JP7328695B2 - 安定で副作用の少ないゲノム編集用複合体及びそれをコードする核酸 - Google Patents
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Description
[1] 二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、(i)疎水性アミノ酸3残基をC末端に含むペプチド、又は(ii)該アミノ酸残基の少なくとも一部がセリンに置換されたアミノ酸3残基をC末端に含むペプチドからなるタンパク質分解タグとが結合した、複合体。
[2] 前記複合体が、核酸改変酵素がさらに結合した複合体であって、標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換し又は欠失させ、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する、[1]に記載の複合体。
[3] 前記アミノ酸3残基が、ロイシン-バリン-アラニン、ロイシン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-バリン又はアラニン-セリン-バリンである、[1]又は[2]に記載の複合体。
[4] 前記核酸配列認識モジュールが、Casの2つのDNA切断能のうちの一方のみ、又は両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、[1]~[3]のいずれかに記載の複合体。
[5] 前記複合体が、CRISPR-Casシステムと、タンパク質分解タグとが結合した複合体である、[1]~[3]のいずれかに記載の複合体。
[6] 前記核酸改変酵素が核酸塩基変換酵素又はDNAグリコシラーゼである、[2]~[4]のいずれかに記載の複合体。
[7] 前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、[6]に記載の複合体。
[8] 塩基除去修復のインヒビターがさらに結合した、[6]又は[7]に記載の複合体。
[9] [1]~[8]のいずれかに記載の複合体をコードする核酸。
[10] 細菌の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する、又は該部位の近傍で二本鎖DNAにコードされる遺伝子の発現を調節する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、(i)疎水性アミノ酸3残基をC末端に含むペプチド、又は(ii)該アミノ酸残基の少なくとも一部がセリンに置換されたアミノ酸3残基をC末端に含むペプチドからなるタンパク質分解タグとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させる工程を含む、方法。
[11] 前記複合体が、核酸改変酵素がさらに結合した複合体であって、該標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、[10]に記載の方法。
[12] 前記アミノ酸3残基が、ロイシン-バリン-アラニン、ロイシン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-バリン又はアラニン-セリン-バリンである、[10]又は[11]に記載の方法。
[13] 前記核酸配列認識モジュールが、Casの2つのDNA切断能のうちの一方のみ、又は両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、[10]~[12]のいずれかに記載の方法。
[14] 前記複合体が、CRISPR-Casシステムと、タンパク質分解タグとが結合した複合体である、[10]~[12]のいずれかに記載の方法。
[15] 異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、2種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、[10]~[14]のいずれかに記載の方法。
[16] 前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、[15]に記載の方法。
[17] 前記核酸改変酵素が核酸塩基変換酵素又はDNAグリコシラーゼである、[10]~[13]、[15]及び[16]のいずれかに記載の方法。
[18] 前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、[17]に記載の方法。
[19] 該複合体が、塩基除去修復のインヒビターがさらに結合したものである、[17]又は[18]に記載の方法。
[20] 二本鎖DNAと複合体との接触が、該二本鎖DNAを有する細菌への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、[10]~[19]のいずれかに記載の方法。
本発明は、二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、タンパク質分解タグとが結合したゲノム編集用複合体及び該複合体をコードする核酸を提供する。本発明のゲノム編集用複合体の一態様において、核酸改変酵素がさらに結合した複合体(即ち、核酸配列認識モジュールと、核酸改変酵素と、タンパク質分解タグとが結合した複合体)であって、標的化された部位の核酸を改変し得る複合体を提供する。一態様において、二本鎖DNAの改変効率を向上させるため、該複合体には、塩基除去修復のインヒビターがさらに結合していてもよい。また、本発明のゲノム編集用複合体の別の態様において、核酸配列認識モジュールと、タンパク質分解タグとが少なくとも結合した複合体であって、標的化された部位の近傍で二本鎖DNAにコードされる遺伝子の発現を調節し得る複合体を提供する。一態様において、該複合体には、転写調節因子がさらに結合されていてもよい。以下では、核酸改変酵素、塩基除去修復のインヒビター及び転写調節因子の少なくともいずれかが結合した複合体と、いずれも結合していない複合体とをまとめて、「本発明の複合体」又は「ゲノム編集用複合体」と称することがあり、核酸改変酵素が結合した複合体を、特に「核酸改変酵素複合体」と称することがある。また、これらの複合体をコードする核酸をまとめて、「本発明の核酸」と称することがある。
核酸改変酵素及び塩基除去修復のインヒビターをコードするDNAも、同様に、使用する酵素のcDNA配列情報をもとにオリゴDNAプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、PBS2由来のUGIをコードするDNAは、NCBI/GenBankデータベースに登録されているDNA配列(accession No. J04434)をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、PBS2由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。
クローン化されたDNAは、そのまま、又は所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカー(例、GSリンカー、GGGARリンカー等)、スペーサー(例、FLAG配列等)及び/又は核移行シグナル(NLS)(目的の二本鎖DNAがミトコンドリアや葉緑体DNAの場合は、各オルガネラ移行シグナル)を付加して、タンパク質をコードするDNAを調製することができる。また、さらに核酸配列認識モジュールをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13);枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194);酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15);昆虫細胞発現プラスミド(例:pFast-Bac);動物細胞発現プラスミド(例:pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);λファージなどのバクテリオファージ;バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター(例:BmNPV、AcNPV);レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。核酸改変酵素として核酸分解酵素を用いる場合には、毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましい。一方で、核酸改変酵素として核酸塩基変換酵素及びDNAグリコシラーゼを用いる場合、あるいは核酸改変酵素を用いない場合には、本発明の複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV-TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主が大腸菌である場合、J23シリーズのプロモーター(例:J23119プロモーター)、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
宿主が植物細胞である場合、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーターなどが好ましい。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60,160 (1968)〕,エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic Acids Research,9,309 (1981)〕,エシェリヒア・コリJA221〔Journal of Molecular Biology,120,517 (1978)〕,エシェリヒア・コリHB101〔Journal of Molecular Biology,41,459 (1969)〕,エシェリヒア・コリC600〔Genetics,39,440 (1954)〕、エシェリヒア・コリDH5α、エシェリヒア・コリBW25113などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔Gene,24,255 (1983)〕,バチルス・サブチルス207-21〔Journal of Biochemistry,95,87 (1984)〕などが用いられる。
これに対し、CRISPR-Casシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAにより目的の二本鎖DNAの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴDNAを合成するだけで、任意の配列を標的化することができる。
従って、本発明のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、DNA切断能の両方の活性が維持されたCRISPR-Casシステム、あるいはCasの1つのみ、又は両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム(CRISPR-変異Cas)が用いられる。
あるいはCasエフェクタータンパク質をコードするDNAは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAやDNAグリコシラーゼをコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで、用いる宿主細胞での発現に適したコドン使用を有するDNAとして構築することもできる。
ここで「標的鎖」とは、標的ヌクレオチド配列のcrRNAとハイブリッド形成する方の鎖を意味し、その反対鎖で標的鎖とcrRNAとのハイブリッド形成により一本鎖状になる鎖を「非標的鎖(non-targeted strand)」と呼ぶこととする。また、核酸塩基変換反応は通常、一本鎖状になった非標的鎖上で起こる場合が多いと推定されるので、標的ヌクレオチド配列を片方の鎖で表現する場合(例えばPAM配列を表記する場合や、標的ヌクレオチド配列とPAMとの位置関係を表す場合等)、非標的鎖の配列で代表させるものとする。
1.に記載した本発明の複合体や核酸を、宿主、特に細菌に導入し、当該宿主を培養することによって、宿主の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する、あるいは標的化された部位の近傍で二本鎖DNAにコードされる遺伝子の発現を調節することができる。従って、別の実施態様において、核酸改変酵素複合体を、宿主細菌の二本鎖DNAと接触させ、標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、細菌の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法(以下「本発明の改変方法」ともいう)が提供される。核酸改変酵素として核酸塩基変換酵素又はDNAグリコシラーゼを用いることで、標的化された部位において、二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位を改変することができる。また、さらに別の実施態様において、本発明の複合体を、宿主細菌の二本鎖DNAと接触させ、標的化された部位の近傍に位置する遺伝子の転写を調節する方法が提供される。
大腸菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110 (1972)やGene,17,107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular & General Genetics,168,111 (1979)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
バチルス属菌の培養は、通常約30~約40℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
また、本発明者らは、核酸改変酵素としてPmCDA1を用いる場合に、動物細胞や植物細胞を通常よりも低温(例えば、20~26℃、好ましくは、約25℃)で培養することにより、変異導入効率を上昇させることを確認しており、細菌を培養する場合も、上記低温で培養することも好ましい。
温度感受性変異を利用する場合、例えば、ベクターの自律複製に必要なタンパク質の温度感受性変異体を、本発明の複合体をコードするDNAを含むベクターに搭載することにより、該複合体の発現後、速やかに自律複製が出来なくなり、細胞分裂に伴って該ベクターは自然に脱落する。このような温度感受性変異タンパク質としては、pSC101 oriの複製に必要なRep101 oriの温度感受性変異体が挙げられるが、これに限定されない。Rep101 ori (ts)は30℃以下(例、28℃)では、pSC101 oriに作用してプラスミドの自律複製を可能にするが、37℃以上(例、42℃)になると機能を失い、プラスミドは自律複製できなくなる。従って、上記λファージのcIリプレッサー(ts)と併用することで、本発明の複合体の一過的発現と、プラスミド除去とを、同時に行うことができる。
<菌株、プラスミド、プライマー及び標的化gRNAデザイン>
大腸菌株DH5α((F- endA1 supE44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR phoA Φ80dlacZ ΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17 (rK-, mK+), λ- )(TaKaRa-Bio)、BW25113(lacI+ rrnBT14 ΔlacZWJ16hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78 rph-1 Δ(araB-D)567 Δ(rhaD-B)568ΔlacZ4787(::rrnB-3) hsdR514 rph-1)及びTop10(F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ-)(Invitrogen)を使用した。実施例で用いたプラスミド及びプライマーを、それぞれ表1及び表2に挙げた。標的化gRNAベクターを構築するためのオリゴDNAのペアを、次のように設計した:5'-tagc-(標的配列)-3 '及び5'-aaac-(標的配列の逆相補的配列)-3'。
pCas9及びpCRISPRプラスミドを、Addgeneを介して、Marraffini研究室(非特許文献8)から入手した。Nickase Cas9:nCas9(D10A又はH840A)及びヌクレアーゼ欠損Cas9:dCas9(D10A及びH840A)(配列番号1及び2)(Jinek, M. et al., Science 337, 816-822 (2012).)をPCR法により作製した。 PmCDA1(配列番号3及び4)は、121アミノ酸のペプチドリンカー(配列番号5及び6)を用いて、nCas9又はdCas9のC末端に融合した(図1)。
目的のプラスミドで化学的に形質転換したDH5α又はBW25113細胞を、1 mLのSOC培地(2% Bacto Tryptone、0.5%酵母エキス、10 mM NaCl、2.5mM KCl、1 mM MgSO4及び20 mMグルコース)で前培養した。28℃で2~3時間インキュベートした後、細胞培養物を1 mlのルリア-ベルターニ(LB)培地又はterrific broth(TB)で1:10希釈し、必要に応じて抗生物質(クロラムフェニコール(25 μg/ml)及び/又はカナマイシン(30 μg/ml))を補充した。マキシマイザ(TAITEC)を用いて、28℃、100K rpmで一晩増殖させた。翌日、細胞培養物を再び1 ml培地で1:10に希釈し、誘導のために37℃で6時間培養し、28℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞培養物を適切な抗生物質を補充したLB又はTB寒天プレート上に連続希釈してスポットし、28℃で一晩インキュベートして単一のコロニーを形成させた。
各発現コンストラクト(dCas9、dCas9-PmCDA1、dCas9-PmCDA1-LVA-UGI、及びrpoB_1標的を有するdCas9-PmCDA1)を有するBW25113細胞を一晩前培養し、1 mLのLB培地で1:10に希釈し、誘導のために37℃で6時間増殖させ、その後28℃で一晩インキュベートした。細胞をリファンピシンを含有するプレート培地上に広げて、単一のコロニーを分離した。それぞれ3個の独立したコロニーをTB培地に接種した。Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega)を用いて、ゲノムDNAを抽出し、次いでBioruptor UCD-200 TS Sonication System(Diagenote)を用いて超音波により断片化し、500~1000 bpのサイズ分布を有する断片を得た。ゲノムDNAライブラリーを、Illumina(New England Biolabs)のNEBNext Ultra DNA Library Prep Kitを用いて調製し、Dual Index Primerで標識した。ライブラリーのサイズ選択を、Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いて行い、600~800bpの範囲の長さの標識断片を得た。サイズ分布を、Agilent 2100 Bioanalyzer system(Agilent Technologies)により評価した。Qibit HS dsDNA HS Assay Kit及び蛍光光度計(Thermo Fisher Scientific)を用いてDNAを定量した。ゲノムサイズの約20倍のカバレッジが期待できる、2×300bpのリード長を得るため、シーケンシングを、MiSeqシーケンシングシステム(Illumina)及びMiSeq Reagent Kit v3を用いて行った。データ解析は、CLC Genomic Workbench 9.0を用いて行った(CLC bio)。シーケンスリードを対にして、リードペア内の重複するリードをマージし、最大2のアンビギュイティで、0.01の品質限界に基づいてトリミングした。次の設定(Masking mode = no masking, Mismatch cost = 2, Insertion cost = 3, Deletion cost = 3, Length fraction = 0.5, Similarity fraction = 0.8, Global alignment = No, Auto-detect paired distances = Yes, Nonspecific match handling = ignore)で、リードをE.coli BW25113の参照ゲノムにマッピングした。ローカルリアライメントを、デフォルト設定で行った(Realign unaligned ends = Yes, Multi-pass realignment = 2)。バリアントコーリングを、次の設定(Ignore positions with coverage = 1,000,000, Ignore broken pairs = Yes, Ignore Nonspecific matches = Reads, Minimum coverage = 5, Minimum count = 2, Minimum frequency = 50%, Base quality filter = No, Read detection filter = No, Relative read direction filter = Yes, Significance = 1%, Read position filter = No, Remove pyro-error variants = No)で行った。出力ファイルを、Excel(Microsoft)を用いて並べ替えた。
galK、gsiA、ycbF又はyfiH遺伝子を標的とするgRNAと共にdCas9-PmCDA1又はdCas9-PmCDA1-UGI-LVAを発現するDH5α細胞を一晩インキュベートし、1 mLのLB培地で1:10に希釈し、誘導のために37℃で6時間増殖させた。細胞培養物を収集し、ゲノムDNAを抽出した。抽出されたゲノムDNAからプライマーペア(p685~p696)を用いて、標的領域を含む断片(~0.3kb)を直接増幅した。アンプリコンをDual Index Primerで標識した。サンプル当たり平均30,000以上のリードを、MiSeqシーケンシングシステムで解析した。シーケンスリードを対にして、最大2のアンビギュイティで、0.01の品質限界に基づいてトリミングし、リードペア内の重複するリードをマージした。次の設定(Masking mode = no masking, Mismatch cost = 2, Insertion cost = 3, Deletion cost = 3, Length fraction = 0.5, Similarity fraction = 0.8, Global alignment = No, Auto-detect paired distances = Yes, Nonspecific match handling = Map randomly)で、リードをそれぞれ参照配列にマッピングした。出力ファイルを、Excelを用いて並べ替えた。
デアミナーゼに媒介される標的の変異誘発が細菌に適用できるかどうかを評価するために、温度誘導性λオペレーターシステム(Wang, Y. et al., Nucleic Acids Res. 40, (2012).)下で、P.marinus(ウミヤツメ)由来のシトシンデアミナーゼPmCDA1(非特許文献11)に融合した触媒的に不活性なCas9(dCas:D10A及びH840Aの変異)を発現し、人工の構成的プロモーター J23119(図1(b))の下で、20ヌクレオチド(nt)の標的配列-gRNA足場のハイブリッド(sgRNA)下でCDAを発現する、細菌を標的としたAID(Target-AID)ベクターを構築した。真核生物では、より高い変異効率を達成するため、デアミナーゼと組み合わせたニッカーゼCas9(nCas:D10A変異)を使用することができるが(非特許文献10、11)、nCas(D10A)-CDAを発現するプラスミドでは、形質転換効率が低いことが示された。このことは、大腸菌において、完全なCas9ヌクレアーゼと同様に、nCas(D10A)-CDAが重篤な細胞増殖及び/又は細胞死を引き起こすことを示唆する(図2)。一方、nCas (H840)-CDAは、dCasやdCas-CDAと同様に高い形質転換効率を示し、細胞増殖や細胞の生存にとって有利であることが示された。
次に標的の変異誘発の効率を定量的に評価するために、ガラクトースのアナログ 2-デオキシ-D-ガラクトース(2-DOG)により、機能の喪失を積極的に選択することができるgalK遺伝子を標的として用いた。2-DOGは、galK遺伝子産物のガラクトキナーゼによって触媒され、有害な化合物となる(Warming, S. et al., Nucleic Acids Res. 33, 1-12 (2005).)。Target-AIDは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列(非特許文献11)の上流16~19塩基のコア領域内の約15~20塩基目に位置するシトシンヌクレオチド(C)において、変異を誘導することが知られている(非特許文献11)(図1(a))。galK遺伝子において、ストップコドンが導入されるように標的の配列(図3)を選択したところ、2-DOGに対してほぼ100%の生存率を誘導し、このことは非常に効率的な変異誘発を示唆した(図4(a))。2-DOGを含まない培地で培養した細胞についてシーケンシング分析を行った場合、8個のコロニーのうち6個が予想通り変異していた。予想通り-17位及び/又は20位で、CからTへの置換が観察された。
変異効率と位置を総合的に分析するために、galK遺伝子の18個の標的配列を用いてディープシーケンシング分析を行った(図6、図7)。7個の標的は高い効率(61.7~95.1%)の変異誘発を示したが、一方で5個は低い(1.4~9.2%)変異誘発を示した。最も効果的な変異位置はPAMの上流17-20塩基であり、これは高等生物における以前の研究と一致した。より長い標的配列を有するsgRNAがgalK_8及びgalK_13でより高い効率を示し、galK_9及びgalK_11でより低い効率を示したことから理解できるように(図6、左側のバー)、変異頻度も標的配列の長さに依存して変化した。
多重編集のために、sgRNA発現ユニットのタンデムなリピートを、改変用プラスミドとは別のプラスミド上に組み立てた。galK遺伝子の3箇所の部位(galK_10、galK_11及びgalK_13)を標的とするプラスミドを構築し、dCas、dCas-CDA、dCas-CDA-LVA又はdCas-CDA1-UGI-LVAを発現する改変用ベクターを有する細胞に同時導入した。まず、リファンピシン耐性変異の発生を分析することにより、非特異的な変異誘発効果を評価した(図9)。dCas-CDAはバックグラウンドの変異頻度より約10倍の増加を示したが、dCas-CDA-UGI-LVAは、dCas-CDAの変異頻度よりさらに10倍の増加を示した。dCas-CDA及びdCas-CDA-LVAでは、同時に三重変異体を得るのに十分な効率ではなかったが、1箇所の変異はどちらでも生じており、少なくとも標的の変異率は、LVAの有無によって有意な差は認められなかった。従って、LVAを付加することで、変異効率を維持しつつ非特異的な変異誘発を抑制することができることが示された。また、dCas-CDA-UGI-LVAでは、各標的に対して100%(8/8)を生じたそれぞれの単一標的の結果と比較した場合には、変異頻度は低かったものの(図9(c)及び(d))、dCas-CDA-UGI-LVAでは、解析した8クローンのうち5クローンで3重変異を誘発することに成功した(図9(b)及び(d))。従って、UGIとLVAを組み合わせることで、高い変異効率を達成しつつ、非特異的な変異誘発を抑制することができることが示された。
複数のコピー因子は、相当量のゲノム配列を占める。組換え、又はゲノム切断を含む他の方法とは異なり、Target-AIDはゲノムの不安定性を誘導することなく、同じsgRNA配列を用いて複数の遺伝子座を一度に編集し得る。このコンセプトを証明するため、大腸菌ゲノム中の4個の主要な転移因子(TE:IS1,2,3及び5)を、4個のsgRNAを用いて同時に標的化した。IS1,2,3及び5のための、それぞれ10個、12個、5個及び14個の遺伝子座は、各遺伝子座についてユニークなPCRプライマーにより特異的に増幅することができた。sgRNAは、各TEのトランスポザーゼ遺伝子の共通配列を含むように設計し、終止コドンを導入した(図11)。大腸菌Top10細胞を、dCas-CDA-UGI-LVA及び4個の標的sgRNAをそれぞれ発現する2個のプラスミドで形質転換した。ISを編集した細胞の分離と検証の手順を図12に示し、以下に詳細に説明する。二重形質転換及び選択の後、コロニーをPCRで増幅し、まずIS5-1、IS5-2、IS5-11、IS5-12の部位でシーケンシングした。IS5標的は効率が悪いことが判明した。分析された4つのコロニーのうち、1つは3箇所の変異部位及び1つの異種遺伝子型の部位を含んでいた(IS5-1)。次いで、細胞を液体培地に懸濁し、プレート上に広げてコロニーを再度単離した。8個のコロニーのうち3個はIS5-1に変異を含み、そのうちの2個について、残り24個のIS遺伝子座の配列をさらにシーケンシングしたところ、全ての変異した部位を含むが、1つの不完全な、異種遺伝子型の部位(IS5-5)を含むことが示された。次いで、細胞を懸濁させて広げ、IS5-5に変異を含む6個の再単離したクローンのうちの4個のクローンを得た。そのクローンの1個をIS5部位でシーケンシングしたところ、1個の異種遺伝子型の部位(IS5-2)を含むことが判明した。8個のクローンを再度単離し、6個のクローンがIS5-2での変異を含んでいた。2個のクローンを非選択培地上に広げて、プラスミドを失った細胞を得た。次いで、細胞をゲノム抽出して、シーケンシングし、全てのIS部位で変異を確認し(図11)、さらにゲノム全体のオフターゲット効果を評価するために、全ゲノムシーケンシングを行った。PAMに近接した1~8塩基で一致した配列を含む参照ゲノムからの34箇所の潜在的なオフターゲット部位のうち、2箇所の部位が変異していることが判明した(表5)。
Casエフェクタータンパク質としてLbCpf1(配列番号326及び327)を、タンパク質分解タグとしてYAASV及びYALAAをコードする酵母発現用ベクター(ベクター3685:Cpf1-NLS-3xFlag-YAASV(配列番号328)、ベクター3687:Cpf1-NLS-3xFlag-YALAA(配列番号329))、及びタンパク質分解タグをコードする核酸を有さないコントロールベクター(ベクター3687:Cpf1-NLS-3xFlag(配列番号330))を、pRS315ベクターをベースとして作成した。これらのベクターを用いて、大腸菌の形質転換効率を検証した。図13に、各ベクターの概略図を示す。下記表6に示す通り、各ベクターを含むDNA溶液を2ng/μlに調整し、20μlの大腸菌Top10コンピテントセルに、1μl(2ng)のDNA溶液を加えて形質転換した。その後、200μlのSOCを加えて37℃1時間回復培養し、氷上で5分おいて増殖停止した後に、1μlの 50mg/ml Ampを加えた。培養液の一部(1μl及び10μl)をTEで希釈してLB+Ampプレートに塗布し、37℃で一晩培養してコロニー数を計測した。結果を表6に示す。
Claims (18)
- 二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、(i)疎水性アミノ酸3残基をC末端に含むペプチド、又は(ii)該アミノ酸残基の少なくとも一部がセリンに置換されたアミノ酸3残基をC末端に含むペプチドからなるタンパク質分解タグとが結合した、複合体であって、前記アミノ酸3残基が、ロイシン-バリン-アラニン、ロイシン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-バリン又はアラニン-セリン-バリンである、複合体。
- 前記複合体が、核酸改変酵素がさらに結合した複合体であって、標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換し又は欠失させ、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する、請求項1に記載の複合体。
- 前記核酸配列認識モジュールが、Casの2つのDNA切断能のうちの一方のみ、又は両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項1または2に記載の複合体。
- 前記複合体が、CRISPR-Casシステムと、タンパク質分解タグとが結合した複合体である、請求項1または2に記載の複合体。
- 前記核酸改変酵素が核酸塩基変換酵素又はDNAグリコシラーゼである、請求項2または3に記載の複合体。
- 前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項5に記載の複合体。
- 塩基除去修復のインヒビターがさらに結合した、請求項5又は6に記載の複合体。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の複合体をコードする核酸。
- 細菌の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する、又は該部位の近傍で二本鎖DNAにコードされる遺伝子の発現を調節する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、(i)疎水性アミノ酸3残基をC末端に含むペプチド、又は(ii)該アミノ酸残基の少なくとも一部がセリンに置換されたアミノ酸3残基をC末端に含むペプチドからなるタンパク質分解タグとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させる工程を含み、前記アミノ酸3残基が、ロイシン-バリン-アラニン、ロイシン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-バリン又はアラニン-セリン-バリンである、方法。
- 前記複合体が、核酸改変酵素がさらに結合した複合体であって、該標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸配列認識モジュールが、Casの2つのDNA切断能のうちの一方のみ、又は両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項9または10に記載の方法。
- 前記複合体が、CRISPR-Casシステムと、タンパク質分解タグとが結合した複合体である、請求項9または10に記載の方法。
- 異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、2種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、請求項9~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、請求項13に記載の方法。
- 前記核酸改変酵素が核酸塩基変換酵素又はDNAグリコシラーゼである、請求項10、並びに請求項11~13が請求項10に従属する場合の請求項11~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項15に記載の方法。
- 該複合体が、塩基除去修復のインヒビターがさらに結合したものである、請求項15又は16に記載の方法。
- 二本鎖DNAと複合体との接触が、該二本鎖DNAを有する細菌への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、請求項9~17のいずれか1項に記載の方法。
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