JP2013530689A - 直接クローニング - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
i)配列番号1のアミノ酸564〜587;または
ii)配列番号1のアミノ酸564〜587に対してその24アミノ酸配列の全長を通して少なくとも70%の同一性を有する24アミノ酸配列
を含む方法を提供する。
驚くべきことに、既存の相同組換え技術で用いられる短縮型RecEに存在しない内因性N末端RecE配列の一部を含むRecEを用いることによって相同組換えが仲介されることができることが見出された。さらに、驚くべきことに、このようなN末端延長型RecEを用いることによって、LLHRの効率が増加することが見出された。LLHRの最高の効率は、完全長RecEを用いることによって得られており、従って、本発明は、好ましくはLLHRを仲介するための完全長RecEの使用を含む。E.コリK12由来の完全長RecEを以下に示す(配列番号1):
MSTKPLFLLRKAKKSSGEPDVVLWASNDFESTCATLDYLIVKSGKKLSSYFKAVATNFPVVNDLPAEGEIDFTWSERYQLSKDSMTWELKPGAAPDNAHYQGNTNVNGEDMTEIEENMLLPISGQELPIRWLAQHGSEKPVTHVSRDGLQALHIARAEELPAVTALAVSHKTSLLDPLEIRELHKLVRDTDKVFPNPGNSNLGLITAFFEAYLNADYTDRGLLTKEWMKGNRVSHITRTASGANAGGGNLTDRGEGFVHDLTSLARDVATGVLARSMDLDIYNLHPAHAKRIEEIIAENKPPFSVFRDKFITMPGGLDYSRAIVVASVKEAPIGIEVIPAHVTEYLNKVLTETDHANPDPEIVDIACGRSSAPMPQRVTEEGKQDDEEKPQPSGTTAVEQGEAETMEPDATEHHQDTQPLDAQSQVNSVDAKYQELRAELHEARKNIPSKNPVDDDKLLAASRGEFVDGISDPNDPKWVKGIQTRDCVYQNQPETEKTSPDMNQPEPVVQQEPEIACNACGQTGGDNCPDCGAVMGDATYQETFDEESQVEAKENDPEEMEGAEHPHNENAGSDPHRDCSDETGEVADPVIVEDIEPGIYYGISNENYHAGPGISKSQLDDIADTPALYLWRKNAPVDTTKTKTLDLGTAFHCRVLEPEEFSNRFIVAPEFNRRTNAGKEEEKAFLMECASTGKTVITAEEGRKIELMYQSVMALPLGQWLVESAGHAESSIYWEDPETGILCRCRPDKIIPEFHWIMDVKTTADIQRFKTAYYDYRYHVQDAFYSDGYEAQFGVQPTFVFLVASTTIECGRYPVEIFMMGEEAKLAGQQEYHRNLRTLSDCLNTDEWPAIKTLSLPRWAKEYAND
i)配列番号1のアミノ酸564〜587;または
ii)配列番号1のアミノ酸564〜587に対してその24アミノ酸配列の全長を通して少なくとも70%の同一性(例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性)を有する24アミノ酸配列
を含む方法を提供する。
i)Tヌクレオチド列(run)を有する3’オリゴヌクレオチドを、前記3’オリゴヌクレオチドがポリA鎖にアニールするように目的とする1以上のmRNA配列と接触させ;ここで前記3’オリゴヌクレオチドはライブラリーの作成に使用するためのクローニングベクターと相同領域を共有する、Tヌクレオチド列に対して3’の配列を含み;
ii)mRNAから相補的cDNAを逆転写し;
iii)Gヌクレオチド列を有する5’オリゴヌクレオチド(“PlugOligo”)を、そのGヌクレオチド列がcDNA配列の末端に付加されたCヌクレオチド列にアニールするようにii)の産物と接触させ;ここで前記5’オリゴヌクレオチドは、ライブラリーを生じさせるために使用されるクローニングベクターと相同な領域を共有する、第1鎖合成の伸長のためのGヌクレオチド列に対して5’のテンプレート配列を提供し、3'リン酸を有し、ここでi)における相同領域とiii)における相同領域とは異なり;
iv)PlugOligoを除去し、第2相同領域の5’末端から第2鎖合成をプライミングし、各末端において2つの相同領域を有する二本鎖cDNAを作成する
ことによって第1核酸分子を作成することを含む。
略語
LLHR-線状-線状相同組換え
LCHR-線状-環状相同組換え
構築物中のgba=Red γ、-Red β、-Red αオペロン
構築物中のgbaA=Red γ-Red β-Red αオペロン+E.コリK12由来のrecA
Red-gba=Red γ、Red βおよびRed α
構築物中のETg=RecE-RecTオペロン+Red γ(完全長RecE)
構築物中のETgA=RecE-RecTオペロン+Red γ+RecA
nt-ヌクレオチド
bp-塩基対
kbp-キロ塩基対
ng-ナノグラム
本実施例において、RecEとは、RecEと共にアミノ酸残基数が示される場合を除き、完全長RecEのことを言う。
LCHRおよびLLHRを仲介する種々のタンパク質の能力をアッセイした。LCHRおよびLLHRは、それぞれ、図1Aおよび図1Bに示した概要に従って行った。LCHRに関しては、kan PCR産物(PCRによって増幅したカナマイシン耐性遺伝子)は、両方の末端において、クロラムフェニコール(Cm)耐性を含むp15A-cmプラスミドに対する50bpホモロジーアームを有する。組換え操作(recombineering)に優れたE.コリ細胞(本明細書においてはGB2005)へのこのプラスミドおよびこのPCR産物の同時エレクトロポレーションとLCHRの成功とによって、クロラムフェニコール(Cm)+カナマイシン(Kan)抵抗性プラスミドp15A-cm-kanが生成される。同様に、LLHRアッセイにおいて、kan PCR産物は、線状p15A-cm PCR産物に対して2つの50bpホモロジーアームを有する。再び、組換えに優れたE.コリ細胞への2つのPCR産物の同時エレクトロポレーションとLLHRの成功とによって、Cm+Kan抵抗性プラスミドp15が生じる。
LCHRにはRecEのC末端領域のみが必要であり、短縮型RecEはLCHRの効率を増加させることが知られている(13、14)。本明細書においては、LLHRを仲介する短縮型RecEと完全長RecEの能力をアッセイした。LCHR(図2A)およびLLHR(図2B)のアッセイは、実施例1の記載と同様に行った。
LCHRおよびLLHR効率に対するホモロジーアームの長さの効果を調べるために、両方の末端に異なる長さのホモロジーアームを有する一連の線状分子を用いて実施例1記載のアッセイを行った。ホモロジーアームの長さが増加するに従って、Red組換え酵素によって仲介されるLCHR(pSC101-BAD-gba-tetから発現されるRed-gba、図4A)およびRecETによって仲介されるLLHR(pSC101-BAD-ETg-tetから発現されるRecETg、図4B)の両方の効率が増加する。ホモロジーアームの最少長さに関してLLHRとLCHRとの間に差異が存在する。RecETによって仲介されるLLHRは、2つの分子間にわずか20bpの相同性を必要とするだけである。λ Redによって仲介されるLCHRは、2つの分子を結合させるのに少なくとも30bpの相同性を必要とする。しかしながら、これらの最少必要量は類似しており、LCHRおよびLLHRは、共に効率とホモロジーアームの長さとの間に線形関係を示す。
LLHRにおいて、JC8679(recBC sbcA)(引用文献5および13参照)はJC9604(recA recBC sbcA)(引用文献5および13参照)よりも効率的であることならびに、recA欠損宿主におけるRecAの一過性発現は、Red/ETリコンビニアリングまたはLCHR(13、15、22)には寄与しないが、形質転換効率を増加させることによってLCHRを改善する(27)ことは既に報告されている。LLHRに対するRecAの一過性発現の効果を試験するために、実施例1のLLHRアッセイを用いて、RecEおよびRecT(ET)の発現によるLLHRの効率と、RecE、RecTおよびRed γ(ETg)の発現によるLLHRの効率およびRecE、RecT、Red γおよびRecA(ETgA)の発現によるLLHRの効率とを比較した(図5A)。タンパク質は、それぞれ、pSC101-BAD-ET-tet、pSC101-BAD-ETg-tetおよびpSC101-BAD-ETgA-tetから発現させた。RecAの発現によってLLHR効率は改善され、3倍のコロニー数増加が引き起こされた。
驚くべきことに、非相同一本鎖DNAオリゴヌクレオチドがLLHRの効率を改善することが測定された。このことは、追加の組換え酵素の発現なしにGB2005における組換えの非効率的バックグラウンドレベルに依存する場合(図6A)と、RedおよびRecET系の発現を伴う場合(図6B)の両方において確認された。
E.コリにおいて、多くの場合、4つの誘導性プロモーター(Para-BADプロモーター-アラビノース誘導性、rhaS-Prhaプロモーター-ラムノース誘導性、tetR-tetOプロモーター-テトラサイクリン誘導性およびcI578-pLプロモーター-温度誘導性)が用いられる。これらの異なる誘導性プロモーターを用いてRedおよびRecET系の発現を駆動し、プロモーターによって駆動される組換え効率を評価した。すべてのプロモーターをpSC101プラスミド上にクローニングした。LCHRおよびLLHRに用いたモデルは、実施例1に記載のものと同じものを用いた。
Red/ET組換え技術には、3つの主要な用途がある。a)環状標的へのDNA配列の挿入または組み込み(13、15);b)環状標的からのDNA配列のサブクローニングまたは線状標的からのDNA配列のクローニング(7);およびc)オリゴ修復法(22、23)である。LLHRおよびLCHRにおいて、図1〜6のデータは、RecET系の性能とRed系の性能との間に有意差が存在することを示している。この差異は、オリゴ修復法にも適用できる。オリゴ修復法は、2つの作用に分類することができる。オリゴを線状化ベクターに組換えて、そのベクターを再環状化すること(OLHR、図7A)およびオリゴを組換えて環状ベクターに組み込むこと(図7B)である。合成オリゴは、親二本鎖DNAの上鎖(upper strand)または下鎖(lower strand)のいずれであることもできる。本明細書においては、我々は、オリゴを、標的分子の複製方向に従って、リーディング鎖またはラギング鎖として区別する。図7Cにおける実験において、2つの相補的オリゴからアニーリングさせた二本鎖DNAもまた対照として用いた。
E.コリK12ゲノムは、組み込まれ無力化された、RecETオペロンを有するracプロファージの部分コピーを含む(28、29)。RecTはこのオペロンから発現されるが、E.コリK12はRecEを発現しない。この実験によって、E.コリK12はRecEを発現しないことが確認され、E.コリゲノムに組み込まれたRecEを活性化してLLHRを仲介させることが可能であることが明らかとなった。
Red/ET組換え技術は、一連のDNA分子を設計するために広く使用されてきた。主な用途は、選択マーカー(sm)遺伝子を有するカセットを標的分子に挿入または組み込むことである。多くの場合、カセットは前もって選択マーカーを有していない。smを有するカセットを作成するための最も一般的な方法は、Red/ET組換え技術を用いて非smおよびsm構築物を結合させて1つの大分子を作成するかまたは、オーバーラッピングPCRを用いて非sm+smの大分子を作成するかである。この手順を簡単にするために、本明細書において、三重組換えと呼ばれる戦略を提供する(図9A)。三重組換えは、Red/ET系および完全長RecEの効率を利用して、3つの分子、例えば1つの環状標的+2つの線状分子(非smおよびsm)を、3分子中に存在する短い相同配列を用いてin vivoで結合させる。本実施例においては、図9Aの記載に従って、2つの線状DNA分子は50bpのオーバーラッピング領域を有し、そのそれぞれは標的ベクターに対してホモロジーアームを有する。通常は、線状分子の1つは選択マーカー遺伝子である。組換え事象後、2つの線状分子は標的ベクターに組み込まれる。
大きなカセットの組み込みには、PCRの限界による問題がある。PCRは、大きなカセットを扱うことはできないし、変異が導入される場合がある。本明細書においては、本方法は、隣接する相同領域を有するカセットを最初に作成し、次いでそれを標的ベクターに組換える二重相同性組換え技術戦略を用いる(31)。
RecET系および完全長RecEによって仲介される相同組換え(LLHR)によって、線状分子を、高い効率で線状ベクターに組換えることができる。RecET系もまた、例えば、多重遺伝子またはオペロン(個々のリポソーム結合部位によって分離される多重遺伝子)の作成において、複数の線状分子と線状ベクターとの組換えに適用することができる。図11Aは、この戦略の図であり、図11Bは、哺乳動物の発現構築物を作成するための例示的な実験である。各PCR産物は、点線矢印によって示されるように、その隣接分子とオーバーラップする配列同一性領域を有する。最終組換え産物はプラスミド複製起点および選択遺伝子を含むだろう。PCRによって、1つの線状ベクター(R6K-cm、1680bp)+異なるサイズ(1358bp、961bpおよび602bp)を有する3つの機能性カセットを作成し、RecETのL-アラビノース誘導後にGB2005-pir+pSC101-BAD-ETgAに同時形質転換した。各分子の末端における短いホモロジーアームを用い、in vivoで、RecETによって4つの線状分子を組換えた。3回のエレクトロポレーションから、カナマイシンプレート上で34コロニーを選択した。制限酵素分析によって32クローンを検証した。
通例、cDNAライブラリーの構築は、線状ベクターへの二本鎖cDNA分子のライゲーションに依存する。RecET系においては、LLHRは、エレクトロポレーション当たり3x106コロニーを超える絶対効率を有する(図6B)。この高い効率に基づいて、LLHRを用いるcDNAライブラリーの構築戦略が提供される(図12Aおよび12B)。図12Aに示すように、i)5’末端におけるホモロジーアーム(HA;灰色の線)および3’末端におけるTのストレッチで構成される3’オリゴヌクレオチドは、mRNAポリA鎖にアニールし、MMLVベースRT逆転写酵素による第一鎖cDNA合成をプライミングする;ii)mRNA5’末端において、RTは、新しく合成された第一鎖cDNAの3’末端に非鋳型ヌクレオチド(主としてデオキシシチジン(dC))を付加し続ける;iii)5’末端におけるホモロジーアーム(灰色の線)および、3’末端におけるGのストレッチ+3’ホスフェートで構成される第2オリゴヌクレオチド(‘PlugOligo’として知られる)は、Cトラックにアニールし、第2鎖合成をプライミングする。最終二本鎖cDNAは、クローニングベクターを用いる組換えのためのホモロジーアーム(HA)を有する。最終生成物は、cDNAライブラリーの構築のためのcDNAプールである。ステップivに特異的プライマーを用いれば、この手順は、遺伝子特異的cDNAの作成に容易に変換することができる。
本実施例において、好都合に置かれた制限部位に依存する必要のない標的配列のクローニング方法を提供する。BACまたはゲノムDNAプール(例えば)は、多くの制限部位で消化されるが、それらは必ずしも標的領域に近くない。標的領域は無傷のままである。線状ベクターは、サブクローニングされる領域を規定するホモロジーアームと共に用いられる。BAC DNAおよびベクターは、完全長RecEを発現し、LLHRを行うことができるE.コリ株に、同時エレクトロポレーションすることができる。これによって、組換えおよび、目的とするDNA、例えば線状ベクターの選択マーカーを含む環状ベクターの作成が行われる。
小さなゲノム断片は、PCRによって容易にクローニングすることができる。しかしながら、ゲノムDNAからの大きな断片(15kbより上)のクローニングは大変難しく、時間がかかる。ゲノムDNA調製、消化、ベクターへの連結、宿主への形質転換、個々のコロニーピッキング、ライブラリースクリーニングおよびサブクローニングを含む多くの異なるステップが必要である。手順を簡単にし、クローニング効率を上げるために、本明細書において、図14Bに示すように、LLHRに基づく直接クローニング戦略を提供する。実施例13Bに示すように、LLHRからの誤った産物は再環状化ベクターである。短い反復配列(未満5bp)の組換えまたは、線状ベクターの外側配列の50ヌクレオチド以内に結合する非相同性末端の組換えによって再環状化ベクターの約80%が形成される。
コロニー:308
挿入を有するクローン:15/42
正しいクローン:12/42
Red-gbaまたはRecETgを発現するE.コリ細胞における形質転換線状分子は、エキソヌクレアーゼRed-αまたはRecEによって5’末端から3’末端に消化されて、3’一本鎖末端が暴露される。ドナーは、LCHRおよびLLHRの両方において線状分子であるが、レシピエントは、LCHRにおいては環状の複製可能なベクターであり、LLHRにおいては線状ベクターである。2つの場合の間には、基本的な差異がある。LCHRにおいては、環状分子は無傷であり、Red-αまたはRecEで処理された線状分子は、相同配列が暴露される複製フォークに侵入する。LLHRにおいては、線状分子は共にRed-αおよびRecEによって処理され、一本鎖相同配列は反応後に暴露される。in vivoでの両方の分子のアニーリングは、RecETによって促進される。LCHRとLLHRとのこの差異によって、LCHRが複製に依存し、LLHRが複製に依存しないことを本発明者らが予測することが可能となった。
エキソヌクレアーゼRed-aおよびRecEは、二本鎖切断の5’末端に作用する。RecEは、5’末端にリン酸を有さない鎖を5’末端から3’末端に分解するが、Red-aは、分解を進行させるためには5’末端リン酸を必要とする(文献34-Red-aおよびRecE)。5’末端におけるリン酸なしの線状DNA分子(例えば、修飾なしのオリゴを用いて製造されたPCR産物)は、Red-aがそれを処理する前に、最初に、in vivoで5’末端でリン酸化されなければならない。分子の末端の修飾は、エキソヌクレアーゼ活性に影響を有するので、LLHRおよびLCHRに対する線状分子の修飾の効果を試験した。異なる5’末端を有する5つのオリゴを本実験に用いた:修飾なし(O);リン酸化(P);ホスホロチオエート化(S);相同性末端、5’末端に修飾なし、ヌクレオチド51に内部ホスホロチオエート化あり(iS);5’末端にリン酸化、ヌクレオチド51に内部ホスホロチオエート化(pS)。実施例1に記載のモデル実験において、これらのオリゴを用いて対称末端または非対称末端を有するPCR産物を製造したが、相同性はPCR産物における50bpである。線状二本鎖PCR産物において、5’末端修飾のない鎖は、RecEによって直接に消化されるか、またはin vivoでのリン酸化後にRed-aによって消化されることができる;5’末端リン酸化を有する鎖は、Red-aおよびRecEによって直接に消化されることができる;5’末端ホスホロチオエート化を有する鎖は、Red-aおよびRecEの両方によって消化されることができない;5’末端に修飾を有さないが、51ntに内部ホスホロチオエート化を有する鎖は、50塩基までRecEによって消化されて、もう1つの鎖における正確な相同性を暴露することができる;5’末端にリン酸化を有し、51ntに内部ホスホロチオエート化を有する鎖は、Red-aおよびRecEの両方によって塩基50まで直接に消化されて、もう1つの鎖における正確な相同性を暴露することができる。これらのPCR産物を用いるLCHR(図17Aおよび17C)およびLLHR(図17Bおよび17D)を、Red-gba(図17Cおよび17D)またはRecETg(図17Aおよび17B)の発現を有するGB2005において試験した。
アラビノース誘導性プロモーターの制御下のベクターに合成I-SceI遺伝子を挿入した。発現プラスミドはR6K由来プラスミドであり、これはBAC、p15AまたはpBR322由来プラスミドと適合性である(図18)。I-SceIの認識部位は30bp配列の5’AGTTACGCTAGGGATAACAGGGTAATATAG3’である。
表2-プラスミドおよび株のリスト
**DH10B遺伝子型:F- mcrA Δ(mmr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara, leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ-
Claims (56)
- 少なくとも1つの配列相同領域を共有する少なくとも第1核酸分子と第2核酸分子との間の相同組換えを行うための方法であって、5’-3’エキソヌクレアーゼおよびアニーリングタンパク質の存在下で第1核酸分子と第2核酸分子とを接触させることを含む方法において、5’-3’エキソヌクレアーゼが、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有する領域および少なくとも:
i)配列番号1のアミノ酸564〜587;または
ii)配列番号1のアミノ酸564〜587に対してその24アミノ酸配列の全長を通して少なくとも70%の同一性を有する24アミノ酸配列
を含む方法。 - 5’-3’エキソヌクレアーゼがRecEである、請求項1に記載の方法。
- RecEが、配列番号1のアミノ酸564〜866またはそのバリアントを含むかまたはそれからなる、または、配列番号1に対して303アミノ酸配列の全長を通して少なくとも70%の配列同一性を有する長さ303アミノ酸の配列を含むかまたはそれからなるバリアントである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- RecEが、配列番号1のアミノ酸1〜866、141〜866、423〜866もしくは564〜866またはこの群からの配列のバリアントからなる群から選択される配列を含むかまたはそれからなり、前記バリアントが、配列番号1に対して配列の全長を通して少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- RecEが、配列番号1に示されるRecEに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。
- RecEが完全長RecEである、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。
- アニーリングタンパク質がRecTである、請求項2〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 第1および第2核酸分子が線状核酸分子である、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。
- 相同組換えが宿主細胞内で行われる、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。
- 5’-3’エキソヌクレアーゼが異種DNAから発現される、請求項9に記載の方法。
- 5’-3’エキソヌクレアーゼがRecEであり、かつ組み込まれたプロファージのRecE遺伝子から発現され、RecEの発現が異種プロモーターによって駆動される、請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法。
- 5’-3’エキソヌクレアーゼの発現が、アラビノース誘導性プロモーターまたはラムノース誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターによって駆動される、請求項10または請求項11に記載の方法。
- 第2核酸が、線状化BAC、線状化p15A由来ベクター、線状化pBR322由来ベクター、線状化フォスミド、線状化pUC由来ベクターまたは線状化ColE1由来ベクターなどの線状化クローニングベクターである、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。
- 第1および第2核酸分子が線状であり、方法が、5’-3’エキソヌクレアーゼおよびアニーリングタンパク質の存在下で第1および第2核酸分子と第3核酸分子とを接触させることをさらに含み、前記第1核酸分子が前記第2核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第3核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第2核酸分子が前記第1核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第3核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第3核酸分子が前記第2核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第1核酸分子と他の相同領域を共有する、請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法。
- 第1および第2核酸分子が線状であり、5’-3’エキソヌクレアーゼおよびファージアニーリングタンパク質の存在下で第3核酸分子および第4核酸分子と前記第1および前記第2核酸分子とを接触させることをさらに含み、前記第1核酸分子が前記第2核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第4核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第2核酸分子が前記第1核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第3核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第3核酸分子が前記第2核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第4核酸分子と他の相同領域を共有し、前記第4核酸分子が前記第3核酸分子と相同領域を共有し、かつ前記第1核酸分子と他の相同領域を共有する、請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法。
- 第1核酸分子が目的とする配列を含み、第2および第4核酸分子が短いオリゴヌクレオチドであり、第3核酸分子がクローニングベクターである、請求項15に記載の方法。
- 第1核酸分子が長さ2kb以上の目的とする配列を含む、請求項1〜16のいずれか1つに記載の方法。
- 第1核酸分子が、遺伝子クラスターである目的とする配列を含む、請求項1〜17のいずれか1つに記載の方法。
- 遺伝子クラスターが、二次代謝物経路または脂肪酸合成経路をコードする、請求項18に記載の方法。
- 第1核酸分子がゲノムDNA断片である、請求項1〜19のいずれか1つに記載の方法。
- 第1核酸分子が線状化BACであり、方法が、目的とする配列をBACからクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも第1および第2核酸分子が線状であり、線状-環状相同組換えの第2ステップにおいて、RedαおよびRedβまたは短縮型RecEおよびRecTの存在下で少なくとも第1核酸分子と第2核酸分子との線状-線状相同組換え反応産物を用いることをさらに含む、前記請求項のいずれか1つに記載の方法。
- 線状-線状相同組換えが完全長RecEおよびRecTの存在下、in vitroで行われ、方法が、線状-線状相同組換え反応産物と宿主細胞内でさらなる核酸分子とを接触させ、RedαおよびRedβおよび好ましくはさらにRedγの存在下、in vivoで線状-環状相同組換えを行うことをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 第1核酸分子が、線状であり、その5’末端の近位にホスホロチオエート化を含み、その3’末端の近位にホスホロチオエート化を含む、請求項1〜23のいずれか1つに記載の方法。
- 第2核酸分子が、線状であり、その3’末端の近位にホスホロチオエート化を含み、その5’末端の近位にホスホロチオエート化を含む、請求項24に記載の方法。
- cDNAライブラリーを作成するための、請求項1〜25のいずれか1つに記載の方法。
- 第1および第2核酸分子が線状であり、方法が、5’-3’エキソヌクレアーゼおよびアニーリングタンパク質の存在下で第1および第2核酸分子と1以上の追加の核酸分子とを接触させ、線状産物を製造することをさらに含む、請求項1〜25のいずれか1つに記載の方法。
- 線状産物が遺伝子、オペロン、染色体または全ゲノムである、請求項27に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載の5’-3’エキソヌクレアーゼを発現する宿主細胞。
- RedαおよびRedβをコードする遺伝子をさらに含み、ここで5’-3’エキソヌクレアーゼがRedαおよびRedβとは異なるプロモーターの制御下にある、請求項29に記載の宿主細胞。
- 組み込まれたプロファージ上にrecE遺伝子を含む宿主細胞であって、recE遺伝子が異種プロモーターの制御下にある前記宿主細胞。
- 相同組換え法に使用するための、請求項1〜6のいずれか1つに記載の5’-3’エキソヌクレアーゼをコードする核酸を含むキット。
- 相同組換え法に使用するための、請求項1〜6のいずれか1つに記載の5’-3’エキソヌクレアーゼを含むキット。
- 相同組換えを行う核酸分子に対して配列相同性を持たない少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドの存在下で相同組換えを行うことによって相同組換えの効率を改善するための方法であって、少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドの非存在下で相同組換えが行われる場合と比較して相同組換えの効率が改善される前記方法。
- 少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドがDNAを含むかまたはそれからなる、請求項34に記載の方法。
- 少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドが10〜100ヌクレオチド長である、請求項34または35に記載の方法。
- 少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドが約40ヌクレオチド長である、請求項36に記載の方法。
- 少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドが各エレクトロポレーションに1〜200pmolの濃度で用いられる、請求項34〜37のいずれか1つに記載の方法。
- 相同組換えがRecEおよびRecTによって仲介される、請求項34〜38のいずれか1つに記載の方法。
- RecEが短縮型RecEである、請求項39に記載の方法。
- 相同組換え法が、請求項1〜28のいずれか1つに記載の方法である、請求項34〜39のいずれか1つに記載の方法。
- 相同組換えがRed αおよびRed βによって仲介される、請求項34〜38のいずれか1つに記載の方法。
- 相同組換えの実施に使用するための、請求項34〜37のいずれか1つに記載の少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含むキット。
- キットが、RecEをコードする核酸を含む宿主細胞を含む、請求項32、33または43のいずれか1つに記載のキット。
- 宿主細胞が、請求項24〜26のいずれか1つに記載の細胞である、請求項44に記載のキット。
- キットが、RedαおよびRedβを発現する宿主細胞を含む、請求項43に記載のキット。
- 宿主細胞が、Red γ、RecA、RedαおよびRedβの1以上をコードする核酸配列をさらに含む、請求項44または請求項45に記載のキット。
- キットが、1以上の線状化クローニングベクターをさらに含む、請求項32、33および43〜47のいずれか1つに記載のキット。
- 少なくとも1つの配列相同領域を共有する少なくとも第1核酸分子と第2核酸分子との間の相同組換えを行うための方法であって、in vivoで相同組換えを行う前に、レアカット配列特異的DNA切断酵素を用いてin vivoで少なくとも1つの環状核酸分子を線状化して第1および/または第2核酸分子を作成するステップを含む前記方法。
- レアカット配列特異的DNA切断酵素が、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)から選択される、請求項49に記載の方法。
- ホーミングエンドヌクレアーゼが、I-SceI、I-CeuI、I-CreI、I-ChuI、I-CsmI、I-DmoI、I-PanI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、F-SceI、F-SceII、PI-AaeI、PI-ApeI、PICeuI、PI-CirI、PI-CtrI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MflI、PI-MgoI、PI-MjaI、PI-MkaI、PI-MleI、PI-MtuI、PI-MtuHI、PI-PabIII、PI-PfuI、Pi-PhoI、PI-PkoI、PI-PspI、PI-RmaI、PI-SceI、PI-SspI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-TliI、PI-TliII.PI-TspI、PI-TspII、PI-BspI、PI-MchI、PI-MfaI、PI-MgaI、PI-MgaII、PI-MinI、PI-MmaI、Pi-MshI、PI-MsmII、PI-MthI、PI-TagI、PI-ThyII、I-NcrI、I-NcrII、I-PanII、I-TevI、I-PpoI、I-DirI、I-HmuI、I-HmuII、I-TevII、I-TevIII、F-SceI、F-SceII(HO)、F-SuvI、F-TevIおよびF-TevIIからなる群から選択される、請求項50に記載の方法。
- 相同組換えがRecEおよびRecTによって仲介される、請求項49〜51のいずれか1つに記載の方法。
- 相同組換え法が請求項1〜28または34〜42のいずれか1つに記載の方法である、請求項49〜52のいずれか1つに記載の方法。
- 請求項50または請求項51に記載のレアカット配列特異的DNA切断酵素をさらに含む、請求項29〜31のいずれか1つに記載の宿主細胞。
- 相同組換え法の実施に使用するためのキットであって、請求項50または請求項51に記載の少なくとも1つのレアカット配列特異的DNA切断酵素を含む前記キット。
- 相同組換え法の実施に使用するためのキットであって、請求項54に記載の宿主細胞を含む前記キット。
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