KR102194368B1 - 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 유전체 개량 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 유전체 개량 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법으로 제조된 미생물의 유전체 개량을 위한 변이 균주는 유전체 내에 인위적으로 삽입한 선별 마커(selective marker)인 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 제거를 위하여 균주 내에 Cre 재조합 효소 등과 같은 위치 특이적 재조합 효소를 발현 할 수 있는 플라스미드를 재도입 할 필요가 없으므로 상기 변이 균주를 활용하여 효율적으로 균주 내에 목적 유전자 서열의 치환, 결실 또는 목적 서열을 삽입할 수 있어 균주의 목적 유전자를 효율적으로 변형할 수 있고, 나아가, 기초 연구를 위한 미생물의 유전체 변이 균주를 제작하는데에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 미생물의 유전체 개량 방법에 관한 것이다.
미생물 대사공학은 미생물 등의 유전체를 개량하여 원하는 목적에 맞게 활용하는 기술이다. 유용 대사산물은 미생물의 유전정보와 대사회로로부터 얻을 수 있으며, 미생물 유전자의 조작을 통해서 더 유용한 대사물질이나 그 특성을 개선시킬 수 있는 기술들이 개발되고 있다. 특히, 대사공학분야에서 CRISPR/Cas9, Flp/FRT 및 cre/lox와 같은 위치-특이적 재조합 기술은 식물, 효모, 미생물과 같은 다양한 생명체 모델에 적용되고 있으며, 이를 이용하여 항생제 마커가 제거된 유전자 돌연변이 균주의 제작이 가능하다(Datsenko, K, A et al, PNAS 97:6640-6645, 2000; Gilbertson, L Trends in biotechnology 21:550-555, 2003; Baba, T et al. Molecular systems biology 2, 2006; Yan, X et al, Applied and environmental microbiology 74:5556-5562, 2008).
한편, 미생물 유전체 개량에 있어 외부유전자의 도입 및 특정 단백질의 과발현을 위해서는 개량하고자 하는 미생물에서 자가복제가 가능한 플라스미드가 필수적 요구되며, Cre-lox 및 CRISPR-Cas9과 같은 유전체 개량 기술에도 플라스미드 기반 유전자 발현 시스템이 도입되고 있다. Cre 재조합 효소를 발현하기 위한 프로모터 및 세포 내에서 자가복제를 위한 Origin, 그리고 항생제 내성 유전자가 포함된 플라스미드가 그 예 일 수 있다. 그러나 이는 세포내에서 자가 복제가 가능한 플라스미드여야 하기 때문에 균주 특이적 (host specific) 일 수 있다. 이를 극복하기 위하여, 다양한 미생물 개체에서 특정 유전자를 과발현하기 위한 광범용성 플라스미드 (Broad-host-range plasmid)가 개발된 바 있으나, 세포내에서의 안정성 (plasmid stablility)이 미생물 종 (strain) 마다 달라 모든 미생물에 적용되기 어렵다. 또한, 플라스미드에 의해 도입된 유전자가 과발현되는 경우 세포내에서의 플라스미드 복제 수 (copy number) 및 프로모터의 발현 강도에 따라 최종적으로 균체량 및 생산성의 감소가 나타날 수 있다. 이에, arabinose, tryptophan, 및 IPTG 등의 유도물질 (inducer)의 처리를 통해 특정 시간 및 균체의 생장 상태 (growth phase)에 따라서 특정 유전자의 발현을 증가시키기 위한 방법들이 고안된 바 있으나, 상기의 방법은 유도물질의 종류 및 농도에 따라 목적 유전자의 발현량의 변화가 크고, 지속적이고 안정적인 유전자 발현이 어려우며, 처리되는 유도물질 (inducer)의 비용 문제로 산업적 적용에 어려운 점이 있다. 또한, 이러한 유도물질들은 균체에 대하여 독성을 가질 수 있기 때문에 결과적으로 균체량에 영향을 줄 수 있는 단점이 있다.
한편, 데이노코쿠스 라디오두란스는 생물체의 DNA 또는 단백질에 직접 손상을 입할 수 있는 이온화 방사선에 대해 내성을 갖는 것으로 알려져 있다(Makarova, K.S et al Microbiology and molecular biology reviews 65:44-79, 2001). 상기 균주는 이온화 방사선에 의한 DNA 손상을 빠른 시간 내에 복구할 수 있고(Grimsley, J K et al, International journal of radiation biology 60:613-626, 1991), 효소적 또는 비효소적 시스템에 의하여 세포 내에 생성된 활성산소종(ROS)를 효과적으로 제거할 수 있는 능력을 지니고 있다(Shashidhar, R et al, Canadian journal of microbiology 56:195-201, 2010). 이와 같은 특성 때문에 데이노코쿠스 라디오두란스는 방사성 폐기물의 정화에 사용되고 있다. 또한, 의약, 보건, 생명공학 등의 다양한 분야에서 데이노코쿠스 라디오두란스를 적용한 기술의 사례가 증가할 것으로 전망된다.
현재까지 보고된 바에 의하면, 데이노코쿠스 라디오두란스의 대사공학적 제어를 위해, 다른 미생물의 유전자를 세포 내로 도입시키거나, 상동적 재조합 방법을 이용한 돌연변이 균주의 제작 기술이 고안되었다. 그러나, 이러한 돌연변이 제작 기술은 반복적인 유전자 클로닝 과정으로 인해 많은 시간이 소요될뿐만 아니라, 돌연변이 균주를 선별하기 위한 항생제 마커의 제한성으로 다중 돌연변이 균주를 제작하는데 어려움이 있다. 즉, 유전체 내에 인위적으로 삽입한 선별 마커(selective marker)인 항생제 내성 유전자의 제거를 위하여 균주 내에 Cre 재조합효소 등과 같은 위치 특이적 재조합 효소를 발현 할 수 있는 플라스미드를 재도입하고 이를 다시 균주로부터 제거하는 반복적인 작업이 요구된다.
이에 본 발명자들은 cre-lox 시스템과 같은 위치 특이적 재조합 기술을 응용하여, trc 프로모터, cre 재조합 효소를 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacΙq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하고, 상기 재조합 플라스미드를 균주 내로 도입하여 trc 프로모터, cre 재조합 효소를 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacΙq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 단편을 데이노코쿠스 라디오두란스와 메틸로모나스 속 DH-1 균주 내로 삽입하는데 성공하였다. 그 후, IPTG 유도물질(inducer)에 의해서 조건적으로 Cre 재조합효소가 발현되어 상기 균주 내에 삽입된 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 완전히 제거됨을 확인하였고, 상기의 과정이 안정적으로 유지되는 변이 균주를 수득하였다. 이후, 상기 제조한 변이 균주를 이용하여 목적 유전자(target gene)가 효율적으로 결실되는 것을 확인하였다. 따라서 상기 변이 균주를 제조하는 방법을 활용하여 다양한 균주에 대해 효율적으로 목적 유전자 서열의 치환, 결실 또는 목적 서열을 삽입하여 균주 내의 목적 유전자를 변형하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 목적은 미생물의 유전체를 개량하기 위한 변이 균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 표적 유전자간부위(intergenic region)의 상부 단편 서열, trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위(intergenic region)의 하부 단편 서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 균주 내에 도입하는 단계; 및
2) 상기 균주의 표적 유전자간부위(intergenic region)에 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입되는 단계;를 포함하는 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 균주 내에 도입하는 단계;
2) 상기 균주의 표적 유전자간부위(intergenic region)에 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입되는 단계; 및
3) IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 배지에 배양하여 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 제거하는 단계를 더 포함하는 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주에 항생제 내성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 함유한 lox 핵산단편의 양 말단에 각각 표적 서열의 상부 단편 서열과 하부 단편 서열이 결합된 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변이 균주의 목적유전자를 변형하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법으로 제조된 미생물의 유전체 개량을 위한 변이 균주는 유전체 내에 인위적으로 삽입한 선별 마커(selective marker)인 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 제거를 위하여 균주 내에 cre 재조합 효소 등과 같은 위치 특이적 재조합 효소를 발현 할 수 있는 플라스미드를 재도입 할 필요가 없으므로 상기 변이 균주를 활용하여 효율적으로 균주 내에 목적 유전자 서열의 치환, 결실 또는 목적 서열을 삽입할 수 있어 균주의 목적 유전자를 효율적으로 변형할 수 있고, 나아가, 기초 연구를 위한 미생물의 유전체 변이 균주를 제작하는데에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주를 제조하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2a는 lox 염기 서열, kat 프로모터 및 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 pAM1 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 2b는 trc 프로모터, cre 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 pAM3 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 3은 trc 프로모터, cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 kat 프로모터와 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 pAM4 플라스미드를 제조하는 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 데이노코쿠스 라디오두란스 dr_C0022 유전자의 일부 염기 서열 및 표적 유전자간부위의 상부 단편 서열, trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위의 하부 단편 서열 및 dr_C0023 유전자의 일부 염기 서열을 포함하는 pAM5 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 5는 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주를 IPTG가 포함된 배지에서 배양하여 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주(DrCre)를 제조하는 과정을 나타낸 도이다.
도 6a는 야생형 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(WT), pAM5 플라스미드의 도입으로 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(DrCreKm) 및 IPTG에 의해 cre 재조합 효소가 발현되어 카나마이신 저항성 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(DrCre)의 변이 부위를 PCR 증폭한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 도 6a의 균주를 카나마이신이 포함된 TGY 배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 TGY 배지에서 배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 IPTG에 의해 cre 재조합 효소가 발현되어 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(DrCre), crtB 및 crtI 유전자가 결실(deletion)되고 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거되지 않은 균주(△crtBI_Km) 및 crtB 및 crtI 유전자가 결실(deletion)되고 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 균주(△crtBI)를 카나마이신이 포함된 TGY 배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 TGY 배지에서 배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 IPTG에 의해 cre 재조합 효소가 발현되어 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(DrCre)와 상기 균주에서 crtB 및 crtI 유전자가 결실(deletion)된 균주의 색을 비교한 도이다.
도 8a는 야생형 메틸로모나스 속 DH-1 균주(WT), pAM6 플라스미드의 도입으로 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 메틸로모나스 속 DH-1 균주(DH-1:Km) 및 IPTG에 의해 cre 재조합 효소가 발현되어 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 메틸로모나스 속 DH-1 균주(DH-1:cre)를 전기영동한 결과를 나타낸 도이다.
1 : 야생형 메틸로모나스 속 DH-1 균주(WT)
2 : DH-1:Km
3 : DH-1:cre
도 8b는 도 8a의 균주를 카나마이신이 포함된 NMS 배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 NMS 배지에 배양한 결과를 나타낸 도이다.
1 : 야생형 메틸로모나스 속 DH-1 균주(WT)
2 : DH-1:Km
3 : DH-1:cre
도 9는 메틸로모나스 속 DH-1 AYM39_00230 유전자의 일부 염기 서열 및 표적 유전자간부위의 상부 단편 서열, trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위의 하부 단편 서열 및 AYM39_00235 유전자의 일부 염기 서열을 포함하는 pAM6 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 2a는 lox 염기 서열, kat 프로모터 및 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 pAM1 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 2b는 trc 프로모터, cre 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 pAM3 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 3은 trc 프로모터, cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 kat 프로모터와 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 pAM4 플라스미드를 제조하는 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 데이노코쿠스 라디오두란스 dr_C0022 유전자의 일부 염기 서열 및 표적 유전자간부위의 상부 단편 서열, trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위의 하부 단편 서열 및 dr_C0023 유전자의 일부 염기 서열을 포함하는 pAM5 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 5는 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주를 IPTG가 포함된 배지에서 배양하여 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주(DrCre)를 제조하는 과정을 나타낸 도이다.
도 6a는 야생형 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(WT), pAM5 플라스미드의 도입으로 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(DrCreKm) 및 IPTG에 의해 cre 재조합 효소가 발현되어 카나마이신 저항성 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(DrCre)의 변이 부위를 PCR 증폭한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 도 6a의 균주를 카나마이신이 포함된 TGY 배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 TGY 배지에서 배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 IPTG에 의해 cre 재조합 효소가 발현되어 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(DrCre), crtB 및 crtI 유전자가 결실(deletion)되고 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거되지 않은 균주(△crtBI_Km) 및 crtB 및 crtI 유전자가 결실(deletion)되고 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 균주(△crtBI)를 카나마이신이 포함된 TGY 배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 TGY 배지에서 배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 IPTG에 의해 cre 재조합 효소가 발현되어 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주(DrCre)와 상기 균주에서 crtB 및 crtI 유전자가 결실(deletion)된 균주의 색을 비교한 도이다.
도 8a는 야생형 메틸로모나스 속 DH-1 균주(WT), pAM6 플라스미드의 도입으로 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 메틸로모나스 속 DH-1 균주(DH-1:Km) 및 IPTG에 의해 cre 재조합 효소가 발현되어 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 메틸로모나스 속 DH-1 균주(DH-1:cre)를 전기영동한 결과를 나타낸 도이다.
1 : 야생형 메틸로모나스 속 DH-1 균주(WT)
2 : DH-1:Km
3 : DH-1:cre
도 8b는 도 8a의 균주를 카나마이신이 포함된 NMS 배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 NMS 배지에 배양한 결과를 나타낸 도이다.
1 : 야생형 메틸로모나스 속 DH-1 균주(WT)
2 : DH-1:Km
3 : DH-1:cre
도 9는 메틸로모나스 속 DH-1 AYM39_00230 유전자의 일부 염기 서열 및 표적 유전자간부위의 상부 단편 서열, trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위의 하부 단편 서열 및 AYM39_00235 유전자의 일부 염기 서열을 포함하는 pAM6 플라스미드를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표적 유전자간부위(intergenic region)의 상부 단편 서열, trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위(intergenic region)의 하부 단편 서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "유전자간부위(intergenic region)"는 유전자가 모여 있는 부분 사이에 위치한 DNA 서열로, 단백질을 코딩하지 않는 DNA 서열을 의미한다. 이는 진핵생물의 유전자 내에서 발견되는 짧고 단백질을 코딩하지 않는 부위인 인트론(비발현부위, intron, intragenic region)과 다른 것으로, 일부 유전자간부위는 인접한 유전자의 발현을 조절하기도 하지만 대부분은 그 기능이 알려져 있지 않다. 유전자간부위는 총체적으로 정크 DNA라고 불리는 DNA 서열 중 하나이나, 최근 프로모터나 인핸서의 DNA 서열을 포함하는 것으로 알려지며 모든 유전자간부위가 정크 DNA가 아님이 밝혀지고 있다.
상기 유전자간부위(intergenic region)는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 dr_C0021 유전자와 dr_C0022 유전자 사이에 위치한 DNA 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유전자간부위(intergenic region)는 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 AYM39_00230 유전자와 AYM39_00235 유전자 사이에 위치한 DNA 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표적 유전자간부위의 상부 단편 서열은 dr_C0022 유전자의 염기 서열의 일부와 표적 유전자간부위의 5' 상류 부위를 포함하는 770bp의 염기 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표적 유전자간부위의 상부 단편 서열은 AYM39_00230 유전자의 염기 서열의 일부와 표적 유전자간부위의 5' 상류 부위를 포함하는 820bp의 염기 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표적 유전자간부위의 하부 단편 서열은 표적 유전자간부위의 하류 부위와 dr_C0023 유전자의 염기 서열의 일부를 포함하는 710bp의 염기 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표적 유전자간부위의 하부 단편 서열은 표적 유전자간부위의 하류 부위와 AYM39_00235 유전자의 염기 서열의 일부를 포함하는 810bp의 염기 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라아제(RNA polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다. 구체적으로, "프로모터"란, 전사개시점 (+1) 부터 20~30번째 염기에 대해 상류에 위치하고, 정확한 위치로부터 RNA 폴리머라아제에 전사를 개시시키는 기능을 담당하는 TATA 박스 또는 TATA 박스 유사의 영역이 포함되지만, 반드시 이들 영역의 전후에 한정되는 것은 아니고, 이 영역 이외에 발현조절을 위해 RNA 폴리머라아제 이외의 단백질이 회합하기 위해 필요한 영역을 포함할 수 있다. 프로모터는 외래 유전자인 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동 가능하게 연결되어 있으며 여기서, "작동 가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 사용되는 프로모터는 Kat 프로모터 또는 trc 프로모터 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Kat 프로모터"는 KatE1 (NCBI acc. number: 1800077) 유전자의 상류(upstream) 부위 101bp를 포함하는 염기서열 (서열번호 1)인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "trc 프로모터"는 ptrc99a 플라스미드 (Pharmarcia Biotech, Uppsala, Sweden)에 포함된 74bp의 염기 서열(서열번호 2)인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Cre 단백질을 암호화하는 서열"은 Cre 재조합 효소를 발현하는 DNA 서열을 의미하며, pAM2 플라스미드(Jeong et al., Korean J. Chem. Eng. 34:1728-1733, 2017)에 포함된 1032bp의 염기 서열(서열번호 25)인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "lox 염기 서열"은 lox 66(서열번호 26) 또는 lox71(서열번호 27)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "선별 마커(selective marker)" 란 특정 유전자의 산물을 의미한다. 상기 산물을 포함하는 미생물은 이를 포함하지 않는 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 가짐으로써, 이에 의해 미생물의 구별을 가능하게 한다.
상기 선별 마커는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항생제 저항성 관련 단백질"은 세균이 특정한 항생제의 영향을 받지 않고 증식할 수 있게 하는 단백질로 항생제 분해 효소일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 항생제 분해 효소의 예로, Streptomyces clavuligerus가 가지고 있는 베타락탐분해효소(β-lactamase)를 들 수 있다. 베타락탐분해효소(β-lactamase)는 베타락탐계(β-lactams) 항생제의 베타락탐 환을 절단하는 가수분해 효소이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열"은 상기 항생제 저항성 관련 단백질을 발현하는 DNA 서열을 의미한다.
상기 항생제는 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "lacΙq 단백질을 암호화하는 서열"은 억제 조절 단백질 (repressor protein)을 발현하는 DNA 서열로, 일반적인 배양조건에서 trc 프로모터에 결합하여 RNA polymerase와의 결합을 방해하고, trc 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 억제하는 역할을 하는 조절 단백질이며, ptrc99a 플라스미드에 포함된 1,092 bp의 염기서열(서열번호 3)인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "Cre-lox 시스템"은 DNA의 특정 부위에서 결실, 삽입, 전좌 및 역위를 수행하는데 사용되는 위치특이적 재조합 효소기술 을 의미한다. 상기 Cre-lox 시스템은 진핵 및 원핵 생물의 유전자로부터 돌연변이를 유발시키는데 사용가능하다. 이는 단일 효소인 Cre 재조합 효소로 구성되어 있고, 짧은 표적 서열인 lox 서열을 재조합한다. 돌연변이를 유발시키고자 하는 위치에 lox 서열을 적절히 배치함으로써, 표적 유전자가 활성화 또는 억제되거나, 다른 유전자와 치환될 수도 있다. 일반적으로 lox P는 34개의 염기로 구성된 박테리오파지 P1 부위로 비대칭인 8 bp의 염기 서열을 포함하고, 중앙에 2개의 염기를 제외하고는, 13 bp 크기인 2쌍의 회문구조(palimdromic)를 갖는다(ATAACTTCGTATANNNTANNN-TATACGAAGTTAT).
본 발명에서 사용되는 용어 "형질전환"이란 특정 외래의 DNA 가닥을 세포 밖에서 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 가닥을 포함한 숙주 미생물은 ‘형질 전환된 미생물’이라 한다. DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미하는 '형질전환'은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하거나 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 염색체에 통합 완성시켜 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector)를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 플라스미드 (plasmid) 및 벡터 (vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합(cloning) 기술로 제조할 수 있으며, 부위 특이적 DNA 서열의 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 제한효소(restriction enzyme) 및 DNA 리가아제(DNA ligase)를 사용할 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus) 벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus) 벡터, RSV(Rous sarcoma virus) 벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터, 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 플라스미드 벡터일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제한 효소(restriction enzyme)는 특정한 DNA 서열에 결합하여 DNA 서열을 절단하는 효소를 통칭한다.
또한, 본 발명은 1) 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 균주 내에 도입하는 단계; 및
2) 상기 균주의 표적 유전자간부위(intergenic region)에 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입되는 단계;를 포함하는 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 균주는 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.), 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus subtilis), 데이노코쿠스 라디오두란스(D. radiodurans), 데이노코쿠스 인디쿠스(D. indicus), 데이노코쿠스 카에니(D. caeni), 데이노코쿠스 아쿠아티쿠스(D. aquaticus), 데이노코쿠스 디폴리머란스(D. depolymerans), 데이노코쿠스 그란디스(D. grandis), 데이노코쿠스 데죠네시스(D. daejeonensis), 데이노코쿠스 라디오톨러란스(D. radiotolerans), 데이노코쿠스 지오써말리스(D. geothermalis), 데이노코쿠스 루버(D. ruber), 데이노코쿠스 안타티커스(D. antarcticus), 데이노코쿠스 프로테오리티쿠스(D. proteolyticus), 데이노코쿠스 라디오푸그난스(D. radiopugnans), 데이노코쿠스 라디오필러스(D. radiophilus), 데이노코쿠스 셀룰로실리티쿠스(D. cellulosilyticus) 및 데이노코쿠스 스웬시스(D. swuensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 전체 염기 서열이 공지되어 있는 모든 미생물일 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 균주 내에 도입하는 단계;
2) 상기 균주의 표적 유전자간부위(intergenic region)에 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입되는 단계; 및
3) IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 배지에 배양하여 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 제거하는 단계를 더 포함하는 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 제거는 Cre 재조합 효소의 발현을 통해 수행될 수 있다.
상기 IPTG의 농도는 0.5mM 내지 1.0mM일 수 있고, 바람직하게는 1.0mM일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주에 항생제 내성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 함유한 lox 핵산단편의 양 말단에 각각 표적 서열의 상부 단편 서열과 하부 단편 서열이 결합된 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변이 균주의 목적유전자를 변형하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "표적 서열"은 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 표적 유전자의 일부분, 예를 들어, 표적 유전자의 하나 이상의 엑손 서열, 표적 유전자의 인트론 서열 또는 조절 서열, 또는 표적 유전자의 엑손 및 인트론 서열, 인트론 및 조절 서열, 엑손 및 조절 서열, 또는 엑손, 인트론 및 조절 서열의 조합을 가리킨다.
상기 목적 유전자는 crtB 및 crtI일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표적 서열의 상부 단편 서열은 0.5 내지 1kb일 수 있고, 바람직하게는 1kb일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표적 서열의 하부 단편 서열은 0.5 내지 1kb일 수 있고, 바람직하게는 1kb일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 함유한 lox 핵산 단편은 lox66, kat 프로모터, 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lox71을 순차적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항생제는 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 목적유전자가 변형된 변이 균주를 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 배지에 배양하여 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 제거는 Cre 재조합 효소의 발현을 통해 수행될 수 있다.
상기 IPTG의 농도는 0.5mM 내지 1.0mM일 수 있고, 바람직하게는 1.0mM일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 변형은 목적유전자 서열의 치환, 결실 또는 목적 서열을 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 데이노코쿠스 라디오두란스 dr_C0022 유전자와 dr_C0023 유전자간부위(intergenic region)에 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주를 제조하고(도 5), 상기 균주를 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 배지에 배양하여 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 변이 균주를 수득하여 이를 유전체 개량을 위한 기본 변이 균주(DrCre)로 명명하였다. 상기 변이 균주를 이용하여, 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 함유한 lox 핵산 단편의 양 말단에 각각 crtB의 일부 서열과 crtI의 일부 서열이 결합된 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변이 균주의 crtB 및 crtI 유전자를 결실시키고, IPTG가 첨가된 배지에 배양하여 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 제거하여, crtB 및 crtI 유전자와 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 모두 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 수득한바, 상기 기본 변이 균주를 이용하여 균주의 유전체를 개량할 수 있음을 확인하였다(도 7a 및 도 7b). 또한, Cre 재조합 효소를 안정적으로 발현하는 메틸로모나스 속 DH-1 변이 균주를 수득하여 균주의 종류에 관계없이 본 발명의 유전체 개량 방법을 적용할 수 있음을 확인하였다(도 8a 및 도 8b).
따라서, 본 발명의 기본 변이 균주(DrCre 및 DH-1:Cre)를 목적 유전자를 변형하는 방법에 이용할 경우, 형질 전환된 균주를 선별하기 위해 인위적으로 도입한 선별 마커(selective marker)를 제거하기 위해 별도의 플라스미드를 도입하고 이를 제거하기 위한 과정을 거칠 필요가 없어, 목적 유전자를 간편하고 효율적으로 변형할 수 있으며 나아가, 기초 연구를 위한 미생물의 유전체 변이 균주를 제작하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드(pAM3)의 제작
trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드(pAM3)를 하기의 방법으로 제조하였다.
먼저, pAM2 플라스미드(Jeong et al., Korean J. Chem. Eng. 34:1728-1733, 2017; 특허등록번호, 10-1835852)를 주형으로 하여 하기 표 1에 기재된 염기 서열을 갖는 CreF(서열번호 5) 및 CreR(서열번호 6) 프라이머를 이용하여 Cre 단백질을 암호화하는 서열을 증폭시켰다. 구체적으로, 1 ㎕의 pAM2, 각각 1 ㎕의 CreF와 CreR 프라이머 (10 pmole/㎕) 및 17 ㎕의 멸균증류수의 혼합물을 pfu 폴리머라아제 믹스(Bioneer)에 첨가한 뒤, 이를 T-100 Thermal cycler DNA 증폭기(Bio-rad)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 뒤, 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 2분의 반응과정을 1회로 하여 이를 25회 반복함으로써 수행되었다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(5'-3') |
| 서열번호 5 | CreF | gatcgaattcatgtccaatttactgcccgta |
| 서열번호 6 | CreR | gatcgtcgacctaatcgccatcttccagca |
수득한 PCR 산물을 1% 아가로오스 겔에서 120V의 전압을 걸어 20분 동안 전기영동하여 확인하고, 이를 1.5ml 튜브에 넣고 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 상기 수득한 PCR 산물과 pTrc99a 플라스미드(Invitrogen)를 완충용액 5 ㎕, EcoRI 1 ㎕, SalI 1 ㎕, PCR 산물 또는 pTrc99a DNA 용액 20 ㎕, 그리고 멸균 증류수 23 ㎕를 1.5 ml 튜브에 첨가하여 37℃에서 6시간 동안 반응시켜 각각 EcoRI와 SalI 제한효소로 절단하였다. 그 후, 제한효소 처리된 PCR 산물 7 ㎕와 pTrc99a 1 ㎕, T4 DNA ligase (Enzynomics) 1 ㎕, 완충용액 1 ㎕ 를 1.5 ml 튜브에 첨가하여 16℃에서 8시간 반응시켜 결찰(ligation)시켰다. DNA 결찰 혼합용액은 대장균 (E. coli DH5α)에 형질전환하고, 형질전환 된 대장균으로부터 plasmid preparation kit (intron lifetechnology사)를 이용하여 제조사에 권고된 방법으로 플라스미드 DNA를 추출하고 해당 염기서열을 분석하여 최종적으로 클로닝된 플라스미드를 확인하였으며 이를 pAM3 (서열번호 7) 플라스미드로 명명하였다 (도 2b).
<실시예 2> trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 loxP 염기 서열을 포함하는 카나마이신 (kanamycin) 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드(pAM4)의 제작
trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 loxP 염기 서열을 포함하는 카나마이신 (kanamycin) 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드(pAM4)를 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
<2-1> trc 프로모터를 포함하는 Cre 단백질을 암호화하는 서열의 수득
trc 프로모터를 포함하는 Cre 단백질을 암호화하는 서열을 수득하기 위해, 상기 실시예 1의 방법으로 제조한 pAM3 플라스미드를 주형으로 사용하고, 하기 표 2에 기재된 염기서열을 갖는 trcCreF(서열번호 8) 및 trcCreR(서열번호 9) 프라이머를 이용하여 trc 프로모터를 포함하는 Cre 단백질을 암호화하는 서열을 증폭시켰다. 구체적으로, 2 ㎕의 pAM3, 각각 1 ㎕의 trcCreF 및 trcCreR 프라이머 2 ㎕ (10 pmole/㎕) 및 멸균증류수 16 ㎕를 AccuPowerTM pfu PCR premix mix (Bioneer사)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, trc 프로모터가 포함된 Cre 단백질을 암호화하는 서열의 PCR 산물을 수득하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(5'-3') |
| 서열번호 8 | trcCreF | ctagggtaccgccgacatcataacggttct |
| 서열번호 9 | trcCreR | gatcctcgagtgtcctactcaggagagcgt |
<2-2> 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 수득
양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 수득하기 위해, 도 2a의 pAM1(Jeong et al., 2017 Korean J. Chem. Eng.,4June 2017, Volume 34, Issue 6, pp 1728-1733이고, 등록특허 10-1835852)를 주형으로 사용하고, 하기 표 3에 기재된 염기 서열을 갖는 loxKmF(서열번호 10) 및 loxKmR(서열번호 11) 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 PCR 산물을 수득하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(5'-3') |
| 서열번호 10 | loxKmF | ggtaccgggccccccctcgaggtc |
| 서열번호 11 | loxKmR | ctctagaggatcctaccgttcgta |
<2-3> lacΙq 단백질을 암호화하는 서열의 수득
lacΙq 단백질을 암호화하는 서열을 수득하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 pAM3 플라스미드를 주형으로 사용하고, 하기 표 4에 기재된 lacΙqF(서열번호 12) 및 lacΙqR(서열번호 13)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, lacΙq 단백질을 암호화하는 서열의 PCR 산물을 수득하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(5'-3') |
| 서열번호 12 | lacΙqF | ctagggatcctcctgcgttatcccctgatt |
| 서열번호 13 | lacΙqR | taacgtcgactctagatcactgcccgctttccagtc |
<2-4> trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 (kanamycin) 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드(pAM4)의 제작
상기 실시예 2-1로 수득한 trc 프로모터가 포함된 Cre 단백질을 암호화하는 서열의 PCR 산물은 제한효소 KpnI과 XhoI으로 절단하고, 상기 실시예 2-2로 수득한 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 PCR 산물은 제한효소 KpnI과 XbaI로 절단하였으며, 상기 실시예 2-3로 수득한 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열의 PCR 산물은 제한효소 BamHI과 SalI로 절단하여 모두 pUC19 플라스미드(서열번호 36)에 결찰(ligation)시켜 제조한 플라스미드를 pAM4(서열번호 4)로 명명하였다(도 3).
<실시예 3> trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주(DrCreKm)의 제조
<3-1> 표적 유전자간부위(intergenic region)의 상부 단편 서열, trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위(intergenic region)의 하부 단편 서열을 포함하는 플라스미드(pAM5)의 제작
데이노코쿠스 라디오두란스의 DNA를 주형으로 하여, drC0022 유전자와 유전자간부위의 일부 서열을 포함하는 770bp의 염기 서열은 하기 표 5의 drc0022upF(서열번호 14) 및 drc0022upR(서열번호 15)의 프라이머, 유전자간부위의 일부 서열과 drC0023 유전자를 포함하는 710bp의 염기 서열은 하기 표 5의 drc0023dnF(서열번호 16) 및 drc0023dnR(서열번호 17)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, drC0022 유전자와 유전자간부위의 일부 서열을 포함하는 770bp의 염기 서열 및 유전자간부위의 일부 서열과 drC0023 유전자를 포함하는 710bp의 염기 서열의 PCR 산물을 수득하였다.
drC0022 유전자와 유전자간부위의 일부 서열을 포함하는 770bp의 염기 서열의 PCR 산물은 제한효소 NdeI 및 KpnI로 절단하고, 유전자간부위의 일부 서열과 drC0023 유전자를 포함하는 710bp의 염기 서열의 PCR 산물은 제한효소 SalI 및 SphI으로 절단하여 상기 실시예 2-4의 방법으로 제작된 pAM4 플라스미드에 결찰시켜 pAM5 플라스미드(서열번호 18)을 제조하였다(도 4).
| 서열번호 | 이름 | 서열(5'-3') |
| 서열번호14 | drc0022upF | atcgcatatgggtgcgcatctcaagtcttg |
| 서열번호15 | drc0022upR | ctagggtaccggcctgtcactgtgattaag |
| 서열번호16 | drc0023dnF | ctgggtcgaccggagcatgacctaagaggt |
| 서열번호17 | drc0023dnR | tacggcatgcggtgatcgcgagttggcgtt |
<3-2> trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주의 제조
먼저, 데이노코쿠스 라디오두란스(ATCC 13939, 농업유전자원정보센터, 한국) 균주를 TGY 배지(0.5%(w/v)의 트립톤, 0.1%(w/v)의 글루코오스 및 0.3%(w/v)의 효모 추출물)을 이용하여 30℃의 온도에서 OD(optical density) 600nm의 값이 0.3에 도달할 때까지 배양하였다. 배양한 세포를 4000rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하여 30 mM의 칼슘클로라이드(CaCl2)가 포함된 2x TGY 배지에 현탁한 뒤, 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 정치시켰다. 이를 다시 4000rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 30 mM의 칼슘클로라이드(CaCl2) 및 10%(v/v) 글리세롤이 포함된 TGY배지를 첨가하여 재현탁 한 뒤, 멸균된 1.5 ml 튜브에 50 ㎕씩 분주하여 준비하였다.
준비된 데이노코쿠스 라이오두란스 균주 50 ㎕에 상기 실시예 3-1에서 제조한 pAM5 플라스미드 DNA 10 ㎕와 30 mM 칼슘클로라이드 (CaCl2)가 포함된 2 X TGY 용액을 첨가하고 얼음에서 30분 동안 정치시킨뒤, 32℃에서 1.5시간 반응시켰다. 그 후, 2 X TGY 용액 900 ㎕를 첨가하여 30℃에서 16시간 배양한 뒤, 25 ㎍/ml의 카나마이신 항생제가 포함된 2 X TGY agar 배지(1%(w/v)의 트립톤, 0.2%(w/v)의 Glucose , 0.6%(w/v)의 효모 추출물 및 1.5%(w/v)의 Bactoagar)에 200 ㎕ 도말하여 30℃ 배양기에서 3 내지 4일 동안 정치배양하였다. 최종적으로 25 ㎍/ml의 카나마이신 항생제가 포함된 2 X TGY agar 배지에서 집락 (colony)을 형성한 trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주는 진단 PCR 및 염기서열분석으로 확인하고, 최종 선별된 균주를 DrCreKm으로 명명하였다 (도 5).
<실시예 4> trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주로부터 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 제거
상기 실시예 3-2에서 제조된 DrCreKm 균주로부터 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 제거하기 위하여 하기의 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-2에서 제조된 DrCeKm 균주를 카나마이신을 첨가하지 않은 3 mL의 TGY배지에 30 ℃에서 16시간 진탕 배양한 후 OD(optical density) 600nm의 값이 0.25가 될 때까지 1 mM isoprophyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여 동일한 배양조건에서 16시간동안 추가 배양하였다. 그 후, 배양액을 1/1000로 희석하여 10 mM IPTG가 포함된 TGY agar 배지에 도말한 뒤 콜로니가 형성될 때까지 30℃에서 정치배양 하였다. TGY agar 배지에 형성된 각각의 단일 집락(colony)을 멸균된 팁(tip)을 이용하여 카나마이신이 포함된 TGY agar 배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 TGY agar 배지에 동시에 접종하였다. 그 후 카나마이신이 포함된 배지에서는 생장할 수 없고 카나마이신이 포함되지 않는 TGY agar 배지에서만 생장할 수 있는 균주를 최종 선별하였다(도 5, 도 6a 및 도 6b).
최종선별 된 균주는 진단 PCR과 염기서열 분석 그리고 plate assay를 통해 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주로부터 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 것을 확인 하였고, 상기 균주는 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체 개량을 위한 기본 변이 균주(DrCre)로 명명하였다 (도 5, 도 6a 및 도 6b).
<실시예 5>
crtB
및
crtI
유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 제조
상기 실시예 4에서 수득한 변이 균주를 이용해 균주의 유전체를 개량할 수 있는지 확인하기 위하여, 카로테노이드 생합성 경로에 관계된 파이토엔 합성 효소를 코딩하는 crtB 유전자와 파이토엔 불포화효소를 코딩하는 crtI 유전자를 결실(deletion)시키는 하기의 실험을 수행하였다.
<5-1> crtB 및 crtI 염기 서열의 수득
데이노코쿠스 라디오두란스 DNA를 주형으로 하여, crtB 유전자를 포함하는 염기 서열 1010bp(서열번호 28)은 하기 표 6의 dr6162-1(서열번호 19) 및 dr6162-2(서열번호 20)의 프라이머, crtI 유전자를 포함하는 염기서열 820bp(서열번호 29)은 하기 표 6의 dr6162-5(서열번호 23) 및 dr6162-6(서열번호 24)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, crtB 및 crtI 유전자의 PCR 산물을 각각 수득하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(5'→3') |
| 서열번호19 | dr6162-1 | aagtagtcgggcgtgatgaa |
| 서열번호20 | dr6162-2 | agcttatcgataccgtcgacggcacgtatttcgactacga |
| 서열번호21 | dr6162-3 | tcgtagtcgaaatacgtgccgtcgacggtatcgataagct |
| 서열번호22 | dr6162-4 | attctggacgacctcgaacgcatgcctgcaggtcgactct |
| 서열번호23 | dr6162-5 | agagtcgacctgcaggcatgcgttcgaggtcgtccagaat |
| 서열번호24 | dr6162-6 | tcaccgtgacggactattca |
<5-2> lox 염기 서열을 양 말단에 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 증폭
pAM1 플라스미드를 주형으로 하여, lox71 및 lox66 유전자를 양 말단에 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 상기 표 6에 기재된 dr6162-3(서열번호 21) 및 dr6162-4(서열번호 22)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1의 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, lox71 및 lox66 유전자를 양 말단에 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 PCR 산물을 수득하였다.
<5-3> crtB 및 crtI 염기 서열과 lox 염기 서열을 양 말단에 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 연결
먼저, 실시예 5-1 및 5-2에서 수득된 PCR 산물을 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 각각 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 상기 표 6에 기재된 dr6162-1(서열번호 19) 및 dr6162-6(서열번호 24) 프라이머를 사용한 것과 PCR 과정에서 72℃ 4분 동안 반응시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, crtB 및 crtI 염기 서열과 lox 염기 서열을 양 말단에 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 연결된 2450bp의 PCR 산물을 수득하였다.
<5-4> crtB 및 crtI 유전자가 결실된 변이 균주의 제조
먼저, 상기 실시예 4에서 제조한 기본 변이 균주(DrCre)를 TGY 배지(0.5%(w/v)의 트립톤, 0.1%(w/v)의 글루코오스 및 0.3%(w/v)의 효모 추출물)를 이용하여 30℃의 온도에서 OD(optical density) 600nm의 값이 0.3에 도달할 때까지 배양하였다. 배양한 세포를 4000rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하여 30 mM의 칼슘클로라이드(CaCl2)가 포함된 2x TGY 배지에 현탁한 뒤, 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 정치시켰다. 이를 다시 4000rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 30 mM의 CaCl2 및 10%(v/v) 글리세롤이 포함된 50 ㎕의 TGY 배지를 첨가하여 재현탁한 뒤, 멸균된 15 ㎖ 튜브에 50 ㎕ 씩 분주하여 준비하였다.
한편, 실시예 5-3에서 수득한 PCR 산물은 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하고, 이를 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다.
준비된 상기 실시예 4에서 제조한 기본 변이 균주(DrCre) 50 ㎕에 상기 실시예 5-3에서 제조한 DNA 10 ㎕와 30 mM 칼슘클로라이드 (CaCl2)가 포함된 2 X TGY 용액을 첨가하고 얼음에서 30분 동안 정치시킨뒤, 32℃에서 1.5시간 반응시켰다. 그 후, 2 X TGY 용액 900 ㎕를 첨가하여 30℃에서 16시간 배양한 뒤, 25 ㎍/ml의 카나마이신 항생제가 포함된 2 X TGY agar 배지(1%(w/v)의 트립톤, 0.2%(w/v)의 Glucose , 0.6%(w/v)의 효모 추출물 및 1.5%(w/v)의 Bactoagar)에 200 ㎕ 도말하여 30℃ 배양기에서 3 내지 4일 동안 정치배양하였다. 최종적으로 25 ㎍/ml의 카나마이신 항생제가 포함된 2 X TGY agar 배지에서 집락 (colony)을 형성한 crtB 및 crtI 유전자가 결실되고 lox 염기 서열을 양 말단에 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 포함된 균주를 수득하였다(도 7a).
그 결과, 도 7b에 나타난 바와 같이 crtB 및 crtI 유전자가 결실, 카로티노이드가 합성되지 않아 주황색을 띄지 않는 변이 균주를 수득하였고, 이를 △crtBI_Km으로 명명하였다(도 7b).
<5-5> crtB, crtI 및 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 모두 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
상기 실시예 5-4에서 수득한 △crtBI_Km 균주에 포함된 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 제거는 상기 실시예 4에서 제조한 DrCre 변이 균주에 도입된 Cre 단백질을 암호화하는 서열이 발현되어 Cre 재조합 효소가 생산됨과 동시에 제거된다.
구체적으로, 상기 실시예 5-2에서 제조한 △crtBI_Km 균주를 TY (트립톤 0.5%, 효모추출물 0.3%) 액체배지에서 16 시간 이상 배양하고, 1 mM의 IPTG가 첨가된 새로운 3 mL TY 액체배지에 30 ㎕의 △crtBI_Km 균주의 배양액을 첨가하여 37℃에서 16시간 이상 추가 배양하였다. 배양액을 멸균수에 1:10000 배율로 희석한 뒤, 1 mM IPTG가 포함된 TY 고체배지에 50 ㎕의 희석액을 균일하게 도말하고 37℃ 배양기에 3일간 정치 배양하였다. TY 고체배지에 형성된 각각의 단일 집락 (single colony)들을 멸균 팁(tip)을 이용하여 25 ㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 TY 고체배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 TY 고체배지에 동시에 접종한 후 37℃에서 1일간 배양하였다. 그 후, 도 7a와 같이 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서만 생장하는 단일 콜로니를 최종적으로 선별하고, crtB, crtI 및 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 모두 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 △crtBI 으로 명명하였다(도 7b). 상기 결과를 통해 실시예 4에서 제조한 유전체 개량을 위한 기본 변이 균주(DrCre)를 이용하여 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열과 목적 유전자가 모두 제거된 변이 균주를 수득할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 6> Cre 재조합 효소를 발현하는 메틸로모나스 속
(Methylomonas sp.)
DH-1 변이 균주의 제조
그람 양성균(gram-positive)인 데이노코쿠스 라디오두란스 균주 뿐 아니라 그람 음성균(gram-negative)인 메틸로모나스 속 균주를 이용하여 Cre 재조합 효소(Cre recombinase)를 발현하는 변이 균주(DH-1:Cre)를 하기의 방법으로 제조하였다.
<6-1> 메틸로모나스 속 DH-1 균주의 유전자를 포함하는 플라스미드(pAM6)의 제작
<6-1-1> AYM39_00230 유전자 및 AYM39_00235 유전자를 포함하는 플라스미드의 제작
메틸로모나스 속 DH-1의 DNA를 주형으로 하여, AYM39_00230 유전자와 유전자간부위의 일부 서열을 포함하는 820bp의 염기 서열(서열번호 38)은 하기 표 7의 DH1 intRG-1(서열번호 30) 및 DH1 intRG-2(서열번호 31)의 프라이머, 유전자간부위의 일부 서열과 AYM39_00235 유전자를 포함하는 810bp의 염기 서열(서열번호 39)은 하기 표 7의 DH1 intRG-3(서열번호 32) 및 DH1 intRG-4(서열번호 33)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다.
그 결과, AYM39_00230 유전자와 유전자간부위의 일부 서열을 포함하는 820bp의 염기 서열 및 유전자간부위의 일부 서열과 AYM39_00235 유전자를 포함하는 810bp의 염기 서열의 PCR 산물을 수득하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열(5'-3') |
| 서열번호30 | DH1 intRG-1 | ctagggtacctgagttcgtattctgagccg |
| 서열번호31 | DH1 intRG-2 | cgttatgatgcagcgcttcaaggcctagtgacgcaagttcggctat |
| 서열번호32 | DH1 intRG-3 | atagccgaacttgcgtcactaggccttgaagcgctgcatcataacg |
| 서열번호33 | DH1 intRG-4 | ctagggtaccacgaacacgcctgtgatact |
수득한 두 PCR산물을 주형으로 하여, 상기 표 7의 DH1 intRG-1 프라이머(서열번호 30)와 DH1 intRG-4 프라이머(서열번호 33)를 사용하는 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여 두 PCR산물을 연결하여 최종적으로 1,656 bp의 염기 서열을 가진 PCR 산물을 수득하였다. 1,656 bp의 염기서열을 가진 PCR 산물은 제한효소 KpnI으로 절단하여 동일한 제한 효소로 절단된 pUC19 플라스미드(서열번호 34)에 결찰시켜, AYM39_00230 유전자 일부 서열 및 AYM39_00235 유전자의 일부 서열을 포함하는 플라스미드(서열번호 40)를 제작하였다.
<6-1-2> 표적 유전자간부위(intergenic region)의 상부 단편 서열, trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위(intergenic region)의 하부 단편 서열을 포함하는 플라스미드(pAM6)의 제작
AYM39_00230 유전자 일부 서열 및 AYM39_00235 유전자의 일부 서열 사이에 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacIq 단백질을 암호화하는 서열을 삽입하기 위하여 pAM5 플라스미드를 주형으로 하기 표 8의 trcCreF2(서열번호 35) 및 lacIqR2(서열번호 36) 프라이머를 이용하여 상기 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 4,118 bp의 PCR 산물을 수득하였다. 수득한 4118 bp의 PCR 산물과 상기 실시예 6-1-1에서 제작한 AYM39_00230 유전자 일부 서열 및 AYM39_00235 유전자의 일부 서열을 포함하는 플라스미드를 각각 StuI 제한효소로 처리하고 결찰시켜 pAM6 플라스미드 (서열번호 37)를 제작하였다(도 9).
| 서열번호 | 이름 | 서열(5'-3') |
| 서열번호35 | trcCreF2 | ctagaggcctgccgacatcataacggttct |
| 서열번호36 | lacIqR2 | taacaggccttcactgcccgctttccagtc |
<6-2> trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 메틸로모나스 속 DH-1 변이 균주(DH-1:Km)의 제조
먼저, 메틸로모나스 속 DH-1(Hur et al., J Chem Technol Biotechnol 2017; 92: 311-318, 등록특허 1017149670000) 균주를 하기 표 9의 조성으로 구성된 NMS 배지(Nitrate mineral salts)가 포함된 플라스크에 접종한 뒤 플라스크를 스크루 뚜껑을 이용하여 밀폐하였다. 진공펌프를 이용하여 플라스크 내부에 메탄가스를 30% 농도가 되도록 채워 넣고 30℃에서 OD(optical density) 600nm의 값이 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 배양한 세포를 4,000 rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리한 뒤 멸균된 3차 증류수에 현탁하였다. 현탁액을 다시 동일한 조건에서 원심분리하여 상등액을 제거하고 멸균된 3차 증류수에 재현탁 한 뒤 멸균된 1.5 ml 튜브에 200 ㎕씩 분주하였다.
준비된 메틸로모나스 속 DH-1 균주 200 ㎕에 상기 실시예 6-1-2에서 제조한 pAM6 플라스미드 DNA 1.0 ㎍을 첨가한 뒤 0.2 cm gap 크기를 가진 Electroporation cuvette (Gene Pulser®™, MicroPulser™, Bio-Rad, 미국)에 옮겼다. Micropulser electroporator (Bio-Rad, 미국)를 이용하여 2.5 kV 조건에서 electroporation하여 DNA를 도입하고 10ml NMS 배지가 들어있는 멸균된 세럼병에 옮겨 밀폐하였다. 세럼병 내부에 메탄가스를 30% 농도가 되도록 채워 넣고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양한 세포를 4,000 rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 200 ㎕ NMS 배지에 재현탁한 뒤 2.5 mg/L의 카나마이신 항생제가 포함된 NMS agar 배지에 도말하였다. NMS agar배지를 혐기성 세균을 배양할 때 사용하는 Anaerobic jar (Oxoid, 영국)에 넣고 밀폐하였고, 진공펌프를 이용하여 anaerobic jar 내부 기체의 30%를 제거한 뒤 동일한 양의 멸균된 메탄가스를 채워 넣었다. 30℃ 배양기에서 6일 내지 7일 동안 정치 배양한 후 2.5 mg/L의 카나마이신이 포함된 NMS agar 배지에서 집락 (colony)을 형성한 trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 변이 균주를 진단 PCR 및 염기 서열 분석으로 확인하였다. 최종 선별된 균주를 DH-1:Km으로 명명하였다(도 8a 및 도 8b).
| 성분 (입수처) | 최종 농도 |
| MgSO4*7H2O (DAEJUNG, 대한민국) | 1 g/ℓ |
| KNO3 (JUNSEI, 일본) | 1 g/ℓ |
| CaCl2*H2O (JUNSEI, 일본) | 0.2 g/ℓ |
| 3.8% (w/v) solution Fe-EDTA (DUKSAN, 대한민국) | 0.1 ㎖/ℓ |
| 0.1% (w/v) NaMo*4H2O (DUKSAN, 대한민국) | 0.5 ㎖/ℓ |
| Trace element solution (표 10) | 1.0 ㎖/ℓ |
| Phosphate stock solution (표 11) | 10 ㎖/ℓ |
| Vitamin stock solution (표 12) | 10 ㎖/ℓ |
| CuCl2*2H2O (DAEJUNG, 대한민국) | 1.4 mg/ℓ |
| Bacto agar (필요시) (BD, 미국) | 15 g/ℓ |
| 성분 (입수처) | 최종 농도 |
| FeSO4*7H2O (JUNSEI, 일본) | 500 mg/ℓ |
| ZnSO4*7H2O (JUNSEI, 일본) | 400 mg/ℓ |
| MnCl2*7H2O (SIGMA, 미국) | 20 mg/ℓ |
| CoCl2*6H2O (DAEJUNG, 대한민국) | 50 mg/ℓ |
| NiCl2*6H2O (SAMCHUN, 대한민국) | 10 mg/ℓ |
| H3BO3 (boric acid) (KANTO, 일본) | 15 mg/ℓ |
| EDTA (SAMCHUN, 대한민국) | 250 mg/ℓ |
| 성분 (입수처) | 최종 농도 |
| KH2PO4 (JUNSEI, 일본) | 26 g/ℓ |
| Na2HPO4*7(H2O) (JUNSEI, 일본) | 62 g/ℓ |
| 성분 (입수처) | 최종 농도 |
| Biotin (ACROS, 미국) | 2.0 mg/ℓ |
| Folic acid (SIGMA, 미국) | 2.0 mg/ℓ |
| Thiamine HCl (DAEJUNG, 대한민국) | 5.0 mg/ℓ |
| Ca pantothenate (KANTO, 일본) | 5.0 mg/ℓ |
| Vitamin B12 (SAMCHUN, 대한민국) | 0.1 mg/ℓ |
| Riboflavin (JUNSEI, 일본) | 5.0 mg/ℓ |
| Nicotiamide (SIGMA, 미국) | 5.0 mg/ℓ |
<6-3> trc 프로모터, Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacΙq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입된 메틸로모나스 속 DH-1 변이 균주로부터 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열의 제거
상기 실시예 6-2에서 제조된 DH-1:Km 균주로부터 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 제거하기 위하여 하기의 방법을 수행하였다.
구체적으로, 스크루 뚜껑으로 밀폐된 플라스크에 카나마이신을 첨가하지 않은 50 mL의 NMS 배지를 넣고 1 mM isoprophyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가한 뒤 상기 실시예 6-2에서 제조한 DH-1:Km 균주 500㎕를 접종하여 30 ℃에서 24 시간 동안 진탕 배양하였다. 이 때, 플라스크 내부 기체의 30%는 멸균된 메탄가스로 치환하였다. 배양한 세포를 1/10000로 희석하여 1 mM IPTG가 포함된 NMS agar 배지에 도말한 뒤 콜로니가 형성될 때까지 30% 메탄 가스를 포함하는 anaerobic jar를 이용하여 30℃에서 정치 배양 하였다. NMS agar 배지에 형성된 각각의 단일 집락(colony)을 멸균된 팁(tip)을 이용하여 카나마이신이 포함된 NMS agar 배지 및 카나마이신이 포함되지 않은 NMS agar 배지에 동시에 접종하였다. 그 후 카나마이신이 포함된 배지에서는 생장할 수 없고 카나마이신이 포함되지 않는 NMS agar 배지에서만 생장할 수 있는 균주를 최종 선별하였다(도 8b).
최종선별 된 균주는 진단 PCR과 염기서열 분석 그리고 plate assay를 통해 메틸로모나스 속 DH-1 변이 균주로부터 카나마이신 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된 것을 확인하였고, 상기 균주는 메틸로모나스 속 DH-1 유전체 개량을 위한 기본 변이 균주(DH-1:Cre)로 명명하였다(도 8a 및 도 8b).
따라서, 메틸로모나스 속 DH-1 균주에 유전체 개량을 위한 기본 변이 균주의 제조 방법을 적용할 수 있음을 확인하였다.
<110> University of Seoul Industry Cooperation Foundation
<120> Mutant strain for editing genome of microorganisms, manufacturing
method thereof and method for editing genome of microorganisms
using the same
<130> 2019p-05-026
<160> 40
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> kat promoter
<400> 1
gaattcgagc tcgcatggag accgagggcc cttgacattg agaatgattc tcaatatggt 60
gcagggagct tcgggcctct tgccgcgcag cagagccagc gaggcgaagg agagcat 117
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter
<400> 2
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 3
<211> 1092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laclq
<400> 3
gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat 60
cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa 120
gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg 180
ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg 240
caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg 300
atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa 360
cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa 420
gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac 480
agtattattt tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg 540
ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt 600
ctggctggct ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa 660
ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc 720
gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt 780
accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat atttcggtag tgggatacga cgataccgaa 840
gacagctcat gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg 900
caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag 960
ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc 1020
tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 1080
agcgggcagt ga 1092
<210> 4
<211> 6564
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAM4
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatggg taccgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg 240
acaattaatc atccggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 300
ggaaacagac catggaattc atgtccaatt tactgcccgt acaccaaaat ttgcctgcat 360
taccggtcga tgcaacgagt gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc 420
gccaggcgtt ttctgagcat acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg 480
catggtgcaa gttgaataac cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt 540
atcttctata tcttcaggcg cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc 600
agctaaacat gcttcatcgt cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt 660
cactggttat gcggcggatc cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg 720
ctctagcgtt cgaacgcact gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc 780
gctgccagga tatacgtaat ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta 840
tagccgaaat tgccaggatc agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt 900
taatccatat tggcagaacg aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta 960
gcctgggggt aactaaactg gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc 1020
cgaataacta cctgttttgc cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca 1080
gccagctatc aactcgcgcc ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg 1140
gcgctaagga tgactctggt cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg 1200
gagccgcgcg agatatggcc cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg 1260
gctggaccaa tgtaaatatt gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg 1320
caatggtgcg cctgctggaa gatggcgatt aggtcgacct gcaggcatgc aagcttggct 1380
gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg 1440
gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc 1500
cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag 1560
tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt 1620
tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga cactcgaggt cgacggtatc 1680
gataagcttg atatctaccg ttcgtatagc atacattata cgaagttatg aattcgagct 1740
cgcatggaga ccgagggccc ttgacattga gaatgattct caatatggtg cagggagctt 1800
cgggcctctt gccgcgcagc agagccagcg aggcgaagga gagcatatga gccatattca 1860
acgggaaacg tcttgctcga agccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg 1920
gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg 1980
gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt 2040
tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa 2100
gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac 2160
agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc 2220
agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg 2280
cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga 2340
ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataagct 2400
tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat 2460
ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg 2520
ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa 2580
acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt 2640
gatgctcgat gagtttttct aatcaataac ttcgtatagc atacattata cgaacggtag 2700
gatcctcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 2760
gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa 2820
gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg 2880
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2940
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 3000
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 3060
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc 3120
gcgcgaaggc gaagcggcat gcatttacgt tgacaccatc gaatggtgca aaacctttcg 3180
cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg tgaaaccagt 3240
aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt cccgcgtggt 3300
gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg cgatggcgga 3360
gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt cgttgctgat 3420
tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg cggcgattaa 3480
atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac gaagcggcgt 3540
cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg ggctgatcat 3600
taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc 3660
ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt tctcccatga 3720
agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc aaatcgcgct 3780
gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct ggcataaata 3840
tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga gtgccatgtc 3900
cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg cgatgctggt 3960
tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg ggctgcgcgt 4020
tggtgcggat atctcggtag tgggatacga cgataccgaa gacagctcat gttatatccc 4080
gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt 4140
gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt 4200
gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga 4260
ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagtcgacgc 4320
atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 4380
caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 4440
tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 4500
cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 4560
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 4620
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 4680
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 4740
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 4800
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 4860
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4920
gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4980
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 5040
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 5100
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 5160
ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 5220
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 5280
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 5340
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 5400
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 5460
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 5520
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 5580
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 5640
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 5700
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 5760
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 5820
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 5880
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 5940
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 6000
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 6060
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 6120
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 6180
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 6240
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 6300
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 6360
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 6420
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 6480
gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 6540
ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 6564
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CreF
<400> 5
gatcgaattc atgtccaatt tactgcccgt a 31
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CreR
<400> 6
gatcgtcgac ctaatcgcca tcttccagca 30
<210> 7
<211> 5181
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAM3
<400> 7
gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60
ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120
gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180
tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240
taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcatgtc caatttactg cccgtacacc 300
aaaatttgcc tgcattaccg gtcgatgcaa cgagtgatga ggttcgcaag aacctgatgg 360
acatgttcag ggatcgccag gcgttttctg agcatacctg gaaaatgctt ctgtccgttt 420
gccggtcgtg ggcggcatgg tgcaagttga ataaccggaa atggtttccc gcagaacctg 480
aagatgttcg cgattatctt ctatatcttc aggcgcgcgg tctggcagta aaaactatcc 540
agcaacattt gggccagcta aacatgcttc atcgtcggtc cgggctgcca cgaccaagtg 600
acagcaatgc tgtttcactg gttatgcggc ggatccgaaa agaaaacgtt gatgccggtg 660
aacgtgcaaa acaggctcta gcgttcgaac gcactgattt cgaccaggtt cgttcactca 720
tggaaaatag cgatcgctgc caggatatac gtaatctggc atttctgggg attgcttata 780
acaccctgtt acgtatagcc gaaattgcca ggatcagggt taaagatatc tcacgtactg 840
acggtgggag aatgttaatc catattggca gaacgaaaac gctggttagc accgcaggtg 900
tagagaaggc acttagcctg ggggtaacta aactggtcga gcgatggatt tccgtctctg 960
gtgtagctga tgatccgaat aactacctgt tttgccgggt cagaaaaaat ggtgttgccg 1020
cgccatctgc caccagccag ctatcaactc gcgccctgga agggattttt gaagcaactc 1080
atcgattgat ttacggcgct aaggatgact ctggtcagag atacctggcc tggtctggac 1140
acagtgcccg tgtcggagcc gcgcgagata tggcccgcgc tggagtttca ataccggaga 1200
tcatgcaagc tggtggctgg accaatgtaa atattgtcat gaactatatc cgtaacctgg 1260
atagtgaaac aggggcaatg gtgcgcctgc tggaagatgg cgattaggtc gacctgcagg 1320
catgcaagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat 1380
cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc 1440
cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt 1500
ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 1560
gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 1620
ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 1680
ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt 1740
gcgtttctac aaactctttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 1800
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 1860
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 1920
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 1980
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 2040
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg 2100
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 2160
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 2220
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 2280
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 2340
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctacagcaa 2400
tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 2460
aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 2520
cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 2580
ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 2640
gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 2700
agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 2760
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 2820
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 2880
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 2940
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 3000
tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 3060
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 3120
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 3180
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 3240
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 3300
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 3360
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 3420
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 3480
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cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 3600
gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga 3660
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca 3720
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga 3780
ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 3840
tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 3900
gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc gcgcgaaggc 3960
gaagcggcat gcatttacgt tgacaccatc gaatggtgca aaacctttcg cggtatggca 4020
tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac 4080
gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc 4140
agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac 4200
attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc 4260
acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc 4320
gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt 4380
aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg 4440
ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt 4500
cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt tctcccatga agacggtacg 4560
cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc 4620
ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct ggcataaata tctcactcgc 4680
aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa 4740
caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat 4800
cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat 4860
atctcggtag tgggatacga cgataccgaa gacagctcat gttatatccc gccgtcaacc 4920
accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc 4980
tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa 5040
accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 5100
cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 5160
gagttagcgc gaattgatct g 5181
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> trcCreF
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ctagggtacc gccgacatca taacggttct 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trcCreR
<400> 9
gatcctcgag tgtcctactc aggagagcgt 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> loxKmF
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ggtaccgggc cccccctcga ggtc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxKmR
<400> 11
ctctagagga tcctaccgtt cgta 24
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctagggatcc tcctgcgtta tcccctgatt 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laclqR
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atcgcatatg ggtgcgcatc tcaagtcttg 30
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<212> DNA
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ctagggtacc ggcctgtcac tgtgattaag 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAM5
<400> 18
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatggg tgcgcatctc aagtcttgca actcggggag gcctcggtac ttcgctttcc 240
gtcccaagat gacccaccct tctggaacag gaatcacccg gctgcctttg acctgctttg 300
gcccctcttc cctatgggcc aacacgtcgg gtgattcagg gtcagggtag aactggaagt 360
tctgcctccg atattcggcc agctcctctt cactcttccc gaccagcgac aggtcctcga 420
cgtagcggtc aagtgccctc tcctccagct caaccgaagt cagccaccgg ctttcctcgg 480
acgctttctc ccccttcgtc cgtctgcgtt ttgggtcagc tctttgcgct gaagtgagcg 540
gtacaagtac accgtgggtg tacttgttgg actgacgaag caccagaatc agaggccaat 600
aatcctcgac tcggtaacgg tagcgactcc agatgggcac gaaaaaactt ctcctgtttg 660
gtcttcaaaa aaaagttggg tgaccacgaa gagtcaatcg atcactgtgt cgctgagggg 720
tgagaagtcc ctctccacag gtcacgcgaa gtcaccactg agttccaatc acttgcctgg 780
cccccttcac ctgcctggct ccttgcggaa accaaaccga ttactacggt gcctctgtcg 840
ctctactttc cggtgtgttg tccacgagtt tgaccccgcg tgattccaca agactctcag 900
gtttttcgca ccctgagttc cccagccact taatcacagt gacaggccgg taccgccgac 960
atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atccggctcg 1020
tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagac catggaattc 1080
atgtccaatt tactgcccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 1140
gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 1200
acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 1260
cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 1320
cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt 1380
cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc 1440
cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 1500
gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat 1560
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agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 1680
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gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc 1800
cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc aactcgcgcc 1860
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cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg agatatggcc 1980
cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa tgtaaatatt 2040
gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg cctgctggaa 2100
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agccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata 2700
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atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag gtattagaag 2940
aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc 3000
attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg 3060
cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg 3120
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cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa 3240
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tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 3360
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ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 3720
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 3780
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 3840
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc gcgcgaaggc gaagcggcat 3900
gcatttacgt tgacaccatc gaatggtgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc 3960
cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag 4020
agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt 4080
ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc 4140
gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc 4200
tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg 4260
gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg 4320
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aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct 4440
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cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 6840
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gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 7380
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ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 7680
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gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 7920
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 7980
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 8034
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<220>
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agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 600
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ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga tgactctggt 840
cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg agatatggcc 900
cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa tgtaaatatt 960
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gatggcgatt ag 1032
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taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
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ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
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aagtagtcgg gcgtgatgaa ctcgaagtgg gtcaggcgct cacgcagccc cggaatcagg 60
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agctcttcgc cgctctccag ccgcacaccg cgcgctgtgc gtttgccggg tagattgccg 540
tccaccagca cctcgtctac gccggcgccg tagcggatgg ctccgccgag ctcctcaaat 600
ttctgcacca gcccgcgcac cagcgccccg gtgccgccca tcgcgtagtg gatgccccag 660
gtcttctcga cgaagtgaat catcgcgtag atggcgggca cgctcagcgg attgccgccg 720
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cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420
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gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660
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tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160
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ggcaacgccg cgaaataggc tttcatcagc cacaggccaa tccgttgttg gttgcctatt 180
tcgataaact gaatttagcg gccggcagcc gggttttgct gcccttgtgc ggcaagaccc 240
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ctttcgtc 4328
Claims (12)
- 표적 유전자간부위(intergenic region)의 상부 단편 서열, 서열번호 2의 염기 서열로 구성된 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 서열번호 25의 염기 서열로 구성된 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 서열번호 26의 염기 서열로 구성되는 lox66 또는 서열번호 27의 염기 서열로 구성되는 lox71 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열, 서열번호 3의 염기 서열로 구성된 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열 및 표적 유전자간부위(intergenic region)의 하부 단편 서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 1) 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 균주 내에 도입하는 단계; 및
2) 상기 균주의 표적 유전자간부위(intergenic region)에 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입되는 단계;를 포함하는 변이 균주의 제조방법.
- 1) 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 균주 내에 도입하는 단계;
2) 상기 균주의 표적 유전자간부위(intergenic region)에 trc 프로모터 및 이에 의해 조절되는 Cre 단백질을 암호화하는 서열, 양 말단에 lox 염기 서열을 포함하는 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열 및 lacⅠq 단백질을 암호화하는 서열이 삽입되는 단계; 및
3) IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 배지에 배양하여 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열을 제거하는 단계를 더 포함하는 변이 균주의 제조방법.
- 제 8항의 제조방법으로 제조된 변이 균주.
- 제 9항의 변이 균주에 표적 서열의 상부 단편 서열, lox 핵산 단편, 항생제 내성 관련 단백질을 암호화하는 서열, lox 핵산 단편 및 표적 서열의 하부 단편 서열이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변이 균주의 목적유전자를 변형하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 목적유전자가 변형된 변이 균주를 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 배지에 배양하여 항생제 저항성 관련 단백질을 암호화하는 서열이 제거된, 변이 균주의 목적유전자를 변형하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 변형은 목적유전자 서열의 치환, 결실 또는 목적 서열을 삽입하는 것인 목적유전자를 변형하는 방법.
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| JP2006513692A (ja) * | 2002-04-22 | 2006-04-27 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 様々なレベルの遺伝子発現を生じる修飾プロモーターを作成する方法 |
| KR101835852B1 (ko) * | 2016-12-27 | 2018-04-19 | 서울시립대학교 산학협력단 | Cre-lox 시스템을 이용한 데이노코쿠스 속 미생물의 개량 방법 |
Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20050079617A1 (en) * | 2003-10-03 | 2005-04-14 | Cervin Marguerite A. | Glucose transport mutants for production of biomaterial |
| KR101927892B1 (ko) * | 2017-03-30 | 2019-02-26 | 서울시립대학교 산학협력단 | 파이토엔 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주 |
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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