JP2006513692A - 様々なレベルの遺伝子発現を生じる修飾プロモーターを作成する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は修飾前駆体プロモーターを含むプロモーターカセットを作成する方法、及び目的遺伝子の発現レベル範囲を有する細菌クローンを生じるプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーを用いて細菌宿主細胞の集団を形質転換する方法に関する。本発明はさらに最適遺伝子発現レベルを有する形質転換細菌宿主細胞の選択に関する。

Description

発明の分野
本発明は細菌細胞の遺伝子組換えに関する。特に、本発明は前駆体及び修飾前駆体プロモーターを含むプロモーターのライブラリーを構築する方法、及び細菌性宿主細胞中の目的染色体遺伝子のプロモーターを置換して、目的染色体遺伝子の発現レベル範囲を有する細菌性宿主細胞の集団を生じるためのプロモーターライブラリーの使用に関する。
発明の背景
何年もの間、微生物は工業的酵素、ホルモン及び抗体などの有用な市販製品の製造のために工業的用途において利用されてきた。組換えＤＮＡ技術がこれらの微生物の生産性を高める試みにおいて用いられてきたという事実にも関わらず、株特性を改善するための代謝遺伝子工学の使用は、特に工業的発酵において期待通りにはいっていない。
株特性を増加するために用いる一般的な方法は遺伝子発現を変化させることであり、多数の手段がこの目標を達成するために用いられてきた。１の手段として、選択宿主株においてマルチコピープラスミド中の異種または相同性遺伝子をクローニングすることを含む。別の手段は染色体遺伝子発現を変化させることに関する。これは種々の方法により達成され、以下のいくつかを含む：１）染色体の所定領域での部位特異変異、欠失または挿入；２）ＤＮＡを染色体にランダムに挿入するためのトランスポゾンへの依存；及び３）遺伝子の天然調節領域をその染色体位置で改変させる。調節領域の改変は例えば、プロモーター強度を変化させることにより、または誘導因子濃度により影響される調節プロモーターを用いることにより達成できる。Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒ、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｎｇ ５８：１９３−１９５；Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒ、（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：８２−８７；及びＫｈｌｅｂｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：３２４１を参照されたい。染色体遺伝子の調節領域を置換するために用いるその他の技術はＡｂｄｅｌ−Ｈａｍｉｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：１４８３−１４９８及びＲｅｐｏｉｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：４０１２−４０２３ に開示されている。
選択宿主を処理する代謝経路の最適化に関して、上述の手段は限界があり、各手段は短所を有する。プラスミドにより遺伝子操作された遺伝子の発現レベルが染色体中に位置した同じ修飾遺伝子の発現レベルと必ずしも相関しないということが研究により示されている（Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：３２４１及びＭｃＣｒａｋｅｎ ａｎｄ Ｔｉｍｍｓ（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：６５６９を参照）。
さらに、代謝経路中の発現増加効果は代謝経路を通した流れにおける限界効果しか有さない。このことは、代謝経路の制御は多数の酵素に割り当てられているので、たとえ操作された遺伝子が律速工程において酵素をコードする場合であっても当てはまるであろう。従って、遺伝子が高発現レベル、例えば発現の増加が１０〜１００倍、を達成するように設計されても、生物反応器の組換え微生物の全体的な性能は減少し得る。当該減少は代謝経路に関するその他の因子のバランスまたは最適な細胞成長に必要なその他の物質が欠失したことによるものである。
上述の問題はＪｅｎｓｅｎとＨａｍｍｅｒ（ＷＯ９８／０７８４６）により一部扱われている。ＷＯ９８／０７８４６の開示は異なるレベルの遺伝子発現を与える１組の構成プロモーターの構築について説明している。具体的には、人口プロモーターライブラリーは−３５の共通ボックス、−１０の共通ボックス及びこれらの２つの共通ボックス間にあるスペーサー（リンカー）を含む調節領域の変異体を含むように構築される。しかしながら、ＷＯ９８／０７８４６に記載される方法の不利な点の１つは広範囲のスクリーニングであり、プロモーターライブラリーが必要であるという点である。共通配列のいくつかの塩基対変化による、またはリンカー配列の長さ変化によるプロモーター強度の調整はプロモーター強度に大きな影響を与え、従って、プロモーター強度調整の小工程を達成するためにふさわしいものではないということも当該文献に記載されている。
従って、代謝経路操作の分野において、代謝経路の遺伝子の最適発現レベルを決定する速くて効率的な、言い換えると、所望の生成物の株性能を最適化するための方法を開発する必要性が依然として存在する。本発明は、修飾前駆体プロモーターのプロモーター強度を少し変化させることを特徴とする方法を提供し、ゆえに遺伝子の最適発現レベルを提供する細胞選択を可能とすることにより当該要望を満たすものである。
発明の概要
１の側面において、本発明は目的の染色体遺伝子発現レベル範囲を有する細菌細胞のライブラリーを作成する方法に関し、以下の工程を含む：少なくとも２のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーを得る工程、ここでプロモーターカセットは配列順に標的部位の上流フランキング領域に相同な５’配列；第１のリコンビナーゼ認識部位；選択マーカー；第２のリコンビナーゼ認識部位；−３５共通領域、リンカー配列及び−１０共通領域を含む前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含み、ここで修飾プロモーターは前駆体プロモーターから修飾された少なくとも１のヌクレオチド位置を含み、及び標的部位の下流フランキング領域に相同な３’配列を含む；プロモーターライブラリーを用いて細菌性宿主細胞を形質転換する工程、ここでプロモーターカセットは相同組換えにより細菌性宿主細胞に統合されて形質転換宿主細胞を生成する；適当な条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程；及び形質転換細菌細胞のライブラリー得る工程であって、ここで形質転換細菌細胞は目的の染色体遺伝子発現レベル範囲を示す。１の実施態様において、本方法はさらにライブラリーから形質転換細菌細胞を選択する工程を含む。さらなる実施態様において、選択形質転換宿主細胞は前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも高いレベルの目的遺伝子発現を有する。第２の実施態様において、選択細菌細胞は前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも低いレベルの目的遺伝子発現を有する。第３の実施態様において、本発明は上述の方法に従って選択された形質転換細菌細胞に関する。さらなる実施態様において、プロモーターライブラリーはＰｔｒｃ前駆体プロモーター及び修飾Ｐｔｒｃ前駆体プロモーター；Ｐｔａｃ前駆体プロモーター及び修飾Ｐｔｒｃ前駆体プロモーター；及びＰＧＩ前駆体プロモーター及び修飾ＰＧＩ前駆体プロモーターを含む。
第２の側面において、本発明は配列順に標的部位の上流フランキング領域に相同な５’配列；第１のリコンビナーゼ認識部位；選択マーカー；第２のリコンビナーゼ認識部位；−３５共通領域、リンカー配列及び−１０共通領域を含む修飾前駆体プロモーターであって、ここで修飾プロモーターが少なくとも１のヌクレオチドを前駆体プロモーターの−３５共通領域、リンカー配列及び−１０共通領域に対応する位置で含み；及び標的部位の下流フランキング領域に相同な３’配列を含む。好ましい実施態様において、前駆体プロモーターは、Ｐｔｒｃ、Ｐｔａｃｌ、ＰＤ／Ｅ２０、ＰＨ２０７、ＰＮ２５、ＰＧ２５、ＰＪ５、ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＬ、Ｐｌａｃ、ＰｌａｃＵＶ５、Ｐｃｏｎ、ＰＧＩ及びＰｂｌａからなる群における塩基対−３５〜＋１を含む配列から選択される。第２の実施態様において、−３５領域の前駆体プロモーターはＴＴＧＡＣＡ、ＴＴＧＣＴＡ、ＴＴＧＣＴＴ、ＴＴＧＡＴＡ、ＴＴＧＡＣＴ、ＴＴＴＡＣＡ、及びＴＴＣＡＡＡからなる群より選択され、−１０領域の前駆体プロモーターは、ＴＡＡＧＡＴ、ＴＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＣＴ、ＧＡＴＡＣＴ、ＡＡＴＡＡＴ、ＴＡＣＧＡＴ、ＴＡＴＧＴＴ、及びＧＡＣＡＡＴからなる群より選択される。さらなる実施態様において、好ましい前駆体プロモーターはＰｔｒｃであり、少なくとも１のヌクレオチドは−３５ボックス、−１０ボックスまたはリンカー領域のいずれかで修飾される。さらなる実施態様において、前駆体プロモーターはＰＧＩであり、少なくとも１のヌクレオチドは−３５ボックス、−１０ボックスまたはリンカー領域のいずれかで修飾される。
さらなる側面において、本発明は上述の少なくとも２のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーに関する。１の実施態様において、本発明はプロモーターカセットまたはプロモーターライブラリーを用いて形質転換された宿主細胞に関し、宿主細胞は大腸菌、バチルス種及びパントエア種からなる群より選択される。
さらに別の側面において、本発明は目的染色体遺伝子の天然プロモーターの調節機能を修飾する方法に関し、以下を含む：本発明に従いプロモーターカセットを得る工程；プロモーターカセットを用いて宿主細胞を形質転換し、プロモーターカセットと標的部位の相同フランキング領域間で相同組換えさせる工程であって、プロモーターカセットは目的の染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換する；及び適当な成長条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程。この側面の１の実施態様において、選択マーカーは形質転換宿主細胞から切除し、及び他の実施態様において、形質転換宿主細胞をさらに単離する。
さらに他の側面において、本発明は目的染色体遺伝子の発現を変化させる方法に関し、以下を含む：本発明に従いプロモーターカセットを得る工程；プロモーターカセットを用いて宿主細胞を形質転換する工程；及びプロモーターカセットと標的部位の相同フランキング領域間で相同組換えさせる工程であって、プロモーターカセットが目的の染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換し、及び目的染色体遺伝子の発現を対応する母体宿主細胞における目的染色体遺伝子の発現と比較して変化させる工程。
発明の詳細な説明
本発明の１の側面は、−３５共通ボックス、−１０共通ボックスまたはリンカー領域におけるヌクレオチドに対応する前駆体プロモーターの１または２のヌクレオチドを修飾することにより、染色体遺伝子発現に関するプロモーター強度を遺伝子発現範囲を素早く同定できるレベルに変化させることができるという発見に関するものである。さらに、適当なプロモーターカセットを構築することにより、本発明者は効率的に染色体レベルでプロモーターを試験することができた。
Ａ．定義
この出願において、別に示さない限り、使用する技術の説明はいくつかの公知の参考文献で見ることができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（研究所マニュアル），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．，編集、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（遺伝子発現技術、酵素学の方法），１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，Ｃａｌｉｆ．（１９９１）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，編集、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（タンパク質精製のガイド、酵素学の方法）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）；及びＩｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（方法及び応用ガイド），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）などがある。
別に定めない限り、ここで用いる全ての技術及び科学的用語は本発明が属する技術の当業者により一般的に理解される意味と同じである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（微生物学及び分子生物学の辞典），第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）の両方は本発明で使用する多くの用語の当業者の一般的な辞書となる。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（研究所マニュアル），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）も当業界の定義及び用語に関する。
本発明の目的に関して、以下の用語が本発明を説明するために用いられる。
“プロモーター”または“プロモーター領域”はここで、転写開始時にＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにより認識及び結合されるヌクレオチド配列として定義される。本発明との関連で、プロモーターは２つの共通領域、通常はヘキサマーを含む。第１の共通領域は転写開始部位から約１０塩基対（ｂｐ）上流に集中し、−１０配列、−１０ボックスまたはプリブノー（Ｐｒｉｂｎｏｗ）ボックスと呼ばれる。第２の共通領域は開始部位の約３５ｂｐ上流に集中し、−３５配列または−３５ボックスと呼ばれる。大腸菌ＲＮＡポリメラーゼが認識し、機能的に最も堅く結合すると考えられるのがこれらの２つの相同領域である。
リンカー配列は各共通配列間に伸び、約１４〜２０塩基対からなる。ヌクレオチド−１５、−１６、−１７及び−１８を除いて、通常、リンカー領域は１のプロモーターからもう一方のプロモーターの２つのｂｐよりも大きな相同性の著しい領域を持たないようである。
プロモーターは、ＩＰＴＧにより誘発されるｔｒｃプロモーターなどの調節プロモーターまたは構造プロモーターであってもよい。遺伝子の調節領域の一部と考えられるその他の配列はリボソーム結合部位及び転写開始部位などがある。転写開始部位とは最初のヌクレオチドが転写され、＋１で指定されることを意味する。開始部位のヌクレオチド下流は＋２、＋３、＋４等で番号付けされ、反対向き（上流）のヌクレオチドは−１、−２、−３等と番号付けられる。“リボソーム結合部位（ＲＢＳ）”は通常、約４〜１６塩基対を含む短いヌクレオチド配列であり、エンコードされたタンパク質の翻訳のためのリボソームとｍＲＮＡの相互作用に関する。
ここで用いる“前駆体プロモーター”は野生型プロモーター及び公知の変異体プロテアーゼを含む。“野生型”プロモーターは、プラスミドまたは宿主生物の染色体における天然プロモーター（非変異プロモーター）であり、当該用語はここで“天然”プロモーターと交換可能に用いられる。変異体プロモーターは公知の変異体または修飾野生型プロモーターであり、公知のハイブリッドプロモーターを含む。ここで用いる前駆体プロモーターは野生型プロモーターまたは変異体プロテアーゼである。
“修飾前駆体プロモーター”とは、−３５ボックス、−１０ボックスまたはリンカー領域に対応する少なくとも１の位置でヌクレオチドを変化させることにより修飾された前駆体プロモーターである。ここで用いる“プロモーターカセット”または“プロモーター構築体”は前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含む。“プロモーターライブラリー”の語はプロモーターカセットの集合体をいい、当該集合体は少なくとも２つのメンバーを含む。ＩＡプロモーターライブラリーは使用でき、例えば、形質転換宿主細胞のライブラリーを生成するために使用でき、ここでライブラリーのメンバー（細菌性クローン）は前駆体プロモーターのプロモーター活性と比較して様々なレベルのプロモーター活性を有する。様々なレベルのプロモーター強度は目的遺伝子の同じコード領域に関して異なる発現レベルを有するクローンライブラリーを生じる。形質転換宿主細胞または細菌性クローンはそれから最適な発現に関して選択できる。
修飾または改変は、核酸断片、特に前駆体プロモーター配列の少なくとも１のヌクレオチド塩基において付加（挿入）、欠失または交換（置換）を含むことができる。“欠失”はヌクレオチドが欠けた１以上のヌクレオチド変化として定義される。“挿入”は前駆体プロモーターと比較して１以上のヌクレオチドが付加されている。“置換”は異なるヌクレオチドを含む１以上のヌクレオチドの置換えから生じる。
本発明の目的のために、“ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）”は文献においてｔａｃｌとも呼ばれ、配列番号３及び配列番号２４に示す核酸配列を含む前駆体プロモーターであり、−３５ボックスはＴＴＧＡＣＡ、リンカーは１６塩基対により表され、−１０ボックスはＴＡＴＡＡＴである（Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３５３９（１９８５）及びＤｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ５：２９８７−２９９４（１９８６））。
ここで用いる“ｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）”とは配列番号２７に示す核酸配列を含む前駆体プロモーターである。−１０ボックス及び−３５ボックスのヌクレオチド配列はＰｔｒｃと同じであるが、リンカー部分は１７ｂｐを含む。ＰｔｒｃはＰｔａｃのヌクレオチド−１８と−１９間にＣヌクレオチドが付加されていることによりＰｔａｃと異なる。Ｐｔｒｃ及びＰｔｒｃは本質的に強度は同じである（Ｒｕｓｓｅｌ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｇｅｎｅ ２０：２３１（１９８２）；Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７−１７８）及びＭｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６０：３５２９（１９８５））。
“遺伝子”はここで機能的ポリペプチドまたはＲＮＡ分子（調節ＲＮＡ’ｓ、ｔＲＮＡ’ｓ、ｒＲＮＡ’ｓ）をコードするヌクレオチド配列として定義される。遺伝子はコード領域（エクソン）、非コード領域（イントロン）及びプロモーター及びエンハンサーなどの調節領域の両方を含む。
“核酸”の語はＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子を含む。当該用語はポリヌクレオチドと交換可能に用いられる。オリゴヌクレオチドは短鎖核酸分子である。プライマーはオリゴヌクレオチドであり、制限消化精製により天然または合成的に生成されたかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導因子の存在下、及び適当な温度、ｐＨ）に置いた場合、合成開始点として作用することができる。プライマーは好ましくは増幅において最大効率の一本鎖である。プライマーは誘導因子の存在下で伸長生成物の合成にとりかかるように十分に長くなければならない。本発明の１の実施態様において、プライマーは１のヌクレオチド塩基が前駆体プロモーターの配列と比較して修飾されている変質プライマーである。
ここで用いる“ポリペプチド”の語はペプチド結合により結合したアミノ酸残基からなる化合物をいう。“タンパク質”及び“ポリペプチド”の語はここで交換可能に用いられる。遺伝子コードの縮退の結果として、所定のタンパク質をエンコードする多数のヌクレオチドが生成され得ることは当業者にとって明らかである。
“ＤＮＡ構築体”とは宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するために用いられる配列をいう。ＤＮＡ構築体の定義は例えば、前駆体プロモーター及び／または修飾前駆体プロモーターなどを含むプロモーターカセットを包含する。１の実施態様において、ＤＮＡ構築体は相同組換えにより染色体標的部位中にポリヌクレオチドを統合するために用いられる。ＤＮＡ構築体は宿主細胞遺伝子と相同または異種配列を含むことができる。１の実施態様において、ＤＮＡ構築体はベクター内に挿入できる。
“標的部位”はＤＮＡ構築体の統合が起こるための細菌性染色体内の所定のゲノム位置を意味するものである。
細胞内に核酸を導入することに関して用いられる“導入”の語はトランスフェクション、形質転換、原形質融合、形質導入等を意味し、原核細胞内への核酸の組込みに関するものであって、核酸が細胞のゲノム内に組込まれ、自律レプリコン内に変換され、または一時的に発現されるものを含む。
“フランキング領域”または“フランキング配列”とは、議論されている配列または領域の上流または下流にある領域または配列を意味し、例えば、遺伝子Ａ、Ｂ、及びＣに関して、遺伝子ＢはＡ及びＣ遺伝子配列の側面に位置する。相同フランキング領域は宿主細胞染色体中の核酸配列に相同（実質的に同一）である。
“ベクター”とは異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築体をいう。ベクターはＤＮＡ構築体、プラスミド、クローニングベクター、発現ベクター及びベクテリオファージを含む。
“リコンビナーゼ認識部位”とは染色体中の標的部位の対応する組換え部位へ核酸配列の直接導入を促進する新規なリコンビナーゼ部位である。
ここで用いる“選択マーカー”または“選択遺伝子”とは、宿主細胞において発現できる遺伝子をいい、選択マーカーを含む導入ＤＮＡ構築体を含んだこれらの宿主細胞の選択を容易にするものをいう。通常、選択マーカーは宿主細胞に抗生物質耐性または代謝利点を与え、外来性導入ＤＮＡを含む細胞が当該外来性核酸を受容していない細胞と区別できるようにする遺伝子である。
染色体統合は、本発明に従うプロモーターカセットなどのＤＮＡ構築体を宿主染色体中に導入するプロセスである。プロモーターカセットの相同フランキング領域は宿主染色体の標的部位で相同領域と一致する。
“相同組換え”とは、同じ核酸配列の部位で（交差しながら）２つのＤＮＡ分子または染色体のペア間の核酸断片の交換を意味する。本発明において、染色体融合は相同組換えにより好ましくは行われる。
“代謝経路”は大きな分子をより小さい分子（異化）に分解する、またはより小さい分子からより複雑な分子を合成する（同化）、一連の化学反応をいう。これらの化学反応のほとんどは多くの酵素により触媒される。多くの代謝経路において、当該経路を調節する働きをする律速酵素段階がある。例えば、グルコースがピルビン酸及びＡＴＰに変換される解糖経路において、ホスホフルクトキナーゼは調節の重要酵素であると考えられ、ＮＡＤＰＨ及びリボース−５−ホスフェートを生成するペントースホスフェート経路において、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ及びフルクトース１，６−ジホスファターゼが重要酵素であると考えられる。
“相同性”の語は配列類似性または同一性をいい、同一であることが好ましい。相同性は当業界に公知の標準技術を用いて決定される（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）。
ここで用いる“発現”の語はポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。当該プロセスは転写及び翻訳の両方を含む。“発現レベル範囲”とは、プロモーターカセットライブラリーを用いて形質転換した細菌性クローンのライブラリーから得た目的遺伝子の複数の発現レベルを意味する。
ここで用いる“最適発現”とは、特定のコード領域に関して最適な遺伝子発現レベルを提供する累積条件をいう。特定条件において、最適発現は低レベルの遺伝子発現を意味する。
“動作可能に連結”とは、核酸配列が機能的に関連していることを意味する。一般的に、動作可能に連結とは連結した核酸配列が隣接していることを意味する。連結は都合の良い制限酵素認識部位で連結反応により達成される。そのような部位が天然には存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来技術に従って用いる。
ここで用いる“単離”とは元々結びついていた少なくとも１の成分から取り除いた核酸またはポリペプチドをいう。
“宿主細胞”とは本発明に従うプロモーターカセットまたはＤＮＡ構築体のための宿主及び発現媒体として働く能力を有する細胞を意味する。宿主細胞は組換え宿主細胞であってもよい。“対応する母体宿主細胞”とは、本発明に従う修飾前駆体プロモーターを含むプロモーターカセットを用いて形質転換されておらず、前駆体プロモーターを保持している細菌細胞を意味する。通常、対応する母体宿主細胞及び修飾前駆体プロモーターを含む形質転換宿主細胞を遺伝子発現レベルに関して比較する場合、両細胞は別に示さない限り、実質的に同じ成長条件下で成長させる。
ここで用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，９６５，１８８号の方法をいい、クローニングまたは精製することなく、ＤＮＡ混合物中においてポリヌクレオチドの断片濃度を増加させるための方法を含む。標的配列またはＤＮＡ断片を増幅するこの方法は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入する工程、ＤＮＡポリメラーゼの存在中、熱処理サイクルを連続させる工程からなる。２つのプライマーは標的配列のそれぞれのストランドに相補的である。
ここで用いる“異種核酸”または“異種ポリペプチド”の語は、宿主細胞に天然では起こらない核酸またはポリペプチド配列をいう。異種核酸に関して、配列はそれが発現する細胞に天然でない部分を含む。
ここで用いる“相同核酸”または“相同ポリペプチド”の語は、宿主細胞に天然に起こる核酸またはポリペプチドをいう。
ここで数値範囲を用いる場合、それらは定めた範囲の数を含む。
明細書中で用いる、単数は文脈が明らかに別に示さない限り、複数も含む。例えば、“カセット”の語は複数のカセットを含み得る。
ここに引用する公開特許出願、発行特許及び文献はこの出願に引用するものとする。
Ｂ．実施態様
本発明に従うプロモーターカセットを作成するために有用な前駆体プロモーターは下記の表１に記載した前駆体プロモーターの配列を含む。図５はこれらの前駆体プロモーターの配列を示し、−３５領域、−１０領域及びリンカー領域を含む。表中の全てのプロモーターはβ−ラクタマーゼプロモーターＰｂｌａに関して特長付けられ、プロモーター強度は“Ｐｂｌａ−単位”で与えられる。（Ｄｅｕｓｃｈｌｅ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，５：２９８７−２９９４（１９８６））。
Figure 2006513692
一般的な前駆体プロモーターにおいて、本発明で有用な配列は、転写開始部位（＋１）から２００〜２０ｂｐ上流の配列、好ましくは１５０〜２５ｂｐ、より好ましくは３０〜１００ｂｐ及び最も好ましくは５０〜３０ｂｐ上流を含む。
１の実施態様において、好ましい前駆体プロモーターはＴｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）であり、ここで−３５ボックスはＴＴＧＡＣＡ、リンカーは１７塩基対で表され、及び−１０ボックスはＴＡＴＡＡＴ（配列番号２７）である（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７−１７８）。
他の実施態様において、好ましい前駆体プロモーターはｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）（配列番号３及び２４）である。−１０ボックス及び−３５ボックスのヌクレオチド配列はＰｔａｃ及びＰｔｒｃにおいて同じであるが、リンカー領域は１ｂｐ異なる。
他の好ましい実施態様において、前駆体プロモーターはＰＧＩである。このプロモーターはキシロース・イソメラーゼプロモーターとしても文献で公知であり、当該プロモーターを含む調節配列はＡｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：３５１−３５７に開示されている。当該プロモーターの短断片の配列（−１０ボックスの＋５０〜−７）は配列番号３４に示す。
式１
Figure 2006513692
ここで、−３５ボックスはＴＴＧＡＣＡで表され、−１０ボックスはＡＡＴＡＡＴで表される。
前駆体プロモーターは種々の典型的方法により決定できる。限定するものではないが、１の実施態様において、特定ゲノムの配列決定はコンピューター処理検索アルゴリズムを用いて行われ、推定上のプロモーター配列が同定される。例えば、プロモーター予測ソフトウェアのためのニューラル・ネットワーク、ＮＮＰＰを用いる。ＮＮＰＰは大部分が２つの主要層からなる時間遅延ニューラル・ネットワークであり、１つはＴＡＴＡボックス（−１０ボックス）を認識し、１つはいわゆる“開始剤”を認識し、転写開始部位に及ぶ領域である。両主要層は１の出力ユニットに組み合わされる。これらの推定上配列はそれから大腸菌での予備の特性付け及び／または大腸菌中での直接の特性付けに適したカセット中にクローンされる。
プロモーター配列は相同分析によっても同定できる。例えば、ゲノムファミリーの相同研究はＢＬＡＳＴを用いて推定共通プロモーターの存在について行い、分析できる。これらの推定プロモーター配列はそれから、大腸菌での予備の特性付けに適したカセット内にクローンできる。いくつかの好ましい前駆体プロモーターは図４及び５に記載する。
本発明に従う修飾前駆体プロモーターは前駆体プロモーター中のヌクレオチドに対して少なくとも１の修飾を含む。１の実施態様において、修飾は−３５共通領域に位置したヌクレオチド塩基に対するものである。この修飾は前駆体プロモーターの−３０、−３１、−３２、−３３、−３４、及び／または−３５位置に等しい位置での１以上のヌクレオチド塩基に対する修飾を含んでもよい。好ましくは、当該修飾は１のヌクレオチドまたは２つのヌクレオチドであり、好ましくは修飾は置換である。２つの位置が修飾された場合、４つの位置が保存され、１の位置が修飾された場合、５つの位置が保存される。さらなる実施態様において、修飾前駆体プロモーターは−３０に対応する位置での変化及び／または−３５に対応する位置での変化を含む。
他の実施態様において、修飾前駆体プロモーターは、以下の配列で表される−３５領域を有する前駆体プロモーターから得られる：ＴＴＧＡＣＡ、ＴＴＧＣＴＡ、ＴＴＧＣＴＴ、ＴＴＧＡＴＡ、ＴＴＧＡＣＴ、ＴＴＴＡＣＡ及びＴＴＣＡＡＡ。前駆体プロモーターから修飾される特に好ましい−３５共通領域はＴＴＴＡＣＡ及びＴＴＧＡＣＡである。非限定的な例として、ＴＴＧＡＣＡが前駆体プロモーターの−３５ボックスである場合、Ａである−３０位置のヌクレオチドはＣ、ＴまたはＧで置換でき、Ｃである−３１位置のヌクレオチドはＧ、Ａ、またはＴで置換でき、Ａである−３２位置のヌクレオチドはＴ、Ｃ、またはＧで置換でき、Ｇである−３３位置のヌクレオチドはＣ、ＴまたはＡで置換でき、Ｔである−３４位置のヌクレオチドはＣ、ＧまたはＡで置換でき、及び／またはＴである−３５位置のヌクレオチドはＣ、ＧまたはＡで置換できる。１の実施態様において、修飾前駆体プロモーターはＴＴＧＡＣＡで表される共通領域において１〜４のヌクレオチドの修飾を含む。１の実施態様において、４つの位置は保存され、２つの位置が修飾される。他の実施態様において、５つの位置が保存され、１つの位置が修飾される。さらなる実施態様において、修飾前駆体プロモーターは−３０に対応する位置での変化または−３５に対応する位置での変化を含む。ＴＴＧＡＣＡが前駆体プロモーターである場合、以下の通り修飾される：ＴＴＧＡＣＴ、ＴＴＧＡＣＧ、ＴＴＧＡＣＣまたはＣＴＧＡＣＡ。
さらなる実施態様において、前駆体プロモーターの修飾は−１０領域である。この修飾は前駆体プロモーターの−７、−８、−９、−１０、−１１または−１２位置に等しい位置で１以上のヌクレオチドに対する修飾を含む。好ましくは、修飾は１または２のヌクレオチド位置においてである。好ましい実施態様において、修飾は１または２のヌクレオチド位置での置換である。好ましい前駆体プロモーターは以下の配列を−１０領域に含む：ＴＡＡＧＡＴ、ＴＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＣＴ、ＧＡＴＡＣＴ、ＴＡＣＧＡＴ、ＡＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＧＴＴ及びＧＡＣＡＡＴ。特に好ましい−１０領域はＡＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＧＴＴ及びＴＡＡＧＡＴを含む。１の実施態様において、前駆体プロモーターはＰｔｒｃ（配列番号２７）であり、修飾前駆体プロモーターは少なくとも１のヌクレオチド修飾をＴＡＡＧＡＴで表される−１０領域中に含む。例えば、Ｔである−７位置でのヌクレオチドはＧ、ＣまたはＡで置換でき、Ａである−８位置でのヌクレオチドはＴ、ＣまたはＧで置換でき、Ｇである−９位置でのヌクレオチドはＣ、ＴまたはＡで置換でき、Ａである−１０位置でのヌクレオチドはＴ、ＣまたはＧで置換でき、Ａである−１１位置でのヌクレオチドはＴ、ＣまたはＧで置換でき、及びＴである−１２位置でのヌクレオチドはＴ、ＣまたはＧで置換できる。１の実施態様において、４つの位置が保存され、２つの位置が修飾される。他の実施態様において、５つの位置が保存され、１つの位置が修飾される。
本発明のいくつかの実施態様において、前駆体プロモーターの−３５領域及び−１０領域の両方が修飾を含むことができる。１の実施態様において、修飾は−３５ボックス中の１のヌクレオチド位置を含み、ここでその他のヌクレオチドは保存され、及び−１０ボックス中の１のヌクレオチド位置で修飾を含み、ここでその他のヌクレオチドは保存される。他の実施態様において、修飾はＴＴＧＡＣＡで表される−３５領域に対する修飾及びＴＡＴＡＡＴで表される−１０領域に対する修飾を含み、他の実施態様において、修飾はＴＴＧＡＣＡで表される−３５領域に対する修飾及びＡＡＴＡＡＴで表される−１０領域に対する修飾を含む。前駆体プロモーターの−３５ボックス及び−１０ボックスにおける修飾の合計数は各共通ボックスにおける１の位置を含むことができ、ここでその他の位置は保存される。前駆体プロモーターの−３５ボックス及び−１０ボックスにおける修飾の合計数は１の共通ボックスにおける１の位置及びその他の共通ボックスにおける２の位置を含むこともでき、その他の位置は保存される。また、前駆体プロモーターの−３５ボックス及び−１０ボックスにおける修飾の合計数は各共通ボックスにおける２の位置を含むこともでき、その他の位置は保存される。
さらなる実施態様において、修飾前駆体プロモーターは前駆体プロモーターのリンカー配列に対する修飾を含む。リンカー配列は通常、１４〜２０ヌクレオチドであり、より一般的には１６〜１８ヌクレオチドである。修飾は１、２、３、４、または５塩基対のリンカー配列への付加を含み、または１、２、３、４、５またはそれ以上の塩基対の置換を含む。好ましくは修飾はリンカー領域における１または２の塩基対の付加であり、ここで付加はＡ、Ｔ、ＣまたはＧのヌクレオチドのいずれか１つのである。好ましくは付加は１または２の塩基対をＰｔｒｃのリンカー配列に含む。さらに、Ｐｔｒｃへの付加は好ましくは塩基対−２３と−２４の間で起こる。さらなる実施態様は塩基対−２３と−２４の間にＴの付加を含み（配列番号３２を参照）、及びＴＴの付加を含む（配列番号３３を参照）。さらなる実施態様において、修飾は前駆体リンカー配列の任意の位置において１、２、または３のヌクレオチド塩基置換を含む。好ましくは修飾は前駆体リンカーの任意の位置での１のヌクレオチド塩基の置換である。
さらなる実施態様において、修飾前駆体プロモーターは−３５ボックス、リンカー領域及び−１０ボックスに対する修飾を含む。当該修飾は少なくとも３つ、かつ８以下のヌクレオチド位置を含み、ここで各領域は１の修飾を含む。好ましくは修飾は３つのヌクレオチド位置を含み、ここで各領域は１の修飾を含む。
修飾前駆体プロモーター配列は当業界に公知の方法により生成し、限定されないが、化学的突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応及び１以上のヌクレオチドに対する部位特異的変異誘発などの突然変異誘発技術を含む（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ａ．Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９２を参照）。１の実施態様において、変質オリゴヌクレオチドはプロモーターライブラリーが構築される宿主細胞のために合成される。好ましい実施態様において、前駆体プロモーターに対する改変はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ市販キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州）を用いて部位特異的変異誘発により達成される。
ここで明確にする修飾プロモーターの個々のプロモーターも本発明に含まれる。１の実施態様において、特定のプロモーターで、本発明に従って構築されたプロモーターは修飾Ｐｔｒｃプロモーター：ＮＦ−Ｔ（配列番号２８）；ＮＦ−Ｇ（配列番号２９）；ＮＦ−Ｃ（配列番号３０）；ＮＦ−１Ｔ（配列番号３２）及びＮＦ−２Ｔ（配列番号３３）を含む。本発明に含まれる他のプロモーターは以下の配列を有するＭＣ−Ｃ３設計プロモーターである：ＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡ ＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＧ ＴＡＴＡＡＴ ＧＴＧＴＧＧ（配列番号３１）、ここで−３５ボックスはＣＴＧＡＣＡであり、リンカー領域はＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＧ、及び−１０ボックスはＴＡＴＡＡＴである。
本発明に従うプロモーターカセットは上述の前駆体プロモーター及び／または修飾前駆体プロモーターを含む。さらに、本発明に従うプロモーターカセットは標的部位の上流フランキング領域に相同な５’配列を含み、ここで標的部位は好ましくは目的染色体遺伝子である。標的部位の上流フランキング領域に相同な５’配列は５〜５００ヌクレオチドを含み、好ましくは１０〜２００ヌクレオチド、及び１０〜１００ヌクレオチド、及びさらに１０〜５０ヌクレオチドを含み、標的部位のヌクレオチド上流に相同である。
目的の遺伝子は任意の染色体遺伝子であってよい。１の実施態様において、目的遺伝子は成長因子、サイトカイン、ホルモン、配位子、受容体及び抗体などの治療的に重要なタンパク質をエンコードする。他の実施態様において、目的遺伝子はアミラーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、デヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、キナーゼ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、リパーゼ及びフィターゼなどの商業的に重要な酵素をエンコードする。さらなる実施態様において、目的遺伝子はグルコース及び／またはガラクトースパーミアーゼ（トランスポーター）などの輸送タンパク質をエンコードする。他の実施態様において、目的遺伝子は代謝経路において、グルコースデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、及びピルビン酸オキシダーゼなどの酵素をエンコードする。特定の実施態様において、目的遺伝子はリパーゼ、エステラーゼ、ヒドロゲナーゼ及びプロテアーゼなどの工業的に重要な酵素をエンコードする。目的の染色体遺伝子またはそれらのコード領域は宿主細胞と異種または相同であるが、プロモーターライブラリーによりまたは本発明に従う修飾前駆体プロモーターにより置換される天然プロモーターまたは前駆体プロモーターに動作可能に連結する。
本発明に従うプロモーターカセットも２つのリコンビナーゼ認識部位及び各リコンビナーゼ認識部位に隣接した選択マーカーを含むことができる。リコンビナーゼ認識部位の例は当業界に公知である。リコンビナーゼは通常、２つの明確なファミリーに分類され、それぞれ異なる触媒メカニズムを用いる。これらはチロシン・リコンビナーゼ及びセリン・リコンビナーゼである。いずれかのタイプのリコンビナーゼシステムを本発明で用いる。チロシン・リコンビナーゼファミリーはλインテグラーゼファミリーとしても公知であり、１００以上の確認されているメンバーを含む（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（核酸調査）２６：３９１−４０６（１９９８））。文献記載された７２以上のセリン・リコンビナーゼがあり、これらはＴｎ３、Ｈｉｎ、ＳＯＰＩＶＣＡ、φＣ３１及びλがある。本発明で使用できる特に好ましいリコンビナーゼはＣｒｅ及びＦｌｐを含む（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６：３９１−４０６（１９９８）及びＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：４４３（１９９１）；ＸｅｒＣ−ＸｅｒＤ（ｃｅｒ、ｐａｒＢ ｄｉｆ及びｐｓｉ）（Ｂｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：３８７−３９８）；Ｐ２２ ｘｉｓ−ｉｎｔ（ＡｔｔＰ２２及びａｔａＡ）（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８１：４２４５−４２４９）；ＳＰＯＩＶＣＡ（ＳｐｏＩＶＣＢ、ＳｐｏＩＩＩＣ、ＡｔｔＰｓｋｉｎ及びＡｔｔＢｓｋｉｎ）（Ｓｔｒａｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉ．２４３：５０７−５１２）；Ｒｅｓｏｌｖａｓｅ（ｒｅｓ）（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ（１９９５）Ｃｅｌｌ ８２：１９３−２０７）及びλＩｎｔ（Ａｔｔ，ａｔｔＬ及びａｔｔＲ）（Ｈａｌｌｅｔ ａｎｄ Ｓｈｅｒｒａｔ（１９９７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１：１５７−１７８）。
特に好ましいリコンビナーゼはＣｒｅ及びＦｌｐである。最も好ましい実施態様において、第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位はバクテリオファージＰ１ Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムを含み、Ｃｒｅ酵素及び２つの非対称３４ｂｐ ｌｏｘＰ組換え部位を含む（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：４６７−４８６；Ｖａｎ Ｄｕｙｎｅ（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３０：８７−１０４及びＰａｌｍｅｒｏｓ，Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ２４７：２５５（２０００）を参照）。ｌｏｘＰ部位は２つの１３配列を含み、転化され、不十分に繰り返され、８ｂｐコア非対称配列を囲み、ここで交差が起こる。２つの平衡ｌｏｘＰ部位間のＣｒｅ依存分子内組換えは環状分子として任意の介在ＤＮＡ配列の切除を生じ、２つの組換え生成物を生じ、それぞれ１のｌｏｘＰ部位を含む。好ましくは、プロモーターカセットは２つのｌｏｘＰ部位に隣接した選択マーカーを含む。特に好ましい実施態様において、リコンビナーゼ配列は、２つのＬｏｘＰ部位が染色体中において正しい配向にある場合それらはループ作成または染色体の大きな領域の反転を促進するので、ｌｏｘＰ部位の変異体を含む。Ｓａｕｅｒ Ｅ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９４）、５：５２１−５２７；Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ２４７（２０００）２５５−２６４、及びＨｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）ＮＡＲ、１４：２２８７−２２３０を参照されたい。
好ましい実施態様において、選択マーカーは２つのリコンビナーゼ部位間に位置する。種々の選択マーカーが使用できるが、好ましい選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。これらは当業界に公知である。例えば、当該遺伝子はエリスロマイシン耐性遺伝子（Ｅｍ’）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ’）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ’）、ゲンタマイシン耐性遺伝子（Ｇｍ’）またはカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍ’）である。好ましくは選択マーカーを含むプロモーターカセットが宿主細胞にいったん導入されると、マーカーを例えば、Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４７（２０００）２５５−２６４の教示に従って除去する。
プロモーターカセットは標的部位の下流フランキング領域に相同な３’配列を含んでもよい。３’配列は５〜５００ヌクレオチド、また１０〜２００ヌクレオチド、また１０〜１００ヌクレオチド及びさらに１０〜５０ヌクレオチドを含むことができ、標的部位の下流ヌクレオチドに相同である。
本発明のプロモーターカセットを含むＤＮＡ構築体はＤＮＡ構築体の様々な断片の連結反応を促進する種々の制限酵素認識部位を含むことができる。制限酵素認識部位はＸｂａｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ｔａｑｌ等を含むことができる。例えば、制限酵素認識部位は−３５配列断片を用いる連結反応、及び翻訳開始コドン及びそこから下流に位置する遺伝子配列に用いることができる。
プロモーターカセット及び修飾前駆体プロモーター核酸はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ｍＲＮＡ安定化配列、エンハンサー、抑制配列、転写ターミネーター、転写アテニュエーター、オペレーター及びｍＲＮＡ不安定化配列などその他の配列も含むことができる。
いくつかの実施態様において、前駆体プロモーター及び目的染色体遺伝子は異種であり、他の実施態様において、前駆体プロモーター及び目的染色体遺伝子は相同である。
プロモーターカセットはＰＣＲなどの公知の標準組換え技術を用いて構築でき、Ｓａｍｂｒｏｏｋ上述、Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ２４７：２５５−２６４；Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０：６４０−６６４５などの種々の文献に記載されている。通常、プロモーターはベクター内にクローンされ、選択マーカーはプロモーター上流にマーカーをクローニングすることによりプロモーターに結合され、クローニング工程はプロモーター機能に影響を与えないようにする。得られたマーカー−プロモーター領域はプロモーターカセットとして用いる。カセットはＰＣＲにより、または制限酵素を用いて単離できる。相同組換えを可能にするために、カセットは宿主細胞染色体に相同な領域にＰＣＲを用いてＰＣＲプライマー中の相同領域を組込むことにより結合できる。または、適当なＤＮＡ制限断片を連結する（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０：６６４０−６６４５）。
他の実施態様において、修飾プロモーターの特定部分はプロモーターカセットから欠失または削除され、修飾前駆体プロモーターを再試験する。発現がこの修飾の後に観測された場合、及び発現が修飾により増加または減少したか測定して、プロモーターの陽性または陰性調節因子を同定することができる。さらに、前駆体プロモーターの特定領域を単離し、単離中試験できる。この方法において、宿主細胞中で遺伝子発現を調節する特定因子が同定できる。
本発明はさらにプロモーターライブラリーを含む。ライブラリーは少なくとも２つのプロモーターカセットを含む。しかしながら、プロモーターライブラリーは１０３以上のメンバーを含み得る。好ましい実施態様において、プロモーターライブラリーは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも８、少なくとも１６、少なくとも６４のメンバーを含む。好ましくは、ライブラリーはプロモーターカセットを含み、ここで修飾前駆体プロモーターは同じ前駆体プロモーターから得られる。１の実施態様において、プロモーターライブラリーは修飾Ｐｔｒｃ及び前駆体Ｐｔｒｃを含むプロモーターカセットを含む。他の実施態様において、プロモーターライブラリーは修飾Ｐｔａｃ及び前駆体Ｐｔａｃを含むプロモーターカセットを含み、他の実施態様において、プロモーターライブラリーは修飾ＰＧＩ及び前駆体ＰＧＩを含むプロモーターカセットを含む。好ましい前駆体プロモーターはプロモーターカセットのための上述のものを含む。他の実施態様において、ライブラリーはプロモーターカセットを含み、ここで修飾前駆体プロモーターは異なる前駆体プロモーターから得る。
本発明に従うプロモーターカセットは個々宿主細胞中導入するために用いることができ、またはプロモーターライブラリー中で用いることができる。図６及び７はプロモーターカセット構築、宿主内へのプロモーターカセットの導入、プロモーターカセットを用いた宿主調節領域の置換及び本発明に従う選択マーカーの削除の略図である。
１の実施態様において、宿主細胞は細菌細胞である。細菌性宿主細胞はグラム陽性細胞であってよい。好ましくは宿主細胞はバチルス種である。バチルス種は、限定されないが、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、及びＢ．チューリンゲンシスを含む。
他の実施態様において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞であり、例えばエシェリキア種またはパントエア種である。大腸菌は最も好ましい宿主細胞である。パントエア属は当業界に公知の全てのメンバーを含み、限定されないが、パントエアｃｉｔｒｅａ、パントエアｔｅｒｒｅａ、パントエア・アグロメランス、パントエアｄｉｓｐｅｒｓａ、パントエアｐｕｎｃｔａｔａ、パントエアａｎａｎａｓ、及びパントエアｓｔｅｗａｒｔｉｉを含む。パントエア属は分類上再編成を受け続けている。従って、当該属は限定されないが、エルウィニアｈｅｒｂｉｃｏｌａなどの微生物の再分類された種を含むものとする。
好ましくはプロモーターカセットは形質転換により宿主細胞中に導入される。形質転換の一般的な方法は公知であり、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．第１版．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）第７章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓを参照されたい。形質転換技術はエレクトロポレーション、塩化カルシウム及び塩化ルビジウムの使用を含む（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第８章．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，上述）及びＰｏｔｔｅｒ，Ｈ（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７４：３６１−３７３）。
宿主細胞の成長及び維持に適した方法も公知であり、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、編集、Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン、ＤＣ（１９９４）及びＴ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ，サンダーランド、ＭＡを参照されたい。通常、細胞は適当な培地中で３５℃で成長する。好ましい成長倍地は市販で調製されており、例えば、ルリア栄養培地（ＬＢ）、サブロー・デキストロース（ＳＤ）またはその他の公知の成長培地がある。前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含む形質転換宿主細胞は選択マーカーに対する表現型反応に基づいて選択し、プロモーターカセットを提供した。本発明のいくつかの実施態様において、選択マーカーを形質転換宿主細胞から切除する。図６Ｂ及びＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．上述を参照されたい。具体的な実施態様において。ｌｏｘＰ部位はプロモーターの上流に残る（例えば、図６ＢにおいてＰｔｒｃ）。ｌｏｘＰ部位が宿主中に残る場合、マーカー切除プロセスが繰り返し可能であれば問題となり得る。２つのｌｏｘＰ部位が宿主染色体中の正しい位置にある場合、それらはループ作成または宿主染色体の大きな領域の反転を促進する（Ｓａｕｅｒ，（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ５：５２１−５２７を参照）。この問題を解決するために、本発明は野生型ｌｏｘＰ部位を効果的に組換えないｌｏｘＰ部位の変異体を含むｌｏｘＰ−ｃａｔ構築体の構築についても開示する。ｌｏｘＰ野生型及びｌｏｘＰ５１１部位がＣｒｅ−依存法においてお互いを組換えないことは公知である（Ｈｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＮＡＲ，１４：２２８７−２２３０）。その他の非競合ｌｏｘＰ部位は公知である。
最適レベルの遺伝子発現を有する形質転換宿主細胞が選択でき、さらに単離できる。宿主細胞中の遺伝子発現の最適化は前駆体プロモーターの約１〜２５０％、約５〜２００％、約１０〜１５０％、及び約１０〜１００％の強度または発現を有する形質転換宿主細胞を選択することにより達成される。これは前駆体プロモーターの約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、８０％、１００％、１５０％、２００％及び２５０％以上の強度である。
プロモーター強度は特定のＤＮＡ断片へのＲＮＡポリメラーゼの結合速度を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて定量でき、転写開始の測定も可能である。Ｈａｗｌｅｙ Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，第３章：Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ編集、Ｐｒａｅｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．ニューヨークを参照されたい。ｉｎ ｖｉｖｏ法もプロモーター強度を定量するために用いることができる。例えば、プロモーターはリポーター遺伝子に融合でき、ＲＮＡ合成の効果が測定される（Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．５：２９８７−２９９４）。異なるリポーター遺伝子を用いる大腸菌プロモーターの強度はＤｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．により測定し、データを前述の表１に示す。さらに、プロモーター強度は多数の方法において定められる。１の一般的な方法は相対的なものであり、ここで時間単位当たりの１の遺伝子により発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質を対照と比較し、同じ遺伝子を異なるプロモーターにより発現する。例えば、天然プロモーター（Ｐｌａｃ）により転写された場合、またはＰｌａｃＵＶ５プロモーターからのｌａｃＺ遺伝子の相対発現レベルである。
本発明の実施態様において、プロモーターカセットは目的染色体遺伝子の天然プロモーターの調節機能を修飾する方法において用いることができ、または１以上のプロモーターカセット（プロモーターライブラリー）を含む形質転換宿主細胞により目的染色体遺伝子の発現を変化させることにより、及びプロモーターカセットと宿主細胞中の目的染色体遺伝子の標的部位の相同フランキング領域間の相同組換えを可能にすることにより用いることができ、プロモーターカセットは目的染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換する。
同じ前駆体プロモーター由来の修飾前駆体プロモーターを含んだ異なるプロモーターカセットは様々な範囲の遺伝子発現レベルを有する形質転換宿主細胞を生成する。プロモーター強度及び／または遺伝子発現は種々の公知の方法により決定できる。プロモーター強度または遺伝子発現は、本質的に同じ条件下で培養された場合、異なる形質転換宿主細胞と前駆体プロモーターを有する母体間で比較できる。所望の発現レベルを有する形質転換宿主はそれから選択及び単離できる。発現レベルは天然または前駆体プロモーターを有する対照母体における同じ遺伝子の発現よりも低いまたは高い。
さらに、選択形質転換宿主細胞はプロモーターライブラリーから選択でき、修飾前駆体プロモーターからの目的遺伝子発現は最初の前駆体プロモーターの強度の約１〜２５０％、約５〜２００％、約１０〜１５０％、及び約１０〜１００％である。
目的遺伝子の種々の発現レベルを有する細菌細胞集団を作成するためにプロモーターライブラリーを使用することは代謝工学経路構成において特に有用である。代謝工学は菌株の代謝経路を最適化するために用い、生体分子を過剰生成する。これらの生体分子は細胞代謝、ポリペプチドＲＮＡ、糖質、脂質などの媒体になることができる。
さらに、ステロイド、抗生物質及びその他の薬剤など複合体分子の合成は複雑かつ複数の触媒経路を必要とする。
単離システムにおいて、特に代謝経路における各工程は設計する必要がある。一方、全細胞システムにおいて利用される微生物はそれぞれ必要な経路を提供する。しかしながら、特定プロモーターの使用は特定プロモーターが強すぎるかもしれないという問題を被る可能性がある。結果として、特定遺伝子の過剰発現が起こり、細胞に有害となる可能性があり、例えば、遺伝子がその他の遺伝子を排除するように発現される。細胞の生存は従って、減少し、生成時間が限定され得る。
ここで提供する方法は細菌性宿主細胞中に導入するプロモーターライブラリーを提供するために利用され、遺伝子発現の範囲を有する形質転換細菌細胞の集団を生じる。発現範囲は最適な発現レベルを有する特定の細菌性クローンの選択を可能にするので有用であるが、依然として細胞生存性を維持する（例えば、所望の生成レベルを維持する宿主細胞の生存性に関する所望の最終生成物の流動生成または所望の生成レベルの維持）。特定の実施態様において、遺伝子の最適発現レベルは高く、他の実施態様において、遺伝子の最適発現レベルは低い。この方法の直接的な利点は細菌クローンが修飾前駆体プロモーターにより得られる発現レベルに基づいて選択でき、それから発酵プロセスに使用できる状態になり、それにより細胞生存が目的遺伝子の発現により悪影響を及ぼされないということである。
以下の実施例は説明のみを目的とするものであり、本発明を限定するものではなく、そのように解釈されるべきではない。当業者は本発明の概念または範囲を逸脱しないで変更及び修正を行うことができることは当然に理解されることである。
実施例
実施例１ Ｔｒｃ−ｌｏｘＰ−Ｃａｔプロモーターカセットの構築
切除可能な選択マーカーを以下の方法によりＴｒｃプロモーターの上流に導入した。市販のプラスミドｐＴｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を供給元の説明書に従い制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏｌを用いて消化した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。消化したＤＮＡを精製し、それからＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．上述に説明されているようにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる（ｆｉｌｌ−ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）。得られた平滑末端直鎖ＤＮＡを標準手順に従い再度円形にし（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上述）、得られた連結混合物を大腸菌ＴＯＰ−１０コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換する。当該細胞を５０マイクログラム／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ−寒天プレート上に置いた。３７℃、１６時間の培養後、多数のコロニーがプレート上に現れた。４つのコロニーをさらに分析するために選んだ。
精製プラスミドＤＮＡをこれらのコロニーから得て、制限酵素分析に供した。４つのコロニーは同じプラスミドを含むことを確認し、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏＩ間のＤＮＡ領域を削除した。このプラスミドをｐＴｒｃ１と名付けた。
プラスミドｐＴｒｃ１は制限酵素ＢｓｐＭ１のための認識部位を１つだけ含み、Ｔｒｃプロモーターの−３５領域上流に約１２０塩基対が位置した。この位置は削除可能な選択マーカーを導入するために選択した。ｐＴｒｃ１は供給元の説明書に従いＢｓｐＭ１酵素を用いて消化した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。直鎖ｐＴｒｃ１をＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲル精製し、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．上述に説明されているようにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させた。得られた平滑末端直鎖ＤＮＡをｌｏｘＰ部位に隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を含むＤＮＡ構築体に連結させた。この構築体はプラスミドｐＬｏｘＣａｔ２（Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ２４７（２０００）２５５−２６４）からＳｓｐ１及びＢａｍ Ｈ１を用いる消化により得た。Ｓｓｐ１−Ｂａｍ Ｈ１ ＤＮＡ断片をゲル精製し、平滑末端にした。直鎖ｐＴＲＣ１及びＳｓｐ１−ＢａｍＨ１断片を連結した。連結混合物を大腸菌ＴＯＰ−１０コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、５０マイクログラム／ｍｌのカルベニシリン及び２０マイクログラム／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ−寒天プレート上に置いた。３７℃、１６時間の培養後、いくつかのコロニーがプレート上に現れた。これらのコロニーのいくつかをカルベニシリンとクロラムフェニコールを含む新しいＬＢ−プレートに移した。プラスミド精製及び制限酵素分析後、両方の方向でｌｏｘＰ−ｃａｔカセットを含む２つのクローンを選択した。これらのプラスミドをｐＴｒＣｍ１及びｐＴｒＣｍ２と名付けた（図２及び３）。
ここに記載したｐＬｏｘＣａｔ１及び２ベクターの重要な検討材料は、それらがＬａｃｌ抑制因子の結合を可能にするｌａｃオペレーターを依然として含み、Ｔｒｃプロモーターをある程度調節するということである（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ、６９：３０１−３１５）。
実施例２ −３５ボックスにおける修飾Ｔｒｃプロモーターの構築
ＤＮＡ突然変異誘発に関して多数の方法が存在し、ここに記載する手順は本方法を例示するために用いるが、それに限定されるものではない。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を明確なＤＮＡ領域に少数の修飾（変異）を導入するために選択した。この方法はテンプレート（通常はプラスミド）に突然変異を起こさせるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用に基づき、当該方法は２つのプライマーが必要である。数回のＰＣＲサイクル後、多くのテンプレートのコピーが生成される。各コピーは変異原性プライマーにより準備される。ＰＣＲ反応はそれから、多くの部位の中で元のテンプレート（非変異）だけを切断する制限酵素Ｄｐｎ１を用いて処理する。ＰＣＲ生成物はＤｐｎ１に対して感度を有さない。Ｄｐｎ１処理後、得られたＤＮＡは大腸菌コンピテントセルを形質転換するために用いる。回収した形質転換体は通常、変異体が高度に濃縮されている。
−３５領域のＴＴＧＡＣＡ配列の第２Ａ（位置−３１）を変化させるために、２つの変異原性プライマーを設計し、市販の供給元により合成した（Ｏｐｅｒｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）。
式２
Figure 2006513692
これらの２つのプライマーを、供給元により推奨される手順に従ってテンプレートとしてｐＴｒＣｍ２プラスミド（図１及び２）及びＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを用いた突然変異誘発のために用いた。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットは、形質転換後、通常は多数の形質転換体を生成する独自の形質転換手順及びコンピテントセル（大腸菌株ＸＬ１ブルー）と一緒に提供される。
形質転換及び選択プレート上にプレートした後、プラスミドＤＮＡをいくつかのクローンから精製し、配列決定した。この方法において、修飾前駆体プロモーターを同定した。すなわち、以下の配列を含む−３５ボックスを含んだプロモーター：
クローン ＮＦ−Ｔ（配列番号２８） ＴＴＧＡＣＴ＝プラスミドｐＴｒｃＣｍ３１Ｔ
クローン ＮＦ−Ｃ（配列番号３０） ＴＴＧＡＣＣ＝プラスミドｐＴｒｃＣｍ３１Ｃ
クローン ＮＦ−Ｇ（配列番号２９） ＴＴＧＡＣＧ＝プラスミドｐＴｒｃＣｍ３１Ｇ
図８を参照されたい。
実施例３ −１０と−３５ボックス間のスペーサー領域における修飾Ｔｒｃプロモーターの構築
少数の修飾で、ある程度のプロモーター強度レベルをリンカー領域中に提供するのに十分であるということを示すために、Ｔｒｃプロモーターの通常間隔をその時点で１ｂｐ増加させた。すなわち、１または２塩基を実施例２に記載のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ手順を用いて、以下のプライマーを用いて加えた：
式３
Figure 2006513692
修飾（変異）プラスミドを以下のように名付けた：
クローンＮＦ−１Ｔ（配列番号３２） ｐＴｒＣｍ１８：スペーサー長さ＝１８
クローンＮＦ−２Ｔ（配列番号３３） ｐＴｒＣｍ１９：スペーサー長さ＝１９
実施例４ 染色体調節領域を置換するためのｐＴｒＣｍ２の使用
ｌａｃＺプロモーターの置換
ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒに開示されている方法（Ｐｒｏｃ，．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０：６６４０−６６４５，（２０００）をｌａｃＺ遺伝子の天然調節領域を置換するためにＰｔｒｃ及び修飾Ｐｔｒｃプロモーターを用いて利用した。この方法はＰＣＲ生成物と大腸菌宿主細胞染色体間の相同組換えを促進するための相同領域として３０−５０ヌクレオチドを利用する。プラスミドＴｒＣｍ２及びその誘導体をＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。
式４
Figure 2006513692
上記のプライマーをｐＴｒｃＣｍ２に相補的な２０のヌクレオチド及びｌａｃＺ遺伝子調節領域に相補的な３９のヌクレオチドを含むように設計した（図７）。これらのプライマーを用いて、１３３３ｂｐ ＤＮＡ断片をＰＣＲにより生じた。
大腸菌株、ＭＧ１６５５をＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（上述）により推奨されるようにプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換した。得られた株ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６をＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（上述）において記載されている方法に従いコンピテントセルを調製するために用いた。コンピテントセル（１００μｌ）を２０〜１００ｎｇの上述の１３３３ｂｐ ＰＣＲ生成物を用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。１．０ｍｌのＳＯＣ培地（殺菌した１０ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２及び殺菌した２０ｍｌの１Ｍグルコースをオートクレーブにかけた２０ｇのトリプトン、５ｇ酵母抽出物、０．５ＮａＣｌ及び２．５ｍｌ １Ｍ ＫＣｌに加える）中で１時間、細胞を回収した後、それらを１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む４ＬＡプレート上に置いた。プレートを３７℃で少なくとも１６時間培養した。ＣｍＲコロニーを１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む新しいＬＡプレートに移した。ＬａｃＺ遺伝子の天然調節領域がＭＧ１６５５から修飾された染色体ＤＮＡであることを証明するために、ＣｍＲ形質転換体のいくつかをＵｌｔｒａＣｌｅａｎ微生物ＤＮＡ単離キット（ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｓ，Ｓｏｌａｎａ Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）を用いて精製した。これらのＤＮＡはプライマーを用いたＰＣＲの基質として用いた。
式５
Figure 2006513692
これら２つのプライマーはｌａｃＺ１及びｌａｃＺ２がハイブリダイズする外側領域をハイブリダイズし、以下のサイズのＰＣＲ生成物を生成する：ＭＧ１６５５−４２５ｂｐ及びＭＧ１６５５：：Ｐｔｒｃ−Ｃｍ−ｌａｃｚ−１５８５ｂｐ（及びｐＴｒＣｍ１８及びｐＴｒＣｍ１９カセットの１５８６ｂｐ及び１５８７ｂｐ）。
ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル中で分離した。ｌａｃＺに適当な修飾を有するゲルコロニーの結果に基づいて調節領域を同定した。
カセットの適当な統合はＰＣＲ生成物を配列決定することによりさらに確認できる。
さらに、実施例２に記載したプラスミドｐＴｒｃＣｍ３１Ｔ、ｐＴｒｃＣｍ３１Ｃ及びｐＴｒｃＣｍ３１Ｇも同じ目的で使用できる。ｐＴｒｃＣｍ１及びｐＴｒｃＣｍ２のカセットはｐＴｒｃＣｍ３１Ｔｍ、ｐＴｒｃＣｍ３１Ｃ、またはｐＴｒｃＣｍ３１Ｇ由来のカセットよりも高い発現レベルを生じると考えられる。ｐＴｒｃＣｍ１８及びｐＴｒｃＣｍ１９プロモーターはｗｔ ｔｒｃプロモーターよりも弱いことも考えられる。
実施例５ ｌａｃＺ遺伝子の発現測定
大腸菌におけるβ−ガラクトシダーゼ酵素のｌａｃＺコード及びこの遺伝子は遺伝子発現を定量するためにリポーターとして広く使用されている。β−ガラクトシダーゼ活性はＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．（Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９２２）に記載された手順に従い合成基質ＯＮＰＧ（オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）を用いて測定する。実施例３に記載の株におけるｌａｃＺ遺伝子の発現レベルを定量するために、当該株をルリア栄養培地（ＬＢ）中で一晩中成長させた。これらを５０ｍｌのＬＢまたはＬＢ＋１００μＭ ＩＰＴＧを含む２５０ｍｌフラスコを培養するために一晩中用いた。基準点として、株ＭＧ１６５５も植菌した。ＭＧ１６５５の場合、ｌａｃＺはその天然プロモーターから発現される。
フラスコをそれらが初期指数関数段階（６００ｎｍで、〜０．８ＯＤ）に達するまで３７℃で振動器中で培養し、１．５サンプルを遠心分離により回収した。当該細胞を１ｍｌの緩衝液Ｚ中で再懸濁し、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ，（Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９２２）により記載されているようにβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。当該分析で用いた体積を補正した後、光学密度（６００ｎｍ）単位当たりのβ−ガラクトシダーゼの相対活性を計算した。これらの測定結果を表２に表す。
Figure 2006513692
実施例６ ＬｏｘＰ変異体を含むＬｏｘＰ−Ｃａｔカセットの構築
野生型及びｌｏｘＰ５１１の配列を下記に示す。２つのｌｏｘＰ部位は１つの塩基対のみ異なる。
式６
Figure 2006513692
ＬｏｘＰ５１１−Ｃａｔカセットを構築するために、変異塩基を含む２つのプライマーをＰＣＲによりｌｏｘＰ−Ｃａｔカセットを増幅するために用いた。この方法（及びその他）は任意のＬｏｘＰ配列の変異体を構築するために使用できる。
ＰＣＲプライマー配列は以下の通り。
式７
Figure 2006513692
ＰＣＲを行い、ベクターキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）付属の説明書に従いＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯにおいてクローンした。大腸菌細胞を形質転換し、多くのコロニーを得た。プラスミド精製及び制限酵素解析後、正しい制限酵素パターンを有する３つのコロニーをＤＮＡシーケンシングのために出し、１のプラスミドが正しいＬｏｘＰ５１１配列を提示した。このプラスミドをｐＬｏｘＣａｔ２７と名付けた。１の実施態様において、このカセットは、修飾前駆体プロモーターまたはプロモーターカセットがすでにＬｏｘＰ部位を有する細菌性宿主株中に導入される場合本発明に従い前駆体プロモーターと使用する。
当業者は通常の実験によりここに記載した本発明の特定の実施態様と同等な多く実施態様を理解し、確認することができる。当該同等な実施態様は請求の範囲に含まれる。
図１ＡはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１BはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１CはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１DはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１EはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１FはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１GはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１HはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１IはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１JはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 図１KはｐＴｒＣｍ２プラスミド（配列番号１）の核酸配列を示す。当該プラスミドはｌｏｘＰの第１のリコンビナーゼ部位及び第２のリコンビナーゼ部位及びｌｏｘＰの各部位の側面に位置したクロラムフェニコール（ｃａｔまたはＣｍ）マーカー遺伝子を含む。さらに、プラスミドは−３５共通ボックス、−１０共通ボックス及びリンカー配列を含むｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域及びアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ酵素のｂｌａコード領域を含む。さらに、当該コード領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 ＴｒＣｍ２プラスミドのマップを表す。 ＴｒＣｍ１プラスミドのマップを表す。 プロモーター領域のヌクレオチド配列、及び１または２塩基対（ｂｐ）変化を有するＰｔａｃプロモーター及びそれらの変異体の関連プロモーター強度を示す（Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：２６４３−２６５３に開示）。Ｐｔａｃ、キメラ細菌性プロモーターは配列番号３で表され；変異体Ｍは配列番号４、変異体Ｍ２は配列番号５、変異体Ｍ３は配列番号６、変異体Ｍ４は配列番号７、変異体Ｍ１２は配列番号８、変異体Ｍ１３は配列番号９、変異体Ｍ１４は配列番号１０、変異体Ｍ２３は配列番号１１、及び変異体Ｍ３４は配列番号１２で表される。 種々の明確に特性付けられたプロモーターの配列を示し、転写開始部位（＋１）の約４５塩基対（ｂｐ）上流を含み、−３５共通ボックス、リンカー配列及び−１０共通ボックスを含む。プロモーターは−３５共通領域の最初のＴ及び−１０共通領域の最後のＴに関して配列される。保存領域は当該ボックスにより示される。ＰＤ／Ｅ２０は配列番号１３により表され、ＰＨ２０７は配列番号１４、ＰＮ２４は配列番号１５、ＰＧ２５は配列番号１６、ＰＪ５は配列番号１７、ＰＡ１は配列番号１８、ＰＡ２は配列番号１９、ＰＡ３は配列番号２０、ＰＬは配列番号２１、Ｐｌａｃは配列番号２２、ＰｌａｃＵＶ５は配列番号２３、Ｐｔａｃｌは配列番号２４、Ｐｃｏｎは配列番号２５、Ｐｂｌａは配列番号２６及びＰＧＩは配列番号３４により表される。 目的の染色体遺伝子の調節領域を置換するために用いる方法の本発明に従った略図である。プロモーターカセットはｌｏｘＰリコンビナーゼ部位を含み、ＡｂＲ抗生物質マーカー、第２のｌｏｘＰリコンビナーゼ部位及びＰｔｒｃプロモーター（断片Ａ、Ｂ及びＣが同じ遺伝子由来である修飾Ｐｔｒｃであってもよい。しかしながら、Ａ断片は異なる遺伝子由来または調節断片Ｃに無関係の領域由来であってもよい。）を含むように構築される。 目的の染色体遺伝子の調節領域を置換するために用いる方法の本発明に従った略図である。目的染色体遺伝子に相同な上流フランキング領域（ＸＡ）及び目的染色体遺伝子に相同な下流フランキング領域（ＸＣ）は当該カセットに組込まれる。相同なフランキング領域はダブル・クロスオーバー・イベントによる組換えのために用いる。 プロモーターカセットは目的染色体遺伝子の天然調節領域を置換する（Ｘｃ）。選択マーカーは染色体から切除され、最終的な染色体構造は前駆体または修飾前駆体プロモーターを含む。 野生型前駆体ｌａｃＺプロモーターをｌａｃＺの５’末端に相同な上流核酸断片、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位、クロラムフェニコール耐性遺伝子、第２のｌｏｘＰ部位、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃＺ遺伝子の下流領域に相同な核酸断片を含むプロモーターカセットで置換することを示す略図である。核酸配列はＰＣＲプライマー；ｌａｃＺ１（配列番号４１）及びｌａｃＺ２（配列番号４２）の設計に関する２本鎖ＤＮＡ領域を表す（実施例４を参照）。 前駆体プロモーターＰｔｒｃ（配列番号２７）及び７つの修飾前駆体プロモーターのヌクレオチド配列を示し、当該前駆体プロモーターはＰｔｒｃである。Ｐｔｒｃの３５ボックスはＴＴＧＡＣＡにより表され、−１０はＴＡＴＡＡＴにより表される。修飾前駆体プロモーターＮＦ−Ｔ（配列番号２８）、ＮＦ−Ｇ（配列番号２９）、及びＮＦ−Ｃ（配列番号３０）は−３５ボックスのヌクレオチド基変化を含む。ＮＦ−Ｔの−３５ボックスはＴＴＧＡＣＴであり、ＮＦ−Ｇの−３５ボックスはＴＴＧＡＣＧ、及びＮＦ−Ｃの−３５ボックスはＴＴＧＡＣＣである。修飾前駆体プロモーターＮＦ−１Ｔ（配列番号３２）及びＮＦ−２Ｔ（配列番号３３）はＰｔｒｃの１７ｂｐ配列のＡＴＴＡＡＴとＣＡＴＣＣＧＧＣＴ間でそれぞれ“Ｔ”及び“ＴＴ”のヌクレオチド基付加を含む。プロモーター強度は、標準β−ガラクトシダーゼ分析を用いて対照、染色体プロモーターＰｌａｃのプロモーター強度に関して測定して誘導因子イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在または不存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性により決定する（Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ（分子遺伝学の実験）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ３５２−３５５頁）。

Claims (34)

  1. 目的染色体遺伝子の発現レベル範囲を有する細菌細胞のライブラリーを作成する方法であって、以下を含む：
    ａ）少なくとも２のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーを得る工程であって、ここでプロモーターカセットは配列順に標的部位の上流フランキング領域に相同な５’配列；第１のリコンビナーゼ認識部位；選択マーカー；第２のリコンビナーゼ認識部位；−３５共通領域、リンカー配列及び−１０共通領域を含む前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含み、ここで修飾前駆体プロモーターは前駆体プロモーターから修飾された少なくとも１のヌクレオチド位置を含み；及び標的部位の下流フランキング領域に相同な３’配列を含む
    ｂ）プロモーターライブラリーを用いて細菌性宿主細胞を形質転換する工程であって、ここでプロモーターカセットは相同組換えにより細菌性宿主細胞に統合されて形質転換宿主細胞を生成する；
    ｃ）適当な成長条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程；
    ｄ）形質転換細菌細胞のライブラリー得る工程であって、ここで形質転換細菌細胞は目的の染色体遺伝子発現レベル範囲を示す。
  2. さらにライブラリーから形質転換細菌細胞を選択する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 宿主細胞が大腸菌、バチルス種、及びパントエア種からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 選択細菌細胞が前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも高いレベルの目的遺伝子発現を有する、請求項２に記載の方法。
  5. 選択細菌細胞が前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも低いレベルの目的遺伝子発現を有する、請求項２に記載の方法。
  6. 請求項２の方法に従って選択される形質転換細菌細胞。
  7. プロモーターライブラリーがＰｔｒｃ前駆体プロモーター及び修飾Ｐｔｒｃ前駆体プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
  8. プロモーターライブラリーがＰｔａｃ前駆体プロモーター及び修飾Ｐｔｒｃ前駆体プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
  9. プロモーターライブラリーがＰＧＩ前駆体プロモーター及び修飾ＰＧＩ前駆体プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
  10. プロモーターライブラリーが配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０を有する修飾プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 配列順に以下を含むプロモーターカセット：
    ａ）標的部位の上流フランキング領域に相同な５’配列
    ｂ）第１のリコンビナーゼ認識部位
    ｃ）選択マーカー
    ｄ）第２のリコンビナーゼ認識部位
    ｅ）前駆体プロモーターの−３５共通領域、リンカー配列及び−１０共通領域に対応する位置において少なくとも１の修飾ヌクレオチドを含む修飾前駆体プロモーター；及び
    ｆ）標的部位の下流フランキング領域に相同な３’配列。
  12. 前駆体プロモーターがＰｔｒｃ、Ｐｔａｃｌ、ＰＤ／Ｅ２０、ＰＨ２０７、ＰＮ２５、ＰＧ２５、ＰＪ５、ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＬ、Ｐｌａｃ、ＰｌａｃＵＶ５、Ｐｃｏｎ及びＰｂｌａからなる群より選択される、請求項１１に記載のプロモーターカセット。
  13. 前駆体プロモーターの−３５領域がＴＴＧＡＣＡ、ＴＴＧＣＴＡ、ＴＴＧＣＴＴ、ＴＴＧＡＴＡ、ＴＴＧＡＣＴ、ＴＴＴＡＣＡ、及びＴＴＣＡＡＡからなる群より選択される、請求項１１に記載のプロモーターカセット。
  14. 前駆体プロモーターの−１０領域が、ＴＡＡＧＡＴ、ＴＡＴＡＡＴ、ＡＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＣＴ、ＧＡＴＡＣＴ、ＴＡＣＧＡＴ、ＴＡＴＧＴＴ、及びＧＡＣＡＡＴからなる群より選択される、請求項１１に記載のプロモーターカセット。
  15. 前駆体プロモーターの−３５領域がＴＴＧＡＣＡであり、前駆体プロモーターの−１０領域がＴＡＴＡＡＴである、請求項１１に記載のプロモーターカセット。
  16. 前駆体プロモーターの−３５領域がＴＴＧＡＣＡであり、前駆体プロモーターの−１０領域がＡＡＴＡＡＴである、請求項１１に記載のプロモーターカセット。
  17. 前駆体プロモーターのリンカー配列が修飾される、請求項１１に記載のプロモーターカセット。
  18. 前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位が異なるリコンビナーゼ部位であり、ｌｏｘ及び変異ｌｏｘ部位から選択される、請求項１１に記載のプロモーターカセット。
  19. 修飾前駆体プロモーターが配列番号２８（ＮＦ−Ｔ）、配列番号２９（ＮＦ−Ｇ）、配列番号３０（ＮＦ−Ｃ）、配列番号３２（ＮＦ−１Ｔ）及び配列番号３３（ＮＦ−２Ｔ）からなる群より選択される、請求項１１に記載のプロモーターカセット。
  20. 少なくとも２つの請求項１１のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリー。
  21. 少なくとも２つの請求項１３のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリー。
  22. 請求項１１のプロモーターカセットを含むベクター。
  23. 請求項１１のプロモーターカセットを用いて形質転換した宿主細胞。
  24. 宿主細胞が大腸菌、バチルス種及びパントエア種からなる群より選択される、請求項２３の宿主細胞。
  25. 目的染色体遺伝子の天然プロモーターの調節機能を修飾する方法であって、以下を含む：
    ａ）請求項１１に従うプロモーターカセットを得る工程；
    ｂ）プロモーターカセットを用いて宿主細胞を形質転換し、プロモーターカセットと標的部位の相同フランキング領域間で相同組換えさせる工程であって、ここでプロモーターカセットは目的の染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換する；及び
    ｃ）適当な成長条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程。
  26. 形質転換宿主細胞から選択マーカーを切除する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 形質転換宿主細胞を単離する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 目的染色体遺伝子の発現を変化させる方法であって、以下を含む：
    ａ）請求項１１に従うプロモーターカセットを得る工程；
    ｂ）プロモーターカセットを用いて宿主細胞を形質転換する工程；及び
    ｃ）プロモーターカセットと標的部位の相同フランキング領域間で相同組換えさせる工程であって、ここでプロモーターカセットが目的の染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換し、及び目的染色体遺伝子の発現が対応する母体宿主細胞における目的染色体遺伝子の発現と比較して変化する工程。
  29. 配列番号２８に示す配列を含む単離プロモーター。
  30. 配列番号２９に示す配列を含む単離プロモーター。
  31. 配列番号３０に示す配列を含む単離プロモーター。
  32. 配列番号３２に示す配列を含む単離プロモーター。
  33. 配列番号３３に示す配列を含む単離プロモーター。
  34. 配列番号３１に示す配列を含む単離プロモーター。



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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020246845A1 (ko) * 2019-06-05 2020-12-10 서울시립대학교 산학협력단 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 유전체 개량 방법
JP2021530555A (ja) * 2018-07-25 2021-11-11 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド 農業のための組成物及び関連する方法
WO2023233996A1 (ja) * 2022-05-31 2023-12-07 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 改変プロモーター、発現ベクター、微生物、物質の生産方法、改変シアノバクテリア及び改変プロモーターの作製方法

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1546304B1 (en) 2002-10-04 2013-05-08 Danisco US Inc. Improved production of bacterial strains
US20050079617A1 (en) 2003-10-03 2005-04-14 Cervin Marguerite A. Glucose transport mutants for production of biomaterial
KR101130587B1 (ko) * 2002-10-04 2012-03-30 다니스코 유에스 인크. 생물질 제조용 글루코오스 수송 돌연변이
US20120315670A1 (en) * 2009-11-02 2012-12-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for the Regulation of Multiple Genes of Interest in a Cell
US20140273152A1 (en) * 2013-03-13 2014-09-18 Oregon Health & Science University Recombinant manganese oxidase
KR102375732B1 (ko) 2017-02-24 2022-03-16 다니스코 유에스 인크. 바실러스 리체니포르미스에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 조성물 및 방법
EP3607097B1 (en) 2017-04-07 2023-06-21 DuPont Nutrition Biosciences ApS Bacillus host cells producing beta-galactosidases and lactases in the absence of p-nitrobenzylesterase side activity
EP3655537A1 (en) 2017-08-23 2020-05-27 Danisco US Inc. Methods and compositions for efficient genetic modifications of bacillus licheniformis strains
EP3682010A1 (en) 2017-09-13 2020-07-22 Danisco US Inc. Modified 5'-untranslated region (utr) sequences for increased protein production in bacillus
CN111670244B (zh) 2018-01-03 2023-08-01 丹尼斯科美国公司 突变的和遗传修饰的芽孢杆菌属细胞及其用于增加蛋白质产生的方法
EP3887526A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Danisco US Inc. Novel promoter sequences and methods thereof for enhanced protein production in bacillus cells
CN110144626A (zh) * 2019-03-29 2019-08-20 浙江工业大学 一种启动子文库的构建方法
US20220177923A1 (en) 2019-04-05 2022-06-09 Danisco Us Inc Methods for integrating a donor DNA sequence into the genome of bacillus using linear recombinant DNA constructs and compositions thereof
CA3136113A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Danisco Us Inc. Methods for polynucleotide integration into the genome of bacillus using dual circular recombinant dna constructs and compositions thereof
WO2021030267A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Danisco Us Inc Compositions and methods for increased protein production in bacillus licheniformis
EP4051793A1 (en) 2019-10-28 2022-09-07 Danisco US Inc Microbial host cells for the production of heterologous cyanuric acid hydrolases and biuret hydrolases
JP2023500362A (ja) 2019-11-11 2023-01-05 ダニスコ・ユーエス・インク バチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における強化されたタンパク質産生のための組成物及び方法
KR20220098245A (ko) 2019-11-19 2022-07-11 다니스코 유에스 인크. 바실러스 게놈 및 이의 조성물을 변형시키기 위한 선택 마커-부재 방법
JP2023524334A (ja) 2020-01-15 2023-06-12 ダニスコ・ユーエス・インク バチルス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における強化したタンパク質産生のための組成物及び方法
EP4294823A1 (en) 2021-02-22 2023-12-27 Danisco US Inc. Methods and compositions for producing proteins of interest in pigment deficient bacillus cells
EP4347812A1 (en) 2021-05-24 2024-04-10 Danisco US Inc. Compositions and methods for enhanced protein production in bacillus cells
WO2023091878A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Danisco Us Inc. Compositions and methods for enhanced protein production in bacillus cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5532142A (en) * 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
WO1994025609A1 (en) * 1993-04-28 1994-11-10 Hybritech Incorporated Method for creating optimized regulatory regions affecting protein expression and protein trafficking
US6140087A (en) * 1993-06-24 2000-10-31 Advec, Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
US5888732A (en) * 1995-06-07 1999-03-30 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using engineered recombination sites
AU3938397A (en) * 1996-08-23 1998-03-06 Peter Ruhdal Jensen Artificial promoter libraries for selected organisms and promoters derived from such libraries
US5851808A (en) * 1997-02-28 1998-12-22 Baylor College Of Medicine Rapid subcloning using site-specific recombination
US6294358B1 (en) * 1999-09-07 2001-09-25 Thermogen, Inc. Thermus promoters for gene expression

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021530555A (ja) * 2018-07-25 2021-11-11 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド 農業のための組成物及び関連する方法
WO2020246845A1 (ko) * 2019-06-05 2020-12-10 서울시립대학교 산학협력단 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 유전체 개량 방법
KR20200140442A (ko) * 2019-06-05 2020-12-16 서울시립대학교 산학협력단 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 유전체 개량 방법
KR102194368B1 (ko) * 2019-06-05 2020-12-24 서울시립대학교 산학협력단 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 유전체 개량 방법
WO2023233996A1 (ja) * 2022-05-31 2023-12-07 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 改変プロモーター、発現ベクター、微生物、物質の生産方法、改変シアノバクテリア及び改変プロモーターの作製方法

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