JP2007020583A - 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング - Google Patents

Abstract

【課題】インビトロおよびインビボにおいて、ＤＮＡ、ベクターおよび方法
を使用する方法を用いて、所望の特性および／あるいはＤＮＡセグメントを有す
るキメラＤＮＡ分子を提供することにある。
【解決手段】第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含むベ
クタードナーＤＮＡ分子であって、該第１のＤＮＡセグメントまたは該第２のＤ
ＮＡセグメントは少なくとも１つの選択マーカーを含み、ここで該第１のセグメ
ントおよび該第２のセグメントは、（ｉ） 環状ベクタードナーにおいては、第
１の組換え部位および第２の組換え部位により、または（ｉｉ） 直鎖状ベクタ
ードナーにおいては、少なくとも第１の組換え部位により、のいずれかで分離さ
れ、ここで隣接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換えない
、ベクタードナーＤＮＡ分子を提供することによって、課題を解決する。
【選択図】なし

Description

本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。操作された組換え部位を有するＤＮＡ
およびベクターが、組換えタンパク質を用いるＤＮＡセグメントの効率的かつ特
異的な組換えを可能にする組換えクローニング方法における使用のために提供さ
れる。このＤＮＡ、ベクターおよび方法は、インビトロまたはインビボにおける
、ＤＮＡのサブクローニングのような種々のＤＮＡ交換のために有用である。

（関連技術）
部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、いくつかのウイル
スおよび細菌において存在する酵素であり、そしてエンドヌクレアーゼ特性およ
びリガーゼ特性の両方を有すると特徴付けられている。これらのリコンビナーゼ
は（いくつかの場合においては会合タンパク質とともに）、ＤＮＡ中の特異的塩
基の配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを交
換する。リコンビナーゼおよび会合タンパク質は、集合的に「組換えタンパク質
」といわれる（例えば、Ｌａｎｄｙ， Ａ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏ
ｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７ （１９９３）を
参照のこと）。

種々の生物由来の多数の組換え系が記載されている。例えば、Ｈｏｅｓｓら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（６）：２２８７ （１
９８６）； Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１（１
）：３９１ （１９８６）； Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
． １７４（２３）：７４９５ （１９９２）； Ｑｉａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ． ２６７（１１）：７７９４ （１９９２）； Ａｒａｋｉら、
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２５（１）：２５ （１９９２）； Ｍａｅｓ
ｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ （１９９１） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ
． ２３０：１７０−１７６。

これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒ
ｇｏｓら、ＥＭＢＯ Ｊ． ５：４３３−４４０ （１９８６））。おそらく、
これらの中で最も十分に研究されたのは、バクテリオファージλ由来のインテグ
ラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ． Ａ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ
ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． ３：６９９−７０７ （１９
９３））、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（Ｈｏｅｓｓおよ
びＡｂｒｅｍｓｋｉ （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌ
ｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ； ９０−１０９頁）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌ
ｌ ２９：２２７−２３４ （１９８２））である。

これらの組換え系は特定の生物について特徴付けられたが、関連技術は、イン
ビボにおける組換えについて、組換え部位により隣接される組換えＤＮＡを用い
て教示されたのみである。

Ｂａｃｋｍａｎ（米国特許第４，６７３，６４０号）は、野生型組換え部位ａ
ｔｔＢおよびａｔｔＰを用いる酵素的部位特異的組換えによりＤＮＡセグメント
を産生するタンパク質を組み換えるためのλリコンビナーゼのインビボにおける
使用を開示する。

ＨａｓａｎおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ（Ｇｅｎｅ ５６：１４５−１５１ （
１９８７））は、プロモーターに隣接する野生型ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位と
の間の分子内組換えのためのインビボにおけるλＩｎｔリコンビナーゼの使用を
開示する。これらの部位の方向は互いに関して逆であるので、これは目的の遺伝
子に対して不可逆的なプロモーター領域のフリッピング（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）を
引き起こす。

Ｐａｌａｚｚｏｌｏら、Ｇｅｎｅ ８８：２５−３６ （１９９０）は、クロ
ーン化されるＤＮＡ配列の外側および野生型ｌｏｘＰ部位間に配置された制限部
位を含有するバクテリオファージλアームを有するファージλベクターを開示す
る。これらのファージベクターでの、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＥ． ｃ
ｏｌｉ細胞の感染は、ｌｏｘＰ部位間での組換えおよびプラスミドレプリコン（
クローン化ｃＤＮＡを含む）のインビボ切り出しを生じる。

Ｐoｓｆａｉら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２３９２−２３
９８ （１９９４））は、ゲノムＤＮＡ中へ、２つの野生型ＦＲＴ認識配列によ
り隣接される選択マーカーを有する部分的発現ベクターを挿入するための方法を
開示する。細胞中に存在するＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼが、ベクターをゲ
ノム中に所定の部位において組み込むために使用される。レプリコンが機能的で
ある条件下において、このクローン化ゲノムＤＮＡは増幅され得る。

Ｂｅｂｅｅら（米国特許第５，４３４，０６６号）は、２つのｌｏｘＰ部位を
含むＤＮＡのためのＣｒｅのような部位特異的リコンビナーゼの使用が部位間の
インビボ組換えのために使用されることを開示する。

Ｂｏｙｄ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：８１７−８２１ （
１９９３））は、Ｅ． ｃｏｌｉ宿主細胞中に存在するＣｒｅ部位特異的リコン
ビナーゼにより作用される野生型ｌｏｘＰ部位を含有する脱リン酸化されたベク
ターの分子間連結を促進する条件を用いて平滑末端ＤＮＡのクローニングを容易
にする方法を開示する。

Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＰＣＴ第９３／１９１７２号およびＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１（９）：２２６５ （１９９３））は、特定の抗
体のＬ鎖およびＨ鎖がｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ ５１１部位の間で異なるファー
ジベクター中にクローン化され、そしてそれを使用して新たなＥ． ｃｏｌｉ細
胞を形質転換するインビボ方法を開示する。Ｃｒｅ（宿主細胞において２つの親
分子（１つはプラスミド、１つはファージ）に作用する）は４つの産物を平衡し
て産生した：２つの異なるコインテグレート（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）（ｌｏ
ｘＰ部位またはｌｏｘＰ ５１１部位のいずれかにおける組換えにより産生され
る）、および２つの娘分子（その１つが所望された産物であった）。

他の関連技術とは対照的に、ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｂｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３３：１２７４６−１２７５１ （１９９４））は、各々が野生型
およびスペーサー変異されたＦＲＴ組換え部位により隣接される、規定された染
色体位置において発現カセットを交換するためのインビボ方法を開示する。二重
交換交叉（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）が部位
特異的組換えのためにこのＦＬＰ／ＦＲＴ系を用いることにより培養哺乳動物細
胞において媒介された。

トランスポゼース。酵素トランスポゼースのファミリーもまた、レプリコン間
で遺伝子情報を移動するために使用されている。トランスポゾンは構造的に可変
性であるが（単純（ｓｉｍｐｌｅ）または複合（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と記載され
る）、代表的には逆方向に構成されるＤＮＡ配列により隣接されるリコンビナー
ゼ遺伝子をコードする。トランスポゾンの組み込みは、ランダムであり得るかま
たは高度に特異的であり得る。Ｔｎ７（これは高度に部位特異的である）のよう
な代表物が、レプリコン間のＤＮＡセグメントのインビボにおける移動に適用さ
れた（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｊ． Ｖｉｏｌ． ６７：４５６６−４５７９ （１
９９３））。

ＤｅｖｉｎｅおよびＢｏｅｋｅ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：
３７６５−３７７２ （１９９４）は、ＤＮＡセグメントのインビトロにおける
レシピエントＤＮＡ分子中への挿入のための人工トランスポゾンの構築を開示す
る。この系は、酵母ＴＹ１ウイルス様粒子のインテグラーゼを利用する。目的の
ＤＮＡセグメントは、標準的な方法を用いて、トランスポゾン様エレメントＴＹ
１の末端間にクローン化される。ＴＹ１インテグラーゼの存在下において、生じ
るエレメントは第２の標的ＤＮＡ分子中へランダムに組み込まれる。

ＤＮＡクローニング。ＤＮＡセグメントのクローニングは、現在、多数の研究
所における日常的な慣例として、そして多数の遺伝子解析における事前に必要な
工程として生じている。しかし、これらのクローニングの目的は多様であり、２
つの一般的な目的は以下にように考えられ得る：（１） 大きなＤＮＡまたはＲ
ＮＡセグメント（染色体、ＹＡＣ、ＰＣＲフラグメント、ｍＲＮＡなど）からの
ＤＮＡの最初のクローニング（ｐＵＣ、ｐＧｅｍ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのよ
うな比較的少ない公知のベクターにおいて実施される）、および（２） これら
のＤＮＡセグメントの特殊化されたベクター中への機能的分析のためのサブクロ
ーニング。多量の時間および努力が、ＤＮＡセグメントの最初のクローニングに
おいて、およびＤＮＡセグメントの最初のクローニングベクターからより特殊化
されたベクターへの移動においての両方で費やされている。この移動なサブクロ
ーニングと呼ばれる。

クローニングのための基本的な方法は長年知られており、そしてその時間でほ
とんど変化していない。代表的なクローニングプロトコルは以下とおりである：
（１） 目的のＤＮＡを１つまたは２つの制限酵素で消化し；
（２） 既知の場合目的のＤＮＡセグメントをゲル精製し；
（３） 適切な制限酵素での切断、アルカリホスファターゼでの処理、ゲル精
製など（適切なように）によりベクターを調製し；
（４） 未切断および自己連結されたベクターのバックグラウンドを概算する
ための適切なコントロールを有して、ＤＮＡセグメントをベクターに連結し；
（５） 生じるベクターをＥ． ｃｏｌｉ宿主細胞中に導入し；
（６） 選択されたコロニーをひろい、そして小培養物を一晩増殖させ；
（７） ＤＮＡミニプレップを作製し；そして
（８） アガロースゲルで（しばしば診断的制限酵素消化の後）またはＰＣＲ
により、単離されたプラスミドを分析する。

ＤＮＡセグメントをサブクローニングするために使用される特殊化されたベク
ターは、機能的に多様である。これらは、以下を包含するがこれらに限定されな
い：種々の生物において遺伝子を発現させるための；遺伝子発現を調節するため
の；タンパク質精製を補助するためのまたは細胞におけるタンパク質の追跡を可
能にするためのタグを提供するための；クローン化されたＤＮＡセグメントを改
変するための（例えば、欠失の生成）；プローブの合成のための（例えば、リボ
プローブ）；ＤＮＡ配列決定のためのテンプレートの調製のための；タンパク質
コード領域の同定のための；種々のタンパク質コード領域の融合のための；多量
の目的のＤＮＡを提供するための、などのベクター。特定の研究が、目的のＤＮ
Ａセグメントをいくつかの異なる特殊化されたベクター中へサブクローニングす
る工程を包含することは一般的である。

当該分野において公知であるように、単純なサブクローニングは１日で実施さ
れ得る（例えば、ＤＮＡセグメントは大きくなく、そして制限部位がサブクロー
ニングベクターの制限部位と適合性である）。しかし、他の多くのサブクローニ
ング（特に、未知の配列、長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な
配置、高いバックグラウンド、不純な酵素などを含むサブクローニング）は、数
週間かかり得る。従って、ＤＮＡフラグメントのサブクローニングは、しばしば
、可能な限り少ない回数で実施されるべき面倒な仕事であるとみなされる。

ＤＮＡセグメントのクローニングを容易にするいくつかの方法が、例えば以下
の参考文献におけるように記載されている。

Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ １６：１９１ （１９８１）は、酵
母ＤＮＡのフラグメントのサブクローニングのためのベクターのファミリーを開
示する。このベクターは、カナマイシン耐性をコードする。より長い酵母ＤＮＡ
セグメントのクローンが部分的に消化され得、そしてサブクローニングベクター
中に連結され得る。もとのクローニングベクターがアンピシリンに対する耐性を
有する場合には、形質転換の前に精製は必要ではない。なぜなら、選択はカナマ
イシンについてであるからである。

Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ ４１：１２５ （１
９８６）は、ストレプトマイシン感受性遺伝子内のユニークなクローニング部位
を有するサブクローニングベクターを開示し；ストレプトマイシン耐性宿主にお
いて、優勢感受性遺伝子における挿入または欠失を有するプラスミドのみが、ス
トレプトマイシン選択を生き残る。

従って、制限酵素およびリガーゼを用いる伝統的なサブクローニング方法は、
時間がかかり、そして比較的信頼できない。かなりの労働が費やされ、そして２
日以上後に所望のサブクローンが候補プラスミドの中で見出され得なければ、次
いで、全体のプロセスが計画される別の条件で繰り返されなければならない。部
位特異的リコンビナーゼがＤＮＡをインビボにおいて組換えるために使用された
が、インビトロにおけるこのような酵素の成功する使用は、いくつかの問題を抱
えると予想された。例えば、部位特異性および効率は、インビトロにおいて異な
ると予想され；トポロジー的に連結された産物が予想され；そしてＤＮＡ基質お
よび組換えタンパク質のトポロジーがインビトロにおいて顕著に異なると予想さ
れた（例えば、Ａｄａｍｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２６：６６１−
７３ （１９９２）を参照のこと）。インビボにおいて長時間続き得る反応は、
酵素が不活性になる前にインビトロにおいて顕著に短い時間で生じると予想され
た。複数のＤＮＡ組換え産物が使用される生物学的宿主において予想され、サブ
クローニングの不満足な信頼性、特異性または効率を生じた。インビトロ組換え
反応は、所望のレベルの産物を生じるに十分に効率的であるとは予想されなかっ
た。

従って、制限酵素およびリガーゼの公知の使用を超えて利点を提供する別のサ
ブクローニング系を提供する長い間感じられていた必要が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質および操作
された組換え部位を用いる、キメラ核酸を得るための、核酸、ベクターおよび方
法を提供する。これらの方法は、関連する背景技術において開示または示唆され
る方法より、高度に特異的であり、迅速でありかつ労働集約的でない。本発明の
改善された特異性、スピードおよび収率は、任意の関連する目的のために有用な
ＤＮＡまたはＲＮＡのサブクローニング、調節または交換を容易にする。このよ
うな目的は、ＤＮＡセグメントのインビトロにおける組換えおよび転写される、
複製される、単離されるまたはゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡの、インビトロまた
はインビボにおける挿入または改変を包含する。

本発明は、少なくとも１つの操作された組換え部位および少なくとも１つの組
換えタンパク質を用いて、所望の特性（単数または複数）および／あるいはＤＮ
Ａセグメント（単数または複数）を有するキメラＤＮＡ分子を提供する、ＤＮＡ
のセグメントを移動または交換するための、核酸、ベクターおよび方法に関する
。一般に、１つ以上の親ＤＮＡ分子が組換えられて、１つ以上の娘分子を与え、
その少なくとも１つが所望の産物ＤＮＡセグメントまたはベクターである。従っ
て、本発明は、交換をもたらすための、ならびに／または１つ以上の所望の産物
を選択するための、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ベクターおよび方法に関する。

本発明の１つの実施態様は、キメラＤＮＡの作製方法に関し、この方法は以下
の工程を包含する
（ａ） インビトロまたはインビボにおいて
（ｉ） 第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望の
ＤＮＡセグメントを含む、インサートドナーＤＮＡ分子、ここで第１および第２
の組換え部位は互いに組換えない；
（ｉｉ） 第３の組換え部位および第４の組換え部位を含むベクタードナー
ＤＮＡ分子、ここで、第３および第４の組換え部位は互いに組換えない；
（ｉｉｉ） 第１および第３の組換え部位ならびに／または第２および第４
の組換え部位を組換え得る１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせ；
それにより、組換えを生じさせ、その結果少なくとも１つのコインテグレート
ＤＮＡ分子、上記所望のＤＮＡセグメントを含む少なくとも１つの所望の産物Ｄ
ＮＡ分子、および任意に副産物ＤＮＡ分子を産生する工程；および、次いで、任
意に、
（ｂ） 産物または副産物ＤＮＡ分子について選択する工程。

本発明の別の実施態様は、少なくとも１つの容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）をそ
の中に受けるまたは保持するように区画化されたキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）ま
たは入れ物（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）を含むキットに関し、ここで、第１の容器
は、本明細書に記載のように、クローニング部位または選択マーカーに隣接する
少なくとも２つの組換え部位を有するベクターを含むＤＮＡ分子を含む。キット
は任意に、以下を含む：
（ｉ） その一方もしくは両方が１つ以上の操作された組換え部位により隣
接される、サブクローニングベクターおよび／または選択マーカーを含むベクタ
ードナープラスミドを含む第２の容器；ならびに／あるいは
（ｉｉ） 少なくとも１つの上記組換え部位を認識し、そして組換え得る、
少なくとも１つの組換えタンパク質を含む第３の容器。

他の実施態様は、本発明の方法において有用なＤＮＡおよびベクターを包含す
る。特に、ベクタードナー分子が１つの実施態様において提供され、ここでベク
タードナー内のＤＮＡセグメントが、（ｉ） 環状ベクタードナーにおいて、少
なくとも２つの組換え部位において、または（ｉｉ） 直鎖状ベクタードナーに
おいて、少なくとも１つの組換え部位において、のいずれかにより分離され、こ
こで、組換え部位は、好ましくは、組換えの特異性または効率を増強するように
操作される。

１つのベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤ
ＮＡセグメントを含み、第１または第２のセグメントは選択マーカーを含む。第
２のベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡ
セグメントを含み、第１または第２のＤＮＡセグメントは、毒性遺伝子を含む。
第３のベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮ
Ａセグメントを含み、第１または第２のＤＮＡセグメントは、少なくとも１つの
選択マーカーの不活性フラグメントを含み、ここで選択マーカーの不活性フラグ
メントは、第１または第２の組換え部位を少なくとも１つの選択マーカーの別の
不活性フラグメントをわたって組み換えられる場合に機能的な選択マーカーを再
構成し得る。

本発明の組換えクローニング方法は、以前のインビボ方法を超えていくつかの
利点を有する。組換え産物の単一の分子が生物学的宿主中へ導入され得、他のＤ
ＮＡ分子（例えば、出発分子、中間体、および副産物）の非存在下における所望
の産物ＤＮＡの増殖が、より容易に実現される。反応条件は、酵素活性を最適化
するように自由に調整され得る。ＤＮＡ分子は、所望の生物学的宿主に非適合性
であり得（例えば、ＹＡＣ、ゲノムＤＮＡなど）、使用され得る。多様な供給源
由来の組換えタンパク質が、一緒にまたは逐次的に用いられ得る。

他の実施態様は、当該分野において公知であることと組み合わせて本明細書に
含まれる教示から当業者に明らかである。

従って、本発明は以下を提供する。
１．第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含むベクタードナ
ーＤＮＡ分子であって、該第１のＤＮＡセグメントまたは該第２のＤＮＡセグメ
ントは少なくとも１つの選択マーカーを含み、ここで該第１のセグメントおよび
該第２のセグメントは、（ｉ） 環状ベクタードナーにおいては、第１の組換え
部位および第２の組換え部位により、または（ｉｉ） 直鎖状ベクタードナーに
おいては、少なくとも第１の組換え部位により、のいずれかで分離され、ここで
隣接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換えない、ベクター
ドナーＤＮＡ分子。
２．前記選択マーカーが以下：
（ｉ） そうでなければ毒性の化合物に対する耐性を提供する産物をコード
するＤＮＡセグメント；
（ｉｉ） そうでなければレシピエント細胞において欠如している産物をコ
ードするＤＮＡセグメント；
（ｉｉｉ） 遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤＮＡセグメン
ト；
（ｉｖ） 容易に同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント；
（ｖ） 細胞の生存および／または機能に有害である産物をコードするＤＮ
Ａセグメント；
（ｖｉ） 該（ｉ）〜（ｖ）のＤＮＡセグメントのいずれかの活性を阻害す
るＤＮＡセグメント；
（ｖｉｉ） 基質を修飾する産物に結合するＤＮＡセグメント；
（ｖｉｉｉ） 所望の分子の単離を提供するＤＮＡセグメント；
（ｉｘ） そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌクレオチド配列をコ
ードするＤＮＡセグメント；および
（ｘ） 存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する感
受性を与えるＤＮＡセグメント、
からなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡセグメントである、項目１に
記載のベクタードナーＤＮＡ分子。
３．前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マー
カー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド；制限エ
ンドヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク
質結合部位；およびＰＣＲプライマーに相補的な配列、からなる群より選択され
る少なくとも１つである、項目２に記載のベクタードナーＤＮＡ分子。
４．前記選択マーカーが少なくとも１つの選択マーカーの不活性フラグメントを
含み、ここで該不活性フラグメントが前記第１の組換え部位または前記第２の組
換え部位と、別の選択マーカーの不活性フラグメントを含むさらなるＤＮＡセグ
メントとにわたって組換えられる場合に、機能性の選択マーカーを再構成し得る
、項目１に記載のベクタードナーＤＮＡ分子。
５．第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のＤＮＡセ
グメントを含むインサートドナーＤＮＡ分子であって、該第１の組換え部位およ
び該第２の組換え部位は操作され、そして互いに組換えない、インサートドナー
ＤＮＡ分子。
６．前記所望のＤＮＡセグメントが、クローニング部位、制限部位、プロモータ
ー、オペロン、複製起点、機能性ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＰＣＲフラグメ
ント、タンパク質またはタンパク質フラグメント、からなる群より選択される少
なくとも１つをコードする、項目５に記載のインサートドナーＤＮＡ分子。
７．１つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器を
含むキットであって、ここで第１の区画は第１のＤＮＡセグメントおよび第２の
ＤＮＡセグメントを含むベクタードナーＤＮＡ分子を含み、該第１のＤＮＡセグ
メントまたは該第２のＤＮＡセグメントは少なくとも１つの選択マーカーを含み
、ここで該第１のセグメントおよび該第２のセグメントは、（ｉ） 環状ベクタ
ードナードナーにおいては、第１の組換え部位および第２の組換え部位、または
（ｉｉ） 直鎖状ベクタードナーにおいては、第１の組換え部位、のいずれかに
より隣接され、ここで隣接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに
組換えない、キット。
８．第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のＤＮＡセ
グメントを含むインサートドナーＤＮＡ分子を含む第２の区画をさらに含み、こ
こで該第１の組換え部位および該第２の組換え部位が操作され、そして互いに組
換えない、項目７に記載のキット。
９．少なくとも１つの前記組換え部位を含むＤＮＡセグメントを組換え得る少な
くとも１つの組換えタンパク質を含むさらなる区画をさらに含む、項目７に記載
のキット。
１０．選択マーカーまたは所望のＤＮＡセグメントに隣接する少なくとも２つの
組換え部位を有する少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含む核酸分子であって
、ここで少なくとも１つの該組換え部位がコインテグレートＤＮＡまたは産物Ｄ
ＮＡの形成においてインビトロで組換えを増強する少なくとも１つの操作された
変異を有するコア領域を含む、核酸分子。
１１．前記変異が少なくとも１つの前記組換えの増強を与え、該増強が実質的に
、（ｉ） 切り出し組換えの優先；（ｉｉ） 組み込み組換えの優先；（ｉｉｉ
） 宿主因子の要求の軽減；（ｉｖ） 前記コインテグレートＤＮＡまたは産物
ＤＮＡ形成の効率の増加；（ｖ） 前記コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮ
Ａ形成の特異性の増加からなる群より選択され；そして該産物ＤＮＡに対する所
望の特性に貢献する、項目１０に記載の核酸分子。
１２．前記組換え部位が、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲからな
る群より選択される少なくとも１つの組換え部位に由来する、項目１０に記載の
核酸分子。
１３．前記ａｔｔ部位が、ａｔｔ１、ａｔｔ２およびａｔｔ３からなる群より選
択される、項目１２に記載の核酸分子。
１４．前記コア領域が以下：

からなる群より選択されるＤＮＡ配列、および対応するまたは相補的なＤＮＡま
たはＲＮＡ配列、を含み、ここでＲ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝Ｃ
またはＴ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ
＝ＣまたはＧ；およびＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、項目１０に記載の核
酸分子。
１５．前記コア領域が以下：

からなる群より選択されるＤＮＡ配列、および対応するまたは相補的なＤＮＡま
たはＲＮＡ配列、を含む、項目１４に記載の核酸分子。
１６．核酸分子を作製するための方法であって、配列番号１〜１６の少なくとも
１つに少なくとも９０％の相同性を有する少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む少
なくとも１つの操作された組換え部位を有する核酸分子を提供する工程を包含す
る、方法。
１７．項目１６に記載の方法により提供される核酸分子。
１８．項目１０に記載の核酸分子を含む組成物。
１９．少なくとも１つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化
された容器を含むキットであって、ここで第１の区画が項目１８に記載の組成物
を含む、キット。
２０．前記組換え部位を認識する少なくとも１つの組換えタンパク質を有する第
２の区画をさらに含む、項目１９に記載のキット。
２１．項目２２に記載の方法に有用である、単離された形態の少なくとも１つの
組換えタンパク質をその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器
を含むキット。
２２．コインテグレートＤＮＡ分子を作製する方法であって、以下の工程：
インビトロにおいて
（ｉ） 第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のＤ
ＮＡセグメントを含むインサートドナーＤＮＡ分子、ここで該第１の組換え部位
および該第２の組換え部位は互いに組換えない；
（ｉｉ） 第３の組換え部位および第４の組換え部位を含むベクタードナーＤ
ＮＡ分子、ここで、該第３の組換え部位および該第４の組換え部位は互いに組換
えない；および
（ｉｉｉ） 該第１の組換え部位および該第３の組換え部位または該第２の組
換え部位および該第４の組換え部位を組換え得る少なくとも１つの部位特異的組
換えタンパク質；
を組み合わせ、それにより、組換えを生じさせ、その結果該第１の組換え部位お
よび該第３の組換え部位または該第２の組換え部位および該第４の組換え部位を
含むコインテグレートＤＮＡ分子を産生する工程、
を包含する、方法。
２３．産物ＤＮＡ分子が前記コインテグレートＤＮＡから、（ｉ） 前記第１の
組換え部位および前記第３の組換え部位、または（ｉｉ） 前記第２の組換え部
位および前記第４の組換え部位の少なくとも１つを組換えることにより産生され
、該産物ＤＮＡが前記所望のＤＮＡセグメントを含む、項目２２に記載の方法。
２４．前記方法がまた副産物ＤＮＡ分子も産生する、項目２３に記載の方法。
２５．前記産物ＤＮＡ分子について選択する工程をさらに含む、項目２３に記載
の方法。
２６．前記ベクタードナーＤＮＡ分子が前記第３の組換え部位および前記第４の
組換え部位により隣接されるベクターセグメントを含む、項目２２に記載の方法
。
２７．前記ベクタードナーＤＮＡ分子がさらに（ａ）毒性遺伝子および（ｂ）選
択マーカーを含み、ここで該毒性遺伝子および該選択マーカーが異なるＤＮＡセ
グメント上に存在し、該ＤＮＡセグメントが（ｉ） 環状ＤＮＡ分子においては
、２つの組換え部位、または（ｉｉ） 直鎖状ＤＮＡ分子においては、１つの組
換え部位、のいずれかにより分離されている、項目２２に記載の方法。
２８．前記ベクタードナーＤＮＡ分子がさらに（ａ） 抑制カセット、および（
ｂ） 該抑制カセットのリプレッサーにより抑制される選択マーカーを含み、こ
こで該選択マーカーおよび該抑制カセットが異なるＤＮＡセグメント上に存在し
、該ＤＮＡセグメントが（ｉ） 環状ＤＮＡ分子においては、２つの組換え部位
、または（ｉｉ） 直鎖状ＤＮＡ分子においては、１つの組換え部位、のいずれ
かにより分離されている、項目２２に記載の方法。
２９．前記インサートドナーＤＮＡ分子および前記ベクタードナーＤＮＡ分子の
少なくとも１つが環状ＤＮＡ分子である、項目２２に記載の方法。
３０．前記インサートドナーＤＮＡ分子および前記ベクタードナーＤＮＡ分子の
少なくとも１つが直鎖状ＤＮＡ分子である、項目２２に記載の方法。
３１．前記選択する工程がインビトロまたはインビボにおいて実施される、項目
２２に記載の方法。
３２．前記組換えタンパク質が少なくとも第１の組換えタンパク質および第２の
組換えタンパク質を含み、該第２の組換えタンパク質が該第１の組換えタンパク
質と異なる、項目２２に記載の方法。
３３．前記組換えタンパク質がＩｎｔである、項目２２に記載の方法。
３４．前記少なくとも１つの組換えタンパク質が（ｉ） ＩｎｔおよびＩＨＦ、
ならびに（ｉｉ） Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦから選択される、項目２２に
記載の方法。

サブクローニング反応が組換えクローニングを用いて提供され得るこいうこと
が、本発明において予想外に見出された。本発明による組換えクローニングは、
操作された組換え部位および組換えタンパク質を用いて、ＤＮＡ分子のセグメン
トの移動または交換のために、インビトロおよびインビボにおいて、ＤＮＡ、ベ
クターおよび方法を使用する。これらの方法は、所望の特性（単数または複数）
および／あるいはＤＮＡセグメント（単数または複数）を有するキメラＤＮＡ分
子を提供する。

従って、本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質お
よび操作された組換え部位を使用して、キメラ核酸を得るための、核酸、ベクタ
ーおよび方法を提供する。これらの方法は、関連背景技術において開示または示
唆された方法より、高度に特異的であり、迅速であり、そして労働集約的でない
。本発明の改善された特異性、スピードおよび収率は、任意の関連する目的に有
用である、ＤＮＡまたはＲＮＡのサブクローニング、調節または交換を容易にす
る。このような目的としては、ＤＮＡセグメントのインビトロ組換え、および転
写される、複製される、単離されるまたはゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡのインビ
トロまたはインビボにおける挿入または改変が挙げられる。

（定義）
以下の記載において、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語が多く
利用される。明細書および請求の範囲（こような用語に与えられるべき範囲を含
む）の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。

副産物：これは、サブクローン化されることが所望されるＤＮＡを欠く、娘分
子（組換えクローニングプロセスの間に第２の組換え事象の後に産生される新た
なクローン）である。

コインテグレート：これは、親（出発）ＤＮＡ分子の両方を含む、本発明の少
なくとも１つの組換え中間体ＤＮＡ分子である。これは通常環状である。いくつ
かの実施態様においては、これは直鎖状であり得る。

宿主：これは、組換えクローニング産物のレシピエントであり得る、任意の原
核生物または真核生物であり得る。本明細書において用いられる用語「宿主」は
、遺伝子操作され得る原核生物または真核生物を包含する。このような宿主の例
については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）を参照のこと。

インサート：これは、本発明の方法により操作しようとする、所望のＤＮＡセ
グメント（図１のセグメントＡ）である。インサートは、１つ以上の遺伝子を有
し得る。

インサートドナー：これは、インサートを有する、本発明の２つの親ＤＮＡ分
子のうちの１つである。インサートドナーＤＮＡ分子は、両方の末端において組
換えシグナルに隣接されるインサートを含む。インサートドナーは直鎖状または
環状であり得る。本発明の１つの実施態様において、インサートドナーは環状Ｄ
ＮＡ分子であり、そして組換えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさ
らに含む（図１を参照のこと）。

産物：これは、組換えクローニングプロセスの間に第２の組換え事象の後に産
生される、ＡおよびＤまたはＢおよびＣ配列を含む所望の娘分子の一方または両
方である（図１を参照のこと）。産物は、クローン化またはサブクローン化され
るべきであったＤＮＡを含む。

プロモーター：これは、開始コドンの近位に位置する、遺伝子の５’領域であ
ると一般に記載されるＤＮＡ配列である。隣接するＤＮＡセグメントの転写はプ
ロモーター領域から開始される。抑制性プロモーターの転写速度は、抑制物質に
応答して減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導物質に応答して増加
する。構成性プロモーターの転写速度は、一般的な代謝条件の影響下で変化し得
るが、特異的に調節されていない。
認識配列：認識配列は、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、制限
エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が認識し、そし
て結合する、特定のＤＮＡ配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための
認識配列は、８塩基対のコア配列に隣接する２つの１３塩基対の逆方向反復（リ
コンビナーゼ結合部位として作用する）を含む３４塩基対の配列である、ｌｏｘ
Ｐである。Ｓａｕｅｒ， Ｂ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７ （１９９４）の図１を参照の
こと。認識配列の他の例としては、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼ
により認識される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である
。ａｔｔＢは、２つの９塩基対のコア型Ｉｎｔ結合部位および７塩基対の重複領
域を含む約２５塩基対の配列である。ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位および
アーム型Ｉｎｔ結合部位、ならびに補助タンパク質ＩＨＦ、ＦＩＳ、およびＸｉ
ｓのための部位を含む約２４０塩基対の配列である。Ｌａｎｄｙ， Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０
７ （１９９３）を参照のこと。このような部位はまた、方法および産物を増強
するように、本発明に従って操作される。

リコンビナーゼ：これは、特異的な組換え部位におけるＤＮＡセグメントの交
換を触媒する酵素である。

組換えクローニング：これは、本明細書において記載される方法であって、こ
れによりＤＮＡ分子のセグメントが、インビトロまたはインビボにおいて、交換
、挿入、置換（ｒｅｐｌａｃｅ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）または改変さ
れる。

組換えタンパク質：これは、１つ以上の組換え部位が関与する組換え反応に関
与する、切り出しタンパク質または組み込みタンパク質、酵素、補因子または会
合タンパク質を包含する。Ｌａｎｄｙ （１９９４）（下記）を参照のこと。

抑制カセット：これは、サブクローニングベクター中に存在する選択マーカー
のリプレッサーを含むＤＮＡセグメントである。

選択マーカー：これは、しばしば特定の条件下で、それを含有する分子または
細胞について、あるいはそれを含有する分子または細胞に対して選択することを
可能にする、ＤＮＡセグメントである。これらのマーカーは、ＲＮＡ、ペプチド
、またはタンパク質の産生のような（これらに限定されない）活性をコードし得
るか、あるいは、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物または
組成物などのための結合部位を提供し得る。選択マーカーの例としては以下が挙
げられるがそれらに限定されない：（１） そうでなければ毒性の化合物（例え
ば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；（
２） そうでなければレシピエント細胞において欠如している産物をコードする
ＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マーカー）；（３） 遺
伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤＮＡセグメント；（４） 容易に
同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、βガラクトシダーゼ
、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および細胞表面タンパク質のような表現
型マーカー）；（５） そうでなければ細胞の生存および／または機能に有害で
ある産物に結合するＤＮＡセグメント；（６） そうでなければ上記番号（１）
〜（５）に記載のＤＮＡセグメントのいずれかの活性を阻害するＤＮＡセグメン
ト（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７） 基質を修飾する産物
に結合するＤＮＡセグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８） 所
望の分子（例えば、特異的タンパク質結合部位）を単離するために使用され得る
ＤＮＡセグメント；（９） そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌクレオ
チド配列をコードするＤＮＡセグメント（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅の
ための）；および／または（１０） 存在しない場合、直接的または間接的に、
特定の化合物に対する感受性を与えるＤＮＡセグメント。

選択スキーム：これは、インサートドナー、ベクタードナー、および／または
任意の中間体、（例えば、コインテグレート）副産物を含む混合物からの、所望
の産物（単数または複数）の、選択、富化、または同定を可能にする任意の方法
である。１つの好ましい実施態様の選択スキームは、組換えクローニングの間に
連結されているまたは連結されていないのいずれかである、少なくとも２つの成
分を有する。一方の成分は選択マーカーである。他方の成分は、選択マーカーの
インビトロまたはインビボにおける発現、あるいは選択マーカーを有するプラス
ミドを有する細胞の生存を制御する。一般的に、この制御エレメントは、選択マ
ーカーのリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現を制
御するための他の手段が使用され得る。リプレッサーが使用されるかアクチベー
ターが使用されるかは、当業者に容易に明らかなように、マーカーがポジティブ
選択用であるかネガティブ選択用であるか、および種々のＤＮＡセグメントの正
確な配列に依存する。好ましい必要性は、選択スキームが１つ以上の所望の産物
のみの選択または富化を生じることである。本明細書において定義されるように
、ＤＮＡ分子について選択することは、（ａ） 所望のＤＮＡ分子の存在につい
て選択または富化すること、および（ｂ） 所望のＤＮＡ分子でないＤＮＡ分子
の存在に対して選択または富化することを包含する。

１つの実施態様において、選択スキーム（これは、逆に実施され得る）は、３
つの形態のうちの１つをとり、これは図１に関して議論される。第１（選択マー
カーおよびそのリプレッサーについて本明細書において例証される）は、セグメ
ントＤを有し、そしてセグメントＣを欠く分子について選択する。第２は、セグ
メントＣを有する分子に対しておよびセグメントＤを有する分子について選択す
る。第２の形態の可能な実施態様は、その中にインビトロ反応産物が導入される
べき細胞に対して毒性の遺伝子を有するＤＮＡセグメントを有する。毒性遺伝子
は、毒性遺伝子産物（毒性タンパク質またはＲＮＡ）として発現されるＤＮＡで
あり得るか、またはそれ自体もしくはそれだけで毒性であり得る。（後者の場合
において、毒性遺伝子はその古典的な定義の「遺伝性の特性（ｈｅｒｉｔａｂｌ
ｅ ｔｒａｉｔ）」を有すると理解される。）
このような毒性遺伝子産物の例は当該分野において周知であり、そして、制限
エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）および抑制機能の非存在下で宿主を傷
害する遺伝子（例えば、ｋｉｃＢ）を包含するがそれらに限定されない。あるい
は、毒性遺伝子はインビトロにおいて選択され得る（例えば、制限部位）。

第２の形態において、セグメントＤは選択マーカーを有する。毒性遺伝子は、
ベクタードナー、コインテグレート、および副産物分子を有する形質転換体を除
去するが、選択マーカーは、産物を含有する細胞について、およびインサートド
ナーのみを有する細胞に対して選択するために使用され得る。

第３の形態は、同一の分子上にシスでセグメントＡおよびセグメントＤの両方
を有する細胞については選択するが、異なる分子上にトランスに両方のセグメン
トを有する細胞については選択しない。これは、２つの不活性なフラグメント（
各々１つがセグメントＡおよびＤ上にある）に分割される選択マーカーにより具
体化され得る。

フラグメントは、セグメントが組換え事象により一緒にされるときに、それら
が機能性の選択マーカーを再構成するように、組換え部位に関して配列される。
例えば、組換え事象はプロモーターを構造遺伝子と連結し得る、構造遺伝子の２
つのフラグメントを連結し得る、または生存のために必要なヘテロダイマー遺伝
子産物をコードする遺伝子を連結し得る、またはレプリコンの部分を連結し得る
。

部位特異的リコンビナーゼ：これは、代表的には少なくとも以下の４つの活性
を有するリコンビナーゼの型である：（１） １つまたは２つの特異的ＤＮＡ配
列の認識；（２） 前記ＤＮＡ配列（単数または複数）の切断；（３） 鎖交換
に関与するＤＮＡトポイソメラーゼ活性；および（４） ＤＮＡの切断された鎖
の再封鎖をするＤＮＡリガーゼ活性。Ｓａｕｅｒ， Ｂ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｏｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７
（１９９４）を参照のこと。保存的部位特異的組換えは、両方のパートナーにつ
いての高度の特異性により、相同組換えおよび転位から区別される。鎖交換機構
は、ＤＮＡ合成の非存在下における特異的ＤＮＡ配列の切断および再結合を含む
（Ｌａｎｄｙ， Ａ． （１９８９） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
５８：９１３−９４９）。

サブクローニングベクター：これは、適切なレプリコンを含む環状または直鎖
状ＤＮＡ分子を含むクローニングベクターである。本発明において、サブクロー
ニングベクター（図１におけるセグメントＤ）はまた、最終産物中に組み込まれ
て、クローン化されたＤＮＡインサート（図１におけるセグメントＡ）に対して
またはそれともに作用することが所望される、機能性および／または調節エレメ
ントを含み得る。サブクローニングベクターはまた、選択マーカー（図１におけ
るセグメントＣに含まれる）を含み得る。

ベクター：これは、インサートに、有用な生物学的または生化学的性質を提供
するＤＮＡである。例としては、インビトロまたは宿主細胞において複製し得る
かまたは複製され得る、あるいは所望のＤＮＡセグメントを宿主細胞内の所望の
位置に運搬し得る、プラスミド、ファージ、および他のＤＮＡ配列が挙げられる
。ベクターは、そこにおいてＤＮＡ配列が、ベクターの本質的な生物学的機能の
損失なしに決定可能な様式で切断され得、そしてその中にＤＮＡフラグメントが
、その複製およびクローニングを生じさせるためにスプライスされ得る、１つ以
上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し得る。ベクターは、プライマー部位
（例えば、ＰＣＲのための）、転写および／または翻訳開始および／または調節
部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらに提供し得る。明
らかに、相同組換えまたは制限酵素の使用を必要としない所望のＤＮＡフラグメ
ントの挿入方法（例えば（これらに限定されない）、ＰＣＲフラグメントのＵＤ
Ｇクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号、その全体が本明細書中に参
考として援用される）、Ｔ：Ａクローニングなど）はまた、本発明に従って使用
されるべきクローニングベクター中へＤＮＡのフラグメントをクローン化するた
めに適用され得る。クローニングベクターは、クローニングベクターで形質転換
された細胞の同定における使用のために適切な選択マーカーをさらに含み得る。

ベクタードナー：これは、所望の産物の部分になるべきＤＮＡベクターをコー
ドするＤＮＡセグメントを有する、本発明の２つの親ＤＮＡ分子の１つである。
ベクタードナーは、組換え部位により隣接される、サブクローニングベクターＤ
（または、インサートドナーが既にクローニングベクターを含まない場合、これ
はクローニングベクターと呼ばれ得る）およびセグメントＣを含む（図１を参照
のこと）。セグメントＣおよび／またはＤは、選択スキームについて上記したよ
うに、所望の産物娘分子についての選択に貢献するエレメントを含み得る。組換
えシグナルは、同一であるかまたは異なり得、そして同一のまたは異なるリコン
ビナーゼにより作用され得る。さらに、ベクタードナーは直鎖状または環状であ
り得る。

（説明）
本発明のインビトロまたはインビボ方法についての１つの一般的なスキームを
図１に示す。ここでインサートドナーおよびベクタードナーは、環状または直鎖
状ＤＮＡのいずれかであり得るが、環状として示す。ベクターＤは、もとのクロ
ーニングベクターＡを交換する。エレメントＡおよびＤを含む娘ベクターについ
て、および１つ以上のコインテグレート（単数または複数）を含む他の分子に対
して選択することが所望される。四角および丸は、組換え部位の異なる組である
（例えば、ｌｏｘ部位またはａｔｔ部位）。セグメントＡまたはＤは、Ｄがこの
例において使用される場合、少なくとも１つの選択マーカー、発現シグナル、複
製起点、あるいは欠失、選択、発現、マッピングまたはＤＮＡ配列決定のための
特殊化された機能を含み得る。

エレメントＡまたはＤの部分であり得る所望のＤＮＡセグメントの例は、ＰＣ
Ｒ産物、大きなＤＮＡセグメント、ゲノムクローンまたはフラグメント、ｃＤＮ
Ａクローン、機能性エレメントなど、および有用な核酸またはタンパク質をコー
ドする遺伝子または部分的遺伝子を包含するが、それらに限定されない。さらに
、本発明の組換えクローニングは、タンパク質発現および／または遺伝子治療の
ための、エクスビボおよびインビボ遺伝子移入ビヒクルを作製するために使用さ
れ得る。

図１において、スキームは以下のようにベクターＤおよびＡを含む所望の産物
を提供する。インサートドナー（ＡおよびＢを含む）は、組換えタンパク質によ
り、ベクタードナー（ＣおよびＤを含む）と四角の組換え部位においてまず組換
えて、Ａ−Ｄ−Ｃ−Ｂの各々を有するコインテグレートを形成する。次に、丸の
組換え部位において組換えが生じて、産物ＤＮＡ（ＡおよびＤ）ならびに副産物
ＤＮＡ（ＣおよびＢ）を形成する。しかし、所望であれば、２つ以上の異なるコ
インテグレートが形成されて、２つ以上の産物を生成し得る。

本発明のインビトロまたはインビボ組換えクローニング方法の１つの実施態様
において、少なくとも１つの所望の産物ＤＮＡを選択するための方法が提供され
る。これは、図２に示されるプラスミドｐＥＺＣ７２６のマップの考慮により理
解され得る。２つの例示的な組換え部位は、ａｔｔＰおよびｌｏｘＰである。こ
れらの部位により規定される１つのセグメント上に、そのプロモーターがトラン
スポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレーター／プロモーターにより置換され
ているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。ｔｅｔリプレッサータンパク質の非
存在下において、Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナ
マイシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔ
ｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。ｐＥ
ＺＣ７２６の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリ
プレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ７２６により形質転換される細胞
は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感
受性である。組換え反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の調節されたカナマイシン耐性遺伝
子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞におい
てカナマイシン耐性を生じる。

２つの異なる組のプラスミドを、インビトロ方法を実証するために構築した。
Ｃｒｅリコンビナーゼのみのでの使用のための１つの組（クローニングベクター
６０２およびサブクローニングベクター６２９（図３））は、ｌｏｘＰおよびｌ
ｏｘＰ ５１１部位を含んだ。Ｃｒｅおよびインテグラーゼでの使用のための第
２の組（クローニングベクター７０５およびサブクローニングベクター７２６（
図２））は、ｌｏｘＰおよびａｔｔ部位を含んだ。所望の娘プラスミドの産生の
効率は、Ｃｒｅ単独を使用してよりも、両方の酵素を使用して、約６０倍高かっ
た。Ｃｒｅ単独反応由来の２４コロニー中１９が、所望の産物を含んだが、イン
テグラーゼ＋Ｃｒｅ反応由来の３８コロニー中３８が、所望の産物プラスミドを
有した。

他の選択スキーム それらがそのために組換えクローニングが実施される特定
の目的に適合し得るとして当該分野において公知である種々の選択スキームが、
使用され得る。個々の嗜好および要求に依存して、多数の異なる型の選択スキー
ムが本発明の組換えクローニング方法において使用され得る。当業者は、多数の
ＤＮＡセグメントまたはそれらを作製するための方法、および当該分野において
慣例的に使用される異なる選択方法の利用可能性を利用し得る。このようなＤＮ
Ａセグメントは、活性（ＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質の産生を包含す
るが、これらに限定されない）をコードするＤＮＡセグメント、またはこのよう
なＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質のための結合部位を供給するＤＮＡセグ
メントを包含するが、これらに限定されない。選択スキームの案出において使用
されるＤＮＡ分子の例は、「選択スキーム」の定義のもとに、上記に与えられる
。

さらなる例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（ｉ） ＰＣＲのための新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置さ
れていなかった２つのＤＮＡ配列の並置）；
（ｉｉ） 制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質、リ
ボザイムなどにより作用されるＤＮＡ配列の含有；
（ｉｉｉ） ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学物質などにより認
識されるＤＮＡ配列の含有（例えば、集団についての選択または集団からの排除
のためのアフィニティータグとしての使用のための）（Ｄａｖｉｓ， Ｎｕｃｌ
． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：７０２−７０６ （１９９６）； Ｊ． Ｖ
ｉｒｏｌ． ６９： ８０２７−８０３４ （１９９５））；
（ｉｖ） ランダマイズされ、そしてｃＤＮＡ由来のＲＮＡライブラリーを用
いることによる、エプスタインバールウイルスに発現されるＲＮＡに会合するリ
ボソームＬ２２タンパク質についてのＲＮＡリガンドのインビトロ選択；
（ｖｉ） その活性が特異的方向および並置を必要とする機能性エレメント（
例えば、（ａ） トランスでは弱く反応するが、シスに配置されると、適切なタ
ンパク質の存在下において、分子の特定の集団を破壊する組換え（例えば、イン
ビトロＲＮＡ合成を可能にするプロモーター配列の再構成）を生じる組換え部位
）の配置。ＲＮＡは直接使用され得るか、または逆転写されて所望のＤＮＡ構築
物を得ることが出来る；
（ｖｉｉ） 分子（単数または複数）のサイズ（例えば、分画）または他の物
理的性質による所望の産物の選択；および
（ｖｉｉｉ） その同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）のため
に必要とされるＤＮＡ配列の含有。

本発明の方法における産物および副産物の形成後、特定の組換えクローニング
手順において任意に案出された特定の選択スキームに依存して、選択工程はイン
ビトロまたはインビボのいずれかにおいて実施され得る。

例えば、選択のインビトロ方法は、インサートドナーおよびベクタードナーＤ
ＮＡ分子について案出され得る。このようなスキームは、組換え事象の後に、希
な切断部位が副産物中に至るように、出発環状ベクターにおいて希な制限部位を
操作することを含む。従って、希な制限部位を結合し、そしてそれを切断する制
限酵素がインビトロにおいて反応混合物に添加されると、希な切断部位を有する
ＤＮＡ分子（すなわち、出発ＤＮＡ分子、コインテグレート、および副産物）の
全ては、切断され、そして意図される宿主細胞において複製不能にされる。例え
ば、セグメントＢおよびＣにおける切断部位（図１を参照のこと）は、産物以外
のすべての分子に対して選択するために使用され得る。あるいは、セグメントＤ
について（例えば、Ｂ上に見出されない薬剤耐性遺伝子により）選択し得る場合
、Ｃにおける切断部位のみが必要とされる。

同様に、直鎖状ＤＮＡ分子を扱う場合、インビトロ選択方法が案出され得る。
ＰＣＲプライマーに相補的なＤＮＡ配列が、産物分子にのみ、組換えクローニン
グ方法を介して、移入されるように操作され得る。反応が完了した後、適切なプ
ライマーが反応溶液に添加され、そしてサンプルがＰＣＲに供される。従って、
産物分子の全てまたは一部が増幅される。

他のインビボ選択スキームが、種々のＥ． ｃｏｌｉ細胞株を用いて使用され
得る。１つのスキームは、サブクローニングプラスミドの一方のセグメント上に
リプレッサー遺伝子を、そして同じプラスミドの他方のセグメント上にそのリプ
レッサーにより制御される薬剤マーカーを置くことである。別のスキームは、サ
ブクローニングプラスミドのセグメントＣ上にキラー（ｋｉｌｌｅｒ）遺伝子を
置くことである（図１）。もちろん、このようなプラスミドを増殖させるための
方法が存在しなくてはならない。すなわち、それにおいてキラー遺伝子が死滅さ
せない状況が存在しなければならない。Ｅ． ｃｏｌｉの特定の株を必要とする
公知の多数の遺伝子が存在する。１つのこのようなスキームは、制限酵素Ｄｐｎ
Ｉ（これは、その認識配列ＧＡＴＣがメチル化されない限り切断しない）を使用
することである。多数の普及した一般的なＥ． ｃｏｌｉ株はＧＡＴＣ配列をメ
チル化するが、その中でクローン化されたＤｐｎＩが害なしに発現され得る変異
体が存在する。

もちろん、類似の選択スキームが他の宿主生物のために案出され得る。例えば
、Ｔｎ１０のｔｅｔリプレッサー／オペレーターが真核生物において遺伝子発現
を制御するように適合させられた（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ．，およびＢｕｊａｒｄ
， Ｈ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：
５５４７−５５５１ （１９９２））。従って、本明細書において例証されるｔ
ｅｔリプレッサーによる薬剤耐性の同じ制御が、真核生物細胞において産物を選
択するために適用され得る。

（組換えタンパク質）
本発明において、ＤＮＡセグメントの交換は、組換えタンパク質（リコンビナ
ーゼならびに会合する補因子およびタンパク質を含む）の使用によって達成され
る。種々の組換えタンパク質が当該分野において記載されている。このようなリ
コンビナーゼの例には以下が含まれる：
Ｃｒｅ： バクテリオファージＰ１由来のタンパク質（Ａｂｒｅｍｓｋｉおよ
びＨｏｅｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５９（３）：１５０９−１５１４
（１９８４））は、ｌｏｘＰ（交叉の遺伝子座）部位と呼ばれる３４ｂｐ Ｄ
ＮＡ配列間の交換を触媒する（すなわち、組換えを引き起こす）（Ｈｏｅｓｓら
、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４（５）：２２８７ （１９８６）を参
照のこと）。Ｃｒｅは市販されている（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログＮｏ．６９２
４７−１）。Ｃｒｅによって媒介される組換えは、自由に可逆的である。熱力学
的考察からは、Ｃｒｅ媒介性組み込み（１つの分子を形成する２つの分子間の組
換え）が、Ｃｒｅ媒介性切り出し（２つの娘分子を形成する同一分子中の２つの
ｌｏｘＰ部位間の組換え）より、はるかに効率的でないことは驚くべきことでは
ない。Ｃｒｅは、当該分野において周知のように、補因子としてマグネシウムま
たはスペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。ＤＮＡ基質は、直鎖
状または超らせん状のいずれかであり得る。多くの変異体ｌｏｘＰ部位が記載さ
れている（Ｈｏｅｓｓら、前掲）。これらの１つｌｏｘＰ ５１１は、別のｌｏ
ｘＰ ５１１部位と組換えるが、ｌｏｘＰ部位とは組み換えない。

インテグラーゼ：λゲノムのＥ．ｃｏｌｉ染色体への組み込みを媒介する、バ
クテリオファージλ由来のタンパク質。バクテリオファージλＩｎｔ組換えタン
パク質は、溶原状態の形成または誘導の一部として、その基質ａｔｔ部位間の不
可逆的な組換えを促進する。組換え反応の可逆性は、組み込み組換えおよび切り
出し組換えのための２つの独立した経路から生じる。各経路は特有であるが重複
する、ａｔｔ部位ＤＮＡを含む１５のタンパク質結合部位のセットを使用する。
４つのタンパク質（Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、ＩＨＦおよびＦＩＳ）が関与する協同的お
よび競合的相互作用が組換えの方向を決定する。

組み込み組換えには、ＩｎｔおよびＩＨＦタンパク質、ならびに部位ａｔｔＰ
（２４０ ｂｐ）およびａｔｔＢ（２５ ｂｐ）が関与する。組換えは、２つの
新たな部位：ａｔｔＬおよびａｔｔＲの形成を生じる。切り出し組換えは、ａｔ
ｔＰおよびａｔｔＢを生成するために、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓ、ならび
に部位ａｔｔＬおよびａｔｔＲを必要とする。特定の条件下で、ＦＩＳは、切り
出し組換えを刺激する。これらの正常な反応に加えて、ａｔｔＰおよびａｔｔＢ
は、同一分子上に配置される場合、切り出し組換えを促進して２つの切り出し産
物（ａｔｔＬを有するものおよびａｔｔＲを有するもの）を生成し得ることを理
解すべきである。同様に、ａｔｔＬを含む分子とａｔｔＲを含む分子との間での
分子間組換えは、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓの存在下で、組み込み組換えなら
びにａｔｔＰおよびａｔｔＢの生成を生じ得る。従って、ＤＮＡセグメントを、
操作したａｔｔ部位の適切な組合せと隣接させることによって、適切な組換えタ
ンパク質の存在下で、切り出し組換えまたは組み込み組換えを、互いの逆反応と
して導き得る。

ａｔｔ部位のそれぞれは、１５ｂｐのコア配列を含む。機能的重要性の個々の
配列エレメントは、この共通コアの境界の範囲内に、外側に、およびその境界を
横切って存在する（Ｌａｎｄｙ，Ａ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
５８：９１３ （１９８９））。種々のａｔｔ部位間の効率的な組換えは、中心
共通領域の配列が組換えパートナー間で同一であることを必要とする。しかし、
現在は、正確な配列は改変可能であることが見出されている。その結果、コア内
に変化を有する、ａｔｔ部位の誘導体が、少なくとも天然のコア配列と同程度に
効率的に組換えることが、現在は見出されている。

インテグラーゼはバクテリオファージλ上のａｔｔＰ部位（約２４０ ｂｐ）
をＥ．ｃｏｌｉゲノム上のａｔｔＢ部位（約２５ ｂｐ）と組換えて（Ｗｅｉｓ
ｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．およびＬａｎｄｙ，Ａ． Ｌａｍｂｄａ ＩＩ、ｐ．２１１
（１９８３）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、ａｔｔＬ（約１００ ｂｐ）およびａｔｔＲ（約１６０ ｂｐ）部位によ
って隣接された、組み込まれたλゲノムを生成するように作用する。Ｘｉｓの非
存在下（下記参照のこと）で、この反応は本質的に不可逆的である。インテグラ
ーゼおよびＩＨＦによって媒介される組み込み反応は、インビトロで、スペルミ
ジンを含む単純な緩衝液を用いて働く。インテグラーゼは、Ｎａｓｈ，Ｈ．Ａ．
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １００：２１０−２１６（１
９８３）によって記載されるように入手され得る。ＩＨＦは、Ｆｉｌｕｔｏｗｉ
ｃｚ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ １４７：１４９−１５０ （１９９４）によって記載
されるように入手され得る。

λタンパク質Ｘｉｓ（切り出し）の存在下で、インテグラーゼは、ａｔｔＲと
ａｔｔＬとの反応を触媒してａｔｔＰおよびａｔｔＢを形成する。すなわち、イ
ンテグラーゼは、上記の反応の逆転を促進する。この反応もまた、本発明におい
て適用され得る。

他の組換え系。種々の生物由来の多くの組換え系もまた、本明細書中に提供さ
れる教示およびガイダンスに基づいて、使用され得る。例えば、Ｈｏｅｓｓら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（６）：２２８７ （１
９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６１（１）：３
９１ （１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４（
２３）：７４９５ （１９９２）；Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２
６７（１１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２２５（１）：２５ （１９９２）を参照のこと。これらの多くは、リコンビ
ナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．
５：４３３−４４０ （１９８６））。おそらく、これらのうち、バクテリオフ
ァージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ． （１９９３）
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖ
ｅｌ． ３：６９９−７０７）、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘ
Ｐ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、Ｅｃｋｓｔ
ｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９０−１０９頁）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏ
ａｃｈら、Ｃｅｌｌ ２９：２２７−２３４ （１９８２））が、最も良く研究
されている。

部位特異的リコンビナーゼの第２のファミリーのメンバーであるリゾルベース
ファミリー（例えば、γδ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、およびＣｉ
ｎ）もまた公知である。リコンビナーゼのこの高度に関連するファミリーのメン
バーは、代表的には、分子内反応（例えば、反転および切り出し）に制約され、
そして宿主がコードする因子を必要とし得る。宿主因子の要求性のいくつか（Ｍ
ａｅｓｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ （１９９１） Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ． ２３０：１７０−１７６）および分子内組換えの制約のいくつかを軽減す
る変異体が単離されている。

λＩｎｔに類似の他の部位特異的リコンビナーゼおよびＰ１ Ｃｒｅに類似の
他の部位特異的リコンビナーゼは、ＩｎｔおよびＣｒｅを置換し得る。このよう
なリコンビナーゼは公知である。多くの場合、このような他のリコンビナーゼの
精製は、当該分野において記載されている。それらが公知でない場合、細胞抽出
物が使用され得るか、またはＣｒｅおよびＩｎｔについて記載された手順を使用
して、酵素が部分的に精製され得る。

ＣｒｅおよびＩｎｔが例として詳細に記載されているが、多くの関連するリコ
ンビナーゼ系が存在し、そして記載された発明に対するそれらの適用もまた、本
発明に従って提供される。部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリ
ーは、バクテリオファージλ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１
によりコードされる部位特異的組換えタンパク質のような、本発明のための別の
組換えタンパク質および組換え部位を提供するために使用され得る。この群のタ
ンパク質は、配列の予想し得ないほど大きな多様性を示す。この多様性にも関わ
らす、すべてのリコンビナーゼは、そのＣ末端側の半分においてアラインされ得
る。

Ｃ末端付近の４０残基領域は、すべてのタンパク質において、特によく保存さ
れており、そして酵母２μプラスミドＦｌｐタンパク質のＣ末端付近の領域と相
同である。３つの位置がこのファミリー内で完全に保存されている：ヒスチジン
、アルギニンおよびチロシンが、よく保存されたＣ末端領域内のそれぞれのアラ
インメント位置３９６、３９９および４３３に見出される。これらの残基は、こ
のファミリーのリコンビナーゼの活性部位に寄与し、そしてチロシン−４３３が
鎖切断および再結合の間にＤＮＡと一時的に共有結合を形成することを示唆する
。例えば、Ａｒｇｏｓ，Ｐ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ５：４３３−４０ （１９８
６）を参照のこと。

あるいは、ＩＳ２３１および他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓの転移因子が、組換えタンパク質および組換え部位として使用され得る。Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、その毒性が、農業的な有害生
物ならびにヒトおよび動物の疾患のベクターに対して活性である、胞子嚢中のデ
ルタエンドトキシン結晶の存在に起因する、昆虫病原性（ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈ
ｏｇｅｎｉｃ）細菌である。これらの毒素タンパク質をコードする遺伝子のほと
んどは、プラスミドに保有され、そして一般に、挿入配列（ＩＳ２３１、ＩＳ２
３２、ＩＳ２４０、ＩＳＢＴ１およびＩＳＢＴ２）ならびにトランスポゾン（Ｔ
ｎ４４３０およびＴｎ５４０１）と構造的に関連している。これらの可動要素の
いくつかは活性であり、そして結晶遺伝子の可動性に関与し、そのことによって
細菌毒性の変動に寄与することが示されている。

イソＩＳ２３１エレメントの構造分析により、それらがＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のＩＳ１１５１に関連し、そしてＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＩＳ４およびＩＳ１８６に遠縁に関連する。他のＩ
Ｓ４ファミリーのメンバーと同様に、それらは、他のＩＳファミリーおよびレト
ロウイルスに見出される、保存されたトランスポゼース−インテグラーゼモチー
フを含む。

さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＩＳ２３１Ａから収集した機能
的データは、特異的な標的に対して優先性を有する、非複製様式の転位を示す。
同様な結果はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓにおいても得られた。例えば、Ｍａｈｉｌｌｏｎ，Ｊ．ら、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃａ ９３：１３−２６（１９９４）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ． ７４９５−７４９９ （１９９２）を参照のこと。

組換え反応を駆動するために添加されるリコンビナーゼの量は、公知のアッセ
イを用いることによって決定され得る。詳細には、力価アッセイを使用して、精
製されたリコンビナーゼ酵素の適切な量または抽出物の適切な量を決定する。

操作された組換え部位。上記リコンビナーゼおよび対応するリコンビナーゼ部
位は、本発明に従う組換えクローニングにおける使用に適切である。しかし、野
生型組換え部位は、本発明の方法において適用されるような、組換え反応の効率
または特異性を低下させる配列を含む。例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ
、ａｔｔＬおよびｌｏｘＰ組換え部位における複数の終止コドンが、両方の鎖上
の複数のリーディングフレーム中に生じる。従って、組換えの効率は、例えば、
コード配列が組換え部位を横切らなければならない（１つのリーディングフレー
ムのみがｌｏｘＰおよびａｔｔＢ部位の各鎖上で利用可能である）場合、低下す
るか、または（ａｔｔＰ、ａｔｔＲもしくはａｔｔＬにおいて）不可能である。

従って、本発明はまた、これらの問題を克服する操作された組換え部位を提供
する。例えば、ａｔｔ部位は、組換え反応の特異性または効率および産物ＤＮＡ
の性質を増強するために（例えば、ａｔｔ１、ａｔｔ２、およびａｔｔ３部位）
、逆反応を減少させるために（例えば、ａｔｔＢからのＰ１およびＨ１の除去）
、１または複数の変異を有するように操作され得る。これらの変異体の試験は、
どの変異体が、本発明に従う組換えサブクローニングに適切であるに十分な組換
え活性を生じるかを決定する。

従って、変異は、部位特異的組換えを増強するために組換え部位に導入され得
る。このような変異には、翻訳終止コドンを有さない組換え部位（これは、融合
タンパク質がコードされることを可能にする）；同一のタンパク質によって認識
されるが塩基配列が異なる組換え部位（その結果、これらは、それらの相同なパ
ートナーと大きくまたは排他的に反応して、複数の意図されるべき反応を可能に
する）が含まれれが、これらに限定されない。どの特定の反応が生じるかは、ど
の特定のパートナーが反応混合物中に存在するかによって特定され得る。例えば
、三部分タンパク質融合体は、組換え部位ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２；ａｔｔ
Ｌ１およびａｔｔＬ３；ならびに／またはａｔｔＲ３およびａｔｔＬ２を含む親
プラスミドを用いて達成され得る。

特定の変異を核酸配列に導入するための周知の手順が存在する。これらの多く
はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９−１９９６））に記載されている。変異は、
オリゴヌクレオチド中に設計され得、これは、既存のクローニングされた配列を
改変するために、または増幅反応において使用され得る。所望の変異体ＤＮＡま
たはＲＮＡを単離するために適切な選択方法が利用可能である場合、ランダム変
異誘発もまた用いられ得る。所望の変異の存在は、核酸を周知の方法によって配
列決定することにより確認され得る。

以下の限定されない方法が、所定の組換え部位のコア領域を操作して、本発明
における使用に適切な変異した部位を提供するために、使用され得る：
１．部位特異的（例えば、ａｔｔＢを得るためのａｔｔＬおよびａｔｔＲ）組換
え機構または他の（例えば、相同）組換え機構による２つの親ＤＮＡ配列の組換
えによる。ＤＮＡ親ＤＮＡセグメントは、最終的なコア配列を生じる１またはそ
れ以上の塩基変化を含む；
２．所望のコア配列の直接的な変異または変異誘発（部位特異的、ＰＣＲ、ラン
ダム、自発的など）による；
３．組み換えられて所望のコア配列を生じる親ＤＮＡ配列の変異誘発（部位特異
的、ＰＣＲ、ランダム、自発的など）による；および
４．所望のコア配列をコードするＲＮＡの逆転写による。

変異体組換え部位の機能性は、所望の特定の特性に依存する方法で示され得る
。例えば、組換え部位における翻訳終止コドンの欠如は、適切な融合タンパク質
を発現させることによって示され得る。相同なパートナー間の組換えの特異性は
、適切な分子をインビトロ反応に導入し、そして組換え産物について、本明細書
中に記載したように、または当該分野において公知のように、アッセイすること
によって、示され得る。組換え部位における他の所望の変異は、制限部位、翻訳
または転写開始シグナル、タンパク質結合部位、および核酸塩基配列の他の公知
の機能が存在することまたは存在しないことを包含し得る。組換え部位における
特定の機能的特性に関する遺伝子選択スキームは、公知の方法の工程に従って使
用され得る。例えば、（相互作用しない一対の部位から）相互作用するパートナ
ーを提供するための部位の改変は、毒性物質をコードするＤＮＡ配列のこれら部
位間の組換えを介しての欠失を要求することよって達成され得る。同様に、翻訳
終止配列を除去する部位についての選択、タンパク質結合部位の存在または非存
在などは、当業者によって容易に案出され得る。

従って、本発明は、選択マーカーおよび／または所望のＤＮＡセグメントに隣
接する少なくとも２つの操作された組換え部位を有する少なくとも１つのＤＮＡ
セグメントを含む核酸分子を提供する。ここで、上記組換え部位のうち少なくと
も１つは、コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡの形成においてインビトロ
で組換えを増強する、少なくとも１つの操作された変異を有するコア領域を含む
。

核酸分子は、上記組換えの少なくとも１つの増強を付与する、少なくとも１つ
の変異を有し得る。この増強は、（ｉ）切り出し組み込みを優先すること；（ｉ
ｉ）切り出し組換えを優先すること；（ｉｉ）宿主因子の要求性を軽減すること
；（ｉｉｉ）上記コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の効率を増加さ
せること；および（ｉｖ）上記コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の
特異性を増加させることから実質的になる群より選択される。

核酸分子は、好ましくは、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲに由
来する少なくとも１つの組換え部位を含む。より好ましくは、ａｔｔ部位は、本
明細書に記載のように、ａｔｔ１、ａｔｔ２、またはａｔｔ３から選択される。

好ましい実施態様において、コア領域は、以下からなる群より選択されるＤＮ
Ａ配列：

あるいは対応するまたは相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含む。ここで、米
国特許法施行規則§１．８２２（本明細書中に参考としてその全体を援用する）
に示されているように、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ
／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝Ｃまた
はＧ；そしてＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕであり、コア領域は、１またはそれ以
上のリーディングフレームにおいて終止コドンを含まない。

コア領域はまた、好ましくは、以下からなる群より選択されるＤＮＡ配列：

あるいは対応するまたは相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含む。

従って、本発明はまた、核酸分子を作製するための方法を提供する。この方法
は、配列番号１〜１６のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０〜９９％
の相同性（あるいはその中の任意の範囲または値）を有する少なくとも１つのＤ
ＮＡ配列を含む少なくとも１つの操作された組換え部位、または任意の適切な組
換え部位を有する核酸分子、あるいは、当該分野において公知のように、ストリ
ンジェントな条件下で、その核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する
工程を包含する。

明らかなことではあるが、このような周知のインビトロおよびインビボ選択方
法の種々のタイプおよび変更が存在する。これらの各々については、簡略にする
ために、本明細書に記載されない。しかし、このような変形および変更は、本発
明の異なる実施態様であると意図されており、そしてそのようにみなされる。

インビトロ組換え反応である好ましい実施態様の結果として、非生物学的分子
（例えば、ＰＣＲ産物）が、本発明の組換えクローニング方法により操作され得
ることに注目することが重要である。１つの例において、直鎖状分子を環状ベク
ターにクローニングすることが可能である。

本発明には多くの適用がある。これらの使用には、ベクターを変化させること
、プロモーターを遺伝子の隣に並べること（ａｐｐｏｓｉｎｇ）、融合タンパク
質に対する遺伝子を構築すること、コピー数を変化させること、レプリコンを変
化させること、ファージにクローニングすること、ならびに例えば、ＰＣＲ産物
（一方の端にａｔｔＢ部位、そして他方の端にｌｏｘＰ部位を有する）、ゲノム
ＤＮＡおよびｃＤＮＡをクローニングすることが含まれるが、これらに限定され
ない。

以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施態様をさらに例示することを意
図され、限定することを全く意図されない。

本発明の組換えクローニング法は、クローニングベクターの変化のような、あ
るものを使用者にとって有用にさせるための核酸セグメントの交換を達成する。
これらのセグメントは、お互いに関して適切な方向にある組換えシグナルによっ
て両側で隣接されなければならない。以下の実施例において、２つの親の核酸分
子（例えば、プラスミド）を、インサートドナーおよびベクタードナーと呼ぶ。
インサートドナーは、ベクタードナーによって寄与された新しいベクターに結合
されるようになるセグメントを含む。両方の開始分子を含む組換え中間体（単数
または複数）は、コインテグレート（単数または複数）と呼ばれる。第２の組換
え事象は、２つの娘分子を産生し、これらは産物（所望の新しいクローン）およ
び副産物と呼ばれる。

（緩衝液）
本発明の反応において、種々の公知の緩衝液を使用し得る。制限酵素について
は、製造者によって推奨される緩衝液の使用が望ましい。代替緩衝液が、文献か
ら容易に見出され得るか、または当業者によって案出され得る。

実施例１〜３。λインテグラーゼのための１つの例示的な緩衝液には、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５〜７．８）、７０ ｍＭ ＫＣｌ、５
ｍＭスペルミジン、０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．２５ ｍｇ／ｍｌ ウ
シ血清アルブミン、ならびに必要に応じて１０％グリセロールが含まれる。

Ｐ１ Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの好ましい緩衝液には、５０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、３３ ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ スペル
ミジン、および０．５ ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンが含まれる。

λ ＩｎｔおよびＰ１ Ｃｒｅに類似する他の部位特異的リコンビナーゼのた
めの緩衝液は、当該分野で公知であるか、または特に上記の緩衝液に照らして、
当業者によって経験的に決定され得るかのいずれかである。

（実施例１：ＣｒｅならびにＣｒｅおよびＩｎｔを用いる組換えクローニング
）
２対のプラスミドを、２つの異なる方法においてインビトロ組換えクローニン
グ法を行うために構築した。一方の対であるｐＥＺＣ７０５およびｐＥＺＣ７２
６（図２Ａ）を、Ｃｒｅおよびλインテグラーゼとともに用いられる、ｌｏｘＰ
およびａｔｔ部位を有して構築した。他方の対であるｐＥＺＣ６０２およびｐＥ
ＺＣ６２９（図３Ａ）は、ＣｒｅのためのｌｏｘＰ（野生型）部位および１塩基
（全３４中）においてｌｏｘＰと異なる第２の変異体ｌｏｘ部位（ｌｏｘＰ ５
１１）を含んだ。本発明の組換えクローニングに対する最小の要求は、各プラス
ミドにおける２つの組換え部位（一般に、ＸおよびＹ、ならびにＸ’およびＹ’
）である。いずれかまたは両方の型の部位が組換えて、コインテグレート（例え
ば、ＸおよびＸ’）を形成し得る場合、およびいずれかまたは両方の（しかし、
コインテグレートを形成する型と異なる部位である必要がある）が、組換えて、
コインテグレート（例えば、ＹおよびＹ’）から産物または副産物プラスミドを
切り出し得る場合、組換えクローニングが起こる。同一のプラスミド上の組換え
部位は、組換えないことが重要である。本発明の組換えクローニングは、Ｃｒｅ
のみを用いて行われ得ることが見出された。
（Ｃｒｅのみ）
２つのプラスミドを、この概念を示すために構築した（図３Ａを参照のこと）
。ｐＥＺＣ６２９が、ベクタードナープラスミドであった。これは、構成性薬剤
マーカー（クロラムフェニコール耐性）、複製起点、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ
５１１部位、条件的薬剤マーカー（トランスポゾンＴｎ１０のテトラサイクリン
耐性オペロンのオペレーター／プロモーターによってその発現が制御されるカナ
マイシン耐性）、およびｔｅｔリプレッサータンパク質に対する構成性に発現さ
れる遺伝子ｔｅｔＲを含んでいた。ｐＥＺＣ６２９を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞は、
３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対して耐性であるが、１００μｇ／ｍ
ｌのカナマイシンに対して感受性であった。ｐＥＺＣ６０２が、インサートドナ
ープラスミドであり、これは、異なる薬剤マーカー（アンピシリン耐性）、複製
起点、ならびにマルチクローニング部位に隣接しているｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ
５１１部位を含んだ。

本実験は、以下の２つのパートからなった：
（パートＩ：各々約７５μｇのｐＥＺＣ６０２およびｐＥＺＣ６２９を全容積
３０μｌのＣｒｅ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３３ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ スペルミジン−ＨＣｌ、５００μｇ／ｍｌ ウシ血清ア
ルブミン）中で混合した。）
２つの１０μｌアリコートを、新しいチューブに移した。１つのチューブに、
０．５μｌのＣｒｅタンパク質（約４単位／μｌ；ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏ
ｅｓｓ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９： １５０９ （１９８４）
に従って、部分精製した）を入れた。両方のチューブを、３７℃で３０分間イン
キュベートし、次いで、７０℃で１０分間インキュベートした。各反応物のアリ
コートを希釈し、そしてＤＨ５αに形質転換した。発現後、アリコートを、３０
μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール；１００μｇ／ｍｌ アンピシリン＋２００
μｇ／ｍｌメチシリン；または１００μｇ／ｍｌ カナマイシン上にプレートし
た。結果：表１を参照のこと。Ｃｒｅを含まない反応物は、１．１１×１０^６個
のアンピシリン耐性コロニー（インサートドナープラスミドｐＥＺＣ６０２由来
）；７．８×１０^５個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープ
ラスミド由来）；および１４０個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラウン
ド）を生じた。Ｃｒｅを添加した反応物は、７．５×１０^５個のアンピリン耐性
コロニー（インサートドナープラスミドｐＥＺＣ６０２由来）；６．１×１０^５
個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープラスミドｐＥＺＣ６
２９由来）；および７６０個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラウンドコ
ロニーおよび組換えクローニング産物プラスミド由来のコロニーの混合物）を生
じた。分析：Ｃｒｅの存在において、カナマイシンプレート上のコロニーの数が
ずっと多かったので、それらの多数またはほとんどが所望の産物プラスミドを含
むと予想された。

パートＩＩ：「＋Ｃｒｅ」カナマイシンプレート由来の２４コロニーをひろい
、そして１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培地中に接種した。ミニプレップ
を行い、そしてミニプレップＤＮＡ（非切断あるいはＳｍａＩまたはＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断を電気泳動した。結果：２４個のミニプレップ中１９個は、産物プラ
スミドについて予想されるサイズの超らせん状のプラスミドを示した。１９個の
全ては、予想されるＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを示した。
分析：Ｃｒｅのみのスキームを示した。詳細には、約７０％（２４個中１９個）
の産物コロニーを生じることが示された。効率は、約０．１％（６．１×１０^５
個のクロラムフェニコール耐性コロニーから７６０個のカナマイシン耐性クロー
ンが得られた）であった。

（Ｃｒｅ＋インテグラーゼ）
本方法を示すために使用されるプラスミドは、ベクタードナープラスミドであ
るｐＥＺＣ７２６がｌｏｘＰ ５１１の代わりにａｔｔＰ部位を含んだこと、お
よびインサートドナープラスミドであるｐＥＺＣ７０５がｌｏｘＰ ５１１の代
わりにａｔｔＢ部位を含んだことを除き上記で使用されたプラスミドに正確に類
似する（図２Ａ）。

この実験は、以下の３つのパートからなった：
パートＩ：約５００ｎｇのｐＥＺＣ７０５（インサートドナープラスミド）を
、アンピシリン耐性遺伝子内でプラスミドを直鎖化するＳｃａＩを用いて切断し
た。（λインテグラーゼ反応は、歴史的に直鎖状態のａｔｔＢプラスミドを用い
て行われている（Ｈ．Ｎａｓｈ，私信）ので、これを行った）。しかし、インテ
グラーゼ反応は、超らせん状の両方のプラスミドを用いて良好に進行することが
後に見出された。次いで、直鎖状プラスミドをエタノール沈殿し、そして２０μ
ｌのλインテグラーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ７．８）、
７０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭスペルミジン−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５
０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中で溶解した。また、約５００ｎｇのベクタ
ードナープラスミドｐＥＺＣ７２６をエタノール沈殿し、そして２０μｌのλイ
ンテグラーゼ緩衝液中で溶解した。使用の直前に、λインテグラーゼ（２μｌ、
３９３μｇ／ｍｌ）を融解し、そして１８μｌの冷λインテグラーゼ緩衝液を添
加することにより希釈した。１μｌのＩＨＦ（組み込み宿主因子、２．４ｍｇ／
ｍｌ、アクセサリータンパク質）を、１５０μｌの冷λインテグラーゼ緩衝液中
で希釈した。アリコート（２μｌ）の各ＤＮＡを、全量１０μｌで、λインテグ
ラーゼ緩衝液（各々１μｌのλインテグラーゼおよびＩＨＦを含むまたは含まな
い）と混合した。混合物を、２５℃で４５分間インキュベートし、次いで、７０
℃で１０分間インキュベートした。各反応物の半分をアガロースゲルに供した。
結果：インテグラーゼおよびＩＨＦの存在下で、全ＤＮＡの約５％が、直鎖状の
コインテグレート形態に転換された。分析：インテグラーゼおよびＩＨＦの活性
を確認した。

パートＩＩ：３μｌの各反応物（すなわち、インテグラーゼおよびＩＨＦを含
むまたは含まない）を、２７μｌのＣｒｅ緩衝液（上記）中で希釈し、次いで、
各反応物を２つの１０μｌアリコートに分割した（全部で４つ）。これらの反応
物の２つに、０．５μｌのＣｒｅタンパク質（上記）を添加し、そして全ての反
応物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで７０℃で１０分間インキュベ
ートした。各反応物に、ＴＥ緩衝液（９０μｌ；ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、そして各１μｌを、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。形質転換混合物を、１００μｇ／ｍｌ
アンピシリン＋２００μｇ／ｍｌ メチシリン；３０μｇ／ｍｌ クロラムフェ
ニコール；または１００μｇ／ｍｌ カナマイシン上にプレートした。結果：表
２を参照のこと。

分析：Ｃｒｅタンパク質は、形質転換を減少させた。この効果について調節し
た場合、カナマイシン耐性コロニー数は、Ｃｒｅおよびインテグラーゼの両方を
用いた場合、コントロール反応物と比較して、１００倍より多く増加した。これ
は、９９％より高い特異性を示唆した。

パートＩＩＩ：３８個のコロニーを、インテグラーゼ＋Ｃｒｅプレートからひ
ろい、ミニプレップＤＮＡを作製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで切断して診断マッ
ピング情報を得た。結果：３８個全てが正確に予想されたフラグメントザイズを
有した。分析：Ｃｒｅ＋λインテグラーゼ法は、Ｃｒｅのみよりずっと高い特異
性を有することが観察された。結論：Ｃｒｅ＋λインテグラーゼ法を示した。効
率および特異性は、Ｃｒｅのみよりもずっと高かった。

（実施例２：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の真核
生物細胞における発現のためのベクターへのサブクローン化のためのインビトロ
組換えクローニングの使用（図４Ａ））
ｌｏｘＰ部位とａｔｔＢ部位の間でクローン化され、その結果ｌｏｘＰ部位が
遺伝子の５’末端に位置する、Ｅ． ｃｏｌｉのクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子を含む、インサートドナープラスミドであるｐＥＺＣ
８４３を構築した（図４Ｂ）。ｌｏｘＰ部位に隣接するサイトメガロウイルス真
核生物プロモーターを含む、ベクタードナープラスミドであるｐＥＺＣ１００３
を構築した（図４Ｃ）。１μｌアリコートの各超らせん状のプラスミド（約５０
ｎｇの粗製ミニプレップＤＮＡ）を、等量のλインテグラーゼ緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、７０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ スペルミジン
、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）およびＣ
ｒｅリコンビナーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３３
ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ スペルミジン、０．５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミ
ン）、２単位のＣｒｅリコンビナーゼ、１６ｎｇの組み込み宿主因子、および３
２ｎｇ λインテグラーゼを含む１０μｌの反応物中で合わせた。３０℃で３０
分間インキュベートした後、７５℃で１０分間インキュベートし、１μｌをコン
ピテントＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）に形質転換した。形質転換体のアリコートを、２００μｇ／ｍｌ カ
ナマイシンを含む寒天プレート上に広げ、そして３７℃で一晩インキュベートし
た。それ以外の同一のコントロール反応は、ベクタードナープラスミドのみを含
んだ。コントロール反応形質転換の１０％を受けたプレートから、１つのコロニ
ーを得た；組換えクローニング反応の１０％を受けたプレートからは１４４のコ
ロニーを得た。これらの数は、９９％より多い組換えクローニングコロニーが、
所望の産物プラスミドを含んだことを示唆した。６個の組換えクローニングコロ
ニーから作製したミニプレップＤＮＡから、予想されたサイズのプラスミド（５
０２６塩基対）であるＣＭＶＰｒｏｄを得た。ＮｃｏＩを用いた制限消化から、
６個全てのプラスミドについてＣＭＶプロモーターの下流にクローン化したクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼと予想されるフラグメントを得た
。

（実施例３：終止コドンを有さないａｔｔＢ部位によって隣接されるサブクロ
ーン化されたＤＮＡセグメント）
（パートＩ：背景）
上記の実施例は、転写が組換え部位を横切る転写融合に適する。しかし、ａｔ
ｔＲ部位およびｌｏｘＰ部位の両方は、両方の鎖に複数の終止コドンを含み、従
って、コード配列が組換え部位を横断しなければならない（１つのリーディング
フレームのみがｌｏｘＰ部位の各鎖上で利用可能である）場合、転写融合は困難
であり得るか、または不可能であり得る（ａｔｔＲまたはａｔｔＬにおいて）。

サブクローニングのための主要な理由は、タンパク質ドメインを融合すること
である。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインの目
的のタンパク質への融合は、融合タンパク質がグルタチオンアガロース（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．、１９９５カタログ）のアフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製されることを可能にする。目的のタンパク質が連続的なヒスチ
ジンの連続（例えば、Ｈｉｓ６）に融合される場合、融合タンパク質は、金属イ
オンを含むキレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）のアフィニティークロマト
グラフィーによって精製され得る。活性、溶解性、安定性などについてアミノ末
端融合体とカルボキシ末端融合体とを比較することがしばしば望まれる。

バクテリオファージλ組み込み系のａｔｔＢ部位を、ｌｏｘＰに対する代替物
として試験した。なぜなら、それらは小さく（２５ ｂｐ）、そしていくらかの
配列可撓性を有するからである（Ｎａｓｈ，Ｈ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４０４９−４０５３（１９８７））。全ての終
止コードを取り除く複数の変異により、組換えサブクローニングのための有用な
組換え部位を得るであろうことは以前には示唆されていなかった。

λバクテリオファージにおける部位特異的組換えのための標準的な表記（Ｗｅ
ｉｓｂｅｒ， Ｌａｍｂｄａ ＩＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ ＮＹ （１９８９））を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ宿主細胞における組
換え反応に関与する核酸領域を以下に示す：

ここで：Ｏは、ファージおよびＥ． ｃｏｌｉゲノムの両方に見出される１５
ｂｐコアＤＮＡ配列を示す；ＢおよびＢ’は、Ｅ． ｃｏｌｉゲノム中のコアに
隣接する約５塩基を示す；およびＰ１、Ｈ１、Ｐ２、Ｘ、Ｈ２、Ｃ、Ｃ’、Ｈ’
、Ｐ’１、Ｐ’２、およびＰ’３は、バクテリオファージλゲノム中のタンパク
質結合ドメインをコードする公知のＤＮＡ配列を示す。
反応は、タンパク質Ｘｉｓ（エキシジョナーゼ）の存在下で可逆的であり；ａ
ｔｔＬとａｔｔＲとの間の組換えは、その組み込まれた状態からλゲノムを正確
に切り出し、ａｔｔＰ、およびａｔｔＢを含む直鎖状Ｅ． ｃｏｌｉゲノムを含
む環状λゲノムを再生する。

（パートＩＩ：変異体ａｔｔ部位を含むプラスミドの構築および試験）
変異体ａｔｔＬ部位および変異体ａｔｔＲ部位を構築した。重要なことに、Ｌ
ａｎｄｙら（Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５８：９１３ （１９８
９））は、ａｔｔＰのＰ１およびＨ１ドメインの欠失が、切り出し反応を促進し
、そして組み込み反応を除去し、その結果切り出し反応を不可逆的にさせること
を観察した。従って、変異がａｔｔＲに導入されて、Ｐ１およびＨ１ドメインも
また欠失されたので、本実施例におけるａｔｔＲ部位は、Ｐ１領域およびＨ１領
域を欠き、そして取り除かれたＮｄｅＩ部位を有し（塩基２７６３０をＣからＧ
に改変した）、そしてバクテリオファージ座標２７６１９〜２７７３８（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ ｒｅｌｅａｓｅ ９２．０，ｂｐ：ＬＡＭＣＧ、「バクテリオファー
ジλの完全な配列」）に対応する配列を含む。

野生型ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位の組換えによって産生されるａｔｔＢの配
列は以下のとおりである：

終止コドンを斜体にし、そして下線を引いた。ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、およびａｔ
ｔＰの配列はａｔｔＢ配列に由来し得、そしてバクテリオファージλの境界は、
ａｔｔＬおよびａｔｔＲ内（座標２７６１９〜２７８１８）に含まれたことに留
意のこと。

変異体ａｔｔＲ１部位およびａｔｔＬ１部位を組み換えた場合、配列ａｔｔＢ
１が産生された（変異を太字の、大きな文字で表す）：

４つの終止コドンが消失していることに留意のこと。

ａｔｔＲ１配列およびａｔｔＬ１配列（太字）にさらなる変異を導入した場合
、ａｔｔＲ２部位およびａｔｔＬ２部位を得た。ａｔｔＲ２およびａｔｔＬ２の
組換えは、ａｔｔＢ２部位を産生した：

上記のａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位の組換え活性を以下のようにアッセイ
した。プラスミドｐＥＺＣ７０５のａｔｔＢ部位（図２Ｂ）を、ａｔｔＬｗｔ、
ａｔｔＬ１、またはａｔｔＬ２と置換した。プラスミドｐＥＺＣ７２６のａｔｔ
Ｐ部位（図２Ｃ）を、ａｔｔＲｗｔ（Ｐ１およびＨ１領域を欠く）、ａｔｔＲ１
、またはａｔｔＲ２と置換した。従って、得られたプラスミドは、 Ｃｒｅによ
って媒介されて、それらのｌｏｘＰ部位を介して組換え得、そしてＩｎｔ、Ｘｉ
ｓ、およびＩＨＦによって媒介されて、それらのａｔｔＲ部位およびａｔｔＬ部
位を介して組換え得る。プラスミドの対を、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩ
ＨＦと混合しそして反応させ、Ｅ． ｃｏｌｉコンピテント細胞に形質転換し、
そしてカナマイシンを含有する寒天上にプレートした。結果を表３に示す：

上記のデータは、野生型ａｔｔ部位およびａｔｔ１部位は低い程度に組換えた
が、ａｔｔ１部位およびａｔｔ２部位は互いに検出可能には組換えないことをを
示す。

（パートＩＩＩ：目的のＤＮＡセグメントに隣接する両方のａｔｔＢ部位のコ
ア領域が終止コドンを含まない場合の、組換えが示された。）
関与するプラスミドの物理的な状態が、組換え効率に影響することが見出され
た。

適切なａｔｔ部位を、ｐＥＺＣ７０５およびｐＥＺＣ７２６中に移動し、プラ
スミドｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）（ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２）ならびにｐ
ＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）（ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２）を作製した。本実験
における所望のＤＮＡセグメントは、ｐＥＺＣ１５０２の２つのａｔｔＬ部位の
間にクローン化されたクロラムフェニコール耐性遺伝子のコピーであった。プラ
スミドの対を、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦ（ｌｏｘＰ部位が存在しなかった
のでＣｒｅはなし）を用いてインビトロで組換えた。表４に示すように、親プラ
スミドの両方が環状である場合、または一方のプラスミドが環状でありかつ他方
が直鎖状の場合に、所望のカナマイシン耐性コロニーの収率を決定した：

分析：変異体ａｔｔＲ部位および変異体ａｔｔＬ部位を用いる組換えクローニン
グを確認した。所望のＤＮＡセグメントは、いずれの鎖においても終止コドンを
全く含まないａｔｔＢ部位の間にサブクローン化される。両方の関与する分子が
超らせん状であり、そしてタンパク質が制限されている場合、切り出し反応がよ
り効率的であった初期の観察のために、（一方の親が直鎖状の場合の）産物ＤＮ
Ａの増大した収率は、予想外であった（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら、Ｃｅｌｌ ５
０：７７９−７８８（１９８７））。

（実施例４：逆方向反復を有さない組換えクローニングの実証）
（パートＩ：原理）
上記実施例３は、適切な組換え部位の逆方向反復を含むプラスミド（例えば、
プラスミドｐＥＺＣ１５０２中のａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２）（図５Ｈ）が、
組換えて、これも逆方向で終止コドンを有さないａｔｔＢ部位によって隣接され
る所望のＤＮＡセグメントが得られ得ることを示した。逆方向反復のインビボお
よびインビトロでの影響が危惧された。例えば、逆方向でａｔｔＢ部位によって
隣接される所望のＤＮＡセグメントの転写は、ヘアピン構造を形成し得る一本鎖
ＲＮＡ分子を生じ、その結果、翻訳を阻害し得る。

類似の組換え部位の逆方向を、部位を直列反復配置のａｔｔ部位に配置するこ
とにより回避し得る。親プラスミドの各々が野生型ａｔｔＬ部位および野生型ａ
ｔｔＲ部位を直列反復で有する場合、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦタンパク質
は、分子内反応においてそれらの部位によって隣接されるＤＮＡセグメントを単
に取り除く。しかし、上記の実施例３に記載の変異体部位は、分子内組換えを所
望のように進行させながら、分子内反応を阻害することが可能であり得ることを
示唆した。
パートＩＩ：組換えクローニングのための逆方向反復を有さないプラスミドの構
造
プラスミドｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）中のａｔｔＲ２配列を、反対方向での
ａｔｔＬ２と置換し、ｐＥＺＣ１６０３（図６Ａ）を作製した。ｐＥＺＣ１５０
２（図５Ｈ）のａｔｔＬ２配列を、反対方向でのａｔｔＲ２と置換し、ｐＥＺＣ
１７０６（図６Ｂ）を作製した。これらのプラスミドの各々は、ａｔｔ１コアと
ａｔｔ２コアの間の分子内反応を非常に非効率的にするコア領域中の変異を含ん
だ（実施例３、上記を参照のこと）。

プラスミドｐＥＺＣ１４０５、ｐＥＺＣ１５０２、ｐＥＺＣ１６０３およびｐ
ＥＺＣ１７０６を、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）で精製した
。プラスミドｐＥＺＣ１４０５およびｐＥＺＣ１６０３のアリコートを、Ｘｂａ
Ｉを用いて直鎖化した。プラスミドｐＥＺＣ１５０２およびｐＥＺＣ１７０６の
アリコートを、ＡｌｗＮＩを用いて直鎖化した。１００ｎｇのプラスミドを、Ｉ
ｎｔ（４３．５ｎｇ）、Ｘｉｓ（４．３ｎｇ）、およびＩＨＦ（８．１ｎｇ）を
含む最終容量１０μｌの緩衝液（等容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７
．５）、２５ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ
スペルミジン、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０％グリ
セロール）中で混合した。反応物を２５℃で４５分間、６５℃で１０分間インキ
ュベートし、そして１μｌをＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。発現後
、アリコートを、２００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天プレート上に
広げ、そして３７℃でインキュベートした。

コロニー数／１μｌの組換え反応物として表現した結果を表５に示す：

分析：全ての配置において（すなわち、環状または直鎖状）、ｐＥＺＣ１４０
５×ｐＥＺＣ１５０２対（逆方向反復配置でのａｔｔ部位を有する）は、ｐＥＺ
Ｃ１６０３×ｐＥＺＣ１７０６対（ヘアピン形成を回避するために変異されたａ
ｔｔ部位を有する）よりもより効率的であった。ｐＥＺＣ１６０３×ｐＥＺＣ１
７０６対は、ｐＥＺＣ１４０５×ｐＥＺＣ１５０２対より高いバックグラウンド
およびより低い効率を与えた。より低い効果であるが、ｐＥＺＣ１６０３×ｐＥ
ＺＣ１７０６反応由来の８０％以上のコロニーが、所望のプラスミド産物を含む
と予想された。１つのパートナーを直鎖状にすることが、全ての場合において反
応を刺激した。

（パートＩＩＩ：産物プラスミドの構造の確認）
直鎖状ｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）×環状ｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）、環状
ｐＥＺＣ１４０５×直鎖状ｐＥＺＣ１５０２、直鎖状ｐＥＺＣ１６０３（図６Ａ
）×環状ｐＥＺＣ１７０６（図６Ｂ）、および環状ｐＥＺＣ１６０３×直鎖状ｐ
ＥＺＣ１７０６反応由来の各々６個のコロニーを、富化培地にひろい、そしてミ
ニプレップＤＮＡを調製した。Ｓｓｐ Ｉを用いる診断的切断により、２４個の
コロニーについて予想される制限フラグメントを得た。

分析：同一の分子上の変異体ａｔｔＬ部位および変異体ａｔｔＲ部位を有する
プラスミド間の組換え反応により、高い程度の特異性を有して、所望のプラスミ
ド産物を得た。

（実施例５：毒性遺伝子を用いる組換えクローニング）
（パートＩ：背景）
制限酵素Ｄｐｎ Ｉは、配列ＧＡＴＣを認識し、そしてＡがｄａｍメチラーゼ
によってメチル化された場合のみ、この配列を切断する。大部分の一般的に使用
されるＥ． ｃｏｌｉ株は、ｄａｍ^＋である。細胞の染色体が多数の断片に切断
されるので、Ｅ． ｃｏｌｉのｄａｍ^＋株におけるＤｐｎ Ｉの発現は致死性で
ある。しかし、ｄａｍ⁻細胞において、Ｄｐｎ Ｉの発現は無害である。なぜな
ら染色体は、Ｄｐｎ Ｉ切断に対して免疫性であるからである。

ベクタードナーが、組換え部位によって分離される２つのセグメントＣおよび
Ｄを含む一般的な組換えクローニングスキームにおいて、所望の産物の選択は、
セグメントＤの存在およびセグメントＣの非存在についての選択に依存する。元
の実施例において、セグメントＤは、セグメントＣ上に見出されるリプレッサー
遺伝子によってネガティブに制御される薬剤耐性遺伝子（Ｋｍ）を含んだ。Ｃが
存在する場合、Ｄを含む細胞は、耐性遺伝子がオフになっていたのでカナマイシ
ンに対して耐性ではなかった。

Ｄｐｎ Ｉ遺伝子は、上記実施態様のリプレッサー遺伝子を置換し得る毒性遺
伝子の例である。セグメントＣがＤｐｎ Ｉ遺伝子産物を発現するする場合、ｄ
ａｍ^＋宿主へのプラスミドＣＤの形質転換は細胞を死滅させる。セグメントＤを
、例えば組換えクローニングによって新しいプラスミド移入する場合、毒性遺伝
子がもはや存在しないので、薬剤マーカーについての選択は成功する。

（パートＩＩ：毒性遺伝子としてＤｐｎ Ｉを用いるベクタードナーの構築）
Ｄｐｎ Ｉエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を、プライマー５’ＣＣＡ
ＣＣＡ ＣＡＡ ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＡＣ ＡＣＴ
ＴＴＡ ＡＴＴ ＴＡＧ３’（配列番号１７）および５’ＣＣＡ ＣＣＡ Ｃ
ＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＧＡ ＣＡＧ ＣＣＴ ＴＣＣ Ａ
ＡＡ ＴＧＴ３’（配列番号１８）ならびに鋳型としてＤｐｎ Ｉ遺伝子を含む
プラスミド（Ｓａｎｆｏｒｄ Ａ．Ｌａｃｋｓ， Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手
したプラスミド由来であり；またＡＴＣＣ ６７４９４としてアメリカンタイプ
カルチャーコレクションから入手可能である）を用いるＰＣＲによって増幅した
。

さらなる変異を、所望の塩基変化を含むプライマーを用いる既存のａｔｔＬド
メインおよびａｔｔＲドメインを増幅することによって、それぞれ、ａｔｔＬお
よびａｔｔＲのＢ領域およびＢ’領域に導入した。変異体ａｔｔＬ３（オリゴＸ
ｉｓ１１５を用いて作製された）およびａｔｔＲ３（オリゴＸｉｓ１１２を用い
て作製された）の組換えにより、以下の配列（太字がａｔｔＢ１と異なる）を有
するａｔｔＢ３を得た：

既存の遺伝子ドナープラスミドのａｔｔＬ２の代わりにａｔｔＬ３配列をクロー
ン化し、プラスミドｐＥＺＣ２９０１を得た（図７Ａ）。既存のベクタードナー
プラスミドのａｔｔＲ２の代わりにａｔｔＲ３配列をクローン化し、プラスミド
ｐＥＺＣ２９１３を得た（図７Ｂ）。ＤｐｎＩ遺伝子をプラスミドｐＥＺＣ２９
１３にクローン化して、ｔｅｔリプレッサー遺伝子を置換した。得られたベクタ
ードナープラスミドをｐＥＺＣ３１０１と名付けた（図７Ｃ）。ｐＥＺＣ３１０
１をｄａｍ⁻ＳＣＳ１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した場合、数
百のコロニーを得た。同じプラスミドをｄａｍ^＋ＤＨ５α株に形質導入した場合
、たとえＤＨ５α細胞がＳＣＳ１１０細胞より約２０倍コンピテントであっても
、ほんの１コロニーを生じただけであった。Ｄｐｎ Ｉ遺伝子を含まない関連す
るプラスミドを同じの２つの細胞株に形質転換した場合、ＤＨ５α細胞から４４
８のコロニーが得られたが、ＳＣＳ１１０細胞からは２８個のコロニーが生じた
。これは、Ｄｐｎ Ｉ遺伝子がプラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）上で発現
され、そしてｄａｍ^＋ＤＨ５α細胞を死滅させるが、ｄａｍ⁻ＳＣＳ１１０細胞
を死滅させないという証拠である。

（パートＩＩＩ：Ｄｐｎ Ｉ選択を用いる組換えクローニングの実証）
プラスミド対を使用し、毒性遺伝子Ｄｐｎ Ｉに依存する産物についての選択
を用いる組換えクローニングを示した。プラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）
を、Ｍｌｕ Ｉを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミドｐＥＺＣ２９０１（
図７Ａ）と反応させた。リプレッサー遺伝子による薬剤耐性の制御に基づく選択
を用いるプラスミドの第２の対を、コントロールとして使用した：プラスミドｐ
ＥＺＣ１８０２（図７Ｄ）を、Ｘｂａ Ｉを用いて直鎖状にし、そして環状プラ
スミドｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）と反応させた。以前の実施例におけると同一
の緩衝液ならびにタンパク質Ｘｉｓ、Ｉｎｔ、およびＩＨＦを含む８マイクロリ
ットルの反応物を、２５℃で４５分間、次いで７５℃で１０分間インキュベート
し、そして１μｌアリコートを、表６に示すようにＤＨ５α（すなわち、ｄａｍ
^＋）コンピテント細胞に形質転換した。

ミニプレップＤＮＡを、反応＃２由来の４つのコロニーから調製し、そして制
限酵素Ｓｓｐ Ｉを用いて切断した。全てから予想されるフラグメントを得た。

分析：毒性遺伝子を用いる選択を用いるサブクローニングを示した。予想され
る構造のプラスミドを産生した。

（実施例６：融合タンパク質作製のための、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを
用いる遺伝子のクローニングおよび組換えクローニングを用いる遺伝子のサブク
ローニング）
（パートＩ：既存の発現ベクターの組換えクローニングのためのベクタードナ
ーへの変換）
既存のベクターの機能的ベクタードナーへの変換に有用なカセットを、以下の
ように作製した。プラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）を、Ａｐａ Ｉおよび
Ｋｐｎ Ｉを用いて消化し、末端を平滑にするためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
およびｄＮＴＰで処理し、所望でないＤＮＡフラグメントを小さくするためにＳ
ｍａ Ｉ、ＨｐａＩ、およびＡｌｗＮ Ｉを用いてさらに消化し、そしてａｔｔ
ＲＩ−Ｃｍ^Ｒ−Ｄｐｎ Ｉ−ａｔｔＲ−３ドメインを含む２．６ｋｂカセットを
ゲル精製した。精製されたカセットの濃度を、約７５ｎｇＤＮＡ／μｌであると
評価した。

プラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫ（図８Ａ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、タンパク
質グルタチオンＳトランスフェラーゼと、そのマルチクローニング部位に挿入さ
れ得る任意の第２のコード配列との間の融合を可能にする。ｐＧＥＸ−２ＴＫ
ＤＮＡを、Ｓｍａ Ｉを用いて消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理し
た。約７５ｎｇの上記の精製ＤＮＡカセットを、約１００ｎｇのｐＧＥＸ−２Ｔ
Ｋベクターと５μｌ連結物中で２．５時間連結し、次いで、１μｌをコンピテン
トＢＲＬ３０５６細胞（ＤＨ１０Ｂのｄａｍ⁻誘導体；市販のｄａｍ⁻株は、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，由来のＤＭ１およびＳｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ由来のＳＣＳ１１０を含む）に形質転換した。形質転換混合物のアリ
コートを、１００μｌ／ｍｌアンピシリン（耐性遺伝子は、ｐＧＥＸ−２ＴＫ上
に存在する）および３０μｌ／ｍｌクロラムフェニコール（耐性遺伝子は、ＤＮ
Ａカセット上に存在する）を含有するＬＢ寒天上にプレートした。コロニーをひ
ろい、そしてミニプレップＤＮＡを作製した。ｐＧＥＸ−２ＴＫ中のカセットの
方向を、ＥｃｏＲ Ｉを用いる診断的切断によって決定した。所望の方向を有す
るプラスミドを、ｐＥＺＣ３５０１（図８Ｂ）と名付けた。

（パートＩＩ：３つのリーディングフレームでのレポーター遺伝子の組換えク
ローニング遺伝子ドナープラスミドへのクローニング）
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）クローニングは、クローニングベク
ターへＰＣＲ増幅産物をクローニングするための方法である（米国特許第５，３
３４，５１５号、本明細書中でその全体が参考として援用される）。簡単に述べ
れば、所望のＤＮＡセグメントのＰＣＲ増幅を、それらの５’末端にチミジン塩
基の代わりにウラシル塩基を含むプライマーを用いて実施する。このようなＰＣ
Ｒ産物を酵素ＵＤＧと共にインキュベートする場合、ウラシル塩基は特異的に取
り除かれる。これらの塩基の欠損は、ＰＣＲ産物ＤＮＡの末端における塩基対合
を弱め、そして適切な温度（例えば、３７℃）でインキュベートした場合、この
ような産物の末端は、主として一本鎖化される。ＰＣＲ産物の３’末端に相補的
である突出した３’テールを含む直鎖状クローニングベクターの存在下でこのよ
うなインキュベーションを行った場合、塩基対合は、効率的にクローニングベク
ターにＰＣＲ産物をアニーリングする。アニーリングされた産物を、形質転換に
よってＥ． ｃｏｌｉ細胞に導入した場合、インビボプロセスは、効率的にそれ
を組換えプラスミドに変換する。

３つ全てのリーディングフレームでの任意のＰＣＲ産物のクローニングを可能
にするＵＤＧクローニングベクターをｐＥＺＣ３２０１（図８Ｋ）から以下のよ
うに調製した。８つのオリゴヌクレオチドが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．から得られた（全て５’→３’で記載される：ｒｆ１ 上部（Ｇ
ＧＣＣ ＧＡＴ ＴＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＡＡ
ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＴ）（配列番号１９）、ｒｆ１
下部（ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＧＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ
ＧＴＡ ＡＴＣ）（配列番号２０）、ｒｆ２ 上部（ＧＧＣＣＡ ＧＡＴ ＴＡ
Ｃ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡ
Ｔ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＴ）（配列番号２１、ｒｆ２ 下部（ＣＡＧ ＧＴＴ
ＴＴＣ ＧＧＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＴＣＴ）（配
列番号２３）、ｒｆ３ 上部（ＧＧＣＣＡＡ ＧＡＴ ＴＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ
ＣＣＡ ＡＣＧ ＡＣＣ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＡＧ
ＧＧＴ）（配列番号２３）、ｒｆ３ 下部（ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＴＣ ＧＧＴ
ＣＧＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＴＡ ＡＴＣ ＴＴ）（配列番号２４）
、カルボキシ上部（ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＡＣ ＧＴＧ ＧＡＴ）（配列番号２５
）、およびカルボキシ下部（ＴＣＧＡ ＧＴＣ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＡＣ ＧＧ
Ｔ ＴＣＣ ＣＡＣ ＴＴＡ ＴＴＡ）（配列番号２６））。ｒｆ１、２および
３上部鎖ならびにカルボキシ下部鎖を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
その５’末端上でリン酸化し、次いで各対の相補的な鎖をハイブリダイズした。
プラスミドｐＥＺＣ３２０１（図８Ｋ）をＮｏｔ ＩおよびＳａｌ Ｉを用いて
切断し、そして切断プラスミドのアリコートをカルボキシ−オリゴ二重鎖（Ｓａ
ｌ Ｉ末端）およびｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３二重鎖のいずれか（Ｎｏｔ
Ｉ末端）と混合した（２５０ｐｍｏｌカルボキシオリゴ二重鎖と１０μｌ（約５
ｐｍｏｌ）切断プラスミドとを混合し、３つの２０μｌ容積に分割し、ｒｆ１、
ｒｆ２、またはｒｆ３二重鎖の５μｌ（２５０ｐｍｏｌ）および２μｌ＝２単位
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを各反応物に添加した）。室温での９０分の連結後、各反
応物を調製用アガロースゲルに供し、そして２．１ｋｂのベクターバンドを溶出
し、そして５０μｌのＴＥに溶解した。
パートＩＩＩ：ＣＡＴおよびｐｈｏＡ遺伝子のＰＣＲ
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子およびＥ． ｃｏｌｉ由来のアルカリホスファターゼ
遺伝子であるｐｈｏＡを増幅するために、プライマーをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．，から得た。プライマーは、ウラシル塩基を含む１２
塩基５’伸長を有し、その結果ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）でのＰ
ＣＲ産物の処理は、ＤＮＡの各末端での塩基対合を弱め、そして３’鎖が上記の
ｒｆ１、ｒｆ２、およびｒｆ３ベクターの突出す３’末端とのアニーリングを可
能にする。プライマーの配列（全て５’→３’で記載）は以下のとおりであった
：ＣＡＴ左、ＵＡＵ ＵＵＵ ＣＡＧ ＧＧＵ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＡ
Ａ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＡＴ ＡＣＣ（配列番号２７）；ＣＡＴ右、Ｕ
ＣＣ ＣＡＣ ＵＵＡ ＵＵＡ ＣＧＣ ＣＣＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＣＡ Ｃ
ＴＣ ＡＴＣ（配列番号２８）；ｐｈｏＡ左、ＵＡＵ ＵＵＵ ＣＡＧ ＧＧＵ
ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＧＧ（配列番号２９）
；およびｐｈｏＡ右、ＵＣＣ ＣＡＣ ＵＵＡ ＵＵＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＣ
Ｃ ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＴＴＴ Ｃ（配列番号３０）。次いで、プライマ
ーを公知の方法工程（例えば、米国特許第５，３３４，５１５号（これは本明細
書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）を用いるＰＣＲ反応の
ために使用し、そしてこれらのプライマーを用いて得られたポリメラーゼ連鎖反
応増幅産物は、開始ＡＴＧを有するがいかなる転写シグナルも有さないＣＡＴま
たはｐｈｏＡ遺伝子を含んだ。さらに、アミノ末端上のウラシル含有配列は、Ｔ
ＥＶプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の切断部
位をコードし、そしてカルボキシ末端上のウラシル含有配列は、連続的なＴＡＡ
ナンセンスコドンをコードした。

非精製ＰＣＲ産物（約３０ｎｇ）を、１×ＲＥａｃｔ４緩衝液（ＬＴＩ）およ
び１単位のＵＤＧ（ＬＴＩ）を含む１０μｌの反応物中で、ゲル精製された、直
鎖状ｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３クローニングベター（約５０ｎｇ）と混合し
た。３７℃での３０分後、各反応の１μｌアリコートを、コンピテントＥ． ｃ
ｏｌｉ ＤＨ５α細胞（ＬＴＩ）に形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのカナマ
イシンを含有する寒天上にプレートした。コロニーをひろい、そしてミニプレッ
プＤＮＡの分析は、ＣＡＴ遺伝子が、リーディングフレーム１（ｐＥＺＣ３６０
１）（図８Ｃ）、リーディングフレーム２（ｐＥＺＣ３６０９）（図８Ｄ）、お
よびリーディングフレーム３（ｐＥＺＣ３６１７）（図８Ｅ）でクローン化され
、そしてｐｈｏＡ遺伝子が、リーディングフレーム１（ｐＥＺＣ３６０６）（図
８Ｆ）、リーディングフレーム２（ｐＥＺＣ３６１３）（図８Ｇ）、およびリー
ディングフレーム３（ｐＥＺＣ３６２１）（図８Ｈ）でクローン化されたことを
示した。
パートＩＶ：ＣＡＴまたはｐｈｏＡのＵＤＧクローニングベクターからＧＳＴ融
合ベクターへのサブクローニング
３つ全てのリーディングフレームでのＧＳＴとＣＡＴまたはｐｈｏＡのいずれ
かとの間の融合物をコードするプラスミドを、以下の組換えクローニングによっ
て構築した。ＧＳＴベクタードナーｐＥＺＣ３５０１（図８Ｂ）（上記のＰｈａ
ｒｍａｃｉａプラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫ由来）のミニプレップＤＮＡを、Ｃｌ
ａ Ｉを用いて直鎖状にした。約５ｎｇのベクタードナーを、緩衝液および組換
えタンパク質Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦ（上記）を含む８μｌの反応物中、
ＣＡＴまたはｐｈｏＡを含む各約１０ｎｇの適切な環状遺伝子ドナーベクターと
混合した。インキュベーション後、１μｌの各反応物を、Ｅ． ｃｏｌｉＤＨ５
α株に形質転換し、そして表７に示すようにアンピシリン上にプレートした。

（パートＶ：融合タンパク質の発現）
各形質転換由来の２つのコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
する１７×１００ｍｍのプラスチックチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９，Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中の２ｍｌのリッチ培地（ＣｉｒｃｌｅＧｒｏ
ｗ， Ｂｉｏ１０１ Ｉｎｃ．）中にひろい、そして３７℃で約４時間強く振盪
し、その時培養物は視覚的に濁っていた。１ｍｌの各培養物を、ＧＳＴの発現を
誘導するために１０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＩＰＴＧを含む新しいチューブに移
した。さらなる２時間のインキュベーション後、全ての培養物は、ほぼ同じ濁度
を有した；１つの培養物のＡ６００は、１．５であった。０．３５ｍｌの各培養
物由来の細胞を回収し、そしてサンプル緩衝液（ＳＤＳおよびβ−メルカプトエ
タノールを含む）で処理し、そして細胞の約０．１５ Ａ６００単位に等価なア
リコートを、Ｎｏｖｅｘ ４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルに供した。電
気泳動後、ゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。

結果：単一のタンパク質のバンドの増大した発現は、１２の培養物の全てで見
出された。これらのタンパク質の観察されたサイズは、３つのリーディングフレ
ームでＣＡＴまたはｐｈｏＡに（終止コドンを含まないａｔｔＢ組換え部位を介
して）融合されたＧＳＴの予想したサイズと良く一致した：ＣＡＴ ｒｆ１＝２
６９アミノ酸；ＣＡＴ ｒｆ２＝３０３アミノ酸；ＣＡＴ ｒｆ３＝４７８アミ
ノ酸；ｐｈｏＡ ｒｆ１＝２８２アミノ酸；ｐｈｏＡ ｒｆ２＝２８０アミノ酸
；およびｐｈｏＡ ｒｆ３＝７０５アミノ酸。

分析：ＣＡＴおよびｐｈｏＡ遺伝子の両方を、３つ全てのリーディングフレー
ムでＧＳＴ融合ベクターにサブクローン化し、そして６つの融合タンパク質の発
現を示した。

上記発明は、明瞭化および理解の目的で幾らか詳細に記載されているが、形式
および詳細における種々の変化が、本発明および添付の請求の範囲の真の範囲か
ら逸脱することなくなされ得ることが、本開示の解釈から当業者によって認識さ
れる。本明細書中で引用された全ての特許および刊行物は、本明細書中にその全
てが参考として援用される。

（発明の効果）
組換えクローニングが、所望の特性（単数もしくは複数）および／またはＤＮ
Ａセグメント（単数もしくは複数）を有するキメラＤＮＡ分子を提供するための
操作された組換え部位および組換えタンパク質を用いてＤＮＡ分子のセグメント
を移動または交換するための、インビトロおよびインビボにおける、核酸、ベク
ターおよび方法の使用により、提供される。
（配列表）

図１は、本明細書の１つの一般的な方法を示す。ここで、開始（親）ＤＮＡ分子は、環状または直鎖状であり得る。目標は、新たなサブクローニングベクターＤをもとのクローニングベクターＢと交換することである。１つの実施態様において、ＡＤについて、およびすべての他の分子（コインテグレートを含む）に対して選択することが所望される。四角および丸は、組換えの部位（例えば、ｌｏｘＰ部位、ａｔｔ部位など）である。例えば、セグメントＤは、発現シグナル、新たな薬剤マーカー、新たな複製起点、またはマッピングもしくはＤＮＡ配列決定のための特殊化された機能を含み得る。 図２Ａは、インサートドナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ７０５）をベクタードナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ７２６）と組換え、そして産物ＤＮＡおよび副産物娘分子を得るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、ベクタードナー上のａｔｔＰおよびｌｏｘＰである。これらの部位により規定される１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。Ｓｉｚｅｍｏｒｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８（１０）：２８７５ （１９９０）を参照のこと。ｔｅｔリプレッサータンパク質の非存在下において、Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。ｐＥＺＣ７２６の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリプレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ７２６により形質転換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。リコンビナーゼ媒介性反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の、調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。第１の組換え反応はインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの添加により駆動される。第２の組換え反応はリコンビナーゼＣｒｅをコインテグレート（ここでは、ｐＥＺＣ７ Ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）へ添加することにより駆動される。 図２Ｂは、ｐＥＺＣ７０５の制限地図を示す。 図２Ｃは、ｐＥＺＣ７２６の制限地図を示す。 図２Ｄは、ｐＥＺＣ７ Ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅの制限地図を示す。 図２Ｅは、Ｉｎｔｐｒｏｄの制限地図を示す。 図２Ｆは、Ｉｎｔｂｙｐｒｏの制限地図を示す。 図３Ａは、インサートドナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ６０２）をベクタードナープラスミド（ここでは、ｐＥＺＣ６２９）と組換え、そして産物（ここでは、ＥＺＣ６ｐｒｏｄ）および副産物（ここでは、ＥＺＣ６Ｂｙｐｒ）娘分子を得るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ ５１１である。これらの部位により規定されるｐＥＺＣ６２９の１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。ｔｅｔリプレッサータンパク質の非存在下において、Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。ｐＥＺＣ６２９の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリプレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ６２９により形質転換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の、調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。第１および第２の組換え事象は、同じリコンビナーゼＣｒｅの添加により駆動される。 図３Ｂは、ＥＺＣ６Ｂｙｐｒの制限地図を示す。 図３Ｃは、ＥＺＣ６ｐｒｏｄの制限地図を示す。 図３Ｄは、ｐＥＺＣ６０２の制限地図を示す。 図３Ｅは、ｐＥＺＣ６２９の制限地図を示す。 図３Ｆは、ＥＺＣ６ｃｏｉｎｔの制限地図を示す。 図４Ａは、組換えクローニングのインビトロ方法の、真核生物細胞における発現のために、ベクター中へクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をサブクローン化するための適用を示す。インサートドナープラスミドｐＥＺＣ８４３は、ｌｏｘＰ部位が遺伝子の５’末端に位置するようにｌｏｘＰ部位とａｔｔＢ部位との間にクローン化されたＥ． ｃｏｌｉのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ベクタードナープラスミドｐＥＺＣ１００３は、ｌｏｘＰ部位に並置されたサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含む。超らせんプラスミドをλインテグラーゼおよびＣｒｅリコンビナーゼとインビトロで組み合わせた。インキュベーション後、コンピテントなＥ． ｃｏｌｉ細胞を組換え反応溶液を用いて形質転換した。形質転換のアリコートをカナマイシンを含有する寒天プレート上に広げて、産物分子（ここでは、ＣＭＶＰｒｏｄ）を選択した。 図４Ｂは、ｐＥＺＣ８４３の制限地図を示す。 図４Ｃは、ｐＥＺＣ１００３の制限地図を示す。 図４Ｄは、ＣＭＶＢｙｐｒｏの制限地図を示す。 図４Ｅは、ＣＭＶＰｒｏｄの制限地図を示す。 図４Ｆは、ＣＭＶｃｏｉｎｔの制限地図を示す。 図５Ａは、ｐＥＺＣ１３０１の制限地図を示す。 図５Ｂは、ｐＥＺＣ１３０５の制限地図を示す。 図５Ｃは、ｐＥＺＣ１３０９の制限地図を示す。 図５Ｄは、ｐＥＺＣ１３１３の制限地図を示す。 図５Ｅは、ｐＥＺＣ１３１７の制限地図を示す。 図５Ｆは、ｐＥＺＣ１３２１の制限地図を示す。 図５Ｇは、ｐＥＺＣ１４０５の制限地図を示す。 図５Ｈは、ｐＥＺＣ１５０２の制限地図を示す。 図６Ａは、ｐＥＺＣ１６０３の制限地図を示す。 図６Ｂは、ｐＥＺＣ１７０６の制限地図を示す。 図７Ａは、ｐＥＺＣ２９０１の制限地図を示す。 図７Ｂは、ｐＥＺＣ２９１３の制限地図を示す。 図７Ｃは、ｐＥＺＣ３１０１の制限地図を示す。 図７Ｄは、ｐＥＺＣ１８０２の制限地図を示す。 図８Ａは、ｐＧＥＸ−２ＴＫの制限地図を示す。 図８Ｂは、ｐＥＺＣ３５０１の制限地図を示す。 図８Ｃは、ｐＥＺＣ３６０１の制限地図を示す。 図８Ｄは、ｐＥＺＣ３６０９の制限地図を示す。 図８Ｅは、ｐＥＺＣ３６１７の制限地図を示す。 図８Ｆは、ｐＥＺＣ３６０６の制限地図を示す。 図８Ｇは、ｐＥＺＣ３６１３の制限地図を示す。 図８Ｈは、ｐＥＺＣ３６２１の制限地図を示す。 図８Ｉは、ＧＳＴ−ＣＡＴの制限地図を示す。 図８Ｊは、ＧＳＴ−ｐｈｏＡの制限地図を示す。 図８Ｋは、ｐＥＺＣ３２０１の制限地図を示す。

Claims (1)

1. 核酸分子であって、以下：
   （ａ）ＲＫＹＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＳＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔ）（配列番号１）；
   （ｂ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＢ）（配列番号２）；
   （ｃ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＲ）（配列番号３）；
   （ｄ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＬ）（配列番号４）；
   （ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＰｌ）（配列番号５）；および
   対応するかまたは相補的なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、
   からなる群より選択される核酸配列を含み、ここでＲ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；そしてＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；
   である、核酸分子。

Images