JP7305553B2 - Dnaアセンブリ - Google Patents
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Description
-認識配列の外側を開裂する制限酵素によって認識される制限酵素認識配列;及び
-DNAメチラーゼ認識配列
を含み、
上記制限酵素認識配列及び上記DNAメチラーゼ認識配列は、DNAメチラーゼにより修飾された塩基が制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
上記DNAメチラーゼ認識配列は、制限酵素認識配列と同一ではなく、又は制限酵素認識配列に囲まれておらず、
上記DNAメチラーゼ認識配列は、制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成し得る配列とオーバーラップしない。
メチル化保護可能な制限要素がDNAメチラーゼでメチル化されている、本発明による直線化されたメチル化核酸を提供すること;
直線化されたメチル化核酸とのアセンブリのための2つ以上の目的のDNA断片を提供すること、ここで、第1のDNA断片が、直線化されたメチル化核酸の第1の末端とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを含み、第2のDNA断片が、直線化されたメチル化核酸のもう一方の/第2の末端とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを含み;並びに
(i)第1及び第2のDNA断片が、互いにライゲーションするための相補的なオーバーハングを更に含み、又は
(ii)DNA断片及び直線化されたメチル化核酸をDNAリガーゼでライゲートすることが単一のアセンブルされたDNA分子をもたらすように、第1及び第2のDNA断片が、相補的なオーバーハングを有する1つ以上のDNA断片とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを更に含み;
DNA断片及び直線化されたメチル化核酸をリガーゼでライゲートして、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列が両側に隣接するアセンブルされたDNA断片の配列を含む単一のアセンブルされたDNA分子を形成することを含む、DNAをアセンブルする方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、以下:
(A)一端に維持された複合要素を有し、もう一端に短縮複合要素を有する、本発明による第1の直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、前記維持された複合要素及び短縮複合要素が、DNAメチラーゼでメチル化されている工程;
第1の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されているオーバーハング末端を有するアセンブリのための第1のDNA断片を提供する工程;
上記アセンブリのための第1のDNA断片及び第1の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第1のメチル化中間ベクターを形成する工程;
上記第1のメチル化中間体ベクターを、維持された複合要素及び短縮複合要素のDNAメチラーゼ認識配列(複数の場合もある)のいずれかを認識するDNAメチラーゼ(複数の場合もある)を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第1の中間ベクターを形成する工程;
上記第1の中間ベクターを単離する工程;
(B)一端に維持された複合要素を有し、もう一端に短縮複合要素を有する、本発明による第2の直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、上記維持された複合要素及び短縮複合要素がDNAメチラーゼでメチル化されており、前記第1の直線化されたメチル化核酸の維持された複合要素によって提供されるオーバーハングが、第2の直線化されたメチル化核酸のメチル化保護可能な制限要素によって提供されるオーバーハングと配列が異なる工程;
第2の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されたオーバーハング末端を有するアセンブリのための第2のDNA断片を提供する工程;
上記アセンブリのための第2のDNA断片及び第2の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第2のメチル化中間ベクターを形成する工程;
上記第2のメチル化中間体ベクターを、維持された複合要素及び短縮複合要素のDNAメチラーゼ認識配列(複数の場合もある)のいずれかを認識するDNAメチラーゼ(複数の場合もある)を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第2の中間ベクターを形成する工程;
上記第2の中間ベクターを単離する工程;
(C)上記維持された複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素、及び短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で第1の中間ベクターを切断し、それにより維持された複合要素によって決定される維持されるオーバーハング配列、及びアセンブリのための第1のDNA断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第1の適合DNA断片インサートを形成する工程;
(D)上記維持された複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素、及び短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で第2の中間ベクターを切断することにより、
維持された複合要素によって決定される維持されるオーバーハング配列、及びアセンブリのための第2のDNA断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第2の適合DNA断片インサートを形成する工程;
を含み、
ここで、
(i)上記第1及び第2の適合DNA断片は、それらが互いにライゲートするために配置されるように、それらのネイティブオーバーハング配列が相補的である末端断片である;又は
(ii)アセンブリのための1つ以上の中央DNA断片が提供され、ここで、上記第1及び第2の適合DNA断片は、アセンブリ内の各末端断片であり、上記1つ以上の中央DNA断片が、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、上記第1及び第2の適合DNA断片の間にライゲートされるように配置され;
さらに、リガーゼで、第1及び第2の適合DNA断片、又は第1及び第2の適合DNA断片と1つ以上の中央DNA断片と共にライゲートして、各末端に維持されたオーバーハングを有するアセンブルされたDNA断片を形成する工程を含む、
DNA断片の瘢痕のないDNAアセンブリの方法が提供される。
本発明による更なる直線化されたメチル化核酸を提供することであって、該直線化されたメチル化核酸は、各末端に短縮複合要素を含み、該短縮複合要素はDNAメチラーゼでメチル化されていること;
上記直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されたオーバーハング末端を有するアセンブリのための適合中央DNA断片を提供すること;
上記アセンブリのための適合中央DNA断片及び直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、メチル化中間ベクターを形成すること;
上記メチル化された中間ベクターを、短縮複合要素のDNAメチラーゼ認識配列(複数の場合もある)のいずれかを認識するDNAメチラーゼ(複数の場合もある)を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない中間ベクターを形成すること;
上記中間ベクターを単離すること;
上記中間ベクターを、短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で切断し、それにより、アセンブリのための中央DNA断片のネイティブ配列によって決定される各末端にネイティブオーバーハング配列を含む中央DNA断片インサートを形成すること、
によって提供される。
Metcloの概要
本発明者らは、ここに、Metcloという名称の改良されたIIS型制限酵素に基づく階層型アセンブリ方法を開発し、これにより、使用する制限酵素の数を1つに削減する。本発明者らは、アセンブリに使用されるのと同じ酵素に対して特異的な一対のIIS型制限部位をアセンブリベクターに付加し、DNAメチル化によって選択的にブロックされるようにして、これを達成した。特定のメチラーゼを欠く正常な株へのアセンブルされたDNAの形質転換は、隣接する制限部位のブロックを解除し、同じIIS型制限酵素を使用して放出され得て、次いでDNAアセンブリのその後のラウンドに使用され得る、アセンブルされた断片を保持するプラスミドをもたらす。本発明者らは、一般的に使用されている3つの市販のIIS型酵素、BsaI、BpiI、及びLguIのオーバーラップするメチル化/制限部位をブロックする能力について多くのメチラーゼを試験し、それぞれに適したメチラーゼ、すなわちM.Osp807II(BsaIの場合、オーバーラップ配列GACNNGGTCTCN^NNNNを持つ)、M2.NmeMC58II(BpiIの場合、
プラスミド構築
プラスミドは、標準的な制限酵素及びライゲーションに基づくクローニング技術によって構築された。クローニング用のDNA断片は、PCR又は遺伝子合成(IDT又はInvitrogen)によって生成された。4つの断片に由来する約1kb DNAのモジュール式アセンブリの原理の証明のため、モジュール式アセンブリアクセプターベクター骨格はアンピシリン耐性MocloベクターpICH47732(Addgeneから入手可能であり、多重遺伝子コンストラクトの標準化されたアセンブリ用のモジュール式クローニングシステムで説明されている。Weber E,Engler C,Gruetzner R,Werner S,Marillonnet S.PLoS One.2011 Feb 18;6(2):e16765.doi:10.1371/journal.pone.0016765)に基づき、ドナープラスミド骨格は、pICH47732のアンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えることにより構築されたカナマイシン耐性ベクターに基づく。28個の断片に由来する200kb DNAの階層型アセンブリの場合、モジュール式アセンブリアクセプターベクターはF複製起点を含むゲンタマイシン又はカナマイシンに耐性の低コピーBACベクター骨格に基づき、ドナープラスミド骨格は、p15A又はFの複製起点を含むカナマイシン耐性の低コピーベクター骨格に基づく。メチラーゼ過剰発現用のプラスミドは、F複製起点を含むカナマイシン耐性の低コピーBACベクター骨格に基づいて構築される。メチラーゼ遺伝子はJ23100合成プロモーターの制御下にあり、組み換えによる大腸菌ゲノムへの安定した統合を促進するため、ゼオシン選択カセットと並んでarsB遺伝子座の相同配列が両側に隣接する。メチラーゼアッセイ用の鋳型プラスミドは、アンピリシリン耐性pICH47732に基づく。
特定のメチラーゼの安定した発現を伴う大腸菌株を、組み換えによって生成した。簡潔に言えば、メチラーゼ遺伝子と、ゼオシン選択マーカーと、隣接するarsB相同配列とを含むDNA断片を、対応するメチラーゼ発現BACプラスミドを鋳型として使用するPCRによって生成した。上記断片を、DH10B細胞でのラムダレッド(lambda red)の組み換えに使用し、続いてゼオシン選択によりメチラーゼ発現カセットをarsB遺伝子座に挿入した。正しい染色体挿入を有するクローンを、PCR及びシーケンシングによって検証した。メチラーゼ発現株は、抗生物質を選択せずに安定的に維持され得る。
4つの断片に由来する約1kb DNAのモジュール式アセンブリの原理を証明するため、DH5アルファ細胞から調製した各ドナープラスミド60fmol、適合性メチラーゼを発現するDH10B株から調製したアセンブリベクター60fmol、1000U T4 DNAリガーゼ(NEB)、及び1×T4リガーゼバッファー(NEB)20μl中の5U BsaI(NEB)又はBpiI(Fermentas)又は2.5U LguI(Fermentas)を使用して、アセンブリ反応を設定した。反応条件は以下の通りであった:37℃で15分間、続いて37℃で2分間+16℃で5分間を45サイクル、その後37℃で20分間、及び80℃で5分間。アセンブルしたサンプルをDH5アルファ化学コンピテント細胞に形質転換し、AIX選択(アンピシリン100ug/ml、IPTG 100μM、X-Gal 50μg/ml)を含むLBプレートに37℃で一晩播種した。白色コロニーを増殖させ、DNAシーケンシングによりスクリーニングした。
Metcloシステムは、標準IIS型制限酵素に基づくワンポットDNAアセンブリシステムによるものであり、次の段階のアセンブリでアセンブルされたDNAを放出するためアセンブリベクター骨格にIIS型制限部位の追加ペアを付加した。アセンブリプロセスで使用されるIIS型酵素とは異なる制限部位を使用するMocloシステムとは異なり、Metcloは同じ酵素に対する制限部位を使用する。アセンブルされたプラスミドがワンポットアセンブリ反応でこの酵素によって切断されるのを防ぐため、Metcloは特定のメチラーゼを使用してメチラーゼ認識配列とオーバーラップするIIS型制限部位をメチル化し、ベクター骨格のこれらのIIS型制限部位をブロックする。アセンブルされたプラスミドが特定のメチラーゼを欠く大腸菌株に形質転換されるとメチル化が失われるため、アセンブリ反応で使用されるのと同じIIS型制限酵素によってアセンブルされたプラスミドからのアセンブルされた断片の放出が可能になる。したがって、得られるMetcloシステムは、様々な用途の中で、単一のIIS型制限酵素を用いるワンポット反応を使用する、DNA断片の階層型アセンブリを可能にする。
本発明者らは、ここに、同じ制限酵素によって放出可能なアセンブルされたDNAを生成するBsaI、BpiI、LguI等の一般的なIIS型制限酵素を使用するDNAのワンポットアセンブリのためのIIS型制限酵素に基づく改変型DNAアセンブリシステムであるMetcloを提示する。これにより、単一のIIS型制限酵素を使用する、大きなDNAコンストラクトの階層型アセンブリが可能になる。該システムは、オーバーラップするメチル化/制限部位のin vivoメチル化のためのベクター調製工程中にメチラーゼ過剰発現株を使用して、ベクターの選択的制限部位をブロックする。アセンブリプロセスは、ワンポット反応を使用するIIS型DNAアセンブリシステムと同じであるため、既存のシステムの単純さを維持する。パーツの調製及び形質転換の工程は、標準Mocloシステムと同様に正常株を利用し、現在のIIS型アセンブリシステムに類似する、DNAアセンブリに通例のクローニング株の使用を可能にする。
別のシナリオでは、より長いDNA配列を、DNAアセンブリ後にこれらの配列がアセンブルされたDNAプラスミドの5’又は3’末端に付加されるように、アセンブリベクターのメチル化保護可能な制限部位と対向する保護不可能な制限部位との間に含めてもよい。この設計は、特殊化されたベクターを使用して、アセンブルされたプラスミドに共通要素を追加するのに便利である。
Metcloの独特な適用は、ユニバーサルクローニングベクターの限られたセットを使用する、大きなDNAコンストラクトの瘢痕のない階層型アセンブリのためのシステムである。ユニバーサルベクターを使用するIIS型に基づくDNAアセンブリは、クローン化された断片の接着末端を変更するアセンブリベクター中の1対1のIIS型制限部位の特定の配置に依拠する。瘢痕のないアセンブリは、その後のアセンブリラウンド用のDNA断片によって規定される接着末端(瘢痕)を有するアセンブルされたDNA断片を生成するためのこれらのユニバーサルベクターを使用して実現され、これは、アセンブリの瘢痕をアセンブルされた配列に埋め込んだ。Metcloシステムを使用すると、階層型アセンブリの異なる段階で外側断片に対して同じユニバーサル接着末端を維持できる。これら3つの特徴を組み合わせることで、普遍的な瘢痕のないアセンブリシステムをもたらす。
Metcloは、大きなDNAコンストラクトのIIS型制限酵素に基づく階層型アセンブリに単一の制限酵素を使用する課題を解決するために発明された。瘢痕のないMetcloは、ユニバーサルアセンブリベクターのセットを使用する、大きなDNAコンストラクトの瘢痕のない階層型アセンブリを達成するためにMetcloシステムの主要な構成要素(メチラーゼ発現株、オーバーラップするメチル化/制限部位)を利用するMetcloの更なる発展である。
1.Mocloシステムで「レベル-1」ユニバーサルクローニングベクター設計に使用されている、接着末端切り替え用の1対1型IIS制限部位の特殊な設計。Moclo「レベル-1」ベクター設計は、BpiI-BsaIの1対1制限部位を使用し、これは、MetcloのBsaIのみの1対1設計とは異なるが、接着末端切り替えの概念はMoclo「レベル-1」ベクター設計に基づく。
2.アセンブルされたDNA配列の周りに瘢痕配列を設計することによる、アセンブリ瘢痕の除去。これは、IIS型に基づく階層型アセンブリではこれまで実証されていない。
3.アセンブリの各段階でDNA断片の外側ブロックに同じ接着末端配列を維持するためのMetcloシステムの使用。
表3には、既知の全てのIIS型制限酵素(19種類の特異性を表す78個の酵素)のオーバーラップするメチル化/制限部位のブロッキングをもたらす可能性があるメチラーゼ/制限酵素の組み合わせの一覧が含まれる。
実施例では、II型DNAメチル化酵素を使用しているが、I型制限修飾酵素も検討され得る。I型制限修飾酵素は、メチルトランスフェラーゼと制限エンドヌクレアーゼの両方の活性を持つマルチサブユニット酵素である。それのI型制限修飾酵素は通常、3つの異なる遺伝子:メチル化サブユニット、制限サブユニット、DNA配列認識サブユニット(特異性サブユニット)によってコードされる3つのタイプのサブユニットで構成される。メチル化サブユニットと特異性サブユニットの両方がメチルトランスフェラーゼ活性に必要である。
瘢痕のないMetcloのプラスミドの配列を以下にfasta形式で収載する。下線付き配列は、LacZ選択断片及び高コピーベクターDNA調製用の複製起点を含む「廃棄配列」である。四角で囲まれた配列は、アダプターの切り替えに適した距離で1対1に配置される「メチル化保護可能な要素」及び「保護不可能な要素」を含む「劣勢/短縮複合要素」である。残りの配列は、低コピー複製起点(p15Aベース)及び選択マーカー(カナマイシン又はスペクチノマイシンのいずれか)を含むベクター骨格である。
pMXLK_VL、pMXLK_VM、pMXLK_VR(カナマイシン)
pMXLS_VL、pMXLS_VM、pMXLS_VR(スペクチノマイシン)
pMZLK_VL、pMZLK_VM、pMZLK_VR(カナマイシン)
pMZLS_VL、pMZLS_VM、pMZLS_VR(スペクチノマイシン)
pMXP_A4E、pMYP_A5E、pMZP_P6T
pMXBG_A7I、pMXBG_I7G、pMXBG_G7F、pMXBG_F7E、pMXBK_A7E
Claims (15)
- DNAアセンブリで使用するための核酸であって、
前記核酸が、少なくとも1つのメチル化保護可能な制限要素を含み、前記メチル化保護可能な制限要素は:
IIS型制限酵素認識配列;及び
DNAメチラーゼ認識配列
を含み、
前記IIS型制限酵素認識配列及び前記DNAメチラーゼ認識配列は、DNAメチラーゼにより修飾された塩基が前記IIS型制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記DNAメチラーゼ認識配列は、前記IIS型制限酵素認識配列と同一ではないか、又は前記IIS型制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記DNAメチラーゼ認識配列は、前記IIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成する配列とオーバーラップせず、
前記核酸は、前記メチル化保護可能な制限要素の切断部位の反対側に設けられた対向するIIS型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより短縮複合要素が形成され、
前記短縮複合要素の前記対向するIIS型制限酵素認識配列は、前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記IIS型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、
核酸。 - 前記核酸が第1および第2のメチル化保護可能な制限要素を含み、
前記核酸は、前記第1および第2のメチル化保護可能な制限要素のそれぞれの切断部位の反対側に設けられた対向するIIS型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより
(A)i)維持される複合要素、または挿入複合要素、およびii)短縮複合要素;または
(B)2つの短縮複合要素;
が形成され、
前記維持される複合要素は、前記対向するIIS型制限酵素認識配列が、同じオーバーハングが生じるように対向するメチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列と同じ部位で前記IIS型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記挿入複合要素は、前記メチル化保護可能な制限要素と前記対向するIIS型制限酵素認識配列との間に設けられた機能性配列インサートを含む配置であり、
前記短縮複合要素は、前記短縮複合要素の前記対向するIIS型制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記IIS型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置である、
請求項1に記載の核酸。 - 前記核酸が、2つのメチル化保護可能な制限要素の切断部位の間に廃棄配列である核酸配列を含む、又は
前記核酸が、各末端にメチル化保護可能な制限要素を有する直線化されたベクターである、
請求項2に記載の核酸。 - 前記廃棄配列が、選択マーカー、レポーター遺伝子、又は標識をコードする配列を含む、請求項3に記載の核酸。
- 前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列が、対向する保護不可能な制限酵素認識配列と同じ制限酵素種によって認識される、および/または
各メチル化保護可能な制限要素のDNAメチラーゼ認識配列が、同じメチラーゼによって認識される、
請求項1~4のいずれかに記載の核酸。 - 前記メチル化保護可能な制限要素が、配列GACNNGGTCTCNNNNN(BsaI/M.Osp807II-配列番号:1)、若しくはGAAGACGCNNNNNN(BpiI/M2.NmeMC58II-配列番号2)、若しくはGAAGCTCTTCNNNN(LguI/M.XmnI-配列番号3)を含む、又はそれからなる、請求項1~5のいずれかに記載の核酸。
- DNA断片の瘢痕のないDNAアセンブリの方法であって:
(A)第1の核酸の制限酵素切断によって生成された、第1の直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、前記第1の核酸は、廃棄配列が切り出されるように、それらの間に廃棄配列を含む第1および第2のメチル化保護可能な制限要素を含み、
前記第1の核酸の第1および第2のメチル化保護可能な制限要素はそれぞれ、
IIS型制限酵素認識配列;及び
DNAメチラーゼ認識配列
を含み、
前記IIS型制限酵素認識配列及び前記DNAメチラーゼ認識配列は、DNAメチラーゼにより修飾された塩基が前記IIS型制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記DNAメチラーゼ認識配列は、前記IIS型制限酵素認識配列と同一ではないか、又は前記IIS型制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記DNAメチラーゼ認識配列は、前記IIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成する配列とオーバーラップせず、
前記第1および第2のメチル化保護可能な制限要素は、前記DNAメチラーゼ認識配列を認識するDNAメチラーゼでメチル化され、
前記第1の核酸は、前記第1および第2のメチル化保護可能な制限要素のそれぞれの切断部位の反対側に設けられた対向するIIS型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより(i)維持される複合要素および(ii)短縮複合要素がもたらされ、
前記維持される複合要素は、前記対向するIIS型制限酵素認識配列が、同じオーバーハングが生じるように対向するメチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列と同じ部位で前記IIS型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記短縮複合要素は、前記短縮複合要素の前記対向するIIS型制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記IIS型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記第1の核酸は、前記対向するIIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素によって制限酵素切断され、それにより、前記第1の直線化されたメチル化核酸が形成され、
前記維持される複合要素及び短縮複合要素が、前記DNAメチラーゼでメチル化されている、
工程;
前記第1の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されているオーバーハング末端を有するアセンブリのための第1のDNA断片を提供する工程;
前記アセンブリのための第1のDNA断片及び第1の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第1のメチル化中間ベクターを形成する工程;
前記第1のメチル化中間ベクターを、前記維持される複合要素及び短縮複合要素のDNAメチラーゼ認識配列(複数の場合もある)のいずれかを認識するDNAメチラーゼ(複数の場合もある)を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第1の中間ベクターを形成する工程;
前記第1の中間ベクターを単離する工程;
(B)第2の核酸の制限酵素切断によって生成された、第2の直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、前記第2の核酸は、廃棄配列が切り出されるように、それらの間に廃棄配列を含む第1および第2のメチル化保護可能な制限要素を含み、
前記第2の核酸の第1および第2のメチル化保護可能な制限要素はそれぞれ、
IIS型制限酵素認識配列;及び
DNAメチラーゼ認識配列
を含み、
前記IIS型制限酵素認識配列及び前記DNAメチラーゼ認識配列は、DNAメチラーゼにより修飾された塩基が前記IIS型制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記DNAメチラーゼ認識配列は、前記IIS型制限酵素認識配列と同一ではないか、又は前記IIS型制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記DNAメチラーゼ認識配列は、前記IIS型制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成する配列とオーバーラップせず、
前記第1および第2のメチル化保護可能な制限要素は、前記DNAメチラーゼ認識配列を認識するDNAメチラーゼでメチル化され、
前記第2の核酸は、前記第1および第2のメチル化保護可能な制限要素のそれぞれの切断部位の反対側に設けられた対向するIIS型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより(i)維持される複合要素および(ii)短縮複合要素がもたらされ、
前記維持される複合要素は、前記対向するIIS型制限酵素認識配列が、同じオーバーハングが生じるように対向するメチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列と同じ部位で前記IIS型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記短縮複合要素は、前記短縮複合要素の前記対向するIIS型制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記IIS型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記第2の核酸は、前記対向するIIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素によって制限酵素切断され、それにより、前記第2の直線化されたメチル化核酸が形成され、
前記維持される複合要素及び短縮複合要素が前記DNAメチラーゼでメチル化されており、前記第1の直線化されたメチル化核酸の維持される複合要素によって提供されるオーバーハングが、前記第2の直線化されたメチル化核酸のメチル化保護可能な制限要素によって提供されるオーバーハングと配列が異なる、工程;
前記第2の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されているオーバーハング末端を有するアセンブリのための第2のDNA断片を提供する工程;
前記アセンブリのための第2のDNA断片及び第2の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第2のメチル化中間ベクターを形成する工程;
前記第2のメチル化中間ベクターを、維持される複合要素及び短縮複合要素のDNAメチラーゼ認識配列(複数の場合もある)のいずれかを認識するDNAメチラーゼ(複数の場合もある)を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第2の中間ベクターを形成する工程;
前記第2の中間ベクターを単離する工程;
(C)前記維持される複合要素のIIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素、及び前記短縮複合要素のIIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素で前記第1の中間ベクターを切断し、それにより前記維持される複合要素によって決定される維持されたオーバーハング配列、及びアセンブリのための前記第1のDNA断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第1の適合DNA断片インサートを形成する工程;
(D)前記維持される複合要素のIIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素、及び前記短縮複合要素のIIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素で前記第2の中間ベクターを切断し、それにより前記維持される複合要素によって決定される維持されたオーバーハング配列、及びアセンブリのための前記第2のDNA断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第2の適合DNA断片インサートを形成する工程;
を含み、
ここで
(i)前記第1及び第2の適合DNA断片は、それらが共にライゲートするため配列されるように、それらのネイティブオーバーハング配列が相補的である末端断片であるか;又は
(ii)アセンブリのための1つ以上の中央DNA断片が提供され、ここで、前記第1及び第2の適合DNA断片は、前記アセンブリにおいて各末端断片であり、前記1つ以上の中央DNA断片は、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、前記第1及び第2の適合DNA断片の間にライゲートされるように配置され;
さらに、リガーゼで、前記第1及び第2の適合DNA断片、又は前記第1及び第2の適合DNA断片と1つ以上の中央DNA断片と共にライゲートして、各末端に維持されたオーバーハングを有するアセンブルされたDNA断片を形成する工程を含む、
方法。 - 前記中央DNA断片が、前記第1の適合DNA断片のネイティブオーバーハングに相補的な第1のネイティブオーバーハング配列と、前記第2の適合DNA断片のネイティブオーバーハングに相補的な第2のネイティブオーバーハング配列と、を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記方法が、アセンブリのために2つ以上の中央DNA断片を含み、
前記中央DNA断片が、それらが予め決められた順序で一緒にライゲートされ得るように、隣接する中央DNA断片のネイティブオーバーハングに相補的なネイティブオーバーハング配列を含み、
配列中の最初と最後の中央DNA断片が、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、それぞれの第1の適合DNA断片及び第2の適合DNA断片にライゲートするように配置される、
請求項7に記載の方法。 - アセンブリのための中央DNA断片が、
核酸の制限酵素切断によって生成された、更なる直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、前記核酸は、廃棄配列が切り出されるように、それらの間に廃棄配列を含む第1および第2のメチル化保護可能な制限要素を含み、
前記核酸の第1および第2のメチル化保護可能な制限要素はそれぞれ、
IIS型制限酵素認識配列;及び
DNAメチラーゼ認識配列
を含み、
前記IIS型制限酵素認識配列及び前記DNAメチラーゼ認識配列は、DNAメチラーゼにより修飾された塩基が前記IIS型制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記DNAメチラーゼ認識配列は、前記IIS型制限酵素認識配列と同一ではないか、又は前記IIS型制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記DNAメチラーゼ認識配列は、前記IIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成する配列とオーバーラップせず、
前記第1および第2のメチル化保護可能な制限要素は、前記DNAメチラーゼ認識配列を認識するDNAメチラーゼでメチル化され、
前記核酸は、前記第1および第2のメチル化保護可能な制限要素のそれぞれの切断部位の反対側に設けられた対向するIIS型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより2つの短縮複合要素がもたらされ、
前記短縮複合要素は、前記短縮複合要素の前記対向するIIS型制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記IIS型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記核酸は、前記対向するIIS型制限酵素認識配列を認識するIIS型制限酵素によって制限酵素切断され、それにより、前記更なる直線化されたメチル化核酸が形成される、
工程;
前記更なる直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されたオーバーハング末端を有するアセンブリのための適合中央DNA断片を提供する工程;
前記アセンブリのための適合中央DNA断片及び更なる直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、メチル化中間ベクターを形成する工程;
前記メチル化中間ベクターを、前記メチル化保護可能な制限要素のDNAメチラーゼ認識配列(複数の場合もある)のいずれかを認識するDNAメチラーゼ(複数の場合もある)を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない中間ベクターを形成する工程;
前記中間ベクターを単離する工程;
前記中間ベクターを、前記メチル化保護可能な制限要素のIIS型制限酵素認識配列を認識する制限酵素で切断し、それにより、アセンブリのための中央DNA断片のネイティブ配列によって決定される各末端のネイティブオーバーハング配列を含む中央DNA断片インサートを形成する工程、
によって提供される、請求項7~9のいずれかに記載の方法。 - 前記アセンブルされたDNA断片の挿入のため直線化されたデスティネーションベクターを提供する工程を更に含む、請求項7~10のいずれかに記載の方法であって、任意選択で、前記直線化されたデスティネーションベクターは、維持される複合要素及び/又は短縮複合要素のIIS型制限酵素認識配列を認識する同じIIS型制限酵素で環状デスティネーションベクターを切断することにより提供されてもよい、方法。
- 請求項1~6のいずれかに記載の核酸を含む、組成物。
- 1つ以上の請求項1~6のいずれかに記載の核酸と、制限酵素及び/又はリガーゼと、を含むキット。
- 請求項1~6のいずれかに記載の核酸を含む、宿主細胞。
- 目的のDNA断片をアセンブルするための請求項1~6のいずれかに記載の核酸の使用であって、前記使用はin vitroである、使用。
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