
アンピシリン感受性ドナーベクターを、緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子を有し、この遺伝子が消化後に相補的一本鎖DNAオーバーハングを生成しないSfiI部位が隣接するように作製する(図20A)。また、アンピシリン耐性アクセプターベクターを、赤色発行ルシフェラーゼ遺伝子を有し、この遺伝子が消化後に相補的一本鎖DNAオーバーハングを生成しないが、それぞれが緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子に隣接した一本鎖DNAオーバーハングのうちの1つに相補的であるSfiI部位が隣接するように作製する。これらの2つのベクターを、SfiIを含むT4DNAリガーゼ緩衝液により50℃で1時間消化した。反応物を室温まで冷却し、T4DNAリガーゼを添加した。連結反応を、22℃で30〜60分間実施した。一部の連結反応物をゲル電気泳動にかけ、別の一部分はJM109を形質転換するために使用した。形質転換細胞を、ニトロセルロース上に置き、一晩インキュベートした。
ベクター
pDONOR−4CATベクターは、SgfI及びPmeI部位間の天然プロモーターのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子源として利用した。pDONOR−4は、細菌選択のためのカナマイシン耐性遺伝子、方向性フレキシブルクローニングのための制限酵素部位SgfI及びPmeIを含む。
pDONOR−6LacZ由来のLacZレポーター遺伝子を、2段階の工程でpACCEPT−Fに導入した。最初に、pDONOR−6LacZを、BSAを含むPromega緩衝液Cの制限酵素SgfI及びPmeIによって37℃で1時間消化し、ベクターからLacZ遺伝子を遊離させた。消化後、反応管を65℃へ20分間加熱することでこの制限酵素を、不活化した。第2の線状pACCEPT−F、T4DNAリガーゼ、ATP、DTT及び追加の緩衝液Cを反応管に加え、管を22℃で1時間インキュベートすることで連結を開始した。連結の後で、反応物の一定分量を大腸菌細胞(JM109)に形質転換し、形質転換混合物をアンピシリン、X−gal及びラムノースを含むL培地(LB)プレート上に蒔いて培養した。コロニーを、それによって青色を発するX−galの利用能について視覚的スクリーニングをした。結果は、約90%のコロニーが、LacZ遺伝子のpDONOR−6LacZからpACCEPT−Fベクターへの導入パーセント(パーセンテージは、総青色コロニー数/総コロニー数×100によって算出した)を示す青色を発することを実証した。
方向性クローニングを含むクローニングに有用な誘導系は、誘導プロモーターによって調節される遺伝子産物をコードする組換え宿主細胞を含み、この遺伝子産物は、細胞に導入されたベクターにおける対象のDNAの転写を特異的に増加する。一実施形態では、第1のベクターは、プロモーター、例えば、T7プロモーターに作用可能に連結した対象の遺伝子のためのオープンリーディングフレームを含み、本ベクターは、プロモーターの5’側の転写ターミネーター配列、例えば、rrnBターミネーター(異常発現を減少する)、薬剤耐性遺伝子、例えば、kanR、宿主細胞における高いコピー数でのベクターの維持を可能にする配列、場合によって、ベクターの多量体化を減少する配列、例えば、cer配列を有し、さらにオープンリーディングフレームに隣接した制限酵素を有する。一実施形態では、オープンリーディングフレームに隣接した制限酵素部位は、相補DNA末端を生成しない2つの異なる低頻度切断酵素のためのものである(酵素I及び酵素II)(図21)。また、図21のベクターは、PmeI部位のT7転写ターミネーター3’を含む。オープンリーディングフレームのための対象の骨格を有する第2のベクターは、好ましくは、異なる薬剤耐性遺伝子、例えば、ampRを含み、さらに、場合によって、同一の転写ターミネーター配列、プロモーター、宿主細胞における高いコピー数でのベクターの維持を可能にする配列を含み、さらに、場合によって、対象のオープンリーディングフレームを含むベクターのような、ベクターの多量体化を減少させる配列を含み、第2のベクターにおける転写ターミネーター配列及びプロモーターは、それぞれ、酵素I及び酵素IIにより生成された末端と互換性を持つ末端を生成する2つの制限酵素(酵素III及び酵素IV)のための制限酵素部位に対して5’側にある。例えば、酵素IはSgfI、酵素IIはPmeI、酵素IIIはPvuI及び酵素IVはDraIである。他の実施形態では、酵素I及びIIIにより認識される制限部位は同一であって、例えば、SgfIのための部位であり、酵素II及びIVにより認識される制限部位は同一であって、例えば、PmeIのための部位である。得られたベクターは、誘導して遺伝子産物を発現することができる宿主細胞に導入し、遺伝子産物は、例えば、T7RNAポリメラーゼなどの遺伝子産物で、オープンリーディングフレームの5’側であるプロモーターの転写を増加する。
毒性遺伝子の発現系を作製した。安定して形質転換された宿主細胞(JM109)を、lamBに統合された構成的プロモーター、例えば、4cプロモーターから発現した、バルナーゼ、バルスターの免疫因子をコードした発現ベクターを含むように作製した。分泌配列を欠いた切断バルナーゼ遺伝子(参照、例えば、登録番号X12871又はM14442(バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)由来のバルナーゼ遺伝子)或いはAE007600(アロストリヂウム・アセトブチリカム(Alostridium acetobutylicum)由来のバルナーゼ遺伝子))に連結したλPLプロモーターを含むベクターを、これらの安定して形質転換された細胞に導入した。
Claims (141)
- a)第1の選択マーカー遺伝子及び対象のDNA配列を含む第1のベクターを準備するステップであって、対象のDNA配列には、少なくとも2つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第1の制限酵素の部位であり、第1の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成し、隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第2の制限酵素の部位であり、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第1の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成し、第1の制限酵素及び第2の制限酵素部位で第1のベクターを消化することによって、第1の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のDNA配列を含む第1の線状DNA断片が生成される、第1のベクターを準備するステップと;
b)対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第1の選択マーカー遺伝子及び非必須DNA配列から識別可能な第2の選択マーカー遺伝子を含む第2のベクターを準備するステップであって、非必須配列には少なくとも2つの制限酵素部位が隣接し、第2のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第3の制限酵素の部位であり、第3の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される、第1の線状DNA断片中の一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成し、第2のベクター中の隣接制限部位の少なくとも1つは第4の制限酵素の部位であり、第4の制限酵素は、第1の制限酵素又は第3の制限酵素によって生成される末端には相補的でないが第2の制限酵素によって生成された末端には連結できる末端を生成し、第3の制限酵素及び第4の制限酵素で第2のベクターを消化することによって、非必須DNA配列を欠くが第2の選択マーカーを含む第2の線状DNA断片が生成され、第2の線状DNA断片には、第1の線状DNA断片が第2の線状DNA断片に一定方向で結合するのを可能にする末端が隣接する、第2のベクターを提供するステップと;
c)一定方向で結合している第1の線状DNA分子及び第2の線状DNA分子を含む第3のベクターを任意選択で含む混合物を産生する消化及び任意選択で連結をもたらすのに効果的な条件下において、適当な緩衝液中で、1つ又は複数の制限酵素、及び任意選択でDNAリガーゼを用いて、第1のベクター及び第2のベクター、第1のベクター及び第2の線状DNA断片、又は第2のベクター及び第1の線状DNA断片を一体にするステップと
を含む、DNA断片の方向性サブクローニングの方法。 - 第2の制限酵素が平滑末端を生成し、かつ、第1の線状DNA断片に第1の一本鎖DNAオーバーハング及び平滑末端が隣接する、請求項1に記載の方法。
- 第1の制限酵素及び第3の制限酵素が同一でない、請求項1に記載の方法。
- 第2の制限酵素及び第4の制限酵素が同一でない、請求項1に記載の方法。
- 第2の制限酵素及び第4の制限酵素が平滑末端を生成する、請求項1に記載の方法。
- 第1の制限酵素がSgfIである、請求項1に記載の方法。
- 第2の制限酵素がPmeIである、請求項6に記載の方法。
- 第3の制限酵素が3’TAオーバーハングを生成する、請求項1に記載の方法。
- 第3の制限酵素がPvuI又はPacIである、請求項8に記載の方法。
- 第1の制限酵素又は第2の制限酵素の部位を1つ又は複数含むオープンリーディングフレームが、対象のDNA配列に含まれる、請求項1に記載の方法。
- 1つ又は複数の制限酵素で消化を行う前に、オープンリーディングフレーム中の1つ又は複数の制限酵素部位を、消化されないように保護する、請求項10に記載の方法。
- 前記部位がメチル化によって保護される、請求項11の方法。
- メチル化の前に、第1の制限酵素又は第2の制限酵素の隣接部位を、前記隣接制限酵素部位に相補的なオリゴヌクレオチド及びRecAと接触させる、請求項12に記載の方法。
- 第1のベクターを含むクローニング用ベクター系であって、
第1のベクターは、第1の選択マーカー遺伝子及び対象のDNA配列を含み、対象のDNA配列には、少なくとも2つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第1の制限酵素の部位であり、第1の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成し、隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第2の制限酵素の部位であり、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第1の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成し、第1のベクターの消化によって、第1の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のDNA配列を含む第1の線状DNA断片が生成され、前記制限酵素部位は、第1の線状DNA断片を第2のベクターに直接再連結できるように設計されており、第2のベクターは、対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第1の選択マーカー遺伝子及び非必須DNA配列から識別可能な第2の選択マーカー遺伝子を含み、非必須DNA配列には少なくとも2つの制限酵素部位が隣接し、第2のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第3の制限酵素の部位であり、第3の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成し、第2のベクター中の隣接制限部位の少なくとも1つは第4の制限酵素の部位であり、第4の制限酵素は、第1の制限酵素又は第3の制限酵素によって生成される末端には相補的でないが第2の制限酵素によって生成された末端には連結できる末端を生成し、第3の制限酵素及び第4の制限酵素で第2のベクターを消化することによって、非必須DNA配列を欠くが第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の線状DNA断片が生成され、第2の線状DNA断片には、第1の線状DNA断片が第2の線状DNA断片に一定方向で結合するのを可能にする末端が隣接する、クローニング用ベクター系。 - 第2の制限酵素は平滑末端を生成し、かつ、第1の線状DNA断片には第1の一本鎖DNAオーバーハング及び平滑末端が隣接する、請求項14に記載のベクター系。
- 第1の制限酵素及び第3の制限酵素が同一でない、請求項14に記載のベクター系。
- 第2の制限酵素及び第4の制限酵素が同一でない、請求項14に記載のベクター系。
- 第2の制限酵素及び第4の制限酵素が平滑末端を生成する、請求項14に記載のベクター系。
- 連結及び一定方向での接合によって、対象のDNA配列及び第2の線状DNA断片の3’末端の5’側にある核酸配列によってコードされているN末端融合タンパク質をコードする第3のベクターが産生される、請求項14に記載のベクター系。
- 連結及び一定方向での結合によって、対象のDNA配列及び第2の線状DNA断片の5’末端の3’側にある核酸配列によってコードされているC末端融合タンパク質をコードする第3のベクターが産生される、請求項14に記載のベクター系。
- 連結及び一定方向での結合によって、対象のDNA配列及び第2の線状DNA断片の3’末端及び5’末端のそれぞれ5’側及び3’側にある核酸配列によってコードされている融合タンパク質をコードする第3のベクターが産生される、請求項14に記載のベクター系。
- 連結及び一定方向での結合によって、対象のDNA配列と、一定方向での結合によって生成された置換部位とによってコードされている融合タンパク質をコードする第3のベクターが産生される、請求項14に記載のベクター系。
- 前記制限酵素の1つが、AarI、AscI、BbrCI、CspI、DraI、FseI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、SapI、SdaI、SfiI、SgfI、SplI、SrfI、又はSwaIであるか、或いは、AarI、AscI、BbrCI、CspI、DraI、FseI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、SapI、SdaI、SfiI、SgfI、SplI、SrfI、又はSwaIと同一の認識部位を有する制限酵素である、請求項14に記載のベクター系。
- 前記融合タンパク質が、GST融合タンパク質、GFP融合タンパク質、チオレドキシン融合タンパク質、マルトース結合タンパク質融合タンパク質、プロテアーゼ切断部位融合タンパク質、金属結合ドメイン融合タンパク質、又はデハロゲナーゼ融合タンパク質である、請求項20、21、又は22に記載のベクター系。
- 対応する非融合タンパク質と比較して、前記融合タンパク質がより可溶性であるか、より精製しやすいか、又は、より検出しやすい、請求項20、21、又は22に記載のベクター系。
- 請求項14に記載のベクター系を含むキット。
- 第3のベクターを任意選択で含む混合物を産生する消化及び任意選択で連結をもたらすのに効果的な条件下において、適当な緩衝液中で、1つ又は複数の制限酵素及び任意選択でDNAリガーゼを用いて、少なくとも2つのベクターを一体にするステップであって、第1のベクターは、第1の選択マーカー遺伝子及び対象のDNA配列を含み、対象のDNA配列には、少なくとも2つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位のうち2つ以上が第1の制限酵素の部位であり、第1の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、第1の制限酵素で第1のベクターを消化することによって、第1の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のDNA配列及び第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングを含む第1の線状DNA断片を生成し、第2のベクターは、対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第1の選択マーカー遺伝子及び非必須DNA配列から識別可能な第2の選択マーカー遺伝子を含み、非必須DNA配列には2つ以上の制限酵素部位が隣接し、第2のベクター中の隣接部位のうち2つ以上が第2の制限酵素の部位であり、第2の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、第2の制限酵素で第2のベクターを消化することによって、非必須DNA配列を欠くが、第2の選択マーカー遺伝子及び第2対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングを含む第2の線状DNA断片を生成し、第2対の非自己相補的DNAオーバーハングのそれぞれは、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングの一本鎖DNAオーバーハングのうちの1つのみと相補的であり、第1の線状DNA断片が第2の線状DNA断片に一定方向で結合するのを可能にする、ステップ
を含む、対象のアミノ酸配列の発現に適したベクターを作製する方法。 - 第3のベクターを任意選択で含む混合物を産生する消化及び任意選択で連結をもたらすのに効果的な条件下において、適当な緩衝液中で、1つ又は複数の制限酵素及び任意選択でDNAリガーゼを用いて、少なくとも2つのベクターを一体にするステップであって、第1のベクターは、第1の選択マーカー遺伝子及び対象のDNA配列を含み、対象のDNA配列には、少なくとも2つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第1の制限酵素の部位であり、第1の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成し、隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第2の制限酵素の部位であり、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第1の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成し、第1のベクターの消化によって、第1の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のDNA配列を含む第1の線状DNA断片が生成され、第2のベクターは、対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第1の選択マーカー遺伝子及び非必須DNA配列から識別可能な第2の選択マーカー遺伝子を含み、非必須DNA配列には少なくとも2つの制限酵素部位が隣接し、第2のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも1つは第3の制限酵素の部位であり、第3の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成し、第2のベクター中の隣接制限部位の少なくとも1つは第4の制限酵素の部位であり、第4の制限酵素は、第1の制限酵素又は第3の制限酵素によって生成される末端には相補的でないが第2の制限酵素によって生成された末端には連結できる末端を生成し、第3の制限酵素及び第4の制限酵素で第2のベクターを消化することによって、非必須DNA配列を欠くが第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の線状DNA断片が生成され、第2の線状DNA断片には、第1の線状DNA断片が第2の線状DNA断片に一方向で結合するのを可能にする末端が隣接するステップ
を含む、対象のアミノ酸配列の発現に適したベクターを作製する方法。 - 第2の制限酵素が平滑末端を生成し、かつ、第1の線状DNA断片に第1の一本鎖DNAオーバーハング及び平滑末端が隣接する、請求項28に記載の方法。
- 第1の制限酵素及び第3の制限酵素が同一でない、請求項28に記載の方法。
- 第2の制限酵素及び第4の制限酵素が同一でない、請求項28に記載の方法。
- 第2の制限酵素及び第4の制限酵素が平滑末端を生成する、請求項28に記載の方法。
- 前記制限酵素の1つがクラスIIS制限酵素である、請求項28に記載の方法。
- 前記制限酵素の1つが、AarI、AscI、BbrCI、CspI、DraI、FseI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、SapI、SdaI、SfiI、SgfI、SplI、SrfI、SwaIであるか、或いは、AarI、AscI、BbrCI、CspI、DraI、FseI、NotI、NruI、PacI、PmeI、PvuI、SapI、SdaI、SfiI、SgfI、SplI、SrfI、又はSwaIと同一の認識部位を有する制限酵素である、請求項1又は28に記載の方法。
- ラムノース異化作用を欠失しており、かつ異種RNAポリメラーゼのオープンリーディングフレームに作用可能に連結したラムノース誘導プロモーターを含む組換えDNA分子を有する組換え宿主細胞を、ラムノース、及び、対象のDNA配列に作用可能に連結した異種RNAポリメラーゼのプロモーターを含む発現ベクターに接触させるステップを含む、対象のDNA配列の発現を宿主細胞中で誘導する方法。
- 対象のDNA配列に2つの制限酵素部位が隣接しており、隣接制限酵素部位の1つは第1の制限酵素の部位であり、第1の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ一本鎖DNAオーバーハングを生成し、別の隣接制限酵素部位は第2の制限酵素の部位であり、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第1の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成する、請求項37に記載の方法。
- 分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片を含むベクターを、原核細胞で構成的に発現されるプロモーターからバルスターを発現する組換え宿主細胞中に導入するステップを含む方法。
- 請求項14に記載のベクター系を宿主細胞中に導入するステップを含む方法であって、第2のベクターは、分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片を含む対抗選択可能な遺伝子を含む方法。
- リボソーム結合部位と、SgfI認識部位と、mRNA中に存在する場合に真核生物リボソームのスモールサブユニットに前記mRNAが結合するのを促進する配列とを含む30塩基対未満のDNA断片の3’側に、オープンリーディングフレームを含むベクター。
- 前記DNA断片が、AAGGAGCGATCGCX1ATGX2(配列番号1)を含み、配列中、X1及びX2は個々にA、T、G又はCである、請求項41のベクター。
- SgfI認識部位と、ATGを含む配列と、前記配列中の前記ATGで開始するオープンリーディングフレームとを含むベクターであって、前記配列は、mRNA中に存在する場合に真核生物リボソームのスモールサブユニットに前記mRNAが結合するのを促進するベクター。
- 第1の制限酵素の認識部位の5’側にSgfI認識部位を含むベクターであって、第1の制限酵素は平滑末端を生成し、前記ベクターは、SgfI及び第1の制限酵素で消化して、3’TAオーバーハングを生成する第2の制限酵素によって生成された末端、及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むDNA断片に連結すると、前記オープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生し、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するベクター。
- 第1の制限酵素及び第3の制限酵素が同一である、請求項44に記載のベクター。
- 第1の制限酵素及び第3の制限酵素が異なる、請求項44に記載のベクター。
- 第1の制限酵素が、PmeI、EcoRV、又はBalIである、請求項44に記載のベクター。
- 第1の制限酵素が、PmeI、DraI、EsaBC3I、HindIII、HpaI、SciI、又はSwaIである、請求項44に記載のベクター。
- 3’TAオーバーハングを生成する前記制限酵素がSgfIである、請求項44に記載のベクター。
- SgfI部位を含むオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項44に記載のベクター。
- SgfIによって切断されたヌクレオチドの5’側にリボソーム結合部位を含む、請求項44に記載のベクター。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、AAGGAGCGATCGCYATG(配列番号69)又はX1X2X3GCGATCGCCATG(配列番号70)が組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3、X2X3G、又はX3GCは、終止コドンではないコドンであり、Yは、A、T、G、又はCである、請求項44に記載のベクター。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、X1X2X3GTTTY1Y2が組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3は、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Y1及びY2がそれぞれAであるか、Y1=AかつY2=Gであるか、Y1=GかつY2=Aである、請求項44に記載のベクター。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、X1X2X3GTTTY1Y2が組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3、X2X3G、又はX3GTが、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Y2がA又はGである場合にY1がAでないか、或いは、Y2がAである場合にY1がGでない、請求項44に記載のベクター。
- SgfI認識部位と、オープンリーディングフレーム中に存在しない制限酵素の認識部位とを含む第1のオープンリーディングフレームを含むベクターであって、前記制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、前記ベクターは、SgfI及び前記制限酵素で消化して、一本鎖3’TA DNAオーバーハング及び平滑末端が隣接した第2のオープンリーディングフレームを含むDNA断片に連結すると、第1のオープンリーディングフレーム及び第2のオープンリーディングフレームを含む第3のオープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生し、前記制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、第3のオープンリーディングフレームは融合ペプチド又はタンパク質をコードするベクター。
- SgfI認識部位との1ヌクレオチドのオーバーラップを任意選択で有するリボソーム結合部位と、オープンリーディングフレーム中に存在しない制限酵素の認識部位とを含むベクターであって、前記制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、前記ベクターは、SgfI及び前記制限酵素で消化して、
及び平滑末端が隣接した、ペプチド又はポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むDNA断片に連結すると、ペプチド又はポリペプチドをコードする組換えベクターを産生し、前記制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、配列中、X1は、前記オープンリーディングフレームの開始コドンの3’側にある最初のコドンであり、X2はX1に対して相補的であり、Y1は前記オープンリーディングフレームの残部であり、Y2はY1に対して相補的であるベクター。 - X1=GR1R2であり、R1又はR2=A、T、C、又はGである、請求項57に記載のベクター。
- 第1の制限酵素の認識部位を含むベクターであって、第1の制限酵素は、平滑末端を生成する第2の制限酵素の認識部位の5’側に3’TAオーバーハングを生成し、前記ベクターは、第1の制限酵素及び第2の制限酵素で消化して、SgfIによって生成された末端及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むDNA断片に連結すると、前記オープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生し、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するベクター。
- 第2の制限酵素及び第3の制限酵素が同一である、請求項59に記載のベクター。
- 第2の制限酵素及び第3の制限酵素が異なる、請求項59に記載のベクター。
- 第2の制限酵素が、PmeI、EcoRV、又はBalIである、請求項59に記載のベクター。
- 第2の制限酵素が、PmeI、DraI、EsaBC3I、HindIII、HpaI、SciI、又はSwaIである、請求項59に記載のベクター。
- 3’TAオーバーハングを生成する前記制限酵素がSgfIである、請求項59に記載のベクター。
- 第1の制限酵素の認識部位を含むオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項59に記載のベクター。
- 第1の制限酵素によって切断されたヌクレオチドの5’側に、適切に配置されたリボソーム結合部位を含む、請求項59に記載のベクター。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、AAGGAGCGATCGCYATG、又はX1X2X3GCGATCGCCATGが組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3、X2X3G、又はX3GCは、終止コドンでないコドンであり、Yは、A、T、G、又はCである、請求項59のベクター。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、X1X2X3GTTTY1Y2が組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3は、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Y1及びY2がそれぞれAであるか、Y1=AかつY2=Gであるか、Y1=GかつY2=Aである、請求項59に記載のベクター。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、X1X2X3GTTTY1Y2が組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3、X2X3G、又はX3GTが、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Y2がA又はGである場合にY1がAでないか、或いはY2がAである場合にY1がGでない、請求項59に記載のベクター。
- 3’TAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位と、オープンリーディングフレーム中に存在しない、平滑末端を生成する第2の制限酵素の認識部位とを含む第1のオープンリーディングフレームを含むベクターであって、前記ベクターは、第1の制限酵素及び第2の制限酵素で消化して、SgfIによって生成された末端及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接した第2のオープンリーディングフレームを含むDNA断片に連結すると、第1のオープンリーディングフレーム及び第2のオープンリーディングフレームを含む第3のオープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生し、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、第3のオープンリーディングフレームは融合ペプチド又はタンパク質をコードするベクター。
- SgfI認識部位との1ヌクレオチドのオーバーラップを任意選択で有するリボソーム結合部位と、平滑末端を生成する第1の制限酵素の認識部位とを含むベクターであって、前記ベクターは、SgfI及び第1の制限酵素で消化して、
及び第2の制限酵素によって生成された平滑末端が隣接した、ペプチド又はポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むDNA断片と連結すると、前記ペプチド又はポリペプチドをコードする組換えベクターを産生し、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、配列中、X1は、前記オープンリーディングフレームの開始コドンの3’側にある最初のコドンであり、X2はX1に対して相補的であり、Y1は前記オープンリーディングフレームの残部であり、Y2はY1に対して相補的であるベクター。 - 複数の組換えベクターを含む支持体であって、前記組換えベクターのうち2つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも1つの組換えベクターが、プロモーターと、2つの置換部位が隣接した第1のオープンリーディングフレームとを含み、
平滑末端を生成する第1の制限酵素の認識部位の5’側に3’TAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位の5’側に前記プロモーターを含むベクターであって、第1の制限酵素及び第2の制限酵素で消化されたベクターと、
SgfIによって生成された末端、及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接した第1のオープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する、DNA配列と
を連結することによって置換部位が形成される支持体。 - 前記ベクターが、プロモーターの3’側に、第1の制限酵素の認識部位を含む第2のオープンリーディングフレームをさらに含み、第2のオープンリーディングフレームは、第1のオープンリーディングフレームに連結された際に、融合ペプチド又はタンパク質をコードする第3のオープンリーディングフレームを形成する、請求項73に記載の支持体。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、AAGGAGCGATCGCYATG、又はX1X2X3GCGATCGCCATGが組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3、X2X3G、又はX3GCは、終止コドンではないコドンであり、YはA、T、G又はCである、請求項73に記載の支持体。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、X1X2X3GTTTY1Y2が組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3は、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Y1及びY2がそれぞれAであるか、Y1=AかつY2=Gであるか、Y1=GかつY2=Aである、請求項73に記載の支持体。
- 連結によって、以下の配列、すなわち、X1X2X3GTTTY1Y2が組換えベクター中に生成され、配列中、X1X2X3、X2X3G、又はX3GTは、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Y2がA又はGである場合にY1がAでないか、或いはY2がAである場合にY1がGでない、請求項73に記載の支持体。
- 平滑末端を生成する第1の制限酵素の認識部位の5’側にSgfI認識部位を含むベクターをSgfI及び第1の制限酵素で消化すること、並びに、3’TAオーバーハングを生成する第2の制限酵素によって生成された末端及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むDNA断片に、消化されたベクターを連結することによって調製された組換えベクターであって、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する組換えベクター。
- 複数の組換えベクターを含む支持体であって、前記組換えベクターのうち1つ又は複数が、異なるオープンリーディングフレームを含み、平滑末端を生成する第1の制限酵素の認識部位の5’側にSgfI認識部位を含むベクターをSgfI及び第1の制限酵素で消化すること、並びに、3’TAオーバーハングを生成する第2の制限酵素によって生成された末端及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むDNA断片に、消化されたベクターを連結することによって各組換えベクターが調製され、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する支持体。
- 前記支持体がマルチウェルプレートであり、その各ウェルが、任意選択で、それぞれ異なった組換えベクターを含む、請求項79に記載の支持体。
- 前記異なるオープンリーディングフレームが、選択されたオープンリーディングフレームのヌクレオチド置換を有するオープンリーディングフレームを含み、前記異なるオープンリーディングフレームが、選択されたオープンリーディングフレームへの変異導入によって調製される、請求項79に記載の支持体。
- a)複数の組換えベクター又は組換えベクターを含む組換え細胞を選択するステップであって、前記組換えベクターのうち2つ以上が異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも1つの組換えベクターが、プロモーター、及び、2つの置換部位が隣接した第1のオープンリーディングフレームを含み、
平滑末端を生成する第2の制限酵素の認識部位の5’側に3’TAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位の5’側に前記プロモーターを含むベクターと、
SgfIによって生成された末端、及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接した第1のオープンリーディングフレームを含むDNA配列と
を連結することによって置換部位が形成され、前記ベクターは、第1の制限酵素及び第2の制限酵素で消化され、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するステップ、並びに、
b)選択された組換えベクター又は組換え細胞を前記支持体の1つ又は複数の容器内に導入するステップ
を含む、複数の組換えベクター又は組換え細胞を含む支持体を調製する方法。 - a)SgfI認識部位及び第1の制限酵素の部位が隣接した複数の変異型オープンリーディングフレームを含むDNAを準備するステップであって、第1の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するステップと、
b)SgfI及び第1の制限酵素で前記DNAを消化し、プロモーターを含むベクターに、消化されたDNAを連結して、複数の変異型組換えベクターを産生するステップであって、前記プロモーターは、平滑末端を生成する第3の制限酵素の認識部位の5’側にある3’TAオーバーハングを生成する第2の制限酵素の認識部位の5’側にあり、前記ベクターが第2の制限酵素及び第3の制限酵素で消化されるステップと
を含む、複数の変異型組換えベクターを調製する方法。 - a)3’TAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位、及び第2の制限酵素の部位が隣接した、複数の変異型オープンリーディングフレームを含むDNAを準備するステップであって、第2の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するステップと、
b)第1の制限酵素及び第2の制限酵素でDNAを消化して、消化されたDNAを、プロモーターを含むベクターに連結して、複数の変異型組換えベクターを産生するステップであって、前記プロモーターは、平滑末端を生成する第3の制限酵素の認識部位の5’側にあるSgfI認識部位の5’側にあり、前記ベクターがSgfI及び第3の制限酵素で消化されるステップと
を含む、複数の変異型組換えベクターを調製する方法。 - 第1の制限酵素がPmeIである、請求項84に記載の方法。
- 組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えベクターのうち2つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも1つの組換えベクターが、プロモーターと、2つの置換部位が隣接した第1のオープンリーディングフレームとを含み、
平滑末端を生成する第2の制限酵素の認識部位の5’側に3’TAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位の5’側に前記プロモーターを含むベクターであって、第1の制限酵素及び第2の制限酵素で消化されたベクターと、
SgfIによって生成された末端、及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接した第1のオープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するDNA配列と
を連結することによって置換部位が形成される、ライブラリー。 - 組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えベクターの複数が、選択されたオープンリーディングフレームの変異型オープンリーディングフレームを含む変異型組換えベクターを含み、少なくとも1つの変異型組換えベクターが、プロモーターと、2つの置換部位が隣接した変異型オープンリーディングフレームとを含み、
平滑末端を生成する第2の制限酵素の認識部位の5’側に3’TAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位の5’側に前記プロモーターを含むベクターであって、第1の制限酵素及び第2の制限酵素で消化されたベクターと、
SgfIによって生成された末端、及び第3の制限酵素によって生成された末端が隣接した変異型オープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、第3の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するDNA配列と
を連結することによって置換部位が形成されるライブラリー。 - 少なくとも2つの異なる制限酵素の認識部位を少なくとも2つ、オープンリーディングフレームの両端に導入する方法であって、
a)それぞれがオープンリーディングフレームを含む1つ又は複数の核酸配列を準備するステップと;
b)各核酸配列を、少なくとも1対のオリゴヌクレオチドで増幅して、前記1対のオリゴヌクレオチド中の配列を含む増幅された核酸を産生するステップであって、前記1対のオリゴヌクレオチドは、1つ又は複数のオープンリーディングフレームにある配列にアニールする配列を有し、前記1対のオリゴヌクレオチドのうち一方の配列に対応する増幅された核酸の配列は、前記オープンリーディングフレームにアニールする配列の5’側にSgfIの制限酵素部位を含み、前記1対のオリゴヌクレオチドのもう一方の配列に対応する増幅された核酸の配列は、第1の制限酵素の制限酵素部位を含み、第1の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、第1の制限酵素部位は、前記オープンリーディングフレームにアニールする配列の3’側にあり、前記オリゴヌクレオチドの配列に対応する増幅された核酸の配列がSgfI及び第1の制限酵素で消化できるステップと
を含む方法。 - 増幅された核酸の3’末端にアデニンを付加して、修飾された増幅核酸断片を産生することをさらに含む、請求項88に記載の方法。
- 前記修飾された増幅核酸断片を、5’Tオーバーハングを有するDNA断片に連結して、組換えベクターを産生することをさらに含む、請求項89に記載の方法。
- 前記1対のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5’末端にトポイソメラーゼI結合部位をさらに含む、請求項88に記載の方法。
- トポイソメラーゼIの存在下で、平滑末端を有するDNA断片に、前記増幅された核酸断片を連結して、組換えベクターを産生することをさらに含む、請求項91に記載の方法。
- 前記増幅された核酸を、SgfI及び第1の制限酵素で消化し、消化された前記増幅された核酸を、平滑末端と、SgfIによって生成された末端に連結可能な末端とを有するDNA断片に連結して、組換えベクターを産生することをさらに含む、請求項88に記載の方法。
- 前記増幅された核酸が、消化の前に精製される、請求項93に記載の方法。
- 前記増幅された核酸が、消化の後かつ連結の前に精製される、請求項93に記載の方法。
- 前記核酸配列がcDNAである、請求項88に記載の方法。
- 前記核酸配列がRNAである、請求項88に記載の方法。
- SgfI部位を含む前記1対のオリゴヌクレオチドの一方が、前記オープンリーディングフレームとインフレームであるATGを、SgfI部位の3’側に含む、請求項88に記載の方法
- 2つ以上の異なる核酸配列が増幅される、請求項88に記載の方法。
- 前記組換えベクターで細胞を形質転換させて、組換え細胞を産生することを含む、請求項90、92、又は93に記載の方法。
- 請求項100に記載の方法で調製された組換え細胞。
- 2つの置換部位が隣接したオープンリーディングフレームを、前記少なくとも1つの組換えベクターが含み、
平滑末端を生成する制限酵素の認識部位の3’に第4の制限酵素及び第5の制限酵素の認識部位を含む組換えベクターであって、第4の制限酵素は、3’TAオーバーハングを生成し、かつ、第1の制限酵素とは異なり、第5の制限酵素は平滑末端を生成し、第4の制限酵素及び第5の制限酵素によって、消化された組換えベクターと、
SgfIによって生成された末端及び第6の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームをさらに含むDNA配列であって、第6の制限酵素は、少なくとも一生物種のcDNA又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するDNA配列と
を連結することによって置換部位が形成される、請求項86又は87に記載のライブラリー。 - PmeI認識部位を含み、かつ、相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位が5’末端に隣接している第1のオープンリーディングフレームを含むベクターであって、前記ベクターは、PmeI及び第1の制限酵素で消化して、第2のオープンリーディングフレームの5’末端に平滑末端を含み、かつ第2の制限酵素によって生成された末端を含むDNA断片に連結すると、第1のオープンリーディングフレーム及び第2のオープンリーディングフレームを含む第3のオープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生し、第2の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成するベクター。
- 第3のオープンリーディングフレームが、N1N2N3GTTTN4N5R(配列番号72)を含み、配列中、N1N2N3及びTN4N5は、終止コドンをコードしないコドンであり、Rは、1つ又は複数のコドンである、請求項103に記載のベクター。
- 前記DNA断片の平滑末端が、PmeI以外の制限酵素によって生成される、請求項103に記載のベクター。
- 前記DNA断片の平滑末端がPmeI消化によって生成される、請求項103に記載のベクター。
- PmeI認識部位を含み、かつ、相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の部位が5’末端に隣接している第1のオープンリーディングフレームを含むベクターであって、前記ベクターは、PmeI及び第1の制限酵素で消化して、平滑末端、及び第2の制限酵素によって生成された末端を含むDNA断片に連結すると、N1N2N3GTTTN4N5を含む組換えベクターを産生し、第2の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成し、配列中、N1N2N3GTTTは、消化された発現ベクターの3’末端の配列であり、N1N2N3は、終止コドンをコードせず、N4及びN5=A、又はN4=AかつN5=G、又はN4=GかつN5=Aであるベクター。
- 前記DNA断片の平滑末端がPmeI消化によって生成される、請求項107に記載のベクター。
- 前記DNA断片の平滑末端が、PmeI以外の制限酵素によって生成される、請求項107に記載のベクター。
- 複数の組換えベクターを含む支持体であって、前記組換えベクターのうち2つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、前記組換えベクターの少なくとも1つは、プロモーターと、第2のオープンリーディングフレーム、及び第2のオープンリーディングフレームとインフレームである1つ又は複数のコドンを含む第1のオープンリーディングフレームとを含み、第2のオープンリーディングフレームには、2つの置換部位が隣接し、
PmeI認識部位を含み、かつ、相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位が5’末端に隣接している第2のオープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、PmeI及び第1の制限酵素で消化されたDNA配列と、
前記1つ又は複数のインフレームのコドンの5’側にある5’末端に平滑末端を含み、さらに、第2の制限酵素によって生成された末端の5’側にあるプロモーターを含むベクターであって、第2の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成するベクターと
を連結することによって置換部位が形成される支持体。 - 平滑末端の連結によって形成された置換部位が、N1N2N3GTTTN4N5を含み、配列中、N1N2N3GTTTは、前記DNA配列の3’末端の配列であり、N1N2N3が終止コドンをコードしない場合にN4及びN5=A、又はN4=AかつN5=G、又はN4=GかつN5=Aであり、或いは、N1N2N3が終止コドンをコードする、請求項110に記載の支持体。
- a)複数の組換えベクター又は組換えベクターを含む組換え細胞を選択するステップであって、前記組換えベクターのうち2つ以上が異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、前記組換えベクターの少なくとも1つが、プロモーターと、第2のオープンリーディングフレーム、及び第2のオープンリーディングフレームとインフレームである1つ又は複数のコドンを含む第1のオープンリーディングフレームとを含み、第2のオープンリーディングフレームには、2つの置換部位が隣接し、
PmeI認識部位を含み、かつ、相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位が5’末端に隣接している第2のオープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、PmeI及び第1の制限酵素で消化されたDNA配列と、
前記1つ又は複数のコドンの5’側にある5’末端に平滑末端を含み、さらに、第2の制限酵素によって生成された末端の5’側にあるプロモーターを含むベクターであって、第2の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成するベクターと
を連結することによって置換部位が形成されるステップ、並びに、
b)選択された組換えベクター又は組換え細胞を前記支持体の1つ又は複数の容器内に導入するステップ
を含む、複数の組換えベクター又は組換え細胞を含む支持体を調製する方法。 - 組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えベクターのうち2つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、前記組換えベクターの少なくとも1つが、プロモーターと、第2のオープンリーディングフレーム、及び第2のオープンリーディングフレームとインフレームである1つ又は複数のコドンを含む第1のオープンリーディングフレームとを含み、第2のオープンリーディングフレームには、2つの置換部位が隣接し、
PmeI認識部位を含み、かつ、相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位が5’末端に隣接している第2のオープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、PmeI及び第1の制限酵素で消化されたDNA配列と、
前記1つ又は複数のインフレームのコドンの5’側にある5’末端に平滑末端を含み、さらに、第2の制限酵素によって生成された末端の5’側にあるプロモーターを含むベクターであって、第2の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成するベクターと
を連結することによって置換部位が形成されるライブラリー。 - 組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えベクターの複数が、選択されたオープンリーディングフレームの変異型オープンリーディングフレームを含む変異型組換えベクターを含み、前記組換えベクターの少なくとも1つが、プロモーターと、変異型オープンリーディングフレーム及び変異型オープンリーディングフレームとインフレームである1つ又は複数のコドンを含むオープンリーディングフレームとを含み、変異型オープンリーディングフレームには、2つの置換部位が隣接し、
PmeI認識部位を含み、かつ、相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の認識部位が5’末端に隣接している変異型オープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、PmeI及び第1の制限酵素で消化されたDNA配列と、
前記1つ又は複数のインフレームのコドンの5’側にある5’末端に平滑末端を含み、さらに、第2の制限酵素によって生成された末端の5’側にあるプロモーターを含むベクターであって、第2の制限酵素は、第1の制限酵素によって生成される一本鎖DNAオーバーハングに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成するベクターと
を連結することによって置換部位が形成されるライブラリー。 - 複数の組換えベクターを含む支持体であって、前記組換えベクターのうち2つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも1つの組換えベクターが、プロモーターと、2つの置換部位が隣接したオープンリーディングフレームとを含み、
第1の制限酵素の制限酵素部位が少なくとも2つ隣接したオープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、第1の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記DNA配列を第1の制限酵素で消化することによって、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングが隣接した第1のDNA断片が生成されるDNA配列と、
プロモーター、及び、第2の制限酵素の制限酵素部位が2つ隣接した非必須DNA配列を含むベクターであって、第2の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記ベクターを第2の制限酵素で消化することによって第2のDNA断片が生成され、第2のDNA断片は、非必須DNA配列が欠失していて、かつ第2対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングが隣接しており、第2対の非自己相補的DNAオーバーハングのそれぞれは、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングの一本鎖DNAオーバーハングのうちの1つのみと相補的であるベクターと
を連結することによって置換部位が形成される支持体。 - マルチウェルプレートである、請求項73から77まで、110から111まで、又は114のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記複数の組換えベクターのそれぞれが、同一生物の異なるポリペプチドをコードする、請求項73から77まで、110から111まで、又は114のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記複数の組換えベクターが、相互にオルソロガスなポリペプチドをコードする、請求項73から77まで、110から111まで、又は114のいずれか一項に記載の支持体。
- 前記複数の組換えベクターが、相互にパラロガスなポリペプチドをコードする、請求項73から77まで、110から111まで、又は114のいずれか一項に記載の支持体。
- a)複数の組換えベクター又は組換えベクターを含む組換え細胞を選択するステップであって、前記組換えベクターのうち2つ以上が異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも1つの組換えベクターが、プロモーターと、2つの置換部位が隣接したオープンリーディングフレームとを含み、
第1の制限酵素の制限酵素部位が少なくとも2つ隣接したオープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、第1の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記DNA配列を第1の制限酵素で消化することによって、第1の対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングが隣接した第1のDNA断片が生成されるDNA配列と、
プロモーター、及び、第2の制限酵素の制限酵素部位が2つ隣接した非必須DNA配列を含むベクターであって、第2の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記ベクターを第2の制限酵素で消化することによって第2のDNA断片が生成され、第2のDNA断片は、非必須DNA配列が欠失していて、かつ第2対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングが隣接しており、第2対の非自己相補的DNAオーバーハングのそれぞれは、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングの一本鎖DNAオーバーハングのうちの1つのみと相補的であるベクターと
を連結することによって置換部位が形成されるステップ、並びに、
b)選択された組換えベクター又は組換え細胞を前記支持体の1つ又は複数の容器内に導入するステップ
を含む、複数の組換えベクター又は組換え細胞を含む支持体を調製する方法。 - 選択された組換えベクターのそれぞれが、異なるパラロガスタンパク質をコードする、請求項82、112、又は120のいずれか一項に記載の方法。
- 選択された組換えベクターのそれぞれが、異化経路における異なるタンパク質をコードする、請求項82、112、又は120のいずれか一項に記載の方法。
- 選択された組換えベクターのそれぞれが、生合成経路における異なるタンパク質をコードする、請求項82、112、又は120のいずれか一項に記載の方法。
- 選択された組換えベクターのそれぞれが、異なるプロテアーゼをコードする、請求項82、112、又は120のいずれか一項に記載の方法。
- 選択された組換えベクターのそれぞれが、同一生物のタンパク質をコードする、請求項82、112、又は120のいずれか一項に記載の方法。
- 選択された組換えベクターのそれぞれが、相互にオルソロガスなタンパク質をコードする、請求項82、112、又は120のいずれか一項に記載の方法。
- a)ハパックス末端制限酵素であり、かつ第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングを生成する第1の制限酵素の制限酵素部位が2つ隣接した複数の変異型オープンリーディングフレームを含むDNAを準備するステップと;
b)前記DNAを第1の制限酵素で消化して、プロモーター、及び第2の制限酵素の制限酵素部位が2つ隣接した非必須DNA配列を含むベクターに、消化されたDNAを連結するステップであって、第2の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記ベクターを第2の制限酵素で消化することによって、非必須DNA配列を欠くが第2対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングを含むDNA断片が生成されて、それによって複数の変異型組換えベクターが産生され、第2対の非自己相補的DNAオーバーハングのそれぞれは、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングの一本鎖DNAオーバーハングのうちの1つのみと相補的であるステップと
を含む、複数の変異型組換えベクターを調製する方法。 - 請求項83、84、又は127のいずれか一項に記載の方法で調製された複数の変異型組換えベクターを含む支持体。
- 組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えベクターのうち2つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも1つの組換えベクターが、プロモーターと、2つの置換部位が隣接したオープンリーディングフレームとを含み、
第1の制限酵素の制限酵素部位が少なくとも2つ隣接したオープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、第1の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記DNA配列を第1の制限酵素で消化することによって、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングが隣接した第1のDNA断片が生成されるDNA配列と、
プロモーター、及び、第2の制限酵素の制限酵素部位が2つ隣接した非必須DNA配列を含むベクターであって、第2の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記ベクターを第2の制限酵素で消化することによって第2のDNA断片が生成され、第2のDNA断片は、非必須DNA配列が欠失していて、かつ第2対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングが隣接しており、第2対の非自己相補的DNAオーバーハングのそれぞれは、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングの一本鎖DNAオーバーハングのうちの1つのみと相補的であるベクターと
を連結することによって置換部位が形成されるライブラリー。 - 組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えベクターの複数が、選択されたオープンリーディングフレームの変異型オープンリーディングフレームを含む組換えベクターを含み、少なくとも1つの組換えベクターが、2つの置換部位が隣接した変異型オープンリーディングフレームに作用可能に連結したプロモーターを含み、
第1の制限酵素の制限酵素部位が少なくとも2つ隣接した変異型オープンリーディングフレームを含むDNA配列であって、第1の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記DNA配列を第1の制限酵素で消化することによって、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングが隣接した第1のDNA断片が生成されるDNA配列と、
プロモーター、及び、第2の制限酵素の制限酵素部位が2つ隣接した非必須DNA配列を含むベクターであって、第2の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、前記ベクターを第2の制限酵素で消化することによって第2のDNA断片が生成され、第2のDNA断片は、非必須DNA配列が欠失していて、かつ第2対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングが隣接しており、第2対の非自己相補的DNAオーバーハングのそれぞれは、第1対の非自己相補的一本鎖DNAオーバーハングの一本鎖DNAオーバーハングのうちの1つのみと相補的であるベクターと
を連結することによって置換部位が形成されるライブラリー。 - a)遺伝子データのデータベースに複数の遺伝子記録を格納するステップと;
b)遺伝子データのデータベースを検索して、第1のサブセットの遺伝子記録を同定するステップであって、所定の1制限酵素、又は1セットの所定の制限酵素に含まれる制限酵素の認識部位を、各記録が少なくとも1つ有するステップと;
c)第1のサブセット中の少なくとも第2のサブセットの遺伝子記録の制限酵素認識部位に関連した1セットの統計を決定するステップと
を含む、遺伝子解析を行う方法。 - 前記1セットの統計を決定するステップが、所定の1制限酵素の認識部位、又は前記1セットの所定の制限酵素に含まれる各制限酵素の認識部位を含む遺伝子記録の数を決定することを含む、請求項131に記載の方法。
- 前記1セットの統計を決定するステップが、第2のサブセット中の1遺伝子記録における、所定の1制限酵素、又は前記所定の制限酵素の少なくとも1つの部位の発生数を決定することを含む、請求項131に記載の方法。
- 前記遺伝子記録が核酸配列を含む、請求項131に記載の方法。
- 前記サブセットの遺伝子記録をふるい分けて、選択された1つ又は複数の特性を有する遺伝子記録を含めるか、或いは排除することをさらに含む、請求項131に記載の方法。
- 前記サブセットの遺伝子記録をふるい分けて、所定の値より大きなサイズを有する遺伝子記録を排除することをさらに含む、請求項131に記載の方法。
- 所定の値が21000文字である、請求項136に記載の方法。
- 認識部位中の不確定塩基として存在する特定の塩基、又は、制限酵素の認識部位と、認識部位を含有するDNAを前記制限酵素が切断する位置との間に存在する特定の塩基の配列を決定することをさらに含む、請求項131に記載の方法。
- 前記制限酵素の少なくとも1つが、6bp、7bp、又は8bpの認識部位を有する、請求項131に記載の方法。
- 前記制限酵素の少なくとも1つがハパックス末端制限酵素である、請求項131に記載の方法。
- 遺伝子データのデータベースと;
プロセッサーと;
プロセッサーに、
第1のサブセットの遺伝子記録を同定するための、遺伝子データのデータベースの検索であって、所定の1制限酵素、又は1セットの所定の制限酵素に含まれる制限酵素の認識部位を各記録が少なくとも1つ有する検索;及び、
第1のサブセット中の少なくとも第2のサブセットの遺伝子記録の制限酵素認識部位に関連した1セットの統計の決定
を行わせる、プロセッサーによって実行される1セットの1つ又は複数のプログラムと
を含む遺伝子解析用の計算機化されたシステム。
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