JP4214230B2 - 環状dnaへのランダム変異導入方法 - Google Patents
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Description
(1) 以下の工程を含むことを特徴とする、環状DNAの増幅方法。
(a)環状DNAを鋳型としてローリングサークル型増幅法によりDNAを増幅し、直鎖状DNAからなる増幅産物を得る工程
(b)得られた増幅産物を用いて原核宿主細胞を形質転換し、該細胞内で環状DNAを再構築させる工程
(2) 原核宿主細胞が大腸菌である、(1)に記載の方法。
(3) 環状DNAが原核宿主細胞内で独自に複製可能なDNAである、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 原核宿主細胞内で独自に複製可能なDNAがプラスミドである、(3)に記載の方法。
(5) 環状DNAが、遺伝子ライブラリーを形成しているものである、(1)又は(2)に記載の方法。
(6) 遺伝子ライブラリーが、cDNA又はゲノムDNAのプラスミドライブラリーである、(5)に記載の方法。
(7) 形質転換がエレクトロポレーション法又はコンピテント細胞法により行なわれる、(1)から(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 以下の工程を含むことを特徴とする、環状DNAへのランダム変異導入方法。
(c)環状DNAを鋳型とし、複製の忠実度を低下させる条件下でローリングサークル型増幅法によりDNAを増幅し、直鎖状DNAからなる増幅産物を得る工程
(d)得られた増幅産物を用いて宿主細胞を形質転換し、該細胞内で環状DNAを再構築させる工程
(9) 複製の忠実度の低下をマンガンイオンの添加により行うことを特徴とする、(8)に記載の方法。
(10) 宿主細胞が原核細胞又は真核細胞である、(8)又は(9)に記載の方法。
(11) 環状DNAが宿主細胞内で独自に複製可能なDNAである、(8)から(10)のいずれかに記載の方法。
(12) 宿主細胞内で独自に複製可能なDNAがプラスミドである、(11)に記載の方法。
本発明の環状DNAの増幅方法は、(a)環状DNAを鋳型としてローリングサークル型増幅法によりDNAを増幅し、直鎖状のDNAからなる増幅産物を得る工程、(b)得られた増幅産物を用いて原核宿主細胞を形質転換し、該細胞内で環状DNAを再構築させる工程を含む(図1参照)。以下、各工程について説明する。
本発明の環状DNAへのランダム変異導入方法は、(c)環状DNAを鋳型とし、複製の忠実度を低下させる条件下でローリングサークル型増幅法によりDNAを増幅し、直鎖状DNAからなる増幅産物を得る工程、(d)得られた増幅産物を用いて宿主細胞を形質転換し、該細胞内で環状DNAを再構築させる工程を含む(図2参照)。
本変異方法においては、宿主細胞として真核細胞及び原核細胞のいずれをも用いることができる。真核細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母;サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウスL細胞、ヒトGH3、ヒトFL細胞等の動物細胞;Sf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。また、原核細胞としては、大腸菌(Escherichia coli)等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌などが挙げられる。
(実施例1) 環状DNAの増幅反応(1)
Templiphi DNA amplification kitを用いて、プラスミドpUC19をRCA法により増幅した。すなわち、0.5μLのpUC19 (50 pg/μL) と キット添付の5μLの sample buffer を混合し、95℃で3分間インキュベートした後、キット添付の5μLのreaction buffer及び0.2 μLのphi29 DNA polymerase と混合して30℃で24時間インキュベートした。
pUC19とは ori 部位の由来が異なる、pACYC184及び pMW219(日本ジーンより購入)を用いて、実施例1と同様の実験を行った。すなわち、0.5μLのpACYC184及び pMW219 (50 pg/μL) と Templiphi DNA amplification kit添付の5μLの sample buffer を混合し、95℃で3分間インキュベートした後、キット添付の5μLのreaction buffer及び0.2 μLのphi29 DNA polymerase と混合して30℃で24時間インキュベートした。増幅産物1μLを用いて50μLの大腸菌BL21 gold (DE3)(ストラタジェン製)をエレクトロポレーション法で形質転換し、LB プレート(20μg/mLカナマイシンを含む)に塗布した。その結果、24時間増幅産物から約2000個のコロニーを得ることができた。コロニーを1 mLのLB培地(20μg/mLカナマイシンを含む)で培養し、QIA prep miniprep kit(キアゲン製)でプラスミドを回収し、同様にしてアガロース電気泳動を行ったところ、pACYC184及び pMW219が再構築されていることを確認した。
変異導入率が高い条件で、プラスミドpUC19に、ランダム変異を導入した。RCAを行う際には、templiphi DNA amplification kitを利用した。まず、0.5μLのpUC19 (50 pg/μL) と キット添付の 5μL sample bufferを混合し、95℃で3分間インキュベートした後、キット添付の 5μL reaction buffer及び0.2 μL phi29 DNA polymeraseと1μLのMnCl2 (1 及び 1.5 mM、最終濃度)を混合して、30℃で24時間インキュベートした。24時間反応後の増幅産物1μLを用いて50μLの大腸菌TOP10(インビトロジェン製)をエレクトロポレーション法で形質転換し、LB プレート(50μg/mLアンピシリンを含む)に塗布した。その結果、1 mM MnCl2 を添加した条件では約300個、1.5 mM MnCl2 を添加した条件では約150個のコロニーを得ることができた。
Claims (5)
- 以下の工程を含むことを特徴とする、環状DNAへのランダム変異導入方法。
(c)環状DNAを鋳型とし、複製の忠実度を低下させる条件下でローリングサークル型増幅法によりDNAを増幅し、直鎖状DNAからなる増幅産物を得る工程
(d)得られた増幅産物を用いて宿主細胞を形質転換し、該細胞内で環状DNAを再構築させる工程 - 複製の忠実度の低下をマンガンイオンの添加により行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
- 環状DNAが宿主細胞内で独自に複製可能なDNAである、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 宿主細胞内で独自に複製可能なDNAがプラスミドである、請求項4に記載の方法。
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