KR102488128B1 - 게놈의 큰 단편 직접 클로닝 및 dna 다중-분자 어셈블리를 위한 새로운 기술 - Google Patents

게놈의 큰 단편 직접 클로닝 및 dna 다중-분자 어셈블리를 위한 새로운 기술 Download PDF

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Abstract

상동성 재조합 방법에 있어서, 상기 방법은 2개 이상의 표적 핵산 분자를 제1엑소뉴클레아제로 절단 및 어닐링하는 단계, 및 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질의 존재하에서 상기 2개 이상의 표적 핵산 분자를 재조합하는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 서열 상동성 영역은 상동성 재조합이 발생하는 표적 핵산 분자 사이에서 공유된다. 상기 방법에서 사용하기 위한 키트가 추가로 제공된다.

Description

게놈의 큰 단편 직접 클로닝 및 DNA 다중-분자 어셈블리를 위한 새로운 기술
본 발명은 핵산 클로닝 및 어셈블리 방법, 보다 상세하게는 데옥시리보핵산(DNA) 클로닝 및 어셈블리 방법에 관한 것이다.
DNA 클로닝은 유전자 기능 연구를 위해 분자 생물학 및 생명 공학에 사용되는 핵심 기술이다. DNA 시퀀싱 기술의 진보와 시퀀싱 비용의 감소로, 게놈 전체 시퀀싱이 쉬워지고 있다. 연구자들은 게놈에 미개발 자원이 풍부하다는 것을 발견했다. 짧은 DNA 단편은 PCR 또는 화학적 합성에 의해 쉽게 얻을 수 있지만, 10-kb보다 큰 DNA 단편을 클로닝하는 기존의 방법은 DNA 라이브러리의 구성 및 스크리닝에 의존한다. 기존의 라이브러리 구성 및 스크리닝 방법은 복잡하고 시간이 오래 걸리며 힘들며, 타겟 DNA 단편은 종종 여러 다른 영역에 존재한다. 연구원들은 단편을 서브 클로닝하거나 불필요한 서열을 제거하거나 유전자 기능을 조사하기 위한 완전한 생합성 경로로 그들을 통합하며, 따라서 기존의 라이브러리 구성 및 스크리닝 방법은 더 이상 시대의 요구를 충족시킬 수 없으며, 연구원은 간단하고 효율적이며 빠른 게놈 DNA 클로닝 및 변형 기술이 시급히 필요하다. 합성 생물학에 사용된 진보 기술로, 10-kb 이상의 큰 DNA 단편은 또한 시험관내 Gibson 어셈블리1 또는 생체 내 DNA 어셈블리2를 사용하여 선택된 작은 단편으로부터 조립될 수 있다. 그러나 상기 DNA 조립 공정에서, 작은 단편은 PCR 또는 화학적 합성에 의해서만 제조되므로, 임의의 돌연변이가 도입하여 후속 유전자 기능 연구에서 불편을 야기할 수 있다. 상기 방법은 고순도 및 농도를 갖는 DNA 단편을 필요로하며, 효소 게놈 DNA 단편의 혼합물로부터 표적 DNA 단편을 직접 조립하는데 사용될 수 없다.
게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열은 본 명세서에서 직접 클로닝(direct cloning)으로 지칭되는 벡터 내로 직접 클로닝된다. Rac 파지의 재조합 단백질 RecE 및 RecT는 선형-선형 재조합(linear-linear recombination)으로도 알려진 E. coli의 세포에서 선형 DNA 분자 사이의 효율적 상동성 재조합(homologous recombination)을 매개할 수 있다. RecE는 5'->3' 엑소뉴클레아제(5' to 3' exonuclease)이고, RecT는 단일 가닥 DNA(ssDNA)-어닐링 단백질이며, RecE와 RecT 사이의 단백질-단백질 상호 작용은 선형-선형 재조합, 단일 효과의 1000배의 효율인 RecET 결합 작용(combined action)의 선형-선형 재조합 효율을 위해 필요하다. RecET 직접 클로닝 기술은 10-kb 이상의 큰 게놈 DNA 단편을 발현 벡터로 직접 포획할 수 있고, 2-5 DNA 단편을 조립할 수도 있다. 게놈에서 적합한 제한 효소 부위를 발견하여 표적 DNA 단편을 방출할 수 있고, 이어서 게놈 DNA 및 제한 효소로 분해된 선형 벡터를 RecET 재조합 효소를 발현하는 E. coli 세포 내로 전기 천공시킨다. 세포 내의 표적 DNA 단편 및 선형 벡터는 양 말단의 상동성 박스(homologous box)에 의해 상동(homologously) 재조합되어 원형 플라스미드를 형성하고, 최종적으로 상기 재조합 DNA 분자를 함유하는 콜로니는 항생제 스크리닝 및 제한 분석에 의해 수득될 수 있다. 선형 벡터 및 게놈 DNA를 제조한 후, 표적 DNA 단편의 직접 클로닝을 완료하는데 단지 3일이 소요된다. 현재, 이 기술은 박테리아 천연 생성물 생합성 경로의 클로닝 및 이종 발현 연구에 널리 사용되어왔다. 예를 들어, Photorhabdus luminescens에서 유래된 ten10-52-kb 폴리케타이드 신타아제(PKS)/비-리보솜 폴리펩티드 합성효소(NRPS) 유전자 클러스터3, Paenibacillus larvae에서 유래된 12-kb 세바디신 유전자 클러스터, Pseudomonas syringae에서 유래된 19-kb 시린골린 유전자 클러스터, Burkholderia DSM7029에서 유래된 25-kb 글리도박틴 유전자 클러스터6, E. coli Nissle 1917에서 유래된 50-kb 콜리박틴 유전자 클러스터7.
직접 복제의 장점은 라이브러리 구축 및 선별과 비교하여 해당 분야의 많은 관련 연구를 주도한다. Larionov et al.는 효모 재조합 시스템에 의존하는 TAR 클로닝 기술8을 확립한 다음, 더욱 용이한 적용을 위해 TAR 클로닝의 효율이 증가하도록 TAR을 Cas9 절단과 조합하였다9 ,10. 최근에 확립된 Cas9-Assisted Targeting of Chromosome Segments(CATCH) 기술은 Cas9 시험관내 절단 및 Gibson 어셈블리를 사용하여 큰 DNA 단편을 BAC11에 결합한다. 이 방법은 현재 원핵생물 게놈에만 적용되며, 재조합 DNA의 제한 효소 절단(digestion) 전에 콜로니의 PCR 사전 스크리닝이 필요하다. 본 발명자들이 아는 한, 상기 2가지 방법을 포함하여 현재 알려진 모든 직접 복제 방법은 일부 전문가에 의해서만 조작될 수 있다.
RecET 직접 클로닝은 박테리아 게놈3 -6,12에서 50kb 미만의 DNA 단편을 클로닝하는데 편리하지만, 박테리아 게놈으로부터 더 큰 DNA 단편을 클로닝하거나 포유동물 게놈으로부터 클론 DNA 단편을 클로닝하는 것은 어렵다. 그 이유는 RecET 직접 클로닝 기술은 RecET 재조합 효소의 세포 내 발현에 의존하고, 클로닝 벡터 및 표적 DNA 단편이 동시에 대장균 세포에 들어가서 만나는 경우에만 상동성 재조합이 발생하기 때문이고, 이것은 다음과 같은 결함이 발생한다: (1) 게놈 DNA 단편의 크기를 제한한다. 예를 들어, 박테리아 게놈으로부터 50-kb보다 큰 DNA 단편을 클로닝하거나 포유동물(예를 들어 마우스 및 인간)로부터 10-kb보다 큰 게놈 단편을 클로닝하는 것은 불가능하다. 이는 게놈에서 특정 DNA 단편의 농도가 매우 낮기 때문이며, 이는 형질 전환 동안 표적 DNA 단편 및 클로닝 벡터가 동시에 세포로 들어갈 가능성이 적기 때문이다. 더욱이, 게놈 DNA를 제조하는 동안 물리적 전단력의 영향으로 인해, 표적 DNA 단편이 클수록 게놈의 농도가 낮아져서 표적 DNA 단편이 클로닝 벡터와 함께 세포로 유입될 확률이 낮아진다. 마우스(2800 Mb) 및 인간(3200 Mb)의 게놈은 박테리아 게놈(5 Mb)보다 거의 약 1000배 더 크므로 같은 크기의 게놈 DNA 단편의 농도는 박테리아보다 포유류 게놈에서 훨씬 낮다. 따라서, 클로닝 벡터와 동시에 표적 DNA 단편이 E. coli 세포로 들어갈 확률은 포유동물의 게놈 DNA 단편을 직접 클로닝할 때 훨씬 낮다. (2) 다수의 단편을 조립하는 동안 DNA 단편의 수에 의해 영향을 받고, DNA 단편의 수가 4를 초과함에 따라 조립 효율이 크게 감소된다. 현재 RecET 직접 복제 기술은 최대 5개의 DNA 단편만 조립한다. 다중 단편 조립의 경우, DNA 단편의 수가 많을수록 이들이 함께 세포로 들어갈 가능성이 낮아지고 조립 효율이 낮아진다. 따라서, 이 분야는 특히 결과 DNA 단편의 크기 및 게놈 복잡성에 의해 제한되지 않는 작동하기 쉽고 널리 사용되는 직접 클로닝 기술이 필요하다.
게놈에서 큰 DNA 단편을 직접 복제하는 기술적 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 먼저, 시험관내에서 게놈 DNA 및 클로닝 벡터를 엑소뉴클레아제로 절단하고, 시험관내 반응 생성물을 RecET 재조합 효소의 존재하에 상동적으로(homologously) 재조합하여 ExoCET 클로닝 기술을 확립하였다. ExoCET 기술은 박테리아 게놈에서 직접 100-kb보다 큰 DNA 단편을 복제하고 포유류 세포와 인간 혈액에서 50-kb보다 큰 DNA 단편을 복제할 수 있다. ExoCET 기술은 또한 완전한 플라스미드를 형성하기 위해 적어도 20 개의 DNA 단편을 효율적으로 조립할 수 있다.
RecET 직접 클로닝 기술과 마찬가지로 ExoCET은 충실도(fidelity)가 높고 DNA 하플로타입(haplotype)을 파괴하지 않는다는 점에서 PCR에 비해 비교 우위가 있으며, 표적 DNA는 플라스미드 벡터로 직접 복제되어 발현 연구를 용이하게 한다. 또한, Gibson은 시험관내 어셈블리에 의해 생성된 원형 DNA 분자에 의존하기 때문에 ExoCET은 Gibson 어셈블리보다 더 효율적이다. 더욱이, 빈 캐리어 자체의 고리화로 인해, Gibson 어셈블리는 직접 클로닝 과정에서 매우 심각한 배경(background)을 생성할 수 있는데, 이는 Jiang et al 11이 재조합 DNA를 식별하기 전에 PCR 사전 스크리닝을 수행하는 이유일 수 있다; Zhou et al13이 Streptomyces conglobatus 게놈에서 콩글로바틴(conglobatin) 유전자 클러스터를 복제하기 위해 Gibson 어셈블리를 사용할 때 제한 절단(restriction digestion) 및 아가로스겔 전기 영동에 의해 생성된 20kb 이하의 게놈 DNA 단편을 제거해야 하는 이유이기도 하다.
ExoCET은 단일-뉴클에오티드 다형성(single-nucleotide polymorphism, SNP)의 할로타입(haplotype) 연구를 촉진하고 뉴클레아제-매개 인간 줄기세포 표적화를 위한 할로타입 동질유전자 표적화(haplotype isogenic targeting, HIT) 벡터를 신속하게 구축하기 위하여 혈액, 질병 관련 세포주 등과 같은 포유동물 게놈에서 DNA 단편을 직접 복제하는데 사용될 수 있다. 생의학 연구에서 재프로그래밍하는 환자, 제대혈 또는 체세포로부터 분리된 인간 줄기세포의 중요성이 점점 더 많은 관심을 받고 있으며, 줄기세포 게놈의 정확한 변형에 대한 연구도 널리 주목을 받고 있다. 인간 게놈을 변형시키는 것은 복잡한 인간 유전자 다양성으로 인해 실험실 마우스 게놈을 변형시키는 것보다 더 어렵다. 상동성 재조합(homologous recombination)에 대한 동질 유전자성(isogenicity)(서열 유사성)의 중요성은 사람들이 유전자 표적화를 위해 마우스 배아 줄기세포를 사용할 때 수년 전에 실현되었다14. 그러나 상동성 재조합에 대한 서열 불일치의 효과는 잘 연구되지 않았다. 예를 들어, 단일 미스매치(SNP 또는 indel)가 얼마나 많은 재조합 효율을 감소시키는지, 재결합 사이트로부터 불일치 사이트의 거리가 재조합 효율에 어떻게 영향을 미치는지, 여러 불일치가 재조합 효율에 어떤 영향을 주는지, 위의 문제는 아직 명확하지 않다. 어쨌든 유전자 표적화에 동일한 서열을 사용하는 것이 분명히 권장되므로 ExoCET은 이상적인 상동성 박스(homology box)를 신속하게 얻는 효과적인 기술이다. PCR에 의해 게놈으로부터 상동성 박스를 증폭시키는 방법과 달리, ExoCET은 단편 크기에 의해 제한되지 않으며, 돌연변이를 도입하지 않으며, DNA 할로타입을 유지할 수 있다. 또한, 상동성 박스의 말단은 또한 유전자형의 형태(예를 들어 서던 블롯팅 또는 라이게이션 PCR)에 따라 선택되어 상동성 박스의 길이를 최적화할 수 있다. 따라서 ExoCET은 특히 CRISPR/Cas9와 결합된 경우에 개별화된 게놈 수술에 대해 이점을 제공한다15. 서던 블롯팅 및 라이게이션 PCR은 위양성 신호(false positive signal)를 갖는 반면, ExoCET은 변형된 게놈의 유전자형을 분석하는 가장 신뢰할 수 있은 방법으로 사용될 수 있다.
ExoCET은 복잡한 게놈에서 큰 DNA 조각을 선택적으로 캡처할 수 있어 질병 진단 및 병리 검사의 수단이 된다. 예를 들어, 개별화된 의약품에서 직접 DNA 서열을 포획하거나 환자 샘플에서 DNA 바이러스를 분리. ExoCET은 기능적 유전체학 및 비교 유전체학 연구, 특히 원핵생물 합성 경로의 직접 클로닝 또는 합성 생물학을 위한 다중 DNA 분자 조립에 널리 사용될 것이다.
일 양태에서, 본 개시는 상동성 재조합(homologous recombination) 방법을 제공하고, 상기 방법은 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자를 제1엑소뉴클레아제(exonuclease)로 처리하는 단계, 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질(annealing protein)의 존재하에 처리하여 상기 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자를 재조합하는 단계를 포함하고, 여기서 재조합 표적 핵산 분자는 하나 이상의 상동성 서열(homologous sequence)을 공유한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 상동성 재조합(homologous recombination) 방법을 제공하고, 상기 방법은 제1핵산 분자 및 제2핵산 분자를 제1엑소뉴클레아제(exonuclease)로 처리하는 단계, 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질(annealing protein)의 존재하에 처리하여 상기 제1핵산 분자 및 제2핵산 분자를 재조합하는 단계를 포함하고, 여기서 제1핵산 분자 및 제2핵산 분자는 하나 이상의 상동성 서열을 공유한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 선형 핵산 분자를 조립(assembling)하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자를 제1엑소뉴클레아제(exonuclease)로 처리하는 단계, 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질(annealing protein)의 존재하에 처리하여 상기 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자를 재조합하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 핵산 분자는 생성된 조립(assembly) 생성물에서 인접한 핵산 분자와 하나 이상의 상동성 서열을 공유한다.
또한, 본 개시는 게놈 DNA를 클로닝하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 게놈 DNA 단편 혼합물 및 선형 클로닝 벡터를 제1엑소뉴클레아제로 처리하는 단계, 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질의 존재하에 처리하여 상기 게놈 DNA 단편 혼합물 및 선형 클로닝 벡터를 재조합하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 선형 클로닝 벡터는 게놈 DNA 단편의 혼합물의 표적 DNA 단편과 하나 이상의 상동성 서열을 공유한다.
적어도 하나의 상동성 서열은 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자의 내부 또는 일단부(one end)에, 특히, 적어도 하나의 상동성 서열이 표적 핵산 분자의 일단부에, 그리고 보다 특히, 모든 상동성 서열이 상기 표적 핵산 분자의 일단부에 위치할 수 있다.
적어도 하나의 상동성 서열은 적어도 6, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80 뉴클레오티드, 특히 25, 40 또는 80 뉴클레오티드, 더욱 특히 80 뉴클레오티드의 길이를 포함한다.
제1엑소뉴클레아제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 또는 3'->5' 엑소뉴클레아제, 특히 T4 DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I의 클레노프(Klenow) 단편, T5 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제, 더욱 특히 T4 DNA 폴리머라제 또는 T5 엑소뉴클레아제일 수 있다.
제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 시험관내 결합(in vitro joining)을 포함한다. 상기 시험관내 결합은 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자 또는 제1핵산 분자를 제2핵산 분자에 결합시키거나, 처리된 선형 클로닝 벡터를 게놈 DNA 단편의 혼합물의 표적 DNA 단편에 결합시킬 수 있다.
제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 효소 절단(enzyme digestion) 및 어닐링을 포함하고; 상이한 핵산 분자의 효소 절단은 예를 들어 샘플의 혼합물에서 개별적으로 또는 동시에 수행될 수 있다.
제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 DNA 폴리머라제, dNTP 및 DNA 리가제(ligase)를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제의 첨가를 추가로 포함한다.
제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 dNTP의 첨가를 배제한다.
제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 T4 DNA 폴리머라제 처리 또는 깁슨 어셈블리(Gibson assembly)를 포함한다.
제2엑소뉴클레아제는 RecE이고, 특히 RecE는 재조합 발현 생성물이다.
상기 단일-가닥 어닐링 단백질은 RecA, RAD51, Redβ, RecT, Pluβ 또는 RAD52를 포함하고, 특히 상기 어닐링 단백질은 RecT이며, 보다 구체적으로, RecT는 재조합 발현 생성물이다.
상기 어닐링 단백질은 RecT이고, 특히 RecT는 재조합 발현 생성물이다.
상기 상동성 재조합은 시험관내 또는 숙주 세포에서 수행된다.
상기 숙주 세포는 효모 세포일 수 있고, 특히 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae ) 세포이고; 또는 박테리아 세포, 특히 박테리아 세포는 바실러스 서브스틸리스 (Bacillus subtilis ) 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다.
상기 숙주 세포는 엑소뉴클레아제, 특히 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질을 발현시킨다.
상기 숙주 세포는 엑소뉴클레아제, 어닐링 단백질 및 Redγ를 발현시킨다. 특히, 상기 숙주 세포는 RecA를 추가로 발현하고, 보다 특히 숙주 세포는 RecE, RecT, Redγ, 및 RecA를 발현한다.
상기 숙주 세포는 전장(full length) RecE 및/또는 RecT를 발현하는 E. coli 세포이고, 특히 상기 숙주 세포는 전장 RecE, RecT 및 Redγ를 발현하는 E. coli 세포이고, 보다 특히 상기 숙주 세포는 전장 RecE, RecT, Redγ 및 RecA를 발현하는 E. coli 세포이다.
상기 숙주 세포는 절단된(truncated) RecE 및 RecT를 발현하는 E. coli 세포이다.
상기 숙주 세포는 Redα 및 Redβ를 발현하는 E. coli 세포이다.
상기 숙주 세포는 플라스미드 벡터 및/또는 염색체에서 엑소뉴클레아제, 특히 플라스미드 벡터에 의해 발현되고, 보다 구체적으로는 플라스미드 벡터와 염색체 동시에 의해 발현되는 특히, 제2엑소뉴클레아제, 어닐링 단백질, Redγ 및/또는 RecA를 발현한다.
상기 표적 핵산 분자 또는 표적 DNA 단편은 엔도뉴클레아제에 의해 절단된(digested) DNA 단편, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편, 게놈 DNA 단편, cDNA 라이브러리의 구성원, 박테리아 인공 염색체(BAC) 및 클로닝 벡터의 단편으로부터 선택된 선형 DNA 단편이다.
상기 엔도뉴클레아제는 제한 효소 또는 프로그램 가능한 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9 일 수 있다.
상기 표적 핵산 분자 또는 DNA 단편의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상이다.
상기 표적 핵산 분자는 0.5kb 또는 그 이상(예를 들어, 1-kb 이상, 2.5-kb 이상, 4-kb 이상, 5-kb 이상, 7.5-kb 이상, 10-kb 이상, 15-kb 이상, 20-kb 이상, 25-kb 이상, 40-kb 이상, 50-kb 이상, 75-kb 이상 또는 100-kb 이상)의 서열을 포함한다.
상기 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자, 제1표적 핵산 분자 및 제2표적 핵산 분자 또는 표적 DNA 단편은 하나 이상의 PCR 증폭된 DNA 단편, 게놈 DNA 단편, cDNA 라이브러리 구성원 및/또는 BAC로부터 유래된 단편을 포함할 수 있다.
상기 제1엑소뉴클레아제는 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지며, 특히 T4 DNA 폴리머라제이다.
상기 엑소뉴클레아제로 처리하는 단계는 dNTP가 없는 시험관내에서 수행된다.
상기 제2엑소뉴클레아제는 전장 RecE이다.
상기 어닐링 단백질은 RecT이다.
상기 상동성 재조합은 전장 RecE 및 RecT를 발현하는 박테리아 숙주 세포, 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 수행된다.
상기 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 PCR 증폭된 DNA 단편, 게놈 DNA 단편, cDNA 라이브러리 구성원 및/또는 BAC로 유래된 단편, 선형 플라스미드 및/또는 클로닝 벡터 단편, 특히 3개 또는 그 이상의 선형 플라스미드 및/또는 클로닝 벡터 단편을 포함한다.
상기 제1엑소뉴클레아제는 깁슨 어셈블리를 포함한다.
상기 제2엑소뉴클레아제는 전장 RecE이다.
상기 어닐링 단백질은 RecT이다.
상기 상동성 재조합은 전장 RecE 및 RecT를 발현하는 박테리아 숙주 세포, 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 수행된다.
상기 2개 또는 그 이상의 표적 핵산 분자는 3개 또는 그 이상의 PCR 증폭된 DNA 단편, 게놈 DNA 단편, cDNA 라이브러리 구성원 및/또는 BAC로 유래된 단편, 선형 플라스미드 및/또는 클로닝 벡터 단편, 특히 3개 또는 그 이상의 선형 플라스미드 및/또는 클로닝 벡터 단편을 포함한다.
상기 제1엑소뉴클레아제는 깁슨 어셈블리를 포함한다.
상기 제2엑소뉴클레아제는 전장 RecE이다.
상기 어닐링 단백질은 RecT이다.
상기 상동성 재조합은 전장 RecE 및 RecT를 발현하는 박테리아 숙주 세포, 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 수행된다.
또한, 상기 방법에 기재된 제1엑소뉴클레아제 및 제2엑소뉴클레아제 또는 상기 방법에 기재된 제1엑소뉴클레아제 및 제2엑소뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 키트는 상기 방법에 기재된 제1엑소뉴클레아제 및 제2엑소뉴클레아제, 또는 제1엑소뉴클레아제 및 제2엑소뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함한다. 특히, 상기 키트는 제2엑소뉴클레아제를 발현하는 숙주 세포를 추가로 포함하고, 특히 상기숙주 세포는 엑소뉴클레아제, 어닐링 단백질 및 Redγ를 발현하고, 특히 상기 숙주 세포는 RecA를 발현하고, 보다 특히 상기 숙주 세포는 RecE, RecT, Redγ 및 RecA를 발현하고, 상기 숙주 세포는 효모 세포(yeast cell)일 수 있고, 특히 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae ) 세포; 또는 박테리아 세포, 특히 상기 박테리아 세포는 바실러스 서브 틸리스 (Bacillus subtilis ) 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다. 상기 숙주 세포는 플라스미드 벡터 및/또는 염색체상에서 동시에, 특히 플라스미드 벡터에 의해 발현되는, 더욱 특히 플라스미드 벡터 또는 염색체에 의해 발현되는, 엑소뉴클레아제, 어닐링 단백질, Redγ 및/또는 RecA를 발현하며, 더욱 특히 상기 키트는 하나 이상의 미리 제조된 선형 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제1엑소뉴클레아제는 T4 DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I의 클레노프(Klenow) 단편, T5 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제와 같은 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제이고, 제2엑소뉴클레아제는 전장 RecE이다.
상기 키트는 제2엑소뉴클레아제를 발현하는 숙주 세포를 추가로 포함하며, 특히 상기 숙주 세포는 전장 RecE, RecT, Redγ 및 RecA의 인코딩하는 핵산을 포함한다.
상기 키트는 하나 이상의 미리 준비된 선형 벡터를 추가로 포함한다.
표적화 벡터의 구축에서 상기 언급된 방법 또는 키트의 용도.
포유동물 세포의 유전자형 분석에서 상기 언급된 방법 또는 키트의 용도.
DNA 합성에서의 상기 언급된 방법 또는 키트의 용도.
도 1은 시험관내 어셈블리의 공동 작용을 나타내고, 전장 RecE/RecT는 직접 클로닝의 효율을 향상시킨다. (a) : P. phosphoreum ANT-2200 게놈으로부터의 14-kb lux 유전자 클러스터의 직접 클로닝의 개략도. p15A-cm 벡터 및 표적 게놈 DNA 단편은 마지막에 동일한 서열을 갖는다. (b) : 더욱 긴 상동성 암(homology arm)은 ExoCET의 클로닝 효율을 증가시킨다. 25-bp, 40-bp 또는 80-bp 상동성 박스를 갖는 선형 벡터를 각각 게놈 DNA와 혼합하고, 어닐링 및 아라비노스-유도된 E. coli GB05-dir로 전환하기 전에 T4pol 0.02 U μL-1로 25℃에서 20분 동안 반응을 수행하였다. 오차 막대, s.d.; n = 3. (c) : T4pol의 농도를 최적화. 상이한 농도의 T4pol을 제외하고, 80-bp 상동성 박스 및 게놈 DNA를 포함하는 선형 벡터를 (b)에서와 동일한 방식으로 처리하였다. (d) : 클로닝 효율에 대한 T4pol의 인큐베이션 시간의 영향. (c)와 마찬가지로, 0.02 U μL-1의 T4pol을 사용하였으나 배양 시간은 상이하였다. (e) : ETgA의 사본 수(copy number)가 많을수록 ExoCET 클로닝 효율이 증가한다. (d)와 같이, 인큐베이션 시간은 1시간이었고, 이어서 시험관내 조립 생성물을 아라비노스-유도 E. coli GB05-dir(염색체 상에 ETgA의 카피 포함), pSC101-BAD-ETgA-tet의 GB2005(pSC101 플라스미드 상에 ETgA -5 카피 포함) 또는 pSC101-BAD-ETgA-tet의 GB05-dir(EtgA의 -6 카피 포함)으로 개별 전기 천공시켰다. (f) : ExoCET은 직접 복제 효율을 증가시킨다. (e)와 마찬가지로 pSC101-BAD-ETgA-tet를 포함하는 GB05-dir(ExoCET)가 사용되었으며, 또는 T4pol 처리(ETgA)를 사용하지 않았거나 아라비노스 유도(T4pol)를 사용하지 않았다.
도 2는 lux 유전자 클러스터의 직접 클로닝에 대한 상이한 엑소뉴클레아제의 효과를 보여준다. p15A-cm 벡터 및 P. phosphoreum 게놈 DNA를 엑소뉴클레아제로 처리하고, 어닐링한 다음 아라비노스-유도된 E. coli GB05-dir로 전기 천공시켰다. (a) : 상이한 엑소뉴클레아제의 초기 검출. (b-d) : Kle, T5exo 및 T7exo의 농도 최적화. (e) : 최적 농도에서 T4pol, Kle, T5exo 및 T7exo로 20분 분해(digestion)후 클로닝 효율의 비교. (f) : T4pol(0.02 U μL-1)의 분해 온도 및 시간 최적화. 오차 막대, s.d.; n = 3.
도 3은 lux 유전자 클러스터의 직접 클로닝에 대한 어닐링 속도의 효과를 보여준다. 오차 막대, s.d.; n = 3. p15A-cm 벡터 및 P. phosphoreum 게놈 DNA를 0.02 U μL-1 T4pol로 분해한 다음 다른 방법(A, B, C)으로 어닐링하고 최종적으로 아라비노스-유도 E. coli GB05-dir에 전기 천공시켰다.
도 4는 선형 클로닝 벡터 및 ExoCET 직접 클로닝 기술의 제조 흐름도이다. (a) : p15A-cm 벡터는 PCR 증폭에 의해 제조되었고, 사용된 프라이머는 80개 뉴클레오티드의 상동성 박스를 가지고 있다. (b) : ExoCET 직접 클로닝의 표준 전략. 시험관내 어셈블리된된 생성물을 pSC101-BAD-ETgA-tet를 함유하는 아라비노스-유도 GB05-dir로 형질 전환시키고, 항생제 스크리닝에 의해 올바른 재조합체를 수득하였다.
도 5 (a) : p15A-cm와 14-kb lux 게놈 DNA 단편 사이의 80-bp 상동성 박스의 위치 : (A) 두 상동성 박스는 가장 말단에 있다; (B, C) 하나는 상기 말단에서 1 kb에 위치하고 다른 하나는 말단에 있다. (D) 둘 다 말단에서 1-kb에 위치한다. 반응 조건은 (1f)와 동일하다. (b) : 상기 4개의 상동성 박스와 조합하여 ETgA, T4pol 또는 ExoCET에 의해 콜로니 수를 수득하였다. (c) : GB2005에서 ExoCET 및 말단 상동성 박스를 사용하여, 14-kb lux 유전자 클러스터의 직접 클로닝 효율은 pSC101 플라스미드(ETg-no express RecA; Eg-no express RecA 및 RecT; Tg-no express RecA 및 RecE; pSC101-tet-empty vector)에 의해 발현된 재조합 단백질의 상이한 조합에 의해 얻어졌다.
도 6은 EcoRV 또는 Cas9로 절단된 Streptomyces albus 게놈 DNA를 사용한 106-kb 살리노마이신 유전자 클러스터의 직접 클로닝을 보여준다. (a) : ExoCET의 작용하에, 살리노마이신 유전자 클러스터를 EcoRV 또는 Cas9 gRNA2/Cas9-gRNA7로 절단된 게놈 DNA로부터 클로닝한 후 pBeloBAC11 벡터에 삽입하였다. 상동성 박스(청색)를 우선 BAC 벡터에 삽입하고 상기 BAC 벡터를 BamHI 분해에 의해 선형화하여 직접 클로닝 벡터로 만들었다. 상동성 박스의 길이는 게놈 DNA 단편의 말단에 표시되었다. (b) : 재조합 DNA의 PvuII 제한 분석, 정확한 클론은 화살표로 표시하였다.
도 7은 ExoCET 및 Gibson 어셈블리의 효율 비교를 보여준다. (a) : 말단 상동성 박스를 사용하여 마우스 게놈으로부터 Wnt4 유전자를 함유하는 45-kb DNA 단편의 직접 클로닝의 개략도. (b) : ExoCET 및 Gibson 방법으로 얻은 콜로니 수. p15A-cm 및 SwaI로 절단된 마우스 게놈 DNA를 각각 ExoCET 및 Gibson으로 처리한 다음, 아라비노스-유도(ExoCET 또는 Gibson + ETgA) 또는 비- 유도(T4pol 또는 Gibson)이든지 pSC101-BAD-ETgA-tet-dir을 함유하는 GB05로 형질 전환시켰다. -. (c) : T4pol, ExoCET, Gibson 및 Gibson + ETgA에 의해 다수의 DNA 단편을 플라스미드로 조립하는 개략도. DNA 단편의 크기 범위는 1.0-kb 내지 5.4-kb이고, 어셈블리된된 p5A 플라스미드의 크기 범위는 29.8-kb 내지 54.9-kb이며, 상기 플라스미드는 클로람페니콜(cm)에 내성이 있었다. (d) : 다수의 단편 어셈블리의 실험에 의해 수득 된 클론의 수 및 정확한 속도. 시험관내 조립된 생성물을 아라비노스-유도 (ExoCET 또는 Gibson + ETgA) 또는 비유도 (T4pol 또는 Gibson)에 상관없이 pSC101-BAD-ETgA-tet를 함유하는 GB05-dir로 형질 전환시켰다.
도 8은 포유동물 게놈 DNA를 사용한 DPY30에 대한 HIT(haplotype isogenic targeting) 벡터의 구축을 보여준다. (a) : SpeI로 절단된 인간 게놈 DNA를 사용한 DPY30 정지 코돈의 클로닝의 개략도. 상기 직접 클로닝이 완료된 후, DPY30의 C-말단은 Redαβ 재조합공학(recombineering)의 mVenus 요소16 ,17에 의해 표지되었다. (b) : 인간 혈액으로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, ExoCET에 의해 직접 클로닝된 재조합 DNA를 EcoRI 절단 분석에 적용하였다. (c) : ExoCET 및 인간 배아 신장 293T 세포로부터 분리된 게놈 DNA를 통한 직접 클로닝에 의해 수득된 재조합 DNA의 EcoRI 절단 분석. (d) : Redαβ 재조합공학에 의해 mVenus 요소를 삽입한 후 수득된 재조합 DNA의 PvuII 절단 분석. 수득된 모든 클론은 정확하였으며, 레인 11이 대조군이었다. 올바른 클론은 화살표로 표시되었다.
도 9는 마우스 게놈 DNA를 사용하여 Dpy30에 대한 HIT(haplotype isogenic targeting) 벡터의 구축을 보여준다. (a) : BamHI + KpnI로 절단된 마우스 게놈 DNA를 사용한 Dpy30 정지 코돈의 클로닝의 개략도. 직접 복제된 후, DPY30의 C-말단에 Redαβ 재조합공학을 사용하여 mVenus 카세트16 ,17로 태그하였다. (b) : ExoCET 및 마우스 흑색종 B16 세포로부터 분리된 게놈 DNA를 통한 직접 클로닝에 의해 수득된 재조합 DNA에 대한 EcoRI 절단 분석. (c) : Redαβ 재조합공학의 mVenus 요소를 삽입하여 얻은 재조합 DNA의 NheI 절단 분석. 수득된 모든 클론은 정확하였으며, 레인 11이 대조군이었다. 올바른 클론은 화살표로 표시되었다.
도 10은 ExoCET를 사용한 포유동물 세포의 유전자형 분석을 보여준다. (a) : ExoCET을 사용한 유전자형 분석의 개략도. 제한 부위는 각각 타겟팅 요소의 상류와 하류에 위치했다. (b) : ExoCET을 사용하여 카나마이신 내성을 갖는 Kmt2d-AID-neo에 의해 표적화된 마우스 배아 줄기세포의 유전자형 분석. 표적화 요소를 함유하는 DNA 단편은 SspI 및 SpeI를 사용하여 게놈으로부터 방출되었다. 10 μg의 제한-절단된 게놈 DNA 및 PCR-증폭된 p15A-cm 벡터를 사용하여 ExoCET 클로닝을 수행하였다. p15A 벡터에 클로닝된 표적화 단편 및 야생형 단편은 이중 줄무늬(double streak) 및 제한 효소 절단에 의해 분리될 수 있다.
도 11은 Klf4-Venus-neo-targeted 마우스 배아 줄기세포의 ExoCET 유전자형 분석에 의해 얻어진 클로람페니콜 내성 콜로니의 EcoRV + PstI 제한 분석을 나타낸다.
DNA 재조합은 파지 syn/exo 단백질(주로 Redα 및 Redβ)의 상동성 재조합에 의해 매개되는 E. coli 세포에서 DNA 분자를 변형시키기 위한 유전공학 기술이다18 -22. DNA 재조합은 E. coli sbcA(recBC 억제제) 균주에서 처음 발견되었으며, 이는 DNA 분자 사이의 상동성 재조합을 상동성 박스로 효율적으로 매개하는 활성을 가지고 있다23. 상기 sbcA 균주는 E. coli 에서 상동성 재조합 경로를 찾는 AJ Clark의 고전적인 실험에서 발견되었다. 그는 DNA 손상에 매우 민감한 recBC 균주를 사용하여 억제제를 스크리닝하고의 RecE 및 RecT 발현 활성을 갖는 sbcA 돌연변이 균주를 발견했다24 -26. 후속 연구에 따르면 RecE 및 RecT는 염색체에 통합된 Rac 파지에 의해 발현된다는 것을 보여주었으며, 이는 파지 Redα 및 Redβ27와 동일하게 기능하며, RecE 단백질의 C-말단에서 280개의 아미노산만이 sbcA 돌연변이 균주에서 발현된다28 -30. 상기 절단된 RecE는 Redα(266 아미노산)와 유사하며 5'->3' 엑소뉴클레아제이다31. RecT는 Recβ와 유사하며 단일 가닥 어닐링 단백질(single-strand annealing protein, SSAP)이다32. RecE/RecT 및 Redα/Redβ는 5'->3' 엑소뉴클레아제/SSAP syn/exo 단백질 쌍에 속하며21 , 33, 이중 가닥 DNA의 상동성 재조합을 위해서는 각 단백질 쌍 사이의 특정 단백질-단백질 상호 작용 가능성이 필요하다29 , 34, 35. Redα/Redβ 매개 상동성 재조합은 주로 복제 분기점(replication fork)에서 발생하며 동시 복제가 필요하다. 본 발명자들은 처음에 절단된(truncated) RecE/RecT를 통해 재조합 공학 기술을 발견했지만, 본 발명자들은 후에 DNA 분자를 변형시키기 위해 Redα/Redβ를 사용하였다16 ,38-42. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 RecE/RecT의 특성을 지속적으로 연구하고 있으며, RecE의 N-말단에 있는 600개의 아미노산 잔기가 그들의 복제 활성을 복제-의존성에서 복제-독립적(replication-independent)으로 변화시킨다는 것을 발견하였다3. 따라서, 2개의 선형 DNA 분자는 매우 짧은 상동성 박스를 통한 효율적인 상동성 재조합에 의해 원형 플라스미드를 형성할 수 있다. Redα/Redβ 재조합과 비교하여, 이 선형-선형 재조합 메커니즘은 게놈으로부터 큰 DNA 단편을 직접 클로닝하거나3 -6, 12 다중 DNA 단편 어셈블리를 수행하는 것15 ,43과 같은 다른 응용을 갖는다.
본 개시는 적어도 하나의 상동성 서열을 공유하는 2개 또는 그 이상의 표적 선형 핵산 분자 사이의 상동성 재조합(선형-선형 재조합) 방법을 제공한다. 상기 방법은 제1엑소뉴클레아제로 처리된 표적 선형 핵산 분자의 혼합물을 포함하고; 그 다음 상기 처리된 표적 선형 핵산 분자는 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질의 존재하에 상동성 재조합에 적용된다. 제2엑소뉴클레아제는 RecE일 수 있고, E. coli K12로부터의 전장 RecE의 아미노산 서열은 WO2011/154927에 개시되어 있다. 또는 제2엑소뉴클레아제는 또한 절단된 RecE, 및 아미노산 588-866, 595-866, 602-866 또는 606-866로 이루어진 RecE 단백질을 포함하는 절단된 RecE 형태일 수 있다.
상동성 재조합은 상기 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질에 의해 매개된다. 일부 실시 예에서, 본 개시의 방법에 사용된 어닐링 단백질은 WO2011/154927에 개시된 어닐링 된 단백질이다. 특히, 상기 어닐링 단백질은 RecT 또는 이의 단편이다(Rac 파지로부터 유도됨). 보다 구체적으로, 상기 어닐링 단백질은 전장 RecT이고 제2엑소뉴클레아제는 전장 RecE이다. 그러나 어닐링 단백질이 사용된 엑소뉴클레아제와 상호 작용하는 한, 임의의 다른 적합한 어닐링 단백질이 사용될 수 있다. 다른 적합한 어닐링 단백질의 예는 WO 02/062988에 제공된다. 선형-선형 재조합은 특정 내인성(endogenous) RecT-유사 활성의 존재로 인해, E. coli 균주 GB2005와 같은 RecT 발현이 결여된 숙주 세포에서 발생할 수 있다. 그러나 전장 RecE에 의해 매개되는 선형-선형 재조합의 효율은 RecT의 존재하에서 상당히 증가된다.
본 개시의 방법은 숙주 세포에 전체적으로 또는 부분적으로 영향을 받을 수 있다. 적합한 숙주 세포는 기생충, 원핵생물 및 진핵 생물을 포함하여 많은 종의 세포를 포함하지만, 그람 음성 박테리아와 같은 박테리아가 바람직한 숙주이다. 보다 구체적으로, 상기 숙주 세포는 Salmonella, Klebsiella, Bacillus, Neisseria, Photorhabdus or Escherichia Coli 세포와 같은 장내 박테리아 세포이다(본 발명의 방법은 시험된 모든 대장균 균주에서 효과적인 역할을 한다). 바람직한 숙주 세포는 E. coli K12이다. 그러나 본 개시의 방법은 진핵 세포 또는 진균, 효모, 식물 또는 동물 세포와 같은 유기체에 동일하게 적용될 수 있음에 유의해야 한다. 이 시스템은 마우스의 ES 세포에서 기능하는 것으로 나타났으며 다른 진핵 세포에서도 기능한다고 추측하는 것이 합리적이다. 상기 숙주 세포는 전형적으로 분리된 숙주 세포이지만, 분리되지 않은 숙주 세포일 수 있다.
본 개시의 숙주 세포는 엑소뉴클레아제(특히 전장 RecE)를 암호화하는 핵산, 어닐링 단백질 (특히 RecT) 및 Redγ를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 숙주 세포는 RecA를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 특히, 상기 숙주 세포는 RecE, RecT 및 Redγ, 및 선택적으로 RecA를 발현한다. 보다 구체적으로, 상기 숙주 세포는 RecE, RecT, Redγ 및 RecA를 발현한다.
본 개시의 엑소뉴클레아제, 어닐링 단백질, Redγ 및/또는 RecA는 예를 들어 숙주 세포로 형질 전환된 벡터에 의해 발현되는, 숙주 세포에서 외래 DNA로부터의 재조합 발현 생성물일 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pSC101 플라스미드이지만, 다른 적합한 벡터도 사용될 수 있다. 이들 단백질의 발현을 유도하기 위해 임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 그러나 RecE를 발현시키는 경우, 아라비노스-유도성 프로모터(PBAD) 또는 람노스-유도성 프로모터(PRhaSR)와 같은 유도성 프로모터가 바람직하다. 이들 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 개시의 상기 숙주 세포는 플라스미드 벡터 또는 염색체 상의 유도성 프로모터에 의해 엑소뉴클레아제, 어닐링 단백질, Redγ 및/또는 RecA를 발현시킨다. 특히, 상기 엑소뉴클레아제, 어닐링 단백질, Redγ 및/또는 RecA는 플라스미드 벡터에 의해 상기 숙주 세포에서 발현된다. 보다 구체적으로, 상기 엑소뉴클레아제, 어닐링 단백질, Redγ 및/또는 RecA는 플라스미드 벡터 및 염색체에 의해 숙주 세포에서 동시에 발현된다.
E. coli K12 숙주 세포의 게놈은 전장 recE 유전자 및 recT 유전자의 내인성 카피(endogenous copy)로 구성되며, 이는 숙주 게놈에 통합된 Rac 파지에 존재한다. 그러나 유전자가 침묵하기 때문에, 상기 전장 RecE의 발현은 통합된 유전자로부터 자연적으로 발생할 수 없다. 따라서, 5'->3' 엑소뉴클레아제가 외인성(exogenous) DNA에 의해 발현되는 실시 예에서, 상기 방법은 내인성 recE 유전자의 부재하에 수행될 수 있다.
상기 엑소뉴클레아제의 핵산 분자와 같은 인코딩으로 형질 전환된 숙주 세포가 또한 제공된다. 특히, 엑소뉴클레아제는 핵산 분자에 의해 발현되므로, 본 개시는 또한 본 개시의 방법에 열거된 엑소뉴클레아제를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 엑소뉴클레아제는 특히 아라비노스-유도성 프로모터(PBAD) 또는 람노스-유도성 프로모터(PRhaSR)와 같은 유도성 프로모터의 제어하에 발현된다.
상기 실시 예에서, 본 개시의 방법은 시험관내 전체적으로 또는 부분적으로 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 정제된 5'->3' 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질(특히 정제된 RecE 및 RecT 단백질)이 사용될 수 있거나, 5'->3' 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질을 발현하는 E. coli 세포의 추출물이 사용될 수 있다. 상기 방법이 시험관 내에서 수행될 때, 단일 가닥 상동성 말단을 노출시키기 위해 제1 및 제2선형 표적 핵산 분자를 전처리하는 것이 유리하다.
선형-선형 재조합은 상동성 재조합이 발생하는 표적 선형 핵산 분자 간에 적어도 하나의 상동성 서열이 공유되어야 한다. 일부 실시 예에서, 제1표적 핵산 분자는 제2표적 핵산 분자와 상동성 서열을 공유하여 제1 및 제2표적 핵산 분자 사이에 선형-선형 재조합을 수행하여 선형 생성물을 생성한다. 선형 생성물을 생성하기 위하여 선형-선형 재조합이 제1 및 제2선형 핵산과 하나 또는 그 이상의 추가 선형 핵산 사이에서 발생하는 실시 예에서, 각각의 선형 핵산은 선형-선형 재조합 반응의 상기 선형 생성물에서 그의 이웃을 형성하는 선형 핵산과 상동성 서열을 공유한다. 고리형(cyclic) 생성물을 형성하기 위하여 선형 재조합이 제1 및 제2선형 핵산과 하나 또는 그 이상의 추가 선형 표적 핵산 분자 사이에서 발생하는 실시 예에서, 각각의 선형 핵산은 선형-선형 재조합 반응의 고리형 생성물에서 그의 이웃을 형성하는 선형 핵산과 상동성 서열을 공유한다. 일부 실시 예에서, 제1표적 핵산 분자와 제2표적 핵산 분자 사이에 선형-선형 재조합을 수행하여 고리형 분자를 형성하기 위하여 제1표적 핵산 분자 및 제2표적 핵산 분자는 2개의 상동성 서열을 공유한다. 당업자는 선형 또는 고리형 분자를 형성하기 위해 상동성 서열을 설계하는 방법을 알고 있다.
특히, 적어도 하나의 상동성 박스(homology box)는 각각의 선형 단편의 맨 끝에 있다. 상동성 박스가 각각의 선형 단편의 맨 끝에 있고 다른 상동성 박스가 다른 끝에 있는 경우, 이러한 상동성 서열 또는 '상동성 박스'는 최적의 구성을 생성하고, 이러한 상동성 박스의 구성은 재조합이 고리를 생성할 수 있게 한다. 상동성 상자가 끝에 존재하지 않을 때 선형 재조합이 발생할 수 있지만 효율이 감소합니다. 따라서, 바람직한 실시 예에서, 적어도 하나의 적어도 하나의 상동성 서열은 표적 핵산 분자의 하나 또는 양쪽 말단의 최 외곽에 위치한다. 일부 실시 예에서, 적어도 하나의 상동성 서열은 특정 표적 핵산 분자의 내부에 존재한다.
본 개시의 상동성 서열은 4 이상, 6 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 일부 실시 예에서, 상기 상동성 서열은 4-6, 6-9, 6-30, 6-100, 10-20, 20-29, 20-40, 20-50, 10-100, 25 -30, 25-40, 25-50, 30-40, 30-50, 40-50, 40-80 또는 80 이상의 뉴클레오티드이다. 상기 상동성 재조합의 효율은 사용되는 상동성 박스의 길이에 따라 증가하므로 더 긴 상동성 박스가 사용될 수 있다.
두 핵산 분자 사이의 '상동성'은 두 핵산 분자의 서열이 정렬될 때 서열의 동일한 위치에서 동일한 많은 뉴클레오티드 잔기가 있음을 의미한다. 상동 성의 정도는 쉽게 계산할 수 있다(Computational　Molecular　Biology, Lesk, A.M.,ed., Oxford　University　Press, New　York,1988; Biocomputing. Informati　cs　and　Genome　Projects, Smith,D.W.,ed., Academic　Press,New　York,1993; Computer　Analysis　of　Sequence　Data,Part1,Griffin,A.M.,and　Griffin,H.G.,eds.,Humana　Press,New　Jersey,1994; Sequence　Analysi　s　in　Molecular　Biology, von　Heinje,G.,Academic　Press,1987;and　Seq　uence　Analysis　Primer,Gribskov,M.and　Devereux,J.,eds.,M　Stockton　Press,New　York,1991).
일부 실시 예에서, 본 개시의 방법은 복수의 선형 핵산 분자를 함께 연결하여(joining) 원형 플라스미드와 같은 원형 핵산 분자를 형성하는 단계를 포함한다. 각각의 표적 핵산 분자는 생성된 고리형 생성물에서 이웃을 형성하고 본 개시의 방법에 따라 선형-선형 재조합이 이루어지는 표적 핵산 분자와 하나 이상의 상동성 서열을 공유한다. 표적 핵산 분자의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상이다.
일부 실시 예에서, 상기 표적 선형 핵산 분자 중 적어도 하나는 올바른 재조합체(recombinant)의 선택을 허용하는 선별 마커를 포함한다. 임의의 적합한 선별 마커가 본 개시에서 사용될 수 있다. 일부 실시 예에서, 선별 마커는 항생제 내성 유전자, 예를 들어 클로람페니콜, 암피실린, 카나마이신 또는 블라스티시딘에 대한 내성 유전자이다.
상기 표적 선형 핵산 분자는 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 진핵 생물 또는 원핵생물로부터의 핵산 서열이 포함될 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 제 1 표적 선형 핵산 분자는 게놈 DNA 이다. 일반적으로, 상기 게놈 DNA는 게놈 DNA 단편이다. 상기 게놈 DNA는 특히 표적 서열로 구성된다. 일부 실시 예에서, 완전한 표적 서열을 수득하기 위하여 게놈 DNA 단편은 게놈 DNA의 절단 또는 분해에 의해(예를 들어, 제한 효소를 사용하여) 수득될 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 제 1 표적 선형 핵산 분자(예를 들어, 게놈 DNA 단편, cDNA 라이브러리 구성원 또는 BAC-유래 단편)는 2-kb 또는 이상(예를 들어, 2.5-kb 또는 이상, 4-kb 또는 이상, 5-kb 또는 이상, 7.5-kb 또는 이상, 10-kb 또는 이상, 15-kb 또는 이상, 20-kb 또는 이상, 25-kb 또는 이상, 40-kb 또는 이상, 50 -kb 또는 이상, 75-kb 또는 이상 또는 100-kb 또는 이상)의 표적 서열을 포함한다. 특히, 상기 표적 서열은 상기 제 1 표적 선형 핵산 분자의 어느 한 말단에서 상동성 박스 사이의 전체 영역이다. 예를 들어, 이차 대사 산물 경로 또는 지방산 합성 경로를 암호화하는 유전자 클러스터. 일부 실시 예에서, 본 개시의 방법은 인간 또는 비인간 동물 게놈으로부터 DNA 영역을 직접 복제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 건강 연구 또는 유전자 표적화에 의한 교정을 위한 재생 요법. 예를 들어, 일부 실시 예에서, 상기 제1표적 핵산 분자는 인간 또는 비인간 동물로부터의 게놈 DNA 단편을 포함하거나 이로 구성된다. 상기 게놈 DNA 단편은 돌연변이를 포함하는 유전자와 같은 표적 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 돌연변이는 질환 또는 증상을 초래하고 야생형 서열로의 돌연변이의 변형은 질환 또는 중상을 치료 또는 예방할 수 있다. 상기 제1표적 핵산 분자가 게놈 DNA 단편인 실시 예에서, 상기 제2표적 핵산 분자는 특히 선형 클로닝 벡터이다.
상기 제1표적 핵산 분자가 게놈 DNA 단편인 실시 예에서, 상기 방법은 게놈 DNA를 분해 또는 절단하여 상기 표적 서열을 포함하는 선형 게놈 DNA 단편을 수득함으로써 제1표적 핵산 분자를 생성하는 단계를 포함하고, 이어서, 제1엑소뉴클레아제는 게놈 DNA 단편과 선형 클로닝 벡터의 혼합물을 처리하는데 사용되며, 상기 표적 핵산 분자를 절단하고 어닐링하여 상기 표적 핵산 분자를 연결하는 단계를 처리하는 단계를 포함하고, 이어서 상기 처리된 핵산 분자의 혼합물을 숙주 세포로 옮긴다. 상기 제2표적 핵산 분자는 특히 선별 마커를 포함한다.
일 실시 예에서, 본 개시의 방법은 시험관 내에서 DNA 분자의 결찰(ligation) 단계를 포함한다.
시험관내 상기 결찰 과정은 엑소뉴클레아제 절단 이후에 어닐링을 포함한다.
상기 엑소뉴클레아제는 T4 폴리머라제이다.
상기 시험관내 결찰 과정은 깁슨 어셈블리를 포함한다.
상기 시험관내 결찰 과정은 엑소뉴클레아제가 있거나 없는 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성 이후에 어닐링을 포함한다.
상기 시험관내 결찰 과정은 단일 가닥 어닐링 단백질, 예컨대 RecA/RAD51, Redβ, RecT. Pluβ 또는 RAD52에 의한 어닐링을 포함한다.
상동성 재조합에 사용되는 숙주 세포는 E. coli 세포이다.
상동성 재조합을 위한 숙주 세포는 전장 RecE 및/또는 RecT를 발현하는 E. coli 세포이다.
상동성 재조합을 위한 숙주 세포는 전장 RecE, RecT 및/또는 Redγ를 발현하는 E. coli 세포이다.
상동성 재조합을 위한 숙주 세포는 절단된 RecE, RecT 및/또는 Redγ를 발현하는 E. coli 세포이다.
상동성 재조합을 위한 숙주 세포는 전장 RecE 및/또는 RecT를 발현하는 임의의 박테리아 숙주 세포이다.
상동성 재조합을 위한 숙주 세포는 Redα, Redβ 및/또는 Redγ를 발현하는 E. coli 세포이다.
상동성 재조합을 위한 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 세포이다.
본 개시에 사용하기 위한 키트가 제공된다. 일부 실시 예에서, 상기 키트는 본원에 기재된 바와 같은 엑소뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 키트는 본원에 기재된 바와 같은 엑소뉴클레아제를 포함한다. 특히, 제1엑소뉴클레아제는 T4 DNA 폴리머라제(T4pol), DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편(Kle), T7 DNA 폴리머라제(T7pol), 엑소뉴클레아제 III(ExoIII), Phusion DNA 폴리머라제(Phu), T5 엑소뉴클레아제(T5exo), T7 엑소뉴클레아제(T7exo) 및 람다 엑소뉴클레아제(λexo)이며, 상기 제2엑소뉴클레아제는 전장 RecE이다. 보다 구체적으로, 상기 키트는 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 예에서, 상기 키트의 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어하에 본원에 기재된 전장 RecE, RecT, Redγ 및 RecA를 암호화하는 핵산을 포함한다. 상기 키트는 또한 하나 이상의 미리 제조된 선형 클로닝 벡터를 포함할 수 있다.
본 개시의 다른 바람직한 적용은 합성 생물학에서, 특히 선형 DNA에서의 선형 핵산 분자의 조립에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시 예에서, 제 1 및 제2표적 핵산 분자는 선형이고, 상기 방법은 선형 또는 고리형 생성물을 생성하기 위하여 5'->3' 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질의 존재하에 상기 제 1 및 제2표적 핵산 분자를 하나 또는 그 이상의 다른 선형 표적 핵산 분자(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 적어도 10, 적어도 20의 다른 표적 핵산 분자) 와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 예에서, 상기 제 1 및 제2표적 핵산 분자와 하나 이상의 다른 표적 핵산 분자 사이의 상동성 재조합은 유전자, 오페론, 염색체 또는 전체 게놈의 생성을 초래한다. DNA 핵산의 합성 생물학적 어셈블리는 유전자, 오페론, 염색체를 생성하는데 사용되었거나 최근에 전체 게놈을 생성하는데 사용되었다. 본 개시의 실시 예에서, 상기 제1엑소뉴클레아제 및 제2엑소뉴클레아제의 조합은 선형 핵산 분자의 조립 효율을 유의하게 증가시키며, 본 개시는 상업 및 연구에서 합성 생물학적 DNA의 조립을 위한 바람직한 방법이 될 것이다.
본 개시의 또 다른 바람직한 적용은 본 개시의 방법을 일배체형(haplotype) 동질유전자(isogenic) 표적화 벡터를 구축하는 것이며, 이는 동질유전자 상동성 박스로 본 개시의 방법을 사용하여 포유동물 게놈으로부터 5 내지 10-kb DNA 단편을 직접 클로닝할 수 있고, 이들 DNA 단편은 동일한 유전자일뿐만 아니라 다형성 일배체형(polymorphic haplotype)을 유지하므로, 본 발명자들은 이를 일배체형 동질유전자 표적화 벡터, 즉 소위 HIT(haplotype isogenic targeting) 벡터라고 부른다. 이어서, 상기 선별 마커 및 다른 기능적 요소를 재조합 공학에 의해 HIT 벡터에 삽입하여 표적화를 위한 벡터를 수득한다. 본 개시의 다른 바람직한 적용은 포유동물 세포의 유전자형 분석이다. 완전한 표적화 요소를 함유하는 DNA 단편은 본 개시의 방법에 의해 가능한 표적 배아 줄기세포의 게놈으로부터 클로닝되며, 상기 클로닝에 의해 수득된 재조합 플라스미드는 제한 분석(restriction analysis) 및 DNA 서열 분석에 적용되고, 그 결과에 따라 세포가 성공적으로 결정된다.
실시예
재료 및 방법
균주 및 플라스미드(Strain and plasmid)
E. coli GB2005는 fhuA , ybcC 및 recET를 삭제함으로써 DH10B로부터 유래되었다3 ,16,44. GB05-dir은 ybcC 유전자좌(locus)에 PBAD-ETgA 오페론(아라비노스-유도성 PBAD 프로모터 하의 전장 recE, recT, redγ 및 recA)3을 통합함으로써 GB2005로부터 유래되었다. GB08-red는 ybcC 유전자좌에 PBAD-gbaA 오페론(아라비노스-유도성 PBAD 프로모터 하의 redγ, redβ, redα 및 recA)16을 통합함으로써 GB2005로부터 유래되었다. pSC101-BAD-ETgA-tet3는 테트라사이클린 내성을 전달하고 PBAD-전장 ETgA 오페론과 37℃가 아닌 30℃에서 복제하는 온도에 민감한 pSC101 복제 기점을 전달하며, 따라서 선택이 없을 때 온도 이동으로 호스트에서 쉽게 제거할 수 있다.
게놈 DNA의 제조 및 절단(Preparation and digestion of genomic DNA)
그람 음성 Photobacterium phosphoreum ANT-2200 및 Photorhabdus luminescens DSM15139를 50 ml 배지에서 밤새 배양하였다. 원심 분리 후, 세포를 8 ml의 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)에 완전히 재현탁시켰다. 20 mg ml-1 프로테이나제 K의 500 mg 및 1 ml의 10% SDS를 첨가하고 용액이 투명해질 때까지 50℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1, pH 8.0) 추출 및 에탄올 침전에 의해 용해물로부터 게놈 DNA를 회수하였다. 상기 DNA를 10 mM Tris-Cl(pH 8.0)에 용해시키고 14-kb lux 유전자 클러스터의 클로닝을 위해 BamHI + KpnI로 절단하였다(digested).
그람 양성 Streptomyces albus DSM41398을 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth) 50 ml 배지에서 30℃로 2일 동안 배양하였다. 상기 게놈 DNA를 약간 수정과 함께 ref.(10)에 기재된 방법에 따라 분리하였다. 원심 분리 후, 세포를 8 ml의 SET 버퍼(75 mM NaCl, 25 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 8.0)에 완전히 재현탁시키고 10 mg 리소자임을 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 500 ㎕의 20 mg ml-1 단백질 분해 효소 K 및 1 ㎖의 10% SDS를 첨가하고 용액이 투명해질 때까지 50℃에서 2시간 동안 배양하였다. 5M NaCl를 3과 1/2 밀리리터를 상기 용해물에 첨가하였다. 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1, pH 8.0) 추출 및 에탄올 침전에 의해 용해물로부터 게놈 DNA를 회수하였다. 상기 DNA를 10 mM Tris-Cl(pH 8.0)에 용해시켰다.
제조사의 지시에 따라 Qiagen Blood & Cell Culture DNA 키트를 사용하여 마우스 흑색종 B16 세포, 인간 배아 신장 293T 세포 및 인간 혈액으로부터 게놈 DNA를 정제하였다. 단, 페놀-클로로포름-이소아밀 알콜(25:24:1, pH 8.0) 추출 및 에탄올 침전에 의해 Proteinase K 처리된 용해물로부터 DNA를 회수하였다. 상기 DNA를 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)에 용해시켰다. 제한 절단된 게놈 DNA를 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1, pH 8.0)로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 상기 DNA를 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)에 용해시켰다. 엔드 컷 피펫 팁(End cut pipette tip)은 전단 게놈 DNA의 절단을 피하기 위해 사용되었다.
P. luminescens DSM15139의 게놈 DNA를 plu3535 - plu3532 클로닝을 위한 XbaI 및 plu2670 클로닝을 위한 XbaI + XmaI로 절단하였다. 살리노마이신 유전자 클러스터의 클로닝을 위해 S. albus의 게놈 DNA를 EcoRV 또는 Cas9-gRNA 복합체로 분해하였다. 상기 마우스 게놈 DNA를 Prkar1a 클로닝의 경우 HpaI, Dpy30 클로닝의 경우 BamHI + KpnI, Wnt4 또는 Lmbr1l - Tuba1a 클로닝의 경우 SwaI로 절단하였다. 인간 게놈 DNA를 DPY30 클로닝을 위한 SpeI, IGFLR1 - LIN37 클로닝을 위한 NdeI + BstZ17I, IGFLR1 - ARHGAP33 클로닝을 위한 BstZ17I 및 ZBTB32 - LIN37 클로닝을위한 NdeI로 절단하였다. 상기 절단된 게놈 DNA를 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1, pH 8.0)로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. DNA를 ddH2O에 용해시키고 1 μg μl-1로 농축시켰다. 엔드 컷 피펫 팁은 전단 게놈 DNA의 절단을 피하기 위해 사용되었다. 10 마이크로그램의 절단된 게놈 DNA를 ExoCET 클로닝에 사용하였다.
S. albus 게놈 DNA의 Cas9 절단
S. pyogenes Cas9 단백질은 뉴 잉글랜드 바이오 랩(New England Biolab)에서 구입하였다. S. albus 게놈 DNA의 Cas9 절단은 80 μg의 게놈 DNA, 40 μg의 gRNA-2, 40 μg의 gRNA-7 및 20 μg의 Cas9을 함유하는 800 μL 반응 시스템에서 수행되었다. 상기 Cas9의 절단 효율은 DNA 기질의 순도에 의해 심각한 영향을 받기 때문에, 이 실험에서, Cas9의 절단 효율을 보장하기 위해 S. albus 게놈 DNA를 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1, pH 8.0)로 3회 추출해야 했다. 생성된 생성물을 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션 한 후, 100 μg의 RNase A(Thermo Scientific)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 100 μg의 프로테이나제 K(Roche)를 첨가하고, 배양을 1시간 동안 50℃에서 계속하였다. 이어서, 게놈 DNA를 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1, pH 8.0)로 1회 추출하고, 에탄올 침전 후, 적절한 양의 ddH2O에 약 1 μg uL-1의 최종 농도로 용해시켰다. 마지막으로, Cas9 단백질에 의해 절단된 10 ㎍의 게놈 DNA가 본 발명의 방법의 클로닝 실험에 사용되었다.
선형 클로닝 벡터의 제조
p15A-Pamp-luxABECD 플라스미드(Genebridge)를 주형으로 사용하여, 상기 p15A-cm 벡터를 PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)로 PCR 증폭하였으며, 사용된 프라이머(표 1)는 80개의 뉴클레오티드 상동성 박스로 구성되며 PAGE로 정제되었습니다. 상기 PCR 생성물은 겔 회수에 의한 후속 실험에서 프라이머의 간섭을 제거했다. 사용된 키트는 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)였다. 마지막으로, DNA를 약 200 ng/μL의 농도로 ddH2O로 용리시키고, 200 ng를 ExoCET 클로닝 실험에 사용하였다.
살리노마이신 유전자 클러스터를 클로닝하는데 사용된 pBeloBAC11 벡터 및 plu3535-3532를 클로닝하는데 사용된 pBAC2015 벡터는 참조43 ,46에 따라 구축되었다. BAC 벡터를 BamHI로 선형화하여 상동성 암을 노출시키고 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1, pH 8.0)로 추출하고 이소프로판올로 침전시켰다. 상기 DNA를 ddH2O에 용해시키고 1 μg/μL로 농축시켰다. 1 마이크로 그램의 선형 BAC 벡터를 ExoCET 클로닝에 사용하였다.
p15A-cm 선형 벡터에 의해 증폭된 올리고뉴클레오티드
유전자 프라이머 서열 (5'-3')
plu2670 plu2670-1 ctgggaaaactacggtgagcatatgtttaccacttcttcagagaaccgtgaatattgcgttaaaccgatgaactgcccgggTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 1)
plu2670-2 aaatccatgattaccaacccactcccaaagatattataaaatctcaacatgctgatttgatcctttggaatgggctaaatctagaGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 2)
Mouse
Prkar1a 		mPrkar1a-1 agatgacgccctctccactctgcataccaattccacataaccactcttcaaattataatgctcacagaccctctaaggttTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 3)
mPrkar1a-2 catagtgacccattgttatagagtacttagctatgcctcagagtaatgctcttgatctaggtgctttctttttacttgttGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 4)
Mouse
Dpy30 		mDpy30-1 ggattttataagtgaagggtgacatttgtagtattccttaccccgtctggttcctcatacgcattaactcataatccttggtaccTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 5)
mDpy30-2 tgccctttcagaagacctaggtttgattcctagcacccactgatgctaacaaccagacataatgccagttctaggggatccGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 6)
Mouse
Wnt4 		mWnt4-1 gtttaactcccttaacacacacacacacacatgcacacgcacatgcacacgcgcactcacaccacaaaatcacacaatttTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 7)
mWnt4-2 ctgtgctcagagctttgagtgccctacatataacaggacacaaactcttccttactttctgattgccacatggtccatttGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 8)
Mouse
Lmbr1l -Tuba1a 		mLT-1 ctatgccataggaatttggaggaaattaggcttactggtccattaattatttccaacggatgcagtcagaatgtatatttTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 9)
mLT-2 ttagagcagacagtgctcttaaccgttgagccatctctccagtccctggacacactgattttaagttgacattaaaatttGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 10)
human
DPY30 		hDpy30-1 ccaccacgccaggctaattttagcttaataccctattacctctcaggtgtgtctaaatttttctttgatggaaaaactagtTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 11)
hDpy30-2 agttatgtcagtttgctattataatgtttattattattccttgaataaaaaagaatatgcacctaataaacgttgactagtGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 12)
human IGFLR1-LIN37 hIL-1 AgtggccctagagggtcggtaaggagccaagggcctatgcaaggatgctcacacacctcccatccccaccttcccagacacatatgTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 13)
hIL-2 gtgctgtccaagcttggctcatctggggtttgctgggcttaacacccaataaagaactttgctgactactaagcccagtaGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 14)
human IGFLR1-ARHGAP33 hIA-1 acggccggcgactgctcctcagtgaggaggcgtcactcaatatccctgcagtggcggccgcccatgtgatcaaacggtaTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 15)
hIA-2 gtgctgtccaagcttggctcatctggggtttgctgggcttaacacccaataaagaactttgctgactactaagcccagtaGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 16)
human
ZBTB32 -LIN37 		hZL-1 cctagagggtcggtaaggagccaagggcctatgcaaggatgctcacacacctcccatccccaccttcccagacacatatgTTACGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ . ID. NO. 17)
hZL-2 aagaactagactagaagttggaaaacaggtttcactgcatcccttcacagtgaatggcccttctcttcagcactcatatgGGTAACGAATCAGACAATTGACG (SEQ . ID. NO. 18)
표 1의 소문자는 상동성 박스 서열을 나타낸다.
다중 단편 어셈블리를 위한 PCR 산물의 제조
멀티-피스 어셈블리 실험에 사용된 40bp 상동성을 갖는 DNA 단편은 주형으로서 P. luminescens DSM15139의 게놈 DNA 및 제조사의 지침에 따라 PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara)를 사용하여 PCR 증폭되었다. 전기영동 후 아가로스겔로부터 PCR 산물을 추출하고, 상기 DNA를 ddH2O로 컬럼으로부터 용출시키고 200 ng μL-1로 농축한 것을 제외하고는 제조자의 지시에 따라 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 각각의 단편 250ng을 DNA 어셈블리에 사용하였다.
mVenus-PGK-neo DNA 카세트의 제조
mVenus-PGK-neo 카세트는 제조사의 지시에 따라 PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara) 판독 값(proof reading)을 사용하여 PCR로 pR6K-2Ty1-2PreS-mVenus-Biotin-PGK-em7-neo17로부터 PCR로 증폭시켰다. 프라이머는 [표 1]에 나열되어 있다. 상기 DNA를 ddH2O로 컬럼으로부터 용출시키고 100 ng μL-1로 농축한 것을 제외하고는 제조자의 지시에 따라 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 각각의 단편 250ng을 DNA 어셈블리에 사용하였다.
시험관내 어셈블리(In vitro assembly)
10 μg의 게놈 DNA 및 200 ng의 2.2-kb p15A-cm 선형 벡터(1 μg의 8-kb 선형 BAC 벡터)를 2 μL of 10 x NEBuffer 2.1 및 0.13 μL의 3 U μL -1 T4pol (NEB, cat. no. M0203)를 포함하는 20 μL 반응으로 어셈블리 하였다. 어셈블리 반응을 0.2 ml PCR 튜브에서 제조하고 다음과 같이 열 순환기에서 순환시켰다: 25℃에서 1시간, 75℃에서 20분, 50℃에서 30분, 이어서 4℃에서 유지시켰다. 멀티-피스 조립을 위해, 250ng의 각 단편을 첨가하고 20분의 chew-back 시간을 사용하였다. 시험관내 어셈블리 생성물을 전기천공 전에 Millipore Membrane Filters(Merck-Millipore, 카탈로그 번호 VSWP01300)를 사용하여 ddH2O에 대한 적하 투석에 의해 실온에서 30분 동안 탈염시켰다. 모든 실험은 3회 수행되었다.
다른 엑소뉴클레아제와의 어셈블리 반응을 다음과 같이 순환시켰다: T7exo: 25℃에서 20분, 50℃에서 30분, 이어서 4℃에서 유지; Kle, T7pol 및 λexo: 25℃에서 20분, 75℃에서 20분, 50℃에서 30분, 이어서 4℃에서 유지; ExoIII: 37℃에서 20분, 75℃에서 20분, 50℃에서 30분, 이어서 4℃에서 유지; Phu: 37℃에서 20분, 50℃에서 3분, 이어서 4℃에서 유지. 깁슨 어셈블리는 깁슨 어셈블리 마스터믹스(NEB, cat. E2611)로 50℃에서 30분 동안 수행된 후, 4℃에서 유지되었다.
전기 적격(electrocompetent) E. coli 세포의 제조
E. coli GB05-dir 함유 플라스미드 pSC101-BAD-ETgA-tet를 4 μg/mL 테트라사이클린이 보충된 LB에서 30℃에서 밤새 배양하였다(OD600 = 3-4). 40㎕의 하룻밤 배양(OD600 = 3-4)을 적절한 항생제가 보충된 1.4mL LB로 옮긴 다음, 혼합물을 30℃에서 Eppendorf 열 혼합기에 놓고 950rpm에서 2시간 동안 배양하였다(OD600 = 0.35-0.4) . 재조합 효소(ETgA 또는 gbaA)의 발현을 유도하기 위해 35 μL의 10% L-아라비노스(w/v, in ddH2O)를 첨가하고, 37℃에서 40분 동안 배양을 계속하였다(OD600 = 0.7 내지 0.8). 세포를 2℃에서 30초 동안 9,400g에서 원심 분리하여 수집하였다.
상기 상청액을 제거하고 상기 세포 펠렛을 1 mL의 차가운 ddH2O에 현탁시켰다. 상기 세포를 2℃에서 30초 동안 9,400g에서 원심 분리하여 수집하였다. 상기 상청액을 제거하고 상기 세포 펠렛을 1 mL의 차가운 ddH2O에 현탁시켰다. 상기 세포를 반복적으로 원심 분리하고, 재현탁시키고, 다시 원심 분리하고, 세포를 20 μL의 차가운 ddH2O에 현탁시켰다. 이어서, mVenus-PGK-neo 구성요소 삽입 실험에서, 5 μL의 탈염된 시험관내 조립된 생성물을 첨가하고, 200 ng의 플라스미드 및 200 ng의 PCR 생성물의 혼합물을 첨가하였다. 상기 세포와 DNA의 혼합물을 1mm 큐벳으로 옮기고 전압 1350V, 정전 용량 10uF 및 저항 600Ω에서 Eppendorf electroporator 2510으로 전기 천공했다. 1mL LB를 electric shock cup에 첨가하고, 상기 세포를 세척하고 이를 구멍이있는 1.5mL 튜브로 옮긴 다음, 37℃에서 1시간 동안 950 rpm으로 Eppendorf 열 혼합기에 두었다. 마지막으로, 적절한 양의 박테리아 용액을 적합한 항생제 (15 ㎍/mL 클로람페니콜 또는 15 ㎍/mL 카나마이신)가 보충된 LB 플레이트에 뿌려 37℃에서 밤새 인큐베이션 하였다.
실시예 1
시험관내 조립 및 전장 RecE/RecT의 공동 작용(concerted action)은 직접 클로닝의 효율을 향상시킨다.
발명자들은 Photobacterium phosphoreum ANT-2200 47의 14kb lux 유전자 클러스터의 직접 클로닝에 의하여 일련의 엑소뉴클레아제 및 어닐링 방법을 테스트하였다(도 1A). 이 클로닝 실험에서, BamHI 및 KpnI를 사용하여 절단된 10 ㎍의 ANT-2200 게놈 DNA를 200 ng의 2.2-kb p15A-cm 선형 벡터와 혼합하였다. 상기 선형 벡터는 양 말단에서 제한 절단에 의해 생성된 lux 유전자 클러스터를 함유하는 게놈 단편의 말단(상동 박스)과 동일한 서열을 갖는다. 최종 고리형 플라스미드를 형성하기 위하여, 선형 벡터는 양 말단의 상동성 박스를 통해 표적 DNA 단편과 상동 적으로 재조합된다. 클로닝 벡터 및 BamHI + KpnI 절단된 게놈 DNA를 먼저 상이한 엑소뉴클레아제 효소로 시험관내에서 처리한 다음, 시험관내 처리 후 반응 생성물을 RecE/RecT 재조합 효소를 발현하는 E. coli 로 형질 전환시켰다. 상기 시험 된 엑소뉴클레아제는 T4 DNA 폴리머라제(T4pol), DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편(Kle), T7 DNA 폴리머라제(T7pol), 엑소뉴클레아제 III(ExoIII), Phusion DNA 폴리머라제(Phu), T5 엑소뉴클레아제(T5exo), T7 엑소뉴클레아제(T7exo) 및 람다 엑소뉴클레아제(λexo) 를 포함한다(도 2A). 결과는 T4pol, Kle, T5exo 및 T7exo가 직접 클로닝 효율을 현저히 향상시킨다는 것을 보여 주었다(도 2A-E). 엑소뉴클레아제 절단 후 어닐링 속도는 클로닝 효율에 영향을 미치지 않으므로, 본 발명자들은 Eppendorf MC nexus PCR 기계에서 기본 냉각 속도(2℃ s-1)를 선택하였다(도 3). 직접 클로닝 효율에 대한 T4pol의 농도, 반응 온도 및 반응 시간의 효과를 테스트하였다(도 1C, D 및 도 2F). 전장 RecE/RecT 단독, T4pol 시험관내 어닐링 단독, 및 전장 RecE/RecT와 T4pol 시험관내 어닐링의 조합을 사용한 직접 클로닝의 효율을 비교하였다(도 1F). RecE/RecT를 단독으로 사용하는 경우, 14-kb lux 유전자 클러스터는 발광 박테리아(luminescent bacterium)의 염색체에서 p15A 벡터로 직접적으로 높은 정확성과 함께(427) 복제되지만, 그러나 T4pol 시험관내 조립 후 표준 엔지니어링 E. coli으로 반응 생성물을 조립하는 직접 클로닝은 훨씬 더 효율적이다(427 대 4,880). 상기 결과는 다음과 같다: (1) 대장균 내인성(endogenous) DNA 복구 시스템은 플라스미드 골격을 능숙하게 닫을(close) 수 있다; (2) T4pol은 시험관내 조립에서 매우 효율적이다(4880); (3) T4pol 시험관내 어셈블리를 RecE/RecT 세포내 재조합과 결합시키는 ExoCET 기술은 어느 기술보다 효과적이다(32500).
실시예 2
클로닝 효율에 대한 상동성 박스의 효과
상동성 박스가 길수록 클로닝 효율이 높아진다(도 1B). 본 발명자들은 클로닝 벡터의 한 말단에 80 bp 상동성 박스를 상기 유전자 클러스터 내부의 1-kb 위치에, 또는 양쪽 말단에 유전자 클러스터 내부의 1-kb 위치에 두고 ExoCET의 효율과 T4pol 및 RecET의 효율을 비교하였다(도 5b). 상기 벡터의 상동성 박스 둘 다가 말단에 있을 때, 본 발명자들은 이전과 동일한 결과를 얻었다. 그러나 하나 또는 두 개의 상동성 박스가 상기 유전자 클러스터의 1-kb 내에 위치했을 때, T4pol 단독 처리의 클로닝 효율은 매우 낮았으며, 이는 T4pol 엑소뉴클레아제 처리 후 어닐링은 말단 DNA 서열의 상보적인 쌍에 의존한다는 것을 나타낸다. RecET 재조합의 효율은 상기 상동성 박스의 위치와 거의 관련이 없다는 것을 주목할 가치가 있었다. 하나의 상동성 박스가 말단에 있고 다른 상동성 박스가 내부에 있을 때 얻은 실험 결과는 시사하는 바가 크다. 상기 벡터와 상기 게놈 DNA 단편 사이에 단 하나의 상동성 박스가 존재하는 경우, ExoCET의 효율은 RecET보다 12배였으며, 이는 시험관내 T4pol 처리가 전기 천공 및 RecET 재조합 이전에 한쪽 말단 어닐링을 통하여 2개의 DNA 분자가 효과적으로 결찰될 수 있음을 나타냈다. 상기 데이터는 T4pol이 말단 상동성 박스에서만 작용할 수 있으며, 내부 상동성 박스의 재조합에는 RecET의 작용이 필요하다는 것을 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 ExoCET에 대한 T4pol의 주된 기여는 2개의 선형 DNA 분자의 한쪽 말단을 어닐링함으로써 그들의 공동 변환 효율(co-transformation efficiency)을 상당히 증가시키는 것이라고 결론지었다. 그런 다음 RecET을 사용하여 다른 쪽 말단에서 재구성을 용이하게 할 수 있다. 14-kb lux 유전자 클러스터의 클로닝 실험에서, 두 상동성 박스가 표적 절단된 게놈 단편의 맨 말단에 위치할 때, ExoCET의 클로닝 효율은 T4pol보다 6-8배였으며(도 1F 및 5B), 이는 시험관내 조립된 생성물의 대부분이 서로 결합(> 85%)하는 단지 하나의 말단을 가졌음을 나타냈으며, 시험관내 조립된 고리형 생성물 및 2개의 선형 DNA 분자의 공동-전환 후 RecET에 의해 생성된 재조합 플라스미드는 ExoCET의 높은 효율에 거의 기여하지 않았다. ExoCET 직접 클로닝 실험을 설계할 때 상동성 박스 위치는 클로닝 효율에 매우 중요했다. 최고의 클로닝 효율을 달성하기 위해, 두 상동성 박스를 표적 DNA 단편의 맨 끝에 위치시켰다. 실제로, 시험관내에서 T4pol 엑소뉴클레아제 및 어닐링의 효과를 발휘하기 위해, 적어도 하나의 상동성 박스가 끝에 배치되었다. 그러나 RecE/RecT가 그것을 국소화하고 재조합할 수 있기 때문에 다른 상동성 박스가 표적 DNA 단편 내에 배치될 수 있다. 이는 상동성 박스 중 하나가 상기 표적 단편의 3' 말단의 끝에 위치할 수 있고 상기 표적 유전자의 5' 말단은 내부 상동성 박스를 사용하여 프로모터 및 리보솜 결합 부위의 제어하에 직접 배치될 수 있기 때문에, 발현 벡터를 구축하기 위한 직접 클로닝의 사용에 매우 유리하다.
실시예 3
ExoCET에는 RecE와 RecT가 모두 필요했다.
RecT는 단일 가닥 DNA 어닐링 단백질이기 때문에, 본 발명자들은 RecT가 T4pol (3' 엑소뉴클레아제)에 의해 생성된 단일 가닥 DNA 영역을 어닐링할 수 있다고 가정하여, RecE는 ExoCET 기술 시스템에서 요구되지 않을 수 있다. 이러한 추측을 검증하기 위해, 본 발명자들은 T4pol-처리된 DNA 기질을 RecT 및 Redγ (pSC101-Tg)를 발현하고 RecE를 발현하지 않는 E. coli 세포로 형질전환시켰고, RecT와 T4pol 사이의 상호 작용을 발견하지 못했다. 따라서, ExoCET에는 RecE 및 RecT가 모두 필요하였다(도 5C). RecA는 직접 클로닝 효율이 어느 정도 개선되었다.
실시예 4
큰 DNA 단편의 직접 클로닝 검증
ExoCET 기술의 우수성을 검증하기 위해, 본 발명자들은 이전에 RecET 기술로는 수행하기 어려운 일부 실험을 수행하였다. Photorhabdus luminescens의 게놈에는 37.5-kb plu3535 -3532와 52.6-kb plu2670의 두 가지 큰 유전자 클러스터가 있다. 본 발명자들은 RecET 기술로 이들 2개의 유전자 클러스터를 직접 복제하는 것이 매우 어려웠으며, 효율은 각각 2/12 및 0/48에 불과했다3. ExoCET 기술을 사용하는 발명자들은 각각 10/12 및 11/17의 정확한 속도를 달성했다(표 2).
ExoCET을 사용하여 박테리아, 포유류 세포 및 인간 혈액에서 직접 복제된 게놈 DNA의 큰 단편
표적 유전자 근원 게놈
(Mb)		 게놈 제한 효소 사이즈
(kb)		 벡터 콜로니 수
(/mL)		 교정 수/검출 수(Correct number/ Detection number)
plu3535 -3532 （ Photorhabdus luminescens ）DSM15139 5.69 XbaI 38 pBAC2015 1815±132 10/12
plu2670 （ Photorhabdus luminescens ） DSM15139 5.69 XbaI+XmaI 53 p15A 1152±211 11/17
Salinomycin gene cluster (Streptomyces albus) DSM41398 8.38 EcoRV 106 pBeloBAC11 425±91 2/24
Salinomycin gene cluster (Streptomyces albus) DSM41398 8.38 Cas9 106 pBeloBAC11 260±14 1/24
Prkar1a 마우스 흑색종 B16 세포 2800.06 HpaI 8 p15A 205±17 10/12
Dpy30 마우스 흑색종 B16 세포 2800.06 BamHI+KpnI 8.7 p15A 273±18 9/12
Wnt4 마우스 흑색종 B16 세포 2800.06 SwaI 45 p15A 76±16 8/25
Lmbr1l -Tuba1a 마우스 흑색종 B16 세포 2800.06 SwaI 53 p15A 52±6 1/12
DPY30 인간 배아 신장 293T 세포 3221.49 SpeI 9.1 p15A 40±10 17/24
DPY30 인간 혈액 3221.49 SpeI 9.1 p15A 45±2 5/24
IGFLR1 -LIN37 인간 혈액 3221.49 NdeI+BstZ17I 14 p15A 320±67 9/48
IGFLR1 -ARHGAP33 인간 혈액 3221.49 BstZ17I 41 p15A 275±76 5/48
ZBTB32 -LIN37 인간 혈액 3221.49 NdeI 45 p15A 115±35 2/48
Oct4 -Venus 마우스 R1 배아 줄기세포 2800.06 EcoRV+PacI 9.6 p15A 34±1 9/36
Nanog -Cherry 마우스 R1 배아 줄기세포 2800.06 NdeI 13 p15A 49±12 17/54
Gata2 -Venus 마우스 R1 배아 줄기세포 2800.06 BstZ17I 16.8 p15A 212±27 5/45
Mll4 (1) 마우스 R1 배아 줄기세포 2800.06 SspI+SpeI 17.1 p15A 127±38 7+3/24
Mll4 (2) 마우스 R1 배아 줄기세포 323±65 2+2/36
Mll4 (3) 마우스 R1 배아 줄기세포 142±27 6+9/72
Mll4 (4) 마우스 R1 배아 줄기세포 483±91 3+5/36
또한, 이전에 본 발명자는 Streptomyces albicans 게놈으로부터 106-kb 살리노마이신 유전자 클러스터를 직접 복제하려는 시도에 실패하였다. 그래서 본 발명자는 이것을 3개의 단편으로 나누고 단계별로 클로닝을 한 다음 완전한 유전자 클러스터에 통합해야 했었다43. 그러나 본 발명자들은 ExoCET를 통해, 상동성 박스 및 EcoRV 분해된 게놈 DNA를 포함하는 BAC 벡터를 사용하여 106-kb 살리노마이신 유전자 클러스터를 BAC 벡터로 직접 클로닝할 수 있었고, 2/24의 정확한 비율(correct rate)을 얻었다 (표 2 및 도 6). 상기 106-kb 살리노마이신 유전자 클러스터의 양쪽에 EcoRV 제한 부위가 있었기 때문에, 본 발명자들은 이를 염색체로부터 방출하여 벡터로 클로닝할 수 있었다. 큰 DNA 단편을 클로닝할 때, 때때로 표적 DNA 단편의 양쪽에서 적합한 제한 부위(restriction site)를 찾는 것이 어려웠지만, 프로그래밍 가능한 뉴클레아제의 사용은 제한 부위에 대한 제한을 제거할 수 있었고, 특히 RNA-매개 엔도뉴클레아제-Cas9이다48 ,49. 이 아이디어를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 Cas9를 사용하여 EcoRV에 매우 폐쇄된 염색체로부터 106-kb 살리노마이신 유전자 클러스터를 방출한 다음, 동일한 BAC 벡터를 사용하여 동일한 106-kb DNA 단편을 BAC 벡터로 클로닝 하였다. 유사한 클로닝 효율이 최종적으로 얻어졌다(표 2 및 도 6). 따라서, ExoCET은 RecET과 비교하여 큰 DNA 단편의 직접 클로닝에서 상당히 우수한 성능을 갖는다.
다음으로, 본 발명자들은 ExoCET의 효율이 포유동물 게놈으로부터 큰 DNA 단편을 직접 클로닝하는 요건을 충족시킬 수 있는지를 시험하였다. 본 발명자들은 마우스 게놈으로부터 Wnt4 유전자를 함유하는 45-kb 단편을 방출하기 위해 SwaI를 사용하였고(도 7A), 본 발명자는 ExoCET를 통해 8/25의 정확한 비율(correct rate)을 얻었다(도 7B). 본 발명자들은 또한 이 DNA 단편을 클로닝하기 위해 Gibson assembly1의 사용을 시험하였다. Gibson assembly는 T5exo, Phusion DNA 중합 효소 및 Taq DNA 리가제를 사용하여 DNA 분자를 서로 상동성 박스로 조립한다. 본 발명자들은 Gibson 어셈블리된 DNA 생성물을 pSC101-BAD-ETgA-tet를 함유하는 아라비노스 유도 및 비유도 E. coli GB05-dir로 형질 전환함으로써 다수의 콜로니(181,000 및 257,000)를 수득하였다. 그리고 60개 콜로니가 검출되었고 정확한 클론(correct clone)이 수득되지 않았고(도 7B), 모두 자가 순환(self-circularization)의 p15A 빈 벡터였다.
실시예 5
ExoCET을 사용한 DNA 단편 어셈블리
깁슨은 다중 단편 DNA 어셈블리를 위한 방법이므로, 본 발명자들은 일부 DNA 다중 단편 어셈블리 실험을 통해 ExoCET 및 Gibson을 비교하였다(도 7C). 이들 DNA 단편은 PCR에 의해 증폭되었고, 말단에 40-bp 상동성 박스를 갖는다. ExoCET 및 Gibson 어셈블리의 효율성은 7-단편 및 10-단편 어셈블리 실험에서 우수했다. Gibson의 시험관내 어셈블리된 생성물이 RecE, RecT, Redγ 및 RecA (Gibson 및 ETgA)를 발현하는 E. coli 세포로 형질 전환될 때, 어셈블리 효율 및 정확도가 상당히 개선되었다(도 7D). ExoCET은 13개 이상의 DNA 단편을 조립할 수 없었고, Gibson은 16개 이상의 DNA 단편을 조립할 수 없었으며, Gibson과 ETgA는 최소 20개의 DNA 단편을 54.9-kb 플라스미드에 조립할 수 있었다. 따라서, 시험관내 어셈블리를 RecET 재조합과 조합하면, DNA 어셈블리의 이점이 명백하다.
실시예 6
ExoCET을 이용한 일배체형 동질유전자 표적화 벡터 구축
ExoCET은 SNP의 일배체형 연구를 촉진하고, 뉴클레아제-매개 인간 줄기세포의 표적화를 위한 일배체형 공통 유전자(HIT) 표적화 벡터를 신속하게 구축하기 위하여 혈액, 질병 관련 세포주 등을 포함한 포유류 게놈의 DNA 단편을 직접 복제하는데 사용될 수 있다. 생의학 연구에서 환자로부터 분리된 줄기세포, 제대혈 또는 체세포 재프로그래밍의 중요성이 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 줄기세포 게놈의 정확한 변형에 대한 연구는 광범위한 관심을 받았다. 상기 인간 게놈의 변형은 인간 유전자 다양성이 복잡하기 때문에 실험용 마우스의 게놈을 구조화하는 것보다 더 어려웠다. 사람들이 유전자 표적화를 위해 마우스 배아 줄기세포를 사용할 때 상동성 재조합에 대한 동질유전자성(isogenicity)(서열 유사성)의 중요성은 수년 전에 깨달았었다14.
서열 불일치 상동성 재조합의 효과는 잘 연구되지 않았다. 예를 들어 단일 불일치(SNP 또는 indel)가 얼마나 많은 재조합 효율을 감소시킬 수 있는지, 불일치한 재조합 부위의 거리가 재조합 효율에 어떤 영향을 미치는지, 다중 불일치가 재조합 효율에 어떤 영향을 미치는지, 이러한 문제는 아직 명확하지 않았다. 어쨌든 유전자 표적화에 동일한 서열을 사용하는 것이 명백히 권장되었으므로 ExoCET은 이상적인 상동성 박스를 신속하게 얻는 효과적인 방법이었다. PCR에 의해 게놈으로부터 상동성 박스를 증폭시키는 방법과 달리, ExoCET은 단편 크기에 의해 제한되지 않았고, 돌연변이를 도입하지 않았으며, DNA 일배체형을 유지할 수 있었다. 더욱이, 상동성 박스의 말단은 또한 (서던 블롯팅 또는 결찰 PCR과 같은) 유전자형 분석 방식에 따라 선택될 수 있어서, 상동성 박스의 길이가 최적화될 수 있다. 따라서 ExoCET은 특히 CRISPR/Cas9와 결합된 개별화된 게놈 수술에 이점을 제공한다15.
본 발명자들은 ExoCET을 사용하여 동질유전자 표적화 벡터를 구축하여 포유동물 게놈을 조작하였다. 마우스 배아 줄기세포 연구에서의 경험50을 고려하여, 본 발명자들은 동질유전자 상동성 박스로서 인간 또는 마우스 게놈으로부터 직접적으로 5 내지 10-kb DNA 단편을 클로닝하는 것을 목표로 하였다(도 8A 및 도 9A). 이들 DNA 단편은 동일한 유전자일 뿐만 아니라 다형성 일배체형(polymorphic haplotype)을 유지한다는 점에 주목할 만하다. 따라서, 본 발명자들은 이를 HIT(haplotype isogenic targeting) 벡터라고 불렀다. 본 발명자들은 ExoCET에 의해 인간 게놈(시험관내 배양된 세포주 및 인간 혈액) 및 마우스(시험관내 배양된 세포주)로부터 8-9-kb DNA 단편을 직접 클로닝하였다(도 8B 및 도 9B). 이어서, 선택 마커 및 다른 기능적 요소16를 Redαβ 재조합에 의해 HIT 벡터에 삽입하였다(도 8C 및 도 9C).
실시예 7
ExoCET을 이용한 포유류 세포의 유전자형 분석(genotyping)
서던 블롯팅 및 결찰 PCR은 위양성 신호(false positive signal)를 생성할 수 있는 반면, ExoCET은 변형된 게놈의 유전자형 분석을 위한 가장 신뢰할 수 있는 방법으로 사용될 수 있다. 긴 범위 PCR(long range PCR)은 포유동물 유전자형 연구에서 위양성 신호를 받기 쉽기 때문에, 본 발명자들은 이전에 서던 블롯팅에 의해 긴-절편 PCR에 의해 스크리닝된 Kmt2d-AID-neo-표적화된 마우스 배아 줄기세포를 확인하고자 하였다. 그러나 본 발명자들은 좋은 프로브를 얻지 못했다. 따라서, 본 발명자들은 도 10A에 도시된 ExoCET 방법을 사용하여 4개의 가능한 Kmt2d-AID-neo- 표적화된 마우스 배아 줄기세포의 게놈으로부터 전체 표적화 구성요소를 함유하는 DNA 단편을 클로닝 하였다. ExoCET에 의해 클로닝된 재조합 플라스미드는 제한 분석 및 DNA 시퀀싱을 거쳤으며, 그 결과 4개의 세포가 성공적으로 표적화되고 단일 표적화됨을 보여주었다(도 10B). 또한, 본 발명자들은 ExoCET을 사용하여 이전에 수득한 Oct4-Venus-neo, Nanog-Cherry-neo, Gata2-Venus-neo 및 Set1b-TC-neo 표적 마우스 배아 줄기세포를 재검증하였다(표 3). 이들 표적 세포는 서던 블롯팅에 의해 이전에 확인되었다. 이들 결과는 ExoCET 유전자형에 대한 부위 제한이 없음을 나타냈다. 본 발명자들은 긴 범위 PCR 및 서던 블롯팅이 정확한 신호를 얻지 못했기 때문에 Klf4-Venus-neo-표적화된 마우스 배아 줄기세포가 성공적으로 표적화되었는지를 이전에 결정에 실패하였다. 본 발명자들은 ExoCET를 사용하여 게놈 상에 상응하는 영역에서 카나마이신 내성을 갖는 DNA 단편을 클로닝하지 않았다(표 3). 클로닝된 클로람페니콜 내성 플라스미드의 제한 분석은 이들 중 50%가 야생형 DNA 서열을 함유한다는 것을 발견하였다(도 11). 따라서, 본 발명자들은 이 세포가 정확하게 표적화되지 않았다는 것을 정확히 알고 있었다.
ExoCET 유전자형 분석 실험 데이터
마우스 배아 줄기세포
(형질전환된 DNA의 양)		 게놈 제한 효소 사이즈 (kb) 클로람페니콜 플레이트의 콜로니 수 (/mL) 카나마이신 및 클로람페니콜 플레이트/
Double streak (Km/Cm)		 카나마이신 + 클로람페니콜의 이중-안티 플레이트에서 콜로니의 정확한 비율 *
Oct4-Venus-neo #7 (R1)
(10 μg genomic DNA+ 250 ng vector)		 EcoRV+PacI 9.6 34 ± 1 9/36 9/9
Nanog-Cherry-neo #18 (R1)(7.7 μg genomic DNA+ 400 ng vector) NdeI 13 49 ± 12 17/54 7/17 **
Gata2-Venus-neo #19 (GM8)(1.5 μg genomic DNA+ 500 ng vector) BstZ17I 16.8 212 ± 27 5/45 5/5
Set1b-TC-neo #4 (R1)(10 μg genomic DNA+ 250 ng vector) AseI 24 49 ± 8 1/36 1/1
Klf4-Venus-neo #9 (R1)(10 μg genomic DNA+ 250 ng vector) AflII 10.2 18 ± 4 0/36 -
* 표 3에서 제한 분석 후의 의미.
** 표 3에서, 나머지 10개는 분자 내 재조합이었다는 것을 의미한다(클론된 표적 서열에서 40 bp 초과의 11회 직접 반복을 포함).
ExoCET 유전자형 분석 최적화에 필요한 Oct4-Venus-neo 표적화된 마우스 배아 줄기세포 게놈 DNA의 양
EcoRV 및 PacI로 절단된 500ng의 게놈 DNA를 하기에 나타낸 p15A-cm 벡터의 양과 혼합하였다
벡터 카나마이신 및 클로람페니콜 이중 저항 플레이트의 콜로니 수 (/mL) 정확한 수/검출 수(Correct number/detection number)*
500 ng 12 3/3, 100%
1000 ng 10 3/3, 100%
2000 ng 8 3/3, 100%
EcoRV 및 PacI로 절단된 1000ng의 게놈 DNA를 하기에 나타낸 p15A-cm 벡터의 양과 혼합하였다
벡터 카나마이신 및 클로람페니콜 이중 저항 플레이트의 콜로니 수 (/mL) 정확한 수/검출 수(Correct number/detection number)*
500 ng 10 3/3, 100%
1000 ng 10 3/3, 100%
2000 ng 10 3/3, 100%
* 표 4에서 제한 분석 후의 의미.
ExoCET 유전자형 분석은 긴 범위 PCR과 비교하여 위양성 신호를 생성하지 않았다. 서던 블롯팅과 비교하여 ExoCET 유전자형 분석이 더 간단하고 혼성화 프로브의 번거로운 스크리닝이 필요하지 않았다. ExoCET 유전자형 분석에서, 온전한 표적화 요소의 방출을 위한 제한 효소 부위를 쉽게 이용할 수 있었고, 잘 준비된 게놈의 경우, 유전자형 분석 결과가 3일 내에 얻어졌다. 더 중요한 것은 ExoCET이 위양성 신호를 생성하지 않았다는 것이다. 상기 표적화 요소는 선별 마커를 갖기 때문에, 500ng의 제한 효소 게놈 DNA면 더 나은 클로닝 효율을 얻기에 충분하다(표 4). ExoCET 유전자형 분석의 처리량을 증가시키기 위해, 96-웰 플레이트에서 배양된 세포가 사용될 수 있다.
실시예 8
메타 유전자(Metagenomic) 샘플에 적용된 ExoCET 클로닝 기술
전체 게놈 시퀀싱 결과의 기능적 분석에는 간단하고 빠른 발현 벡터 구성 방법이 필요하다. 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명자들은 3.0x109-bp 게놈으로부터 최대 50-kb까지의 DNA 단편을 클로닝할 수 있다. 이를 위해, 본 발명자들은 1ng의 P. phosphoreum 게놈 DNA를 10 μg의 Bacillus subtilis 게놈 DNA로 희석하여 메타 유전자(metagenomics)를 모방하였다. 상기 실험은 ExoCET에 의해 14-kb lux 유전자 클러스터를 성공적으로 클로닝하였고 상당한 효율을 얻었다(표 5). 환경 샘플은 일반적으로 104종 이상의 종을 포함하므로51 -53 상기 결과는 발명가가 ExoCET 클로닝 기술을 메타 유전자 샘플에 적용하도록 동기를 부여할 수 있다.
ExoCET을 사용하여 희석된 P. phosphoreum 게놈으로부터 14kb lux 유전자 클러스터를 직접 클로닝하였다.
P. phosphoreum (ng)
(BamHI+KpnI)		 B. subtilis (μg)
(BamHI)		 벡터 콜로니수(/mL) 정확한 수/검출 수(Correct number/detection number)
10 10 p15A-cm 200±2 7/12
5 10 p15A-cm 142±22 5/12
2 10 p15A-cm 102±8 2/12
1 10 p15A-cm 104±18 2/24
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Claims (35)

  1. 2개 이상의 표적 핵산 분자를 제1엑소뉴클레아제로 처리하는 단계 및
    숙주 세포에서 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질의 존재하에서 상기 2개 이상의 표적 핵산 분자를 재조합하는 단계를 포함하고,
    여기서 재조합된 표적 핵산 분자는 적어도 하나의 동일한 서열을 공유하고, 적어도 하나의 동일한 서열이 2개 이상의 표적 핵산 분자 각각의 내부 또는 그 말단에 있고,
    여기서 제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 시험관내 결합(in vitro joining)을 포함하고; 상기 시험관내 결합은 2개 이상의 표적 핵산 분자를 결합하는 단계를 포함하고,
    여기서 제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 효소 절단(enzyme digestion) 및 어닐링을 포함하고,
    상기 제2엑소뉴클레아제는 RecE이고, 상기 어닐링 단백질은 RecT인 것을 특징으로 하는 상동성 재조합 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 동일한 서열은 적어도 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1엑소뉴클레아제는 T4 DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I의 클레노프 단편, T5 엑소뉴클레아제 및 T7 엑소뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 2개 이상의 표적 핵산 분자를 처리하는 단계는 DNA 폴리머라제, dNTP 및 DNA 리가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 효모 세포 또는 박테리아 세포이며 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 전장 RecE 및 RecT를 발현하는 E. coli 세포이거나, 또는 상기 숙주 세포는 플라스미드 벡터 또는 염색체 상에서 상기 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 2개 이상의 표적 핵산 분자는 엔도뉴클레아제에 의해 절단된 DNA 단편, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편, 게놈 DNA 단편, cDNA 라이브러리의 구성원, 박테리아 인공 염색체(BAC)로부터 유래된 단편 및 클로닝 벡터의 단편으로부터 선택된 선형 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 2개 이상의 표적 핵산 분자를 제1엑소뉴클레아제로 처리하는 단계 및
    숙주 세포에서 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질의 존재하에서 상기 2개 이상의 표적 핵산 분자를 재조합하는 단계를 포함하고,
    각각의 핵산 분자는 생성된 어셈블리 생성물에서 인접한 핵산 분자와 적어도 하나의 동일한 서열을 공유하고,
    적어도 하나의 동일한 서열이 2개 이상의 표적 핵산 분자 각각의 내부 또는 그 말단에 있고,
    여기서 제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 시험관내 결합(in vitro joining)을 포함하고; 상기 시험관내 결합은 2개 이상의 표적 핵산 분자를 결합하는 단계를 포함하고,
    여기서 제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 효소 절단(enzyme digestion) 및 어닐링을 포함하고,
    상기 제2엑소뉴클레아제는 RecE이고, 상기 어닐링 단백질은 RecT인 것을 특징으로 하는 핵산 분자를 어셈블리하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 동일한 서열은 적어도 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1엑소뉴클레아제는 T4 DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I의 클레노프 단편, T5 엑소뉴클레아제 및 T7 엑소뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 2개 이상의 표적 핵산 분자를 처리하는 단계는 DNA 폴리머라제, dNTP 및 DNA 리가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 효모 세포 또는 박테리아 세포이며 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 전장 RecE 및 RecT를 발현하는 E. coli 세포이거나, 또는 상기 숙주 세포는 플라스미드 벡터 또는 염색체 상에서 상기 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 2개 이상의 표적 핵산 분자는 엔도뉴클레아제에 의해 절단된 DNA 단편, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편, 게놈 DNA 단편, cDNA 라이브러리의 구성원, 박테리아 인공 염색체(BAC)로부터 유래된 단편 및 클로닝 벡터의 단편으로부터 선택된 선형 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 선형 클로닝 벡터 및 게놈 DNA 단편의 혼합물을 제1엑소뉴클레아제로 처리하는 단계 및
    숙주 세포에서 제2엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질의 존재하에서 상기 선형 클로닝 벡터 및 상기 게놈 DNA 단편의 혼합물의 표적 DNA 단편을 재조합하는 단계를 포함하고,
    상기 선형 클로닝 벡터는 상기 선형 클로닝 벡터 및 표적 DNA 단편 각각의 내부 또는 말단에서 상기 게놈 DNA 단편의 혼합물의 표적 DNA 단편과 적어도 하나의 동일한 서열을 공유하고,
    여기서 제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 시험관내 결합(in vitro joining)을 포함하고; 상기 시험관내 결합은 2개 이상의 표적 핵산 분자를 결합하는 단계를 포함하고,
    여기서 제1엑소뉴클레아제의 존재하에 처리하는 단계는 효소 절단(enzyme digestion) 및 어닐링을 포함하고,
    상기 제2엑소뉴클레아제는 RecE이고, 상기 어닐링 단백질은 RecT인 것을 특징으로 하는 게놈 DNA를 클로닝하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 동일한 서열은 적어도 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 제1엑소뉴클레아제는 T4 DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I의 클레노프 단편, T5 엑소뉴클레아제 및 T7 엑소뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    선형 클로닝 벡터 및 게놈 DNA 단편의 혼합물을 처리하는 단계는 DNA 폴리머라제, dNTP 및 DNA 리가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 효모 세포 또는 박테리아 세포이며 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 전장 RecE 및 RecT를 발현하는 E. coli 세포이거나, 또는 상기 숙주 세포는 플라스미드 벡터 또는 염색체 상에서 상기 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 표적 DNA 단편은 엔도뉴클레아제에 의해 절단된 DNA 단편, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편, 게놈 DNA 단편, cDNA 라이브러리의 구성원, 박테리아 인공 염색체(BAC)로부터 유래된 단편 및 클로닝 벡터의 단편으로부터 선택된 선형 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법을 사용하는 DNA 합성 방법.
  23. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 DNA 단편 어셈블리 방법.
  24. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 표적화 벡터의 구축 방법.
  25. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 표적화 벡터를 구축하는 방법.
  26. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법을 사용하는 유전자형 분석 방법.
  27. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 포유동물 세포의 유전자형 분석 방법.
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