JP2006513692A - 様々なレベルの遺伝子発現を生じる修飾プロモーターを作成する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は修飾前駆体プロモーターを含むプロモーターカセットを作成する方法、及び目的遺伝子の発現レベル範囲を有する細菌クローンを生じるプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーを用いて細菌宿主細胞の集団を形質転換する方法に関する。本発明はさらに最適遺伝子発現レベルを有する形質転換細菌宿主細胞の選択に関する。
Description
本発明は細菌細胞の遺伝子組換えに関する。特に、本発明は前駆体及び修飾前駆体プロモーターを含むプロモーターのライブラリーを構築する方法、及び細菌性宿主細胞中の目的染色体遺伝子のプロモーターを置換して、目的染色体遺伝子の発現レベル範囲を有する細菌性宿主細胞の集団を生じるためのプロモーターライブラリーの使用に関する。
何年もの間、微生物は工業的酵素、ホルモン及び抗体などの有用な市販製品の製造のために工業的用途において利用されてきた。組換えDNA技術がこれらの微生物の生産性を高める試みにおいて用いられてきたという事実にも関わらず、株特性を改善するための代謝遺伝子工学の使用は、特に工業的発酵において期待通りにはいっていない。
株特性を増加するために用いる一般的な方法は遺伝子発現を変化させることであり、多数の手段がこの目標を達成するために用いられてきた。1の手段として、選択宿主株においてマルチコピープラスミド中の異種または相同性遺伝子をクローニングすることを含む。別の手段は染色体遺伝子発現を変化させることに関する。これは種々の方法により達成され、以下のいくつかを含む:1)染色体の所定領域での部位特異変異、欠失または挿入;2)DNAを染色体にランダムに挿入するためのトランスポゾンへの依存;及び3)遺伝子の天然調節領域をその染色体位置で改変させる。調節領域の改変は例えば、プロモーター強度を変化させることにより、または誘導因子濃度により影響される調節プロモーターを用いることにより達成できる。Jensen and Hammer、(1988)Biotechnology and Bioengineerinng 58:193−195;Jensen and Hammer、(1988)Appl.Environ.Microbiol.64:82−87;及びKhlebnikov et al.(2001)Microbiol.147:3241を参照されたい。染色体遺伝子の調節領域を置換するために用いるその他の技術はAbdel−Hamid et al.(2001)Microbiol.147:1483−1498及びRepoila and Gottesman(2001)J.Bacteriol.183:4012−4023 に開示されている。
選択宿主を処理する代謝経路の最適化に関して、上述の手段は限界があり、各手段は短所を有する。プラスミドにより遺伝子操作された遺伝子の発現レベルが染色体中に位置した同じ修飾遺伝子の発現レベルと必ずしも相関しないということが研究により示されている(Khlebnikov et al.(2001),Microbiol.147:3241及びMcCraken and Timms(1999)J.Bacteriol.181:6569を参照)。
さらに、代謝経路中の発現増加効果は代謝経路を通した流れにおける限界効果しか有さない。このことは、代謝経路の制御は多数の酵素に割り当てられているので、たとえ操作された遺伝子が律速工程において酵素をコードする場合であっても当てはまるであろう。従って、遺伝子が高発現レベル、例えば発現の増加が10〜100倍、を達成するように設計されても、生物反応器の組換え微生物の全体的な性能は減少し得る。当該減少は代謝経路に関するその他の因子のバランスまたは最適な細胞成長に必要なその他の物質が欠失したことによるものである。
上述の問題はJensenとHammer(WO98/07846)により一部扱われている。WO98/07846の開示は異なるレベルの遺伝子発現を与える1組の構成プロモーターの構築について説明している。具体的には、人口プロモーターライブラリーは−35の共通ボックス、−10の共通ボックス及びこれらの2つの共通ボックス間にあるスペーサー(リンカー)を含む調節領域の変異体を含むように構築される。しかしながら、WO98/07846に記載される方法の不利な点の1つは広範囲のスクリーニングであり、プロモーターライブラリーが必要であるという点である。共通配列のいくつかの塩基対変化による、またはリンカー配列の長さ変化によるプロモーター強度の調整はプロモーター強度に大きな影響を与え、従って、プロモーター強度調整の小工程を達成するためにふさわしいものではないということも当該文献に記載されている。
従って、代謝経路操作の分野において、代謝経路の遺伝子の最適発現レベルを決定する速くて効率的な、言い換えると、所望の生成物の株性能を最適化するための方法を開発する必要性が依然として存在する。本発明は、修飾前駆体プロモーターのプロモーター強度を少し変化させることを特徴とする方法を提供し、ゆえに遺伝子の最適発現レベルを提供する細胞選択を可能とすることにより当該要望を満たすものである。
発明の概要
1の側面において、本発明は目的の染色体遺伝子発現レベル範囲を有する細菌細胞のライブラリーを作成する方法に関し、以下の工程を含む:少なくとも2のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーを得る工程、ここでプロモーターカセットは配列順に標的部位の上流フランキング領域に相同な5’配列;第1のリコンビナーゼ認識部位;選択マーカー;第2のリコンビナーゼ認識部位;−35共通領域、リンカー配列及び−10共通領域を含む前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含み、ここで修飾プロモーターは前駆体プロモーターから修飾された少なくとも1のヌクレオチド位置を含み、及び標的部位の下流フランキング領域に相同な3’配列を含む;プロモーターライブラリーを用いて細菌性宿主細胞を形質転換する工程、ここでプロモーターカセットは相同組換えにより細菌性宿主細胞に統合されて形質転換宿主細胞を生成する;適当な条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程;及び形質転換細菌細胞のライブラリー得る工程であって、ここで形質転換細菌細胞は目的の染色体遺伝子発現レベル範囲を示す。1の実施態様において、本方法はさらにライブラリーから形質転換細菌細胞を選択する工程を含む。さらなる実施態様において、選択形質転換宿主細胞は前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも高いレベルの目的遺伝子発現を有する。第2の実施態様において、選択細菌細胞は前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも低いレベルの目的遺伝子発現を有する。第3の実施態様において、本発明は上述の方法に従って選択された形質転換細菌細胞に関する。さらなる実施態様において、プロモーターライブラリーはPtrc前駆体プロモーター及び修飾Ptrc前駆体プロモーター;Ptac前駆体プロモーター及び修飾Ptrc前駆体プロモーター;及びPGI前駆体プロモーター及び修飾PGI前駆体プロモーターを含む。
1の側面において、本発明は目的の染色体遺伝子発現レベル範囲を有する細菌細胞のライブラリーを作成する方法に関し、以下の工程を含む:少なくとも2のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーを得る工程、ここでプロモーターカセットは配列順に標的部位の上流フランキング領域に相同な5’配列;第1のリコンビナーゼ認識部位;選択マーカー;第2のリコンビナーゼ認識部位;−35共通領域、リンカー配列及び−10共通領域を含む前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含み、ここで修飾プロモーターは前駆体プロモーターから修飾された少なくとも1のヌクレオチド位置を含み、及び標的部位の下流フランキング領域に相同な3’配列を含む;プロモーターライブラリーを用いて細菌性宿主細胞を形質転換する工程、ここでプロモーターカセットは相同組換えにより細菌性宿主細胞に統合されて形質転換宿主細胞を生成する;適当な条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程;及び形質転換細菌細胞のライブラリー得る工程であって、ここで形質転換細菌細胞は目的の染色体遺伝子発現レベル範囲を示す。1の実施態様において、本方法はさらにライブラリーから形質転換細菌細胞を選択する工程を含む。さらなる実施態様において、選択形質転換宿主細胞は前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも高いレベルの目的遺伝子発現を有する。第2の実施態様において、選択細菌細胞は前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも低いレベルの目的遺伝子発現を有する。第3の実施態様において、本発明は上述の方法に従って選択された形質転換細菌細胞に関する。さらなる実施態様において、プロモーターライブラリーはPtrc前駆体プロモーター及び修飾Ptrc前駆体プロモーター;Ptac前駆体プロモーター及び修飾Ptrc前駆体プロモーター;及びPGI前駆体プロモーター及び修飾PGI前駆体プロモーターを含む。
第2の側面において、本発明は配列順に標的部位の上流フランキング領域に相同な5’配列;第1のリコンビナーゼ認識部位;選択マーカー;第2のリコンビナーゼ認識部位;−35共通領域、リンカー配列及び−10共通領域を含む修飾前駆体プロモーターであって、ここで修飾プロモーターが少なくとも1のヌクレオチドを前駆体プロモーターの−35共通領域、リンカー配列及び−10共通領域に対応する位置で含み;及び標的部位の下流フランキング領域に相同な3’配列を含む。好ましい実施態様において、前駆体プロモーターは、Ptrc、Ptacl、PD/E20、PH207、PN25、PG25、PJ5、PA1、PA2、PA3、PL、Plac、PlacUV5、Pcon、PGI及びPblaからなる群における塩基対−35〜+1を含む配列から選択される。第2の実施態様において、−35領域の前駆体プロモーターはTTGACA、TTGCTA、TTGCTT、TTGATA、TTGACT、TTTACA、及びTTCAAAからなる群より選択され、−10領域の前駆体プロモーターは、TAAGAT、TATAAT、TATACT、GATACT、AATAAT、TACGAT、TATGTT、及びGACAATからなる群より選択される。さらなる実施態様において、好ましい前駆体プロモーターはPtrcであり、少なくとも1のヌクレオチドは−35ボックス、−10ボックスまたはリンカー領域のいずれかで修飾される。さらなる実施態様において、前駆体プロモーターはPGIであり、少なくとも1のヌクレオチドは−35ボックス、−10ボックスまたはリンカー領域のいずれかで修飾される。
さらなる側面において、本発明は上述の少なくとも2のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーに関する。1の実施態様において、本発明はプロモーターカセットまたはプロモーターライブラリーを用いて形質転換された宿主細胞に関し、宿主細胞は大腸菌、バチルス種及びパントエア種からなる群より選択される。
さらに別の側面において、本発明は目的染色体遺伝子の天然プロモーターの調節機能を修飾する方法に関し、以下を含む:本発明に従いプロモーターカセットを得る工程;プロモーターカセットを用いて宿主細胞を形質転換し、プロモーターカセットと標的部位の相同フランキング領域間で相同組換えさせる工程であって、プロモーターカセットは目的の染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換する;及び適当な成長条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程。この側面の1の実施態様において、選択マーカーは形質転換宿主細胞から切除し、及び他の実施態様において、形質転換宿主細胞をさらに単離する。
さらに他の側面において、本発明は目的染色体遺伝子の発現を変化させる方法に関し、以下を含む:本発明に従いプロモーターカセットを得る工程;プロモーターカセットを用いて宿主細胞を形質転換する工程;及びプロモーターカセットと標的部位の相同フランキング領域間で相同組換えさせる工程であって、プロモーターカセットが目的の染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換し、及び目的染色体遺伝子の発現を対応する母体宿主細胞における目的染色体遺伝子の発現と比較して変化させる工程。
発明の詳細な説明
本発明の1の側面は、−35共通ボックス、−10共通ボックスまたはリンカー領域におけるヌクレオチドに対応する前駆体プロモーターの1または2のヌクレオチドを修飾することにより、染色体遺伝子発現に関するプロモーター強度を遺伝子発現範囲を素早く同定できるレベルに変化させることができるという発見に関するものである。さらに、適当なプロモーターカセットを構築することにより、本発明者は効率的に染色体レベルでプロモーターを試験することができた。
本発明の1の側面は、−35共通ボックス、−10共通ボックスまたはリンカー領域におけるヌクレオチドに対応する前駆体プロモーターの1または2のヌクレオチドを修飾することにより、染色体遺伝子発現に関するプロモーター強度を遺伝子発現範囲を素早く同定できるレベルに変化させることができるという発見に関するものである。さらに、適当なプロモーターカセットを構築することにより、本発明者は効率的に染色体レベルでプロモーターを試験することができた。
A.定義
この出願において、別に示さない限り、使用する技術の説明はいくつかの公知の参考文献で見ることができ、例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning(分子クローニング):A Laboratory Manual(研究所マニュアル),Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Goeddel,D.,編集、Gene Expression Technology,Methods in Enzymology(遺伝子発現技術、酵素学の方法),185,Academic Press,サンディエゴ,Calif.(1991);Deutscher,M.P.,編集、Guide to Protein Purification,Methods in Enzymology(タンパク質精製のガイド、酵素学の方法)、Academic Press,サンディエゴ、Calif.(1989);及びInnis,et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(方法及び応用ガイド),Academic Press,サンディエゴ、Calif.(1990)などがある。
この出願において、別に示さない限り、使用する技術の説明はいくつかの公知の参考文献で見ることができ、例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning(分子クローニング):A Laboratory Manual(研究所マニュアル),Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Goeddel,D.,編集、Gene Expression Technology,Methods in Enzymology(遺伝子発現技術、酵素学の方法),185,Academic Press,サンディエゴ,Calif.(1991);Deutscher,M.P.,編集、Guide to Protein Purification,Methods in Enzymology(タンパク質精製のガイド、酵素学の方法)、Academic Press,サンディエゴ、Calif.(1989);及びInnis,et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(方法及び応用ガイド),Academic Press,サンディエゴ、Calif.(1990)などがある。
別に定めない限り、ここで用いる全ての技術及び科学的用語は本発明が属する技術の当業者により一般的に理解される意味と同じである。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物学及び分子生物学の辞典),第2版、John Wiley and Sons,New York(1994)及びHale and Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial New York(1991)の両方は本発明で使用する多くの用語の当業者の一般的な辞書となる。また、Sambrook et al.,Molecular Cloning(分子クローニング):A Laboratory Manual(研究所マニュアル),Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)も当業界の定義及び用語に関する。
本発明の目的に関して、以下の用語が本発明を説明するために用いられる。
“プロモーター”または“プロモーター領域”はここで、転写開始時にDNA依存RNAポリメラーゼにより認識及び結合されるヌクレオチド配列として定義される。本発明との関連で、プロモーターは2つの共通領域、通常はヘキサマーを含む。第1の共通領域は転写開始部位から約10塩基対(bp)上流に集中し、−10配列、−10ボックスまたはプリブノー(Pribnow)ボックスと呼ばれる。第2の共通領域は開始部位の約35bp上流に集中し、−35配列または−35ボックスと呼ばれる。大腸菌RNAポリメラーゼが認識し、機能的に最も堅く結合すると考えられるのがこれらの2つの相同領域である。
リンカー配列は各共通配列間に伸び、約14〜20塩基対からなる。ヌクレオチド−15、−16、−17及び−18を除いて、通常、リンカー領域は1のプロモーターからもう一方のプロモーターの2つのbpよりも大きな相同性の著しい領域を持たないようである。
プロモーターは、IPTGにより誘発されるtrcプロモーターなどの調節プロモーターまたは構造プロモーターであってもよい。遺伝子の調節領域の一部と考えられるその他の配列はリボソーム結合部位及び転写開始部位などがある。転写開始部位とは最初のヌクレオチドが転写され、+1で指定されることを意味する。開始部位のヌクレオチド下流は+2、+3、+4等で番号付けされ、反対向き(上流)のヌクレオチドは−1、−2、−3等と番号付けられる。“リボソーム結合部位(RBS)”は通常、約4〜16塩基対を含む短いヌクレオチド配列であり、エンコードされたタンパク質の翻訳のためのリボソームとmRNAの相互作用に関する。
ここで用いる“前駆体プロモーター”は野生型プロモーター及び公知の変異体プロテアーゼを含む。“野生型”プロモーターは、プラスミドまたは宿主生物の染色体における天然プロモーター(非変異プロモーター)であり、当該用語はここで“天然”プロモーターと交換可能に用いられる。変異体プロモーターは公知の変異体または修飾野生型プロモーターであり、公知のハイブリッドプロモーターを含む。ここで用いる前駆体プロモーターは野生型プロモーターまたは変異体プロテアーゼである。
“修飾前駆体プロモーター”とは、−35ボックス、−10ボックスまたはリンカー領域に対応する少なくとも1の位置でヌクレオチドを変化させることにより修飾された前駆体プロモーターである。ここで用いる“プロモーターカセット”または“プロモーター構築体”は前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含む。“プロモーターライブラリー”の語はプロモーターカセットの集合体をいい、当該集合体は少なくとも2つのメンバーを含む。IAプロモーターライブラリーは使用でき、例えば、形質転換宿主細胞のライブラリーを生成するために使用でき、ここでライブラリーのメンバー(細菌性クローン)は前駆体プロモーターのプロモーター活性と比較して様々なレベルのプロモーター活性を有する。様々なレベルのプロモーター強度は目的遺伝子の同じコード領域に関して異なる発現レベルを有するクローンライブラリーを生じる。形質転換宿主細胞または細菌性クローンはそれから最適な発現に関して選択できる。
修飾または改変は、核酸断片、特に前駆体プロモーター配列の少なくとも1のヌクレオチド塩基において付加(挿入)、欠失または交換(置換)を含むことができる。“欠失”はヌクレオチドが欠けた1以上のヌクレオチド変化として定義される。“挿入”は前駆体プロモーターと比較して1以上のヌクレオチドが付加されている。“置換”は異なるヌクレオチドを含む1以上のヌクレオチドの置換えから生じる。
本発明の目的のために、“tacプロモーター(Ptac)”は文献においてtaclとも呼ばれ、配列番号3及び配列番号24に示す核酸配列を含む前駆体プロモーターであり、−35ボックスはTTGACA、リンカーは16塩基対により表され、−10ボックスはTATAATである(Brosius et al.,J.Biol.Chem.260:3539(1985)及びDeuschle et al.,EMBO J 5:2987−2994(1986))。
ここで用いる“trcプロモーター(Ptrc)”とは配列番号27に示す核酸配列を含む前駆体プロモーターである。−10ボックス及び−35ボックスのヌクレオチド配列はPtrcと同じであるが、リンカー部分は17bpを含む。PtrcはPtacのヌクレオチド−18と−19間にCヌクレオチドが付加されていることによりPtacと異なる。Ptrc及びPtrcは本質的に強度は同じである(Russel and Bennett,Gene 20:231(1982);Amann et al.,(1983)Gene 25:167−178)及びMulligan et al.,J.Biol Chem.260:3529(1985))。
“遺伝子”はここで機能的ポリペプチドまたはRNA分子(調節RNA’s、tRNA’s、rRNA’s)をコードするヌクレオチド配列として定義される。遺伝子はコード領域(エクソン)、非コード領域(イントロン)及びプロモーター及びエンハンサーなどの調節領域の両方を含む。
“核酸”の語はRNA、DNA及びcDNA分子を含む。当該用語はポリヌクレオチドと交換可能に用いられる。オリゴヌクレオチドは短鎖核酸分子である。プライマーはオリゴヌクレオチドであり、制限消化精製により天然または合成的に生成されたかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下(すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼなどの誘導因子の存在下、及び適当な温度、pH)に置いた場合、合成開始点として作用することができる。プライマーは好ましくは増幅において最大効率の一本鎖である。プライマーは誘導因子の存在下で伸長生成物の合成にとりかかるように十分に長くなければならない。本発明の1の実施態様において、プライマーは1のヌクレオチド塩基が前駆体プロモーターの配列と比較して修飾されている変質プライマーである。
ここで用いる“ポリペプチド”の語はペプチド結合により結合したアミノ酸残基からなる化合物をいう。“タンパク質”及び“ポリペプチド”の語はここで交換可能に用いられる。遺伝子コードの縮退の結果として、所定のタンパク質をエンコードする多数のヌクレオチドが生成され得ることは当業者にとって明らかである。
“DNA構築体”とは宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するために用いられる配列をいう。DNA構築体の定義は例えば、前駆体プロモーター及び/または修飾前駆体プロモーターなどを含むプロモーターカセットを包含する。1の実施態様において、DNA構築体は相同組換えにより染色体標的部位中にポリヌクレオチドを統合するために用いられる。DNA構築体は宿主細胞遺伝子と相同または異種配列を含むことができる。1の実施態様において、DNA構築体はベクター内に挿入できる。
“標的部位”はDNA構築体の統合が起こるための細菌性染色体内の所定のゲノム位置を意味するものである。
細胞内に核酸を導入することに関して用いられる“導入”の語はトランスフェクション、形質転換、原形質融合、形質導入等を意味し、原核細胞内への核酸の組込みに関するものであって、核酸が細胞のゲノム内に組込まれ、自律レプリコン内に変換され、または一時的に発現されるものを含む。
“フランキング領域”または“フランキング配列”とは、議論されている配列または領域の上流または下流にある領域または配列を意味し、例えば、遺伝子A、B、及びCに関して、遺伝子BはA及びC遺伝子配列の側面に位置する。相同フランキング領域は宿主細胞染色体中の核酸配列に相同(実質的に同一)である。
“ベクター”とは異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築体をいう。ベクターはDNA構築体、プラスミド、クローニングベクター、発現ベクター及びベクテリオファージを含む。
“リコンビナーゼ認識部位”とは染色体中の標的部位の対応する組換え部位へ核酸配列の直接導入を促進する新規なリコンビナーゼ部位である。
ここで用いる“選択マーカー”または“選択遺伝子”とは、宿主細胞において発現できる遺伝子をいい、選択マーカーを含む導入DNA構築体を含んだこれらの宿主細胞の選択を容易にするものをいう。通常、選択マーカーは宿主細胞に抗生物質耐性または代謝利点を与え、外来性導入DNAを含む細胞が当該外来性核酸を受容していない細胞と区別できるようにする遺伝子である。
染色体統合は、本発明に従うプロモーターカセットなどのDNA構築体を宿主染色体中に導入するプロセスである。プロモーターカセットの相同フランキング領域は宿主染色体の標的部位で相同領域と一致する。
“相同組換え”とは、同じ核酸配列の部位で(交差しながら)2つのDNA分子または染色体のペア間の核酸断片の交換を意味する。本発明において、染色体融合は相同組換えにより好ましくは行われる。
“代謝経路”は大きな分子をより小さい分子(異化)に分解する、またはより小さい分子からより複雑な分子を合成する(同化)、一連の化学反応をいう。これらの化学反応のほとんどは多くの酵素により触媒される。多くの代謝経路において、当該経路を調節する働きをする律速酵素段階がある。例えば、グルコースがピルビン酸及びATPに変換される解糖経路において、ホスホフルクトキナーゼは調節の重要酵素であると考えられ、NADPH及びリボース−5−ホスフェートを生成するペントースホスフェート経路において、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ及びフルクトース1,6−ジホスファターゼが重要酵素であると考えられる。
“相同性”の語は配列類似性または同一性をいい、同一であることが好ましい。相同性は当業界に公知の標準技術を用いて決定される(Pearson et al.,(1988)PNAS USA 85:2444及びNeedleman et al.,(1970)Adv.Appl.Math.2:482)。
ここで用いる“発現”の語はポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。当該プロセスは転写及び翻訳の両方を含む。“発現レベル範囲”とは、プロモーターカセットライブラリーを用いて形質転換した細菌性クローンのライブラリーから得た目的遺伝子の複数の発現レベルを意味する。
ここで用いる“最適発現”とは、特定のコード領域に関して最適な遺伝子発現レベルを提供する累積条件をいう。特定条件において、最適発現は低レベルの遺伝子発現を意味する。
“動作可能に連結”とは、核酸配列が機能的に関連していることを意味する。一般的に、動作可能に連結とは連結した核酸配列が隣接していることを意味する。連結は都合の良い制限酵素認識部位で連結反応により達成される。そのような部位が天然には存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来技術に従って用いる。
ここで用いる“単離”とは元々結びついていた少なくとも1の成分から取り除いた核酸またはポリペプチドをいう。
“宿主細胞”とは本発明に従うプロモーターカセットまたはDNA構築体のための宿主及び発現媒体として働く能力を有する細胞を意味する。宿主細胞は組換え宿主細胞であってもよい。“対応する母体宿主細胞”とは、本発明に従う修飾前駆体プロモーターを含むプロモーターカセットを用いて形質転換されておらず、前駆体プロモーターを保持している細菌細胞を意味する。通常、対応する母体宿主細胞及び修飾前駆体プロモーターを含む形質転換宿主細胞を遺伝子発現レベルに関して比較する場合、両細胞は別に示さない限り、実質的に同じ成長条件下で成長させる。
ここで用いる、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とは米国特許第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,965,188号の方法をいい、クローニングまたは精製することなく、DNA混合物中においてポリヌクレオチドの断片濃度を増加させるための方法を含む。標的配列またはDNA断片を増幅するこの方法は、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを標的配列を含むDNA混合物に導入する工程、DNAポリメラーゼの存在中、熱処理サイクルを連続させる工程からなる。2つのプライマーは標的配列のそれぞれのストランドに相補的である。
ここで用いる“異種核酸”または“異種ポリペプチド”の語は、宿主細胞に天然では起こらない核酸またはポリペプチド配列をいう。異種核酸に関して、配列はそれが発現する細胞に天然でない部分を含む。
ここで用いる“相同核酸”または“相同ポリペプチド”の語は、宿主細胞に天然に起こる核酸またはポリペプチドをいう。
ここで数値範囲を用いる場合、それらは定めた範囲の数を含む。
明細書中で用いる、単数は文脈が明らかに別に示さない限り、複数も含む。例えば、“カセット”の語は複数のカセットを含み得る。
ここに引用する公開特許出願、発行特許及び文献はこの出願に引用するものとする。
B.実施態様
本発明に従うプロモーターカセットを作成するために有用な前駆体プロモーターは下記の表1に記載した前駆体プロモーターの配列を含む。図5はこれらの前駆体プロモーターの配列を示し、−35領域、−10領域及びリンカー領域を含む。表中の全てのプロモーターはβ−ラクタマーゼプロモーターPblaに関して特長付けられ、プロモーター強度は“Pbla−単位”で与えられる。(Deuschle,et al.,EMBO J.,5:2987−2994(1986))。
本発明に従うプロモーターカセットを作成するために有用な前駆体プロモーターは下記の表1に記載した前駆体プロモーターの配列を含む。図5はこれらの前駆体プロモーターの配列を示し、−35領域、−10領域及びリンカー領域を含む。表中の全てのプロモーターはβ−ラクタマーゼプロモーターPblaに関して特長付けられ、プロモーター強度は“Pbla−単位”で与えられる。(Deuschle,et al.,EMBO J.,5:2987−2994(1986))。
一般的な前駆体プロモーターにおいて、本発明で有用な配列は、転写開始部位(+1)から200〜20bp上流の配列、好ましくは150〜25bp、より好ましくは30〜100bp及び最も好ましくは50〜30bp上流を含む。
1の実施態様において、好ましい前駆体プロモーターはTrcプロモーター(Ptrc)であり、ここで−35ボックスはTTGACA、リンカーは17塩基対で表され、及び−10ボックスはTATAAT(配列番号27)である(Amann et al.,(1983)Gene 25:167−178)。
他の実施態様において、好ましい前駆体プロモーターはtacプロモーター(Ptac)(配列番号3及び24)である。−10ボックス及び−35ボックスのヌクレオチド配列はPtac及びPtrcにおいて同じであるが、リンカー領域は1bp異なる。
他の好ましい実施態様において、前駆体プロモーターはPGIである。このプロモーターはキシロース・イソメラーゼプロモーターとしても文献で公知であり、当該プロモーターを含む調節配列はAmore et al.,(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.30:351−357に開示されている。当該プロモーターの短断片の配列(−10ボックスの+50〜−7)は配列番号34に示す。
前駆体プロモーターは種々の典型的方法により決定できる。限定するものではないが、1の実施態様において、特定ゲノムの配列決定はコンピューター処理検索アルゴリズムを用いて行われ、推定上のプロモーター配列が同定される。例えば、プロモーター予測ソフトウェアのためのニューラル・ネットワーク、NNPPを用いる。NNPPは大部分が2つの主要層からなる時間遅延ニューラル・ネットワークであり、1つはTATAボックス(−10ボックス)を認識し、1つはいわゆる“開始剤”を認識し、転写開始部位に及ぶ領域である。両主要層は1の出力ユニットに組み合わされる。これらの推定上配列はそれから大腸菌での予備の特性付け及び/または大腸菌中での直接の特性付けに適したカセット中にクローンされる。
プロモーター配列は相同分析によっても同定できる。例えば、ゲノムファミリーの相同研究はBLASTを用いて推定共通プロモーターの存在について行い、分析できる。これらの推定プロモーター配列はそれから、大腸菌での予備の特性付けに適したカセット内にクローンできる。いくつかの好ましい前駆体プロモーターは図4及び5に記載する。
本発明に従う修飾前駆体プロモーターは前駆体プロモーター中のヌクレオチドに対して少なくとも1の修飾を含む。1の実施態様において、修飾は−35共通領域に位置したヌクレオチド塩基に対するものである。この修飾は前駆体プロモーターの−30、−31、−32、−33、−34、及び/または−35位置に等しい位置での1以上のヌクレオチド塩基に対する修飾を含んでもよい。好ましくは、当該修飾は1のヌクレオチドまたは2つのヌクレオチドであり、好ましくは修飾は置換である。2つの位置が修飾された場合、4つの位置が保存され、1の位置が修飾された場合、5つの位置が保存される。さらなる実施態様において、修飾前駆体プロモーターは−30に対応する位置での変化及び/または−35に対応する位置での変化を含む。
他の実施態様において、修飾前駆体プロモーターは、以下の配列で表される−35領域を有する前駆体プロモーターから得られる:TTGACA、TTGCTA、TTGCTT、TTGATA、TTGACT、TTTACA及びTTCAAA。前駆体プロモーターから修飾される特に好ましい−35共通領域はTTTACA及びTTGACAである。非限定的な例として、TTGACAが前駆体プロモーターの−35ボックスである場合、Aである−30位置のヌクレオチドはC、TまたはGで置換でき、Cである−31位置のヌクレオチドはG、A、またはTで置換でき、Aである−32位置のヌクレオチドはT、C、またはGで置換でき、Gである−33位置のヌクレオチドはC、TまたはAで置換でき、Tである−34位置のヌクレオチドはC、GまたはAで置換でき、及び/またはTである−35位置のヌクレオチドはC、GまたはAで置換できる。1の実施態様において、修飾前駆体プロモーターはTTGACAで表される共通領域において1〜4のヌクレオチドの修飾を含む。1の実施態様において、4つの位置は保存され、2つの位置が修飾される。他の実施態様において、5つの位置が保存され、1つの位置が修飾される。さらなる実施態様において、修飾前駆体プロモーターは−30に対応する位置での変化または−35に対応する位置での変化を含む。TTGACAが前駆体プロモーターである場合、以下の通り修飾される:TTGACT、TTGACG、TTGACCまたはCTGACA。
さらなる実施態様において、前駆体プロモーターの修飾は−10領域である。この修飾は前駆体プロモーターの−7、−8、−9、−10、−11または−12位置に等しい位置で1以上のヌクレオチドに対する修飾を含む。好ましくは、修飾は1または2のヌクレオチド位置においてである。好ましい実施態様において、修飾は1または2のヌクレオチド位置での置換である。好ましい前駆体プロモーターは以下の配列を−10領域に含む:TAAGAT、TATAAT、TATACT、GATACT、TACGAT、AATAAT、TATGTT及びGACAAT。特に好ましい−10領域はAATAAT、TATAAT、TATGTT及びTAAGATを含む。1の実施態様において、前駆体プロモーターはPtrc(配列番号27)であり、修飾前駆体プロモーターは少なくとも1のヌクレオチド修飾をTAAGATで表される−10領域中に含む。例えば、Tである−7位置でのヌクレオチドはG、CまたはAで置換でき、Aである−8位置でのヌクレオチドはT、CまたはGで置換でき、Gである−9位置でのヌクレオチドはC、TまたはAで置換でき、Aである−10位置でのヌクレオチドはT、CまたはGで置換でき、Aである−11位置でのヌクレオチドはT、CまたはGで置換でき、及びTである−12位置でのヌクレオチドはT、CまたはGで置換できる。1の実施態様において、4つの位置が保存され、2つの位置が修飾される。他の実施態様において、5つの位置が保存され、1つの位置が修飾される。
本発明のいくつかの実施態様において、前駆体プロモーターの−35領域及び−10領域の両方が修飾を含むことができる。1の実施態様において、修飾は−35ボックス中の1のヌクレオチド位置を含み、ここでその他のヌクレオチドは保存され、及び−10ボックス中の1のヌクレオチド位置で修飾を含み、ここでその他のヌクレオチドは保存される。他の実施態様において、修飾はTTGACAで表される−35領域に対する修飾及びTATAATで表される−10領域に対する修飾を含み、他の実施態様において、修飾はTTGACAで表される−35領域に対する修飾及びAATAATで表される−10領域に対する修飾を含む。前駆体プロモーターの−35ボックス及び−10ボックスにおける修飾の合計数は各共通ボックスにおける1の位置を含むことができ、ここでその他の位置は保存される。前駆体プロモーターの−35ボックス及び−10ボックスにおける修飾の合計数は1の共通ボックスにおける1の位置及びその他の共通ボックスにおける2の位置を含むこともでき、その他の位置は保存される。また、前駆体プロモーターの−35ボックス及び−10ボックスにおける修飾の合計数は各共通ボックスにおける2の位置を含むこともでき、その他の位置は保存される。
さらなる実施態様において、修飾前駆体プロモーターは前駆体プロモーターのリンカー配列に対する修飾を含む。リンカー配列は通常、14〜20ヌクレオチドであり、より一般的には16〜18ヌクレオチドである。修飾は1、2、3、4、または5塩基対のリンカー配列への付加を含み、または1、2、3、4、5またはそれ以上の塩基対の置換を含む。好ましくは修飾はリンカー領域における1または2の塩基対の付加であり、ここで付加はA、T、CまたはGのヌクレオチドのいずれか1つのである。好ましくは付加は1または2の塩基対をPtrcのリンカー配列に含む。さらに、Ptrcへの付加は好ましくは塩基対−23と−24の間で起こる。さらなる実施態様は塩基対−23と−24の間にTの付加を含み(配列番号32を参照)、及びTTの付加を含む(配列番号33を参照)。さらなる実施態様において、修飾は前駆体リンカー配列の任意の位置において1、2、または3のヌクレオチド塩基置換を含む。好ましくは修飾は前駆体リンカーの任意の位置での1のヌクレオチド塩基の置換である。
さらなる実施態様において、修飾前駆体プロモーターは−35ボックス、リンカー領域及び−10ボックスに対する修飾を含む。当該修飾は少なくとも3つ、かつ8以下のヌクレオチド位置を含み、ここで各領域は1の修飾を含む。好ましくは修飾は3つのヌクレオチド位置を含み、ここで各領域は1の修飾を含む。
修飾前駆体プロモーター配列は当業界に公知の方法により生成し、限定されないが、化学的突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応及び1以上のヌクレオチドに対する部位特異的変異誘発などの突然変異誘発技術を含む(Miller,J.H.A.A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press 1992を参照)。1の実施態様において、変質オリゴヌクレオチドはプロモーターライブラリーが構築される宿主細胞のために合成される。好ましい実施態様において、前駆体プロモーターに対する改変はQuickChange市販キット(Stratagene,La Jolla,カリフォルニア州)を用いて部位特異的変異誘発により達成される。
ここで明確にする修飾プロモーターの個々のプロモーターも本発明に含まれる。1の実施態様において、特定のプロモーターで、本発明に従って構築されたプロモーターは修飾Ptrcプロモーター:NF−T(配列番号28);NF−G(配列番号29);NF−C(配列番号30);NF−1T(配列番号32)及びNF−2T(配列番号33)を含む。本発明に含まれる他のプロモーターは以下の配列を有するMC−C3設計プロモーターである:TCTGAAATGAGCTGCTGACA ATTAATCATCCGGCTCG TATAAT GTGTGG(配列番号31)、ここで−35ボックスはCTGACAであり、リンカー領域はATTAATCATCCGGCTCG、及び−10ボックスはTATAATである。
本発明に従うプロモーターカセットは上述の前駆体プロモーター及び/または修飾前駆体プロモーターを含む。さらに、本発明に従うプロモーターカセットは標的部位の上流フランキング領域に相同な5’配列を含み、ここで標的部位は好ましくは目的染色体遺伝子である。標的部位の上流フランキング領域に相同な5’配列は5〜500ヌクレオチドを含み、好ましくは10〜200ヌクレオチド、及び10〜100ヌクレオチド、及びさらに10〜50ヌクレオチドを含み、標的部位のヌクレオチド上流に相同である。
目的の遺伝子は任意の染色体遺伝子であってよい。1の実施態様において、目的遺伝子は成長因子、サイトカイン、ホルモン、配位子、受容体及び抗体などの治療的に重要なタンパク質をエンコードする。他の実施態様において、目的遺伝子はアミラーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、デヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、キナーゼ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、リパーゼ及びフィターゼなどの商業的に重要な酵素をエンコードする。さらなる実施態様において、目的遺伝子はグルコース及び/またはガラクトースパーミアーゼ(トランスポーター)などの輸送タンパク質をエンコードする。他の実施態様において、目的遺伝子は代謝経路において、グルコースデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、及びピルビン酸オキシダーゼなどの酵素をエンコードする。特定の実施態様において、目的遺伝子はリパーゼ、エステラーゼ、ヒドロゲナーゼ及びプロテアーゼなどの工業的に重要な酵素をエンコードする。目的の染色体遺伝子またはそれらのコード領域は宿主細胞と異種または相同であるが、プロモーターライブラリーによりまたは本発明に従う修飾前駆体プロモーターにより置換される天然プロモーターまたは前駆体プロモーターに動作可能に連結する。
本発明に従うプロモーターカセットも2つのリコンビナーゼ認識部位及び各リコンビナーゼ認識部位に隣接した選択マーカーを含むことができる。リコンビナーゼ認識部位の例は当業界に公知である。リコンビナーゼは通常、2つの明確なファミリーに分類され、それぞれ異なる触媒メカニズムを用いる。これらはチロシン・リコンビナーゼ及びセリン・リコンビナーゼである。いずれかのタイプのリコンビナーゼシステムを本発明で用いる。チロシン・リコンビナーゼファミリーはλインテグラーゼファミリーとしても公知であり、100以上の確認されているメンバーを含む(Nunes−Duby,et al.,Nucleic Acids Research(核酸調査)26:391−406(1998))。文献記載された72以上のセリン・リコンビナーゼがあり、これらはTn3、Hin、SOPIVCA、φC31及びλがある。本発明で使用できる特に好ましいリコンビナーゼはCre及びFlpを含む(Nunes−Duby,D,et al.,Nucleic Acids Research 26:391−406(1998)及びHuang et al.,Nucleic Acids Research 19:443(1991);XerC−XerD(cer、parB dif及びpsi)(Blake et al.,(1997)Mol.Microbiol.23:387−398);P22 xis−int(AttP22及びataA)(Cho et al.(1999)J.Bact.181:4245−4249);SPOIVCA(SpoIVCB、SpoIIIC、AttPskin及びAttBskin)(Straiger et al.,(1989)Sci.243:507−512);Resolvase(res)(Yang and Steitz(1995)Cell 82:193−207)及びλInt(Att,attL及びattR)(Hallet and Sherrat(1997)FEMS Microbiol.Lett.21:157−178)。
特に好ましいリコンビナーゼはCre及びFlpである。最も好ましい実施態様において、第1及び第2のリコンビナーゼ認識部位はバクテリオファージP1 Cre/loxP組換えシステムを含み、Cre酵素及び2つの非対称34bp loxP組換え部位を含む(Sternberg and Hamilton(1981)J.Mol.Biol.150:467−486;Van Duyne(2001)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.30:87−104及びPalmeros,B,et al.Gene 247:255(2000)を参照)。loxP部位は2つの13配列を含み、転化され、不十分に繰り返され、8bpコア非対称配列を囲み、ここで交差が起こる。2つの平衡loxP部位間のCre依存分子内組換えは環状分子として任意の介在DNA配列の切除を生じ、2つの組換え生成物を生じ、それぞれ1のloxP部位を含む。好ましくは、プロモーターカセットは2つのloxP部位に隣接した選択マーカーを含む。特に好ましい実施態様において、リコンビナーゼ配列は、2つのLoxP部位が染色体中において正しい配向にある場合それらはループ作成または染色体の大きな領域の反転を促進するので、loxP部位の変異体を含む。Sauer E.,Curr.Opin.Biotech.(1994)、5:521−527;Palmeros et al.Gene 247(2000)255−264、及びHoess et al.,(1986)NAR、14:2287−2230を参照されたい。
好ましい実施態様において、選択マーカーは2つのリコンビナーゼ部位間に位置する。種々の選択マーカーが使用できるが、好ましい選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。これらは当業界に公知である。例えば、当該遺伝子はエリスロマイシン耐性遺伝子(Em’)、アンピシリン耐性遺伝子(Ap’)、クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm’)、ゲンタマイシン耐性遺伝子(Gm’)またはカナマイシン耐性遺伝子(Km’)である。好ましくは選択マーカーを含むプロモーターカセットが宿主細胞にいったん導入されると、マーカーを例えば、Palmeros et al.(2000)Gene 247(2000)255−264の教示に従って除去する。
プロモーターカセットは標的部位の下流フランキング領域に相同な3’配列を含んでもよい。3’配列は5〜500ヌクレオチド、また10〜200ヌクレオチド、また10〜100ヌクレオチド及びさらに10〜50ヌクレオチドを含むことができ、標的部位の下流ヌクレオチドに相同である。
本発明のプロモーターカセットを含むDNA構築体はDNA構築体の様々な断片の連結反応を促進する種々の制限酵素認識部位を含むことができる。制限酵素認識部位はXbal、EcoRI、BgIII、BamHI、Taql等を含むことができる。例えば、制限酵素認識部位は−35配列断片を用いる連結反応、及び翻訳開始コドン及びそこから下流に位置する遺伝子配列に用いることができる。
プロモーターカセット及び修飾前駆体プロモーター核酸はリボソーム結合部位(RBS)、mRNA安定化配列、エンハンサー、抑制配列、転写ターミネーター、転写アテニュエーター、オペレーター及びmRNA不安定化配列などその他の配列も含むことができる。
いくつかの実施態様において、前駆体プロモーター及び目的染色体遺伝子は異種であり、他の実施態様において、前駆体プロモーター及び目的染色体遺伝子は相同である。
プロモーターカセットはPCRなどの公知の標準組換え技術を用いて構築でき、Sambrook上述、Palmeros et al.(2000)Gene247:255−264;Datsenko and Wanner(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA10:640−6645などの種々の文献に記載されている。通常、プロモーターはベクター内にクローンされ、選択マーカーはプロモーター上流にマーカーをクローニングすることによりプロモーターに結合され、クローニング工程はプロモーター機能に影響を与えないようにする。得られたマーカー−プロモーター領域はプロモーターカセットとして用いる。カセットはPCRにより、または制限酵素を用いて単離できる。相同組換えを可能にするために、カセットは宿主細胞染色体に相同な領域にPCRを用いてPCRプライマー中の相同領域を組込むことにより結合できる。または、適当なDNA制限断片を連結する(Datsenko and Wanner(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10:6640−6645)。
他の実施態様において、修飾プロモーターの特定部分はプロモーターカセットから欠失または削除され、修飾前駆体プロモーターを再試験する。発現がこの修飾の後に観測された場合、及び発現が修飾により増加または減少したか測定して、プロモーターの陽性または陰性調節因子を同定することができる。さらに、前駆体プロモーターの特定領域を単離し、単離中試験できる。この方法において、宿主細胞中で遺伝子発現を調節する特定因子が同定できる。
本発明はさらにプロモーターライブラリーを含む。ライブラリーは少なくとも2つのプロモーターカセットを含む。しかしながら、プロモーターライブラリーは103以上のメンバーを含み得る。好ましい実施態様において、プロモーターライブラリーは少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも8、少なくとも16、少なくとも64のメンバーを含む。好ましくは、ライブラリーはプロモーターカセットを含み、ここで修飾前駆体プロモーターは同じ前駆体プロモーターから得られる。1の実施態様において、プロモーターライブラリーは修飾Ptrc及び前駆体Ptrcを含むプロモーターカセットを含む。他の実施態様において、プロモーターライブラリーは修飾Ptac及び前駆体Ptacを含むプロモーターカセットを含み、他の実施態様において、プロモーターライブラリーは修飾PGI及び前駆体PGIを含むプロモーターカセットを含む。好ましい前駆体プロモーターはプロモーターカセットのための上述のものを含む。他の実施態様において、ライブラリーはプロモーターカセットを含み、ここで修飾前駆体プロモーターは異なる前駆体プロモーターから得る。
本発明に従うプロモーターカセットは個々宿主細胞中導入するために用いることができ、またはプロモーターライブラリー中で用いることができる。図6及び7はプロモーターカセット構築、宿主内へのプロモーターカセットの導入、プロモーターカセットを用いた宿主調節領域の置換及び本発明に従う選択マーカーの削除の略図である。
1の実施態様において、宿主細胞は細菌細胞である。細菌性宿主細胞はグラム陽性細胞であってよい。好ましくは宿主細胞はバチルス種である。バチルス種は、限定されないが、B.ズブチリス、B.リケニホルミス、B.レンタス、B.ブレビス、B.ステロサーモフィラス、B.アルカロフィラス(alkalophilus)、B.アミロリケファシエンス、B.clausii、B.ハロデュランス、B.メガテリウム、B.コアグランス、B.サーキュランス、及びB.チューリンゲンシスを含む。
他の実施態様において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞であり、例えばエシェリキア種またはパントエア種である。大腸菌は最も好ましい宿主細胞である。パントエア属は当業界に公知の全てのメンバーを含み、限定されないが、パントエアcitrea、パントエアterrea、パントエア・アグロメランス、パントエアdispersa、パントエアpunctata、パントエアananas、及びパントエアstewartiiを含む。パントエア属は分類上再編成を受け続けている。従って、当該属は限定されないが、エルウィニアherbicolaなどの微生物の再分類された種を含むものとする。
好ましくはプロモーターカセットは形質転換により宿主細胞中に導入される。形質転換の一般的な方法は公知であり、及びCurrent Protocols in Molecular Biology,vol.第1版.Ausubel et al.,(1987)第7章、John Wiley&Sonsを参照されたい。形質転換技術はエレクトロポレーション、塩化カルシウム及び塩化ルビジウムの使用を含む(Maniatis et al.,(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第8章.Cold Spring Harbor Laboratory,上述)及びPotter,H(1988)Anal.Biochem 174:361−373)。
宿主細胞の成長及び維持に適した方法も公知であり、Manual of Methods of General Bacteriology、編集、P.Gerhardt et al.,America Society for Microbiology,ワシントン、DC(1994)及びT.D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology 第2版(1989)Sinauer Associate,サンダーランド、MAを参照されたい。通常、細胞は適当な培地中で35℃で成長する。好ましい成長倍地は市販で調製されており、例えば、ルリア栄養培地(LB)、サブロー・デキストロース(SD)またはその他の公知の成長培地がある。前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含む形質転換宿主細胞は選択マーカーに対する表現型反応に基づいて選択し、プロモーターカセットを提供した。本発明のいくつかの実施態様において、選択マーカーを形質転換宿主細胞から切除する。図6B及びPalmeros et al.上述を参照されたい。具体的な実施態様において。loxP部位はプロモーターの上流に残る(例えば、図6BにおいてPtrc)。loxP部位が宿主中に残る場合、マーカー切除プロセスが繰り返し可能であれば問題となり得る。2つのloxP部位が宿主染色体中の正しい位置にある場合、それらはループ作成または宿主染色体の大きな領域の反転を促進する(Sauer,(1994)Curr.Opin.Biotech 5:521−527を参照)。この問題を解決するために、本発明は野生型loxP部位を効果的に組換えないloxP部位の変異体を含むloxP−cat構築体の構築についても開示する。loxP野生型及びloxP511部位がCre−依存法においてお互いを組換えないことは公知である(Hoess et al.(1986)NAR,14:2287−2230)。その他の非競合loxP部位は公知である。
最適レベルの遺伝子発現を有する形質転換宿主細胞が選択でき、さらに単離できる。宿主細胞中の遺伝子発現の最適化は前駆体プロモーターの約1〜250%、約5〜200%、約10〜150%、及び約10〜100%の強度または発現を有する形質転換宿主細胞を選択することにより達成される。これは前駆体プロモーターの約1%、5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、80%、100%、150%、200%及び250%以上の強度である。
プロモーター強度は特定のDNA断片へのRNAポリメラーゼの結合速度を測定するin vitro法を用いて定量でき、転写開始の測定も可能である。Hawley D.K.et al.,第3章:Promoters Structure and Function in R.L.Rodriguez and M.J.Chamberlin編集、Praeger Scientific.ニューヨークを参照されたい。in vivo法もプロモーター強度を定量するために用いることができる。例えば、プロモーターはリポーター遺伝子に融合でき、RNA合成の効果が測定される(Deuschle et al.,(1986)EMBO J.5:2987−2994)。異なるリポーター遺伝子を用いる大腸菌プロモーターの強度はDeuschle et al.により測定し、データを前述の表1に示す。さらに、プロモーター強度は多数の方法において定められる。1の一般的な方法は相対的なものであり、ここで時間単位当たりの1の遺伝子により発現されるmRNAまたはタンパク質を対照と比較し、同じ遺伝子を異なるプロモーターにより発現する。例えば、天然プロモーター(Plac)により転写された場合、またはPlacUV5プロモーターからのlacZ遺伝子の相対発現レベルである。
本発明の実施態様において、プロモーターカセットは目的染色体遺伝子の天然プロモーターの調節機能を修飾する方法において用いることができ、または1以上のプロモーターカセット(プロモーターライブラリー)を含む形質転換宿主細胞により目的染色体遺伝子の発現を変化させることにより、及びプロモーターカセットと宿主細胞中の目的染色体遺伝子の標的部位の相同フランキング領域間の相同組換えを可能にすることにより用いることができ、プロモーターカセットは目的染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換する。
同じ前駆体プロモーター由来の修飾前駆体プロモーターを含んだ異なるプロモーターカセットは様々な範囲の遺伝子発現レベルを有する形質転換宿主細胞を生成する。プロモーター強度及び/または遺伝子発現は種々の公知の方法により決定できる。プロモーター強度または遺伝子発現は、本質的に同じ条件下で培養された場合、異なる形質転換宿主細胞と前駆体プロモーターを有する母体間で比較できる。所望の発現レベルを有する形質転換宿主はそれから選択及び単離できる。発現レベルは天然または前駆体プロモーターを有する対照母体における同じ遺伝子の発現よりも低いまたは高い。
さらに、選択形質転換宿主細胞はプロモーターライブラリーから選択でき、修飾前駆体プロモーターからの目的遺伝子発現は最初の前駆体プロモーターの強度の約1〜250%、約5〜200%、約10〜150%、及び約10〜100%である。
目的遺伝子の種々の発現レベルを有する細菌細胞集団を作成するためにプロモーターライブラリーを使用することは代謝工学経路構成において特に有用である。代謝工学は菌株の代謝経路を最適化するために用い、生体分子を過剰生成する。これらの生体分子は細胞代謝、ポリペプチドRNA、糖質、脂質などの媒体になることができる。
さらに、ステロイド、抗生物質及びその他の薬剤など複合体分子の合成は複雑かつ複数の触媒経路を必要とする。
単離システムにおいて、特に代謝経路における各工程は設計する必要がある。一方、全細胞システムにおいて利用される微生物はそれぞれ必要な経路を提供する。しかしながら、特定プロモーターの使用は特定プロモーターが強すぎるかもしれないという問題を被る可能性がある。結果として、特定遺伝子の過剰発現が起こり、細胞に有害となる可能性があり、例えば、遺伝子がその他の遺伝子を排除するように発現される。細胞の生存は従って、減少し、生成時間が限定され得る。
ここで提供する方法は細菌性宿主細胞中に導入するプロモーターライブラリーを提供するために利用され、遺伝子発現の範囲を有する形質転換細菌細胞の集団を生じる。発現範囲は最適な発現レベルを有する特定の細菌性クローンの選択を可能にするので有用であるが、依然として細胞生存性を維持する(例えば、所望の生成レベルを維持する宿主細胞の生存性に関する所望の最終生成物の流動生成または所望の生成レベルの維持)。特定の実施態様において、遺伝子の最適発現レベルは高く、他の実施態様において、遺伝子の最適発現レベルは低い。この方法の直接的な利点は細菌クローンが修飾前駆体プロモーターにより得られる発現レベルに基づいて選択でき、それから発酵プロセスに使用できる状態になり、それにより細胞生存が目的遺伝子の発現により悪影響を及ぼされないということである。
以下の実施例は説明のみを目的とするものであり、本発明を限定するものではなく、そのように解釈されるべきではない。当業者は本発明の概念または範囲を逸脱しないで変更及び修正を行うことができることは当然に理解されることである。
実施例
実施例1 Trc−loxP−Catプロモーターカセットの構築
切除可能な選択マーカーを以下の方法によりTrcプロモーターの上流に導入した。市販のプラスミドpTrc99a(Pharmacia)を供給元の説明書に従い制限酵素HindIII及びNcolを用いて消化した(New England Biolabs)。消化したDNAを精製し、それからManiatis et al.上述に説明されているようにT4 DNAポリメラーゼを用いて反応させる(fill−in reaction)。得られた平滑末端直鎖DNAを標準手順に従い再度円形にし(Sambrook et al.、上述)、得られた連結混合物を大腸菌TOP−10コンピテントセル(Invitrogen)内に形質転換する。当該細胞を50マイクログラム/mlのカルベニシリンを含むLB−寒天プレート上に置いた。37℃、16時間の培養後、多数のコロニーがプレート上に現れた。4つのコロニーをさらに分析するために選んだ。
実施例1 Trc−loxP−Catプロモーターカセットの構築
切除可能な選択マーカーを以下の方法によりTrcプロモーターの上流に導入した。市販のプラスミドpTrc99a(Pharmacia)を供給元の説明書に従い制限酵素HindIII及びNcolを用いて消化した(New England Biolabs)。消化したDNAを精製し、それからManiatis et al.上述に説明されているようにT4 DNAポリメラーゼを用いて反応させる(fill−in reaction)。得られた平滑末端直鎖DNAを標準手順に従い再度円形にし(Sambrook et al.、上述)、得られた連結混合物を大腸菌TOP−10コンピテントセル(Invitrogen)内に形質転換する。当該細胞を50マイクログラム/mlのカルベニシリンを含むLB−寒天プレート上に置いた。37℃、16時間の培養後、多数のコロニーがプレート上に現れた。4つのコロニーをさらに分析するために選んだ。
精製プラスミドDNAをこれらのコロニーから得て、制限酵素分析に供した。4つのコロニーは同じプラスミドを含むことを確認し、HindIIIとNcoI間のDNA領域を削除した。このプラスミドをpTrc1と名付けた。
プラスミドpTrc1は制限酵素BspM1のための認識部位を1つだけ含み、Trcプロモーターの−35領域上流に約120塩基対が位置した。この位置は削除可能な選択マーカーを導入するために選択した。pTrc1は供給元の説明書に従いBspM1酵素を用いて消化した(New England Biolabs)。直鎖pTrc1をQIAquickゲル抽出キット(QIAGEN)を用いてゲル精製し、Maniatis et al.上述に説明されているようにT4 DNAポリメラーゼを用いて反応させた。得られた平滑末端直鎖DNAをloxP部位に隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)を含むDNA構築体に連結させた。この構築体はプラスミドpLoxCat2(Palmeros et al.,Gene247(2000)255−264)からSsp1及びBam H1を用いる消化により得た。Ssp1−Bam H1 DNA断片をゲル精製し、平滑末端にした。直鎖pTRC1及びSsp1−BamH1断片を連結した。連結混合物を大腸菌TOP−10コンピテントセル(Invitrogen)に形質転換し、50マイクログラム/mlのカルベニシリン及び20マイクログラム/mlのクロラムフェニコールを含むLB−寒天プレート上に置いた。37℃、16時間の培養後、いくつかのコロニーがプレート上に現れた。これらのコロニーのいくつかをカルベニシリンとクロラムフェニコールを含む新しいLB−プレートに移した。プラスミド精製及び制限酵素分析後、両方の方向でloxP−catカセットを含む2つのクローンを選択した。これらのプラスミドをpTrCm1及びpTrCm2と名付けた(図2及び3)。
ここに記載したpLoxCat1及び2ベクターの重要な検討材料は、それらがLacl抑制因子の結合を可能にするlacオペレーターを依然として含み、Trcプロモーターをある程度調節するということである(Amann et al.(1988)Gene、69:301−315)。
実施例2 −35ボックスにおける修飾Trcプロモーターの構築
DNA突然変異誘発に関して多数の方法が存在し、ここに記載する手順は本方法を例示するために用いるが、それに限定されるものではない。QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を明確なDNA領域に少数の修飾(変異)を導入するために選択した。この方法はテンプレート(通常はプラスミド)に突然変異を起こさせるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用に基づき、当該方法は2つのプライマーが必要である。数回のPCRサイクル後、多くのテンプレートのコピーが生成される。各コピーは変異原性プライマーにより準備される。PCR反応はそれから、多くの部位の中で元のテンプレート(非変異)だけを切断する制限酵素Dpn1を用いて処理する。PCR生成物はDpn1に対して感度を有さない。Dpn1処理後、得られたDNAは大腸菌コンピテントセルを形質転換するために用いる。回収した形質転換体は通常、変異体が高度に濃縮されている。
DNA突然変異誘発に関して多数の方法が存在し、ここに記載する手順は本方法を例示するために用いるが、それに限定されるものではない。QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を明確なDNA領域に少数の修飾(変異)を導入するために選択した。この方法はテンプレート(通常はプラスミド)に突然変異を起こさせるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用に基づき、当該方法は2つのプライマーが必要である。数回のPCRサイクル後、多くのテンプレートのコピーが生成される。各コピーは変異原性プライマーにより準備される。PCR反応はそれから、多くの部位の中で元のテンプレート(非変異)だけを切断する制限酵素Dpn1を用いて処理する。PCR生成物はDpn1に対して感度を有さない。Dpn1処理後、得られたDNAは大腸菌コンピテントセルを形質転換するために用いる。回収した形質転換体は通常、変異体が高度に濃縮されている。
−35領域のTTGACA配列の第2A(位置−31)を変化させるために、2つの変異原性プライマーを設計し、市販の供給元により合成した(Operon technologies Inc.)。
これらの2つのプライマーを、供給元により推奨される手順に従ってテンプレートとしてpTrCm2プラスミド(図1及び2)及びQuickChangeキットを用いた突然変異誘発のために用いた。QuickChangeキットは、形質転換後、通常は多数の形質転換体を生成する独自の形質転換手順及びコンピテントセル(大腸菌株XL1ブルー)と一緒に提供される。
形質転換及び選択プレート上にプレートした後、プラスミドDNAをいくつかのクローンから精製し、配列決定した。この方法において、修飾前駆体プロモーターを同定した。すなわち、以下の配列を含む−35ボックスを含んだプロモーター:
クローン NF−T(配列番号28) TTGACT=プラスミドpTrcCm31T
クローン NF−C(配列番号30) TTGACC=プラスミドpTrcCm31C
クローン NF−G(配列番号29) TTGACG=プラスミドpTrcCm31G
図8を参照されたい。
クローン NF−T(配列番号28) TTGACT=プラスミドpTrcCm31T
クローン NF−C(配列番号30) TTGACC=プラスミドpTrcCm31C
クローン NF−G(配列番号29) TTGACG=プラスミドpTrcCm31G
図8を参照されたい。
実施例3 −10と−35ボックス間のスペーサー領域における修飾Trcプロモーターの構築
少数の修飾で、ある程度のプロモーター強度レベルをリンカー領域中に提供するのに十分であるということを示すために、Trcプロモーターの通常間隔をその時点で1bp増加させた。すなわち、1または2塩基を実施例2に記載のQuickChange手順を用いて、以下のプライマーを用いて加えた:
少数の修飾で、ある程度のプロモーター強度レベルをリンカー領域中に提供するのに十分であるということを示すために、Trcプロモーターの通常間隔をその時点で1bp増加させた。すなわち、1または2塩基を実施例2に記載のQuickChange手順を用いて、以下のプライマーを用いて加えた:
実施例4 染色体調節領域を置換するためのpTrCm2の使用
lacZプロモーターの置換
DatsenkoとWannerに開示されている方法(Proc,.Natl.Acad.Sci.USA,10:6640−6645,(2000)をlacZ遺伝子の天然調節領域を置換するためにPtrc及び修飾Ptrcプロモーターを用いて利用した。この方法はPCR生成物と大腸菌宿主細胞染色体間の相同組換えを促進するための相同領域として30−50ヌクレオチドを利用する。プラスミドTrCm2及びその誘導体をPCR反応のテンプレートとして用いた。
lacZプロモーターの置換
DatsenkoとWannerに開示されている方法(Proc,.Natl.Acad.Sci.USA,10:6640−6645,(2000)をlacZ遺伝子の天然調節領域を置換するためにPtrc及び修飾Ptrcプロモーターを用いて利用した。この方法はPCR生成物と大腸菌宿主細胞染色体間の相同組換えを促進するための相同領域として30−50ヌクレオチドを利用する。プラスミドTrCm2及びその誘導体をPCR反応のテンプレートとして用いた。
上記のプライマーをpTrcCm2に相補的な20のヌクレオチド及びlacZ遺伝子調節領域に相補的な39のヌクレオチドを含むように設計した(図7)。これらのプライマーを用いて、1333bp DNA断片をPCRにより生じた。
大腸菌株、MG1655をDatsenkoとWanner(上述)により推奨されるようにプラスミドpKD46を用いて形質転換した。得られた株MG1655/pKD46をDatsenkoとWanner(上述)において記載されている方法に従いコンピテントセルを調製するために用いた。コンピテントセル(100μl)を20〜100ngの上述の1333bp PCR生成物を用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。1.0mlのSOC培地(殺菌した10mlの1M MgCl2及び殺菌した20mlの1Mグルコースをオートクレーブにかけた20gのトリプトン、5g酵母抽出物、0.5NaCl及び2.5ml 1M KClに加える)中で1時間、細胞を回収した後、それらを10μg/mlのクロラムフェニコールを含む4LAプレート上に置いた。プレートを37℃で少なくとも16時間培養した。CmRコロニーを10μg/mlクロラムフェニコールを含む新しいLAプレートに移した。LacZ遺伝子の天然調節領域がMG1655から修飾された染色体DNAであることを証明するために、CmR形質転換体のいくつかをUltraClean微生物DNA単離キット(MO BIO Labs,Solana Beach,CA)を用いて精製した。これらのDNAはプライマーを用いたPCRの基質として用いた。
これら2つのプライマーはlacZ1及びlacZ2がハイブリダイズする外側領域をハイブリダイズし、以下のサイズのPCR生成物を生成する:MG1655−425bp及びMG1655::Ptrc−Cm−lacz−1585bp(及びpTrCm18及びpTrCm19カセットの1586bp及び1587bp)。
PCR生成物を2%アガロースゲル中で分離した。lacZに適当な修飾を有するゲルコロニーの結果に基づいて調節領域を同定した。
カセットの適当な統合はPCR生成物を配列決定することによりさらに確認できる。
さらに、実施例2に記載したプラスミドpTrcCm31T、pTrcCm31C及びpTrcCm31Gも同じ目的で使用できる。pTrcCm1及びpTrcCm2のカセットはpTrcCm31Tm、pTrcCm31C、またはpTrcCm31G由来のカセットよりも高い発現レベルを生じると考えられる。pTrcCm18及びpTrcCm19プロモーターはwt trcプロモーターよりも弱いことも考えられる。
実施例5 lacZ遺伝子の発現測定
大腸菌におけるβ−ガラクトシダーゼ酵素のlacZコード及びこの遺伝子は遺伝子発現を定量するためにリポーターとして広く使用されている。β−ガラクトシダーゼ活性はMiller,J.H.(A Short Course in Bacterial Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1922)に記載された手順に従い合成基質ONPG(オルト−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシド)を用いて測定する。実施例3に記載の株におけるlacZ遺伝子の発現レベルを定量するために、当該株をルリア栄養培地(LB)中で一晩中成長させた。これらを50mlのLBまたはLB+100μM IPTGを含む250mlフラスコを培養するために一晩中用いた。基準点として、株MG1655も植菌した。MG1655の場合、lacZはその天然プロモーターから発現される。
大腸菌におけるβ−ガラクトシダーゼ酵素のlacZコード及びこの遺伝子は遺伝子発現を定量するためにリポーターとして広く使用されている。β−ガラクトシダーゼ活性はMiller,J.H.(A Short Course in Bacterial Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1922)に記載された手順に従い合成基質ONPG(オルト−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシド)を用いて測定する。実施例3に記載の株におけるlacZ遺伝子の発現レベルを定量するために、当該株をルリア栄養培地(LB)中で一晩中成長させた。これらを50mlのLBまたはLB+100μM IPTGを含む250mlフラスコを培養するために一晩中用いた。基準点として、株MG1655も植菌した。MG1655の場合、lacZはその天然プロモーターから発現される。
フラスコをそれらが初期指数関数段階(600nmで、〜0.8OD)に達するまで37℃で振動器中で培養し、1.5サンプルを遠心分離により回収した。当該細胞を1mlの緩衝液Z中で再懸濁し、Miller,J.H,(A Short Course in Bacterial Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1922)により記載されているようにβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。当該分析で用いた体積を補正した後、光学密度(600nm)単位当たりのβ−ガラクトシダーゼの相対活性を計算した。これらの測定結果を表2に表す。
実施例6 LoxP変異体を含むLoxP−Catカセットの構築
野生型及びloxP511の配列を下記に示す。2つのloxP部位は1つの塩基対のみ異なる。
野生型及びloxP511の配列を下記に示す。2つのloxP部位は1つの塩基対のみ異なる。
LoxP511−Catカセットを構築するために、変異塩基を含む2つのプライマーをPCRによりloxP−Catカセットを増幅するために用いた。この方法(及びその他)は任意のLoxP配列の変異体を構築するために使用できる。
PCRプライマー配列は以下の通り。
PCRを行い、ベクターキット(Invitrogen)付属の説明書に従いPCR生成物をベクターpCR−Blunt II TOPOにおいてクローンした。大腸菌細胞を形質転換し、多くのコロニーを得た。プラスミド精製及び制限酵素解析後、正しい制限酵素パターンを有する3つのコロニーをDNAシーケンシングのために出し、1のプラスミドが正しいLoxP511配列を提示した。このプラスミドをpLoxCat27と名付けた。1の実施態様において、このカセットは、修飾前駆体プロモーターまたはプロモーターカセットがすでにLoxP部位を有する細菌性宿主株中に導入される場合本発明に従い前駆体プロモーターと使用する。
当業者は通常の実験によりここに記載した本発明の特定の実施態様と同等な多く実施態様を理解し、確認することができる。当該同等な実施態様は請求の範囲に含まれる。
Claims (34)
- 目的染色体遺伝子の発現レベル範囲を有する細菌細胞のライブラリーを作成する方法であって、以下を含む:
a)少なくとも2のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリーを得る工程であって、ここでプロモーターカセットは配列順に標的部位の上流フランキング領域に相同な5’配列;第1のリコンビナーゼ認識部位;選択マーカー;第2のリコンビナーゼ認識部位;−35共通領域、リンカー配列及び−10共通領域を含む前駆体プロモーターまたは修飾前駆体プロモーターを含み、ここで修飾前駆体プロモーターは前駆体プロモーターから修飾された少なくとも1のヌクレオチド位置を含み;及び標的部位の下流フランキング領域に相同な3’配列を含む
b)プロモーターライブラリーを用いて細菌性宿主細胞を形質転換する工程であって、ここでプロモーターカセットは相同組換えにより細菌性宿主細胞に統合されて形質転換宿主細胞を生成する;
c)適当な成長条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程;
d)形質転換細菌細胞のライブラリー得る工程であって、ここで形質転換細菌細胞は目的の染色体遺伝子発現レベル範囲を示す。 - さらにライブラリーから形質転換細菌細胞を選択する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞が大腸菌、バチルス種、及びパントエア種からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 選択細菌細胞が前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも高いレベルの目的遺伝子発現を有する、請求項2に記載の方法。
- 選択細菌細胞が前駆体プロモーターを含む細菌細胞よりも低いレベルの目的遺伝子発現を有する、請求項2に記載の方法。
- 請求項2の方法に従って選択される形質転換細菌細胞。
- プロモーターライブラリーがPtrc前駆体プロモーター及び修飾Ptrc前駆体プロモーターを含む、請求項1に記載の方法。
- プロモーターライブラリーがPtac前駆体プロモーター及び修飾Ptrc前駆体プロモーターを含む、請求項1に記載の方法。
- プロモーターライブラリーがPGI前駆体プロモーター及び修飾PGI前駆体プロモーターを含む、請求項1に記載の方法。
- プロモーターライブラリーが配列番号28、配列番号29及び配列番号30を有する修飾プロモーターを含む、請求項1に記載の方法。
- 配列順に以下を含むプロモーターカセット:
a)標的部位の上流フランキング領域に相同な5’配列
b)第1のリコンビナーゼ認識部位
c)選択マーカー
d)第2のリコンビナーゼ認識部位
e)前駆体プロモーターの−35共通領域、リンカー配列及び−10共通領域に対応する位置において少なくとも1の修飾ヌクレオチドを含む修飾前駆体プロモーター;及び
f)標的部位の下流フランキング領域に相同な3’配列。 - 前駆体プロモーターがPtrc、Ptacl、PD/E20、PH207、PN25、PG25、PJ5、PA1、PA2、PA3、PL、Plac、PlacUV5、Pcon及びPblaからなる群より選択される、請求項11に記載のプロモーターカセット。
- 前駆体プロモーターの−35領域がTTGACA、TTGCTA、TTGCTT、TTGATA、TTGACT、TTTACA、及びTTCAAAからなる群より選択される、請求項11に記載のプロモーターカセット。
- 前駆体プロモーターの−10領域が、TAAGAT、TATAAT、AATAAT、TATACT、GATACT、TACGAT、TATGTT、及びGACAATからなる群より選択される、請求項11に記載のプロモーターカセット。
- 前駆体プロモーターの−35領域がTTGACAであり、前駆体プロモーターの−10領域がTATAATである、請求項11に記載のプロモーターカセット。
- 前駆体プロモーターの−35領域がTTGACAであり、前駆体プロモーターの−10領域がAATAATである、請求項11に記載のプロモーターカセット。
- 前駆体プロモーターのリンカー配列が修飾される、請求項11に記載のプロモーターカセット。
- 前記第1及び第2のリコンビナーゼ認識部位が異なるリコンビナーゼ部位であり、lox及び変異lox部位から選択される、請求項11に記載のプロモーターカセット。
- 修飾前駆体プロモーターが配列番号28(NF−T)、配列番号29(NF−G)、配列番号30(NF−C)、配列番号32(NF−1T)及び配列番号33(NF−2T)からなる群より選択される、請求項11に記載のプロモーターカセット。
- 少なくとも2つの請求項11のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリー。
- 少なくとも2つの請求項13のプロモーターカセットを含むプロモーターライブラリー。
- 請求項11のプロモーターカセットを含むベクター。
- 請求項11のプロモーターカセットを用いて形質転換した宿主細胞。
- 宿主細胞が大腸菌、バチルス種及びパントエア種からなる群より選択される、請求項23の宿主細胞。
- 目的染色体遺伝子の天然プロモーターの調節機能を修飾する方法であって、以下を含む:
a)請求項11に従うプロモーターカセットを得る工程;
b)プロモーターカセットを用いて宿主細胞を形質転換し、プロモーターカセットと標的部位の相同フランキング領域間で相同組換えさせる工程であって、ここでプロモーターカセットは目的の染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換する;及び
c)適当な成長条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程。 - 形質転換宿主細胞から選択マーカーを切除する工程をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 形質転換宿主細胞を単離する工程をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 目的染色体遺伝子の発現を変化させる方法であって、以下を含む:
a)請求項11に従うプロモーターカセットを得る工程;
b)プロモーターカセットを用いて宿主細胞を形質転換する工程;及び
c)プロモーターカセットと標的部位の相同フランキング領域間で相同組換えさせる工程であって、ここでプロモーターカセットが目的の染色体遺伝子の天然プロモーター領域を置換し、及び目的染色体遺伝子の発現が対応する母体宿主細胞における目的染色体遺伝子の発現と比較して変化する工程。 - 配列番号28に示す配列を含む単離プロモーター。
- 配列番号29に示す配列を含む単離プロモーター。
- 配列番号30に示す配列を含む単離プロモーター。
- 配列番号32に示す配列を含む単離プロモーター。
- 配列番号33に示す配列を含む単離プロモーター。
- 配列番号31に示す配列を含む単離プロモーター。
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