JP2003299487A

JP2003299487A - 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング

Info

Publication number: JP2003299487A
Application number: JP2002331431A
Authority: JP
Inventors: James L Hartley; エル．ハートレイジェイムズ; Michael A Brasch; エイ．ブラッシュマイケル
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 2002-11-14
Publication date: 2003-10-21
Also published as: EP1229113A2; ES2181900T3; US6270969B1; NZ500843A; EP1227147A2; EP1229113A3; JP2007306931A; WO1996040724A1; HK1019068A1; PT937098E; NZ312332A; EP0937098B1; US6171861B1; JP2009100776A; CA2226463A1; DE69623057D1; JPH11507236A; JP4020429B2; ATE222289T1; AU724922B2

Abstract

(57)【要約】【課題】インビトロおよびインビボにおいて、ＤＮ
Ａ、ベクターおよび方法を使用する方法を用いて、所望
の特性および／あるいはＤＮＡセグメントを有するキメ
ラＤＮＡ分子を提供することにある。【解決手段】第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤ
ＮＡセグメントを含むベクタードナーＤＮＡ分子であっ
て、該第１のＤＮＡセグメントまたは該第２のＤＮＡセ
グメントは少なくとも１つの選択マーカーを含み、ここ
で該第１のセグメントおよび該第２のセグメントは、
（ｉ）環状ベクタードナーにおいては、第１の組換え
部位および第２の組換え部位により、または（ｉｉ）
直鎖状ベクタードナーにおいては、少なくとも第１の組
換え部位により、のいずれかで分離され、ここで隣接す
る組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換
えない、ベクタードナーＤＮＡ分子を提供することによ
って、課題を解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えＤＮＡ技術
に関する。操作された組換え部位を有するＤＮＡおよび
ベクターが、組換えタンパク質を用いるＤＮＡセグメン
トの効率的かつ特異的な組換えを可能にする組換えクロ
ーニング方法における使用のために提供される。このＤ
ＮＡ、ベクターおよび方法は、インビトロまたはインビ
ボにおける、ＤＮＡのサブクローニングのような種々の
ＤＮＡ交換のために有用である。

【０００２】

【従来の技術】（関連技術）部位特異的リコンビナー
ゼ。部位特異的リコンビナーゼは、いくつかのウイルス
および細菌において存在する酵素であり、そしてエンド
ヌクレアーゼ特性およびリガーゼ特性の両方を有すると
特徴付けられている。これらのリコンビナーゼは（いく
つかの場合においては会合タンパク質とともに）、ＤＮ
Ａ中の特異的塩基の配列を認識し、そしてそれらのセグ
メントに隣接するＤＮＡセグメントを交換する。リコン
ビナーゼおよび会合タンパク質は、集合的に「組換えタ
ンパク質」といわれる（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，
ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ３：６９９−７０７（１９９３）
を参照のこと）。

【０００３】種々の生物由来の多数の組換え系が記載さ
れている。例えば、Ｈｏｅｓｓら、ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１４（６）：２２８７
（１９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１）：３９１（１９８
６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７４（２３）：７４９５（１９９２）；Ｑ
ｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１
１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９
９２）；ＭａｅｓｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ（１
９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３
０：１７０−１７６。

【０００４】これらの多くは、リコンビナーゼのインテ
グラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢＯ
Ｊ．５：４３３−４４０（１９８６））。おそら
く、これらの中で最も十分に研究されたのは、バクテリ
オファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎ
ｄｙ．Ａ．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎ
ＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＤｅｖｅｌ．３：６９
９−７０７（１９９３））、バクテリオファージＰ１
由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅ
ｍｓｋｉ（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第４
巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌ
ｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ；９０−１０９頁）、およびＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ２μ環状プラス
ミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌ
ｌ２９：２２７−２３４（１９８２））である。

【０００５】これらの組換え系は特定の生物について特
徴付けられたが、関連技術は、インビボにおける組換え
について、組換え部位により隣接される組換えＤＮＡを
用いて教示されたのみである。

【０００６】Ｂａｃｋｍａｎ（米国特許第４，６７３，
６４０号）は、野生型組換え部位ａｔｔＢおよびａｔｔ
Ｐを用いる酵素的部位特異的組換えによりＤＮＡセグメ
ントを産生するタンパク質を組み換えるためのλリコン
ビナーゼのインビボにおける使用を開示する。

【０００７】ＨａｓａｎおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ（Ｇ
ｅｎｅ５６：１４５−１５１（１９８７））は、プ
ロモーターに隣接する野生型ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部
位との間の分子内組換えのためのインビボにおけるλＩ
ｎｔリコンビナーゼの使用を開示する。これらの部位の
方向は互いに関して逆であるので、これは目的の遺伝子
に対して不可逆的なプロモーター領域のフリッピング
（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）を引き起こす。

【０００８】Ｐａｌａｚｚｏｌｏら、Ｇｅｎｅ８８：
２５−３６（１９９０）は、クローン化されるＤＮＡ
配列の外側および野生型ｌｏｘＰ部位間に配置された制
限部位を含有するバクテリオファージλアームを有する
ファージλベクターを開示する。これらのファージベク
ターでの、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞の感染は、ｌｏｘＰ部位間での組換えおよびプ
ラスミドレプリコン（クローン化ｃＤＮＡを含む）のイ
ンビボ切り出しを生じる。

【０００９】Ｐoｓｆａｉら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２２：２３９２−２３９８（１９９
４））は、ゲノムＤＮＡ中へ、２つの野生型ＦＲＴ認識
配列により隣接される選択マーカーを有する部分的発現
ベクターを挿入するための方法を開示する。細胞中に存
在するＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼが、ベクターを
ゲノム中に所定の部位において組み込むために使用され
る。レプリコンが機能的である条件下において、このク
ローン化ゲノムＤＮＡは増幅され得る。

【００１０】Ｂｅｂｅｅら（米国特許第５，４３４，０
６６号）は、２つのｌｏｘＰ部位を含むＤＮＡのための
Ｃｒｅのような部位特異的リコンビナーゼの使用が部位
間のインビボ組換えのために使用されることを開示す
る。

【００１１】Ｂｏｙｄ（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．２１：８１７−８２１（１９９３））は、Ｅ．
ｃｏｌｉ宿主細胞中に存在するＣｒｅ部位特異的リコ
ンビナーゼにより作用される野生型ｌｏｘＰ部位を含有
する脱リン酸化されたベクターの分子間連結を促進する
条件を用いて平滑末端ＤＮＡのクローニングを容易にす
る方法を開示する。

【００１２】Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＰＣＴ第９３／
１９１７２号およびＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．２１（９）：２２６５（１９９３））は、特定
の抗体のＬ鎖およびＨ鎖がｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ５
１１部位の間で異なるファージベクター中にクローン化
され、そしてそれを使用して新たなＥ．ｃｏｌｉ細胞
を形質転換するインビボ方法を開示する。Ｃｒｅ（宿主
細胞において２つの親分子（１つはプラスミド、１つは
ファージ）に作用する）は４つの産物を平衡して産生し
た：２つの異なるコインテグレート（ｃｏｉｎｔｅｇｒ
ａｔｅ）（ｌｏｘＰ部位またはｌｏｘＰ５１１部位の
いずれかにおける組換えにより産生される）、および２
つの娘分子（その１つが所望された産物であった）。

【００１３】他の関連技術とは対照的に、Ｓｃｈｌａｋ
ｅおよびＢｏｂｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：
１２７４６−１２７５１（１９９４））は、各々が野
生型およびスペーサー変異されたＦＲＴ組換え部位によ
り隣接される、規定された染色体位置において発現カセ
ットを交換するためのインビボ方法を開示する。二重交
換交叉（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｃｒｏ
ｓｓｏｖｅｒ）が部位特異的組換えのためにこのＦＬＰ
／ＦＲＴ系を用いることにより培養哺乳動物細胞におい
て媒介された。

【００１４】トランスポゼース。酵素トランスポゼース
のファミリーもまた、レプリコン間で遺伝子情報を移動
するために使用されている。トランスポゾンは構造的に
可変性であるが（単純（ｓｉｍｐｌｅ）または複合（ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄ）と記載される）、代表的には逆方向に
構成されるＤＮＡ配列により隣接されるリコンビナーゼ
遺伝子をコードする。トランスポゾンの組み込みは、ラ
ンダムであり得るかまたは高度に特異的であり得る。Ｔ
ｎ７（これは高度に部位特異的である）のような代表物
が、レプリコン間のＤＮＡセグメントのインビボにおけ
る移動に適用された（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｊ．Ｖｉｏ
ｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３））。

【００１５】ＤｅｖｉｎｅおよびＢｏｅｋｅＮｕｃ
ｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：３７６５−３７７
２（１９９４）は、ＤＮＡセグメントのインビトロに
おけるレシピエントＤＮＡ分子中への挿入のための人工
トランスポゾンの構築を開示する。この系は、酵母ＴＹ
１ウイルス様粒子のインテグラーゼを利用する。目的の
ＤＮＡセグメントは、標準的な方法を用いて、トランス
ポゾン様エレメントＴＹ１の末端間にクローン化され
る。ＴＹ１インテグラーゼの存在下において、生じるエ
レメントは第２の標的ＤＮＡ分子中へランダムに組み込
まれる。

【００１６】ＤＮＡクローニング。ＤＮＡセグメントの
クローニングは、現在、多数の研究所における日常的な
慣例として、そして多数の遺伝子解析における事前に必
要な工程として生じている。しかし、これらのクローニ
ングの目的は多様であり、２つの一般的な目的は以下に
ように考えられ得る：（１）大きなＤＮＡまたはＲＮ
Ａセグメント（染色体、ＹＡＣ、ＰＣＲフラグメント、
ｍＲＮＡなど）からのＤＮＡの最初のクローニング（ｐ
ＵＣ、ｐＧｅｍ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのような比較
的少ない公知のベクターにおいて実施される）、および
（２）これらのＤＮＡセグメントの特殊化されたベク
ター中への機能的分析のためのサブクローニング。多量
の時間および努力が、ＤＮＡセグメントの最初のクロー
ニングにおいて、およびＤＮＡセグメントの最初のクロ
ーニングベクターからより特殊化されたベクターへの移
動においての両方で費やされている。この移動なサブク
ローニングと呼ばれる。

【００１７】クローニングのための基本的な方法は長年
知られており、そしてその時間でほとんど変化していな
い。代表的なクローニングプロトコルは以下とおりであ
る：（１）目的のＤＮＡを１つまたは２つの制限酵素で消
化し；（２）既知の場合目的のＤＮＡセグメントをゲル精製
し；（３）適切な制限酵素での切断、アルカリホスファタ
ーゼでの処理、ゲル精製など（適切なように）によりベ
クターを調製し；（４）未切断および自己連結されたベクターのバック
グラウンドを概算するための適切なコントロールを有し
て、ＤＮＡセグメントをベクターに連結し；（５）生じるベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞中に
導入し；（６）選択されたコロニーをひろい、そして小培養物
を一晩増殖させ；（７）ＤＮＡミニプレップを作製し；そして（８）アガロースゲルで（しばしば診断的制限酵素消
化の後）またはＰＣＲにより、単離されたプラスミドを
分析する。

【００１８】ＤＮＡセグメントをサブクローニングする
ために使用される特殊化されたベクターは、機能的に多
様である。これらは、以下を包含するがこれらに限定さ
れない：種々の生物において遺伝子を発現させるため
の；遺伝子発現を調節するための；タンパク質精製を補
助するためのまたは細胞におけるタンパク質の追跡を可
能にするためのタグを提供するための；クローン化され
たＤＮＡセグメントを改変するための（例えば、欠失の
生成）；プローブの合成のための（例えば、リボプロー
ブ）；ＤＮＡ配列決定のためのテンプレートの調製のた
めの；タンパク質コード領域の同定のための；種々のタ
ンパク質コード領域の融合のための；多量の目的のＤＮ
Ａを提供するための、などのベクター。特定の研究が、
目的のＤＮＡセグメントをいくつかの異なる特殊化され
たベクター中へサブクローニングする工程を包含するこ
とは一般的である。

【００１９】当該分野において公知であるように、単純
なサブクローニングは１日で実施され得る（例えば、Ｄ
ＮＡセグメントは大きくなく、そして制限部位がサブク
ローニングベクターの制限部位と適合性である）。しか
し、他の多くのサブクローニング（特に、未知の配列、
長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な配
置、高いバックグラウンド、不純な酵素などを含むサブ
クローニング）は、数週間かかり得る。従って、ＤＮＡ
フラグメントのサブクローニングは、しばしば、可能な
限り少ない回数で実施されるべき面倒な仕事であるとみ
なされる。

【００２０】ＤＮＡセグメントのクローニングを容易に
するいくつかの方法が、例えば以下の参考文献における
ように記載されている。

【００２１】Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ
１６：１９１（１９８１）は、酵母ＤＮＡのフラグメ
ントのサブクローニングのためのベクターのファミリー
を開示する。このベクターは、カナマイシン耐性をコー
ドする。より長い酵母ＤＮＡセグメントのクローンが部
分的に消化され得、そしてサブクローニングベクター中
に連結され得る。もとのクローニングベクターがアンピ
シリンに対する耐性を有する場合には、形質転換の前に
精製は必要ではない。なぜなら、選択はカナマイシンに
ついてであるからである。

【００２２】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．
ら、Ｇｅｎｅ４１：１２５（１９８６）は、ストレ
プトマイシン感受性遺伝子内のユニークなクローニング
部位を有するサブクローニングベクターを開示し；スト
レプトマイシン耐性宿主において、優勢感受性遺伝子に
おける挿入または欠失を有するプラスミドのみが、スト
レプトマイシン選択を生き残る。

【００２３】従って、制限酵素およびリガーゼを用いる
伝統的なサブクローニング方法は、時間がかかり、そし
て比較的信頼できない。かなりの労働が費やされ、そし
て２日以上後に所望のサブクローンが候補プラスミドの
中で見出され得なければ、次いで、全体のプロセスが計
画される別の条件で繰り返されなければならない。部位
特異的リコンビナーゼがＤＮＡをインビボにおいて組換
えるために使用されたが、インビトロにおけるこのよう
な酵素の成功する使用は、いくつかの問題を抱えると予
想された。例えば、部位特異性および効率は、インビト
ロにおいて異なると予想され；トポロジー的に連結され
た産物が予想され；そしてＤＮＡ基質および組換えタン
パク質のトポロジーがインビトロにおいて顕著に異なる
と予想された（例えば、Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２２６：６６１−７３（１９９２）を
参照のこと）。インビボにおいて長時間続き得る反応
は、酵素が不活性になる前にインビトロにおいて顕著に
短い時間で生じると予想された。複数のＤＮＡ組換え産
物が使用される生物学的宿主において予想され、サブク
ローニングの不満足な信頼性、特異性または効率を生じ
た。インビトロ組換え反応は、所望のレベルの産物を生
じるに十分に効率的であるとは予想されなかった。

【００２４】従って、制限酵素およびリガーゼの公知の
使用を超えて利点を提供する別のサブクローニング系を
提供する長い間感じられていた必要が存在する。

【００２５】（発明の要旨）本発明は、インビトロまた
はインビボにおいて、組換えタンパク質および操作され
た組換え部位を用いる、キメラ核酸を得るための、核
酸、ベクターおよび方法を提供する。これらの方法は、
関連する背景技術において開示または示唆される方法よ
り、高度に特異的であり、迅速でありかつ労働集約的で
ない。本発明の改善された特異性、スピードおよび収率
は、任意の関連する目的のために有用なＤＮＡまたはＲ
ＮＡのサブクローニング、調節または交換を容易にす
る。このような目的は、ＤＮＡセグメントのインビトロ
における組換えおよび転写される、複製される、単離さ
れるまたはゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡの、インビトロ
またはインビボにおける挿入または改変を包含する。

【００２６】本発明は、少なくとも１つの操作された組
換え部位および少なくとも１つの組換えタンパク質を用
いて、所望の特性（単数または複数）および／あるいは
ＤＮＡセグメント（単数または複数）を有するキメラＤ
ＮＡ分子を提供する、ＤＮＡのセグメントを移動または
交換するための、核酸、ベクターおよび方法に関する。
一般に、１つ以上の親ＤＮＡ分子が組換えられて、１つ
以上の娘分子を与え、その少なくとも１つが所望の産物
ＤＮＡセグメントまたはベクターである。従って、本発
明は、交換をもたらすための、ならびに／または１つ以
上の所望の産物を選択するための、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ベ
クターおよび方法に関する。

【００２７】本発明の１つの実施態様は、キメラＤＮＡ
の作製方法に関し、この方法は以下の工程を包含する（ａ）インビトロまたはインビボにおいて（ｉ）第１の組換え部位および第２の組換え部位によ
り隣接される所望のＤＮＡセグメントを含む、インサー
トドナーＤＮＡ分子、ここで第１および第２の組換え部
位は互いに組換えない；（ｉｉ）第３の組換え部位および第４の組換え部位を
含むベクタードナーＤＮＡ分子、ここで、第３および第
４の組換え部位は互いに組換えない；（ｉｉｉ）第１および第３の組換え部位ならびに／ま
たは第２および第４の組換え部位を組換え得る１つ以上
の部位特異的組換えタンパク質；を組み合わせ；それにより、組換えを生じさせ、その結果少なくとも１
つのコインテグレートＤＮＡ分子、上記所望のＤＮＡセ
グメントを含む少なくとも１つの所望の産物ＤＮＡ分
子、および任意に副産物ＤＮＡ分子を産生する工程；お
よび、次いで、任意に、（ｂ）産物または副産物ＤＮＡ分子について選択する
工程。

【００２８】本発明の別の実施態様は、少なくとも１つ
の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）をその中に受けるまたは
保持するように区画化されたキャリア（ｃａｒｒｉｅ
ｒ）または入れ物（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）を含むキッ
トに関し、ここで、第１の容器は、本明細書に記載のよ
うに、クローニング部位または選択マーカーに隣接する
少なくとも２つの組換え部位を有するベクターを含むＤ
ＮＡ分子を含む。キットは任意に、以下を含む：（ｉ）その一方もしくは両方が１つ以上の操作された
組換え部位により隣接される、サブクローニングベクタ
ーおよび／または選択マーカーを含むベクタードナープ
ラスミドを含む第２の容器；ならびに／あるいは（ｉｉ）少なくとも１つの上記組換え部位を認識し、
そして組換え得る、少なくとも１つの組換えタンパク質
を含む第３の容器。

【００２９】他の実施態様は、本発明の方法において有
用なＤＮＡおよびベクターを包含する。特に、ベクター
ドナー分子が１つの実施態様において提供され、ここで
ベクタードナー内のＤＮＡセグメントが、（ｉ）環状
ベクタードナーにおいて、少なくとも２つの組換え部位
において、または（ｉｉ）直鎖状ベクタードナーにお
いて、少なくとも１つの組換え部位において、のいずれ
かにより分離され、ここで、組換え部位は、好ましく
は、組換えの特異性または効率を増強するように操作さ
れる。

【００３０】１つのベクタードナーの実施態様は、第１
のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含
み、第１または第２のセグメントは選択マーカーを含
む。第２のベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡ
セグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含み、第１
または第２のＤＮＡセグメントは、毒性遺伝子を含む。
第３のベクタードナーの実施態様は、第１のＤＮＡセグ
メントおよび第２のＤＮＡセグメントを含み、第１また
は第２のＤＮＡセグメントは、少なくとも１つの選択マ
ーカーの不活性フラグメントを含み、ここで選択マーカ
ーの不活性フラグメントは、第１または第２の組換え部
位を少なくとも１つの選択マーカーの別の不活性フラグ
メントをわたって組み換えられる場合に機能的な選択マ
ーカーを再構成し得る。

【００３１】本発明の組換えクローニング方法は、以前
のインビボ方法を超えていくつかの利点を有する。組換
え産物の単一の分子が生物学的宿主中へ導入され得、他
のＤＮＡ分子（例えば、出発分子、中間体、および副産
物）の非存在下における所望の産物ＤＮＡの増殖が、よ
り容易に実現される。反応条件は、酵素活性を最適化す
るように自由に調整され得る。ＤＮＡ分子は、所望の生
物学的宿主に非適合性であり得（例えば、ＹＡＣ、ゲノ
ムＤＮＡなど）、使用され得る。多様な供給源由来の組
換えタンパク質が、一緒にまたは逐次的に用いられ得
る。

【００３２】他の実施態様は、当該分野において公知で
あることと組み合わせて本明細書に含まれる教示から当
業者に明らかである。

【００３３】

【発明が解決しようとする課題】インビトロおよびイン
ビボにおいて、ＤＮＡ、ベクターおよび方法を使用する
方法を用いて、所望の特性（単数または複数）および／
あるいはＤＮＡセグメント（単数または複数）を有する
キメラＤＮＡ分子を提供することにある。

【００３４】

【課題を解決するための手段】インビトロおよびインビ
ボにおいて、ＤＮＡ、ベクターおよび方法を使用する本
件発明の方法を用いて、所望の特性（単数または複数）
および／あるいはＤＮＡセグメント（単数または複数）
を有するキメラＤＮＡ分子を提供する。

【００３５】従って、本発明は以下を提供する。１．第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメ
ントを含むベクタードナーＤＮＡ分子であって、該第１
のＤＮＡセグメントまたは該第２のＤＮＡセグメントは
少なくとも１つの選択マーカーを含み、ここで該第１の
セグメントおよび該第２のセグメントは、（ｉ）環状
ベクタードナーにおいては、第１の組換え部位および第
２の組換え部位により、または（ｉｉ）直鎖状ベクタ
ードナーにおいては、少なくとも第１の組換え部位によ
り、のいずれかで分離され、ここで隣接する組換え部位
の各々の対が操作され、そして互いに組換えない、ベク
タードナーＤＮＡ分子。２．前記選択マーカーが以下：（ｉ）そうでなければ毒性の化合物に対する耐性を提
供する産物をコードするＤＮＡセグメント；（ｉｉ）そうでなければレシピエント細胞において欠
如している産物をコードするＤＮＡセグメント；（ｉｉｉ）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコード
するＤＮＡセグメント；（ｉｖ）容易に同定され得る産物をコードするＤＮＡ
セグメント；（ｖ）細胞の生存および／または機能に有害である産
物をコードするＤＮＡセグメント；（ｖｉ）該（ｉ）〜（ｖ）のＤＮＡセグメントのいず
れかの活性を阻害するＤＮＡセグメント；（ｖｉｉ）基質を修飾する産物に結合するＤＮＡセグ
メント；（ｖｉｉｉ）所望の分子の単離を提供するＤＮＡセグ
メント；（ｉｘ）そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌ
クレオチド配列をコードするＤＮＡセグメント；および（ｘ）存在しない場合、直接的または間接的に、特定
の化合物に対する感受性を与えるＤＮＡセグメント、か
らなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡセグメ
ントである、項目１に記載のベクタードナーＤＮＡ分
子。３．前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮ
Ａ遺伝子、栄養要求マーカー、毒性遺伝子、表現型マー
カー、アンチセンスオリゴヌクレオチド；制限エンドヌ
クレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切
断部位、タンパク質結合部位；およびＰＣＲプライマー
に相補的な配列、からなる群より選択される少なくとも
１つである、項目２に記載のベクタードナーＤＮＡ分
子。４．前記選択マーカーが少なくとも１つの選択マーカー
の不活性フラグメントを含み、ここで該不活性フラグメ
ントが前記第１の組換え部位または前記第２の組換え部
位と、別の選択マーカーの不活性フラグメントを含むさ
らなるＤＮＡセグメントとにわたって組換えられる場合
に、機能性の選択マーカーを再構成し得る、項目１に記
載のベクタードナーＤＮＡ分子。５．第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣
接される所望のＤＮＡセグメントを含むインサートドナ
ーＤＮＡ分子であって、該第１の組換え部位および該第
２の組換え部位は操作され、そして互いに組換えない、
インサートドナーＤＮＡ分子。６．前記所望のＤＮＡセグメントが、クローニング部
位、制限部位、プロモーター、オペロン、複製起点、機
能性ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＰＣＲフラグメン
ト、タンパク質またはタンパク質フラグメント、からな
る群より選択される少なくとも１つをコードする、項目
５に記載のインサートドナーＤＮＡ分子。７．１つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するよ
うに区画化された容器を含むキットであって、ここで第
１の区画は第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡ
セグメントを含むベクタードナーＤＮＡ分子を含み、該
第１のＤＮＡセグメントまたは該第２のＤＮＡセグメン
トは少なくとも１つの選択マーカーを含み、ここで該第
１のセグメントおよび該第２のセグメントは、（ｉ）
環状ベクタードナードナーにおいては、第１の組換え部
位および第２の組換え部位、または（ｉｉ）直鎖状ベ
クタードナーにおいては、第１の組換え部位、のいずれ
かにより隣接され、ここで隣接する組換え部位の各々の
対が操作され、そして互いに組換えない、キット。８．第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣
接される所望のＤＮＡセグメントを含むインサートドナ
ーＤＮＡ分子を含む第２の区画をさらに含み、ここで該
第１の組換え部位および該第２の組換え部位が操作さ
れ、そして互いに組換えない、項目７に記載のキット。９．少なくとも１つの前記組換え部位を含むＤＮＡセグ
メントを組換え得る少なくとも１つの組換えタンパク質
を含むさらなる区画をさらに含む、項目７に記載のキッ
ト。１０．選択マーカーまたは所望のＤＮＡセグメントに隣
接する少なくとも２つの組換え部位を有する少なくとも
１つのＤＮＡセグメントを含む核酸分子であって、ここ
で少なくとも１つの該組換え部位がコインテグレートＤ
ＮＡまたは産物ＤＮＡの形成においてインビトロで組換
えを増強する少なくとも１つの操作された変異を有する
コア領域を含む、核酸分子。１１．前記変異が少なくとも１つの前記組換えの増強を
与え、該増強が実質的に、（ｉ）切り出し組換えの優
先；（ｉｉ）組み込み組換えの優先；（ｉｉｉ）宿
主因子の要求の軽減；（ｉｖ）前記コインテグレート
ＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の効率の増加；（ｖ）前
記コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の特異
性の増加からなる群より選択され；そして該産物ＤＮＡ
に対する所望の特性に貢献する、項目１０に記載の核酸
分子。１２．前記組換え部位が、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔ
ＬおよびａｔｔＲからなる群より選択される少なくとも
１つの組換え部位に由来する、項目１０に記載の核酸分
子。１３．前記ａｔｔ部位が、ａｔｔ１、ａｔｔ２およびａ
ｔｔ３からなる群より選択される、項目１２に記載の核
酸分子。１４．前記コア領域が以下：

【００３６】

【化１】からなる群より選択されるＤＮＡ配列、および対応する
または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列、を含み、ここ
でＲ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝Ｃまたは
Ｔ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧ
またはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；およびＢ＝ＣまたはＧ
またはＴ／Ｕである、項目１０に記載の核酸分子。１５．前記コア領域が以下：

【００３７】

【化２】からなる群より選択されるＤＮＡ配列、および対応する
または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列、を含む、項目
１４に記載の核酸分子。１６．核酸分子を作製するための方法であって、配列番
号１〜１６の少なくとも１つに少なくとも９０％の相同
性を有する少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む少なくと
も１つの操作された組換え部位を有する核酸分子を提供
する工程を包含する、方法。１７．項目１６に記載の方法により提供される核酸分
子。１８．項目１０に記載の核酸分子を含む組成物。１９．少なくとも１つの区画でその中に厳重な封じ込め
で収容するように区画化された容器を含むキットであっ
て、ここで第１の区画が項目１８に記載の組成物を含
む、キット。２０．前記組換え部位を認識する少なくとも１つの組換
えタンパク質を有する第２の区画をさらに含む、項目１
９に記載のキット。２１．項目２２に記載の方法に有用である、単離された
形態の少なくとも１つの組換えタンパク質をその中に厳
重な封じ込めで収容するように区画化された容器を含む
キット。２２．コインテグレートＤＮＡ分子を作製する方法であ
って、以下の工程：インビトロにおいて（ｉ）第１の組換え部位および第２の組換え部位によ
り隣接される所望のＤＮＡセグメントを含むインサート
ドナーＤＮＡ分子、ここで該第１の組換え部位および該
第２の組換え部位は互いに組換えない；（ｉｉ）第３の組換え部位および第４の組換え部位を
含むベクタードナーＤＮＡ分子、ここで、該第３の組換
え部位および該第４の組換え部位は互いに組換えない；
および（ｉｉｉ）該第１の組換え部位および該第３の組換え
部位または該第２の組換え部位および該第４の組換え部
位を組換え得る少なくとも１つの部位特異的組換えタン
パク質；を組み合わせ、それにより、組換えを生じさせ、その結
果該第１の組換え部位および該第３の組換え部位または
該第２の組換え部位および該第４の組換え部位を含むコ
インテグレートＤＮＡ分子を産生する工程、を包含す
る、方法。２３．産物ＤＮＡ分子が前記コインテグレートＤＮＡか
ら、（ｉ）前記第１の組換え部位および前記第３の組
換え部位、または（ｉｉ）前記第２の組換え部位およ
び前記第４の組換え部位の少なくとも１つを組換えるこ
とにより産生され、該産物ＤＮＡが前記所望のＤＮＡセ
グメントを含む、項目２２に記載の方法。２４．前記方法がまた副産物ＤＮＡ分子も産生する、項
目２３に記載の方法。２５．前記産物ＤＮＡ分子について選択する工程をさら
に含む、項目２３に記載の方法。２６．前記ベクタードナーＤＮＡ分子が前記第３の組換
え部位および前記第４の組換え部位により隣接されるベ
クターセグメントを含む、項目２２に記載の方法。２７．前記ベクタードナーＤＮＡ分子がさらに（ａ）毒
性遺伝子および（ｂ）選択マーカーを含み、ここで該毒
性遺伝子および該選択マーカーが異なるＤＮＡセグメン
ト上に存在し、該ＤＮＡセグメントが（ｉ）環状ＤＮ
Ａ分子においては、２つの組換え部位、または（ｉｉ）
直鎖状ＤＮＡ分子においては、１つの組換え部位、の
いずれかにより分離されている、項目２２に記載の方
法。２８．前記ベクタードナーＤＮＡ分子がさらに（ａ）
抑制カセット、および（ｂ）該抑制カセットのリプレ
ッサーにより抑制される選択マーカーを含み、ここで該
選択マーカーおよび該抑制カセットが異なるＤＮＡセグ
メント上に存在し、該ＤＮＡセグメントが（ｉ）環状
ＤＮＡ分子においては、２つの組換え部位、または（ｉ
ｉ）直鎖状ＤＮＡ分子においては、１つの組換え部
位、のいずれかにより分離されている、項目２２に記載
の方法。２９．前記インサートドナーＤＮＡ分子および前記ベク
タードナーＤＮＡ分子の少なくとも１つが環状ＤＮＡ分
子である、項目２２に記載の方法。３０．前記インサートドナーＤＮＡ分子および前記ベク
タードナーＤＮＡ分子の少なくとも１つが直鎖状ＤＮＡ
分子である、項目２２に記載の方法。３１．前記選択する工程がインビトロまたはインビボに
おいて実施される、項目２２に記載の方法。３２．前記組換えタンパク質が少なくとも第１の組換え
タンパク質および第２の組換えタンパク質を含み、該第
２の組換えタンパク質が該第１の組換えタンパク質と異
なる、項目２２に記載の方法。３３．前記組換えタンパク質がＩｎｔである、項目２２
に記載の方法。３４．前記少なくとも１つの組換えタンパク質が（ｉ）
ＩｎｔおよびＩＨＦ、ならびに（ｉｉ）Ｉｎｔ、Ｘ
ｉｓ、およびＩＨＦから選択される、項目２２に記載の
方法。

【００３８】

【発明の実施の形態】サブクローニング反応が組換えク
ローニングを用いて提供され得るこいうことが、本発明
において予想外に見出された。本発明による組換えクロ
ーニングは、操作された組換え部位および組換えタンパ
ク質を用いて、ＤＮＡ分子のセグメントの移動または交
換のために、インビトロおよびインビボにおいて、ＤＮ
Ａ、ベクターおよび方法を使用する。これらの方法は、
所望の特性（単数または複数）および／あるいはＤＮＡ
セグメント（単数または複数）を有するキメラＤＮＡ分
子を提供する。

【００３９】従って、本発明は、インビトロまたはイン
ビボにおいて、組換えタンパク質および操作された組換
え部位を使用して、キメラ核酸を得るための、核酸、ベ
クターおよび方法を提供する。これらの方法は、関連背
景技術において開示または示唆された方法より、高度に
特異的であり、迅速であり、そして労働集約的でない。
本発明の改善された特異性、スピードおよび収率は、任
意の関連する目的に有用である、ＤＮＡまたはＲＮＡの
サブクローニング、調節または交換を容易にする。この
ような目的としては、ＤＮＡセグメントのインビトロ組
換え、および転写される、複製される、単離されるまた
はゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡのインビトロまたはイン
ビボにおける挿入または改変が挙げられる。

【００４０】（定義）以下の記載において、組換えＤＮ
Ａ技術において使用される多数の用語が多く利用され
る。明細書および請求の範囲（こような用語に与えられ
るべき範囲を含む）の明確かつ一貫した理解を提供する
ために、以下の定義が提供される。

【００４１】副産物：これは、サブクローン化されるこ
とが所望されるＤＮＡを欠く、娘分子（組換えクローニ
ングプロセスの間に第２の組換え事象の後に産生される
新たなクローン）である。

【００４２】コインテグレート：これは、親（出発）Ｄ
ＮＡ分子の両方を含む、本発明の少なくとも１つの組換
え中間体ＤＮＡ分子である。これは通常環状である。い
くつかの実施態様においては、これは直鎖状であり得
る。

【００４３】宿主：これは、組換えクローニング産物の
レシピエントであり得る、任意の原核生物または真核生
物であり得る。本明細書において用いられる用語「宿
主」は、遺伝子操作され得る原核生物または真核生物を
包含する。このような宿主の例については、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹ
ｏｒｋ（１９８２）を参照のこと。

【００４４】インサート：これは、本発明の方法により
操作しようとする、所望のＤＮＡセグメント（図１のセ
グメントＡ）である。インサートは、１つ以上の遺伝子
を有し得る。

【００４５】インサートドナー：これは、インサートを
有する、本発明の２つの親ＤＮＡ分子のうちの１つであ
る。インサートドナーＤＮＡ分子は、両方の末端におい
て組換えシグナルに隣接されるインサートを含む。イン
サートドナーは直鎖状または環状であり得る。本発明の
１つの実施態様において、インサートドナーは環状ＤＮ
Ａ分子であり、そして組換えシグナルの外側のクローニ
ングベクター配列をさらに含む（図１を参照のこと）。

【００４６】産物：これは、組換えクローニングプロセ
スの間に第２の組換え事象の後に産生される、Ａおよび
ＤまたはＢおよびＣ配列を含む所望の娘分子の一方また
は両方である（図１を参照のこと）。産物は、クローン
化またはサブクローン化されるべきであったＤＮＡを含
む。

【００４７】プロモーター：これは、開始コドンの近位
に位置する、遺伝子の５’領域であると一般に記載され
るＤＮＡ配列である。隣接するＤＮＡセグメントの転写
はプロモーター領域から開始される。抑制性プロモータ
ーの転写速度は、抑制物質に応答して減少する。誘導性
プロモーターの転写速度は、誘導物質に応答して増加す
る。構成性プロモーターの転写速度は、一般的な代謝条
件の影響下で変化し得るが、特異的に調節されていな
い。認識配列：認識配列は、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラ
ーゼ、またはリコンビナーゼ）が認識し、そして結合す
る、特定のＤＮＡ配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビ
ナーゼのための認識配列は、８塩基対のコア配列に隣接
する２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結
合部位として作用する）を含む３４塩基対の配列であ
る、ｌｏｘＰである。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参
照のこと。認識配列の他の例としては、リコンビナーゼ
酵素であるλインテグラーゼにより認識される、ａｔｔ
Ｂ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。
ａｔｔＢは、２つの９塩基対のコア型Ｉｎｔ結合部位お
よび７塩基対の重複領域を含む約２５塩基対の配列であ
る。ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位およびアーム型
Ｉｎｔ結合部位、ならびに補助タンパク質ＩＨＦ、ＦＩ
Ｓ、およびＸｉｓのための部位を含む約２４０塩基対の
配列である。Ｌａｎｄｙ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ
ｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：６９
９−７０７（１９９３）を参照のこと。このような部
位はまた、方法および産物を増強するように、本発明に
従って操作される。

【００４８】リコンビナーゼ：これは、特異的な組換え
部位におけるＤＮＡセグメントの交換を触媒する酵素で
ある。

【００４９】組換えクローニング：これは、本明細書に
おいて記載される方法であって、これによりＤＮＡ分子
のセグメントが、インビトロまたはインビボにおいて、
交換、挿入、置換（ｒｅｐｌａｃｅ）、置換（ｓｕｂｓ
ｔｉｔｕｔｅ）または改変される。

【００５０】組換えタンパク質：これは、１つ以上の組
換え部位が関与する組換え反応に関与する、切り出しタ
ンパク質または組み込みタンパク質、酵素、補因子また
は会合タンパク質を包含する。Ｌａｎｄｙ（１９９
４）（下記）を参照のこと。

【００５１】抑制カセット：これは、サブクローニング
ベクター中に存在する選択マーカーのリプレッサーを含
むＤＮＡセグメントである。

【００５２】選択マーカー：これは、しばしば特定の条
件下で、それを含有する分子または細胞について、ある
いはそれを含有する分子または細胞に対して選択するこ
とを可能にする、ＤＮＡセグメントである。これらのマ
ーカーは、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生
のような（これらに限定されない）活性をコードし得る
か、あるいは、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機お
よび有機化合物または組成物などのための結合部位を提
供し得る。選択マーカーの例としては以下が挙げられる
がそれらに限定されない：（１）そうでなければ毒性
の化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する
産物をコードするＤＮＡセグメント；（２）そうでな
ければレシピエント細胞において欠如している産物をコ
ードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、
栄養要求マーカー）；（３）遺伝子産物の活性を抑制
する産物をコードするＤＮＡセグメント；（４）容易
に同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント（例
えば、βガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）、および細胞表面タンパク質のような表現型
マーカー）；（５）そうでなければ細胞の生存および
／または機能に有害である産物に結合するＤＮＡセグメ
ント；（６）そうでなければ上記番号（１）〜（５）
に記載のＤＮＡセグメントのいずれかの活性を阻害する
ＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレ
オチド）；（７）基質を修飾する産物に結合するＤＮ
Ａセグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；
（８）所望の分子（例えば、特異的タンパク質結合部
位）を単離するために使用され得るＤＮＡセグメント；
（９）そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌク
レオチド配列をコードするＤＮＡセグメント（例えば、
分子の亜集団のＰＣＲ増幅のための）；および／または
（１０）存在しない場合、直接的または間接的に、特
定の化合物に対する感受性を与えるＤＮＡセグメント。

【００５３】選択スキーム：これは、インサートドナ
ー、ベクタードナー、および／または任意の中間体、
（例えば、コインテグレート）副産物を含む混合物から
の、所望の産物（単数または複数）の、選択、富化、ま
たは同定を可能にする任意の方法である。１つの好まし
い実施態様の選択スキームは、組換えクローニングの間
に連結されているまたは連結されていないのいずれかで
ある、少なくとも２つの成分を有する。一方の成分は選
択マーカーである。他方の成分は、選択マーカーのイン
ビトロまたはインビボにおける発現、あるいは選択マー
カーを有するプラスミドを有する細胞の生存を制御す
る。一般的に、この制御エレメントは、選択マーカーの
リプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マー
カーの発現を制御するための他の手段が使用され得る。
リプレッサーが使用されるかアクチベーターが使用され
るかは、当業者に容易に明らかなように、マーカーがポ
ジティブ選択用であるかネガティブ選択用であるか、お
よび種々のＤＮＡセグメントの正確な配列に依存する。
好ましい必要性は、選択スキームが１つ以上の所望の産
物のみの選択または富化を生じることである。本明細書
において定義されるように、ＤＮＡ分子について選択す
ることは、（ａ）所望のＤＮＡ分子の存在について選
択または富化すること、および（ｂ）所望のＤＮＡ分
子でないＤＮＡ分子の存在に対して選択または富化する
ことを包含する。

【００５４】１つの実施態様において、選択スキーム
（これは、逆に実施され得る）は、３つの形態のうちの
１つをとり、これは図１に関して議論される。第１（選
択マーカーおよびそのリプレッサーについて本明細書に
おいて例証される）は、セグメントＤを有し、そしてセ
グメントＣを欠く分子について選択する。第２は、セグ
メントＣを有する分子に対しておよびセグメントＤを有
する分子について選択する。第２の形態の可能な実施態
様は、その中にインビトロ反応産物が導入されるべき細
胞に対して毒性の遺伝子を有するＤＮＡセグメントを有
する。毒性遺伝子は、毒性遺伝子産物（毒性タンパク質
またはＲＮＡ）として発現されるＤＮＡであり得るか、
またはそれ自体もしくはそれだけで毒性であり得る。
（後者の場合において、毒性遺伝子はその古典的な定義
の「遺伝性の特性（ｈｅｒｉｔａｂｌｅｔｒａｉ
ｔ）」を有すると理解される。）このような毒性遺伝子
産物の例は当該分野において周知であり、そして、制限
エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）および抑制機
能の非存在下で宿主を傷害する遺伝子（例えば、ｋｉｃ
Ｂ）を包含するがそれらに限定されない。あるいは、毒
性遺伝子はインビトロにおいて選択され得る（例えば、
制限部位）。

【００５５】第２の形態において、セグメントＤは選択
マーカーを有する。毒性遺伝子は、ベクタードナー、コ
インテグレート、および副産物分子を有する形質転換体
を除去するが、選択マーカーは、産物を含有する細胞に
ついて、およびインサートドナーのみを有する細胞に対
して選択するために使用され得る。

【００５６】第３の形態は、同一の分子上にシスでセグ
メントＡおよびセグメントＤの両方を有する細胞につい
ては選択するが、異なる分子上にトランスに両方のセグ
メントを有する細胞については選択しない。これは、２
つの不活性なフラグメント（各々１つがセグメントＡお
よびＤ上にある）に分割される選択マーカーにより具体
化され得る。

【００５７】フラグメントは、セグメントが組換え事象
により一緒にされるときに、それらが機能性の選択マー
カーを再構成するように、組換え部位に関して配列され
る。例えば、組換え事象はプロモーターを構造遺伝子と
連結し得る、構造遺伝子の２つのフラグメントを連結し
得る、または生存のために必要なヘテロダイマー遺伝子
産物をコードする遺伝子を連結し得る、またはレプリコ
ンの部分を連結し得る。

【００５８】部位特異的リコンビナーゼ：これは、代表
的には少なくとも以下の４つの活性を有するリコンビナ
ーゼの型である：（１）１つまたは２つの特異的ＤＮ
Ａ配列の認識；（２）前記ＤＮＡ配列（単数または複
数）の切断；（３）鎖交換に関与するＤＮＡトポイソ
メラーゼ活性；および（４）ＤＮＡの切断された鎖の
再封鎖をするＤＮＡリガーゼ活性。Ｓａｕｅｒ，
Ｂ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｏｎｉｏｎｓｉｎＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：５２１−５２７（１９９
４）を参照のこと。保存的部位特異的組換えは、両方の
パートナーについての高度の特異性により、相同組換え
および転位から区別される。鎖交換機構は、ＤＮＡ合成
の非存在下における特異的ＤＮＡ配列の切断および再結
合を含む（Ｌａｎｄｙ，Ａ．（１９８９）Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３−９４
９）。

【００５９】サブクローニングベクター：これは、適切
なレプリコンを含む環状または直鎖状ＤＮＡ分子を含む
クローニングベクターである。本発明において、サブク
ローニングベクター（図１におけるセグメントＤ）はま
た、最終産物中に組み込まれて、クローン化されたＤＮ
Ａインサート（図１におけるセグメントＡ）に対してま
たはそれともに作用することが所望される、機能性およ
び／または調節エレメントを含み得る。サブクローニン
グベクターはまた、選択マーカー（図１におけるセグメ
ントＣに含まれる）を含み得る。

【００６０】ベクター：これは、インサートに、有用な
生物学的または生化学的性質を提供するＤＮＡである。
例としては、インビトロまたは宿主細胞において複製し
得るかまたは複製され得る、あるいは所望のＤＮＡセグ
メントを宿主細胞内の所望の位置に運搬し得る、プラス
ミド、ファージ、および他のＤＮＡ配列が挙げられる。
ベクターは、そこにおいてＤＮＡ配列が、ベクターの本
質的な生物学的機能の損失なしに決定可能な様式で切断
され得、そしてその中にＤＮＡフラグメントが、その複
製およびクローニングを生じさせるためにスプライスさ
れ得る、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
有し得る。ベクターは、プライマー部位（例えば、ＰＣ
Ｒのための）、転写および／または翻訳開始および／ま
たは調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マー
カーなどをさらに提供し得る。明らかに、相同組換えま
たは制限酵素の使用を必要としない所望のＤＮＡフラグ
メントの挿入方法（例えば（これらに限定されない）、
ＰＣＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許第
５，３３４，５７５号、その全体が本明細書中に参考と
して援用される）、Ｔ：Ａクローニングなど）はまた、
本発明に従って使用されるべきクローニングベクター中
へＤＮＡのフラグメントをクローン化するために適用さ
れ得る。クローニングベクターは、クローニングベクタ
ーで形質転換された細胞の同定における使用のために適
切な選択マーカーをさらに含み得る。

【００６１】ベクタードナー：これは、所望の産物の部
分になるべきＤＮＡベクターをコードするＤＮＡセグメ
ントを有する、本発明の２つの親ＤＮＡ分子の１つであ
る。ベクタードナーは、組換え部位により隣接される、
サブクローニングベクターＤ（または、インサートドナ
ーが既にクローニングベクターを含まない場合、これは
クローニングベクターと呼ばれ得る）およびセグメント
Ｃを含む（図１を参照のこと）。セグメントＣおよび／
またはＤは、選択スキームについて上記したように、所
望の産物娘分子についての選択に貢献するエレメントを
含み得る。組換えシグナルは、同一であるかまたは異な
り得、そして同一のまたは異なるリコンビナーゼにより
作用され得る。さらに、ベクタードナーは直鎖状または
環状であり得る。

【００６２】（説明）本発明のインビトロまたはインビ
ボ方法についての１つの一般的なスキームを図１に示
す。ここでインサートドナーおよびベクタードナーは、
環状または直鎖状ＤＮＡのいずれかであり得るが、環状
として示す。ベクターＤは、もとのクローニングベクタ
ーＡを交換する。エレメントＡおよびＤを含む娘ベクタ
ーについて、および１つ以上のコインテグレート（単数
または複数）を含む他の分子に対して選択することが所
望される。四角および丸は、組換え部位の異なる組であ
る（例えば、ｌｏｘ部位またはａｔｔ部位）。セグメン
トＡまたはＤは、Ｄがこの例において使用される場合、
少なくとも１つの選択マーカー、発現シグナル、複製起
点、あるいは欠失、選択、発現、マッピングまたはＤＮ
Ａ配列決定のための特殊化された機能を含み得る。

【００６３】エレメントＡまたはＤの部分であり得る所
望のＤＮＡセグメントの例は、ＰＣＲ産物、大きなＤＮ
Ａセグメント、ゲノムクローンまたはフラグメント、ｃ
ＤＮＡクローン、機能性エレメントなど、および有用な
核酸またはタンパク質をコードする遺伝子または部分的
遺伝子を包含するが、それらに限定されない。さらに、
本発明の組換えクローニングは、タンパク質発現および
／または遺伝子治療のための、エクスビボおよびインビ
ボ遺伝子移入ビヒクルを作製するために使用され得る。

【００６４】図１において、スキームは以下のようにベ
クターＤおよびＡを含む所望の産物を提供する。インサ
ートドナー（ＡおよびＢを含む）は、組換えタンパク質
により、ベクタードナー（ＣおよびＤを含む）と四角の
組換え部位においてまず組換えて、Ａ−Ｄ−Ｃ−Ｂの各
々を有するコインテグレートを形成する。次に、丸の組
換え部位において組換えが生じて、産物ＤＮＡ（Ａおよ
びＤ）ならびに副産物ＤＮＡ（ＣおよびＢ）を形成す
る。しかし、所望であれば、２つ以上の異なるコインテ
グレートが形成されて、２つ以上の産物を生成し得る。

【００６５】本発明のインビトロまたはインビボ組換え
クローニング方法の１つの実施態様において、少なくと
も１つの所望の産物ＤＮＡを選択するための方法が提供
される。これは、図２に示されるプラスミドｐＥＺＣ７
２６のマップの考慮により理解され得る。２つの例示的
な組換え部位は、ａｔｔＰおよびｌｏｘＰである。これ
らの部位により規定される１つのセグメント上に、その
プロモーターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯ
Ｐオペレーター／プロモーターにより置換されているカ
ナマイシン耐性遺伝子が存在する。ｔｅｔリプレッサー
タンパク質の非存在下において、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮ
Ａポリメラーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺
伝子を転写する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、
それはｔｅｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺
伝子の転写をブロックする。ｐＥＺＣ７２６の他のセグ
メントは、構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔ
リプレッサー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ７２６
により形質転換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメン
ト上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性である
が、カナマイシンに感受性である。組換え反応は、ｔｅ
ｔＲ遺伝子の調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの
分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受
ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。

【００６６】２つの異なる組のプラスミドを、インビト
ロ方法を実証するために構築した。Ｃｒｅリコンビナー
ゼのみのでの使用のための１つの組（クローニングベク
ター６０２およびサブクローニングベクター６２９（図
３））は、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ５１１部位を含ん
だ。Ｃｒｅおよびインテグラーゼでの使用のための第２
の組（クローニングベクター７０５およびサブクローニ
ングベクター７２６（図２））は、ｌｏｘＰおよびａｔ
ｔ部位を含んだ。所望の娘プラスミドの産生の効率は、
Ｃｒｅ単独を使用してよりも、両方の酵素を使用して、
約６０倍高かった。Ｃｒｅ単独反応由来の２４コロニー
中１９が、所望の産物を含んだが、インテグラーゼ＋Ｃ
ｒｅ反応由来の３８コロニー中３８が、所望の産物プラ
スミドを有した。

【００６７】他の選択スキームそれらがそのために組
換えクローニングが実施される特定の目的に適合し得る
として当該分野において公知である種々の選択スキーム
が、使用され得る。個々の嗜好および要求に依存して、
多数の異なる型の選択スキームが本発明の組換えクロー
ニング方法において使用され得る。当業者は、多数のＤ
ＮＡセグメントまたはそれらを作製するための方法、お
よび当該分野において慣例的に使用される異なる選択方
法の利用可能性を利用し得る。このようなＤＮＡセグメ
ントは、活性（ＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質
の産生を包含するが、これらに限定されない）をコード
するＤＮＡセグメント、またはこのようなＲＮＡ、ペプ
チド、またはタンパク質のための結合部位を供給するＤ
ＮＡセグメントを包含するが、これらに限定されない。
選択スキームの案出において使用されるＤＮＡ分子の例
は、「選択スキーム」の定義のもとに、上記に与えられ
る。

【００６８】さらなる例としては以下が挙げられるが、
これらに限定されない：（ｉ）ＰＣＲのための新たなプライマー部位の生成
（例えば、以前は並置されていなかった２つのＤＮＡ配
列の並置）；（ｉｉ）制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ修
飾酵素、化学物質、リボザイムなどにより作用されるＤ
ＮＡ配列の含有；（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、
化学物質などにより認識されるＤＮＡ配列の含有（例え
ば、集団についての選択または集団からの排除のための
アフィニティータグとしての使用のための）（Ｄａｖｉ
ｓ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：７０
２−７０６（１９９６）；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６
９：８０２７−８０３４（１９９５））；（ｉｖ）ランダマイズされ、そしてｃＤＮＡ由来のＲ
ＮＡライブラリーを用いることによる、エプスタインバ
ールウイルスに発現されるＲＮＡに会合するリボソーム
Ｌ２２タンパク質についてのＲＮＡリガンドのインビト
ロ選択；（ｖｉ）その活性が特異的方向および並置を必要とす
る機能性エレメント（例えば、（ａ）トランスでは弱
く反応するが、シスに配置されると、適切なタンパク質
の存在下において、分子の特定の集団を破壊する組換え
（例えば、インビトロＲＮＡ合成を可能にするプロモー
ター配列の再構成）を生じる組換え部位）の配置。ＲＮ
Ａは直接使用され得るか、または逆転写されて所望のＤ
ＮＡ構築物を得ることが出来る；（ｖｉｉ）分子（単数または複数）のサイズ（例え
ば、分画）または他の物理的性質による所望の産物の選
択；および（ｖｉｉｉ）その同定を可能にする特異的修飾（例え
ば、メチル化）のために必要とされるＤＮＡ配列の含
有。

【００６９】本発明の方法における産物および副産物の
形成後、特定の組換えクローニング手順において任意に
案出された特定の選択スキームに依存して、選択工程は
インビトロまたはインビボのいずれかにおいて実施され
得る。

【００７０】例えば、選択のインビトロ方法は、インサ
ートドナーおよびベクタードナーＤＮＡ分子について案
出され得る。このようなスキームは、組換え事象の後
に、希な切断部位が副産物中に至るように、出発環状ベ
クターにおいて希な制限部位を操作することを含む。従
って、希な制限部位を結合し、そしてそれを切断する制
限酵素がインビトロにおいて反応混合物に添加される
と、希な切断部位を有するＤＮＡ分子（すなわち、出発
ＤＮＡ分子、コインテグレート、および副産物）の全て
は、切断され、そして意図される宿主細胞において複製
不能にされる。例えば、セグメントＢおよびＣにおける
切断部位（図１を参照のこと）は、産物以外のすべての
分子に対して選択するために使用され得る。あるいは、
セグメントＤについて（例えば、Ｂ上に見出されない薬
剤耐性遺伝子により）選択し得る場合、Ｃにおける切断
部位のみが必要とされる。

【００７１】同様に、直鎖状ＤＮＡ分子を扱う場合、イ
ンビトロ選択方法が案出され得る。ＰＣＲプライマーに
相補的なＤＮＡ配列が、産物分子にのみ、組換えクロー
ニング方法を介して、移入されるように操作され得る。
反応が完了した後、適切なプライマーが反応溶液に添加
され、そしてサンプルがＰＣＲに供される。従って、産
物分子の全てまたは一部が増幅される。

【００７２】他のインビボ選択スキームが、種々のＥ．
ｃｏｌｉ細胞株を用いて使用され得る。１つのスキー
ムは、サブクローニングプラスミドの一方のセグメント
上にリプレッサー遺伝子を、そして同じプラスミドの他
方のセグメント上にそのリプレッサーにより制御される
薬剤マーカーを置くことである。別のスキームは、サブ
クローニングプラスミドのセグメントＣ上にキラー（ｋ
ｉｌｌｅｒ）遺伝子を置くことである（図１）。もちろ
ん、このようなプラスミドを増殖させるための方法が存
在しなくてはならない。すなわち、それにおいてキラー
遺伝子が死滅させない状況が存在しなければならない。
Ｅ．ｃｏｌｉの特定の株を必要とする公知の多数の遺
伝子が存在する。１つのこのようなスキームは、制限酵
素ＤｐｎＩ（これは、その認識配列ＧＡＴＣがメチル化
されない限り切断しない）を使用することである。多数
の普及した一般的なＥ．ｃｏｌｉ株はＧＡＴＣ配列を
メチル化するが、その中でクローン化されたＤｐｎＩが
害なしに発現され得る変異体が存在する。

【００７３】もちろん、類似の選択スキームが他の宿主
生物のために案出され得る。例えば、Ｔｎ１０のｔｅｔ
リプレッサー／オペレーターが真核生物において遺伝子
発現を制御するように適合させられた（Ｇｏｓｓｅｎ，
Ｍ．，およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５
５４７−５５５１（１９９２））。従って、本明細書
において例証されるｔｅｔリプレッサーによる薬剤耐性
の同じ制御が、真核生物細胞において産物を選択するた
めに適用され得る。

【００７４】（組換えタンパク質）本発明において、Ｄ
ＮＡセグメントの交換は、組換えタンパク質（リコンビ
ナーゼならびに会合する補因子およびタンパク質を含
む）の使用によって達成される。種々の組換えタンパク
質が当該分野において記載されている。このようなリコ
ンビナーゼの例には以下が含まれる：Ｃｒｅ：バクテ
リオファージＰ１由来のタンパク質（Ａｂｒｅｍｓｋｉ
およびＨｏｅｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９
（３）：１５０９−１５１４（１９８４））は、ｌｏｘ
Ｐ（交叉の遺伝子座）部位と呼ばれる３４ｂｐＤＮＡ
配列間の交換を触媒する（すなわち、組換えを引き起こ
す）（Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１４（５）：２２８７（１９８６）を参照のこ
と）。Ｃｒｅは市販されている（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタ
ログＮｏ．６９２４７−１）。Ｃｒｅによって媒介され
る組換えは、自由に可逆的である。熱力学的考察から
は、Ｃｒｅ媒介性組み込み（１つの分子を形成する２つ
の分子間の組換え）が、Ｃｒｅ媒介性切り出し（２つの
娘分子を形成する同一分子中の２つのｌｏｘＰ部位間の
組換え）より、はるかに効率的でないことは驚くべきこ
とではない。Ｃｒｅは、当該分野において周知のよう
に、補因子としてマグネシウムまたはスペルミジンのい
ずれかを含む単純な緩衝液中で働く。ＤＮＡ基質は、直
鎖状または超らせん状のいずれかであり得る。多くの変
異体ｌｏｘＰ部位が記載されている（Ｈｏｅｓｓら、前
掲）。これらの１つｌｏｘＰ５１１は、別のｌｏｘＰ
５１１部位と組換えるが、ｌｏｘＰ部位とは組み換え
ない。

【００７５】インテグラーゼ：λゲノムのＥ．ｃｏｌｉ
染色体への組み込みを媒介する、バクテリオファージλ
由来のタンパク質。バクテリオファージλＩｎｔ組換え
タンパク質は、溶原状態の形成または誘導の一部とし
て、その基質ａｔｔ部位間の不可逆的な組換えを促進す
る。組換え反応の可逆性は、組み込み組換えおよび切り
出し組換えのための２つの独立した経路から生じる。各
経路は特有であるが重複する、ａｔｔ部位ＤＮＡを含む
１５のタンパク質結合部位のセットを使用する。４つの
タンパク質（Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、ＩＨＦおよびＦＩＳ）が
関与する協同的および競合的相互作用が組換えの方向を
決定する。

【００７６】組み込み組換えには、ＩｎｔおよびＩＨＦ
タンパク質、ならびに部位ａｔｔＰ（２４０ｂｐ）お
よびａｔｔＢ（２５ｂｐ）が関与する。組換えは、２
つの新たな部位：ａｔｔＬおよびａｔｔＲの形成を生じ
る。切り出し組換えは、ａｔｔＰおよびａｔｔＢを生成
するために、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓ、ならびに
部位ａｔｔＬおよびａｔｔＲを必要とする。特定の条件
下で、ＦＩＳは、切り出し組換えを刺激する。これらの
正常な反応に加えて、ａｔｔＰおよびａｔｔＢは、同一
分子上に配置される場合、切り出し組換えを促進して２
つの切り出し産物（ａｔｔＬを有するものおよびａｔｔ
Ｒを有するもの）を生成し得ることを理解すべきであ
る。同様に、ａｔｔＬを含む分子とａｔｔＲを含む分子
との間での分子間組換えは、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉ
ｓの存在下で、組み込み組換えならびにａｔｔＰおよび
ａｔｔＢの生成を生じ得る。従って、ＤＮＡセグメント
を、操作したａｔｔ部位の適切な組合せと隣接させるこ
とによって、適切な組換えタンパク質の存在下で、切り
出し組換えまたは組み込み組換えを、互いの逆反応とし
て導き得る。

【００７７】ａｔｔ部位のそれぞれは、１５ｂｐのコア
配列を含む。機能的重要性の個々の配列エレメントは、
この共通コアの境界の範囲内に、外側に、およびその境
界を横切って存在する（Ｌａｎｄｙ，Ａ．，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３（１９８
９））。種々のａｔｔ部位間の効率的な組換えは、中心
共通領域の配列が組換えパートナー間で同一であること
を必要とする。しかし、現在は、正確な配列は改変可能
であることが見出されている。その結果、コア内に変化
を有する、ａｔｔ部位の誘導体が、少なくとも天然のコ
ア配列と同程度に効率的に組換えることが、現在は見出
されている。

【００７８】インテグラーゼはバクテリオファージλ上
のａｔｔＰ部位（約２４０ｂｐ）をＥ．ｃｏｌｉゲノ
ム上のａｔｔＢ部位（約２５ｂｐ）と組換えて（Ｗｅ
ｉｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．およびＬａｎｄｙ，Ａ．Ｌａ
ｍｂｄａＩＩ、ｐ．２１１（１９８３）、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、ａｔｔＬ（約１００ｂｐ）およびａｔｔＲ（約
１６０ｂｐ）部位によって隣接された、組み込まれた
λゲノムを生成するように作用する。Ｘｉｓの非存在下
（下記参照のこと）で、この反応は本質的に不可逆的で
ある。インテグラーゼおよびＩＨＦによって媒介される
組み込み反応は、インビトロで、スペルミジンを含む単
純な緩衝液を用いて働く。インテグラーゼは、Ｎａｓ
ｈ，Ｈ．Ａ．、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ１００：２１０−２１６（１９８３）によって
記載されるように入手され得る。ＩＨＦは、Ｆｉｌｕｔ
ｏｗｉｃｚ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ１４７：１４９−１５
０（１９９４）によって記載されるように入手され得
る。

【００７９】λタンパク質Ｘｉｓ（切り出し）の存在下
で、インテグラーゼは、ａｔｔＲとａｔｔＬとの反応を
触媒してａｔｔＰおよびａｔｔＢを形成する。すなわ
ち、インテグラーゼは、上記の反応の逆転を促進する。
この反応もまた、本発明において適用され得る。

【００８０】他の組換え系。種々の生物由来の多くの組
換え系もまた、本明細書中に提供される教示およびガイ
ダンスに基づいて、使用され得る。例えば、Ｈｏｅｓｓ
ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
１４（６）：２２８７（１９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋ
ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１）：３９
１（１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．１７４（２３）：７４９５（１９９
２）；Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７
（１１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９９２）
を参照のこと。これらの多くは、リコンビナーゼのイン
テグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢ
ＯＪ．５：４３３−４４０（１９８６））。おそら
く、これらのうち、バクテリオファージλ由来のインテ
グラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ．（１９９３）
ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔ
ｉｃｓａｎｄＤｅｖｅｌ．３：６９９−７０
７）、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ
系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ（１９９０）
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓａｎｄＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第４巻、Ｅｃｋｓｔｅｉｎお
よびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅ
ｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９０−１０９
頁）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系
（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ２９：２２７−２３４
（１９８２））が、最も良く研究されている。

【００８１】部位特異的リコンビナーゼの第２のファミ
リーのメンバーであるリゾルベースファミリー（例え
ば、γδ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、およ
びＣｉｎ）もまた公知である。リコンビナーゼのこの高
度に関連するファミリーのメンバーは、代表的には、分
子内反応（例えば、反転および切り出し）に制約され、
そして宿主がコードする因子を必要とし得る。宿主因子
の要求性のいくつか（ＭａｅｓｅｒおよびＫａｈｎｍａ
ｎｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
２３０：１７０−１７６）および分子内組換えの制約の
いくつかを軽減する変異体が単離されている。

【００８２】λＩｎｔに類似の他の部位特異的リコンビ
ナーゼおよびＰ１Ｃｒｅに類似の他の部位特異的リコ
ンビナーゼは、ＩｎｔおよびＣｒｅを置換し得る。この
ようなリコンビナーゼは公知である。多くの場合、この
ような他のリコンビナーゼの精製は、当該分野において
記載されている。それらが公知でない場合、細胞抽出物
が使用され得るか、またはＣｒｅおよびＩｎｔについて
記載された手順を使用して、酵素が部分的に精製され得
る。

【００８３】ＣｒｅおよびＩｎｔが例として詳細に記載
されているが、多くの関連するリコンビナーゼ系が存在
し、そして記載された発明に対するそれらの適用もま
た、本発明に従って提供される。部位特異的リコンビナ
ーゼのインテグラーゼファミリーは、バクテリオファー
ジλ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１
によりコードされる部位特異的組換えタンパク質のよう
な、本発明のための別の組換えタンパク質および組換え
部位を提供するために使用され得る。この群のタンパク
質は、配列の予想し得ないほど大きな多様性を示す。こ
の多様性にも関わらす、すべてのリコンビナーゼは、そ
のＣ末端側の半分においてアラインされ得る。

【００８４】Ｃ末端付近の４０残基領域は、すべてのタ
ンパク質において、特によく保存されており、そして酵
母２μプラスミドＦｌｐタンパク質のＣ末端付近の領域
と相同である。３つの位置がこのファミリー内で完全に
保存されている：ヒスチジン、アルギニンおよびチロシ
ンが、よく保存されたＣ末端領域内のそれぞれのアライ
ンメント位置３９６、３９９および４３３に見出され
る。これらの残基は、このファミリーのリコンビナーゼ
の活性部位に寄与し、そしてチロシン−４３３が鎖切断
および再結合の間にＤＮＡと一時的に共有結合を形成す
ることを示唆する。例えば、Ａｒｇｏｓ，Ｐ．ら、ＥＭ
ＢＯＪ．５：４３３−４０（１９８６）を参照の
こと。

【００８５】あるいは、ＩＳ２３１および他のＢａｃｉ
ｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの転移因子が、
組換えタンパク質および組換え部位として使用され得
る。Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
は、その毒性が、農業的な有害生物ならびにヒトおよび
動物の疾患のベクターに対して活性である、胞子嚢中の
デルタエンドトキシン結晶の存在に起因する、昆虫病原
性（ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）細菌である。
これらの毒素タンパク質をコードする遺伝子のほとんど
は、プラスミドに保有され、そして一般に、挿入配列
（ＩＳ２３１、ＩＳ２３２、ＩＳ２４０、ＩＳＢＴ１お
よびＩＳＢＴ２）ならびにトランスポゾン（Ｔｎ４４３
０およびＴｎ５４０１）と構造的に関連している。これ
らの可動要素のいくつかは活性であり、そして結晶遺伝
子の可動性に関与し、そのことによって細菌毒性の変動
に寄与することが示されている。

【００８６】イソＩＳ２３１エレメントの構造分析によ
り、それらがＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎ
ｇｅｎｓ由来のＩＳ１１５１に関連し、そしてＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のＩＳ４およびＩＳ１８
６に遠縁に関連する。他のＩＳ４ファミリーのメンバー
と同様に、それらは、他のＩＳファミリーおよびレトロ
ウイルスに見出される、保存されたトランスポゼース−
インテグラーゼモチーフを含む。

【００８７】さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉのＩＳ２３１Ａから収集した機能的データは、特異的
な標的に対して優先性を有する、非複製様式の転位を示
す。同様な結果はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｉｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにおいて
も得られた。例えば、Ｍａｈｉｌｌｏｎ，Ｊ．ら、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃａ９３：１３−２６（１９９４）；Ｃａｍ
ｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７４９５−７
４９９（１９９２）を参照のこと。

【００８８】組換え反応を駆動するために添加されるリ
コンビナーゼの量は、公知のアッセイを用いることによ
って決定され得る。詳細には、力価アッセイを使用し
て、精製されたリコンビナーゼ酵素の適切な量または抽
出物の適切な量を決定する。

【００８９】操作された組換え部位。上記リコンビナー
ゼおよび対応するリコンビナーゼ部位は、本発明に従う
組換えクローニングにおける使用に適切である。しか
し、野生型組換え部位は、本発明の方法において適用さ
れるような、組換え反応の効率または特異性を低下させ
る配列を含む。例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＲ、ａｔｔ
Ｐ、ａｔｔＬおよびｌｏｘＰ組換え部位における複数の
終止コドンが、両方の鎖上の複数のリーディングフレー
ム中に生じる。従って、組換えの効率は、例えば、コー
ド配列が組換え部位を横切らなければならない（１つの
リーディングフレームのみがｌｏｘＰおよびａｔｔＢ部
位の各鎖上で利用可能である）場合、低下するか、また
は（ａｔｔＰ、ａｔｔＲもしくはａｔｔＬにおいて）不
可能である。

【００９０】従って、本発明はまた、これらの問題を克
服する操作された組換え部位を提供する。例えば、ａｔ
ｔ部位は、組換え反応の特異性または効率および産物Ｄ
ＮＡの性質を増強するために（例えば、ａｔｔ１、ａｔ
ｔ２、およびａｔｔ３部位）、逆反応を減少させるため
に（例えば、ａｔｔＢからのＰ１およびＨ１の除去）、
１または複数の変異を有するように操作され得る。これ
らの変異体の試験は、どの変異体が、本発明に従う組換
えサブクローニングに適切であるに十分な組換え活性を
生じるかを決定する。

【００９１】従って、変異は、部位特異的組換えを増強
するために組換え部位に導入され得る。このような変異
には、翻訳終止コドンを有さない組換え部位（これは、
融合タンパク質がコードされることを可能にする）；同
一のタンパク質によって認識されるが塩基配列が異なる
組換え部位（その結果、これらは、それらの相同なパー
トナーと大きくまたは排他的に反応して、複数の意図さ
れるべき反応を可能にする）が含まれれが、これらに限
定されない。どの特定の反応が生じるかは、どの特定の
パートナーが反応混合物中に存在するかによって特定さ
れ得る。例えば、三部分タンパク質融合体は、組換え部
位ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２；ａｔｔＬ１およびａｔ
ｔＬ３；ならびに／またはａｔｔＲ３およびａｔｔＬ２
を含む親プラスミドを用いて達成され得る。

【００９２】特定の変異を核酸配列に導入するための周
知の手順が存在する。これらの多くはＡｕｓｕｂｅｌ，
Ｆ．Ｍ．ら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１
９８９−１９９６））に記載されている。変異は、オリ
ゴヌクレオチド中に設計され得、これは、既存のクロー
ニングされた配列を改変するために、または増幅反応に
おいて使用され得る。所望の変異体ＤＮＡまたはＲＮＡ
を単離するために適切な選択方法が利用可能である場
合、ランダム変異誘発もまた用いられ得る。所望の変異
の存在は、核酸を周知の方法によって配列決定すること
により確認され得る。

【００９３】以下の限定されない方法が、所定の組換え
部位のコア領域を操作して、本発明における使用に適切
な変異した部位を提供するために、使用され得る：１．部位特異的（例えば、ａｔｔＢを得るためのａｔｔ
ＬおよびａｔｔＲ）組換え機構または他の（例えば、相
同）組換え機構による２つの親ＤＮＡ配列の組換えによ
る。ＤＮＡ親ＤＮＡセグメントは、最終的なコア配列を
生じる１またはそれ以上の塩基変化を含む；２．所望のコア配列の直接的な変異または変異誘発（部
位特異的、ＰＣＲ、ランダム、自発的など）による；３．組み換えられて所望のコア配列を生じる親ＤＮＡ配
列の変異誘発（部位特異的、ＰＣＲ、ランダム、自発的
など）による；および４．所望のコア配列をコードするＲＮＡの逆転写によ
る。

【００９４】変異体組換え部位の機能性は、所望の特定
の特性に依存する方法で示され得る。例えば、組換え部
位における翻訳終止コドンの欠如は、適切な融合タンパ
ク質を発現させることによって示され得る。相同なパー
トナー間の組換えの特異性は、適切な分子をインビトロ
反応に導入し、そして組換え産物について、本明細書中
に記載したように、または当該分野において公知のよう
に、アッセイすることによって、示され得る。組換え部
位における他の所望の変異は、制限部位、翻訳または転
写開始シグナル、タンパク質結合部位、および核酸塩基
配列の他の公知の機能が存在することまたは存在しない
ことを包含し得る。組換え部位における特定の機能的特
性に関する遺伝子選択スキームは、公知の方法の工程に
従って使用され得る。例えば、（相互作用しない一対の
部位から）相互作用するパートナーを提供するための部
位の改変は、毒性物質をコードするＤＮＡ配列のこれら
部位間の組換えを介しての欠失を要求することよって達
成され得る。同様に、翻訳終止配列を除去する部位につ
いての選択、タンパク質結合部位の存在または非存在な
どは、当業者によって容易に案出され得る。

【００９５】従って、本発明は、選択マーカーおよび／
または所望のＤＮＡセグメントに隣接する少なくとも２
つの操作された組換え部位を有する少なくとも１つのＤ
ＮＡセグメントを含む核酸分子を提供する。ここで、上
記組換え部位のうち少なくとも１つは、コインテグレー
トＤＮＡまたは産物ＤＮＡの形成においてインビトロで
組換えを増強する、少なくとも１つの操作された変異を
有するコア領域を含む。

【００９６】核酸分子は、上記組換えの少なくとも１つ
の増強を付与する、少なくとも１つの変異を有し得る。
この増強は、（ｉ）切り出し組み込みを優先すること；
（ｉｉ）切り出し組換えを優先すること；（ｉｉ）宿主
因子の要求性を軽減すること；（ｉｉｉ）上記コインテ
グレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の効率を増加させ
ること；および（ｉｖ）上記コインテグレートＤＮＡま
たは産物ＤＮＡ形成の特異性を増加させることから実質
的になる群より選択される。

【００９７】核酸分子は、好ましくは、ａｔｔＢ、ａｔ
ｔＰ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲに由来する少なくとも１
つの組換え部位を含む。より好ましくは、ａｔｔ部位
は、本明細書に記載のように、ａｔｔ１、ａｔｔ２、ま
たはａｔｔ３から選択される。

【００９８】好ましい実施態様において、コア領域は、
以下からなる群より選択されるＤＮＡ配列：

【００９９】

【化３】あるいは対応するまたは相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ
配列を含む。ここで、米国特許法施行規則§１．８２２
（本明細書中に参考としてその全体を援用する）に示さ
れているように、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／
Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝Ａ
またはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；そし
てＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕであり、コア領域は、１
またはそれ以上のリーディングフレームにおいて終止コ
ドンを含まない。

【０１００】コア領域はまた、好ましくは、以下からな
る群より選択されるＤＮＡ配列：

【０１０１】

【化４】あるいは対応するまたは相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ
配列を含む。

【０１０２】従って、本発明はまた、核酸分子を作製す
るための方法を提供する。この方法は、配列番号１〜１
６のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０〜９
９％の相同性（あるいはその中の任意の範囲または値）
を有する少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む少なくとも
１つの操作された組換え部位、または任意の適切な組換
え部位を有する核酸分子、あるいは、当該分野において
公知のように、ストリンジェントな条件下で、その核酸
分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する工程を包
含する。

【０１０３】明らかなことではあるが、このような周知
のインビトロおよびインビボ選択方法の種々のタイプお
よび変更が存在する。これらの各々については、簡略に
するために、本明細書に記載されない。しかし、このよ
うな変形および変更は、本発明の異なる実施態様である
と意図されており、そしてそのようにみなされる。

【０１０４】インビトロ組換え反応である好ましい実施
態様の結果として、非生物学的分子（例えば、ＰＣＲ産
物）が、本発明の組換えクローニング方法により操作さ
れ得ることに注目することが重要である。１つの例にお
いて、直鎖状分子を環状ベクターにクローニングするこ
とが可能である。

【０１０５】本発明には多くの適用がある。これらの使
用には、ベクターを変化させること、プロモーターを遺
伝子の隣に並べること（ａｐｐｏｓｉｎｇ）、融合タン
パク質に対する遺伝子を構築すること、コピー数を変化
させること、レプリコンを変化させること、ファージに
クローニングすること、ならびに例えば、ＰＣＲ産物
（一方の端にａｔｔＢ部位、そして他方の端にｌｏｘＰ
部位を有する）、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡをクロー
ニングすることが含まれるが、これらに限定されない。

【０１０６】以下の実施例は、本発明の特定の好ましい
実施態様をさらに例示することを意図され、限定するこ
とを全く意図されない。

【０１０７】

【実施例】本発明の組換えクローニング法は、クローニ
ングベクターの変化のような、あるものを使用者にとっ
て有用にさせるための核酸セグメントの交換を達成す
る。これらのセグメントは、お互いに関して適切な方向
にある組換えシグナルによって両側で隣接されなければ
ならない。以下の実施例において、２つの親の核酸分子
（例えば、プラスミド）を、インサートドナーおよびベ
クタードナーと呼ぶ。インサートドナーは、ベクタード
ナーによって寄与された新しいベクターに結合されるよ
うになるセグメントを含む。両方の開始分子を含む組換
え中間体（単数または複数）は、コインテグレート（単
数または複数）と呼ばれる。第２の組換え事象は、２つ
の娘分子を産生し、これらは産物（所望の新しいクロー
ン）および副産物と呼ばれる。

【０１０８】（緩衝液）本発明の反応において、種々の
公知の緩衝液を使用し得る。制限酵素については、製造
者によって推奨される緩衝液の使用が望ましい。代替緩
衝液が、文献から容易に見出され得るか、または当業者
によって案出され得る。

【０１０９】実施例１〜３。λインテグラーゼのための
１つの例示的な緩衝液には、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５〜７．８）、７０ｍＭＫＣｌ、
５ｍＭスペルミジン、０．５ｍＭＥＤＴＡ、および
０．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ならびに
必要に応じて１０％グリセロールが含まれる。

【０１１０】Ｐ１Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つ
の好ましい緩衝液には、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、３３ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭス
ペルミジン、および０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アル
ブミンが含まれる。

【０１１１】λ ＩｎｔおよびＰ１Ｃｒｅに類似する
他の部位特異的リコンビナーゼのための緩衝液は、当該
分野で公知であるか、または特に上記の緩衝液に照らし
て、当業者によって経験的に決定され得るかのいずれか
である。

【０１１２】（実施例１：ＣｒｅならびにＣｒｅおよび
Ｉｎｔを用いる組換えクローニング）２対のプラスミド
を、２つの異なる方法においてインビトロ組換えクロー
ニング法を行うために構築した。一方の対であるｐＥＺ
Ｃ７０５およびｐＥＺＣ７２６（図２Ａ）を、Ｃｒｅお
よびλインテグラーゼとともに用いられる、ｌｏｘＰお
よびａｔｔ部位を有して構築した。他方の対であるｐＥ
ＺＣ６０２およびｐＥＺＣ６２９（図３Ａ）は、Ｃｒｅ
のためのｌｏｘＰ（野生型）部位および１塩基（全３４
中）においてｌｏｘＰと異なる第２の変異体ｌｏｘ部位
（ｌｏｘＰ５１１）を含んだ。本発明の組換えクロー
ニングに対する最小の要求は、各プラスミドにおける２
つの組換え部位（一般に、ＸおよびＹ、ならびにＸ’お
よびＹ’）である。いずれかまたは両方の型の部位が組
換えて、コインテグレート（例えば、ＸおよびＸ’）を
形成し得る場合、およびいずれかまたは両方の（しか
し、コインテグレートを形成する型と異なる部位である
必要がある）が、組換えて、コインテグレート（例え
ば、ＹおよびＹ’）から産物または副産物プラスミドを
切り出し得る場合、組換えクローニングが起こる。同一
のプラスミド上の組換え部位は、組換えないことが重要
である。本発明の組換えクローニングは、Ｃｒｅのみを
用いて行われ得ることが見出された。（Ｃｒｅのみ）２つのプラスミドを、この概念を示すた
めに構築した（図３Ａを参照のこと）。ｐＥＺＣ６２９
が、ベクタードナープラスミドであった。これは、構成
性薬剤マーカー（クロラムフェニコール耐性）、複製起
点、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ５１１部位、条件的薬剤マ
ーカー（トランスポゾンＴｎ１０のテトラサイクリン耐
性オペロンのオペレーター／プロモーターによってその
発現が制御されるカナマイシン耐性）、およびｔｅｔリ
プレッサータンパク質に対する構成性に発現される遺伝
子ｔｅｔＲを含んでいた。ｐＥＺＣ６２９を含むＥ．ｃ
ｏｌｉ細胞は、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
に対して耐性であるが、１００μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンに対して感受性であった。ｐＥＺＣ６０２が、インサ
ートドナープラスミドであり、これは、異なる薬剤マー
カー（アンピシリン耐性）、複製起点、ならびにマルチ
クローニング部位に隣接しているｌｏｘＰおよびｌｏｘ
Ｐ５１１部位を含んだ。

【０１１３】本実験は、以下の２つのパートからなっ
た：（パートＩ：各々約７５μｇのｐＥＺＣ６０２およびｐ
ＥＺＣ６２９を全容積３０μｌのＣｒｅ緩衝液（５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３３ｍＭＮａ
Ｃｌ、５ｍＭスペルミジン−ＨＣｌ、５００μｇ／ｍ
ｌウシ血清アルブミン）中で混合した。）２つの１０
μｌアリコートを、新しいチューブに移した。１つのチ
ューブに、０．５μｌのＣｒｅタンパク質（約４単位／
μｌ；ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９（１９８
４）に従って、部分精製した）を入れた。両方のチュー
ブを、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、７
０℃で１０分間インキュベートした。各反応物のアリコ
ートを希釈し、そしてＤＨ５αに形質転換した。発現
後、アリコートを、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコ
ール；１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋２００μｇ／
ｍｌメチシリン；または１００μｇ／ｍｌカナマイシ
ン上にプレートした。結果：表１を参照のこと。Ｃｒｅ
を含まない反応物は、１．１１×１０^６個のアンピシリ
ン耐性コロニー（インサートドナープラスミドｐＥＺＣ
６０２由来）；７．８×１０^５個のクロラムフェニコー
ル耐性コロニー（ベクタードナープラスミド由来）；お
よび１４０個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラ
ウンド）を生じた。Ｃｒｅを添加した反応物は、７．５
×１０^５個のアンピリン耐性コロニー（インサートドナ
ープラスミドｐＥＺＣ６０２由来）；６．１×１０^５個
のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナー
プラスミドｐＥＺＣ６２９由来）；および７６０個のカ
ナマイシン耐性コロニー（バックグラウンドコロニーお
よび組換えクローニング産物プラスミド由来のコロニー
の混合物）を生じた。分析：Ｃｒｅの存在において、カ
ナマイシンプレート上のコロニーの数がずっと多かった
ので、それらの多数またはほとんどが所望の産物プラス
ミドを含むと予想された。

【０１１４】

【表１】パートＩＩ：「＋Ｃｒｅ」カナマイシンプレート由来の
２４コロニーをひろい、そして１００μｇ／ｍｌカナマ
イシンを含む培地中に接種した。ミニプレップを行い、
そしてミニプレップＤＮＡ（非切断あるいはＳｍａＩま
たはＨｉｎｄＩＩＩで切断を電気泳動した。結果：２４
個のミニプレップ中１９個は、産物プラスミドについて
予想されるサイズの超らせん状のプラスミドを示した。
１９個の全ては、予想されるＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩ制限フラグメントを示した。分析：Ｃｒｅのみのス
キームを示した。詳細には、約７０％（２４個中１９
個）の産物コロニーを生じることが示された。効率は、
約０．１％（６．１×１０^５個のクロラムフェニコール
耐性コロニーから７６０個のカナマイシン耐性クローン
が得られた）であった。

【０１１５】（Ｃｒｅ＋インテグラーゼ）本方法を示す
ために使用されるプラスミドは、ベクタードナープラス
ミドであるｐＥＺＣ７２６がｌｏｘＰ５１１の代わり
にａｔｔＰ部位を含んだこと、およびインサートドナー
プラスミドであるｐＥＺＣ７０５がｌｏｘＰ５１１の
代わりにａｔｔＢ部位を含んだことを除き上記で使用さ
れたプラスミドに正確に類似する（図２Ａ）。

【０１１６】この実験は、以下の３つのパートからなっ
た：パートＩ：約５００ｎｇのｐＥＺＣ７０５（インサート
ドナープラスミド）を、アンピシリン耐性遺伝子内でプ
ラスミドを直鎖化するＳｃａＩを用いて切断した。（λ
インテグラーゼ反応は、歴史的に直鎖状態のａｔｔＢプ
ラスミドを用いて行われている（Ｈ．Ｎａｓｈ，私信）
ので、これを行った）。しかし、インテグラーゼ反応
は、超らせん状の両方のプラスミドを用いて良好に進行
することが後に見出された。次いで、直鎖状プラスミド
をエタノール沈殿し、そして２０μｌのλインテグラー
ゼ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ７．
８）、７０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭスペルミジン−ＨＣ
ｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌウシ血清
アルブミン）中で溶解した。また、約５００ｎｇのベク
タードナープラスミドｐＥＺＣ７２６をエタノール沈殿
し、そして２０μｌのλインテグラーゼ緩衝液中で溶解
した。使用の直前に、λインテグラーゼ（２μｌ、３９
３μｇ／ｍｌ）を融解し、そして１８μｌの冷λインテ
グラーゼ緩衝液を添加することにより希釈した。１μｌ
のＩＨＦ（組み込み宿主因子、２．４ｍｇ／ｍｌ、アク
セサリータンパク質）を、１５０μｌの冷λインテグラ
ーゼ緩衝液中で希釈した。アリコート（２μｌ）の各Ｄ
ＮＡを、全量１０μｌで、λインテグラーゼ緩衝液（各
々１μｌのλインテグラーゼおよびＩＨＦを含むまたは
含まない）と混合した。混合物を、２５℃で４５分間イ
ンキュベートし、次いで、７０℃で１０分間インキュベ
ートした。各反応物の半分をアガロースゲルに供した。
結果：インテグラーゼおよびＩＨＦの存在下で、全ＤＮ
Ａの約５％が、直鎖状のコインテグレート形態に転換さ
れた。分析：インテグラーゼおよびＩＨＦの活性を確認
した。

【０１１７】パートＩＩ：３μｌの各反応物（すなわ
ち、インテグラーゼおよびＩＨＦを含むまたは含まな
い）を、２７μｌのＣｒｅ緩衝液（上記）中で希釈し、
次いで、各反応物を２つの１０μｌアリコートに分割し
た（全部で４つ）。これらの反応物の２つに、０．５μ
ｌのＣｒｅタンパク質（上記）を添加し、そして全ての
反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで７
０℃で１０分間インキュベートした。各反応物に、ＴＥ
緩衝液（９０μｌ；ＴＥ：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ）を添加し、そし
て各１μｌを、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し
た。形質転換混合物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン
＋２００μｇ／ｍｌメチシリン；３０μｇ／ｍｌク
ロラムフェニコール；または１００μｇ／ｍｌカナマ
イシン上にプレートした。結果：表２を参照のこと。

【０１１８】

【表２】分析：Ｃｒｅタンパク質は、形質転換を減少させた。こ
の効果について調節した場合、カナマイシン耐性コロニ
ー数は、Ｃｒｅおよびインテグラーゼの両方を用いた場
合、コントロール反応物と比較して、１００倍より多く
増加した。これは、９９％より高い特異性を示唆した。

【０１１９】パートＩＩＩ：３８個のコロニーを、イン
テグラーゼ＋Ｃｒｅプレートからひろい、ミニプレップ
ＤＮＡを作製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで切断して診断
マッピング情報を得た。結果：３８個全てが正確に予想
されたフラグメントザイズを有した。分析：Ｃｒｅ＋λ
インテグラーゼ法は、Ｃｒｅのみよりずっと高い特異性
を有することが観察された。結論：Ｃｒｅ＋λインテグ
ラーゼ法を示した。効率および特異性は、Ｃｒｅのみよ
りもずっと高かった。

【０１２０】（実施例２：クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の真核生物細胞における発
現のためのベクターへのサブクローン化のためのインビ
トロ組換えクローニングの使用（図４Ａ））ｌｏｘＰ部
位とａｔｔＢ部位の間でクローン化され、その結果ｌｏ
ｘＰ部位が遺伝子の５’末端に位置する、Ｅ．ｃｏｌ
ｉのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子を含む、インサートドナープラスミドであるｐＥ
ＺＣ８４３を構築した（図４Ｂ）。ｌｏｘＰ部位に隣接
するサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含
む、ベクタードナープラスミドであるｐＥＺＣ１００３
を構築した（図４Ｃ）。１μｌアリコートの各超らせん
状のプラスミド（約５０ｎｇの粗製ミニプレップＤＮ
Ａ）を、等量のλインテグラーゼ緩衝液（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、７０ｍＭＫＣｌ、５ｍ
Ｍスペルミジン、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．２５ｍ
ｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）およびＣｒｅリコンビ
ナーゼ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、３３ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭスペルミジン、
０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）、２単位のＣ
ｒｅリコンビナーゼ、１６ｎｇの組み込み宿主因子、お
よび３２ｎｇ λインテグラーゼを含む１０μｌの反応
物中で合わせた。３０℃で３０分間インキュベートした
後、７５℃で１０分間インキュベートし、１μｌをコン
ピテントＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α株（ＬｉｆｅＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に形質転換した。形
質転換体のアリコートを、２００μｇ／ｍｌカナマイ
シンを含む寒天プレート上に広げ、そして３７℃で一晩
インキュベートした。それ以外の同一のコントロール反
応は、ベクタードナープラスミドのみを含んだ。コント
ロール反応形質転換の１０％を受けたプレートから、１
つのコロニーを得た；組換えクローニング反応の１０％
を受けたプレートからは１４４のコロニーを得た。これ
らの数は、９９％より多い組換えクローニングコロニー
が、所望の産物プラスミドを含んだことを示唆した。６
個の組換えクローニングコロニーから作製したミニプレ
ップＤＮＡから、予想されたサイズのプラスミド（５０
２６塩基対）であるＣＭＶＰｒｏｄを得た。ＮｃｏＩを
用いた制限消化から、６個全てのプラスミドについてＣ
ＭＶプロモーターの下流にクローン化したクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼと予想されるフラ
グメントを得た。

【０１２１】（実施例３：終止コドンを有さないａｔｔ
Ｂ部位によって隣接されるサブクローン化されたＤＮＡ
セグメント）（パートＩ：背景）上記の実施例は、転写が組換え部位
を横切る転写融合に適する。しかし、ａｔｔＲ部位およ
びｌｏｘＰ部位の両方は、両方の鎖に複数の終止コドン
を含み、従って、コード配列が組換え部位を横断しなけ
ればならない（１つのリーディングフレームのみがｌｏ
ｘＰ部位の各鎖上で利用可能である）場合、転写融合は
困難であり得るか、または不可能であり得る（ａｔｔＲ
またはａｔｔＬにおいて）。

【０１２２】サブクローニングのための主要な理由は、
タンパク質ドメインを融合することである。例えば、グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメイン
の目的のタンパク質への融合は、融合タンパク質がグル
タチオンアガロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．、
１９９５カタログ）のアフィニティークロマトグラフィ
ーによって精製されることを可能にする。目的のタンパ
ク質が連続的なヒスチジンの連続（例えば、Ｈｉｓ６）
に融合される場合、融合タンパク質は、金属イオンを含
むキレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）のアフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製され得る。活
性、溶解性、安定性などについてアミノ末端融合体とカ
ルボキシ末端融合体とを比較することがしばしば望まれ
る。

【０１２３】バクテリオファージλ組み込み系のａｔｔ
Ｂ部位を、ｌｏｘＰに対する代替物として試験した。な
ぜなら、それらは小さく（２５ｂｐ）、そしていくら
かの配列可撓性を有するからである（Ｎａｓｈ，Ｈ．
Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８４：４０４９−４０５３（１９８７））。全ての終
止コードを取り除く複数の変異により、組換えサブクロ
ーニングのための有用な組換え部位を得るであろうこと
は以前には示唆されていなかった。

【０１２４】λバクテリオファージにおける部位特異的
組換えのための標準的な表記（Ｗｅｉｓｂｅｒ，Ｌａ
ｍｂｄａＩＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘら編、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮＹ（１９８
９））を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における組換
え反応に関与する核酸領域を以下に示す：

【０１２５】

【化５】ここで：Ｏは、ファージおよびＥ．ｃｏｌｉゲノムの
両方に見出される１５ｂｐコアＤＮＡ配列を示す；Ｂお
よびＢ’は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム中のコアに隣接する
約５塩基を示す；およびＰ１、Ｈ１、Ｐ２、Ｘ、Ｈ２、
Ｃ、Ｃ’、Ｈ’、Ｐ’１、Ｐ’２、およびＰ’３は、バ
クテリオファージλゲノム中のタンパク質結合ドメイン
をコードする公知のＤＮＡ配列を示す。反応は、タンパ
ク質Ｘｉｓ（エキシジョナーゼ）の存在下で可逆的であ
り；ａｔｔＬとａｔｔＲとの間の組換えは、その組み込
まれた状態からλゲノムを正確に切り出し、ａｔｔＰ、
およびａｔｔＢを含む直鎖状Ｅ．ｃｏｌｉゲノムを含
む環状λゲノムを再生する。

【０１２６】（パートＩＩ：変異体ａｔｔ部位を含むプ
ラスミドの構築および試験）変異体ａｔｔＬ部位および
変異体ａｔｔＲ部位を構築した。重要なことに、Ｌａｎ
ｄｙら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５
８：９１３（１９８９））は、ａｔｔＰのＰ１および
Ｈ１ドメインの欠失が、切り出し反応を促進し、そして
組み込み反応を除去し、その結果切り出し反応を不可逆
的にさせることを観察した。従って、変異がａｔｔＲに
導入されて、Ｐ１およびＨ１ドメインもまた欠失された
ので、本実施例におけるａｔｔＲ部位は、Ｐ１領域およ
びＨ１領域を欠き、そして取り除かれたＮｄｅＩ部位を
有し（塩基２７６３０をＣからＧに改変した）、そして
バクテリオファージ座標２７６１９〜２７７３８（Ｇｅ
ｎＢａｎｋｒｅｌｅａｓｅ９２．０，ｂｐ：ＬＡＭ
ＣＧ、「バクテリオファージλの完全な配列」）に対応
する配列を含む。

【０１２７】野生型ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位の組換
えによって産生されるａｔｔＢの配列は以下のとおりで
ある：

【０１２８】

【化６】終止コドンを斜体にし、そして下線を引いた。ａｔｔ
Ｌ、ａｔｔＲ、およびａｔｔＰの配列はａｔｔＢ配列に
由来し得、そしてバクテリオファージλの境界は、ａｔ
ｔＬおよびａｔｔＲ内（座標２７６１９〜２７８１８）
に含まれたことに留意のこと。

【０１２９】変異体ａｔｔＲ１部位およびａｔｔＬ１部
位を組み換えた場合、配列ａｔｔＢ１が産生された（変
異を太字の、大きな文字で表す）：

【０１３０】

【化７】４つの終止コドンが消失していることに留意のこと。

【０１３１】ａｔｔＲ１配列およびａｔｔＬ１配列（太
字）にさらなる変異を導入した場合、ａｔｔＲ２部位お
よびａｔｔＬ２部位を得た。ａｔｔＲ２およびａｔｔＬ
２の組換えは、ａｔｔＢ２部位を産生した：

【０１３２】

【化８】上記のａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位の組換え活性を
以下のようにアッセイした。プラスミドｐＥＺＣ７０５
のａｔｔＢ部位（図２Ｂ）を、ａｔｔＬｗｔ、ａｔｔＬ
１、またはａｔｔＬ２と置換した。プラスミドｐＥＺＣ
７２６のａｔｔＰ部位（図２Ｃ）を、ａｔｔＲｗｔ（Ｐ
１およびＨ１領域を欠く）、ａｔｔＲ１、またはａｔｔ
Ｒ２と置換した。従って、得られたプラスミドは、Ｃ
ｒｅによって媒介されて、それらのｌｏｘＰ部位を介し
て組換え得、そしてＩｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦによ
って媒介されて、それらのａｔｔＲ部位およびａｔｔＬ
部位を介して組換え得る。プラスミドの対を、Ｃｒｅ、
Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦと混合しそして反応さ
せ、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞に形質転換し、そ
してカナマイシンを含有する寒天上にプレートした。結
果を表３に示す：

【０１３３】

【表３】上記のデータは、野生型ａｔｔ部位およびａｔｔ１部位
は低い程度に組換えたが、ａｔｔ１部位およびａｔｔ２
部位は互いに検出可能には組換えないことをを示す。

【０１３４】（パートＩＩＩ：目的のＤＮＡセグメント
に隣接する両方のａｔｔＢ部位のコア領域が終止コドン
を含まない場合の、組換えが示された。）関与するプラ
スミドの物理的な状態が、組換え効率に影響することが
見出された。

【０１３５】適切なａｔｔ部位を、ｐＥＺＣ７０５およ
びｐＥＺＣ７２６中に移動し、プラスミドｐＥＺＣ１４
０５（図５Ｇ）（ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２）ならび
にｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）（ａｔｔＬ１およびａｔ
ｔＬ２）を作製した。本実験における所望のＤＮＡセグ
メントは、ｐＥＺＣ１５０２の２つのａｔｔＬ部位の間
にクローン化されたクロラムフェニコール耐性遺伝子の
コピーであった。プラスミドの対を、Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、
およびＩＨＦ（ｌｏｘＰ部位が存在しなかったのでＣｒ
ｅはなし）を用いてインビトロで組換えた。表４に示す
ように、親プラスミドの両方が環状である場合、または
一方のプラスミドが環状でありかつ他方が直鎖状の場合
に、所望のカナマイシン耐性コロニーの収率を決定し
た：

【０１３６】

【表４】分析：変異体ａｔｔＲ部位および変異体ａｔｔＬ部位を
用いる組換えクローニングを確認した。所望のＤＮＡセ
グメントは、いずれの鎖においても終止コドンを全く含
まないａｔｔＢ部位の間にサブクローン化される。両方
の関与する分子が超らせん状であり、そしてタンパク質
が制限されている場合、切り出し反応がより効率的であ
った初期の観察のために、（一方の親が直鎖状の場合
の）産物ＤＮＡの増大した収率は、予想外であった（Ｎ
ｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら、Ｃｅｌｌ５０：７７９−７８
８（１９８７））。

【０１３７】（実施例４：逆方向反復を有さない組換え
クローニングの実証）（パートＩ：原理）上記実施例３は、適切な組換え部位
の逆方向反復を含むプラスミド（例えば、プラスミドｐ
ＥＺＣ１５０２中のａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２）（図
５Ｈ）が、組換えて、これも逆方向で終止コドンを有さ
ないａｔｔＢ部位によって隣接される所望のＤＮＡセグ
メントが得られ得ることを示した。逆方向反復のインビ
ボおよびインビトロでの影響が危惧された。例えば、逆
方向でａｔｔＢ部位によって隣接される所望のＤＮＡセ
グメントの転写は、ヘアピン構造を形成し得る一本鎖Ｒ
ＮＡ分子を生じ、その結果、翻訳を阻害し得る。

【０１３８】類似の組換え部位の逆方向を、部位を直列
反復配置のａｔｔ部位に配置することにより回避し得
る。親プラスミドの各々が野生型ａｔｔＬ部位および野
生型ａｔｔＲ部位を直列反復で有する場合、Ｉｎｔ、Ｘ
ｉｓ、およびＩＨＦタンパク質は、分子内反応において
それらの部位によって隣接されるＤＮＡセグメントを単
に取り除く。しかし、上記の実施例３に記載の変異体部
位は、分子内組換えを所望のように進行させながら、分
子内反応を阻害することが可能であり得ることを示唆し
た。パートＩＩ：組換えクローニングのための逆方向反復を
有さないプラスミドの構造プラスミドｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）中のａｔｔＲ２
配列を、反対方向でのａｔｔＬ２と置換し、ｐＥＺＣ１
６０３（図６Ａ）を作製した。ｐＥＺＣ１５０２（図５
Ｈ）のａｔｔＬ２配列を、反対方向でのａｔｔＲ２と置
換し、ｐＥＺＣ１７０６（図６Ｂ）を作製した。これら
のプラスミドの各々は、ａｔｔ１コアとａｔｔ２コアの
間の分子内反応を非常に非効率的にするコア領域中の変
異を含んだ（実施例３、上記を参照のこと）。

【０１３９】プラスミドｐＥＺＣ１４０５、ｐＥＺＣ１
５０２、ｐＥＺＣ１６０３およびｐＥＺＣ１７０６を、
Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）で精製
した。プラスミドｐＥＺＣ１４０５およびｐＥＺＣ１６
０３のアリコートを、ＸｂａＩを用いて直鎖化した。プ
ラスミドｐＥＺＣ１５０２およびｐＥＺＣ１７０６のア
リコートを、ＡｌｗＮＩを用いて直鎖化した。１００ｎ
ｇのプラスミドを、Ｉｎｔ（４３．５ｎｇ）、Ｘｉｓ
（４．３ｎｇ）、およびＩＨＦ（８．１ｎｇ）を含む最
終容量１０μｌの緩衝液（等容量の５０ｍＭＴｒｉｓ
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、７０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭスペルミジ
ン、０．５ｍＭＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ、１０％グリセロール）中で混合した。反応物を２５
℃で４５分間、６５℃で１０分間インキュベートし、そ
して１μｌをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し
た。発現後、アリコートを、２００μｇ／ｍｌのカナマ
イシンを含有する寒天プレート上に広げ、そして３７℃
でインキュベートした。

【０１４０】コロニー数／１μｌの組換え反応物として
表現した結果を表５に示す：

【０１４１】

【表５】分析：全ての配置において（すなわち、環状または直鎖
状）、ｐＥＺＣ１４０５×ｐＥＺＣ１５０２対（逆方向
反復配置でのａｔｔ部位を有する）は、ｐＥＺＣ１６０
３×ｐＥＺＣ１７０６対（ヘアピン形成を回避するため
に変異されたａｔｔ部位を有する）よりもより効率的で
あった。ｐＥＺＣ１６０３×ｐＥＺＣ１７０６対は、ｐ
ＥＺＣ１４０５×ｐＥＺＣ１５０２対より高いバックグ
ラウンドおよびより低い効率を与えた。より低い効果で
あるが、ｐＥＺＣ１６０３×ｐＥＺＣ１７０６反応由来
の８０％以上のコロニーが、所望のプラスミド産物を含
むと予想された。１つのパートナーを直鎖状にすること
が、全ての場合において反応を刺激した。

【０１４２】（パートＩＩＩ：産物プラスミドの構造の
確認）直鎖状ｐＥＺＣ１４０５（図５Ｇ）×環状ｐＥＺ
Ｃ１５０２（図５Ｈ）、環状ｐＥＺＣ１４０５×直鎖状
ｐＥＺＣ１５０２、直鎖状ｐＥＺＣ１６０３（図６Ａ）
×環状ｐＥＺＣ１７０６（図６Ｂ）、および環状ｐＥＺ
Ｃ１６０３×直鎖状ｐＥＺＣ１７０６反応由来の各々６
個のコロニーを、富化培地にひろい、そしてミニプレッ
プＤＮＡを調製した。ＳｓｐＩを用いる診断的切断に
より、２４個のコロニーについて予想される制限フラグ
メントを得た。

【０１４３】分析：同一の分子上の変異体ａｔｔＬ部位
および変異体ａｔｔＲ部位を有するプラスミド間の組換
え反応により、高い程度の特異性を有して、所望のプラ
スミド産物を得た。

【０１４４】（実施例５：毒性遺伝子を用いる組換えク
ローニング）（パートＩ：背景）制限酵素ＤｐｎＩは、配列ＧＡＴ
Ｃを認識し、そしてＡがｄａｍメチラーゼによってメチ
ル化された場合のみ、この配列を切断する。大部分の一
般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ株は、ｄａｍ^＋であ
る。細胞の染色体が多数の断片に切断されるので、Ｅ．
ｃｏｌｉのｄａｍ^＋株におけるＤｐｎＩの発現は致
死性である。しかし、ｄａｍ⁻細胞において、Ｄｐｎ
Ｉの発現は無害である。なぜなら染色体は、ＤｐｎＩ
切断に対して免疫性であるからである。

【０１４５】ベクタードナーが、組換え部位によって分
離される２つのセグメントＣおよびＤを含む一般的な組
換えクローニングスキームにおいて、所望の産物の選択
は、セグメントＤの存在およびセグメントＣの非存在に
ついての選択に依存する。元の実施例において、セグメ
ントＤは、セグメントＣ上に見出されるリプレッサー遺
伝子によってネガティブに制御される薬剤耐性遺伝子
（Ｋｍ）を含んだ。Ｃが存在する場合、Ｄを含む細胞
は、耐性遺伝子がオフになっていたのでカナマイシンに
対して耐性ではなかった。

【０１４６】ＤｐｎＩ遺伝子は、上記実施態様のリプ
レッサー遺伝子を置換し得る毒性遺伝子の例である。セ
グメントＣがＤｐｎＩ遺伝子産物を発現するする場
合、ｄａｍ^＋宿主へのプラスミドＣＤの形質転換は細胞
を死滅させる。セグメントＤを、例えば組換えクローニ
ングによって新しいプラスミド移入する場合、毒性遺伝
子がもはや存在しないので、薬剤マーカーについての選
択は成功する。

【０１４７】（パートＩＩ：毒性遺伝子としてＤｐｎ
Ｉを用いるベクタードナーの構築）ＤｐｎＩエンドヌ
クレアーゼをコードする遺伝子を、プライマー５’ＣＣ
ＡＣＣＡＣＡＡＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＧＧ
ＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＧ３’
（配列番号１７）および５’ＣＣＡＣＣＡＣＡＡ
ＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧＡＣＡＧＣ
ＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＴ３’（配列番号１８）な
らびに鋳型としてＤｐｎＩ遺伝子を含むプラスミド
（ＳａｎｆｏｒｄＡ．Ｌａｃｋｓ，Ｂｒｏｏｋｈａ
ｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕ
ｐｔｏｎ，ＮｅｗＹｏｒｋから入手したプラスミド由
来であり；またＡＴＣＣ６７４９４としてアメリカン
タイプカルチャーコレクションから入手可能である）を
用いるＰＣＲによって増幅した。

【０１４８】さらなる変異を、所望の塩基変化を含むプ
ライマーを用いる既存のａｔｔＬドメインおよびａｔｔ
Ｒドメインを増幅することによって、それぞれ、ａｔｔ
ＬおよびａｔｔＲのＢ領域およびＢ’領域に導入した。
変異体ａｔｔＬ３（オリゴＸｉｓ１１５を用いて作製さ
れた）およびａｔｔＲ３（オリゴＸｉｓ１１２を用いて
作製された）の組換えにより、以下の配列（太字がａｔ
ｔＢ１と異なる）を有するａｔｔＢ３を得た：

【０１４９】

【化９】既存の遺伝子ドナープラスミドのａｔｔＬ２の代わりに
ａｔｔＬ３配列をクローン化し、プラスミドｐＥＺＣ２
９０１を得た（図７Ａ）。既存のベクタードナープラス
ミドのａｔｔＲ２の代わりにａｔｔＲ３配列をクローン
化し、プラスミドｐＥＺＣ２９１３を得た（図７Ｂ）。
ＤｐｎＩ遺伝子をプラスミドｐＥＺＣ２９１３にクロー
ン化して、ｔｅｔリプレッサー遺伝子を置換した。得ら
れたベクタードナープラスミドをｐＥＺＣ３１０１と名
付けた（図７Ｃ）。ｐＥＺＣ３１０１をｄａｍ⁻ＳＣＳ
１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した場
合、数百のコロニーを得た。同じプラスミドをｄａｍ^＋
ＤＨ５α株に形質導入した場合、たとえＤＨ５α細胞が
ＳＣＳ１１０細胞より約２０倍コンピテントであって
も、ほんの１コロニーを生じただけであった。Ｄｐｎ
Ｉ遺伝子を含まない関連するプラスミドを同じの２つの
細胞株に形質転換した場合、ＤＨ５α細胞から４４８の
コロニーが得られたが、ＳＣＳ１１０細胞からは２８個
のコロニーが生じた。これは、ＤｐｎＩ遺伝子がプラ
スミドｐＥＺＣ３１０１（図７Ｃ）上で発現され、そし
てｄａｍ^＋ＤＨ５α細胞を死滅させるが、ｄａｍ⁻ＳＣ
Ｓ１１０細胞を死滅させないという証拠である。

【０１５０】（パートＩＩＩ：ＤｐｎＩ選択を用いる
組換えクローニングの実証）プラスミド対を使用し、毒
性遺伝子ＤｐｎＩに依存する産物についての選択を用
いる組換えクローニングを示した。プラスミドｐＥＺＣ
３１０１（図７Ｃ）を、ＭｌｕＩを用いて直鎖状に
し、そして環状プラスミドｐＥＺＣ２９０１（図７Ａ）
と反応させた。リプレッサー遺伝子による薬剤耐性の制
御に基づく選択を用いるプラスミドの第２の対を、コン
トロールとして使用した：プラスミドｐＥＺＣ１８０２
（図７Ｄ）を、ＸｂａＩを用いて直鎖状にし、そして
環状プラスミドｐＥＺＣ１５０２（図５Ｈ）と反応させ
た。以前の実施例におけると同一の緩衝液ならびにタン
パク質Ｘｉｓ、Ｉｎｔ、およびＩＨＦを含む８マイクロ
リットルの反応物を、２５℃で４５分間、次いで７５℃
で１０分間インキュベートし、そして１μｌアリコート
を、表６に示すようにＤＨ５α（すなわち、ｄａｍ ^＋）
コンピテント細胞に形質転換した。

【０１５１】

【表６】ミニプレップＤＮＡを、反応＃２由来の４つのコロニー
から調製し、そして制限酵素ＳｓｐＩを用いて切断し
た。全てから予想されるフラグメントを得た。

【０１５２】分析：毒性遺伝子を用いる選択を用いるサ
ブクローニングを示した。予想される構造のプラスミド
を産生した。

【０１５３】（実施例６：融合タンパク質作製のため
の、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いる遺伝子のク
ローニングおよび組換えクローニングを用いる遺伝子の
サブクローニング）（パートＩ：既存の発現ベクターの組換えクローニング
のためのベクタードナーへの変換）既存のベクターの機
能的ベクタードナーへの変換に有用なカセットを、以下
のように作製した。プラスミドｐＥＺＣ３１０１（図７
Ｃ）を、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、
末端を平滑にするためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよ
びｄＮＴＰで処理し、所望でないＤＮＡフラグメントを
小さくするためにＳｍａＩ、ＨｐａＩ、およびＡｌｗ
ＮＩを用いてさらに消化し、そしてａｔｔＲＩ−Ｃｍ
^Ｒ−ＤｐｎＩ−ａｔｔＲ−３ドメインを含む２．６ｋ
ｂカセットをゲル精製した。精製されたカセットの濃度
を、約７５ｎｇＤＮＡ／μｌであると評価した。

【０１５４】プラスミドｐＧＥＸ−２ＴＫ（図８Ａ）
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、タンパク質グルタチオンＳ
トランスフェラーゼと、そのマルチクローニング部位に
挿入され得る任意の第２のコード配列との間の融合を可
能にする。ｐＧＥＸ−２ＴＫＤＮＡを、ＳｍａＩを用
いて消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理し
た。約７５ｎｇの上記の精製ＤＮＡカセットを、約１０
０ｎｇのｐＧＥＸ−２ＴＫベクターと５μｌ連結物中で
２．５時間連結し、次いで、１μｌをコンピテントＢＲ
Ｌ３０５６細胞（ＤＨ１０Ｂのｄａｍ⁻誘導体；市販の
ｄａｍ⁻株は、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．，由来のＤＭ１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ由
来のＳＣＳ１１０を含む）に形質転換した。形質転換混
合物のアリコートを、１００μｌ／ｍｌアンピシリン
（耐性遺伝子は、ｐＧＥＸ−２ＴＫ上に存在する）およ
び３０μｌ／ｍｌクロラムフェニコール（耐性遺伝子
は、ＤＮＡカセット上に存在する）を含有するＬＢ寒天
上にプレートした。コロニーをひろい、そしてミニプレ
ップＤＮＡを作製した。ｐＧＥＸ−２ＴＫ中のカセット
の方向を、ＥｃｏＲＩを用いる診断的切断によって決
定した。所望の方向を有するプラスミドを、ｐＥＺＣ３
５０１（図８Ｂ）と名付けた。

【０１５５】（パートＩＩ：３つのリーディングフレー
ムでのレポーター遺伝子の組換えクローニング遺伝子ド
ナープラスミドへのクローニング）ウラシルＤＮＡグリ
コシラーゼ（ＵＤＧ）クローニングは、クローニングベ
クターへＰＣＲ増幅産物をクローニングするための方法
である（米国特許第５，３３４，５１５号、本明細書中
でその全体が参考として援用される）。簡単に述べれ
ば、所望のＤＮＡセグメントのＰＣＲ増幅を、それらの
５’末端にチミジン塩基の代わりにウラシル塩基を含む
プライマーを用いて実施する。このようなＰＣＲ産物を
酵素ＵＤＧと共にインキュベートする場合、ウラシル塩
基は特異的に取り除かれる。これらの塩基の欠損は、Ｐ
ＣＲ産物ＤＮＡの末端における塩基対合を弱め、そして
適切な温度（例えば、３７℃）でインキュベートした場
合、このような産物の末端は、主として一本鎖化され
る。ＰＣＲ産物の３’末端に相補的である突出した３’
テールを含む直鎖状クローニングベクターの存在下でこ
のようなインキュベーションを行った場合、塩基対合
は、効率的にクローニングベクターにＰＣＲ産物をアニ
ーリングする。アニーリングされた産物を、形質転換に
よってＥ．ｃｏｌｉ細胞に導入した場合、インビボプ
ロセスは、効率的にそれを組換えプラスミドに変換す
る。

【０１５６】３つ全てのリーディングフレームでの任意
のＰＣＲ産物のクローニングを可能にするＵＤＧクロー
ニングベクターをｐＥＺＣ３２０１（図８Ｋ）から以下
のように調製した。８つのオリゴヌクレオチドが、Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得られ
た（全て５’→３’で記載される：ｒｆ１上部（ＧＧ
ＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＴＡＴＣＣＣＡＡＣ
ＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴ
ＣＡＧＧＧＴ）（配列番号１９）、ｒｆ１下部（ＣＡ
ＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＡＴ
ＡＴＣＧＴＡＡＴＣ）（配列番号２０）、ｒｆ２
上部（ＧＧＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＡＴＡＴＣ
ＣＣＡＡＣＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴ
ＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴ）（配列番号２１、ｒｆ
２下部（ＣＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴ
ＧＧＧＡＴＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴ）（配列番号
２３）、ｒｆ３上部（ＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＡＣ
ＧＡＴＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＧＡＡＡ
ＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＴ）（配列
番号２３）、ｒｆ３下部（ＣＡＧＧＴＴＴＴＣ
ＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＡＴＡＴＣＧＴＡＡＴ
ＣＴＴ）（配列番号２４）、カルボキシ上部（ＡＣＣ
ＧＴＴＴＡＣＧＴＧＧＡＴ）（配列番号２
５）、およびカルボキシ下部（ＴＣＧＡＧＴＣＣＡ
ＣＧＴＡＡＡＣＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡ
ＴＴＡ）（配列番号２６））。ｒｆ１、２および３上
部鎖ならびにカルボキシ下部鎖を、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いてその５’末端上でリン酸化し、次い
で各対の相補的な鎖をハイブリダイズした。プラスミド
ｐＥＺＣ３２０１（図８Ｋ）をＮｏｔＩおよびＳａｌ
Ｉを用いて切断し、そして切断プラスミドのアリコー
トをカルボキシ−オリゴ二重鎖（ＳａｌＩ末端）およ
びｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３二重鎖のいずれか（Ｎ
ｏｔＩ末端）と混合した（２５０ｐｍｏｌカルボキシオ
リゴ二重鎖と１０μｌ（約５ｐｍｏｌ）切断プラスミド
とを混合し、３つの２０μｌ容積に分割し、ｒｆ１、ｒ
ｆ２、またはｒｆ３二重鎖の５μｌ（２５０ｐｍｏｌ）
および２μｌ＝２単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼを各反応物
に添加した）。室温での９０分の連結後、各反応物を調
製用アガロースゲルに供し、そして２．１ｋｂのベクタ
ーバンドを溶出し、そして５０μｌのＴＥに溶解した。パートＩＩＩ：ＣＡＴおよびｐｈｏＡ遺伝子のＰＣＲプラスミドｐＡＣＹＣ１８４由来のクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子および
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアルカリホスファターゼ遺伝子で
あるｐｈｏＡを増幅するために、プライマーをＬｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，から得た。
プライマーは、ウラシル塩基を含む１２塩基５’伸長を
有し、その結果ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤ
Ｇ）でのＰＣＲ産物の処理は、ＤＮＡの各末端での塩基
対合を弱め、そして３’鎖が上記のｒｆ１、ｒｆ２、お
よびｒｆ３ベクターの突出す３’末端とのアニーリング
を可能にする。プライマーの配列（全て５’→３’で記
載）は以下のとおりであった：ＣＡＴ左、ＵＡＵＵＵ
ＵＣＡＧＧＧＵＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡ
ＡＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣＣ（配列番号
２７）；ＣＡＴ右、ＵＣＣＣＡＣＵＵＡＵＵＡ
ＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡ
ＴＣ（配列番号２８）；ｐｈｏＡ左、ＵＡＵＵＵＵ
ＣＡＧＧＧＵＡＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡ
ＡＡＡＣＣＧＧ（配列番号２９）；およびｐｈｏＡ
右、ＵＣＣＣＡＣＵＵＡＵＵＡＴＴＴＣＡＧ
ＣＣＣＣＡＧＧＧＣＧＧＣＴＴＴＣ（配列
番号３０）。次いで、プライマーを公知の方法工程（例
えば、米国特許第５，３３４，５１５号（これは本明細
書中にその全体が参考として援用される）を参照のこ
と）を用いるＰＣＲ反応のために使用し、そしてこれら
のプライマーを用いて得られたポリメラーゼ連鎖反応増
幅産物は、開始ＡＴＧを有するがいかなる転写シグナル
も有さないＣＡＴまたはｐｈｏＡ遺伝子を含んだ。さら
に、アミノ末端上のウラシル含有配列は、ＴＥＶプロテ
アーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）の切断部位をコードし、そしてカルボキシ末端上
のウラシル含有配列は、連続的なＴＡＡナンセンスコド
ンをコードした。

【０１５７】非精製ＰＣＲ産物（約３０ｎｇ）を、１×
ＲＥａｃｔ４緩衝液（ＬＴＩ）および１単位のＵＤＧ
（ＬＴＩ）を含む１０μｌの反応物中で、ゲル精製され
た、直鎖状ｒｆ１、ｒｆ２、またはｒｆ３クローニング
ベター（約５０ｎｇ）と混合した。３７℃での３０分
後、各反応の１μｌアリコートを、コンピテントＥ．
ｃｏｌｉＤＨ５α細胞（ＬＴＩ）に形質転換し、そし
て５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天上にプ
レートした。コロニーをひろい、そしてミニプレップＤ
ＮＡの分析は、ＣＡＴ遺伝子が、リーディングフレーム
１（ｐＥＺＣ３６０１）（図８Ｃ）、リーディングフレ
ーム２（ｐＥＺＣ３６０９）（図８Ｄ）、およびリーデ
ィングフレーム３（ｐＥＺＣ３６１７）（図８Ｅ）でク
ローン化され、そしてｐｈｏＡ遺伝子が、リーディング
フレーム１（ｐＥＺＣ３６０６）（図８Ｆ）、リーディ
ングフレーム２（ｐＥＺＣ３６１３）（図８Ｇ）、およ
びリーディングフレーム３（ｐＥＺＣ３６２１）（図８
Ｈ）でクローン化されたことを示した。パートＩＶ：ＣＡＴまたはｐｈｏＡのＵＤＧクローニン
グベクターからＧＳＴ融合ベクターへのサブクローニン
グ３つ全てのリーディングフレームでのＧＳＴとＣＡＴま
たはｐｈｏＡのいずれかとの間の融合物をコードするプ
ラスミドを、以下の組換えクローニングによって構築し
た。ＧＳＴベクタードナーｐＥＺＣ３５０１（図８Ｂ）
（上記のＰｈａｒｍａｃｉａプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ
Ｋ由来）のミニプレップＤＮＡを、ＣｌａＩを用いて
直鎖状にした。約５ｎｇのベクタードナーを、緩衝液お
よび組換えタンパク質Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、およびＩＨＦ
（上記）を含む８μｌの反応物中、ＣＡＴまたはｐｈｏ
Ａを含む各約１０ｎｇの適切な環状遺伝子ドナーベクタ
ーと混合した。インキュベーション後、１μｌの各反応
物を、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α株に形質転換し、そして
表７に示すようにアンピシリン上にプレートした。

【０１５８】

【表７】（パートＶ：融合タンパク質の発現）各形質転換由来の
２つのコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有する１７×１００ｍｍのプラスチックチューブ（Ｆ
ａｌｃｏｎ２０５９，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ）中の２ｍｌのリッチ培地（ＣｉｒｃｌｅＧｒｏ
ｗ，Ｂｉｏ１０１Ｉｎｃ．）中にひろい、そして３
７℃で約４時間強く振盪し、その時培養物は視覚的に濁
っていた。１ｍｌの各培養物を、ＧＳＴの発現を誘導す
るために１０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＩＰＴＧを含む新
しいチューブに移した。さらなる２時間のインキュベー
ション後、全ての培養物は、ほぼ同じ濁度を有した；１
つの培養物のＡ６００は、１．５であった。０．３５ｍ
ｌの各培養物由来の細胞を回収し、そしてサンプル緩衝
液（ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含む）で
処理し、そして細胞の約０．１５Ａ６００単位に等価
なアリコートを、Ｎｏｖｅｘ４〜２０％勾配ポリアク
リルアミドゲルに供した。電気泳動後、ゲルをクーマシ
ーブルーを用いて染色した。

【０１５９】結果：単一のタンパク質のバンドの増大し
た発現は、１２の培養物の全てで見出された。これらの
タンパク質の観察されたサイズは、３つのリーディング
フレームでＣＡＴまたはｐｈｏＡに（終止コドンを含ま
ないａｔｔＢ組換え部位を介して）融合されたＧＳＴの
予想したサイズと良く一致した：ＣＡＴｒｆ１＝２６
９アミノ酸；ＣＡＴｒｆ２＝３０３アミノ酸；ＣＡＴ
ｒｆ３＝４７８アミノ酸；ｐｈｏＡｒｆ１＝２８２
アミノ酸；ｐｈｏＡｒｆ２＝２８０アミノ酸；および
ｐｈｏＡｒｆ３＝７０５アミノ酸。

【０１６０】分析：ＣＡＴおよびｐｈｏＡ遺伝子の両方
を、３つ全てのリーディングフレームでＧＳＴ融合ベク
ターにサブクローン化し、そして６つの融合タンパク質
の発現を示した。

【０１６１】上記発明は、明瞭化および理解の目的で幾
らか詳細に記載されているが、形式および詳細における
種々の変化が、本発明および添付の請求の範囲の真の範
囲から逸脱することなくなされ得ることが、本開示の解
釈から当業者によって認識される。本明細書中で引用さ
れた全ての特許および刊行物は、本明細書中にその全て
が参考として援用される。

【０１６２】

【発明の効果】組換えクローニングが、所望の特性（単
数もしくは複数）および／またはＤＮＡセグメント（単
数もしくは複数）を有するキメラＤＮＡ分子を提供する
ための操作された組換え部位および組換えタンパク質を
用いてＤＮＡ分子のセグメントを移動または交換するた
めの、インビトロおよびインビボにおける、核酸、ベク
ターおよび方法の使用により、提供される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本明細書の１つの一般的な方法を示
す。ここで、開始（親）ＤＮＡ分子は、環状または直鎖
状であり得る。目標は、新たなサブクローニングベクタ
ーＤをもとのクローニングベクターＢと交換することで
ある。１つの実施態様において、ＡＤについて、および
すべての他の分子（コインテグレートを含む）に対して
選択することが所望される。四角および丸は、組換えの
部位（例えば、ｌｏｘＰ部位、ａｔｔ部位など）であ
る。例えば、セグメントＤは、発現シグナル、新たな薬
剤マーカー、新たな複製起点、またはマッピングもしく
はＤＮＡ配列決定のための特殊化された機能を含み得
る。

【図２Ａ】図２Ａは、インサートドナープラスミド（こ
こでは、ｐＥＺＣ７０５）をベクタードナープラスミド
（ここでは、ｐＥＺＣ７２６）と組換え、そして産物Ｄ
ＮＡおよび副産物娘分子を得るインビトロにおける方法
を示す。２つの組換え部位は、ベクタードナー上のａｔ
ｔＰおよびｌｏｘＰである。これらの部位により規定さ
れる１つのセグメント上に、そのプロモーターがトラン
スポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレーター／プロ
モーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子
が存在する。Ｓｉｚｅｍｏｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１８（１０）：２８７５（１９９
０）を参照のこと。ｔｅｔリプレッサータンパク質の非
存在下において、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラーゼ
は、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺伝子を転写す
る。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔｅｔ
ＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写を
ブロックする。ｐＥＺＣ７２６の他のセグメントは、構
成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリプレッサー
遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ７２６により形質転
換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のた
めにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシ
ンに感受性である。リコンビナーゼ媒介性反応は、ｔｅ
ｔＲ遺伝子の、調節されたカナマイシン耐性遺伝子から
の分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを
受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。第１の
組換え反応はインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼ
の添加により駆動される。第２の組換え反応はリコンビ
ナーゼＣｒｅをコインテグレート（ここでは、ｐＥＺＣ
７Ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）へ添加することにより駆動
される。

【図２Ｂ】図２Ｂは、ｐＥＺＣ７０５の制限地図を示
す。

【図２Ｃ】図２Ｃは、ｐＥＺＣ７２６の制限地図を示
す。

【図２Ｄ】図２Ｄは、ｐＥＺＣ７Ｃｏｉｎｔｅｇｒａ
ｔｅの制限地図を示す。

【図２Ｅ】図２Ｅは、Ｉｎｔｐｒｏｄの制限地図を示
す。

【図２Ｆ】図２Ｆは、Ｉｎｔｂｙｐｒｏの制限地図を示
す。

【図３Ａ】図３Ａは、インサートドナープラスミド（こ
こでは、ｐＥＺＣ６０２）をベクタードナープラスミド
（ここでは、ｐＥＺＣ６２９）と組換え、そして産物
（ここでは、ＥＺＣ６ｐｒｏｄ）および副産物（ここで
は、ＥＺＣ６Ｂｙｐｒ）娘分子を得るインビトロにおけ
る方法を示す。２つの組換え部位は、ｌｏｘＰおよびｌ
ｏｘＰ５１１である。これらの部位により規定される
ｐＥＺＣ６２９の１つのセグメント上に、そのプロモー
ターがトランスポゾンＴｎ１０由来のｔｅｔＯＰオペレ
ーター／プロモーターにより置換されているカナマイシ
ン耐性遺伝子が存在する。ｔｅｔリプレッサータンパク
質の非存在下において、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラ
ーゼは、ｔｅｔＯＰからカナマイシン耐性遺伝子を転写
する。ｔｅｔリプレッサーが存在する場合、それはｔｅ
ｔＯＰに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写
をブロックする。ｐＥＺＣ６２９の他のセグメントは、
構成性プロモーターにより発現されるｔｅｔリプレッサ
ー遺伝子を有する。従って、ｐＥＺＣ６２９により形質
転換される細胞は、ｔｅｔＲと同じセグメント上のクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の
ためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイ
シンに感受性である。反応は、ｔｅｔＲ遺伝子の、調節
されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。こ
の分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞において
カナマイシン耐性を生じる。第１および第２の組換え事
象は、同じリコンビナーゼＣｒｅの添加により駆動され
る。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ＥＺＣ６Ｂｙｐｒの制限地図を示
す。

【図３Ｃ】図３Ｃは、ＥＺＣ６ｐｒｏｄの制限地図を示
す。

【図３Ｄ】図３Ｄは、ｐＥＺＣ６０２の制限地図を示
す。

【図３Ｅ】図３Ｅは、ｐＥＺＣ６２９の制限地図を示
す。

【図３Ｆ】図３Ｆは、ＥＺＣ６ｃｏｉｎｔの制限地図を
示す。

【図４Ａ】図４Ａは、組換えクローニングのインビトロ
方法の、真核生物細胞における発現のために、ベクター
中へクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子をサブクローン化するための適用を示す。インサ
ートドナープラスミドｐＥＺＣ８４３は、ｌｏｘＰ部位
が遺伝子の５’末端に位置するようにｌｏｘＰ部位とａ
ｔｔＢ部位との間にクローン化されたＥ．ｃｏｌｉの
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子を含む。ベクタードナープラスミドｐＥＺＣ１００３
は、ｌｏｘＰ部位に並置されたサイトメガロウイルス真
核生物プロモーターを含む。超らせんプラスミドをλイ
ンテグラーゼおよびＣｒｅリコンビナーゼとインビトロ
で組み合わせた。インキュベーション後、コンピテント
なＥ．ｃｏｌｉ細胞を組換え反応溶液を用いて形質転
換した。形質転換のアリコートをカナマイシンを含有す
る寒天プレート上に広げて、産物分子（ここでは、ＣＭ
ＶＰｒｏｄ）を選択した。

【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＥＺＣ８４３の制限地図を示
す。

【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＥＺＣ１００３の制限地図を示
す。

【図４Ｄ】図４Ｄは、ＣＭＶＢｙｐｒｏの制限地図を示
す。

【図４Ｅ】図４Ｅは、ＣＭＶＰｒｏｄの制限地図を示
す。

【図４Ｆ】図４Ｆは、ＣＭＶｃｏｉｎｔの制限地図を示
す。

【図５Ａ】図５Ａは、ｐＥＺＣ１３０１の制限地図を示
す。

【図５Ｂ】図５Ｂは、ｐＥＺＣ１３０５の制限地図を示
す。

【図５Ｃ】図５Ｃは、ｐＥＺＣ１３０９の制限地図を示
す。

【図５Ｄ】図５Ｄは、ｐＥＺＣ１３１３の制限地図を示
す。

【図５Ｅ】図５Ｅは、ｐＥＺＣ１３１７の制限地図を示
す。

【図５Ｆ】図５Ｆは、ｐＥＺＣ１３２１の制限地図を示
す。

【図５Ｇ】図５Ｇは、ｐＥＺＣ１４０５の制限地図を示
す。

【図５Ｈ】図５Ｈは、ｐＥＺＣ１５０２の制限地図を示
す。

【図６Ａ】図６Ａは、ｐＥＺＣ１６０３の制限地図を示
す。

【図６Ｂ】図６Ｂは、ｐＥＺＣ１７０６の制限地図を示
す。

【図７Ａ】図７Ａは、ｐＥＺＣ２９０１の制限地図を示
す。

【図７Ｂ】図７Ｂは、ｐＥＺＣ２９１３の制限地図を示
す。

【図７Ｃ】図７Ｃは、ｐＥＺＣ３１０１の制限地図を示
す。

【図７Ｄ】図７Ｄは、ｐＥＺＣ１８０２の制限地図を示
す。

【図８Ａ】図８Ａは、ｐＧＥＸ−２ＴＫの制限地図を示
す。

【図８Ｂ】図８Ｂは、ｐＥＺＣ３５０１の制限地図を示
す。

【図８Ｃ】図８Ｃは、ｐＥＺＣ３６０１の制限地図を示
す。

【図８Ｄ】図８Ｄは、ｐＥＺＣ３６０９の制限地図を示
す。

【図８Ｅ】図８Ｅは、ｐＥＺＣ３６１７の制限地図を示
す。

【図８Ｆ】図８Ｆは、ｐＥＺＣ３６０６の制限地図を示
す。

【図８Ｇ】図８Ｇは、ｐＥＺＣ３６１３の制限地図を示
す。

【図８Ｈ】図８Ｈは、ｐＥＺＣ３６２１の制限地図を示
す。

【図８Ｉ】図８Ｉは、ＧＳＴ−ＣＡＴの制限地図を示
す。

【図８Ｊ】図８Ｊは、ＧＳＴ−ｐｈｏＡの制限地図を示
す。

【図８Ｋ】図８Ｋは、ｐＥＺＣ３２０１の制限地図を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者マイケルエイ．ブラッシュアメリカ合衆国メリーランド 20882, ガイザースバーグ，サニーエイカーズロード 20931 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 DA06 FA10 FA13 GA11 4B065 AA26X AA98Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 BD50 CA60 4H045 AA20 BA10 BA41 CA01 CA40 EA60 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸分子であって、以下：（ａ）ＲＫＹＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＳＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔ）（配列番号１）；（ｂ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＢ）（配列番号２）；（ｃ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＲ）（配列番号３）；（ｄ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＬ）（配列番号４）；（ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＰｌ）（配列番号５）；および対応するかまたは相補的なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配
列、からなる群より選択される核酸配列を含み、ここで
Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ
／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧま
たはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；そしてＢ＝ＣまたはＧま
たはＴ／Ｕ；である、核酸分子。
【請求項２】核酸分子であって、以下：（ａ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＢ１）（配列番号６）；（ｂ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＢ２）（配列番号７）；（ｃ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＢ３）（配列番号８）；（ｄ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＲ１）（配列番号９）；（ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣ
ＴＴＧＴ（ａｔｔＲ２）（配列番号１０）；（ｆ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＲ３）（配列番号１１）；（ｇ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＬｌ）（配列番号１２）；（ｈ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＬ２）（配列番号１３）；（ｉ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＬ３）（配列番号１４）；（ｊ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＰｌ）（配列番号１５）；（ｋ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＰ２、Ｐ３）（配列番号１６）；および対応するかまたは相補的なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配
列、からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸分
子。
【請求項３】核酸分子であって、配列番号１〜１６、
または相補的なＤＮＡ配列もしくは対応するＲＮＡ配列
の少なくとも１つに対して少なくとも８０％相同性を有
する少なくとも１つの操作された組み換え部位、を含
む、核酸分子。
【請求項４】組成物であって、請求項３に記載の少な
くとも１つの核酸分子、ならびに１つ以上の緩衝液、１
つ以上の組み換えタンパク質、および１つ以上の核酸分
子からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる
成分を含む、組成物。
【請求項５】請求項３に記載の少なくとも１つの核酸
分子を含む、キット。
【請求項６】少なくとも１つの組み換えタンパク質を
さらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】少なくとも第一の組み換え部位を含む、
単離された核酸分子であって、該第一の組み換え部位
が、組み換え特異性を強化する少なくとも１つの変異を
含む、単離された核酸分子。
【請求項８】前記変異が第二の組み換え部位との特異
的組み換えを可能にする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】請求項７に記載の核酸分子であって、該
核酸分子は、選択マーカー、クローニング部位、制限部
位、プロモーター、オペロン、複製起点、および遺伝子
または部分的遺伝子からなる群より選択される、少なく
とも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、核酸分子。
【請求項１０】前記核酸分子が第二の組み換え部位を
さらに含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１１】請求項１０に記載の核酸分子であっ
て、前記第一および第二の組み換え部位は、選択マーカ
ー、クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペ
ロン、複製起点、および遺伝子または部分的遺伝子から
なる群より選択される、少なくとも１つのさらなる核酸
配列に隣接する、核酸分子。
【請求項１２】前記第一組み換え部位が、ａｔｔ部位
およびｌｏｘ部位からなる群より選択される、請求項７
に記載の核酸分子。
【請求項１３】前記第二の組み換え部位が、ａｔｔ部
位およびｌｏｘ部位から選択される、請求項１０に記載
の核酸分子。
【請求項１４】前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺
伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マーカー、毒性遺伝
子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ド、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ
切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位、および
ＰＣＲプライマー配列に相補的な配列、からなる群より
選択される、核酸分子。
【請求項１５】前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺
伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求
項９に記載の核酸分子。
【請求項１６】前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺
伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求
項１１に記載の核酸分子。
【請求項１７】前記遺伝子または部分的遺伝子が、タ
グ配列をコードする核酸配列を含む、請求項９に記載の
核酸分子。
【請求項１８】前記タグ配列がＧＳＴタグおよびＨ
ｉｓタグからなる群より選択される、請求項１７に記
載の核酸分子。
【請求項１９】前記遺伝子または部分的遺伝子が、タ
グ配列をコードする核酸配列を含む、請求項１１に記載
の核酸分子。
【請求項２０】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項１９に
記載の核酸分子。
【請求項２１】請求項７、９、１１、１７、１８、１
９または２０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、
ベクター。
【請求項２２】請求項７、９、１１、１７、１８、１
９または２０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、
細胞。
【請求項２３】請求項２１に記載のベクターを含む、
細胞。
【請求項２４】請求項７、９、１７または１８のいず
れか１項に記載の核酸分子によってコードされる、タン
パク質。
【請求項２５】前記タンパク質が融合タンパク質であ
る、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】前記融合タンパク質が、アミノ末端タ
グ配列を含む、請求項２５に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】前記タグ配列が、遺伝子または部分的
遺伝子によってコードされる、請求項２６に記載の融合
タンパク質。
【請求項２８】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項２７に
記載の融合タンパク質。
【請求項２９】前記融合タンパク質が、カルボキシ末
端タグ配列を含む、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項３０】前記タグ配列が、遺伝子または部分的
遺伝子によってコードされる、請求項２９に記載の融合
タンパク質。
【請求項３１】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項３０に
記載の融合タンパク質。
【請求項３２】核酸分子であって、配列番号１〜１
６、それに対して相補的なＤＮＡ配列、およびそれに対
応するＲＮＡ配列、からなる群より選択される少なくと
も第一の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３３】請求項３２に記載の核酸分子であっ
て、選択マーカー、クローニング部位、制限部位、プロ
モーター、オペロン、複製起点、および遺伝子または部
分的遺伝子、からなる群より選択される、少なくとも１
つのさらなる核酸配列をさらに含む、核酸分子。
【請求項３４】請求項３３に記載の核酸分子であっ
て、前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮ
Ａ遺伝子、栄養要求マーカー、毒性遺伝子、表現型マー
カー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限エンドヌ
クレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切
断部位、タンパク質結合部位、およびＰＣＲプライマー
配列に相補的な配列、からなる群より選択される少なく
とも１つのマーカーを含む、核酸分子。
【請求項３５】請求項３２に記載の核酸分子であっ
て、
【請求項３６】請求項３５に記載の核酸分子であっ
て、前記第一および第二の核酸配列は、選択マーカー、
クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペロ
ン、複製起点、および遺伝子または部分的遺伝子からな
る群より選択される、少なくとも１つのさらなる核酸配
列に隣接する、核酸分子。
【請求項３７】前記遺伝子または部分的遺伝子が、タ
グ配列をコードする核酸配列を含む、請求項３３に記載
の核酸分子。
【請求項３８】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項３７に
記載の核酸分子。
【請求項３９】前記遺伝子または部分的遺伝子が、タ
グ配列をコードする核酸配列を含む、請求項３６に記載
の核酸分子。
【請求項４０】前記タグ配列がＧＳＴタグおよびＨ
ｉｓタグからなる群より選択される、請求項３９に記
載の核酸分子。
【請求項４１】請求項３２、３３、３５、３７、３
８、３９または４０のいずれか１項に記載の核酸分子を
含む、ベクター。
【請求項４２】請求項３２、３３、３５、３７、３
８、３９または４０のいずれか１項に記載の核酸分子を
含む、細胞。
【請求項４３】請求項４１に記載のベクターを含む、
細胞。
【請求項４４】請求項３２、３３。３７、または３８
のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされ
る、タンパク質。
【請求項４５】前記タンパク質が融合タンパク質であ
る、請求項４４に記載のタンパク質。
【請求項４６】前記融合タンパク質が、アミノ末端タ
グ配列を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】前記タグ配列が、遺伝子または部分的
遺伝子によってコードされる、請求項４６に記載の融合
タンパク質。
【請求項４８】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４７に
記載の融合タンパク質。
【請求項４９】前記融合タンパク質が、カルボキシ末
端タグ配列を含む、請求項４５に記載の融合タンパク
質。
【請求項５０】前記タグ配列が、遺伝子または部分的
遺伝子によってコードされる、請求項４９に記載の融合
タンパク質。
【請求項５１】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項５０に
記載の融合タンパク質。
【請求項５２】少なくとも第一の変異した組み換え部
位を含む単離された核酸分子であって、該変異は、該組
み換え部位から１つ以上の終止コドンを除去する、単離
された核酸分子。
【請求項５３】請求項５２に記載の核酸分子であっ
て、前記核酸分子は、選択マーカー、クローニング部
位、制限部位、プロモーター、オペロン、複製起点、お
よび遺伝子または部分的遺伝子、からなる群より選択さ
れる、少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含
む、核酸分子。
【請求項５４】前記核酸分子が第二の組み換え部位を
さらに含む、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項５５】請求項５４に記載の核酸分子であっ
て、前記第一および第二の組み換え部位が、選択マーカ
ー、クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペ
ロン、複製起点、および遺伝子または部分的遺伝子、か
らなる群より選択される、少なくとも１つのさらなる核
酸配列に隣接する、核酸分子。
【請求項５６】前記第一組み換え部位が、ａｔｔ部位
およびｌｏｘ部位からなる群より選択される、請求項５
２に記載の核酸分子。
【請求項５７】請求項５３に記載の核酸分子であっ
て、前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮ
Ａ遺伝子、栄養要求マーカー、毒性遺伝子、表現型マー
カー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限エンドヌ
クレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切
断部位、タンパク質結合部位、およびＰＣＲプライマー
配列に相補的な配列、からなる群より選択される、少な
くとも１つのマーカーを含む、核酸分子。
【請求項５８】前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺
伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求
項５３に記載の核酸分子。
【請求項５９】前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺
伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求
項５４に記載の核酸分子。
【請求項６０】前記遺伝子または部分的遺伝子が、タ
グ配列をコードする核酸配列を含む、請求項５３に記載
の核酸分子。
【請求項６１】前記タグ配列がＧＳＴタグおよびＨ
ｉｓタグからなる群より選択される、請求項６０に記
載の核酸分子。
【請求項６２】前記遺伝子または部分的遺伝子が、タ
グ配列をコードする核酸配列を含む、請求項５４に記載
の核酸分子。
【請求項６３】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項６２に
記載の核酸分子。
【請求項６４】請求項５２、５３、５５、６０、６
１、６２または６３のいずれか１項に記載の核酸分子を
含む、ベクター。
【請求項６５】請求項５２、５３、５５、６０、６
１、６２または６３のいずれか１項に記載の核酸分子を
含む、細胞。
【請求項６６】請求項６４に記載のベクターを含む、
細胞。
【請求項６７】請求項５２、５３、６０または６１の
いずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる、
タンパク質。
【請求項６８】前記タンパク質が融合タンパク質であ
る、請求項６７に記載のタンパク質。
【請求項６９】前記融合タンパク質が、アミノ末端タ
グ配列を含む、請求項６８に記載の融合タンパク質。
【請求項７０】前記タグ配列が、遺伝子または部分的
遺伝子によってコードされる、請求項６９に記載の融合
タンパク質。
【請求項７１】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項７０に
記載の融合タンパク質。
【請求項７２】前記融合タンパク質が、カルボキシ末
端タグ配列を含む、請求項６８に記載の融合タンパク
質。
【請求項７３】前記タグ配列が、遺伝子または部分的
遺伝子によってコードされる、請求項７２に記載の融合
タンパク質。
【請求項７４】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項７３に
記載の融合タンパク質。
【請求項７５】少なくとも第一の変異した組み換え部
位を含む単離された核酸分子であって、該変異は、ヘア
ピン形成を回避する、単離された核酸分子。
【請求項７６】請求項７５に記載の核酸分子であっ
て、該核酸分子は、選択マーカー、クローニング部位、
制限部位、プロモーター、オペロン、複製起点、および
遺伝子または部分的遺伝子、からなる群より選択され
る、少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、
核酸分子。
【請求項７７】前記核酸分子が第二の組み換え部位を
さらに含む、請求項７５に記載の核酸分子。
【請求項７８】請求項７７に記載の核酸分子であっ
て、前記第一および第二の組み換え部位は、選択マーカ
ー、クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペ
ロン、複製起点、および遺伝子または部分的遺伝子から
なる群より選択される、少なくとも１つのさらなる核酸
配列に隣接する、核酸分子。
【請求項７９】前記第一組み換え部位が、ａｔｔ部位
およびｌｏｘ部位からなる群より選択される、請求項７
５に記載の核酸分子。
【請求項８０】前記第二の組み換え部位が、ａｔｔ部
位およびｌｏｘ部位から選択される、請求項７７に記載
の核酸分子。
【請求項８１】請求項７６に記載の核酸分子であっ
て、前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮ
Ａ遺伝子、栄養要求マーカー、毒性遺伝子、表現型マー
カー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限エンドヌ
クレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切
断部位、タンパク質結合部位、およびＰＣＲプライマー
配列に相補的な配列、からなる群より選択される、少な
くとも１つのマーカーを含む、核酸分子。
【請求項８２】前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺
伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求
項７６に記載の核酸分子。
【請求項８３】前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺
伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求
項７８に記載の核酸分子。
【請求項８４】前記遺伝子または部分的遺伝子が、タ
グ配列をコードする核酸配列を含む、請求項７６に記載
の核酸分子。
【請求項８５】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨ
ｉｓタグからなる群より選択される、請求項８４に記載
の核酸分子。
【請求項８６】前記遺伝子または部分遺伝子が、タグ
配列をコードする核酸配列を含む、請求項７８に記載の
核酸分子。
【請求項８７】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨ
ｉｓタグからなる群より選択される、請求項８６に記載
の核酸分子。
【請求項８８】請求項７５、７６、７８、８４、８
５、８６、または８７のいずれか１項に記載の核酸分子
を含む、ベクター。
【請求項８９】請求項７５、７６、７８、８４、８
５、８６、または８７のいずれか１項に記載の核酸分子
を含む、細胞。
【請求項９０】請求項８８に記載のベクターを含む、
細胞。
【請求項９１】請求項７５、７６、８４または８５の
いずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる、
タンパク質。
【請求項９２】前記タンパク質が融合タンパク質であ
る、請求項９１に記載のタンパク質。
【請求項９３】前記融合タンパク質が、アミノ末端タ
グ配列を含む、請求項９２に記載の融合タンパク質。
【請求項９４】前記タグ配列が、遺伝子または部分遺
伝子によってコードされる、請求項９３に記載の融合タ
ンパク質。
【請求項９５】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨ
ｉｓタグからなる群より選択される、請求項９４に記載
の融合タンパク質。
【請求項９６】前記融合タンパク質が、カルボキシ末
端タグ配列を含む、請求項９２に記載の融合タンパク
質。
【請求項９７】前記タグ配列が、遺伝子または部分遺
伝子によってコードされる、請求項９６に記載の融合タ
ンパク質。
【請求項９８】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨ
ｉｓタグからなる群より選択される、請求項９７に記載
の融合タンパク質。
【請求項９９】少なくとも１つのプロモーターおよび
少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子により隣接された
少なくとも１つの第１のｌｏｘ部位を含む、核酸分子。
【請求項１００】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項９９に記載の核酸分子。
【請求項１０１】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
り、そして前記プロモーターおよび前記抗生物質耐性遺
伝子が作動可能に連結される、請求項９９に記載の核酸
分子。
【請求項１０２】前記核酸分子がベクターである、請
求項１０１に記載の核酸分子。
【請求項１０３】少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝
子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモータ
ーを含む核酸分子であって、該プロモーターおよび該抗
生物質耐性遺伝子は、少なくとも１つの組換え部位によ
って分離されている、核酸分子。
【請求項１０４】前記第１の組換え部位が、ｌｏｘ部
位、ａｔｔ部位、およびそれらの変異体からなる群より
選択される、請求項１０３に記載の核酸分子。
【請求項１０５】前記第１の組換え部位がｌｏｘ部位
である、請求項１０３に記載の核酸分子。
【請求項１０６】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項１０５に記載の核酸分子。
【請求項１０７】前記核酸分子が少なくとも１つのさ
らなる組換え部位をさらに含む、請求項１０３に記載の
核酸分子。
【請求項１０８】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１０９】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１０７に記載の核
酸分子。
【請求項１１０】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項１０９に記載の核酸分子。
【請求項１１１】前記核酸分子が少なくとも１つのク
ローニング部位を含む、請求項１０３に記載の核酸分
子。
【請求項１１２】前記核酸分子がベクターである、請
求項１０３に記載の核酸分子。
【請求項１１３】前記ベクターが発現ベクターであ
る、請求項１１２に記載の核酸分子。
【請求項１１４】請求項１０３に記載の核酸分子であ
って、ここで、前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチ
シリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子および
カナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、核
酸分子。
【請求項１１５】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１０３に記載
の核酸分子。
【請求項１１６】機能性の抗生物質耐性遺伝子を含む
核酸分子であって、ここで、該抗生物質耐性遺伝子の第
１の部分および該抗生物質耐性遺伝子の第２の部分は、
少なくとも１つの第１の組換え部位によって分離されて
いる、核酸分子。
【請求項１１７】前記抗生物質耐性遺伝子の前記第１
の部分および前記第２の部分が作動可能に連結されてい
る、請求項１１６に記載の核酸分子。
【請求項１１８】前記抗生物質耐性遺伝子の前記第１
の部分がプロモーターである、請求項１１６に記載の核
酸分子。
【請求項１１９】前記第１の組換え部位が、ｌｏｘ部
位、ａｔｔ部位、およびそれらの変異体からなる群より
選択される、請求項１１６に記載の核酸分子。
【請求項１２０】前記第１の組換え部位が、ｌｏｘ部
位である、請求項１１６に記載の核酸分子。
【請求項１２１】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項１２０に記載の核酸分子。
【請求項１２２】前記核酸分子が少なくとも１つのさ
らなる組換え部位をさらに含む、請求項１１６に記載の
核酸分子。
【請求項１２３】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項１２２に記載の核酸分子。
【請求項１２４】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１２２に記載の核
酸分子。
【請求項１２５】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項１２４に記載の核酸分子。
【請求項１２６】前記核酸分子が少なくとも１つのク
ローニング部位を含む、請求項１１６に記載の核酸分
子。
【請求項１２７】前記核酸分子がベクターである、請
求項１１６に記載の核酸分子。
【請求項１２８】前記ベクターが発現ベクターであ
る、請求項１２７に記載の核酸分子。
【請求項１２９】請求項１１６に記載の核酸分子であ
って、ここで、前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチ
シリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子および
カナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、核
酸分子。
【請求項１３０】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１１６に記載
の核酸分子。
【請求項１３１】前記遺伝子の前記第１の部分が、前
記組換え部位に隣接して配置される、請求項１１６に記
載の核酸分子。
【請求項１３２】前記遺伝子の前記第２の部分が、前
記組換え部位に隣接して配置される、請求項１１６に記
載の核酸分子。
【請求項１３３】少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝
子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモータ
ーを含む核酸分子であって、該プロモーターおよび該抗
生物質耐性遺伝子は、少なくとも１つのｌｏｘＰ部位に
よって分離されている、核酸分子。
【請求項１３４】請求項１３３に記載の核酸分子であ
って、ここで、前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチ
シリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子および
カナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、核
酸分子。
【請求項１３５】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１３３に記載
の核酸分子。
【請求項１３６】少なくとも１つの機能性の抗生物質
耐性遺伝子を含む核酸分子であって、該機能性の遺伝子
は、少なくとも１つのｌｏｘＰ部位によって互いに分離
されているプロモーターおよび抗生物質耐性遺伝子を含
む、核酸分子。
【請求項１３７】請求項１３６に記載の核酸分子であ
って、ここで、前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチ
シリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子および
カナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、核
酸分子。
【請求項１３８】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１３６に記載
の核酸分子。
【請求項１３９】請求項９９または請求項１０１に記
載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１４０】前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項１３９に記載の宿主
細胞。
【請求項１４１】請求項１０３、１０６、１０７、１
１０、１１６、１１７、１２１、１２２、１２５、１３
３または１３６のいずれか１項に記載の核酸分子を含
む、宿主細胞。
【請求項１４２】前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項１４１に記載の宿主
細胞。
【請求項１４３】核酸分子を産生する方法であって、
該方法は、以下：（ａ）第１の遺伝子の少なくとも１つ
の一部および少なくとも１つの第１の組換え部分を含
む、第１の核酸分子を提供する工程；（ｂ）第２の遺伝
子の少なくとも１つの一部および少なくとも１つの第２
の組換え部位を含む、第２の核酸分子を提供する工程；
ならびに（ｃ）該第１の組換え部位と該第２の組換え部
位との間の組換えをもたらすのに十分な条件下で、該第
１の核酸分子および該第２の核酸分子と少なくとも１つ
の組換えタンパク質との間で混合物を形成する工程であ
って、それによって、該第１の遺伝子の一部および該第
２の遺伝子の一部が作動可能に連結されて機能性の遺伝
子を形成する第３の核酸分子を産生する、工程、を包含
する、方法。
【請求項１４４】前記第１の遺伝子または前記第２の
遺伝子が選択マーカーをコードする、請求項１４３に記
載の方法。
【請求項１４５】前記第１の遺伝子または前記第２の
遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である、請求項１４３に記
載の方法。
【請求項１４６】請求項１４５に記載の方法であっ
て、ここで、前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチシ
リン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびカ
ナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、核酸
分子。
【請求項１４７】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１４５に記載
の核酸分子。
【請求項１４８】前記第１の遺伝子の少なくとも１つ
の一部または前記第２の遺伝子の少なくとも１つの一部
がプロモーターを含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４９】前記第１の遺伝子の少なくとも１つ
の一部および前記第２の遺伝子の少なくとも１つの一部
が、１つ以上の構造遺伝子のフラグメントである、請求
項１４３に記載の方法。
【請求項１５０】前記第１の遺伝子または前記第２の
遺伝子がヘテロダイマー遺伝子産物をコードする、請求
項１４３に記載の方法。
【請求項１５１】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位、ａｔｔ部位、およびそ
れらの変異体からなる群より選択される、請求項１４３
に記載の方法。
【請求項１５２】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からな
る群より選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５３】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１４３に
記載の方法。
【請求項１５４】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項１４３に
記載の方法。
【請求項１５６】前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、
ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からな
る群より選択される、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのさらなる組換え部位を
さらに含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５８】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、少なくとも１つのｌｏｘ部位またはその変異
体である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１５７に記載の方
法。
【請求項１６１】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、少なくとも１つのａｔｔ部位またはその変異
体である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６３】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ａｔｔ部位である、請求項１５７に記載の方
法。
【請求項１６４】前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、
ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からな
る群より選択される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】前記第１の遺伝子の少なくとも１つ
の一部が、前記第１の組換え部位に隣接して配置され
る、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１６６】前記第２の遺伝子の少なくとも１つ
の一部が、前記第２の組換え部位に隣接して配置され
る、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１６７】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのクローニング部位を含
む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１６８】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、Ｔｎ３、リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎお
よびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請
求項１４３に記載の方法。
【請求項１６９】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＣｒｅである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１７０】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選
択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１７１】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＩｎｔである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１７２】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＩＨＦである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１７３】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＸｉｓである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１７４】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子または前記第３核酸分子が、ベクターであ
る、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１７５】前記ベクターが発現ベクターであ
る、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が直鎖状である、請求項１４３に記載の方
法。
【請求項１７７】前記第１の遺伝子の少なくとも１つ
の一部または前記第２の遺伝子の少なくとも１つの一部
が、ＰＣＲ産物である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１７８】前記機能性の遺伝子を発現させる工
程をさらに包含する、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１７９】少なくとも１つの宿主細胞を前記混
合物と接触させる工程、および前記第３の核酸分子を含
む宿主細胞について選択する工程をさらに包含する、請
求項１４３に記載の方法。
【請求項１８０】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子を含む宿主細胞に対して選択する工程をさら
に包含する、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】前記選択された宿主細胞中で前記機
能性の遺伝子を発現させる工程をさらに包含する、請求
項１７９に記載の方法。
【請求項１８２】前記宿主細胞が原核生物細胞であ
る、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８３】前記宿主細胞が細菌細胞である、請
求項１７９に記載の方法。
【請求項１８４】前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項１７９に記載の方
法。
【請求項１８５】核酸分子を産生する方法であって、
該方法は、以下：（ａ）抗生物質耐性遺伝子の第１の部分および少なくと
も１つの第１の組換え部位を含む、第１の核酸分子を提
供する工程；（ｂ）該抗生物質耐性遺伝子の第２の部分および少なく
とも１つの第２の組換え部位を含む、第２の核酸分子を
提供する工程；ならびに（ｃ）該第１の組換え部位と該第２の組換え部位との間
の組換えをもたらすのに十分な条件下で、該第１の核酸
分子および該第２の核酸分子と少なくとも１つの組換え
タンパク質との間で混合物を形成する工程であって、そ
れによって、該遺伝子の該第１の部分および該第２の部
分が作動可能に連結されて機能性の抗生物質耐性遺伝子
を形成する第３の核酸分子を産生する、工程、を包含す
る、方法。
【請求項１８６】請求項１８５に記載の方法であっ
て、ここで、前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチシ
リン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびカ
ナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、方
法。
【請求項１８７】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１８５に記載
の方法。
【請求項１８８】前記遺伝子の前記第１の部分または
前記第２の部分がプロモーターを含む、請求項１８５に
記載の方法。
【請求項１８９】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位、ａｔｔ部位、およびそ
れらの変異体からなる群より選択される、請求項１８５
に記載の方法。
【請求項１９０】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からな
る群より選択される、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１９１】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１８５に
記載の方法。
【請求項１９２】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項１８５に
記載の方法。
【請求項１９４】前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、
ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からな
る群より選択される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】前記第１の核酸分子および前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのさらなる組換え部位を
さらに含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１９６】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、少なくとも１つのｌｏｘ部位またはその変異
体である、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９８】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１９５に記載の方
法。
【請求項１９９】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、少なくとも１つのａｔｔ部位またはその変異
体である、請求項１９５に記載の方法。
【請求項２０１】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ａｔｔ部位である、請求項１９５に記載の方
法。
【請求項２０２】前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、
ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からな
る群より選択される、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】前記遺伝子の前記第１の部分が、前
記第１の組換え部位に隣接して配置される、請求項１８
５に記載の方法。
【請求項２０４】前記遺伝子の前記第２の部分が、前
記第２の組換え部位に隣接して配置される、請求項１８
５に記載の方法。
【請求項２０５】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのクローニング部位を含
む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項２０６】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、Ｔｎ３、リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎお
よびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請
求項１８５に記載の方法。
【請求項２０７】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＣｒｅである、請求項１８５に記載の方法。
【請求項２０８】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選
択される、請求項１８５に記載の方法。
【請求項２０９】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子または前記第３核酸分子が、ベクターであ
る、請求項１８５に記載の方法。
【請求項２１０】前記ベクターが発現ベクターであ
る、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が直鎖状である、請求項１８５に記載の方
法。
【請求項２１２】前記遺伝子の前記第１の部分または
前記第２の部分が、ＰＣＲ産物である、請求項１８５に
記載の方法。
【請求項２１３】少なくとも１つの宿主細胞を前記混
合物と接触させる工程、および前記第３の核酸分子を含
む宿主細胞について選択する工程をさらに包含する、請
求項１８５に記載の方法。
【請求項２１４】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子を含む宿主細胞に対して選択する工程をさら
に包含する、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１５】前記第１の核酸分子および前記第２
の核酸分子を含む宿主細胞に対して選択する工程をさら
に包含する、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１６】前記宿主細胞が原核生物細胞であ
る、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１７】前記宿主細胞が細菌細胞である、請
求項２１３に記載の方法。
【請求項２１８】前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項２１３に記載の方
法。
【請求項２１９】前記第３の核酸分子を宿主細胞に導
入する工程をさらに包含する、請求項１８５に記載の方
法。
【請求項２２０】前記第３の核酸分子を宿主細胞に導
入する工程、および前記抗生物質耐性遺伝子を発現させ
る工程をさらに包含する、請求項１８５に記載の方法。
【請求項２２１】前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項２２０に記載の方
法。
【請求項２２２】核酸分子を産生する方法であって、
該方法は、以下：（ａ）少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも
１つの第１の組換え部位を含む、第１の核酸分子を提供
する工程；（ｂ）少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子および少な
くとも１つの第２の組換え部位を含む、第２の核酸分子
を提供する工程；ならびに（ｃ）該第１の組換え部位と該第２の組換え部位との間
の組換えをもたらすのに十分な条件下で、該第１の核酸
分子および該第２の核酸分子ならびに少なくとも１つの
組換えタンパク質とで混合物を形成する工程であって、
それによって、該プロモーターおよび該抗生物質耐性遺
伝子が作動可能に連結された第３の核酸分子を産生す
る、工程、を包含する、方法。
【請求項２２３】請求項２２２に記載の方法であっ
て、ここで、前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチシ
リン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびカ
ナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、方
法。
【請求項２２４】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項２２２に記載
の方法。
【請求項２２５】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位、ａｔｔ部位、およびそ
れらの変異体からなる群より選択される、請求項２２２
に記載の方法。
【請求項２２６】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からな
る群より選択される、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２７】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項２２２に
記載の方法。
【請求項２２８】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】前記第１の組換え部位および前記第
２の組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項２２２に
記載の方法。
【請求項２３０】前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、
ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からな
る群より選択される、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】前記第１の核酸分子および前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのさらなる組換え部位を
さらに含む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２３２】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３３】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、少なくとも１つのｌｏｘ部位またはその変異
体である、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３４】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項２３１に記載の方
法。
【請求項２３５】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、少なくとも１つのａｔｔ部位またはその変異
体である、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３７】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ａｔｔ部位である、請求項２３１に記載の方
法。
【請求項２３８】前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、
ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からな
る群より選択される、請求項２３７に記載の方法。
【請求項２３９】前記プロモーターが、前記第１の組
換え部位に隣接して配置される、請求項２２２に記載の
方法。
【請求項２４０】前記抗生物質耐性遺伝子が、前記第
２の組換え部位に隣接して配置される、請求項２２２に
記載の方法。
【請求項２４１】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのクローニング部位を含
む、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２４２】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項２２２に記載の方法。
【請求項２４３】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＣｒｅである、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２４４】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＩｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選択
される、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２４５】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子または前記第３核酸分子が、ベクターであ
る、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２４６】前記ベクターが発現ベクターであ
る、請求項２４５に記載の方法。
【請求項２４７】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が直鎖状である、請求項２２２に記載の方
法。
【請求項２４８】前記遺伝子の第１の部分または前記
遺伝子の第２の部分が、ＰＣＲ産物である、請求項２２
２に記載の方法。
【請求項２４９】少なくとも１つの宿主細胞を前記混
合物と接触させる工程、および前記第３の核酸分子を含
む宿主細胞を選択する工程をさらに包含する、請求項２
２２に記載の方法。
【請求項２５０】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子を含む宿主細胞に対して選択する工程をさら
に包含する、請求項２４９に記載の方法。
【請求項２５１】前記宿主細胞が原核生物細胞であ
る、請求項２４９に記載の方法。
【請求項２５２】前記宿主細胞が細菌細胞である、請
求項２４９に記載の方法。
【請求項２５３】前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項２４９に記載の方
法。
【請求項２５４】前記第３の核酸分子を宿主細胞に導
入する工程をさらに包含する、請求項２２２に記載の方
法。
【請求項２５５】前記核酸分子を宿主細胞に導入する
工程、および前記抗生物質耐性遺伝子を発現させる工程
をさらに包含する、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２５６】前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項２５５に記載の方
法。
【請求項２５７】核酸分子を産生する方法であって、
該方法は、以下：（ａ）少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも
１つの第１のｌｏｘＰ部位を含む、第１の核酸分子を提
供する工程；（ｂ）少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子および少な
くとも１つの第２のｌｏｘＰ部位を含む、第２の核酸分
子を提供する工程；ならびに（ｃ）該第１のｌｏｘＰ部位と該第２のｌｏｘＰ部位と
の間の組換えをもたらすのに十分な条件下で、該第１の
核酸分子および該第２の核酸分子ならびに少なくとも１
つのＣｒｅ組換えタンパク質とで混合物を形成する工程
であって、それによって、該プロモーターおよび該抗生
物質耐性遺伝子が作動可能に連結された第３の核酸分子
を産生する、工程、を包含する、方法。
【請求項２５８】請求項２５７に記載の方法であっ
て、ここで、前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチシ
リン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびカ
ナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、方
法。
【請求項２５９】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項２５７に記載
の方法。
【請求項２６０】前記第３の核酸分子を宿主細胞に導
入する工程をさらに包含する、請求項２５７に記載の方
法。
【請求項２６１】前記第３の核酸分子を宿主細胞に導
入する工程および前記抗生物質耐性遺伝子を発現させる
工程をさらに包含する、請求項２５７に記載の方法。
【請求項２６２】前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項２６０または２６１
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６３】反応混合物を作製する方法であっ
て、該方法は、少なくとも１つの単離された組換えタン
パク質と少なくとも１つの単離された核酸分子とを混合
させる工程を包含し、該少なくとも１つの単離された核
酸分子は、少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つ
の第１の組換え部位を含み、ここで、該変異は、該組換
え部位から１つ以上の終止コドンを除去する、方法。
【請求項２６４】反応混合物を作製する方法であっ
て、該方法は、少なくとも１つの単離された組換えタン
パク質と少なくとも１つの単離された核酸分子とを混合
させる工程を包含し、該少なくとも１つの単離された核
酸分子は、少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つ
の第１の組換え部位を含み、ここで、該変異は、ヘアピ
ン形成を回避する、方法。
【請求項２６５】反応混合物を作製する方法であっ
て、該方法は、少なくとも１つの単離された組換えタン
パク質と少なくとも１つの単離された核酸分子とを混合
させる工程を包含し、該少なくとも１つの単離された核
酸分子は、配列番号１〜１６の１つ以上に８０〜９９％
の相同性である核酸配列、これらに相補的なＤＮＡ配
列、およびこれらに対応するＲＮＡ配列を含む少なくと
も１つの第１の組換え部位を含む、方法。
【請求項２６６】反応混合物を作製する方法であっ
て、該方法は、少なくとも１つの単離された組換えタン
パク質と少なくとも１つの単離された核酸分子とを混合
させる工程を包含し、該少なくとも１つの単離された核
酸分子は、配列番号１〜１６の１つ以上にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、これらに
相補的なＤＮＡ配列、およびこれらに対応するＲＮＡ配
列を含む少なくとも１つの第１の組換え部位を含む、方
法。
【請求項２６７】反応混合物を作製する方法であっ
て、該方法は、少なくとも１つの単離された組換えタン
パク質と少なくとも１つの単離された核酸分子とを混合
させる工程を包含し、該少なくとも１つの単離された核
酸分子は、組換え特異性を増強する少なくとも１つの変
異を含む少なくとも１つの第１の変異されたａｔｔ組換
え部位を含む、方法。
【請求項２６８】前記変異されたａｔｔ部位が配列番
号１〜１６に示される少なくとも１つの核酸配列を含
む、請求項２６７に記載の方法。
【請求項２６９】請求項２６７に記載の方法であっ
て、ここで、前記変異されたａｔｔ部位は、配列番号１
〜１６に示される少なくとも１つの核酸配列に８０〜９
９％の相同性である少なくとも１つの核酸配列を含む、
方法。
【請求項２７０】請求項２６７に記載の方法であっ
て、ここで、前記変異されたａｔｔ部位は、配列番号１
〜１６に示される少なくとも１つの核酸配列にストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１つ
の核酸配列を含む、方法。
【請求項２７１】請求項２６３、２６４、２６５、２
６６、または２６７のいずれか１項に記載の方法によっ
て作製される、反応混合物。
【請求項２７２】１つ以上の単離された組換えタンパ
ク質および少なくとも１つの単離された核酸分子を含む
組成物であって、該少なくとも１つの単離された核酸分
子は、少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの第
１の組換え部位を含み、該変異は、該組換え部位から１
つ以上の終止コドンを除去する、方法。
【請求項２７３】少なくとも１つの単離された組換え
タンパク質および少なくとも１つの単離された核酸分子
を含む組成物であって、該少なくとも１つの単離された
核酸分子は、配列番号１〜１６、これらに相補的なＤＮ
Ａ配列、およびこれらに対応するＲＮＡ配列からなる群
より選択される少なくとも１つの第１の核酸配列を含
む、組成物。
【請求項２７４】１つ以上の単離された組換えタンパ
ク質および少なくとも１つの単離された核酸分子を含む
組成物であって、該少なくとも１つの単離された核酸分
子は、少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの第
１の組換え部位を含み、ここで、該変異は、ヘアピン形
成を回避する、組成物。
【請求項２７５】少なくとも１つの単離された組換え
タンパク質および少なくとも１つの単離された核酸分子
を含む組成物であって、該少なくとも１つの単離された
核酸分子は、配列番号１〜１６の１つ以上に８０〜９９
％の相同性である核酸配列、これらに相補的なＤＮＡ配
列、およびこれらに対応するＲＮＡ配列からなる群より
選択される少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも
１つの組換え部位を含む、組成物。
【請求項２７６】少なくとも１つの単離された組換え
タンパク質および少なくとも１つの単離された核酸分子
を含む組成物であって、該少なくとも１つの単離された
核酸分子は、配列番号１〜１６の１つ以上にストリンジ
ェントならびに条件下でハイブリダイズする核酸配列、
これらに相補的なＤＮＡ配列、およびこれらに対応する
ＲＮＡ配列からなる群より選択される少なくとも１つの
核酸配列を含む少なくとも１つの組換え部位を含む、組
成物。
【請求項２７７】前記組成物が少なくとも２つの組換
えタンパク質を含む、請求項２７２、２７３、２７４、
２７５または２７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７８】前記組成物が少なくとも３つの組換
えタンパク質を含む、請求項２７２、２７３、２７４、
２７５または２７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７９】組成物であって、該組成物は、１以
上の組換えタンパク質および少なくとも１つの単離され
た核酸分子を含み、該核酸分子は、少なくとも第１のａ
ｔｔ組換え部位を含み、該組換え部位は、コインテグレ
ート核酸分子または産物核酸分子の形成におけるインビ
トロでの組換え効率または組換え特異性を増強する少な
くとも１つの変異を有する、コア領域を含む、組成物。
【請求項２８０】請求項２７９に記載の組成物であっ
て、前記組換え部位が、以下：（ｉ）切り出し組換えの
増強；（ｉｉ）組み込み組換えの増強；（ｉｉｉ）宿主
因子の要求性の減少；（ｉｖ）前記コインテグレート核
酸分子または前記産物核酸分子の組換えによる形成反応
の効率の増加；（ｖ）前記コインテグレート核酸分子ま
たは前記産物核酸分子の組換えによる形成反応の特異性
の増加；および（ｖｉ）該産物核酸分子のその後の組換
え反応またはその後の単離の特異性または収率の増加、
からなる群より選択される、少なくとも１つの増強を付
与する、組成物。
【請求項２８１】請求項２７９に記載の組成物であっ
て、前記コア領域が、以下：ａ）ＲＫＹＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＳＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔ）（配列番号１）；ｂ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔＢ）（配列番号２）；ｃ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔＲ）（配列番号３）；ｄ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔＬ）（配列番号４）；ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔＰ１）（配列番号５）；およびその対応するかまたは相補的なＤＮＡ配列または
ＲＮＡ配列からなる群より選択される、核酸配列を含
み、ここで、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ
＝ＣまたはＴ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝Ａまたは
ＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；そしてＢ＝
ＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、組成物。
【請求項２８２】請求項２７９に記載の組成物であっ
て、前記コア領域が、以下：ａ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＢ１）（配列番号６）；ｂ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＢ２）（配列番号７）；ｃ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＢ３）（配列番号８）；ｄ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＲ１）（配列番号９）；ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＲ２）（配列番号１０）；ｆ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＲ３）（配列番号１１）；ｇ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＬ１）（配列番号１２）；ｈ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＬ２）（配列番号１３）；ｉ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＬ３）（配列番号１４）；ｊ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＰ１）（配列番号１５）；ｋ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＰ２、Ｐ３）（配列番号１６）；およびその対応するかまたは相補的なＤＮＡ配列または
ＲＮＡ配列からなる群より選択される、核酸配列を含
む、組成物。
【請求項２８３】前記組換えタンパク質が、γδ、Ｔ
ｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ＣｉｎおよびＦｌ
ｐからなる群より選択される、請求項２７２〜２７６お
よび２７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８４】前記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、
ＩＨＦ、ＸｉｓおよびＣｒｅからなる群より選択され
る、請求項２７２〜２７６および２７９のいずれか１項
に記載の組成物。
【請求項２８５】前記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、
ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選択される、請求項
２７２〜２７６および２７９のいずれか１項に記載の組
成物。
【請求項２８６】前記組換えタンパク質の少なくとも
１つが、Ｉｎｔである、請求項２７２〜２７６および２
７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８７】前記組換えタンパク質の少なくとも
１つが、バクテリオファージλ、ｐｈｉ８０、Ｐ２２、
Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１からなる群より選択され
る生物によってコードされる、請求項２７２〜２７６お
よび２７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８８】前記組換えタンパク質の少なくとも
１つが、バクテリオファージλによってコードされる、
請求項２７２〜２７６および２７９のいずれか１項に記
載の組成物。
【請求項２８９】前記組換えタンパク質の少なくとも
１つが、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓによってコードされる、請求項２７２〜２７６および
２７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９０】前記組成物が、ＩｎｔおよびＩＨＦ
を含む、請求項２７２〜２７６および２７９のいずれか
１項に記載の組成物。
【請求項２９１】前記組成物が、Ｘｉｓをさらに含
む、請求項２９０に記載の組成物。
【請求項２９２】前記少なくとも２つの組換えタンパ
ク質が、互いに異なる、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２９３】前記少なくとも３つの組換えタンパ
ク質が、互いに異なる、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２９４】組成物であって、該組成物は、少な
くとも１つの単離された組換えタンパク質および少なく
とも１つの単離された核酸分子を含み、該核酸分子は、
組換え特異性を増強する少なくとも１つの変異を含む変
異ａｔｔ組換え部位、それに対する相補的ＤＮＡ配列、
およびそれに対する相補的ＲＮＡ配列からなる群より選
択される少なくとも１つの核酸配列を含む、少なくとも
第１の組換え部位を含む、組成物。
【請求項２９５】前記変異ａｔｔ部位が、配列番号１
〜１６に示される少なくとも１つの核酸配列を含む、請
求項２９４に記載の組成物。
【請求項２９６】前記変異ａｔｔ部位が、配列番号１
〜１６に示される少なくとも１つの核酸配列に８０〜９
９％相同である少なくとも１つの核酸配列を含む、請求
項２９５に記載の組成物。
【請求項２９７】前記変異ａｔｔ部位が、配列番号１
〜１６に示される少なくとも１つの核酸配列にストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１つ
の核酸配列を含む、請求項２９５に記載の組成物。
【請求項２９８】組成物であって、以下：（ａ）遺伝子の第１の部分および少なくとも第１の組換
え部分を含む、第１の核酸分子；（ｂ）該遺伝子の第２の部分および少なくとも第２の組
換え部分を含む、第２の核酸分子；および（ｃ）該第１の組換え部位と第２の組換え部位との間で
組換えを生じ得る、少なくとも１つの組換えタンパク
質、を含む、組成物。
【請求項２９９】組成物であって、以下：（ａ）抗生物質耐性遺伝子の第１の部分および少なくと
も第１の組換え部分を含む、第１の核酸分子；（ｂ）該抗生物質耐性遺伝子の第２の部分および少なく
とも第２の組換え部分を含む、第２の核酸分子；および（ｃ）該第１の組換え部位と第２の組換え部位との間で
組換えを生じ得る、少なくとも１つの組換えタンパク
質、を含む、組成物。
【請求項３００】組成物であって、以下：（ａ）少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも
第１の組換え部分を含む、第１の核酸分子；（ｂ）少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子および少な
くとも第２の組換え部分を含む、第２の核酸分子；およ
び（ｃ）該第１の組換え部位と第２の組換え部位との間で
組換えを生じ得る、少なくとも１つの組換えタンパク
質、を含む、組成物。
【請求項３０１】前記第１の組換え部位および第２の
組換え部位が、ｌｏｘ部位、ａｔｔ部位、およびそれら
の変異体からなる群より選択される、請求項２９８に記
載の組成物。
【請求項３０２】前記第１の組換え部位および第２の
組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項２９８に記載
の組成物。
【請求項３０３】前記ｌｏｘ部位が、ｌｏｘＰ部位で
ある、請求項３０２に記載の組成物。
【請求項３０４】前記第１の組換え部位および第２の
組換え部位が、ｌｏｘ部位、ａｔｔ部位、およびそれら
の変異体からなる群より選択される、請求項２９９に記
載の組成物。
【請求項３０５】前記第１の組換え部位および第２の
組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項２９９に記載
の組成物。
【請求項３０６】前記ｌｏｘ部位が、ｌｏｘＰ部位で
ある、請求項３０５に記載の組成物。
【請求項３０７】前記第１の組換え部位および第２の
組換え部位が、ｌｏｘ部位、ａｔｔ部位、およびそれら
の変異体からなる群より選択される、請求項３００に記
載の組成物。
【請求項３０８】前記第１の組換え部位および第２の
組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項３００に記載
の組成物。
【請求項３０９】前記ｌｏｘ部位が、ｌｏｘＰ部位で
ある、請求項３０８に記載の組成物。
【請求項３１０】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのさらなる組換え部位を
さらに含む、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３１１】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項３１０に記載の組成物。
【請求項３１２】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのさらなる組換え部位を
さらに含む、請求項３０１に記載の組成物。
【請求項３１３】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項３１２に記載の組成物。
【請求項３１４】前記第１の核酸分子または前記第２
の核酸分子が、少なくとも１つのさらなる組換え部位を
さらに含む、請求項３００に記載の組成物。
【請求項３１５】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項３１４に記載の組成物。
【請求項３１６】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項２９８に記載の組成物。
【請求項３１７】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅである、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３１８】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選
択される、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３１９】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項２９９に記載の組成物。
【請求項３２０】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅである、請求項２９９に記載の組成物。
【請求項３２１】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選
択される、請求項２９９に記載の組成物。
【請求項３２２】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項３００に記載の組成物。
【請求項３２３】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅである、請求項３００に記載の組成物。
【請求項３２４】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選
択される、請求項３００に記載の組成物。
【請求項３２５】前記核酸分子および前記第２の核酸
分子が、ベクターである、請求項２９８に記載の組成
物。
【請求項３２６】前記核酸分子および前記第２の核酸
分子が、ベクターである、請求項２９９に記載の組成
物。
【請求項３２７】前記核酸分子および前記第２の核酸
分子が、ベクターである、請求項３００に記載の組成
物。
【請求項３２８】前記遺伝子の前記第１の部分または
前記第２の部分が、ＰＣＲ産物である、請求項２９８に
記載の組成物。
【請求項３２９】少なくとも１つの宿主細胞をさらに
含む、請求項２９８、２９９または３００のいずれか１
項に記載の組成物。
【請求項３３０】前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項３２９に記載の組
成物。
【請求項３３１】少なくとも１つの単離されたＩｎｔ
タンパク質および少なくとも１つの単離されたＩＨＦタ
ンパク質を含む、組成物。
【請求項３３２】少なくとも１つの単離されたＩｎｔ
タンパク質、少なくとも１つの単離されたＩＨＦタンパ
ク質および少なくとも１つの単離されたＸｉｓタンパク
質を含む、組成物。
【請求項３３３】少なくとも１つの組換え部位を含む
少なくとも１つのベクターをさらに含む、請求項３３１
または３３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３４】前記少なくとも１つの組換え部位
が、少なくとも１つのａｔｔ組換え部位またはその変異
体もしくは改変体である、請求項３３３に記載の組成
物。
【請求項３３５】前記少なくとも１つの組換え部位
が、少なくとも１つのａｔｔ組換え部位である、請求項
３３３に記載の組成物。
【請求項３３６】前記少なくとも１つのａｔｔ組換え
部位が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、
ａｔｔＲ部位、およびそれらの変異体または改変体から
なる群より選択される、請求項３３４または３３５のい
ずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３７】少なくとも２つの組換え部位を含む
少なくとも１つのベクターをさらに含む、請求項３３１
または３３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３８】前記組換え部位のうちの少なくとも
１つが、ａｔｔ組換え部位またはその変異体もしくは改
変体である、請求項３３７に記載の組成物。
【請求項３３９】前記組換え部位のうちの少なくとも
１つが、ａｔｔ組換え部位である、請求項３３７に記載
の組成物。
【請求項３４０】前記ａｔｔ組換え部位が、ａｔｔＢ
部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、お
よびそれらの変異体または改変体からなる群より選択さ
れる、請求項３３８または３３９のいずれか１項に記載
の組成物。
【請求項３４１】少なくとも１つの単離されたＦＩＳ
タンパク質をさらに含む、請求項３３１または３３２の
いずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４２】スペルミジンをさらに含む、請求項
３３１または３３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４３】Ｔｒｉｓ−ＨＣｌをさらに含む、請
求項３３１または３３２のいずれか１項に記載の組成
物。
【請求項３４４】エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）をさらに含む、請求項３３１または３３２のいずれ
か１項に記載の組成物。
【請求項３４５】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさ
らに含む、請求項３３２または３３３のいずれか１項に
記載の組成物。
【請求項３４６】Ｃｒｅタンパク質、ＦＬＰタンパク
質、γδタンパク質、Ｔｎ３リゾルベースタンパク質、
Ｈｉｎタンパク質、Ｇｉｎタンパク質、およびＣｉｎタ
ンパク質からなる群より選択される、少なくとも１つさ
らなる単離された組換えタンパク質をさらに含む、請求
項３３２または３３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４７】少なくとも１つの単離されたＣｒｅ
組換えタンパク質をさらに含む、請求項３３１または３
３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４８】少なくとも１つの単離されたＩｎｔ
タンパク質、少なくとも１つの単離されたＩＨＦタンパ
ク質、スペルミジン、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡおよ
びＢＳＡを含む、組成物。
【請求項３４９】少なくとも１つの単離されたＩｎｔ
タンパク質、少なくとも１つの単離されたＩＨＦタンパ
ク質、少なくとも１つの単離されたＸｉｓタンパク質、
スペルミジン、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡおよびＢＳ
Ａを含む、組成物。
【請求項３５０】少なくとも１つの単離されたＩｎｔ
タンパク質、少なくとも１つの単離されたＩＨＦタンパ
ク質およびスペルミジンを含む、組成物。
【請求項３５１】少なくとも１つの単離されたＩｎｔ
タンパク質、少なくとも１つの単離されたＩＨＦタンパ
ク質、少なくとも１つの単離されたＸｉｓタンパク質お
よびスペルミジンを含む、組成物。
【請求項３５２】少なくとも１つの組換え部位を含む
少なくとも１つのベクターをさらに含む、請求項３４８
〜３５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５３】前記少なくとも１つの組換え部位
が、少なくとも１つのａｔｔ組換え部位またはその変異
体もしくは改変体である、請求項３５２に記載の組成
物。
【請求項３５４】前記少なくとも１つの組換え部位
が、少なくとも１つのａｔｔ組換え部位である、請求項
３５２に記載の組成物。
【請求項３５５】前記少なくとも１つのａｔｔ組換え
部位が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、
ａｔｔＲ部位、およびそれらの変異体または改変体から
なる群より選択される、請求項３５３または３５４のい
ずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５６】少なくとも２つの組換え部位を含む
少なくとも１つのベクターをさらに含む、請求項３４８
〜３５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５７】前記組換え部位のうちの少なくとも
１つが、ａｔｔ組換え部位またはその変異体もしくは改
変体である、請求項３５６に記載の組成物。
【請求項３５８】前記組換え部位のうちの少なくとも
１つが、ａｔｔ組換え部位である、請求項３５６に記載
の組成物。
【請求項３５９】前記ａｔｔ組換え部位が、ａｔｔＢ
部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、お
よびそれらの変異体または改変体からなる群より選択さ
れる、請求項３５３または３５４のいずれか１項に記載
の組成物。
【請求項３６０】少なくとも１つの単離されたＦＩＳ
タンパク質をさらに含む、請求項３４８〜３５１のいず
れか１項に記載の組成物。
【請求項３６１】Ｃｒｅタンパク質、ＦＬＰタンパク
質、γδタンパク質、Ｔｎ３リゾルベースタンパク質、
Ｈｉｎタンパク質、Ｇｉｎタンパク質、およびＣｉｎタ
ンパク質からなる群より選択される、少なくとも１つさ
らなる単離された組換えタンパク質をさらに含む、請求
項３４８〜３５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６２】少なくとも１つの単離されたＣｒｅ
組換えタンパク質をさらに含む、請求項３４８〜３５１
のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６３】請求項３３１〜３３３、３３７、３
４１〜３５２、３５６または３６０〜３６２のいずれか
１項に記載の組成物を含む少なくとも１つの容器を備え
る、キット。
【請求項３６４】核酸セグメントのインビトロクロー
ニングのためのキットであって、該キットは、１以上の
単離された組換えタンパク質および少なくとも１つの単
離された核酸分子を備え、該核酸分子は、少なくとも１
つの変異を含む少なくとも第１の組換え部位含み、ここ
で、該変異は、該組換え部位から１以上の終止コドンを
除去する、キット。
【請求項３６５】核酸セグメントのインビトロクロー
ニングのためのキットであって、該キットは、少なくと
も１つの単離された組換えタンパク質および少なくとも
１つの単離された核酸分子を備え、該核酸分子は、配列
番号１〜１６、それに対する相補的ＤＮＡ配列、および
それに対応するＲＮＡ配列からなる群より選択される、
少なくとも第１の核酸配列を含む、キット。
【請求項３６６】核酸セグメントのインビトロクロー
ニングのためのキットであって、該キットは、少なくと
も１つの単離された組換えタンパク質および少なくとも
１つの単離された核酸分子を備え、該核酸分子は、少な
くとも１つの変異を含む少なくとも第１の組換え部位含
み、ここで、該変異は、ヘアピン形成を回避する、キッ
ト。
【請求項３６７】核酸セグメントのインビトロクロー
ニングのためのキットであって、該キットは、少なくと
も１つの単離された組換えタンパク質および少なくとも
１つの単離された核酸分子を備え、該核酸分子は、配列
番号１〜１６、それに対する相補的ＤＮＡ配列、および
それに対応するＲＮＡ配列のうちの１以上に８０〜９９
％相同である核酸配列からなる群より選択される少なく
とも１つの核酸配列を含む、少なくとも第１の組換え部
位を含む、キット。
【請求項３６８】核酸セグメントのインビトロクロー
ニングのためのキットであって、該キットは、少なくと
も１つの単離された組換えタンパク質および少なくとも
１つの単離された核酸分子を備え、該核酸分子は、配列
番号１〜１６、それに対する相補的ＤＮＡ配列、および
それに対応するＲＮＡ配列のうちの１以上にストリンジ
ェント条件下でハイブリダイズする核酸配列からなる群
より選択される少なくとも１つの核酸配列を含む、少な
くとも第１の組換え部位を含む、キット。
【請求項３６９】前記キットが、少なくとも２つの組
換えタンパク質を含む、請求項３６４〜３６８のいずれ
か１項に記載のキット。
【請求項３７０】前記キットが、少なくとも３つの組
換えタンパク質を含む、請求項３６４〜３６８のいずれ
か１項に記載のキット。
【請求項３７１】キットであって、該キットは、少な
くとも２つの単離された組換えタンパク質、第１の組換
え部位および第２の組換え部位を含む少なくとも１つの
第１の核酸分子であって、ここで、該第１および第２の
組換え部位は、互いに組換わらない、第１の核酸分子、
ならびに第１の組換え部位および第２の組換え部位を含
む少なくとも１つの第２の核酸分子であって、ここで、
該第１および第２の組換え部位は、互いに組換わらな
い、第２の核酸分子、を備え、ここで、該第２の核酸分
子は、（ａ）リプレッサーをコードする抑制カセットお
よび（ｂ）該リプレッサーにより抑制される選択マーカ
ーをさらに含み、ここで該選択マーカーおよび該抑制カ
セットは、異なる核酸セグメント上に存在し、該核酸セ
グメントは、少なくとも１つの組換え部位によって互い
に分離されている、キット。
【請求項３７２】前記第１の核酸分子が、環状核酸分
子または直鎖状核酸分子である、請求項３７１に記載の
キット。
【請求項３７３】前記第２の核酸分子が、環状核酸分
子または直鎖状核酸分子である、請求項３７１に記載の
キット。
【請求項３７４】請求項３７１に記載のキットであっ
て、前記第２の核酸分子が、（ａ）毒性遺伝子および
（ｂ）選択マーカーをさらに含み、ここで、該毒性遺伝
子および該選択マーカーが、異なる核酸セグメント上に
存在し、該核酸セグメントが、少なくとも１つの組換え
部位によって互いに分離されている、キット。
【請求項３７５】請求項３７１に記載のキットであっ
て、前記第２の核酸分子が、（ａ）抑制カセットおよび
（ｂ）該抑制カセットにコードされるリプレッサーによ
って抑制される選択マーカーをさらに含み、ここで、該
選択マーカーおよび該抑制カセットが、異なる核酸セグ
メント上に存在し、該核酸セグメントが、少なくとも１
つの組換え部位によって互いに分離されている、キッ
ト。
【請求項３７６】キットであって、該キットは、少な
くとも１つの単離された組換えタンパク質および少なく
とも１つの単離された核酸分子を備え、該核酸分子は、
少なくとも第１の組換え部位を含み、該組換え部位は、
コインテグレート核酸分子または産物核酸分子の形成に
おけるインビトロでの組換え効率または組換え特異性を
増強するコア領域を含む、キット。
【請求項３７７】請求項３７６に記載のキットであっ
て、前記組換え部位が、以下：（ｉ）切り出し組換えの
増強；（ｉｉ）組み込み組換えの増強；（ｉｉｉ）宿主
因子の要求性の減少；（ｉｖ）前記コインテグレート核
酸分子または前記産物核酸分子の組換えによる形成反応
の効率の増加；（ｖ）前記コインテグレート核酸分子ま
たは前記産物核酸分子の組換えによる形成反応の特異性
の増加；および（ｖｉ）該産物核酸分子のその後の組換
え反応またはその後の単離の特異性および収率の増加、
からなる群より選択される、少なくとも１つの増強を付
与する、キット。
【請求項３７８】請求項３７６に記載のキットであっ
て、前記コア領域が、以下：ａ）ＲＫＹＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＳＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔ）（配列番号１）；ｂ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔＢ）（配列番号２）；ｃ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔＲ）（配列番号３）；ｄ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔＬ）（配列番号４）；ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴＳ
ＧＢ（ｍ−ａｔｔＰ１）（配列番号５）；およびその対応するかまたは相補的なＤＮＡ配列または
ＲＮＡ配列からなる群より選択される、核酸配列を含
み、ここで、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ
＝ＣまたはＴ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝Ａまたは
ＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；そしてＢ＝
ＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、キット。
【請求項３７９】請求項３７６に記載のキットであっ
て、前記コア領域が、以下：ａ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＢ１）（配列番号６）；ｂ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＢ２）（配列番号７）；ｃ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＢ３）（配列番号８）；ｄ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＲ１）（配列番号９）；ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＴ（ａｔｔＲ２）（配列番号１０）；ｆ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＲ３）（配列番号１１）；ｇ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＬ１）（配列番号１２）；ｈ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＬ２）（配列番号１３）；ｉ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＬ３）（配列番号１４）；ｊ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＰ１）（配列番号１５）；ｋ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴ
ＧＧ（ａｔｔＰ２、Ｐ３）（配列番号１６）；およびその対応するかまたは相補的なＤＮＡ配列または
ＲＮＡ配列からなる群より選択される、核酸配列を含
む、キット。
【請求項３８０】核酸セグメントのインビトロクロー
ニングのためのキットであって、該キットは、少なくと
も１つの単離された組換えタンパク質および少なくとも
１つの単離された核酸分子を備え、該核酸分子は、組換
え特異性を増強する少なくとも１つの変異を含む変異ａ
ｔｔ組換え部位、それに対する相補的ＤＮＡ配列、およ
びそれに対する相補的ＲＮＡ配列からなる群より選択さ
れる少なくとも１つの核酸配列を含む、少なくとも第１
の組換え部位を含む、キット。
【請求項３８１】前記変異したａｔｔ部位が、配列番
号１〜１６に示される少なくとも１つの核酸配列に８０
〜９９％相同である少なくとも１つの核酸配列を含む、
請求項３８０に記載のキット。
【請求項３８２】前記変異したａｔｔ部位が、配列番
号１〜１６に示される少なくとも１つの核酸配列にスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも
１つの核酸配列を含む、請求項３８１に記載のキット。
【請求項３８３】前記組換えタンパク質が、γδ、Ｔ
ｎ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、およびＦ
ｌｐからなる群より選択される、請求項３６４〜３６
８、３７１または３７６のいずれか１項に記載のキッ
ト。
【請求項３８４】前記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、
ＩＨＦ、ＸｉｓおよびＣｒｅからなる群より選択され
る、請求項３６４〜３６８、３７１または３７６のいず
れか１項に記載のキット。
【請求項３８５】前記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、
ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選択される、請求項
３６４〜３６８、３７１、３７６または３８０のいずれ
か１項に記載のキット。
【請求項３８６】前記組換えタンパク質のうちの少な
くとも１つが、Ｉｎｔである、請求項３６４〜３６８、
３７１、３７６または３８０のいずれか１項に記載のキ
ット。
【請求項３８７】前記組換えタンパク質のうちの少な
くとも１つが、バクテリオファージλ、ｐｈｉ８０、
Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１からなる群より
選択される生物によりコードされる、請求項３６４〜３
６８、３７１または３７６のいずれか１項に記載のキッ
ト。
【請求項３８８】前記組換えタンパク質のうちの少な
くとも１つが、バクテリオファージλによりコードされ
る、請求項３６４〜３６８、３７１、３７６または３８
０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３８９】前記組換えタンパク質のうちの少な
くとも１つが、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓによりコードされる、請求項３６４〜３６８、
３７１または３７６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９０】前記キットがＩｎｔおよびＩＨＦを
含む、請求項３６４〜３６８、３７１、３７６または３
８０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９１】前記キットがＸｉｓをさらに含む、
請求項３９０に記載のキット。
【請求項３９２】少なくとも１つの核酸を含むキット
であって、該核酸分子は、少なくとも１つのプロモータ
ーに隣接した少なくとも１つの第１のｌｏｘ部位および
少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子を含む、キット。
【請求項３９３】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項３９２に記載のキット。
【請求項３９４】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
り、前記プロモーターおよび前記抗生物質耐性遺伝子が
作動可能に連結されている、請求項３９２に記載のキッ
ト。
【請求項３９５】前記核酸分子がベクターである、請
求項３９２に記載のキット。
【請求項３９６】少なくとも１つの核酸分子を含むキ
ットであって、該核酸分子が、少なくとも１つの抗生物
質耐性遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの
プロモーターを含み、該プロモーターおよび該抗生物質
耐性遺伝子が少なくとも１つの組換え部位により分離さ
れている、キット。
【請求項３９７】前記第１の組換え部位が、ｌｏｘ部
位、ａｔｔ部位およびそれらの変異体からなる群より選
択される、請求項３９６に記載のキット。
【請求項３９８】前記第１の組換え部位がｌｏｘ部位
である、請求項３９６に記載のキット。
【請求項３９９】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項３９８に記載のキット。
【請求項４００】前記核酸分子が、少なくとも１つの
さらなる組換え部位をさらに含む、請求項３９６に記載
のキット。
【請求項４０１】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項４００に記載のキット。
【請求項４０２】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位がｌｏｘ部位である、請求項４００に記載のキッ
ト。
【請求項４０３】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項４０２に記載のキット。
【請求項４０４】前記核酸分子が、少なくとも１つの
クローニング部位を含む、請求項３９６に記載のキッ
ト。
【請求項４０５】前記核酸分子がベクターである、請
求項３９６に記載のキット。
【請求項４０６】前記ベクターが発現ベクターであ
る、請求項４０５に記載のキット。
【請求項４０７】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、
メチシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子お
よびカナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択され
る、請求項３９６に記載のキット。
【請求項４０８】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子である、請求項３９６に記載
のキット。
【請求項４０９】少なくとも１つの核酸分子を含むキ
ットであって、該核酸分子は、機能的な抗生物質耐性遺
伝子を含み、該抗生物質耐性遺伝子の第１の部分および
該抗生物質耐性遺伝子の第２の部分は、少なくとも１つ
の第１の組換え部位により分離されている、キット。
【請求項４１０】前記抗生物質耐性遺伝子の前記第１
および第２の部分が作動可能に連結されている、請求項
４０９に記載のキット。
【請求項４１１】前記抗生物質耐性遺伝子の前記第１
の部分がプロモーターである、請求項４０９に記載のキ
ット。
【請求項４１２】前記第１の組換え部位が、ｌｏｘ部
位、ａｔｔ部位およびそれらの変異体からなる群より選
択される、請求項４０９に記載のキット。
【請求項４１３】前記第１の組換え部位がｌｏｘ部位
である、請求項４０９に記載のキット。
【請求項４１４】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項４１３に記載のキット。
【請求項４１５】前記核酸分子が、少なくとも１つの
さらなる組換え部位をさらに含む、請求項４０９に記載
のキット。
【請求項４１６】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より
選択される、請求項４１５に記載のキット。
【請求項４１７】前記少なくとも１つのさらなる組換
え部位がｌｏｘ部位である、請求項４１５に記載のキッ
ト。
【請求項４１８】前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であ
る、請求項４１７に記載のキット。
【請求項４１９】前記核酸分子が、少なくとも１つの
クローニング部位を含む、請求項４０９に記載のキッ
ト。
【請求項４２０】前記核酸分子がベクターである、請
求項４０９に記載のキット。
【請求項４２１】前記ベクターが発現ベクターであ
る、請求項４２０に記載のキット。
【請求項４２２】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、
メチシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子お
よびカナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択され
る、請求項４０９に記載のキット。
【請求項４２３】前記抗生物質耐性遺伝子がクロラム
フェニコール耐性遺伝子である、請求項４０９に記載の
キット。
【請求項４２４】前記遺伝子の前記第１の部分が、前
記組換え部位に隣接して位置する、請求項４０９に記載
のキット。
【請求項４２５】前記遺伝子の前記第２の部分が、前
記組換え部位に隣接して位置する、請求項４０９に記載
のキット。
【請求項４２６】少なくとも１つの核酸分子を含むキ
ットであって、該核酸分子が、少なくとも１つの抗生物
質耐性遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの
プロモーターを含み、該プロモーターおよび該抗生物質
耐性遺伝子が、少なくとも１つのｌｏｘＰ部位により分
離されている、キット。
【請求項４２７】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、
メチシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子お
よびカナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択され
る、請求項４２６に記載のキット。
【請求項４２８】前記抗生物質耐性遺伝子がクロラム
フェニコール耐性遺伝子である、請求項４２６に記載の
キット。
【請求項４２９】少なくとも１つの核酸分子を含むキ
ットであって、該核酸分子は、少なくとも１つの機能的
抗生物質耐性遺伝子を含み、該機能的遺伝子は、少なく
とも１つのｌｏｘＰ部位により互いに分離された、プロ
モーターおよび抗生物質遺伝子を含む、キット。
【請求項４３０】前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、
メチシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子お
よびカナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択され
る、請求項４２９に記載のキット。
【請求項４３１】前記抗生物質耐性遺伝子がクロラム
フェニコール耐性遺伝子である、請求項４２９に記載の
キット。
【請求項４３２】前記キットが、少なくとも１つの組
換えタンパク質および少なくとも１つの宿主細胞からな
る群より選択される１以上の成分をさらに含む、請求項
３９２に記載のキット。
【請求項４３３】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、ＴＮ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項４３２に記載のキット。
【請求項４３４】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＣｒｅである、請求項４３２に記載のキット。
【請求項４３５】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓおよびそれらの組み合
わせからなる群より選択される、請求項４３２に記載の
キット。
【請求項４３６】前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項４３２に記載のキ
ット。
【請求項４３７】前記キットが、少なくとも１つの組
換えタンパク質および少なくとも１つの宿主細胞からな
る群より選択される１以上の成分をさらに含む、請求項
３９６に記載のキット。
【請求項４３８】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、ＴＮ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項４３７に記載のキット。
【請求項４３９】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＣｒｅである、請求項４３７に記載のキット。
【請求項４４０】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびそれらの組み合わせから
なる群より選択される、請求項４３７に記載のキット。
【請求項４４１】前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項４３７に記載のキ
ット。
【請求項４４２】少なくとも１つの組換えタンパク質
および少なくとも１つの宿主細胞からなる群より選択さ
れる１以上の成分をさらに含む、請求項４０９に記載の
キット。
【請求項４４３】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、ＴＮ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項４４２に記載のキット。
【請求項４４４】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＣｒｅである、請求項４４２に記載のキット。
【請求項４４５】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓおよびそれらの組み合
わせからなる群より選択される、請求項４４２に記載の
キット。
【請求項４４６】前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項４４２に記載のキ
ット。
【請求項４４７】前記キットが、少なくとも１つの組
換えタンパク質および少なくとも１つの宿主細胞からな
る群より選択される１以上の成分をさらに含む、請求項
４２６に記載のキット。
【請求項４４８】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、ＴＮ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項４４７に記載のキット。
【請求項４４９】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＣｒｅである、請求項４４７に記載のキット。
【請求項４５０】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓおよびそれらの組み合
わせからなる群より選択される、請求項４４７に記載の
キット。
【請求項４５１】前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項４４７に記載のキ
ット。
【請求項４５２】前記キットが、少なくとも１つの組
換えタンパク質および少なくとも１つの宿主細胞からな
る群より選択される１以上の成分をさらに含む、請求項
４４７に記載のキット。
【請求項４５３】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γ
δ、ＴＮ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよ
びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求
項４５２に記載のキット。
【請求項４５４】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質がＣｒｅである、請求項４５２に記載のキット。
【請求項４５５】前記少なくとも１つの組換えタンパ
ク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓおよびそれらの組み合
わせからなる群より選択される、請求項４５２に記載の
キット。
【請求項４５６】前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ細胞である、請求項４５２に記載のキ
ット。
【請求項４５７】前記核酸分子がベクターである、請
求項４３２、４３７、４４２または４４７のいずれか１
項に記載のキット。
【請求項４５８】核酸分子によりコードされるポリペ
プチドであって、該核酸分子は、組換え特異性を増大さ
せる少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの第１
の組換え部位を含み、そして該ポリペプチドは、該第１
の組換え部位によりコードされるアミノ酸を含む、ポリ
ペプチド。
【請求項４５９】前記核酸分子が、選択マーカー、ク
ローニング部位、制限部位、プロモーター、オペロン、
複製起点、および遺伝子または部分的遺伝子からなる群
より選択される少なくとも１つのさらなる核酸分子をさ
らに含む、請求項４５８に記載のポリペプチド。
【請求項４６０】前記核酸分子が、第２の組換え部位
をさらに含む、請求項４５８に記載のポリペプチド。
【請求項４６１】前記遺伝子または部分的遺伝子が、
存在するのであれば、タグ配列をコードする核酸配列を
含む、請求項４５９に記載のポリペプチド。
【請求項４６２】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４６１に
記載のポリペプチド。
【請求項４６３】前記ポリペプチドが融合ポリペプチ
ドである、請求項４５８〜４６０のいずれか１項に記載
のポリペプチド。
【請求項４６４】前記融合ポリペプチドが、アミノ末
端タグ配列を含む、請求項４６３に記載のポリペプチ
ド。
【請求項４６５】前記タグ配列が、遺伝子または部分
的遺伝子によりコードされる、請求項４６４に記載の融
合ポリペプチド。
【請求項４６６】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４６４に
記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６７】前記融合ポリペプチドが、カルボキ
シ末端タグ配列を含む、請求項４６４に記載の融合ポリ
ペプチド。
【請求項４６８】前記タグ配列が、遺伝子または部分
的遺伝子によりコードされる、請求項４６７に記載の融
合ポリペプチド。
【請求項４６９】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４６７に
記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７０】核酸分子によりコードされるポリペ
プチドであって、該核酸分子は、配列番号１〜１６、こ
れに対して相補的なＤＮＡ配列、配列番号１〜１６のい
ずれか１つに対して少なくとも８０％の相同性を有する
ＤＮＡ配列、これに対して相補的なＤＮＡ配列、および
これらの配列のいずれかに対応するＲＮＡ配列からなる
群より選択される少なくとも１つの第１の核酸配列を含
み、該ポリペプチドは、該第１の核酸配列によりコード
されるアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項４７１】前記核酸分子が、選択マーカー、ク
ローニング部位、制限部位、プロモーター、オペロン、
複製起点、および遺伝子または部分的遺伝子からなる群
より選択される少なくとも１つのさらなる核酸配列をさ
らに含む、請求項４７０に記載のポリペプチド。
【請求項４７２】前記核酸分子が、配列番号１〜１
６、これに対して相補的なＤＮＡ配列、これに対応する
ＲＮＡ配列からなる群より選択される少なくとも１つの
第２の核酸配列をさらに含む、請求項４７０に記載のポ
リペプチド。
【請求項４７３】前記遺伝子または前記部分的遺伝子
が存在する場合に、該遺伝子または該部分的遺伝子が、
タグ配列をコードする核酸配列を含む、請求項４７１に
記載のポリペプチド。
【請求項４７４】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４７３に
記載のポリペプチド。
【請求項４７５】前記ポリペプチドが融合ポリペプチ
ドである、請求項４７０〜４７２のいずれか一項に記載
のポリペプチド。
【請求項４７６】前記融合ポリペプチドが、アミノ末
端タグ配列を含む、請求項４７５に記載の融合ポリペプ
チド。
【請求項４７７】前記タグ配列が、遺伝子または部分
的遺伝子によってコードされる、請求項４７６に記載の
融合ポリペプチド。
【請求項４７８】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４７６に
記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７９】前記融合タンパク質が、カルボキシ
末端タグ配列を含む、請求項４７５に記載の融合ポリペ
プチド。
【請求項４８０】前記タグ配列が、遺伝子または部分
的遺伝子によってコードされる、請求項４７９に記載の
融合ポリペプチド。
【請求項４８１】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４７９に
記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８２】核酸分子によってコードされるポリ
ペプチドであって、ここで該核酸分子は、少なくとも１
つの変異した第１の組換え部位を含み、ここで該変異
は、該組換え部位から１以上の停止コドンを取り除き、
そしてここで、該ポリペプチドは、該変異した第１の組
換え部位によってコードされるアミノ酸を含む、ポリペ
プチド。
【請求項４８３】前記核酸分子がさらに、選択マーカ
ー、クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペ
ロン、複製起点、および遺伝子または部分的遺伝子から
なる群より選択される、少なくとも１つのさらなる核酸
配列を含む、請求項４８２に記載のポリペプチド。
【請求項４８４】前記核酸分子がさらに、第２の組換
え部位を含む、請求項４８２に記載のポリペプチド。
【請求項４８５】前記遺伝子または前記部分的遺伝子
が存在する場合に、該遺伝子または該部分的遺伝子が、
タグ配列をコードする核酸配列を含む、請求項４８３に
記載のポリペプチド。
【請求項４８６】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４８５に
記載のポリペプチド。
【請求項４８７】前記ポリペプチドが融合ポリペプチ
ドである、請求項４８２〜４８４のいずれか一項に記載
のポリペプチド。
【請求項４８８】前記融合ポリペプチドが、アミノ末
端タグ配列を含む、請求項４８７に記載の融合ポリペプ
チド。
【請求項４８９】前記タグ配列が、遺伝子または部分
的遺伝子によってコードされる、請求項４８８に記載の
融合ポリペプチド。
【請求項４９０】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４８８に
記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９１】前記融合ポリペプチドが、カルボキ
シ末端タグ配列を含む、請求項４８７に記載の融合ポリ
ペプチド。
【請求項４９２】前記タグ配列が、遺伝子または部分
的遺伝子によってコードされる、請求項４９１に記載の
融合ポリペプチド。
【請求項４９３】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４９１に
記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９４】核酸分子によってコードされるポリ
ペプチドであって、ここで該核酸分子は、少なくとも１
つの変異した第１の組換え部位を含み、ここで該変異は
ヘアピン形成を回避し、そしてここで、該ポリペプチド
は、該変異した第１の組換え部位によってコードされる
アミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項４９５】前記核酸分子がさらに、選択マーカ
ー、クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペ
ロン、複製起点、および遺伝子または部分的遺伝子から
なる群より選択される、少なくとも１つのさらなる核酸
配列を含む、請求項４９４に記載のポリペプチド。
【請求項４９６】前記核酸分子がさらに、第２の組換
え部位を含む、請求項４９４に記載のポリペプチド。
【請求項４９７】前記遺伝子または前記部分的遺伝子
が存在する場合に、該遺伝子または該部分的遺伝子が、
タグ配列をコードする核酸配列を含む、請求項４９５に
記載のポリペプチド。
【請求項４９８】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項４９６に
記載のポリペプチド。
【請求項４９９】前記ポリペプチドが融合ポリペプチ
ドである、請求項４９４〜４９６のいずれか一項に記載
のポリペプチド。
【請求項５００】前記融合ポリペプチドが、アミノ末
端タグ配列を含む、請求項４９９に記載の融合ポリペプ
チド。
【請求項５０１】前記タグ配列が、遺伝子または部分
的遺伝子によってコードされる、請求項５００に記載の
融合ポリペプチド。
【請求項５０２】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項５００に
記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０３】前記融合ポリペプチドが、カルボキ
シ末端タグ配列を含む、請求項４９９に記載の融合ポリ
ペプチド。
【請求項５０４】前記タグ配列が、遺伝子または部分
的遺伝子によってコードされる、請求項５０３に記載の
融合ポリペプチド。
【請求項５０５】前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよび
Ｈｉｓタグからなる群より選択される、請求項５０３に
記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０６】核酸分子によってコードされるポリ
ペプチドであって、ここで該核酸分子は、配列番号１〜
１６、配列番号１〜１６に対する相補的ＤＮＡ配列、お
よびこれらの配列のいずれかに対応するＲＮＡ配列から
なる群より選択される少なくとも１つの第１の核酸配列
含み、そしてここで該ポリペプチドは、該第１の核酸配
列によってコードされるアミノ酸を含む、ポリペプチ
ド。
【請求項５０７】前記第１の遺伝子および前記第２の
遺伝子が同一である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項５０８】少なくとも１つの単離された組換え
タンパク質および少なくとも１つの単離された核酸分子
を含むキットであって、該核酸分子は、少なくとも１つ
の第１のａｔｔ組換え部位を含み、該ａｔｔ組換え部位
は、コインテグレートＤＮＡまたは産物ＤＮＡの形成に
おけるインビトロでの組換え効率もしくは組換え特異性
を増大させる、少なくとも１つの変異を有するコア領域
を含む、キット。
【請求項５０９】請求項５０８に記載のキットであっ
て、ここで、前記組換え部位が、（ｉ）切り出し組換えの増強；（ｉｉ）組み込み組換えの増強；（ｉｉｉ）宿主因子の要求性の軽減；（ｉｖ）前記コインテグレートＤＮＡまたは前記産物
ＤＮＡの組換えによる形成反応の効率の増大；（ｖ）該コインテグレートＤＮＡまたは前記産物ＤＮ
Ａの組換えによる形成反応の特異性の増大；および（ｖｉ）該産物ＤＮＡの、引き続く組換え反応または
引き続く単離の特異性または収率の増大、からなる群より選択される、少なくとも１つの増強を与
える、キット。
【請求項５１０】請求項５０８に記載のキットであっ
て、ここで、前記コア領域は、以下：ａ）ＲＫＹＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＳＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔ）（配列番号１）；ｂ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＢ）（配列番号２）；ｃ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＣＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＲ）（配列番号３）；ｄ）ＡＧＣＣＷＧＣＴＴＴＣＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＬ）（配列番号４）；ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＹＫＴＲＴＡＣＮＡＡＧＴ
ＳＧＢ（ｍ−ａｔｔＰ１）（配列番号５）；および対応するＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列、または
相補的なＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列、からなる群よ
り選択される核酸配列を含み、ここで、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝Ｃ
またはＴ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣま
たはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；およびＢ＝Ｃま
たはＧまたはＴ／Ｕである、キット。
【請求項５１１】請求項５０８に記載のキットであっ
て、ここで、前記コア領域は、以下：ａ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＢ１）（配列番号６）；ｂ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＢ２）（配列番号７）；ｃ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＢ３）（配列番号８）；ｄ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＲ１）（配列番号９）；ｅ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＴ
ＴＧＴ（ａｔｔＲ２）（配列番号１０）；ｆ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＲ３）（配列番号１１）；ｇ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＬ１）（配列番号１２）；ｈ）ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＬ２）（配列番号１３）；ｉ）ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＬ３）（配列番号１４）；ｊ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＰ１）（配列番号１５）；ｋ）ＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ
ＴＧＧ（ａｔｔＰ２，Ｐ３）（配列番号１６）；および対応するＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列、または
相補的なＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列、からなる群よ
り選択される核酸配列を含む、キット。
【請求項５１２】反応混合物を作製する方法であっ
て、該方法は、少なくとも１つの単離された組換えタン
パク質と、少なくとも１つの単離された核酸分子を混合
する工程を包含し、該少なくとも１つの単離された核酸
分子は、配列番号１〜１６、これらに相補的なＤＮＡ配
列、およびこれらに対応するＲＮＡ配列からなる群より
選択される少なくとも１つの第１の核酸配列を含む、方
法。
【請求項５１３】請求項５１２に記載の方法により作
製された反応混合物。