JP2006087445A - 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第1のDNAセグメントおよび第2のDNAセグメントを含むベクタードナーDNA分子であって、該第1のDNAセグメントまたは該第2のDNAセグメントは少なくとも1つの選択マーカーを含み、ここで該第1のセグメントおよび該第2のセグメントは、(i) 環状ベクタードナーにおいては、第1の組換え部位および第2の組換え部位により、または(ii) 直鎖状ベクタードナーにおいては、少なくとも第1の組換え部位により、のいずれかで分離され、ここで隣接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換えない、ベクタードナーDNA分子。
【選択図】なし
Description
本発明は、組換えDNA技術に関する。操作された組換え部位を有するDNAおよびベクターが、組換えタンパク質を用いるDNAセグメントの効率的かつ特異的な組換えを可能にする組換えクローニング方法における使用のために提供される。このDNA、ベクターおよび方法は、インビトロまたはインビボにおける、DNAのサブクローニングのような種々のDNA交換のために有用である。
部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、いくつかのウイルスおよび細菌において存在する酵素であり、そしてエンドヌクレアーゼ特性およびリガーゼ特性の両方を有すると特徴付けられている。これらのリコンビナーゼは(いくつかの場合においては会合タンパク質とともに)、DNA中の特異的塩基の配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接するDNAセグメントを交換する。リコンビナーゼおよび会合タンパク質は、集合的に「組換えタンパク質」といわれる(例えば、Landy, A., Current Opinion in Biotechnology 3:699−707 (1993)を参照のこと)。
Acids Res. 21(9):2265 (1993))は、特定の抗体のL鎖およびH鎖がloxPおよびloxP 511部位の間で異なるファージベクター中にクローン化され、そしてそれを使用して新たなE. coli細胞を形質転換するインビボ方法を開示する。Cre(宿主細胞において2つの親分子(1つはプラスミド、1つはファージ)に作用する)は4つの産物を平衡して産生した:2つの異なるコインテグレート(cointegrate)(loxP部位またはloxP 511部位のいずれかにおける組換えにより産生される)、および2つの娘分子(その1つが所望された産物であった)。
(1) 目的のDNAを1つまたは2つの制限酵素で消化し;
(2) 既知の場合目的のDNAセグメントをゲル精製し;
(3) 適切な制限酵素での切断、アルカリホスファターゼでの処理、ゲル精製など(適切なように)によりベクターを調製し;
(4) 未切断および自己連結されたベクターのバックグラウンドを概算するための適切なコントロールを有して、DNAセグメントをベクターに連結し;
(5) 生じるベクターをE. coli宿主細胞中に導入し;
(6) 選択されたコロニーをひろい、そして小培養物を一晩増殖させ;
(7) DNAミニプレップを作製し;そして
(8) アガロースゲルで(しばしば診断的制限酵素消化の後)またはPCRにより、単離されたプラスミドを分析する。
本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質および操作された組換え部位を用いる、キメラ核酸を得るための、核酸、ベクターおよび方法を提供する。これらの方法は、関連する背景技術において開示または示唆される方法より、高度に特異的であり、迅速でありかつ労働集約的でない。本発明の改善された特異性、スピードおよび収率は、任意の関連する目的のために有用なDNAまたはRNAのサブクローニング、調節または交換を容易にする。このような目的は、DNAセグメントのインビトロにおける組換えおよび転写される、複製される、単離されるまたはゲノムのDNAまたはRNAの、インビトロまたはインビボにおける挿入または改変を包含する。
(a) インビトロまたはインビボにおいて
(i) 第1の組換え部位および第2の組換え部位により隣接される所望のDNAセグメントを含む、インサートドナーDNA分子、ここで第1および第2の組換え部位は互いに組換えない;
(ii) 第3の組換え部位および第4の組換え部位を含むベクタードナーDNA分子、ここで、第3および第4の組換え部位は互いに組換えない;
(iii) 第1および第3の組換え部位ならびに/または第2および第4の組換え部位を組換え得る1つ以上の部位特異的組換えタンパク質;
を組み合わせ;
それにより、組換えを生じさせ、その結果少なくとも1つのコインテグレートDNA分子、上記所望のDNAセグメントを含む少なくとも1つの所望の産物DNA分子、および任意に副産物DNA分子を産生する工程;および、次いで、任意に、
(b) 産物または副産物DNA分子について選択する工程。
(i) その一方もしくは両方が1つ以上の操作された組換え部位により隣接される、サブクローニングベクターおよび/または選択マーカーを含むベクタードナープラスミドを含む第2の容器;ならびに/あるいは
(ii) 少なくとも1つの上記組換え部位を認識し、そして組換え得る、少なくとも1つの組換えタンパク質を含む第3の容器。
1.第1のDNAセグメントおよび第2のDNAセグメントを含むベクタードナーDNA分子であって、該第1のDNAセグメントまたは該第2のDNAセグメントは少なくとも1つの選択マーカーを含み、ここで該第1のセグメントおよび該第2のセグメントは、(i) 環状ベクタードナーにおいては、第1の組換え部位および第2の組換え部位により、または(ii) 直鎖状ベクタードナーにおいては、少なくとも第1の組換え部位により、のいずれかで分離され、ここで隣接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換えない、ベクタードナーDNA分子。
2.前記選択マーカーが以下:
(i) そうでなければ毒性の化合物に対する耐性を提供する産物をコードするDNAセグメント;
(ii) そうでなければレシピエント細胞において欠如している産物をコードするDNAセグメント;
(iii) 遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするDNAセグメント;
(iv) 容易に同定され得る産物をコードするDNAセグメント;
(v) 細胞の生存および/または機能に有害である産物をコードするDNAセグメント;
(vi) 該(i)〜(v)のDNAセグメントのいずれかの活性を阻害するDNAセグメント;
(vii) 基質を修飾する産物に結合するDNAセグメント;
(viii) 所望の分子の単離を提供するDNAセグメント;
(ix) そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌクレオチド配列をコードするDNAセグメント;および
(x) 存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する感受性を与えるDNAセグメント、
からなる群より選択される少なくとも1つのDNAセグメントである、項目1に記載のベクタードナーDNA分子。
3.前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、tRNA遺伝子、栄養要求マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド;制限エンドヌクレアーゼ;制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位;およびPCRプライマーに相補的な配列、からなる群より選択される少なくとも1つである、項目2に記載のベクタードナーDNA分子。
4.前記選択マーカーが少なくとも1つの選択マーカーの不活性フラグメントを含み、ここで該不活性フラグメントが前記第1の組換え部位または前記第2の組換え部位と、別の選択マーカーの不活性フラグメントを含むさらなるDNAセグメントとにわたって組換えられる場合に、機能性の選択マーカーを再構成し得る、項目1に記載のベクタードナーDNA分子。
5.第1の組換え部位および第2の組換え部位により隣接される所望のDNAセグメントを含むインサートドナーDNA分子であって、該第1の組換え部位および該第2の組換え部位は操作され、そして互いに組換えない、インサートドナーDNA分子。
6.前記所望のDNAセグメントが、クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペロン、複製起点、機能性DNA、アンチセンスRNA、PCRフラグメント、タンパク質またはタンパク質フラグメント、からなる群より選択される少なくとも1つをコードする、項目5に記載のインサートドナーDNA分子。
7.1つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器を含むキットであって、ここで第1の区画は第1のDNAセグメントおよび第2のDNAセグメントを含むベクタードナーDNA分子を含み、該第1のDNAセグメントまたは該第2のDNAセグメントは少なくとも1つの選択マーカーを含み、ここで該第1のセグメントおよび該第2のセグメントは、(i) 環状ベクタードナードナーにおいては、第1の組換え部位および第2の組換え部位、または(ii) 直鎖状ベクタードナーにおいては、第1の組換え部位、のいずれかにより隣接され、ここで隣接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換えない、キット。
8.第1の組換え部位および第2の組換え部位により隣接される所望のDNAセグメントを含むインサートドナーDNA分子を含む第2の区画をさらに含み、ここで該第1の組換え部位および該第2の組換え部位が操作され、そして互いに組換えない、項目7に記載のキット。
9.少なくとも1つの前記組換え部位を含むDNAセグメントを組換え得る少なくとも1つの組換えタンパク質を含むさらなる区画をさらに含む、項目7に記載のキット。
10.選択マーカーまたは所望のDNAセグメントに隣接する少なくとも2つの組換え部位を有する少なくとも1つのDNAセグメントを含む核酸分子であって、ここで少なくとも1つの該組換え部位がコインテグレートDNAまたは産物DNAの形成においてインビトロで組換えを増強する少なくとも1つの操作された変異を有するコア領域を含む、核酸分子。
11.前記変異が少なくとも1つの前記組換えの増強を与え、該増強が実質的に、(i) 切り出し組換えの優先;(ii) 組み込み組換えの優先;(iii) 宿主因子の要求の軽減;(iv) 前記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の効率の増加;(v) 前記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の特異性の増加からなる群より選択され;そして該産物DNAに対する所望の特性に貢献する、項目10に記載の核酸分子。
12.前記組換え部位が、attB、attP、attLおよびattRからなる群より選択される少なくとも1つの組換え部位に由来する、項目10に記載の核酸分子。
13.前記att部位が、att1、att2およびatt3からなる群より選択される、項目12に記載の核酸分子。
14.前記コア領域が以下:
15.前記コア領域が以下:
16.核酸分子を作製するための方法であって、配列番号1〜16の少なくとも1つに少なくとも90%の相同性を有する少なくとも1つのDNA配列を含む少なくとも1つの操作された組換え部位を有する核酸分子を提供する工程を包含する、方法。
17.項目16に記載の方法により提供される核酸分子。
18.項目10に記載の核酸分子を含む組成物。
19.少なくとも1つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器を含むキットであって、ここで第1の区画が項目18に記載の組成物を含む、キット。
20.前記組換え部位を認識する少なくとも1つの組換えタンパク質を有する第2の区画をさらに含む、項目19に記載のキット。
21.項目22に記載の方法に有用である、単離された形態の少なくとも1つの組換えタンパク質をその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器を含むキット。
22.コインテグレートDNA分子を作製する方法であって、以下の工程:
インビトロにおいて
(i) 第1の組換え部位および第2の組換え部位により隣接される所望のDNAセグメントを含むインサートドナーDNA分子、ここで該第1の組換え部位および該第2の組換え部位は互いに組換えない;
(ii) 第3の組換え部位および第4の組換え部位を含むベクタードナーDNA分子、ここで、該第3の組換え部位および該第4の組換え部位は互いに組換えない;および
(iii) 該第1の組換え部位および該第3の組換え部位または該第2の組換え部位および該第4の組換え部位を組換え得る少なくとも1つの部位特異的組換えタンパク質;
を組み合わせ、それにより、組換えを生じさせ、その結果該第1の組換え部位および該第3の組換え部位または該第2の組換え部位および該第4の組換え部位を含むコインテグレートDNA分子を産生する工程、
を包含する、方法。
23.産物DNA分子が前記コインテグレートDNAから、(i) 前記第1の組換え部位および前記第3の組換え部位、または(ii) 前記第2の組換え部位および前記第4の組換え部位の少なくとも1つを組換えることにより産生され、該産物DNAが前記所望のDNAセグメントを含む、項目22に記載の方法。24.前記方法がまた副産物DNA分子も産生する、項目23に記載の方法。
25.前記産物DNA分子について選択する工程をさらに含む、項目23に記載の方法。
26.前記ベクタードナーDNA分子が前記第3の組換え部位および前記第4の組換え部位により隣接されるベクターセグメントを含む、項目22に記載の方法。
27.前記ベクタードナーDNA分子がさらに(a)毒性遺伝子および(b)選択マーカーを含み、ここで該毒性遺伝子および該選択マーカーが異なるDNAセグメント上に存在し、該DNAセグメントが(i) 環状DNA分子においては、2つの組換え部位、または(ii) 直鎖状DNA分子においては、1つの組換え部位、のいずれかにより分離されている、項目22に記載の方法。
28.前記ベクタードナーDNA分子がさらに(a) 抑制カセット、および(b) 該抑制カセットのリプレッサーにより抑制される選択マーカーを含み、ここで該選択マーカーおよび該抑制カセットが異なるDNAセグメント上に存在し、該DNAセグメントが(i) 環状DNA分子においては、2つの組換え部位、または(ii) 直鎖状DNA分子においては、1つの組換え部位、のいずれかにより分離されている、項目22に記載の方法。
29.前記インサートドナーDNA分子および前記ベクタードナーDNA分子の少なくとも1つが環状DNA分子である、項目22に記載の方法。
30.前記インサートドナーDNA分子および前記ベクタードナーDNA分子の少なくとも1つが直鎖状DNA分子である、項目22に記載の方法。
31.前記選択する工程がインビトロまたはインビボにおいて実施される、項目22に記載の方法。
32.前記組換えタンパク質が少なくとも第1の組換えタンパク質および第2の組換えタンパク質を含み、該第2の組換えタンパク質が該第1の組換えタンパク質と異なる、項目22に記載の方法。
33.前記組換えタンパク質がIntである、項目22に記載の方法。
34.前記少なくとも1つの組換えタンパク質が(i) IntおよびIHF、ならびに(ii) Int、Xis、およびIHFから選択される、項目22に記載の方法。
以下の記載において、組換えDNA技術において使用される多数の用語が多く利用される。明細書および請求の範囲(こような用語に与えられるべき範囲を含む)の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)を参照のこと。
このような毒性遺伝子産物の例は当該分野において周知であり、そして、制限エンドヌクレアーゼ(例えば、DpnI)および抑制機能の非存在下で宿主を傷害する遺伝子(例えば、kicB)を包含するがそれらに限定されない。あるいは、毒性遺伝子はインビトロにおいて選択され得る(例えば、制限部位)。
58:913−949)。
本発明のインビトロまたはインビボ方法についての1つの一般的なスキームを図1に示す。ここでインサートドナーおよびベクタードナーは、環状または直鎖状DNAのいずれかであり得るが、環状として示す。ベクターDは、もとのクローニングベクターAを交換する。エレメントAおよびDを含む娘ベクターについて、および1つ以上のコインテグレート(単数または複数)を含む他の分子に対して選択することが所望される。四角および丸は、組換え部位の異なる組である(例えば、lox部位またはatt部位)。セグメントAまたはDは、Dがこの例において使用される場合、少なくとも1つの選択マーカー、発現シグナル、複製起点、あるいは欠失、選択、発現、マッピングまたはDNA配列決定のための特殊化された機能を含み得る。
(i) PCRのための新たなプライマー部位の生成(例えば、以前は並置されていなかった2つのDNA配列の並置);
(ii) 制限エンドヌクレアーゼまたは他のDNA修飾酵素、化学物質、リボザイムなどにより作用されるDNA配列の含有;
(iii) DNA結合タンパク質、RNA、DNA、化学物質などにより認識されるDNA配列の含有(例えば、集団についての選択または集団からの排除のためのアフィニティータグとしての使用のための)(Davis, Nucl. Acids Res. 24:702−706 (1996); J. Virol. 69: 8027−8034 (1995));
(iv) ランダマイズされ、そしてcDNA由来のRNAライブラリーを用いることによる、エプスタインバールウイルスに発現されるRNAに会合するリボソームL22タンパク質についてのRNAリガンドのインビトロ選択;
(vi) その活性が特異的方向および並置を必要とする機能性エレメント(例えば、(a) トランスでは弱く反応するが、シスに配置されると、適切なタンパク質の存在下において、分子の特定の集団を破壊する組換え(例えば、インビトロRNA合成を可能にするプロモーター配列の再構成)を生じる組換え部位)の配置。RNAは直接使用され得るか、または逆転写されて所望のDNA構築物を得ることが出来る;
(vii) 分子(単数または複数)のサイズ(例えば、分画)または他の物理的性質による所望の産物の選択;および
(viii) その同定を可能にする特異的修飾(例えば、メチル化)のために必要とされるDNA配列の含有。
本発明において、DNAセグメントの交換は、組換えタンパク質(リコンビナーゼならびに会合する補因子およびタンパク質を含む)の使用によって達成される。種々の組換えタンパク質が当該分野において記載されている。このようなリコンビナーゼの例には以下が含まれる:
Cre: バクテリオファージP1由来のタンパク質(AbremskiおよびHoess、J.Biol.Chem. 259(3):1509−1514
(1984))は、loxP(交叉の遺伝子座)部位と呼ばれる34bp DNA配列間の交換を触媒する(すなわち、組換えを引き起こす)(Hoessら、Nucl.Acids Res. 14(5):2287 (1986)を参照のこと)。Creは市販されている(Novagen、カタログNo.69247−1)。Creによって媒介される組換えは、自由に可逆的である。熱力学的考察からは、Cre媒介性組み込み(1つの分子を形成する2つの分子間の組換え)が、Cre媒介性切り出し(2つの娘分子を形成する同一分子中の2つのloxP部位間の組換え)より、はるかに効率的でないことは驚くべきことではない。Creは、当該分野において周知のように、補因子としてマグネシウムまたはスペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。DNA基質は、直鎖状または超らせん状のいずれかであり得る。多くの変異体loxP部位が記載されている(Hoessら、前掲)。これらの1つloxP 511は、別のloxP 511部位と組換えるが、loxP部位とは組み換えない。
(1983)、Cold Spring Harbor Laboratory)、attL(約100 bp)およびattR(約160 bp)部位によって隣接された、組み込まれたλゲノムを生成するように作用する。Xisの非存在下(下記参照のこと)で、この反応は本質的に不可逆的である。インテグラーゼおよびIHFによって媒介される組み込み反応は、インビトロで、スペルミジンを含む単純な緩衝液を用いて働く。インテグラーゼは、Nash,H.A.、Methods of Enzymology 100:210−216(1983)によって記載されるように入手され得る。IHFは、Filutowicz,M.ら、Gene 147:149−150 (1994)によって記載されるように入手され得る。
225(1):25 (1992)を参照のこと。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する(Argosら、EMBO J. 5:433−440 (1986))。おそらく、これらのうち、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ/att系(Landy,A. (1993) Current Opinions in Genetics and Devel. 3:699−707)、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系(HoessおよびAbremski (1990) Nucleic Acids and Molecular Biology、第4巻、EcksteinおよびLilley編、Berlin−Heidelberg:Springer−Verlag;90−109頁)、およびSaccharomyces cerevisiae2μ環状プラスミド由来のFLP/FRT系(Broachら、Cell 29:227−234 (1982))が、最も良く研究されている。
1.部位特異的(例えば、attBを得るためのattLおよびattR)組換え機構または他の(例えば、相同)組換え機構による2つの親DNA配列の組換えによる。DNA親DNAセグメントは、最終的なコア配列を生じる1またはそれ以上の塩基変化を含む;
2.所望のコア配列の直接的な変異または変異誘発(部位特異的、PCR、ランダム、自発的など)による;
3.組み換えられて所望のコア配列を生じる親DNA配列の変異誘発(部位特異的、PCR、ランダム、自発的など)による;および
4.所望のコア配列をコードするRNAの逆転写による。
本発明の反応において、種々の公知の緩衝液を使用し得る。制限酵素については、製造者によって推奨される緩衝液の使用が望ましい。代替緩衝液が、文献から容易に見出され得るか、または当業者によって案出され得る。
Tris−HCl(pH 7.5)、33 mM NaCl、5mM スペルミジン、および0.5 mg/ml ウシ血清アルブミンが含まれる。
2対のプラスミドを、2つの異なる方法においてインビトロ組換えクローニング法を行うために構築した。一方の対であるpEZC705およびpEZC726(図2A)を、Creおよびλインテグラーゼとともに用いられる、loxPおよびatt部位を有して構築した。他方の対であるpEZC602およびpEZC629(図3A)は、CreのためのloxP(野生型)部位および1塩基(全34中)においてloxPと異なる第2の変異体lox部位(loxP 511)を含んだ。本発明の組換えクローニングに対する最小の要求は、各プラスミドにおける2つの組換え部位(一般に、XおよびY、ならびにX’およびY’)である。いずれかまたは両方の型の部位が組換えて、コインテグレート(例えば、XおよびX’)を形成し得る場合、およびいずれかまたは両方の(しかし、コインテグレートを形成する型と異なる部位である必要がある)が、組換えて、コインテグレート(例えば、YおよびY’)から産物または副産物プラスミドを切り出し得る場合、組換えクローニングが起こる。同一のプラスミド上の組換え部位は、組換えないことが重要である。本発明の組換えクローニングは、Creのみを用いて行われ得ることが見出された。
2つのプラスミドを、この概念を示すために構築した(図3Aを参照のこと)。pEZC629が、ベクタードナープラスミドであった。これは、構成性薬剤マーカー(クロラムフェニコール耐性)、複製起点、loxPおよびloxP 511部位、条件的薬剤マーカー(トランスポゾンTn10のテトラサイクリン耐性オペロンのオペレーター/プロモーターによってその発現が制御されるカナマイシン耐性)、およびtetリプレッサータンパク質に対する構成性に発現される遺伝子tetRを含んでいた。pEZC629を含むE.coli細胞は、30μg/mlのクロラムフェニコールに対して耐性であるが、100μg/mlのカナマイシンに対して感受性であった。pEZC602が、インサートドナープラスミドであり、これは、異なる薬剤マーカー(アンピシリン耐性)、複製起点、ならびにマルチクローニング部位に隣接しているloxPおよびloxP511部位を含んだ。
(パートI:各々約75μgのpEZC602およびpEZC629を全容積30μlのCre緩衝液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、33mM NaCl、5mM スペルミジン−HCl、500μg/ml ウシ血清アルブミン)中で混合した。)
2つの10μlアリコートを、新しいチューブに移した。1つのチューブに、0.5μlのCreタンパク質(約4単位/μl;AbremskiおよびHoess、J. Biol. Chem. 259: 1509 (1984) に従って、部分精製した)を入れた。両方のチューブを、37℃で30分間インキュベートし、次いで、70℃で10分間インキュベートした。各反応物のアリコートを希釈し、そしてDH5αに形質転換した。発現後、アリコートを、30μg/ml クロラムフェニコール;100μg/ml アンピシリン+200μg/mlメチシリン;または100μg/ml カナマイシン上にプレートした。結果:表1を参照のこと。Creを含まない反応物は、1.11×106個のアンピシリン耐性コロニー(インサートドナープラスミドpEZC602由来);7.8×105個のクロラムフェニコール耐性コロニー(ベクタードナープラスミド由来);および140個のカナマイシン耐性コロニー(バックグラウンド)を生じた。Creを添加した反応物は、7.5×105個のアンピリン耐性コロニー(インサートドナープラスミドpEZC602由来);6.1×105個のクロラムフェニコール耐性コロニー(ベクタードナープラスミドpEZC629由来);および760個のカナマイシン耐性コロニー(バックグラウンドコロニーおよび組換えクローニング産物プラスミド由来のコロニーの混合物)を生じた。分析:Creの存在において、カナマイシンプレート上のコロニーの数がずっと多かったので、それらの多数またはほとんどが所望の産物プラスミドを含むと予想された。
本方法を示すために使用されるプラスミドは、ベクタードナープラスミドであるpEZC726がloxP 511の代わりにattP部位を含んだこと、およびインサートドナープラスミドであるpEZC705がloxP 511の代わりにattB部位を含んだことを除き上記で使用されたプラスミドに正確に類似する(図2A)。
パートI:約500ngのpEZC705(インサートドナープラスミド)を、アンピシリン耐性遺伝子内でプラスミドを直鎖化するScaIを用いて切断した。(λインテグラーゼ反応は、歴史的に直鎖状態のattBプラスミドを用いて行われている(H.Nash,私信)ので、これを行った)。しかし、インテグラーゼ反応は、超らせん状の両方のプラスミドを用いて良好に進行することが後に見出された。次いで、直鎖状プラスミドをエタノール沈殿し、そして20μlのλインテグラーゼ緩衝液(50mM Tris−HCl(約pH7.8)、70mM KCl、5mMスペルミジン−HCl、0.5mM EDTA、250μg/mlウシ血清アルブミン)中で溶解した。また、約500ngのベクタードナープラスミドpEZC726をエタノール沈殿し、そして20μlのλインテグラーゼ緩衝液中で溶解した。使用の直前に、λインテグラーゼ(2μl、393μg/ml)を融解し、そして18μlの冷λインテグラーゼ緩衝液を添加することにより希釈した。1μlのIHF(組み込み宿主因子、2.4mg/ml、アクセサリータンパク質)を、150μlの冷λインテグラーゼ緩衝液中で希釈した。アリコート(2μl)の各DNAを、全量10μlで、λインテグラーゼ緩衝液(各々1μlのλインテグラーゼおよびIHFを含むまたは含まない)と混合した。混合物を、25℃で45分間インキュベートし、次いで、70℃で10分間インキュベートした。各反応物の半分をアガロースゲルに供した。結果:インテグラーゼおよびIHFの存在下で、全DNAの約5%が、直鎖状のコインテグレート形態に転換された。分析:インテグラーゼおよびIHFの活性を確認した。
coli DH5αに形質転換した。形質転換混合物を、100μg/ml アンピシリン+200μg/ml メチシリン;30μg/ml クロラムフェニコール;または100μg/ml カナマイシン上にプレートした。結果:表2を参照のこと。
loxP部位とattB部位の間でクローン化され、その結果loxP部位が遺伝子の5’末端に位置する、E. coliのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、インサートドナープラスミドであるpEZC843を構築した(図4B)。loxP部位に隣接するサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含む、ベクタードナープラスミドであるpEZC1003を構築した(図4C)。1μlアリコートの各超らせん状のプラスミド(約50ngの粗製ミニプレップDNA)を、等量のλインテグラーゼ緩衝液(50mM
Tris−HCl(pH7.8)、70mM KCl、5mM スペルミジン、0.5mM EDTA、0.25mg/ml ウシ血清アルブミン)およびCreリコンビナーゼ緩衝液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、33mM NaCl、5mM スペルミジン、0.5mg/ml ウシ血清アルブミン)、2単位のCreリコンビナーゼ、16ngの組み込み宿主因子、および32ng λインテグラーゼを含む10μlの反応物中で合わせた。30℃で30分間インキュベートした後、75℃で10分間インキュベートし、1μlをコンピテントE. coli DH5α株(Life Technologies,Inc.)に形質転換した。形質転換体のアリコートを、200μg/ml カナマイシンを含む寒天プレート上に広げ、そして37℃で一晩インキュベートした。それ以外の同一のコントロール反応は、ベクタードナープラスミドのみを含んだ。コントロール反応形質転換の10%を受けたプレートから、1つのコロニーを得た;組換えクローニング反応の10%を受けたプレートからは144のコロニーを得た。これらの数は、99%より多い組換えクローニングコロニーが、所望の産物プラスミドを含んだことを示唆した。6個の組換えクローニングコロニーから作製したミニプレップDNAから、予想されたサイズのプラスミド(5026塩基対)であるCMVProdを得た。NcoIを用いた制限消化から、6個全てのプラスミドについてCMVプロモーターの下流にクローン化したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼと予想されるフラグメントを得た。
(パートI:背景)
上記の実施例は、転写が組換え部位を横切る転写融合に適する。しかし、attR部位およびloxP部位の両方は、両方の鎖に複数の終止コドンを含み、従って、コード配列が組換え部位を横断しなければならない(1つのリーディングフレームのみがloxP部位の各鎖上で利用可能である)場合、転写融合は困難であり得るか、または不可能であり得る(attRまたはattLにおいて)。
変異体attL部位および変異体attR部位を構築した。重要なことに、Landyら(Ann. Rev. Biochem. 58:913 (1989))は、attPのP1およびH1ドメインの欠失が、切り出し反応を促進し、そして組み込み反応を除去し、その結果切り出し反応を不可逆的にさせることを観察した。従って、変異がattRに導入されて、P1およびH1ドメインもまた欠失されたので、本実施例におけるattR部位は、P1領域およびH1領域を欠き、そして取り除かれたNdeI部位を有し(塩基27630をCからGに改変した)、そしてバクテリオファージ座標27619〜27738(GenBank release 92.0,bp:LAMCG、「バクテリオファージλの完全な配列」)に対応する配列を含む。
関与するプラスミドの物理的な状態が、組換え効率に影響することが見出された。
(パートI:原理)
上記実施例3は、適切な組換え部位の逆方向反復を含むプラスミド(例えば、プラスミドpEZC1502中のattL1およびattL2)(図5H)が、組換えて、これも逆方向で終止コドンを有さないattB部位によって隣接される所望のDNAセグメントが得られ得ることを示した。逆方向反復のインビボおよびインビトロでの影響が危惧された。例えば、逆方向でattB部位によって隣接される所望のDNAセグメントの転写は、ヘアピン構造を形成し得る一本鎖RNA分子を生じ、その結果、翻訳を阻害し得る。
パートII:組換えクローニングのための逆方向反復を有さないプラスミドの構造
プラスミドpEZC1405(図5G)中のattR2配列を、反対方向でのattL2と置換し、pEZC1603(図6A)を作製した。pEZC1502(図5H)のattL2配列を、反対方向でのattR2と置換し、pEZC1706(図6B)を作製した。これらのプラスミドの各々は、att1コアとatt2コアの間の分子内反応を非常に非効率的にするコア領域中の変異を含んだ(実施例3、上記を参照のこと)。
直鎖状pEZC1405(図5G)×環状pEZC1502(図5H)、環状pEZC1405×直鎖状pEZC1502、直鎖状pEZC1603(図6A)×環状pEZC1706(図6B)、および環状pEZC1603×直鎖状pEZC1706反応由来の各々6個のコロニーを、富化培地にひろい、そしてミニプレップDNAを調製した。Ssp Iを用いる診断的切断により、24個のコロニーについて予想される制限フラグメントを得た。
(パートI:背景)
制限酵素Dpn Iは、配列GATCを認識し、そしてAがdamメチラーゼによってメチル化された場合のみ、この配列を切断する。大部分の一般的に使用されるE. coli株は、dam+である。細胞の染色体が多数の断片に切断されるので、E. coliのdam+株におけるDpn Iの発現は致死性である。しかし、dam−細胞において、Dpn Iの発現は無害である。なぜなら染色体は、Dpn I切断に対して免疫性であるからである。
Dpn Iエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を、プライマー5’CCA
CCA CAA ACG CGT CCA TGG AAT TAC ACT
TTA ATT TAG3’(配列番号17)および5’CCA CCA CAA GTC GAC GCA TGC CGA CAG CCT TCC AAA TGT3’(配列番号18)ならびに鋳型としてDpn I遺伝子を含むプラスミド(Sanford A.Lacks, Brookhaven National Laboratory,Upton,New Yorkから入手したプラスミド由来であり;またATCC 67494としてアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能である)を用いるPCRによって増幅した。
プラスミド対を使用し、毒性遺伝子Dpn Iに依存する産物についての選択を用いる組換えクローニングを示した。プラスミドpEZC3101(図7C)を、Mlu Iを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミドpEZC2901(図7A)と反応させた。リプレッサー遺伝子による薬剤耐性の制御に基づく選択を用いるプラスミドの第2の対を、コントロールとして使用した:プラスミドpEZC1802(図7D)を、Xba Iを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミドpEZC1502(図5H)と反応させた。以前の実施例におけると同一の緩衝液ならびにタンパク質Xis、Int、およびIHFを含む8マイクロリットルの反応物を、25℃で45分間、次いで75℃で10分間インキュベートし、そして1μlアリコートを、表6に示すようにDH5α(すなわち、dam+)コンピテント細胞に形質転換した。
(パートI:既存の発現ベクターの組換えクローニングのためのベクタードナーへの変換)
既存のベクターの機能的ベクタードナーへの変換に有用なカセットを、以下のように作製した。プラスミドpEZC3101(図7C)を、Apa IおよびKpn Iを用いて消化し、末端を平滑にするためにT4 DNAポリメラーゼおよびdNTPで処理し、所望でないDNAフラグメントを小さくするためにSma I、HpaI、およびAlwN Iを用いてさらに消化し、そしてattRI−CmR−Dpn I−attR−3ドメインを含む2.6kbカセットをゲル精製した。精製されたカセットの濃度を、約75ngDNA/μlであると評価した。
ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)クローニングは、クローニングベクターへPCR増幅産物をクローニングするための方法である(米国特許第5,334,515号、本明細書中でその全体が参考として援用される)。簡単に述べれば、所望のDNAセグメントのPCR増幅を、それらの5’末端にチミジン塩基の代わりにウラシル塩基を含むプライマーを用いて実施する。このようなPCR産物を酵素UDGと共にインキュベートする場合、ウラシル塩基は特異的に取り除かれる。これらの塩基の欠損は、PCR産物DNAの末端における塩基対合を弱め、そして適切な温度(例えば、37℃)でインキュベートした場合、このような産物の末端は、主として一本鎖化される。PCR産物の3’末端に相補的である突出した3’テールを含む直鎖状クローニングベクターの存在下でこのようなインキュベーションを行った場合、塩基対合は、効率的にクローニングベクターにPCR産物をアニーリングする。アニーリングされた産物を、形質転換によってE. coli細胞に導入した場合、インビボプロセスは、効率的にそれを組換えプラスミドに変換する。
下部(CAG GTT TTC GGT CGT TGG GAT ATC GTA ATC)(配列番号20)、rf2 上部(GGCCA GAT TAC GAT ATC CCA ACG ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGT)(配列番号21、rf2 下部(CAG GTT
TTC GGT CGT TGG GAT ATC GTA ATCT)(配列番号23)、rf3 上部(GGCCAA GAT TAC GAT ATC
CCA ACG ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG
GGT)(配列番号23)、rf3 下部(CAG GTT TTC GGT
CGT TGG GAT ATC GTA ATC TT)(配列番号24)、カルボキシ上部(ACC GTT TAC GTG GAT)(配列番号25)、およびカルボキシ下部(TCGA GTC CAC GTA AAC GGT TCC CAC TTA TTA)(配列番号26))。rf1、2および3上部鎖ならびにカルボキシ下部鎖を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその5’末端上でリン酸化し、次いで各対の相補的な鎖をハイブリダイズした。プラスミドpEZC3201(図8K)をNot IおよびSal Iを用いて切断し、そして切断プラスミドのアリコートをカルボキシ−オリゴ二重鎖(Sal I末端)およびrf1、rf2、またはrf3二重鎖のいずれか(Not I末端)と混合した(250pmolカルボキシオリゴ二重鎖と10μl(約5pmol)切断プラスミドとを混合し、3つの20μl容積に分割し、rf1、rf2、またはrf3二重鎖の5μl(250pmol)および2μl=2単位T4 DNAリガーゼを各反応物に添加した)。室温での90分の連結後、各反応物を調製用アガロースゲルに供し、そして2.1kbのベクターバンドを溶出し、そして50μlのTEに溶解した。
パートIII:CATおよびphoA遺伝子のPCR
プラスミドpACYC184由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子およびE. coli由来のアルカリホスファターゼ遺伝子であるphoAを増幅するために、プライマーをLife Technologies, Inc.,から得た。プライマーは、ウラシル塩基を含む12塩基5’伸長を有し、その結果ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)でのPCR産物の処理は、DNAの各末端での塩基対合を弱め、そして3’鎖が上記のrf1、rf2、およびrf3ベクターの突出す3’末端とのアニーリングを可能にする。プライマーの配列(全て5’→3’で記載)は以下のとおりであった:CAT左、UAU UUU CAG GGU ATG GAG AAA AAA ATC ACT GGA TAT ACC(配列番号27);CAT右、UCC CAC UUA UUA CGC CCC GCC CTG CCA CTC ATC(配列番号28);phoA左、UAU UUU CAG GGU
ATG CCT GTT CTG GAA AAC CGG(配列番号29);およびphoA右、UCC CAC UUA UUA TTT CAG CCC CAG GGC GGC TTT C(配列番号30)。次いで、プライマーを公知の方法工程(例えば、米国特許第5,334,515号(これは本明細書中にその全体が参考として援用される)を参照のこと)を用いるPCR反応のために使用し、そしてこれらのプライマーを用いて得られたポリメラーゼ連鎖反応増幅産物は、開始ATGを有するがいかなる転写シグナルも有さないCATまたはphoA遺伝子を含んだ。さらに、アミノ末端上のウラシル含有配列は、TEVプロテアーゼ(Life Technologies,Inc.)の切断部位をコードし、そしてカルボキシ末端上のウラシル含有配列は、連続的なTAAナンセンスコドンをコードした。
パートIV:CATまたはphoAのUDGクローニングベクターからGST融合ベクターへのサブクローニング
3つ全てのリーディングフレームでのGSTとCATまたはphoAのいずれかとの間の融合物をコードするプラスミドを、以下の組換えクローニングによって構築した。GSTベクタードナーpEZC3501(図8B)(上記のPharmaciaプラスミドpGEX−2TK由来)のミニプレップDNAを、Cla Iを用いて直鎖状にした。約5ngのベクタードナーを、緩衝液および組換えタンパク質Int、Xis、およびIHF(上記)を含む8μlの反応物中、CATまたはphoAを含む各約10ngの適切な環状遺伝子ドナーベクターと混合した。インキュベーション後、1μlの各反応物を、E. coliDH5α株に形質転換し、そして表7に示すようにアンピシリン上にプレートした。
各形質転換由来の2つのコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを含有する17×100mmのプラスチックチューブ(Falcon 2059,Becton Dickinson)中の2mlのリッチ培地(CircleGrow, Bio101 Inc.)中にひろい、そして37℃で約4時間強く振盪し、その時培養物は視覚的に濁っていた。1mlの各培養物を、GSTの発現を誘導するために10μlの10%(w/v)IPTGを含む新しいチューブに移した。さらなる2時間のインキュベーション後、全ての培養物は、ほぼ同じ濁度を有した;1つの培養物のA600は、1.5であった。0.35mlの各培養物由来の細胞を回収し、そしてサンプル緩衝液(SDSおよびβ−メルカプトエタノールを含む)で処理し、そして細胞の約0.15 A600単位に等価なアリコートを、Novex 4〜20%勾配ポリアクリルアミドゲルに供した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。
Claims (1)
- 核酸分子であって、以下:
(a)RKYCWGCTTTYKTRTACNAASTSGB(m−att)(配列番号1);
(b)AGCCWGCTTTYKTRTACNAACTSGB(m−attB)(配列番号2);
(c)GTTCAGCTTTCKTRTACNAACTSGB(m−attR)(配列番号3);
(d)AGCCWGCTTTCKTRTACNAAGTSGB(m−attL)(配列番号4);
(e)GTTCAGCTTTYKTRTACNAAGTSGB(m−attPl)(配列番号5);および
対応するかまたは相補的なDNA配列またはRNA配列、
からなる群より選択される核酸配列を含み、ここでR=AまたはG;K=GまたはT/U;Y=CまたはT/U;W=AまたはT/U;N=AまたはCまたはGまたはT/U;S=CまたはG;そしてB=CまたはGまたはT/U;
である、核酸分子。
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